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ES2250996T3 - Procedimiento y composiciones utiles para la inhibicion de la angiogenesis mediada alfa v beta 5. - Google Patents

Procedimiento y composiciones utiles para la inhibicion de la angiogenesis mediada alfa v beta 5.

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ES2250996T3
ES2250996T3 ES96928868T ES96928868T ES2250996T3 ES 2250996 T3 ES2250996 T3 ES 2250996T3 ES 96928868 T ES96928868 T ES 96928868T ES 96928868 T ES96928868 T ES 96928868T ES 2250996 T3 ES2250996 T3 ES 2250996T3
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ES
Spain
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angiogenesis
baselineskip
beta
peptide
cam
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES96928868T
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Brooks
David A. Cheresh
Martin Friedlander
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Scripps Research Institute
Original Assignee
Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Research Institute filed Critical Scripps Research Institute
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE METODOS PARA INHIBIR LA ANGIOGENESIS EN TEJIDOS EMPLEANDO ANTAGONISTAS DE VITRONECTINA ALV BE5. LA ANGIOGENESIS MEDIADA POR ALV BE5 SE CORRELACIONA CON LA EXPOSICION A CITOQUINAS INCLUYENDO FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR, FACTOR DE CRECIMIENTO TRANSFORMANTE AL Y FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDERMICO. LA INHIBICION DE LA ANGIOGENESIS MEDIADA POR ALV BE5 ES PARTICULARMENTE PREFERIDA EN ENFERMEDADES NEOVASCULARES OCULARES ENDOTELIALES VASCULARES, EN EL CRECIMIENTO TUMORAL Y EN ESTADOS INFLAMATORIOS, EMPLEANDO COMPOSICIONES TERAPEUTICAS QUE CONTIENEN ANTAGONISTAS ALV BE5.

Description

Procedimientos y composiciones útiles para la inhibición de la angiogénesis mediada por \alpha_{v} \beta_{5}.
Campo técnico
La presente invención se refiere generalmente al campo de la medicina, y se refiere específicamente a procedimientos y composiciones para inhibir la angiogénesis mediada por \alpha_{v}\beta_{5} de tejidos usando antagonistas del receptor un procedimiento para modificar el receptor \alpha_{v}\beta_{5} de vitronectina.
Antecedentes
Las integrinas son una clase de receptores celulares conocidos que se unen a las proteínas de matriz extracelular, y por lo tanto median las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular, que se refieren generalmente como episodios de adhesión celular. Sin embargo, aunque muchas integrinas y sus respectivos ligandos se describen en la bibliografía, la función biológica de muchas integrinas permanece difícil de localizar. Los receptores de integrina constituyen una familia de proteínas con características estructurales compartidas de complejos de glicoproteínas heterodiméricas no covalentes formados por subuniaddes \alpha y \beta.
El receptor de vitronectina, nombrado por su característica original de unión preferencial a vitronectina, se sabe ahora que se refiere a tres diferentes integrinas, denominadas \alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{3}, y \alpha_{v}\beta_{5}. Horton, Int. J. Exp. Pathol. 71: 741-759 (1990). La \alpha_{v}\beta_{5} se une fibronectina y vitronectina. La \alpha_{v}\beta_{3} se une a una gran variedad de ligandos, incluyendo fibrina, fibrinógeno, laminina, trombospondina, vitronectina, factor de von Willebrand, osteospontina y sialoproteína I ósea. La \alpha_{v}\beta_{5} se une a la vitronectina. Los papeles de adhesión celular específica que estas tres integrinas juegan en las muchas interacciones en tejidos están todavía bajo investigación. Sin embargo, está claro que existen diferentes integrinas con diferentes funciones biológicas así como diferentes integrinas y subunidades que tienen especificidades biológicas compartidas.
Un sitio importante de reconocimiento es un ligando para muchas integrinas es la secuencia de tripéptidos arginina-glicina-ácido aspártico (RGD). RGD se encuentra en todos los ligandos identificados anteriormente para las integrinas del rector de vitronectina. Este sitio de reconocimiento de RGD puede estar imitado por polipéptidos ("péptidos") que contienen la secuencia de RGD, y tales péptidos RGD son inhibidores conocidos de la función de integrina. Sin embargo, es importante indicar, que dependiendo de la secuencia y estructura del péptido de RGD, la especificidad de la inhibición se puede alterar para dirigir las integrinas específicas.
Para debates sobre el sitio de reconocimiento de RGD, véase Pierschbacher y col., Nature, 309: 30-33 (1984) y Pierschbacher y col., Proc. Natls. Acad. Sci. USA, 81: 5985-5988 (1984). Diversos polipéptidos de RGD de especificidad de integrina variable también han sido descritos por Grant y col., Cell, 58: 933-943 (1989), Cheresh, y col., Cell, 58: 945-953 (1989), Aumailley y col., FEBS Letts., 291: 50-54 (1991), y Pfaff y col., J. Biol. Chem., 269: 20233-20238 (1994), y en las patentes de Estados Unidos números 4.517.686, 4.578.079, 4.589.881, 4.614.517, 4.661.111, 4.792.525, 4.683.291, 4.879.237, 4.998.621, 5.041380 y 5.061.693.
El documento EP-A-0578083 describe el uso de polipéptidos cíclicos que contienen RGD para inhibir la adhesión.
La angiogénesis, también denominada neovascularización, es un proceso de vascularización de tejidos que implica el crecimiento de nuevos de vasos sanguíneos en desarrollo en un tejido. El proceso está mediado por la infiltración de células endoteliales y células musculares lisas. El proceso se cree que procede en una cualquiera de tres formas: 1) los vasos pueden surgir de vasos preexistentes; 2) desarrollo de novo de vasos pueden surgir de células precursoras (vasculogénesis); o 3) vasos pequeños existentes pueden aumentar de tamaño. Blood y col., Bioch. Biophys. Acta, 1032: 89-118 (1990). Las células endoteliales vasculares se sabe que contienen al menos integrinas dependientes de RGD, incluyendo el receptor de vitronectina (\alpha_{v}\beta_{3} o \alpha_{v}\beta_{5}), los receptores de colágeno tipos I y IV \alpha_{1}\beta_{1}), el receptor de laminina \alpha_{2}\beta_{1}), el receptor de fibronectina/laminina/colágeno \alpha_{3}\beta_{1}) y el receptor de fibronectina \alpha_{5}\beta_{1}). Davis y col., J. Cell.Biochem., 51: 206-218 (1993) La célula de músculo liso se sabe que contiene al menos seis integrinas dependientes de RGD, incluyendo, \alpha_{5}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}.
La angiogénesis es un proceso importante en el desarrollo neonatal, pero también es importante en la curación de heridas y en la patogénesis de una gran variedad de enfermedades clínicamente importantes incluyendo inflamación de tejidos, artritis, psoriasis, cáncer, retinopatía diabética, degeneración macular y otras enfermedades de los ojos neovasculares. Estas entidades clínicas asociadas a angiogénesis se denominan enfermedades angiogénicas. Folkman y col., Science, 235: 442-447 (1987). La angiogénesis generalmente ausente en tejidos adultos o maduros, aunque no se produce en la curación de heridas y en el ciclo de crecimiento del cuerpo lúteo. Véase, por ejemplo, Moses y col., Science., 248: 1408-1410 (1990).
La inhibición de la adhesión celular in vitro usando anticuerpos monoclonales específicos para diversas subunidades \alpha y \beta de integrinas ha implicado al receptor \alpha_{v}\beta_{3} de vitronectina en la adhesión celular de una diversidad de tipos de células incluyendo células endoteliales microvasculares. Davis y col., J. Cell. Biol., 51: 206-218 (1993). Además, Nicosia y col., Am. J. Pathol., 138: 829-833 (1991), describieron el uso del péptido RGD, GRGSS, que inhibe la formación in vitro de "microvesículas" de aorta de rata cultivada en gel de colágeno.
Sin embargo, la inhibición de la formación de "microvesículas" in vitro en cultivos de gel de colágeno no es un modelo para la inhibición de la angiogénesis en un tejido debido a que no se muestra que las estructuras de microvesículas sean las mismas que los crecimientos capilares o que la formulación de la microvesícula en el cultivo de gel de colágeno es el mismo que el crecimiento neovascular en un tejido intacto, tal como tejido artrítico, tejido tumoral o tejido enfermo en el que es deseable la inhibición de la angiogénesis.
El documento WO 95/14714 y el documento WO 95/25543 describen el uso de polipéptidos que contienen RGD para inhibir la angiogénesis mediada por \alpha_{v}\beta_{3}.
El papel del \alpha_{v}\beta_{3} en la angiogénesis se ha confirmado recientemente.. Véase, Brooks, y col., Science., 264: 569-571 (1994). La integrina se mostró que se expresa en los vasos sanguíneos en tejido humano de granulación de heridas pero no en la piel normal. Los anticuerpos monoclonales contra el receptor \alpha_{v}\beta_{3} inhibían la angiogénesis inducida por los factores de crecimiento (citoquinas) factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor \alpha de necrosis tumoral (TNF-\alpha), así como fragmentos de melanoma. Sin embargo, los antagonistas solamente mostraron vasos nuevos y no existentes. Además, los péptidos que contienen RGD lineales y cíclicos también se mostró que inhibían la neovascularización.
Se ha propuesto que la inhibición de la angiogénesis sería una terapia útil para restringir el crecimiento tumoral. La inhibición de la angiogénesis se ha propuesto por (1) inhibición de la liberación de las moléculas angiogénicas tales como el bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico) , (2) neutralización de moléculas angiogénicas, tal como mediante el uso de anticuerpos anti-bFGF, y (3) inhibición de la respuesta de células endoteliales a estímulos angiogénicos. Esta última estrategia ha recibido atención, y Folkman y col., Cancer Biology, 3: 89-96 (1992), han descrito varios inhibidores de respuesta de células endoteliales, incluyendo el inhibidor de la colagenasa, inhibidores del recambio de membrana basal, esteroides angiostáticos, los inhibidores de la angiogénesis derivados de hongos, factor 4 de plaquetas, trombospondina, fármacos contra artritis tales como penicilamina D y tiomalato de oro, análogos de la vitamina D_{3}, interferón alfa, y similares que se podrían usar para inhibir la angiogénesis. Para inhibidores propuestos adicionales de angiogénesis, véase Blood y col., Bioch. Biophys. Acta., 1032: 89-118 (1990), Moses y col., Science, 248: 1408-1410 (1990), Ingber y col., Lab. Invest., 59: 44-51 (1988), y las patentes de estados Unidos números 5.092.885, 5.112.946, 5.192.744, y 5.202.352.
Sin embargo, el papel de la integrina \alpha_{v}\beta_{5} en la angiogénesis no se ha sugerido o identificado hasta la presente invención ni cualquiera de los inhibidores de angiogénesis descritos en las referencias anteriores se ha dirigido en la inhibición de \alpha_{v}\beta_{3}. Además, ninguna de las referencias, distintas de las de la presente invención, han implicado a la integrina \alpha_{v}\beta_{5} en la neovascularización, particularmente la inducida por los factores de crecimiento, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor transformador \alpha de crecimiento (TGF-\alpha) y factor de crecimiento epidérmico (EFG).
Aunque el número de factores de crecimiento implicado en el control de angiogénesis está limitado, existen diferentes niveles de control del proceso para la conversión de un estado quiescente a un estado neovascular. Véase, D'Amore Investigative Ophthal. Visual Sci., 35: 3974-3979 (1994). Aunque algunos factores de crecimiento implicados en la angiogénesis están regulados a nivel de síntesis, otros están regulados por el estado de activación. Estos episodios celulares se producen como un vaso quiescente que experimenta neovascularización después de lesión o isquemia.
VEGF, en particular, se piensa que es un mediador principal de angiogénesis en un tumor primario en enfermedades oculares isquémicas. Para revisión, véase Foolkman, Nature Medicine, 1: 27-31 (1995). VEGF es un homodímero de 46 kilodaltons (kDa) que es un factor angiogénico de células endoteliales (Ferrara y col., Endocrin. Rev., 13: 18-32 (1992)) y vasopermeable (Senger y col., Cancer Res., 46: 5629-5632 (1986)) que se une a receptores unidos a membrana de alta afinidad con actividad tirosina quinasa (Jakeman y col., J. Clin. Invest., 89: 244-253 (1992)).
La activación de las tirosinaquinasas de receptores se ha mostrado recientemente que promueve la migración de células dependiente de integrina en proteínas de matriz extracelular. En particular, Klemke y col., J. Cell. Biol., 127: 859-866 (1994) ha implicado a la tirosina quinasa del receptor EGF (EFGR) en la promoción de la motilidad celular pero no en la adhesión de las células de carcinoma pancreático humano sobre la vitronectina usando la integrina \alpha_{v}\beta_{5}. Los autores proporcionan evidencia directa de que la ocupación de EGFR con el ligando de EGF activa la activación de la tirosina quinasa del EGFR que estimula por último una ruta dependiente de la proteína quinasa C (PKC) que conduce a la inducción de la migración de células dependiente de \alpha_{v}\beta_{5} de un sustrato de vitronectina sobre la que las células normalmente son incapaces de migrar. DE este modo, los hallazgos de Klemke y col., proporcionan evidencia para correlacionar la presencia de citoquinas, especialmente EGF, con actividad de integrina en la migración de células. La activación de PKC se ha mostrado que está implicada en la regulación de la angiogénesis en el sistema de modelo de membranas corioalantoicas de pollo. Véase, Tsopanoglou y col., J. Vasc. Res., 30: 202-208 (1993). Los autores identificaron activadores e inhibidores específicos de PKC que estimulaban e inhibían respectivamente el sistema de modelo.
Sin embargo, ni Klemke y col., ni Tsopanoglou y col., descritos anteriormente describen el papel de las citoquinas y expresión y/o activación de la integrina \alpha_{v}\beta_{5} en la promoción de angiogénesis en diversas afecciones y estados patológicos e inhibición de los mismos con antagonistas específicos de \alpha_{v}\beta_{5}.
Recientes evidencias experimentales han mostrado en un sistema de modelo de mono de enfermedad ocular que la isquemia residual inducida por la oclusión de venas retinales daban como resultado un crecimiento rápido de VEGF en las cámaras acuosas del ojo. Este crecimiento coincidía con la neovascularización del iris que se observó como se describe en Millar y col., Am. J. Path., 145: 574-584 (1994). Los datos adicionales en un sistema de modelo de ratón de retinopatía proliferativa en el que se induce apoxia, el ARN mensajero de VEGF se mostró que aumentaba en 6-12 horas de hipoxia relativa que permanece elevada hasta que se desarrolla la neovascularización. A medida que los vasos sanguíneos se deterioran, así lo hece la expresión de VEGF como han descrito Pierce y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92: 905-909 (1995).
De este modo, los datos recientes como se ha demostrado n modelos animales de isquemia han correlacionado la inducción de VEGF con la de isquemia después de vascularización. El VEGF, así como otros factores de crecimiento, también están implicados en otras afecciones y estados patológicos que implican neovascularización como ha revisado Folkman, Nature Medicine, 1: 27-31 (1995).
La referencia de Folkman y col., también sumariza los planteamientos clínicos actuales usados para controlar al angiogénesis no deseable. Los pacientes en ensayos clínicos han recibido tratamientos terapéuticos con inhibidores angiogénicos que incluyen factor 4 de plaquetas, un derivado de fumagilina, carboxi-amino-triazol, y similares. Sin embargo, ninguna referencia o referencias terapéuticas actuales correlacionan la expresión de \alpha_{v}\beta_{5} con la angiogénesis, particularmente la inducida por VEGF. De este modo, antes de la presente invención, no se ha descrito ni utilizado un régimen terapéutico con antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} que controlan la angiogénesis en un tejido que experimenta angiogénesis correlacionada con la presencia y activación de \alpha_{v}\beta_{5}.
Por lo tanto, otros estudios diferentes de los reseñados en este documento sobre \alpha_{v}\beta_{3} y la relación con los factores de crecimiento a angiogénesis, los solicitantes no son conscientes de cualquier otra demostración en que la angiogénesis se podría inhibir en un tejido que usa inhibidores de la adhesión de células mediada por \alpha_{v}\beta_{5}. En particular, nunca se ha demostrado previamente que la función de \alpha_{v}\beta_{5} se requiere para angiogénesis en un tejido o que los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} pueden inhibir la angiogénesis en un tejido, particularmente en enfermedades neovasculares oculares.
Breve descripción de la invención
La presente invención demuestra que además de una ruta de angiogénesis que requiere \alpha_{v}\beta_{3} en tejidos, una ruta dependiente de \alpha_{v}\beta_{5} también existe. De este modo, la invención describe inhibidores de \alphav\beta_{5} que pueden inhibir angiogénesis. La invención describe adicionalmente que la actividad mediada por \alpha_{v}\beta_{5} en la promoción de angiogénesis se correlaciona con la activación del factor de crecimiento (citoquina) de las tirosina quinasas del receptor de factor de crecimiento y proteína quinasa C (PKC). Los factores de crecimiento (citoquinas) que funcionan de esta manera incluyen factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor transformador \alpha de crecimiento (TGF-\alpha), factor de crecimiento epidérmico (EFG), y similares.
La invención se define en la reivindicación 1.
Un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} para uso en los procedimientos presentes es capaz de unirse a \alpha_{v}\beta_{5} e inhibir competitivamente la capacidad de \alpha_{v}\beta_{5} de unirse al ligando de vitronectina natural. Preferiblemente, el antagonista muestra especificidad para \alpha_{v}\beta_{5} sobre otras integrinas. En una realización particularmente preferida, el antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} inhibe la unión de vitronectina u otros ligandos que contienen RGD a \alpha_{v}\beta_{5} pero no inhiben sustancialmente la unión de vitronectina a \alpha_{v}\beta_{3} o \alpha_{IIb}\beta_{3}. El antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} es un polipéptido que contiene RGD.
La administración de los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} de esta invención incluye administración intraocular.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos que forman una parte de esta descripción:
Las figuras 1 A-1 D ilustran la inhibición de la angiogénesis de córnea de conejo inducida por citoquinas mediante antagonistas de anticuerpos de integrinas \alpha_{v}. La inducción de angiogénesis mediante tratamiento con o bien bFGF o VEGF y efectos de tratamiento de los mismos con los antagonistas de anticuerpos de integrinas \alpha_{v}, P1F6 (\alpha_{v}\beta_{5}) y LM609 (\alpha_{v}\beta_{3}), se describen en el ejemplo 3. OD y OS son respectivamente los ojos derecho e izquierdo de un conejo experimental. Las flechas grandes indican angiogénesis de córnea con edema mientras que las pequeñas flechas apuntan a vasos del limbo conjuntivo. Las figuras 1 A y 1 B muestran la inducción de angiogénesis con bFGF mientras que la figura 1 C y 1 D la muestran con VEGF. Las córneas de conejos en las figuras 1 A y 1 C muestran el tratamiento con P1F6 mientras que las figuras 1 B y 1 D muestran tratamiento con LM609.
Las figuras 2 A y 2 B son histogramas que muestran el área media neovascular en mm^{2} +/- el error estándar (n = 8 para cada una de las dos series) después de la inducción respectivamente con o bien bFGF o VEGF seguido de tratamiento de mAb con o bien P1F6 o LM609. Los resultados se describen en el ejemplo 4.
Las figuras 3 A-3 F ilustran fotográficamente los efectos del tratamiento de anticuerpo anti-integrina en la preparación de CAM de pollo. Los resultados se describen en el ejemplo 6 A. La angiogénesis se induce o bien con nFGF o VEGF seguido de la administración intravenosa de solución salina tamponada con fosfato (PBS) como un control o con anticuerpos monoclonales P1F6 o LM609 descritos en la leyenda de la figura 1. Las CAM tratadas con bFGF se muestran en las figuras 3 A, 3 C y 3 E mientras que las CAM tratadas con VEGF se muestran en las figuras 3 B, 3 D y 3 F. Las CAM control que recibieron inyección intravenosa de PBS se muestran en las figuras 3 A y 3 B. El anticuerpo P1F6 se usó para tratar las CAM mostradas en las figuras 3 C y 3 D mientras que el anticuerpo LM609 se usó para tratar las CAM en las figuras 3 E y 3 F.
Las figuras 4 A y 4 B proporcionan en formato de histograma la cuantificación de resultados mostrados en la figura 3 A-3 F. El índice de angiogénesis se representa gráficamente sobre el eje Y contra el tratamiento control o por anticuerpos. Las figuras 4 A y 4 B respectivamente muestran angiogénesis inducida por bFGF y VEGF. Los resultados se describen en el ejemplo 4.
Las figuras 5 A-5 F ilustran fotográficamente los efectos del tratamiento de péptidos sintéticos sobre la preparación de CAM de pollo como se describe en el ejemplo 6. La angiogénesis se induce o bien con bFGF o VEGF seguido de la administración intravenosa de solución salina tamponada con fosfato (PBS) como control o con péptidos cíclicos sintéticos (RGFfV (SEQ ID Nº 4) o RADfV (SEQ ID Nº 5). Las CAM tratadas con bFGF se muestran en las figuras 5 A, 5 C y 5 E mientras que las CAM tratadas con VEGF se muestran en las figuras % B, 5 D y 5 F. Las CAM control que reciben inyecciones intravenosas de PBS se muestran en las figuras 5 A y 5 B. El péptido RDGfV se usó para tratar las CAM mostradas en las figuras 5 C y 5 D mientras que el péptido RADfV se usó para tratar las CAM en las figuras 5 E y 5 F.
Las figuras 6 A y 6 B proporcionan, en formato de histograma, la cuantificación de resultados mostrados en las figuras 5 A-5 F. El índice de angiogénesis se representa gráficamente sobre el eje Y contra el tratamiento control o por anticuerpos. Las figuras 6 A y 6 B respectivamente muestran angiogénesis inducida por bFGF y VEGF. Los resultados se describen en el ejemplo 6.
Las figuras 7 A-7 E muestran los efectos de anticuerpos monoclonales anti-integrina y calfostin C sobre la angiogénesis de CAM inducida por las citoquinas, bFGF, TNF-\alpha, VEGF y TGF-\alpha separadas. PMA también se ha evaluado. Los ensayos y resultados se describen en el ejemplo 6. Los resultados se representan gráficamente en formato de histograma donde el índice de angiogénesis se representa sobre el eje Y y los diversos control e inhibidores se muestran sobre el eje X. Las figuras 7 A-7 E muestran respectivamente la angiogénesis inducida con bFGF, TNF-\alpha, VEGF, TGF-\alpha y PMA.
La figura 8 es un histograma que muestra los efectos de tratamiento por anticuerpos sobre el crecimiento tumoral de melanoma CS1 en la CAM de embrión de pollo ensayado realizado como se describe en los ejemplos 5 C y 6 D. El peso de los tumores en miligramos (mg) se representa gráficamente sobre el eje Y contra los diversos tratamientos indicados sobre el eje X. CSAT es un anticuerpo control específico para la subunidad \beta1 de integrina. LM609 y P1F6 se describen previamente.
La figura 9 es un histograma de los efectos de control frente a un antagonista peptídico de \alpha_{v}\beta_{5}, péptido 189 marcado (SEQ ID Nº 9) sobre el crecimiento tumoral de melanona como se mide por el volumen de tumor en mm^{3} representado gráficamente sobre el eje Y. El ensayo y resultados se describen en el ejemplo 8.
La figura 10 ilustra la síntesis del compuesto 7 como se describe en el ejemplo 10 A-G.
La figura 11 ilustra la síntesis del compuesto 9 como se describe en el ejemplo 10 A-C; H-I.
La figura 12 ilustra la síntesis del compuesto 10 como se describe en el ejemplo 10 J.
La figura 13 ilustra la síntesis del compuesto 12 y compuesto 14 como se describe en el ejemplo 10 K-L y 10 M-N respectivamente.
La estructura 14 muestra las estructuras químicas del compuesto 15, compuesto 16, compuesto 17 y compuesto 18. La síntesis detallada de los compuestos se describe en el ejemplo 100-R.
Descripción detallada de la invención A. Definiciones
Residuo de aminoácido: Un aminoácido formado tras la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Los residuos de aminoácidos descritos en esta memoria descriptiva están preferiblemente en la forma isomérica "L". Sin embargo, los residuos en la forma isomérica "D" se pueden sustituir por cualquier residuo de aminoácido L, mientras que la propiedad funcional deseada está retenida por el polipéptido. NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino del polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi presente en el extremo carboxi de un polipéptido. Manteniendo la nomenclatura de polipéptidos convencional (descrita en J. Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969) y adoptada en 37 CFR \NAK 1.822 (2)), las abreviaturas para los residuos de aminoácidos se muestran en la siguiente tabla de correspondencia:
TABLA DE CORRESPONDENCIA
Símbolo Aminoácido
1 letra 3 letras
Y Tyr Tirosina
G Gly Glicina
F Phe Fenilalanina
M Met Metionina
A Ala Alanina
S Ser Serina
I Ile Isoleucina
L Leu Leucina
T Thr Treonina
V Val Valina
P Pro Prolina
K Lys Lisina
H His Histidina
Q Gln Glutamina
E Glu Ácido glutámico
Z Glx Glu y/o Gln
W Trp Triptófano
R Arg Arginina
D Asp Ácido aspártico
N Asn Asparagina
B Asx Asn y/o Asp
C Cys Cisteína
X Xaa Desconocido u otro
Además los siguientes tienen los significados a continuación
BOC
terc-butiloxicarbonilo
DCCI
diciclohexilcarbodiimida
DMF
dimetilformamida
OMe
metoxi
HOBt
1-hidroxibenzotriazol
Se debe observar que todas las secuencias de residuos de aminoácidos se representan en esta memoria descriptiva por fórmulas cuya orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional del extremo amino a extremo carboxi. Además, se debe observar que una raya en el comienzo o final de una secuencia de residuos de aminoácido indica un enlace peptídico a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos.
Polipéptido: Una serie lineal de residuos de aminoácidos conectados a otro por enlaces polipeptídicos entre el grupo amino alfa y grupo carboxi se residuos de aminoácidos contiguos.
Péptido: Una serie lineal de no más de aproximadamente 50 residuos de aminoácidos conectados al otro como en un polipéptido.
Péptido cíclico: Un péptido circular derivado de un péptido lineal correspondiente y se refiere a un péptido en el que no existen extremos N- o C- del que los extremos N del péptido lineal correspondiente forman un enlace amida al carboxilato terminal C de dicho péptido lineal correspondiente.
Proteína: Una serie lineal de más de más de 50 residuos de aminoácidos conectados uno al otro como un polipéptido.
Péptido sintético: Una cadena producida químicamente de residuos de aminoácidos unidos juntos mediante enlaces peptídicos que está libre se proteínas de origen natural y fragmentos de las mismas.
B. Consideraciones generales
La presente invención se refiere generalmente al descubrimiento de que la angiogénesis está mediada por el receptor \alpha_{v}\beta_{5} de vitronectina, y esa inhibición de la función de \alpha_{v}\beta_{5} inhibe la angiogénesis.
Este descubrimiento es importante debido al papel que al angiogénesis juega en una diversidad de procesos patológicos. Inhibiendo la angiogénesis, se puede intervenir en la enfermedad, mejora de los síntomas, y en algunos casos la cura de la enfermedad.
Cuando el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos es al causa de, o contribuye a, la patología asociada a una enfermedad, la inhibición de angiogénesis reducirá los efectos perjudiciales de la enfermedad. Los ejemplos incluyen artritis reumatoide, retinopatíía diabética, enfermedades inflamatorias, reestenosis, y similares. Cuando se requiere el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos para soportar en crecimiento de un tejido perjudicial, la inhibición de angiogénesis reducirá el suministro de sangre al tejido y por lo tanto contribuirá a la reducción de masa de tejido en los requerimientos de suministro de sangre. Los ejemplos incluyen el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en respuesta a isquemia, dando como resultado angiogénesis inducida por el factor de crecimiento, crecimiento de tumores en los que la neovascularización es un requerimiento continuo con el fin de que el tumor crezca más allá de unos pocos milímetros de espesor, y para el establecimiento de metástasis de tumores sólidos.
Los procedimientos de la presente invención son eficaces en parte debido a que al terapia es altamente selectiva para angiogénesis y no otros procesos biológicos. Como se muestra en los ejemplos, solamente el crecimiento de nuevos vasos contiene \alpha_{v}\beta_{5} sustancial, y por lo tanto los procedimientos terapéuticos no afectan adversamente a los vasos maduros.
El descubrimiento de que la inhibición del \alpha_{v}\beta_{5} solo inhibirá eficazmente la angiogénesis permite el desarrollo de composiciones terapéuticas con especificidad altamente potencial, y por lo tanto toxicidad relativamente baja. Aunque la invención describe el uso de reactivos basados en péptidos que tienen la capacidad de inhibir una o más integrinas, se pueden diseñar otros reactivos que inhiben más selectivamente \alpha_{v}\beta_{5}. Por lo tanto, ciertos reactivos basados en péptidos no tienen el efecto secundario de inhibir otros procesos biológicos distintos de los mediados por \alpha_{v}\beta_{5}.
Por ejemplo, los péptidos que contienen RGD se pueden diseñar para que sean selectivos en al inhibición de \alpha_{v}\beta_{5}, como se describe en esta memoria descriptiva adicionalmente.
Antes de los descubrimientos de la presente invención, no se sabía que la angiogénesis, y cualquiera de los dependientes de angiogénesis, se podían inhibir in vivo mediante el uso de reactivos que antagonizan la función biológica de \alpha_{v}\beta_{5}.
C. Procedimientos para la inhibición de angiogénesis
La inhibición proporciona un procedimiento de inhibición de la angiogénesis en un tejido, y por lo tanto inhibe episodios en el tejido que dependen de angiogénesis. En general, el procedimiento comprende la administración al tejido de una composición que comprende una cantidad inhibidora de la angiogénesis de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5}.
El tejido diana usado en la práctica de los procedimientos de esta invención se define como tejido corneal que contiene \alpha_{v}\beta_{5} que se caracteriza por la presencia detectable del receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{5}. En otras palabras, un tejido que contiene \alpha_{v}\beta_{5} se define por la presencia del complejo del receptor \alpha_{v}\beta_{5} en las membranas celulares. Tales tejidos incluyen células derivadas epitelialmente y mesenquimáticamente. La presencia del receptor se puede determinar mediante un número de medios que incluyen inmunorreactividad del receptor con un anticuerpo del receptor de integrina anti-\alpha_{v}\beta_{5}, en el que la inmunorreacción se detecta en tejidos mediante microscopía, mediante inmunoprecipitación, mediante competición en ensayos de unión a ligandos y las técnicas similares. Los anticuerpos preferidos para uso en al d detección de la presencia de \alpha_{v}\beta_{5} en un tejido se describe más adelante y en el ejemplo 1. Por ejemplo, la distribución de \alpha_{v}\beta_{5} en tejidos del riñón, epiltelal y ocular mediante microscopía de inmunofluorescencia se describe en el ejemplo 2.
En el contexto de los procedimientos de esta invención, un tejido que contiene \alpha_{v}\beta_{5} también se caracteriza como uno que tiene un indicio de angiogénesis Como se ha descrito anteriormente, la angiogénesis incluye una diversidad de procesos que implican neovascularización de un tejido que incluye "crecimiento", vasculogénesis, o agrandamiento de vasos, todos estos procesos de angiogénesis están mediados por y dependientes de la expresión de \alpha_{v}\beta_{5}. Con la excepción de curación de heridas traumáticas, formación de cuerpo lúteo y embriogénesis, se cree que la mayoría de los procedimientos de angiogénesis están asociados a procesos patológicos y por lo tanto el uso de los presentes procedimientos terapéuticos son selectivos para la enfermedad y no tienen efectos secundarios perjudiciales.
Existen una diversidad de enfermedades en las que la angiogénesis se cree que es importante, denominadas enfermedades angiogénicas, que incluyen pero no se limitan a, trastornos inflamatorios tales como inflamación inmune y no inmune, reumatismo articular crónico y psoriasis, trastornos asociados a invasión inapropiada e inoportuna de vasos tales como reestenosis, proliferación capilar en placas ateroscleróticas y osteoporosis, y enfermedades asociadas a cáncer, tales como tumores sólidos, metástasis de tumores sólidos, angiofibromas, fibroplasia retrolental, hemangiomas, sarcoma de Kaposi y cánceres similares que requieren neovascularización para soportar el crecimiento tumoral.
Las enfermedades oculares caracterizadas por la neovascularización presentan una diana preferida particularmente para terapia. La neovascularización ocular es el cambio patológico más común observado en la gran mayoría de enfermedades oculares que dan como resultado pérdida catastrófica de visión. El crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de los vasos coroidales, retinales, o paralimbales preexistentes puede conducir a edema, hemorragia o formación de membrana fibrovascular que da como resultado la ruptura de las relaciones anatómicas normales del oso y pérdida simultánea de la función visual normal.
La presente invención se refiere específicamente a ciertos trastornos córneos neovasculares, denominados transplante córneo, queratitis herpética, queratitis lútea, pterigion y pannus neovascular asociado a al uso de lentes de contacto.
De este modo, los procedimientos que inhiben la angiogénesis en un tejido enfermo mejoran los síntomas de la enfermedad y, dependiendo de la enfermedad, pueden contribuir a la curación de la enfermedad. El grado de angiogénesis en un tejido, y por lo tanto el grado de inhibición lograda por los procedimientos siguientes, se puede evaluar mediante una diversidad de procedimientos, tales como se describen en los ejemplos para detectar las estructuras de los vasos nacientes e inmaduros de \alpha_{v}\beta_{5} inmunopositivos mediante inmunohistoquímica.
En particular, los procedimientos y composiciones de los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} de esta invención son terapéuticamente útiles para inhibir la angiogénesis que ha estado inducida por factores de crecimiento, también denominados citoquinas. En condiciones fisiológicas, la angiogénesis está altamente regulada y como se ha publicado previamente por Brooks y col., Science, 264: 569-5761 (1994), se ha mostrado que está activada por moléculas específicas antigiogénicas tales como el factor de crecimiento fribroblástico básico (bFGF). También se han descrito los reguladores negativos de angiogénesis. De este modo la angiogénesis está regulada por un equilibrio complicado entre los estimuladores e inhibidores locales. Véase, D'Amore, Investigative Ophthal. Visual Sci., 35: 3974-3979 (1994).
Cuando se altera el equilibrio fisiológico de los estimuladores e inhibidores angiogénicos que controlan estrechamente el vascular capilar normalmente quiescente, como ocurre en ciertos estados patológicos, las células endoteliales capilares se inducen para proliferar, migrar y por último diferenciarse para formar nuevos vasos sanguíneos.
La angiogénesis se caracteriza como una cascada de episodios que tienen un conjunto de episodios tempranos seguido de un conjunto de episodios tardíos como revisó Leibovich, "Role of Citokines in the Process of Tumor Angiogenesis", en "Human Cytokines: Their Role in Disease and Therapy", eds. Aggarwal y Puri, capítulo 15, Blackwell Science Inc. (1995). Los episodios tempranos están precedidos por la administración de factores de crecimiento angiogénicos y citoquinas administradas a partir de una fuente extravascular. Después los episodios tempranos proceden en la microvasculatura diana con la interrupción de las articulaciones intercelulares y un fenotipo proteolítico, e iniciación de la migración celular endotelial de una manera direccional. Los últimos episodios se caracterizan con expresión autocrina y paracrina de genes del factor de crecimiento y de citoquinas dentro de las células, las células endoteliales, pericitos y células del músculo liso, del desarrollo de brote capilar. Estas células a su vez modulan las interacciones de las células con la matriz extracelular que dan como resultado la formación de nuevos bucles capilares funcionales a partir de los vasos maduros existentes.
Como se ha descrito en esta memoria descriptiva en los antecedentes, las reseñas en la bibliografía describen una asociación entre la aparición de factores de crecimiento, que incluyen los asociados a un incremento de la expresión de \alpha_{v}\beta_{5}, llamados VEGF, TGF-\alpha y EGF, con la expansión de una masa tumoral y en el comienzo de angiogénesis en las enfermedades oculares neovasculares proliferativas, tanto en seres humanos como animales experimentales.
De este modo, VEGF, EGF, TGF-\alpha, entre otros muchos, se consideran factores de crecimiento que se caracterizan por sus propiedades de estimular el crecimiento celular Los factores de crecimiento son proteínas que se secretan por una célula que actúa en la célula secretora u otra célula. Su capacidad para actuar depende de la presencia de receptores de factores de crecimiento que son usualmente proteínas transmembrana. Los factores de crecimiento tal como VEGF se refieren también generalmente como citoquinas que están definidas como hormonas polipéptidicas, secretadas por una célula, que afectan al crecimiento y metabolismo o bien del mimo u otra célula (paracrina). El término citoquina no se limita a las moléculas producidas por células del sistema inmune y los modificadores de respuesta biológica del mismo sistema. de este modo, el término citoquina es una amplia categoría de las que una subcategoría basada en el tipo de respuesta biológica son factores de crecimiento o potenciadores estimuladores tales como VEGF, bFGF, EGF, TGF-\alpha, y similares. Para revisión, véase, Aggarwal y col., "Common and Uncommon Features of Cytokines and Cytokine Receptors: An Overview", en "Human Cytokines: Their Role in Disease and Therapy", eds. Aggarwal y Puri, capítulo 1, Blackwell Science Inc. (1995).
En la presente invención, los antagonistas específicos de \alpha_{v}\beta_{5}, y los antagonistas del factor de no crecimiento tales como anticuerpos contra VEGF, se contemplan para uso en al inhibición de angiogénesis en un tejido. En las realizaciones específicas, los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} descritos en esta memoria descriptiva son útiles para inhibir la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento en el que se induce la expresión del receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{5}. Los factores de crecimiento preferidos en este contexto incluyen VEGF, EGF, TGF-\alpha y similares.
Como se ha descrito en los antecedentes, los factores de crecimiento EGF y VEGF se conocen ambos que se unen a sus receptores celulares que actúan como tirosina quinasas. La activación de los receptores de EGF se ha mostrado además que está correlacionada con la activación de proteína quinasa C que da como resultado la activación de \alpha_{v}\beta_{5} que permite la migración de células específicas en un sustrato de vitronectina. De este modo, el mecanismo de acción entre la exposición a citoquinas o factores de crecimiento y la respuesta coordinada en la expresión o activación de integrinas es un proceso biológico complejo. Como se muestra en la presente invención (véase el ejemplo 6 A), el tratamiento de tejidos en o bien el modelo de ojo de conejo o modelo corioalantoico de pollo con la citoquina VEGF da como resultado en la angiogénesis potenciada por \alpha_{v}\beta_{5} que depende de la activación de la proteína quinasa C.
Un sistema de modelo ejemplar para determinar los efectos de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} de esta invención es el modelo murino de neovascularización retinal como se describe en el ejemplo 9. Un modelo quimérico de ratón : humano en el que la piel de un ratón que tiene inmunodeficiencia combinada grave (SCDI) se reemplaza con prepucio neonatal humano los describen Yan y col., J. Clin. Invest., 91: 986-996 (1993). El último modelo presenta un modelo in vivo adicional para investigar angiogénesis e inhibición de la misma con los procedimientos de esta invención. Los resultados ejemplares con un modelo de tumor de conejo y un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} de esta invención se presentan en los ejemplos 5 C y 6 D mientras que los resultados para la inhibición de angiogénesis en el modelo de ratón de SCDI se describe en el ejemplo 8.
El paciente tratado en la presente invención en sus muchas realizaciones es deseablemente un paciente humano, aunque se entiende que los principios de la invención indican que la invención es eficaz con respecto a todos los mamíferos, que se pretenden que estén incluidos en el término "paciente". En este contexto, un mamífero se entiende que incluye cualquier especie de mamífero en al que el tratamiento de enfermedades, particularmente especies de mamíferos agrícolas y domésticos, se busca con respecto a los procedimientos de esta invención. El presente procedimiento para inhibir angiogénesis en un tejido, y por lo tanto para poner en práctica también los procedimientos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con angiogénesis, comprende poner en contacto un tejido en el que se produce angiogénesis, o está en riesgo de producirse, con una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} capaz de inhibir al unión de \alpha_{v}\beta_{5} a su ligando natural. De este modo, el procedimiento comprende la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición fisiológicamente tolerable que contiene un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} de la invención.
Los intervalos de dosificación para la administración del antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} depende de la forma del antagonista, y su potencia, como se describe adicionalmente en esta memoria descriptiva, y son cantidades grandes suficientes para producir el efecto deseado en el que la angiogénesis y los síntomas patológicos mediados por angiogénesis están mejorados. La dosificación no debe ser tan grande como para provocar efectos secundarios adversos, tales como síndrome de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardiaca congestiva, y similares. En general, la dosificación variará con la edad, condición, sexo y grado de la enfermedad en el paciente y la pueden determinar los expertos en la técnica. La dosificación también la puede ajustar un médico particular en el caso de cualquier complicación.
Un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} es una molécula que bloquea o inhibe la actividad fisiológica o farmacológica de \alpha_{v}\beta_{5} inhibiendo la actividad de unión del receptor a su ligando, llamado vitronectina. Los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} de la invención son polipéptidos que contienen RGD.
Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} que suficiente para producir una inhibición medible de angiogénesis en el tejido que se está tratando, es decir, una cantidad inhibidora de angiogénesis. La inhibición de angiogénesis se puede medir in situ mediante inmunohistoquímica, como se describe en esta memoria descriptiva, o mediante otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
En la medida en que un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} pueda tomar la forma de un péptido que contiene RGD se ha de apreciar que la potencia, y por lo tantouna expresión de una cantidad "terapéuticamente eficaz" puede variar. Sin embargo, como se muestra mediante los procedimientos de ensayo presentes, los expertos en la técnica pueden fácilmente determinar la potencia de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} candidato de esta invención.
La potencia de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} se puede medir mediante una diversidad de medios que incluyen la inhibición de angiogénesis en el ensayo de CAM, en el ensayo de oso de conejo in vivo, y midiendo la inhibición de la unión de ligando natural a \alpha_{v}\beta_{5}, como se describen todos en esta memoria descriptiva, y los ensayos similares.
Un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} preferido tiene la capacidad de inhibir sustancialmente la unión de un ligando natural tal como vitronectina a \alpha_{v}\beta_{5} en solución a concentraciones de antagonistas de menos de 0,5 micromolar (\muM), preferiblemente menos de 0,1 \muM, y más preferiblemente menos de 0,05 \muM. Por "sustancialmente" se quiere decir que al menos un 50 por ciento de reducción en al unión de vitronectina se observa por la inhibición en la presencia del antagonista de \alpha_{v}\beta_{5}, y en el 50% de inhibición se refiere en esta memoria descriptiva como un valor de CI_{50}.
Un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} más preferido muestra selectividad por \alpha_{v}\beta_{5} sobre otras integrinas. De este modo, un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} preferido inhibe sustancialmente la unión de vitronectina _{a}\alpha_{v}\beta_{5} pero no inhibe sustancialmente la unión de vitronectina a otra integrina, tal como \alphav\beta1, \alphav\beta3 o \alpha_{v}\beta_{5 }. Se prefiere particularmente un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} que muestra una actividad de CI_{50} 10 veces a 100 veces menor en la inhibición de la unión de vitronectina a \alpha_{v}\beta_{5} comparado con la actividad de CI_{50} en la inhibición de la unión de vitronectina a otra integrina. Los ensayos ejemplares para medir la actividad de la CI_{50} en la inhibición de la unión a una integrina se describen en los ejemplos.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} es típicamente una cantidad de polipéptido de manera que cuando se administra en una composición terapéuticamente eficaz es suficiente para lograr una concentración de plasma de entre 0,1 microgramo (\mug) por militro) y 200 \mug/ml, preferiblemente entre 1 \mug/ml y 150 \mul/ml. Basándose en un polipéptido que tiene una masa de aproximadamente 500 gramos por mol, la concenbtración de plasma preferida en molaridad está entre 2 micromolar (\muM) y 5 milimolar (mM) y preferiblemente 100 \muM y 1 mM de antagonista polipeptídico. Establecida de manera diferente, la dosificación por peso corporal pueed variar entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 300 mg/kg, y preferiblemente entre 0,2 mg/kg y 200 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diariamente, durante uno o varios días.
Los polipéptidos de esta invención se pueden administrar por vía parenteral mediante inyección o mediante infusión gradual con el tiempo. Aunque al tejido a tratar se puede acceder en el cuerpo mediante administración sistémica y por lo tanto más a menudo tratarse mediante administración intravenosa de composiciones terapéuticas, se contemplan otros tejidos y medios de distribución en los que existe una probabilidad de que el tejido dirigido contenga la molécula diana. De este modo los polipéptidos se pueden administrar por vía intraocular, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavidad, transdérmica, y también se puede administrar por medio peristáltico.
Las composiciones terapéuticas que contienen un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} de esta invención se administran convencionalmente por vía intravenosa, como, por ejemplo, mediante inyección de una dosis unitaria. El término "dosis unitaria" cuando se usa en referencia a una composición terapéutica de la presente invención se refiere a unidades discretas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido, es decir, portador, o vehículo.
En una realización preferida como se muestra en los ejemplos, el antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} se administra en una única dosificación por vía intravenosa.
Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar y programación de administración depende del sujeto a tratar, capacidad del sistema del sujeto para utilizar el ingrediente activo, y grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo requerida a administrar depende del juicio del facultativo y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, intervalos de dosificación adecuados para aplicación sistémica se describen en esta memoria descriptiva y dependen de la vía de administración. Los regímenes adecuados para administración son también variables pero se tipifican por una administración inicial seguido de dosis repetidas en intervalos de una o más horas mediante una inyección posterior u otra administración. Como alternativa, se contempla la infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones en la sangre en los intervalos especificados para terapias in vivo.
D. Composiciones terapéuticas
La presente invención contempla las composiciones terapéuticas útiles para practicar los procedimientos terapéuticos descritos en esta memoria descriptiva. Las composiciones terapéuticas de la presente invención contienen un vehículo fisiológicamente tolerable junto con un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} como se describen en esta memoria descriptiva, disuelto o disperso en él como un ingrediente activo. En una realización preferida, la composición terapéutica del antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} no es inmunogénica cuando se administra a un paciente mamífero o humano para propósitos terapéuticos.
Como se usa en esta memoria descriptiva, los términos "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y variaciones gramaticales de los mismos, se refieren a composiciones, vehículos, diluyentes y reactivos, se usan indistintamente y representan que los materiales son capaces de administración a o en un mamífero sin la producción de efectos fisiológicos indeseables tales como nausea, vértigo, molestia gástrica y similares.
La preparación de una composición farmacológica que contiene ingredientes activos disueltos o dispersados en ella se entiende en la técnica y no se necesita limitar basándose en la formulación. Típicamente tales composiciones se preparan como inyectables o bien como soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, también se pueden preparar las formas sólidas adecuadas para solución, o suspensiones, en líquido antes de uso. La preparación también se puede emulsionar.
El ingrediente activo se puede mezclar con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para uso en los procedimientos terapéuticos descritos en esta memoria descriptiva. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y las combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o de emulsión, agentes de tamponación, agentes tamponadores de pH y similares que potencian la eficacia del ingrediente activo.
La composición terapéutica de la presente invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes en ella. Las sales farmacéuticamente aceptables de los componentes incluyen las sales de adición de ácido (formadas con grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o tales ácidos orgánicos como acético, tartárico, mandélico o similares. Las sales formadas con los grupos carboxilos libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, de potasio, de amonio, de calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.
Particularmente preferida es la sal de HCl cuando se usa en la preparación de antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} de polipéptido cíclico.
Los vehículos fisiológicamente tolerables son soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los ingredientes activos y agua, o contienen un tampón tal como fosfato sódico a un valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambas, tal como solución salina tamponada con fosfato. Todavía adicionalmente, los vehículos acuosos pueden contener más de una sal tampón, así como sales tales como cloruros de sodio y de potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos.
Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de y la exclusión de agua. Los ejemplos de tales fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón, y emulsiones agua-aceite.
Una composición terapéutica contiene una cantidad inhibidora de angiogénesis de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} de la presente invención, típicamente formulado para contener una cantidad de al menos 0,1 por ciento en peso de composición terapéutica total. Un porcentaje en peso es una relación en peso de inhibidor con relación a la composición total. De este modo, 0,1 por ciento en peso es 0,1 gramos de inhibidor por 100 gramos de composición total.
E. Antagonistas de la integrina \alpha_{v}\beta_{5}
Los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} se usan en los procedimientos presentes para inla angiogénesis en tejidos, y pueden tomar una diversidad de formas que incluyen compuestos que interactúan con \alpha_{v}\beta_{5} de una manera tal que se interfieren las interacciones funcionales con los ligandos de \alpha_{v}\beta_{5} naturales.
1. Polipéptidos
La invención contempla los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} en forma de polipéptidos que contienen RGD. Un antagonista del \alpha_{v}\beta_{5} del polipéptido Péptido) puede tener la secuencia característica de o bien el ligando natural del \alpha_{v}\beta_{5} o del propio \alpha_{v}\beta_{5} en la región implicada en la interacción \alpha_{v}\beta_{5}-ligando y muestra la actividad del antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} como se he descrito en esta memoria descriptiva. Un péptido antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} corresponde en secuencia al ligando natural en la región que contiene RGD.
Los polipéptidos preferidos que contienen RGD tienen una secuencia que corresponde a la secuencia de residuos de aminoácidos de la región que contiene RGD de un ligando natural de \alpha_{v}\beta_{5} tal como vitronectina, para la que la secuencia es bien conocida.
Un péptido antagonista preferido de \alpha_{v}\beta_{5} preferentemente inhibe la unión de \alpha_{v}\beta_{5} a su(s) ligando(s) natural(es)
cuando se compara con otras integrinas, como se ha descrito anteriormente. Estos péptidos específicos de \alpha_{v}\beta_{5} se prefieren particularmente al menos porque la especificidad para \alpha_{v}\beta_{5} reduce la incidencia de efectos secundarios indeseables tal como inhibición de otras integrinas. La identificación de péptidos del antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} que tienen selectividad para \alpha_{v}\beta_{5} se pueden identificar fácilmente en una inhibición típica de ensayo de unión, tal como el ensayo ELISA descrito en los ejemplos.
En una realización, un polipéptido de la presente invención no comprende más que aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, preferiblemente no más de aproximadamente 60 residuos de aminoácidos, más preferiblemente no más de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos. Los péptidos pueden ser lineales o cíclicos, aunque los péptidos particularmente preferidos son cíclicos. Los péptidos preferidos se describen en los ejemplos.
Se debe entender que un polipéptido sujeto no necesita ser idéntico a la secuencia de residuos de aminoácidos de un ligando natural de \alpha_{v}\beta_{5}, mientras que incluya una secuencia necesaria para antagonizar la unión de un ligando de \alpha_{v}\beta_{5} a \alpha_{v}\beta_{5} y es capaz de funcionar como un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} en un ensayo tal como los descritos en esta memoria descriptiva.
Un polipéptido sujeto incluye cualquier análogo, fragmento o derivado químico de un polipéptido cuya secuencia de residuos de aminoácidos se muestra en esta memoria descriptiva mientras que el polipéptido sea un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5}. Por lo tanto, un polipéptido presente puede se r sometido a diversos cambios, sustituciones, inserciones, y supresiones en los que tales cambios proporcionan ciertas ventajas en su uso. A este respecto , un polipéptido antagonista de esta invención corresponde a, en lugar de ser idéntico a, la secuencia de un péptido descrito en el que se hacen uno o en uno o más de los ensayos como se ha definido en esta memoria descriptiva.
De este modo, un polipéptido puede estar en cualquiera de las formas de derivados de péptido, que incluye amidas, conjugados con proteínas, péptidos polimerizados, análogos, fragmentos, péptidos modificados químicamente, y los derivados similares.
El término "análogo" incluye cualquier polipéptido que tiene una secuencia de residuos de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia específicamente mostrada en esta memoria descriptiva en la que uno o más residuos se han sustituido de manera conservadora con un residuo funcionalmente similar y que muestra la actividad del antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} como se describe en esta memoria descriptiva. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como aspártico o ácido glutámico por otro.
La frase "sustitución conservadora" también incluye el uso de un residuo químicamente derivatizado en lugar de un residuo no derivatizado con tal que tal polipéptido muestre la actividad de inhibición requerida.
"Derivado químico" se refiere a un polipéptido sujeto que tiene uno o más residuos químicamente derivatizado mediante reacción de un grupo secundario funcional. Tales moléculas derivatizadas incluyen por ejemplo, las moléculas en las que los grupos amino libres se han derivatizado para formar clorhidratos de amina, grupos de p-tolueno sulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t- butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres se pueden derivatizar para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres se pueden derivatizar para formar derivados de O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno imidazol de histidina se puede derivatizar para formar N-imbencilhistidina. También incluidos como derivados químicos son los péptidos que contienenuno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo: 4-hidroxiprolina se puede sustituir por prolina; 5-hidroxilisina se puede sustituir por lisina; 3-metiilhistidina se puede sustituir por histidina; homo serina se puede sustituir por serina; y ornitina se puede sustituir por lisina. Los polipéptidos de la presente invención también incluyen cualquier polipéptido que tiene una o más adiciones y/o supresiones o residuos con relación a la secuencia de un polipéptido cuya secuencia se muestra en esta memoria descriptiva, mientras que la actividad requerida se mantenga.
El término "fragmento" se refiere a cualquier polipéptido sujeto que tiene una secuencia de residuos de aminoácidos más corta que la de un polipéptido cuya secuencia de residuos de aminoácidos se muestra en esta memoria descriptiva.
Cuando un polipéptido de la presente invención tiene una secuencia que no es idéntica a la secuencia de un ligando natural de \alpha_{v}\beta_{5}, es típicamente debido a que una o más sustituciones conservadoras o no conservadoras se han realizado, usualmente no más de aproximadamente 30 por ciento en número, y preferiblemente no más de 10 por ciento en número de los residuos de aminoácidos están sustituidos. También se pueden añadir residuos adicionales en cualquier extremo de un polipéptido con el propósito de proporcionar un "engarce" mediante el que los polipéptidos de esta invención se puede fijar convencionalmente a una marca o matriz sólida, o vehículo.
Las marcas, matrices sólidas y vehículos que se pueden usar con los polipéptidos de esta invención se describen en esta memoria descriptiva más adelante.
Los engarces de residuos de aminoácidos son usualmente al menos un residuo y puede ser 40 o más residuos, más a menudo 1 a 10 residuos, pero no forman epítopes de ligandos de \alpha_{v}\beta_{5}. Los residuos de aminoácidos típicos usados para la unión son tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico y ácido aspártico, o similares. Además, un polipéptido sujeto puede diferir, salvo que se especifique otra cosa, de la secuencia natural de un ligando de \alpha_{v}\beta_{5} mediante la secuencia que se está modificando por acilación del terminal NH_{2}, por ejemplo, acetilación, o amidación con ácido tioglicólico, mediante carboxilamidación terminal, por ejemplo, con amoníaco, metilamina, y las modificaciones terminales similares. Las modificaciones terminales son útiles, también conocidas, para reducir la susceptibilidad por digestión por proteinasa, y por lo tanto sirven para prolongar la semivida de los polipéptidos en soluciones, particularmente fluidos biológicos en los que pueden estar presentes las proteasas. A este respecto, la ciclación polipeptídica también es una modificación terminal útil, y se prefiere particularmente también debido a las estructuras estables formadas por ciclación y en vista de las actividades biológicas observadas para tales péptidos cíclicos como se describe en esta memoria descriptiva.
Cualquier péptido de la presente invención se puede usar en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los ácidos adecuados que son capaces de formar sales con los péptidos de la presente invención incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido trifluoroacético (TFA) ácido clorhídrico (HCl), ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido masónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido cinnámico, ácido naftaleno sulfónico, ácido sulfanílico o similares. La sal de HCl se prefiere particularmente.
Las bases adecuadas capaces de formar sales con los péptidos de la presente invención incluyen bases inorgánicas tales como hidróxido sódico, hidróxido amónico, hidróxido potásico y similares; y bases orgánicas tales como mono-, di-, y tri-alquil y aril aminas (por ejemplo, trietilamina, diisopropilamina, metilamina, diemtilamina y similares) y etanolaminas opcionalmente sustituidas (por ejemplo, etanolamina, dietanolamina y similares).
Un péptido de la presente invención también mencionado en esta memoria descriptiva como un polipéptido sujeto, se puede sintetizar mediante cualquiera de las técnicas que se conocen por los expertos en la técnica en la técnica de polipéptidos, incluyendo técnicas de ADN recombinante. Las técnicas de química sintética, tales como la síntesis de tipo Merrifield de fase sólida, se prefieren por razones de pureza, especificidad antigénica, libertad de los productos secundarios no deseados, facilidad de producción y similares. Un sumario excelente de las muchas técnicas disponibles se puede encontrar en Steward y col., "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky , y col., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, segunda edición, 1976; J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", vol. 2, p. 46, Academic Press (Nueva York), 1983; Merrifield, Adv. Enzymol., 32: 221-96, 1969; Fields y col., Int. J. Peptide Protein Res., 35: 161-214, 1990; y la patente de Estados Unidos Nº 4.244.946 para la síntesis de péptidos en fase sólida, y Schroder y col., "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (Nueva York), 1965 para síntesis en solución clásica, cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. Los grupos protectores adecuados que se pueden usar en tal síntesis se describen en los textos anteriores y en J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Nueva York, 1973.
En general, los procedimientos de síntesis en fase sólida contemplados comprenden la adición secuencial de uno o más residuos de aminoácidos o residuos de aminoácidos protegidos adecuadamente para desarrollar la cadena de péptidos. Normalmente, o bien el grupo amino o carboxilo del primer residuo de aminoácidos está protegido por un grupo protector selectivamente separable adecuado. Un grupo protector selectivamente separable, diferente se utiliza para aminoácidos que contienen un grupo secundario reactivo tal como lisina.
Usando de una síntesis de fase sólida como ejemplo, el aminoácido protegido o derivatizado se une a un soporte sólido inerte mediante su grupo carboxilo o amina no protegido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo se retira después selectivamente y el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (mino o carboxilo) adecuadamente protegido se mescal y se hace reaccionar en condiciones adecuadas para formar el enlace amida con el residuo ya unido al soporte sólido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo se retira después de este residuo aminoácido recientemente añadido, y el siguiente aminoácido (protegido adecuadamente) se añade después, y así sucesivamente. Después de que todos los aminoácidos deseados se han unido en la secuencia apropiada, cualquier grupo terminal y secundario que protege los grupos (y soporte sólido) se retira secuencialmente o simultáneamente para generar el polipéptido lineal final.
Los polipéptidos lineales preparados, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente se pueden hacer reaccionar para formar sus péptidos cíclicos correspondientes. Un procedimiento ejemplar para ciclar péptidos lo describen Zimmer y col., Peptides 1992, pp. 393-394, ESCOM Science Publishers, B. V. 1993, Típicamente, el éster metílico de péptido protegido con tercbutoxicarbonilo se disuelve en metanol y se añade solución de hidróxido sódico y la mezcla se hace reaccionar a 20ºC (20C) para retirar hidrolíticamente el grupo protector de éster metílico. Después de evaporar el disolvente, el péptido protegido con tercbutoxicarbonilo se extraer con acetato d eetilo del disolvente adecuado. El grupo protector tercbutoxicarbonilo se retira después en condiciones suavemente ácidas en codisolvente dioxano. El péptido lineal no protegido con extremos amino y carboxi libres así obtenidos se convierte en su péptido cíclico correspondiente haciendo reaccionar una solución diluida del péptido lineal, en una mezcla de diclorometano y dimetilformamida condiciclohexilcarbodiimida en presencia de 1-hidroxibenzotriazol y N-metilmorfolina. El péptido cíclico resultante se purifica después mediante cromatografía.
Un procedimiento de síntesis de péptidos cíclicos particularmente preferido lo describen Gurrath y col., Eur. J. Biochem., 210: 911-921 (1992), se describe en los ejemplos. Los péptidos particularmente preferidos para uso en los procedimientos presentes en tejidos que exhiben principalmente angiogénesis asociada a \alpha_{v}\beta_{5} se describen en los ejemplos, e incluyen los polipéptidos mostrados en las SEQ ID números 4, 6, 7, 8 y 9.
F. Procedimientos para identificar antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5}
La invención también describe procedimientos de ensayo para identificar antagonistas candidatos de \alpha_{v}\beta_{5} para uso de acuerdo con los procedimientos presentes.En estos procedimientos de ensayo las moléculas candidatas se evalúan para determinar su potencia en la inhibición de la unión de \alpha_{v}\beta_{5} a ligandos naturales, y además se evalúan para determinar su potencia en la inhibición de angiogénesis en un tejido.
El primer ensayo mide la angiogénesis en al membrana corioalantoica de pollo (CAM) y se denomina el ensayo de CAM. El ensayo de CAM lo han descrito en detalle otros, y además se ha usado para medir tanto la angiogénesis como la neovascularización de tejidos tumorales. Véase Ausprunk y col., Am. J. Pathol., 79: 597-618 (1975) y Ossonski y col., Cancer Res., 40: 2300-2309 (1980).
El ensayo de CAM es un modelo de ensayo reconocido para angiogénesis in vivo debido a que se produce la neovascularización del tejido entero. Los vasos sanguíneos de embrión de pollo reales se hacen crecer en la CAM o en el tejido desarrollado en la CAM.
Como se demuestra en esta memoria descriptiva, el ensayo de CAM ilustra la inhibición de la neovascularización basándose en tanto la cantidad como en el grado de vasos nuevos desarrollados. Además, es fácil de controlar el crecimiento de cualquier tejido transplantado tras la CAM, tal como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es particularmente útil debido a que existe un control interno para evaluar la toxicidad en el sistema de ensayo. El embrión de pollo se expone a cualquier reactivo de ensayo. Como tal, la salud del embrión es una indicación de toxicidad.
El segundo ensayo que mide la angiogénesis es el modelo de ojo de conejo in vivo y se denomina el ensayo de ojo de conejo. El ensayo de ojo de conejo se ha descrito en detalle por otros y se ha usado adicionalmente para medir tanto la angiogénesis como la neovascularización en presencia de inhibidores angiogénicos tal como talidomida. Véase, D'Amato, y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 4082-4085 (1994).
El ensayo de ojo de conejo es un modelo de ensayo bien reconocido para la angiogénesis in vivo debido a que el proceso de neovascularización, ejemplificado por los vasos sanguíneos de conejo que crecen desde el borde de la córnea en el interior de la córnea, se visualizan fácilmente a través de la córnea visualmente transparente del ojo. Adicionalmente, tanto el grado como la cantidad de estimulación o inhibición de la neovascularización o regresión de la neovascularización se puede controlar fácilmente durante el tiempo.
Finalmente, el conejo se expone a cualquier reactivo de ensayo y como tal la salud del conejo es una indicación de la toxicidad del reactivo de ensayo.
El tercer ensayo mide la inhibición de unión directa del ligando natural, vitronectina, a \alpha_{v}\beta_{5}, y se describe una realización preferida se describe en detalle en los ejemplos. El ensayo típicamente mide el grado de inhibición de unión de un ligando natural, tal como vitronectina, a \alpha_{v}\beta_{5} aislado en la fase sólida mediante ELISA, cuya inhibición está mediada por una inhibición específica de \alpha_{v}\beta_{5}.
De este modo, el ensayo también se puede usar para identificar compuestos que muestran especificidad para \alpha_{v}\beta_{5} y no inhiben los ligandos naturales de unirse a otras integrinas. El ensayo de especificidad se lleva a cabo desarrollando ensayos ELISA paralelos en los que tanto \alpha_{v}\beta_{5} como otras integrinas se seleccionan simultáneamente en cámaras de ensayo separadas por sus capacidades respectivas de unirse a un ligando natural por el compuesto candidato de inhibir las capacidades respectivas de integrinas de unirse a un ligando preseleccionado. Los formatos de ensayo de selección se describen en los ejemplos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos a que se refiere esta invención son ilustrativos y no se ceben considerar, de hecho, como limitantes específicamente de la invención. Además, tales variaciones de la invención, ahora conocidas o desarrolladas más tarde, que estarían dentro del alcance de los expertos en la técnica se han de considerar que caen dentro del alcance de la presente invención reivindicada en esta memoria descriptiva más adelante.
1. Preparación de anticuerpos monoclonales específicos de \alpha_{v}\beta_{5}
Los anticuerpos monoclonales, P1F6y P5H9, se produjeron usando procedimientos de hibridoma convencionales mediante inmunización en ratones RBF/DnJ con células de carcinoma de pulmón A549 como describen Wayner y col., J. Cell. Biol., 113: 919-929 (1991), cuya descripción se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. Los bazos se retiraron de los ratones inmunizados y se fusionaron con células de mieloma Ns-1/FOX-NY. Los hibridomas que producen anticuerpo dirigido a receptores de vitronectina de células de carcinoma se seleccionaron mediante la inhibición específica o adhesión de UCLA-P3 a superficies revestidas con vitronectina como describen Wayner y col., y se clonaron mediante dilución limitante sobre capas de alimentación de timocitos.
Tanto los anticuerpos monoclonales P1F6 como P5H9 se ha mostrado que inmunoreaccionan específicamente con el complejo de \alpha_{v}\beta_{5}, y no inmunorreaccionan con la subunidad \alpha_{v}, con la subunidad \beta_{5}, o con otras integrinas. El anticuerpo monoclonal P1F6 está comercialmente disponible de Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) y el monoclonal P5H9 está disponible del Dr. E. Wayner en el Instituto de investigación de Cáncer Fred Hutchinson, Seattle, WA.
Otros anticuerpos monoclonales de \alpha_{v}\beta_{5} para uso en esta invención se derivan de manera similar y se caracterizan como se describe en esta memoria descriptiva. Además, los anticuerpos monoclonales de \alpha_{v}\beta_{5} se producen mediante fusión de bazos aislados de ratones que recibieron inmunizaciones con el receptor de \alpha_{v}\beta_{5} o bien en forma impura o purificada. La purificación del \alpha_{v}\beta_{5} es un procedimiento bien conocido por los expertos en la técnica de la biología de integrinas y también lo han descrito Smith y col., J. Biol. Chem., 265: 11008-11013 (1990), cuya descripción se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. Una vez purificado, el receptor aislado se prepara como un inmunógeno para inmunizar ratones como se ha descrito en la sección E2 y como se prepara esencialmente como describen Kohler y Milstein, Nature., 256: 495-497 (1975), cuya descripción se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. Los clones de hibridoma resultantes se seleccionan para evaluar la reactividad con en inmunógeno y después se caracterizan como se describe en los siguientes ejemplos.
2. Caracterización de la especificidad del anti-\alpha_{v}\beta_{5} Anticuerpos monoclonales y uso en el mapeo de la distribución de tejidos de al expresión de \alpha_{v}\beta_{5} A. Especificidad por vitronectina
El anticuerpo monoclonal pH59 preparado en el ejemplo 1 lo muestran Wayner y col., J. Cell. Biol., 113: 919-929 (1991) para bloquear la unión de células de carcinoma UCLA-P3 a vitronectina mientras que no afecta la unión de células a colágeno o fibronectina. Las mismas células también se mostró que contenían solamente el receptor de vitronectina \alpha_{v}\beta_{5} y no uno con especificidad de \alpha_{v}\beta_{5}, inmunoprecipitando un heterodímero que consiste en una cadena \alpha (160 kDa) y una cadena \beta (95 kDa) con condiciones no reductoras. El receptor de \alpha_{v}\beta_{5} detectado por P5H9 también se mostró que media la adhesión de células de melanoma M21 y células de carcinoma H2981 a vitronectina. El anticuerpo monoclonal P2F6 tiene el mismo perfil de inmunorreactividad.
B. Inmunofluorescencia con anticuerpos de receptores anti-integrina
Durante la curación de heridas, las membranas basales de vasos sanguíneos expresan varias proteínas adhesivas, incluyendo el factor de von Willebrand, fibronectina, y fibrina. Además, varios miembros de la familia de integrina de receptores de adhesión se expresan sobre la superficie de células de músculo liso y endoteliales cultivadas. Véase, Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 6471 (1987); Janat y col., J. Cell Physiol., 151: 588 (1992); y Cheng y col., J. Cell. Physiol., 139: 275 (1989).
Además de la estructura y función de la subunidad \beta_{5} de integrina, la distribución de tejidos de la subunidad mediante mapeo con otros anticuerpos monoclonales anti-\beta_{5} la han descrito Pasqualini y col., J. Cell. Sci., 105: 101-111 (1993), cuya descripción se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia.
Los anticuerpos monoclonales específicos de la subunidad \beta_{5} descritos anteriormente, similares a los descritos en el ejemplo 1, se secretaron a partir de hibridomas que se prepararon usando esplenocitos de un ratón que recibió inmunizaciones con la línea celular de carcinoma de pulmón A549. Los hibridomas se seleccionaron por una tinción de superficie positiva de células A549 con el sobrenadante de cultivo de hibridomas y mediante inmunopercipitación de complejos de \alpha_{v}\beta_{5} de extractos de A549 marcados en superficie. Los anticuerpos monoclonales después se usaron para mapear la distribución de tejidos de la subunidad \beta_{5} en timo humano normal, piel y riñón. Se cortaron cuatro secciones gruesas de bloques de tejidos congelados sobre un microtomo con criostato para tinción posterior por inmunoperoxidasa estreptavidina-biotina con anticuerpos específicos para las integrinas \beta_{5} realizada como se describe en la referencia de Pasqualini y col.
La tinción de secciones de timo mostró que la distribución de \beta_{5} sobre vasos sanguíneos, corpúsculos de Hazla, células de estroma cortical y medular, y membranas basales. Las secciones de piel mostraron \beta_{5} sobre la capa basal de la epidermis de la epidermis y sobre las paredes de los vasos sanguíneos dérmicos, y secciones de riñón mostraron tinción de regiones glomerulares, el aparato yuxtaglomerular, túbulos convolutos proximales y túmulos de recolección. De este modo, la distribución de \beta_{5} es heterogénea para diferentes tipos de células incluyendo, y más importantemente, sobre células endoteliales capilares, cuya tinción era consistente con la tinción de células endoteliales cultivadas de la vena umbilical.
C. Inmunofluorescencia de tejido retinal humano de pacientes con enfermedad ocular con anticuerpos de receptores anti-integrina
La neovascularización ocular es el cambio patológico más común observado en la vasta mayoría de enfermedades oculares que dan como resultado la pérdida catastrófica de visión. El crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos coroidales, retinales o paralimbales preexistentes pueden conducir a edema, hemorragia o formación de membrana fibrovascular que da como resultado la interrupción de relaciones anatómicas normales del ojo y pérdida simultánea de la función visual normal.
En condiciones fisiológicas, la angiogénesis está altamente regulada y se ha mostrado que se activa por citoquinas angiogénicas específicas tales como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor \alpha de necrosis tumoral (TNF-\alpha). Como describen Brooks y col., Science, 264: 569-571 (1994), anticuerpos monoclonales contra \alpha_{v}\beta_{5} se ha mostrado que bloquean la angiogénesis inducida tanto por el bFGF- como el TNA-\alpha en sistemas de modelo que incluyen el modelo de CAM descrito más adelante. Como se describe en los ejemplos 4-6, los anticuerpos monoclonales contra \alpha_{v}\beta_{5} bloquean una ruta separada de angiogénesis, específicamente la inducida por el factor de crecimiento endotelial (VEGF), factor transformador \alpha de crecimiento (TGF-\alpha) y factor de crecimiento epidérmico (EFG).
De este modo, como se describe en esta memoria descriptiva en el contexto de la presente invención, se definen dos rutas de angiogénesis por distintas integrinas, \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}. Para investigar la expresión y papel de estas integrinas en una enfermedad ocular humana, se obtuvieron membranas neovasculares epirretinales y membranas neovasculares subrretinales en conjunto en la vitrectomía a partir de pacientes con retinopatía diabética proliferativa (PDR). Estos pacientes se han seguido clínicamente y se seleccionaron para evaluación histológica en base a tener enfermedad activa, proliferativa documentada por examen clínico y angiografía por fluoresceína de fondo. El tejido obtenido se congeló inmediatamente en Tissue Tek crioconservado y seccionado.
Cuando los tejidos de estos pacientes se examinaron mediante inmunofluorescencia, los vasos sanguíneo eran positivos para la integrina \alpha_{v}\beta_{3} como se indica por inmunorreactividad con el anticuerpo monoclonal de ratón LM609. La distribución de integrina parecía estar restringida a vasos sanguíneos y coincidían con la tinción para un marcador de vasos sanguíneos, factor de von Willebrand, como se mapea con un anticuerpo de conejo para el factor. Los sitios de inmunorreactividad se visualizaron con o bien inmunoglobulina de anti-ratón conjugada a rodamina o inmunoglobulina de anti-conejo conjugada a fluoresceína, el uso de ambos permitió la co-localización de la localización de la integrina y anticuerpos específicos de vasos sanguíneos.
Las muestras obtenidas de ojos normales o pacientes con membranas atróficas libres de vasos sanguíneos activamente proliferadotes eran negativos para la integrina \alpha_{v}\beta_{3} mediante inmunofluorescencia.
En paralelo, los mismos tejidos se analizaron inmunohistoquímicamente para la presencia y distribución de \alpha_{v}\beta_{5} con el anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{v}\beta_{5}, p1F6, preparado en el ejemplo 1. La tinción reveló que \alpha_{v}\beta_{5} estaba presente en los vasos sanguíneos que se co-localizan con la distribución del factor von Willebrand. Sin embargo, el tejido no vascular también mostró fluorescencia limitada con el anticuerpo P1F6 indicando una distribución más amplia de \alpha_{v}\beta_{5}. Esto estaba en contraposición con la presencia de \alpha_{v}\beta_{3} que estaba limitada a vasos sanguíneos.
Cuando la tinción inmunofluorescente de membrana se comparó entre \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} con los anticuerpos respectivos LM609 y P1F6, el patrón de tinción sobre la pared de los vasos sanguíneos era virtualmente idéntico que tanto \alpha_{v}\beta_{3} como \alpha_{v}\beta_{5} se muestran en la superficie de vasos sanguíneos humanos de nueva proliferación presentes en enfermedades oculares neovasculares tales como retinopatía diabética.
Los resultados descritos en esta memoria descriptiva muestran de esta manera que el receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{5} se expresa selectivamente en tipos de tejido específicos en el que se produce la angiogénesis, tal como la observada con membranas neovasculares de pacientes que tienen enfermedad activa, proliferativa, neovascular. Estos tejidos, junto con los tejidos expuestos a factores de crecimiento particulares como se describe más adelante en los ejemplos 4-6, por lo tanto proporcionan dianas ideales para aspectos terapéuticas de esta invención.
3. Preparación de péptidos sintéticos
Los polipéptidos cíclicos usados en la práctica de los procedimientos de esta invención cuando se sintetizan usando técnicas de síntesis convencionales en fase sólida como, por ejemplo, descritos por Merrifield, Adv. Enzymol., 32: 221-296 (1969), y Fields, G. B. y Noble, R, L. Int. J. Peptide Protein Res., 35: 161-214 (1990).
Dos gramos (g) de BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OMe (SEQ ID Nº 1) primero se disolvieron en 60 ml (ml) de metanol al que se añadieron 1,5 ml de solución de hidróxido sódico 2 N formando una mezcla. Después la mezcla se agitó durante 3 horas a 20 grados centígrados 20 C). Después de la evaporación, el residuo se recogió en agua y se acidificó hasta pH 3 con HCl diluido y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se evaporó de nuevo y el BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH resultante (SEQ ID Nº 2) se agitó a 20ºC durante 2 horas con 20 ml de HCl 2 N en dioxano. La mezcla resultante se evaporó obteniendo H-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH (SEQ ID Nº 3) que se disolvió posteriormente en una mezcla de 1800 ml de diclorometano y 200 ml de dimetilformamida (DMF) seguido de enfriamiento hasta 0ºC.
Después, se añadieron secuencialmente con agitación 0,5 g de diciclohexilcarbodiimida (CDCl), 0,3 g de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y 0,23 ml de N-metilmorfolina.
La mezcla resultante se agitó durante otras 24 horas a 0ºC y después a 20ºC durante todavía otras 48 horas. La solución se concentró y se trató con un intercambiador de iones de lecho mixto para retirar las sales. Después la resina resultante se retiró mediante filtración, la solución transparente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía dando como resultado la recuperación de ciclo (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (también enumerado en código de letras individuales como c-RGDfV) (SEQ ID Nº 4). Las letras minúsculas en el péptido indican la forma D del aminoácido y no la forma L como se indica por letras mayúsculas.
El péptido de control cíclico, ciclo (Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (también enumerado en código de letras minúsculas como RADfV) (SEQ ID Nº 5) se preparó como se ha descrito anteriormente. El péptido cíclico c-RADfV (SEQ ID Nº 5) se ha mostrado previamente que inhibe la unión de fibrinógeno a la integrina \alpha_{v}\beta_{3}, y que no inhibe la unión de fibrinógeno a las integrinas \alpha_{IIb}\beta_{3} o \alpha_{5}\beta_{1}(Pfaff, y col., J. Biol. Chem., 269: 20233- 20238, 1994).
Otros péptidos que son inhibidores específicamente para la unión de ligandos naturales a \alpha_{v}\beta_{5} se preparan de manera similar para evaluar la especificidad e intervalo de actividad como se describen en los siguientes ejemplos. Éstos incluyen los siguientes péptidos que se obtuvieron de manera análoga: ciclo (Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEQ ID Nº 6) y ciclo (Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID Nº 7). El péptido que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe (SEQ ID Nº 8) también se preparó de manera sintética.
4. Inhibión de Angiogénesis inducida por el factor de crecimiento con antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} como se mide mediante ensayo de modelo de ojo de conejo in vivo
El efecto de los antagonistas anti-\alpha_{v}\beta_{5} sobre la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento se pueden observar en estructuras normalmente naturales como se ejemplifica por la córnea del ojo. Nuevos vasos sanguíneos crecen desde el borde de la córnea, que tiene un rico suministro de sangre, hacia el centro de la córnea, que normalmente no tiene vasos sanguíneos. Los estimuladores de angiogénesis, tales como VEGF y TGF-\beta, cuando se aplica a la córnea inducen el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos desde el borde de la córnea. Los antagonistas de la angiogénesis, aplicados a la córnea, inhiben el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos desde el borde de la córnea. De este modo, la córnea experimenta angiogénesis a través de una invasión de células endoteliales desde el borde de la córnea en el duro tejido córneo compactado de colágeno que se visualiza fácilmente. El ensayo de modelo de ojo de conejo por lo tanto proporciona un modelo in vivo para la observación directa de estimulación e inhibición de angiogénesis después de la implantación de compuestos directamente en la córnea del ojo.
A. Ensayo de modelo de ojo de conejo in vivo 1. Angiogénesis inducida por factores de crecimiento
La angiogénesis se indujo en el ensayo de modelo de ojo de conejo in vivo con factores de crecimiento y se describe a continuación.
a. Preparación de gránulos Hydron que contienen factor de crecimiento y anticuerpos monoclonales
Los gránulos Hydron que contienen factor de crecimiento y anticuerpos monoclonales (mAbs) se prepararon como describen D'Amato, y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 4082-4085 (1994). Los gránulos individuales contenían 750 ng del factor de crecimiento (llamado también citoquina), específicamente o bien bFGF o VEGF, unido a sucralfato (carafato) (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation, Cincinnati, OH) para estabilizar las citoquinas y asegurar su lenta liberación en el tejido circundante. Además, los gránulos de Hydron se prepararon de manera que contuvieran o bien 40 \mug del mAb P1F6 (anti-\alpha_{v}\beta_{5}) o el anticuerpo control, LM609 (anti-\alpha_{v}\beta_{3}), en PBS.
Todos los mAbs ensayados se purificaron a partir de fluido de ascitos usando cromatografía en columna de afinidad Proteína-A Sefarosa CL-4B de acuerdo con procedimientos bien conocidos. La inmunoglobulina eluida se dializó después contra PBS y se trató con Detoxi-gel (Pierce Chemicals, Rockford, IL) para retirar endotoxina. La endotoxina se ha mostrado que es un potente estimulante angiogénico e inflamatorio. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales se ensayaron para evaluar la presencia de endotoxina con el ensayo de lisado de amebocitos de límulo cromogénico (BioWhittaker, Walkersville, MD) y solamente aquellos mAbs sin endotoxina detectable se usaron en el ensayo de modelo de ojo de conejo.
Los gránulos se moldearon en estaquillas de Teflón preapartas especialmente que tenían un núcleo de 2,5 mm en sus superficies. Aproximadamente 12 \mul de material moldeado se colocaron en cada estaquilla y se polimerizaron durante toda una noche en una caperuza estéril. Después los gránulos se esterilizaron mediante irradiación ultravioleta.
Se usaron una serie de ocho animales para experimentos de pares de ojos en los que cada animal recibía un implante de Hydron que contenía una citoquina preseleccionada con un anticuerpo o inmunoglobulina control. Específicamente, para cada conejo, se implantó quirúrgicamente una córnea con un gánulo de Hydron que contenía o bien bFGF o VEGF junto con mAB P1F6 y la otra córnea se trató con o bien bFGF o VEGF junto con mAB LM609. Los gránulos individuales se implantaron en "bolsillos" creados quirúrgicamente formados en el estroma medio de la córnea de los conejos. El procedimiento quirúrgico se hizo bajo una técnica estéril usando un microscopio operativo Wild modelo M691 equipado con un divisor de haz al que se montó una cámara para registrar fotográficamente las córneas individuales. Un "bolsillo" de 3 mm por 5 mm se creó en el estroma corneal realizando una incisión de 3 mm hasta la mitad del espesor de la córnea con cuchillas 69 de Beaver. El estroma se diseccionó periféricamente usando una espátula para iris y el gránulo se implantó con su margen periférico de 2 mm desde el limbo.
Durante los 12 días siguientes, las citoquinas y mAbs se difundieron desde los gránulos implantados en el tejido circundante efectuando por lo tanto angiogénesis desde el borde de la córnea.
Las córneas derecha e izquierda se denominan respectivamente OS y OD. Las córneas se observaron después durante 12 días. Se tomaron fotografías después de la operación el día 10, momento en el que la neovascularización era máxima.
Los resultados fotográficos representativos de los tratamientos anteriores con mezclas de citoquina/mAb se muestran en las figuras 1 A-1 D. La cuantificación paralela de la inhibición de mAb angiogénesis inducida por citoquina se muestra en las figuras 2 A y 2 B. En las figuras 1 A y 1 D, en las que las córneas se expusieron respectivamente a combinaciones bFgF/P1F6 y VEGF/LM606, la angiogénesis inducida por citoquinas con edema es prominente como se indica por las flechas grandes. Por lo tanto, el anticuerpo \alpha_{v}\beta, P1F6, no era eficaz en la angiogénesis inducida por bFGF. De manera similar, el anticuerpo de \alpha_{v}\beta_{3}, LM609, no era eficaz en la angiogénesis inducida por VEGF.
Por el contrario, cuando las combinaciones de citoquina/mAb de bFGF/LM609 y VEGF/P1F6 se usaron en el modelo de conejo, la angiogénesis inducida por citoquinas estaba inhibida por los anticuerpos como se muestra en las figuras 1 B y 1 C, respectivamente. En estas figuras, los vasos del limbo conjuntivos normales indicados por las flechas pequeñas se muestran indicando la eficacia de los anticuerpos de integrina en la inhibición de un tipo de angiogénesis inducida por citoquinas.
Los efectos de inmunorreactividad específica de integrina de mAb sobre la angiogénesis inducida por citoquinas también se cuantifica como se muestra en las figuras 2 A y 2 B. La angiogénesis se estimuló con o bien bFGF o VEGF se muestran respectivamente en las figuras 2 A y 2 B. Los ojos tratados se fotografiaron diariamente mediante un microscopio operativo Wild equipado con una cámara Nikon. Las fotografías se registraron en una película de diapositiva Kodak Ektachrome 64 T y las imágenes se convirtieron para cuantificación asistida por ordenador usando el software Molecular Analyst 1.1 de Biorad después de la adquisición a través de un densitómetro de formación de imágenes Modelo Gs670. Ilustrando los histogramas el área media neovascular +/- el erroe estándar (n = 8 para cada uno de las dos series) después de la exposición a lso mAbs P1F6 o LM609.
Como se muestra en la figura 2 A, Lm609 redujo la angiogénesis inducida por bFGF en el 86% (p < 0,005, ensato t apareado) cuando se compara con el tratamiento ojo apareado en el mismo animal con P1F6. Cuando se usó VEGF para estimular la angiogénesis como se muestra en la figura 2 B, se observó el efecto opuesto en el que P1F6 redujo el área media de neovascularización en un 60% (p < 0,03, ensayo de t apareado) comparado con el ojo tratado con LM609 que tenía efecto sobre la angiogénesis inducida por VEGF.
De manera significativa, solamente los nuevos vasos sanguíneos inducidos por citoquinas se efectuaron mediante exposición a un mAb particular mientras que los vasos del perilimbo preexistentes no se afectaron por o bien mAb sugiriendo que los efectos observados están restringidos a los vasos sanguíneos de formación recientemente de la córnea.
Se realizan ensayos similares con péptidos sintéticos preparados en el ejemplo 3 y como se describen para uso en la inhibición de la angiogénesis inducida por citoquinas que se correlaciona específicamente con la expresión de \alpha_{v}\beta_{5}.
Para confirmar estos resultados que indican que la angiogénesis inducida por una citoquina particular se efectuaba solamente por un tipo de anticuerpo anti-integrina, específicamente ese receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{5} juega un papel en la angiogénesis inducida por VEGF, otro modelo neovascular de la membrana corioalantoica de pollo (CAM) se evaluó con las combinaciones de citoquinas y anticuerpos de integrinas como se muestra en el siguiente ejemplo.
5. Angiogénesis en la preparación de membrana corioalantoica de pollo (CAM) A. Caracterización de la CAM no tratada 1) Preparación de la CAM
La angiogénesis se puede inducir sobre la membrana corioalantoica de pollo (CAM) después de angiogénesis embrionaria normal haya dado como resultado la formación de vasos sanguíneos. La angiogénesis se ha mostrado que se induce en respuesta a citoquinas específicas o fragmentos de tumores como describen Leibovich y col., Nature., 329: 630 (1987) y Ausprunk y col., Am. J. Pathol., 79: 597 (1975). Las CAM se prepararon a partir de embriones para la posterior inducción de angiogénesis e inhibición de la misma como se describe más adelante en el ejemplo 6 con los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} de esta invención.
Los embriones de pollo de diez días se obtuvieron de McIntyre Poultry (Lakeside, CA) y se incubaron a 37ºC con 60% de humedad. Se realizó un agujero pequeño a través de la cáscara en el extremo del huevo directamente sobre l saco de aire con el uso de una pequeña broca manual (Dremel, División de Emerson Electric Co., Racine, WI). Se perforó un segundo agujero en el lado ancho del huevo en una región desprovista de vasos sanguíneos embrionarios determinados previamente mirando al trasluz el huevo, que dio como resultado la CAM (membrana corioalantoica) arrancando la membrana de la cáscara y creando un saco de aire falso sobre la CAM. Se cortó una ventana de 1,0 centímetro (cm) x 1,0 centímetro cuadrado a través de la cáscara sobre la CAM descendida con el uso de una pequeña rueda de molienda de modelo pequeño (Dremel). La ventana pequeña permitió el acceso directo a la CAM subyacente.
Después preparación de la CAW resultante se usó a los 10 días de embriogénesis cuando al angiogénesis había disminuido. De esta manera la preparación se usó en esta invención para inducir angiogénesis renovada en respuesta a tratamiento por citoquinas.
2. Histología de la CAM
Para analizar la estructura microscópica de las CAM de embriones de pollo, secciones de seis micrones (\mum) de espesor se cortaron a partir de bloques congelados sobre un microtomo con criostato para análisis de inmunofluorescencia.
Típico de una CAM de 10 días sin tratar es un área desprovista de vasos sanguíneos. Una angiogénesis en el sistema de CAM disminuye en esta fase de embriogénesis, el sistema es útil en esta invención para estimular con diversas citoquinas la producción de nueva vascularización a partir de vasos existentes a partir de las áreas existentes en las áreas de la CAM que actualmente carecen de vasos.
Como se muestra en el modelo de CAM y en los siguientes ejemplos, aunque los vasos sanguíneos que experimentan nuevos crecimiento en la embriogénesis normal o inducido por citoquinas, los vasos sanguíneos expresan \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}.
B. Angiogénesis inducida por factores de crecimiento
La angiogénesis se ha mostrado que se induce por citoquinas o factores de crecimiento como se describe en el ejemplo 4 A en el modelo de ojo de conejo. En los experimentos descritos en esta memoria descriptiva, la angiogénesis en la preparación corneal de conejo descrita en el ejemplo 4 se inducía de manera similar por los factores de crecimiento que se aplicaron por vía tópica sobre los vasos sanguíneos de la CAM como se describe en esta memoria descriptiva.
La angiogénesis se indujo colocando un disco de filtro Whatman de 5 milímetros (mm) x 5 mm (papel de filtro Whatman Nº 1) saturado con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) o citoquinas preseleccionadas que contienen HBSS a una concentración preseleccionada, es decir, una para ensatar el efecto de angiogénesis, sobre la CAM de un embrión de pollo de 10 días en una región desprovista de vasos sanguíneos y las ventanas de sellaron posteriormente con cinta. La angiogénesis se controló mediante un fotomicroscopio después de 72 horas. Las CAM se congelaron de manera repentina después se fijaron secciones congeladas de 6 \mum con acetona y se tiñeron mediante inmunofluorescencia como se describe en el ejemplo 2 A y 2 B con 10 \mug/ml de anticuerpos seleccionados anti-integrina, incluyendo los dirigidos contra \alpha_{v}\beta_{5} como se describe en el ejemplo 1.
Los estudios previos por Brooks y col., Science, 264: 569-571 (1994), han mostrado que los vasos sanguíneos son fácilmente evidentes en las preparaciones tratadas tanto con bFGF como TNF-\alpha pero no están presentes en la CAM sin tratar. Los autores también han mostrado que la expresión de \alpha_{v}\beta_{5} se potenciaba después de la angiogénesis inducida por bGF. Aunque la expresión de la integrina \beta_{1} no cambió de la observada en una CAM no tratada, \beta_{1} también era fácilmente detectable sobre vasos sanguíneos estimulados.
Estos hallazgos publicados indicaban que tanto en seres humanos como pollo, los vasos sanguíneos implicados en la angiogénesis muestran la expresión de \alpha_{v}\beta_{3}. Consistente con esto, la expresión de \alpha_{v}\beta_{3} en células endoteliales cultivadas se indujo mediante diversas citoquinas in vitro como describen Janat y col., J. Cell. Physiol., 151: 588 (1992); Enenstein y col., Exp. Cell Res., 203: 499 (1992) y Swerlick y col., J. Invest. Derm., 99: 715 (1993).
En esta invención, una ruta separada mediada por citoquinas para estimular la angiogénesis que es dependiente de la expresión y activación de un receptor de integrina adhesivo, \alpha_{v}\beta_{5}, no se ha determinado ahora. El efecto de exposición de una CAM como se ha descrito en esta memoria descriptiva a las citoquinas VEGF, TGF-\alpha y EGF en relación con la expresión de \alpha_{v}\beta_{5}, a angiogénesis e inhibición de la misma con antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} se describe en el ejemplo 6.
C. Angiogénesis inducida por tumores
Para investigar el papel de \alpha_{v}\beta_{5} en la angiogénesis inducida por tumores, se usan diversos fragmentos de melanoma y carcinoma humanos \alpha_{v}\beta_{5}- negativos en el ensayo de CAM que se desarrollan previamente y se aíslan a partir de la CAM del embrión de pollo de 17 días como describen Brooks y col., J. Cell. Biol., 122: 1351 (1993) y como se describe en esta memoria descriptiva.
La angiogénesis se induce en el sistema de ensayo de CAM mediante aposición directa de un fragmento de tumor sobre la CAM. La preparación de la CAM de embrión de pollo es idéntica al procedimiento descrito anteriormente. En lugar de un disco de papel de filtro, un fragmento de peso de 50 miligramos (mg) a 55 mg de un tumor \alpha_{v}\beta_{5}-negativo que se produce por crecimiento de suspensiones de líneas celulares descritas más adelante, se coloca en la CAM en un área desprovista originalemente de vasos sanguíneos.
Las líneas celulares, rabdomiosarcoma, mieloide (líneas celulares HL-60 o KG) las describen Pasqualini y col., J. Cell. Sci., 105: 101-111 (1993), se usan para desarrollar los tumores humanos sólidos sobre las CAM de embriones de pollos. Una suspensión de células individuales de las diversas líneas celulares se aplican primero a las CAM en un volumen total de 30 \mul de HBSS estéril. Las ventanas se sellan con cinta y los embriones se incuban durante 7 días para permitir el crecimiento de lesiones tumorales humanas. Al final de los 7 días, ahora un embrión de 17 días, los tumores se vuelven a seccionar de la CAM y se recortan sin tejido de CAM circundante. Los tumores de cortan en rodajas en fragmentos de tumor de 50 mg a 55 mg para uso en angiogénesis. Los fragmentos de tumor se colocan en un nuevo conjunto de CAM de embriones de pollo de 10 días como se describe en el ejemplo 5 en un área desprovista de vasos sanguíneos.
Los tumores desarrollados in vivo sobre las CAM de embriones de pollo con y sin aplicación tópica o intravenosa de citoquinas inductoras de \alpha_{v}\beta_{5} (VEGF, TGF-\alpha, o EGF) se tiñen después para evaluar la expresión de \alpha_{v}\beta_{5}) con los mAbs, P1F6 o P5H9, como se ha descrito previamente. Después estas preparaciones de tumores de CAM se tratan posteriormente como se describe en el ejemplo 6C y 6D para medir los efectos de anticuerpos y péptidos sobre la angiogénesis inducida por tumores.
En una realización, las células de melanoma de hámster, CS-1, obtenidas del Dr. Damsky se la Universidad de California en San Francisco, se usaron en el ensayo de CAM como se ha descrito anteriormente para la formación de tumores de melanoma. Después de la transferencia de aproximadamente un fragmento de tumor de CS-1 de 50 mg sobre una nueva CAM de embrión de polo de 10 días, preparaciones separadas recibieron una inyección intravenosa de o bien 100 \mug o 300 \mug de anticuerpo P1F6, anticuerpo LM609 o anticuerpo control CSAT (anti-\beta1). Un control adicional
incluía una preparación que no recibe tratamiento. Los resultados de describen en el ejemplo 6 D más adelante.
6. Inhibición de angiogénesis medida en el ensayo de CAM A. Inhibición de angiogénesis inducida por factor de crecimiento mediante aplicación intravenosa de inhibidores
El efecto de Angiogénesis inducida por factor de crecimiento con anticuerpo monoclonales inyectados por vía intravenosa en la preparación de CAM se evaluó para uso como sistema de modelo in vivo de esta invención.
Después de la neovascularización activa, una vez que los vasos se han parado de desarrollar, la expresión de \alpha_{v}\beta_{5} disminuye hasta niveles no detectables mediante análisis por inmunofluorescencia. Esta regulación de la expresión de \alpha_{v}\beta_{5} en vasos sanguíneos que padecen angiogénesis en contraste a la carencia de expresión en vasos maduros proporciona la única capacidad de esta invención de controlar e inhibir la angiogénesis como se muestra más adelante como se modela en el ensayo de angiogénesis de CAM.
La preparación de las CAMs de embrión de pollo para inyecciones intravenosas era esencialmente como se ha descrito anteriormente.
Se indujo primero angiogénesis sobre los embriones de pollo de 10 días de edad mediante la aplicación de discos de filtro saturados con factor de crecimiento. Específicamente en los primeros ensayos, se indujo angiogénesis mediante exposición a o bien bFGF o VEGF, cada uno a concentración de 150 ng/ml.
Para aplicación de factores de crecimiento, durante los procedimientos de observación al trasluz, vasos sanguíneos prominentes se seleccionaron y se realizaron marcas en la cáscara del huevo para indicar sus posiciones. Los agujeros se perforaron en la cáscara, las CAM se hicieron descender y papeles de filtro saturados con factor de crecimiento se colocaron después separadamente sobre las CAM descritas anteriormente. Las ventanas se sellaron con cinta estéril y los embriones se volvieron a colocar en el incubador.
Veinticuatro horas más tarde, se cortó cuidadosamente una segunda ventana pequeña en el lado lateral de la cáscara del huevo directamente sobre los vasos sanguíneos prominentes seleccionados previamente. El exterior de la cáscara del huevo se retiró cuidadosamente dejando las membranas embrionarias intactas. La membrana de la cáscara se hizo transparente con una pequeña gota de aceite mineral (Perkin-Elmer Corp. Norwalk, CT) que permitió que los vasos sanguíneos se visualizaran fácilmente. después, solución salina tamponada con fosfato (PBS), 75 \mug de anticuerpos estériles anti-integrina o 75 \mug de péptidos sintéticos (péptico cíclico RGDfV, SEQ ID Nº 4 y péptido cíclico RADfV, SEQ ID Nº 5) en PBS se inyectaron en vasos sanguíneos aparentes sobre las CAM inducidas por factor de crecimiento. Las ventanas se sellaron con cinta y los embriones se dejaron en incubación hasta 72 horas.
Los discos de filtros y tejidos de CAM circundante representativo se fotografiaron en un microscopio estéreo (figuras 3A-3F y figuras 5A-5F) y se determinó el índice medio angiogénico +/- el error estándar para 12 CAM por condición (figuras 6A-6B). La angiogénesis se puntuó para cada embrión se una manera de doble ciego analizando el número y grado de ramificación de vasos sanguíneos dentro del área de cada disco. Las puntuaciones variaban entre 1 (bajo) y 4 (alto) y el índice de angiogénesis se determinó restando un fondo de e de todos los datos.
La especificidad de la inhibición mediada por anticuerpos de integrina de angiogénesis inducida por factor de crecimiento en el modelo de CAM reflejaba la observada en el modelo de córnea de conejo descrito anteriormente. Como se muestra respectivamente en las figuras 3 A y 3 B, tanto bFGF y VEGF provocaban angiogénesis en la CAM tratada con PBS control. Sin embargo, el tratamiento con el anticuerpo específico de \alpha_{v}\beta_{5}, P1F6, dio como resultado la inhibición de angiogénesis inducida por VEGF como se muestra en la figura 3 D mientras que no se detectó ninguna inhibición en la angiogénesis inducida por bFGF como se observa en la figura 3 C. Por el contrario, el anticuerpo específico de \alpha_{v}\beta_{3} LM609 inhibía l a angiogénesis inducida por bFGF (figura 3 E) pero tenía poco efecto sobre la angiogénesis en la CAM inducida por VEGF (figura 3 F).
Estos resultados se muestran también en el gráfico de barras de las figuras 4 A y 4 B, respectivamente para las CAM tratadas con tanto bFGF como VEGF, en las que el índice de angiogénesis se representa gráficamente contra la exposición a o bien LM609 o P1F6 junto con la no exposición de anticuerpos como control. De este modo, la inhibición de angiogénesis inducida por factor de crecimiento depende de del tipo de factor de crecimiento.
La exposición a péptidos que contienen RGD soporta los resultados anteriores. En presencia de PBS, como se muestra en las figuras 5 A y 5 B, exposición a tanto bFGF como VEGF dio como resultado angiogénesis en la CAM control. Por el contrario, el antagonista del péptido cíclico RGDfV (SEQ ID Nº 4), dirigida a tanto \alpha_{v}\beta_{3} como \alpha_{v}\beta_{5}, suprimía la angiogénesis inducida por o bien bFGF o VEGF. El péptido cíclico RADfV (SEQ ID Nº 5) no efectuaba angiogénesis en las preparaciones de CAM tratadas con o bien bFGF o VEGF. Los resultados también se muestran en las figuras 6 A y 6 B en las que el índice de angiogénesis de las CAM inducidas por bFGF y VEGF se representan gráficamente mostrando la exposición a péptidos de ensayo y control. De esta manera, estos hallazgos junto con aquellos en las córneas de conejo indican que la angiogénesis inducida por bFGF y VEGF dependen de integrinas específicas de \alpha_{v} distintas pero homólogas que sin embargo se pueden inhibir ambas con el péptido cíclico
RGDfV.
Se realizan ensayos similares adicionales con péptidos sintéticos preparados como se describe en el ejemplo 3 para definir péptidos que muestran especificidad a angiogénesis correlacionada con \alpha_{v}\beta_{5} y no a \alpha_{v}\beta_{3}. Los ensayos también se realizan con moléculas orgánicas preparadas como se describe en el ejemplo 10.
La especificidad de la inhibición de anticuerpos por integrinas de la angiogénesis inducida por factor de crecimiento se confirmó adicionalmente y se reforzó mediante la extensión de análisis de inducción de angiogénesis por el factor de crecimiento que incluiye el factor \alpha de necrosis tumoral (TNF- \alpha) o el éster forbol, 4-\beta-frobol-12-miristato-13-acetato (PMA).
Los factores de crecimiento anteriores (citoquinas), que incluyen bFGF y VEGF, se aplicaron separadamente a una concentración de 1,0 \mug/ml al modelo de CAM de 10 días de edad como se ha descrito previamente. PMA se usó a una concentración de 20 ng/ml.
24 horas después del tratamiento con factor de crecimiento, los anticuerpos, LM609 y P1F6, o el inhibidor de la proteína quinasa C (PKC), calfostin C, se proporcionaron separadamente al modelo de CAM, o bien mediante una sola dosis intravascular como se describe anteriormente o mediante administración tópica como se describe más adelante en el ejemplo siguiente. Para inyecciones intravasculares durante el período consecutivo de los 3 días siguientes, los anticuerpos se usaron a una concentración de 75 \mug por embrión y la calfostin C estaba a una dosis de 100 nM.
El día 13, los discos de filtro y tejido de CAM asociado se diseccionaron y analizaron para evaluar la Angiogénesis con un microscopio estéreo. La angiogénesis se puntuó de una manera de doble ciego analizando el número y grado de ramificación de los vasos sanguíneos dentro del área de los discos. Las puntuaciones variaban entre baja (1) a alta (4). El índice de angiogénesis se determinó restando una puntuación de fondo de 1 de todos los datos. Los experimentos se repitieron 2-4 veces con 5-6 embriones por condición.
Como se muestra respectivamente en las figuras 7 A y 7 B, el anticuerpo de \alpha_{v}\beta_{3}, LM609, bloqueaba la angiogénesis en reexpuesta a bFGF y TNF-\alpha mientras que el anticuerpo de \alpha_{v}\beta_{5}, P1F6, tenía poco efecto inhibitorio. Por el contrario, como se muestra en las figuras 7 C-7 E respectivamente, P1F6 era eficaz en al inhibición de angiogénesis inducida por VEGF, TGF-\alpha, o PMA mientras que LM609 no lo hacía.
PMA, un inductor potente de la angiogénesis, es capaz de activar la proteína quinasa C (PKC), una familia intracelular de la serina treonina quinasas. Por lo tanto, los inventores también examinaron los efectos de calfostin C, n inhibidor de las PKC, sobre la angiogénesis en las CAM de pollo. El calfostin C bloqueaba la angiogénesis inducida por PMA (figura 7 y 7 D) mientras que tenían efectos mínimos sobre la angiogénesis mediada por bFGF y TNF-\alpha (mostrado respectivamente en las figuras 7 A y 7 B).
Juntos, estos resultados indican la existencia de dos rutas de angiogénesis diferentes en las que una es dependiente de una señal mediada por \alpha_{v}\beta_{5} que es en gran medida independiente de PKC, como han descrito previamente Brooks y col., Science, 264: 569-571 (1994), y una segunda ruta está potenciada por una señal de transducción que depende críticamente de la activación de PKC.
Además de los experimentos anteriores, para determinar la localización de los mAbs P1F6 y LM609 en tejidos de CAM que se inocularon por vía intravenosa con LM609, las secciones fijadas se bloquean con BSA al 2,5% en HBSS durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de tinción con dilución 1:250 de anticuerpo secundario marcado con rodamina de cabra anti-ratón (Tago). Después las secciones se analizan con microscopio compuesto de inmunofluorescencia Zeiss.
B. Inhibición de Angiogénesis inducida por factor de crecimiento mediante aplicación tópica de inhibidores
Para determinar si \alpha_{v}\beta_{5} juega un papel activo en la angiogénesis, discos de filtro saturados con factores de crecimiento descritos anteriormente se colocan sobre CAM para inducir Angiogénesis seguido de aplicaciones de o bien O1F6 o LM609.
Los discos se tratan después con 50 ml de HBSS que contienen 25 mg de mAb en un volumen total de 25 \mul de HBSS estéril a 0, 24, y 48 horas. A las 72 horas, las CAM se recogen y se colocan en una placa petri de 35 mm y se lavan una vez con 1 ml de PBS. El lado del fondo del papel de filtro y el tejido de CAM se analizan después en un microscopio estéreo Olympus, con dos observadores de una manera de doble ciego. La inhibición de la Angiogénesis se considera significativa cuando las CAM muestran > 50% de reducción en la infiltración de los vasos sanguíneos de la CAm directamente bajo la placa. Los experimentos se repiten cuatro veces por anticuerpo, con 6 a 7 embriones por condición.
Para examinar los efectos de los anticuerpos de integrina sobre vasos sanguíneos maduros preexistentes presentes del desarrollo de vasos normales adyacentes a las áreas desprovistas de vasos, discos de filtro saturados con mAbs se colocan en regiones vascularizadas de las CAM de embriones de 10 días que no reciben aplicación tópica de citoquina.
Los ensayos de CAM también se realizan con péptidos sintéticos de esta invención para determinar el efecto de péptidos cíclicos y lineales sobre la angiogénesis inducida por factor de crecimiento. Ocho \mug de péptidos, preparados como se ha descrito previamente, se presentan separadamente en un volumen total de 25 \mul de HBSS estéril. La solución de péptido se aplica a la preparación de CAM inmediatamente y después otra vez a las 24 y 48 horas. A las 72 horas el papel de filtro y tejido de CAM circundante se diseccionan y se observan como se ha descrito anteriormente.
Se realizan ensayos similares con moléculas orgánicas preparadas como se describe en el ejemplo 10.
C. Inhibición de angiogénesis inducida por tumores mediante aplicación tópica 1) Tratamiento con anticuerpos clonales
Además de los ensayos de angiogénesis descritos anteriormente en los que los efectos del anticuerpo anti-\alpha_{v}\beta_{5} se evaluaron antagonistas de péptidos, también se investiga el papel de \alpha_{v}\beta_{5} en la angiogénesis inducida por tumores. Como inductor, se usan tejidos humanos \alpha_{v}\beta_{5}-negativo previamente crecidos y aislados a partir de CAM de embriones de pollo de 17 días. Los fragmentos se preparan como se describe en el ejemplo 5C.
Como se ha descrito anteriormente, los mAbs se aplican de manera separada por vía tópica a los fragmentos de tumor a una concentración de 25 \mug en 25 \mul de HBSS y las ventanas se sellan después con cinta. Los mAbs se añaden otra vez de la misma manera a las 24 horas y 48 horas. A las 72 horas, los tumores y tejidos de CAM circundantes se analizan como se ha descrito anteriormente.
Como se ha descrito en el ejemplo 5 C, los tumores se derivan inicialmente transplantando líneas celulares, que no expresan la integrina \alpha_{v}\beta_{5}, en las CAM de embriones de pollo de 10 días de edad.
Con el fin de cuantificar el efecto de los mAbs sobre la angiogénesis inducida por tumores, los vasos sanguíneos que entran en el tumor dentro del plano focal de la CAM se cuentan en un microscopio estéreo mediante dos observadores de una manera de doble ciego.
Los péptidos sintéticos preparados en el ejemplo 3 y las moléculas orgánicas preparadas en el ejemplo 10 se aplican de manera similar por vía tópica al sistema de ensayo de CAM angiogénico inducida por tumores como se ha descrito anteriormente. El efecto del péptido y moléculas orgánicas sobre la viabilidad de los vasos se determina de manera similar.
D. Inhibición de angiogénesis inducida por tumores mediante aplicación intravenosa 1) Tratamiento con anticuerpos monoclonales
Los vasos sanguíneos inducidos por tumores preparados anteriormente se trataron también con mAbs aplicados mediante inyección intravenosa. Tumores de melanoma CS-1 se colocaron en las CAM como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 5C y las ventanas se sellan con cinta y 24 horas más tarde, 100 a 300 \mug de mAB purificados se inoculan una vez por vía intravenosa en vasos sanguíneos de embriones de pollo como se ha descrito anteriormente. Los embriones de pollo se dejan después incubar durante 7 días. El grado de angiogénesis se observó después como se ha descrito anteriormente. Después de este período de tiempo, los tumores se volvieron a seccionar y se analizaron por su crecimiento para de terminar el efecto de exposición de anticuerpos en el crecimiento o supresión de tumores.
Los resultados del tratamiento de tumores de CS-1 con 300 \mug anticuerpo P1F6 específico de \alpha_{v}\beta_{5} se muestran en la figura 8. El peso de tumor se redujo drásticamente hasta menos de 50 mg comparado con los tumores tratados con CSAT. El anticuerpo específico de \alpha_{v}\beta_{3}, LM609, también inhibía el crecimiento de tumores, sin embargo, con menos eficacia que con P1F6. Se obtuvieron resultados comparables con tumores que reciben tratamiento con 100 \mug de P1F6. De esta manera, P1F6 era eficaz inhibiendo la angiogénesis mediada por \alpha_{v}\beta_{5} en un modelo de tumor sobre una preparación de CAM que da como resultado una disminución de masa celular tumoral.
2) Tratamiento con péptidos sintéticos
También se determinan los efectos de las moléculas de péptido sobre la vasculatura inducida por tumores en el sistema de ensayo de CAM. La preparación de CAM de tumor se usa como se ha descrito anteriormente con la excepción de que en lugar de la inyección intravenosa de un mAb, se inyectan por vía intravenosa separadamente péptidos sintéticos preparados como se ha descrito en el ejemplo 3 en vasos sanguíneos visibles.
7. Identificación de antagonistas específicos de \alpha_{v}\beta_{5} detectados mediante un ensayo de unión a receptor de ligando
Los anticuerpos inmunorreactivos de \alpha_{v}\beta_{5} y péptidos sintéticos preparados en los ejemplos 1 y 3 respectivamente se seleccionan midiendo su capacidad se antagonizar la actividad de unión a receptores de \alpha_{v}\beta_{5}, \alpha_{v}\beta_{3}, y \alpha_{IIb}\beta_{3} en ensayos de unión a ligandos-receptores purificados. El procedimiento para estos estudios de unión los han descrito Barbas y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 10003-10007 (1993), Smith y col., J. Biol. Chem., 265: 11008-11013 (1990) y Pfaff y col., J. Biol. Chem., 269: 20255-20238 (1994).
Un procedimiento de identificación de antagonistas en un ensayo de unión ligando-receptor se describe en los que el receptor se inmoviliza a un soporte sólido y el ligando y antagonista son solubles: Un ensayo de unión ligando-receptor también se describe en el que el ligando se inmoviliza a un soporte sólido y el receptor y antagonistas son solubles.
En resumen, las integrinas purificadas seleccionadas se inmovilizan separadamente en pocillos de microvaloración de Titerkek a una concentración de revestimiento de 50 nanogramos (ng) por pocillo. La purificación de los receptores usados en los ensayos de unión ligando-receptor se conocen bien en la técnica y se obtienen fácilmente con procedimientos familiares para los expertos en la técnica. Después de incubación durante 18 horas a 4ºC, se bloquean los sitios de unión no específica en la placa con 10 miiligramos/mililitro (mg/ml) de albúmina sérica bovina (BSA) en solución salina tamponada con Tris. Para estudios de inhibición, diversas concentraciones de anticuerpos seleccionados o péptidos se ensayan para evaluar la capacidad de bloquear la unión de vitronectina marcada con ^{125}I u otros ligandos marcados a los receptores de integrina, \alpha_{v}\beta_{5}, \alpha_{v}\beta_{3}, \alpha_{v}\beta_{1}, y \alpha_{IIb}\beta_{3}.
Aunque estos ligandos muestran unión óptima para una integrina particular, vitronectina para \alpha_{v}\beta_{5} y \alpha_{v}\beta_{3} y fibrinógeno para \alpha_{IIb}\beta_{3}, inhibición de estudios de unión usando o bien anticuerpos o péptidos para bloquear la unión de vitronectina a cualquier receptor permite la determinación exacta de la cantidad en micromoles (\muM) del péptido necesario para inhibir máximamente a la mitad la unión de receptor a ligando. Los ligandos marcados radiactivamente se usan a concentraciones de 1 nM y la unión se estimula separadamente con péptidos sintéticos no marcados. Después de una incubación de tres horas, el ligando libre se retira mediante lavado y el ligando de unión se detecta mediante conteo gamma.
De esta manera, el ensayo de ligando-receptor descrito en esta memoria descriptiva se usa para seleccionar péptidos sintéticos tanto circulares como sintéticos junto con anticuerpos monoclonales y moléculas orgánicas que muestran especificidad selectiva por un receptor de integrina particular, específicamente \alpha_{v}\beta_{5}, como se usa como antagonistas de receptores de vitronectina \alpha_{v}\beta_{5}) en la práctica de esta invención.
8. Regresión in vivo de crecimiento de tejidos tumorales con antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} medida mediante ensayo de ratón:humano quimérico
Un modelo de ratón: humano quimérico in vivo se generó reemplazando una porción de piel de un ratón SCID con prepucio neonatal humano. El modelo de ratón:humano quimérico in vivo se preparó esencialmente como describen Yan, y col., J. Clin. Invest., 91: 986-996 (1993). En resumen, un área de 2 cm^{2} de piel se retiró quirúrgicamente de un ratón SCID (6-8 semanas de edad) y se reemplazó con un prepucio humano. El ratón se anestesió y se retiró el pelo de un área de 5 cm^{2} en cada lado de la región abdominal lateral mediante afeitado. Dos estratos de injerto circular de 2 cm^{2} se prepararon retirando el espesor completo de piel debajo de la fascia. Se colocaron injertos de piel humana gruesos del mismo tamaño derivado de prepucio neonatal humano en los estratos de herida y se suturaron en el lugar. El injerto se cubrió con una venda que se sutura a la piel. También se aplicó cinta de tela Micropore para cubrir la herida.
Después de que se estableció el injerto, el prepucio humano se inoculó con células de melanoma. La línea celular de melanoma humana M21L se usó para formar los tumores humanos sólidos en los injertos de piel humanos sobre los ratones SCID. Una suspensión de células individuales de 2 x 10^{6} de M21L se inyectó por vía intradérmica en el injerto de piel humana. Después los ratones se observaron durante 2 a 4 semanas para permitir el crecimiento de tumores humanos medibles.
Después de que se estableció un tumor medible, o bien 250 \mug del péptido (en un volumen de 100 \mul) que tiene la SEQ ID Nº 9 (péptido Arg-Gly-Asp-D- Phe-Asn-Val metilado que contiene RGD cíclico) o un péptido control, ciclo Arg- \betaAla-Asp-D-Phe-Val, se inyectaron por vía intraperitoneal en la mucosa 3 veces por semana durante 3 semanas. Al final de este tiempo, el tumor se elimina y se analiza mediante peso e histología.
Los resultados se muestran en la figura 9 en la que el volumen de tumor en mm^{3} se representa gráficamente sobre el eje Y contra los tratamientos por péptido sobre el eje X. El péptido de ensayo que tenía SEQ ID Nº 9, marcado en la figura como péptido 189, se redujo significativamente el volumen del tumor hasta aproximadamente 25 mm^{3} comparado con el péptido control (marcado como péptido 601) en el que el volumen de tumor era mayor que 300 mm^{3}.
De esta manera, el bloqueo del receptor \alpha_{v}\beta_{5} mediante la aplicación intravenosa del péptido 189 antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} dio como resultado una regresión de un tumor de melanoma en este sistema de modelo de la misma manera que la CAM y los sistemas de modelo de ojo de ratón como se ha descrito previamente.
El modelo quimérico de SCI/humano anterior también se usa para determinar la eficacia de otros antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} de esta invención, en concreto anticuerpos y moléculas orgánicas, las últimas de las cuales se prepararon como se describe en el ejemplo 10.
9. Preparación de un modelo de ratón de tipo murino para angiogénesis retinal mediada por \alpha_{v}\beta_{5} e inhibición de la misma con antagonistas de \alpha_{v}\beta5
Basándose en la observación en el ejemplo 2C de la expresión de \alpha_{v}\beta_{3} \alpha_{v}\beta_{5} en tejido neovascular retinal, un modelo de ratón novedoso se usó para estudiar los efectos de antagonistas de péptidos cíclicos administrados se de manera sistémica de ambas integrinas sobre angiogénesis retinal. Los ratones recién nacidos desarrollan vasos retinales durante las dos primeras semanas después del nacimiento tiempo durante el que la vasculatura retinal superficial forma una red rica, altamente ramificada de vasos que se originan en la cabeza del nervio óptico y se difunden periféricamente para cubrir la superficie retinal de una manera similar a la observada en otros mamíferos y seres humanos (Jiang y col., Glia, 15: 1-10 (1995).
Para el modelo, ratones recién nacidos reinyectaron por vía subcutánea dos veces al día durante cuatro días comenzando desde el día 0 con el péptido cíclico RGDfV (SEQ ID Nº 4) (también llamado péptido 203) o el péptido control RADfV (SEQ ID Nº 5). El día 5 después del nacimiento, se retiraron y se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4,0% a temperatura ambiente.
Para cuantificar la angiogénesis retinal de ratón, se midió la distancia se la cabeza del nervio óptico al punto más distal de un vaso individual seleccionado en cada uno se los seis sectores iguales alrededor de un reloj de doce horas. La distancia media se calculó y se promedió con datos similares obtenidos de una camada entera. Para medir el volumen total de vasos retinales sanguíneos, la muestra entera se exploró en secciones ópticas de 2 \mum y se almacenó digitalmente. La función "semilla" en un software Lasersharp de Bio-Rad se usó después para umbral y recuento de píxeles cúbicos en cada sección. Se escribió un macro para sumar el volumen de todas las secciones y determinar el valor para todas las estructuras vasculares.
Con la medición directa de crecimiento de vaso en dos dimensiones de fotografías, antagonista de péptido 203 administrado sistémicamente inhibía la vasculogénesis retinal, con relación al péptido control, en un 44% (N = 9, p < 0,0000001, ensayo de t apareado). No se observó ninguna diferencia estadística entre ratones recién nacidos no tratados y ratones de cinco días que recibían el péptido 203, de este modo el péptido inhibe de manera eficaz la vasculogénesis. Además, no se observó ninguna diferencia estadística entre ratones de cinco días no tratados y los ratones de la misma edad que recibieron péptido control. De este modo, la inhibición de la vasculogénesis retinal en ratones recién nacidos tratados con RGDfV cuando se compara con los homólogos non tratados es 100% efectivamente.
Usando un análisis más cuantitativo que toma la naturaleza de tres dimensiones de crecimiento de vasos, se observó una reducción del 78% en el volumen vascular retinal en los animales tratados con péptido 203 comparado con los controles. El volumen medio de vasos el día cinco después del nacimiento en animales tratados con 203 era 3,6 x 10^{6} \mum^{3} y en animales tratados con control era 15,7 x 10^{6} \mum^{3}. El volumen ocupado por los vasos retinales sanguíneos en ratones recién nacidos no tratados era indistinguible de los animales tratados con 203 de cinco días de edad.
Los resultados obtenidos anteriormente mostraron que los antagonistas bloqueaban específicamente la formación de nuevos vasos sanguíneos sin ningún efecto sobre los vasos establecidos. Los resultados indican que la patología de la enfermedad neovascular retinal es distinta de la observada con enfermedad neovascular subrretinal y los antagonistas de \alpha_{v}\beta_{5} son eficaces para tratar pacientes con enfermedad de ojo ciego asociado a angiogénesis.
La memoria descriptiva escrita anteriormente se considera que es suficiente para permitir que los expertos en la técnica practiquen la invención. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en esta memoria descriptiva serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y cae dentro del alcance se la invención como se define por las reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: El INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN SCRIPPS
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROEDIMEINTOS Y COMPOSICIONES ÚTILES PARA LA INHIBICIÓN DE ANGIOGÉNESIS MEDIADA POR ALFA V BETA 5
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEAM OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn liberación nº 1,0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US96/
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 13 de agosto de 1996
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACNTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US 08/514.799
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 de agosto de 1995
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = BOC
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = D-Phe
\hskip6.5cm
/nota = "Un prefijo ``D'' en D-Phe significa que la fenilalanina en la {}\hskip6.8cm posición 4 es un aminoácido D" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = OMe
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Asp Phe Val}
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = BOC
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = D-Phe
\hskip6.5cm
/nota = "Un prefijo ``D'' en D-Phe significa que la fenilalanina en la {}\hskip6.8cm posición 4 es un aminoácido D" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = OH
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = H
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = D-Phe
\hskip6.5cm
/nota = "Un prefijo ``D'' en D-Phe significa que la fenilalanina en la {}\hskip6.8cm posición 4 es un aminoácido D" 
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = OH
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
topología: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = ciclo
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = D-Phe
\hskip6.5cm
/nota = "Un prefijo ``D'' en D-Phe significa que la fenilalanina en la {}\hskip6.8cm posición 4 es un aminoácido D" 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
topología: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = ciclo
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\newpage
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = D-Phe
\hskip6.5cm
/nota = "Un prefijo ``D'' en D-Phe significa que la fenilalanina en la {}\hskip6.8cm posición 4 es un aminoácido D" 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
topología: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = ciclo
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = D-Arg
\hskip6.5cm
/nota = "Un prefijo ``D'' en D-Arg significa que la arginina en la {}\hskip6.9cm posición 2 es un aminoácido D" 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Gly Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
topología: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = ciclo
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = D-Val
\hskip6.5cm
/nota = "Un prefijo ``D'' en D-Val significa que la valina en la posición {}\hskip6.8cm 5 es un aminoácido D" 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Asp Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
topología: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = D-phe
\hskip6.5cm
/nota = "Un prefijo ``D'' en D-Phe significa que la fenilalanina en la {}\hskip6.8cm posición 4 es un aminoácido D" 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marca = MeVal
\hskip6.5cm
/nota = "Un prefijo ``Me'' en MeVal significa que la valina en la {}\hskip6.8cm posición 6 es una valina metilada" 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Asp Phe Asn Val}

Claims (5)

1. El uso de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} en la fabricación de un medicamento para inhibir la angiogénesis mediada por \alpha_{v}\beta_{5} en un tejido que contiene \alpha_{v}\beta_{5}, en el que dicha angiogénesis está presente en un paciente que tiene un trastorno neovascular corneal seleccionado entre el grupo de trastornos constituidos por transplante de córnea, queratitis herpética, queratitis luética, pterigio y panus vascular asociado a lentes de contacto; y en el que dicho antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} es un polipéptido que contiene RGD.
2. El uso de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido se selecciona entre el grupo constituido por ciclo (Arg-Gly-Asp-D- Phe-Val) (SEQ ID Nº 4), ciclo (Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEQ ID Nº 6), ciclo (Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID Nº 7), Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro- Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe (SEQ ID Nº 8) y una sal de los mismos.
3. El uso de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} según la reivindicación 2, en el que dicha sal es clorhidrato.
4. El uso de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} según la reivindicación 1, en el que dicho antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} está presente en una cantidad de la angiogénesis entre 2 \muM a 5 mM.
5. El uso de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{5} según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento es para administración intraocular.
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