ES2246859T3

ES2246859T3 - Nuevos perfiles mutacionales en la transcriptasa inversa del vih-1 correlacionadas con una resistencia fenotipica a farmacos.

Info

Publication number: ES2246859T3
Application number: ES00936827T
Authority: ES
Inventors: Kurt Hertogs; Brendan Larder; Rudi Wilfried Jan Pauwels
Original assignee: Virco BVBA
Current assignee: Virco BVBA
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-05-25
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2020-05-25
Also published as: US20090162867A1; BR0011555A; JP2003501051A; US7494768B1; ATE302287T1; EP1185712B1; NZ516259A; CA2374215C; US8563236B2; DE60022036T2; DE60022036D1; AU783235B2; EP1185712B8; WO2000073511A1; CA2374215A1; MXPA01012270A; EP1185712A1; AU5217500A

Abstract

Un sistema informático dirigido por un programa informático, en el que el programa informático correlaciona la presencia de al menos una mutación en una transcriptasa inversa del VIH y la resistencia de al menos una cepa del VIH a un inhibidor de la transcriptasa inversa, caracterizado porque: el programa informático usa un primer conjunto de registros correspondientes a una correlación entre al menos una primera mutación elegida entre 88E, 101H, 101N, 101P, 101Q, 101T, 103H, 103S, 179I, 179E, 181V, 190E, 190S, 190T o la combinación de 103R y 179D, y la resistencia a al menos un inhibidor no nucleósido de la transcriptasa inversa; y un segundo conjunto de registros correspondientes a una correlación entre al menos una segunda mutación elegida entre 69S-[S-S], 184G, 184L, 215V, 44D, 44A o 118I, y la resistencia a al menos un inhibidor nucleósido de la transcriptasa inversa.

Description

Nuevos perfiles mutacionales en la transcriptasa inversa del VIH-1 correlacionados con una resistencia fenotípica a fármacos.

La presente invención está dirigida al campo del diagnóstico de ácidos nucleicos y de la identificación de variación de bases en secuencias de ácidos nucleicos objetivos. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de dicha caracterización genotípica de una población objetivo de VIH y la subsiguiente asociación, es decir, correlación, de esta información, con la interpretación fenotípica, con objeto de correlacionar los perfiles mutacionales de los virus con la resistencia a fármacos. La invención también se refiere a procedimientos de utilización de los perfiles mutacionales de la invención en el desarrollo de fármacos, es decir, diseño de fármacos, modificación de fármacos y desarrollo de fármacos, diseño de terapias y tratamientos, supervisión clínica y análisis diagnósticos.

La principal célula objetivo de infección por parte del VIH se identificó como el subconjunto CD4+ de linfocitos T. Con objeto de replicarse, el VIH interactúa en primer lugar con las células que expresan la proteína y el correceptor de superficie CD4 a través de la unión mediante la proteína de cubierta gp120. Tras la fusión a través del dominio gp4l de la cubierta se consigue la entrada, la partícula vírica se degrada y el genoma del ARN se transcribe en un ADN complementario bicatenario (ADNc). Este material genético es transportado hasta el núcleo celular como parte del complejo de preintegración, en el que el ADN es procesado por la integrasa vírica e incorporado al genoma del hospedador. En una célula activada, el genoma vírico es transcrito y subsiguientemente traducido en proteínas estructurales y precursores enzimáticos. Las poliproteínas, la matriz que contiene Gag y Gag-Pol, la cápside, la nucleocápside así como las enzimas transcriptasa inversa, proteasa e integrasa se dirigen hacia la membrana celular, en la que se produce una escisión proteolítica mediante la proteasa vírica y el empaquetamiento de los viriones. La mayoría de estos acontecimientos han sido ampliamente estudiados, y se han identificado varias etapas para una posible intervención para evitar la replicación vírica. Estas incluyen la unión y la entrada en la célula hospedadora, la formación del ADN provírico mediante las enzimas transcriptasas inversas, la integración del ADN provírico en los cromosomas de la célula hospedadora mediante la integrasa, así como el ensamblaje del virus, incluyendo la escisión de las proteínas precursoras víricas mediante la proteasa vírica. Se han desarrollado agentes clínicamente relevantes contra dos de estas etapas objetivo B transcripción inversa (inhibidores de la transcriptasa inversa (RTI)) y del ensamblaje vírico (inhibidores de la proteasa (PI)).

Los inhibidores retrovíricos pueden bloquear la replicación vírica de varias formas. Por ejemplo, los Nucleósidos Inhibidores de la Transcriptasa Inversa (NRTIs), compiten con los nucleósidos trifosfato naturales en su incorporación en el ADN vírico en elongación mediante la transcriptasa inversa. Las modificaciones químicas que distinguen a estos compuestos de los nucleósidos naturales dan como resultado acontecimientos de terminación de la cadena de ADN. Los NRTIs disponibles actualmente incluyen zidovudina (ZDV), didanosina (ddI), zalcitabina (ddC), estavudina (d4T), lamivudina (3TC) y abacavir (ABC).

Los Nucleótidos Inhibidores de la Transcriptasa Inversa (NtRTIs) tienen el mismo modo de acción que los NRTIs, pero difieren en que éstos ya están monofosforilados, y por lo tanto requieren menos etapas metabólicas. El adefovir (bis-POM-PMEA) y el bis-POC PMPA pertenecen a esta categoría de tratamientos.

Los Inhibidores No Nucleósidos de la Transcriptasa Inversa (NNRTIs) son un grupo de compuestos estructuralmente diversos que inhiben la transcriptasa inversa del VIH mediante una unión no competitiva a o cercana al sitio activo de la enzima transcriptasa inversa, inhibiendo así su actividad. Algunos compuestos disponibles de este grupo incluyen nevirapina (NVP), delavirdina (DLV) y efavirenz.

Los Inhibidores de la Proteasa (PIs) son peptidomiméticos y se unen al sitio activo de la enzima proteasa vírica, inhibiendo así la escisión de las poliproteínas precursoras necesarias para producir los componentes estructurales y enzimáticos de los viriones infecciosos. Los PIs que hay disponibles actualmente incluyen saquinavir (SQV), ritonavir (RTV), indinavir (IDV) nelfinavir (NFV), amprenavir (APV) y ABT-378.

Las opciones para la terapia antirretrovírica han mejorado considerablemente según han ido habiendo disponibles nuevos agentes. Las directrices actuales de la terapia antirretrovírica recomiendan un régimen de terapia de combinación triple para el tratamiento inicial, tal como un PI y 2 NRTIs o un NNRTI y 2 NRTIs. Estos regímenes de combinación muestran una potente actividad antirretrovírica y se denominan HAART (terapia antivírica altamente activa -highly active antiviral therapy-). La introducción de los HAART ha dado como resultado una significativa reducción de la morbilidad y la mortalidad en poblaciones de pacientes con VIH-1 con acceso a estos
fármacos.

Adicionalmente, el desarrollo y la estandarización de ensayos de cuantificación de ARN de VIH-1 en plasma ha conducido al uso de medidas de la carga vírica como una herramienta clave de la monitorización de la respuesta a la terapia. Los niveles de carga vírica en pacientes pretratados o mínimamente tratados es un factor fuertemente predictivo de la progresión de la enfermedad a largo plazo, y las reducciones inducidas por los tratamientos en la carga vírica se han relacionado con un beneficio clínico. La meta de la terapia antirretrovírica es reducir la viremia plasmática por debajo del límite de detección en un plan a largo plazo. Esto se puede conseguir parcialmente con los HAART estándar. Sin embargo, en un número significativo de pacientes, no se consigue una máxima supresión de la replicación del virus, y para aquellos en los que se alcanza esta meta, un número significativo experimenta un rebote en la carga vírica. Aunque un rebote en la viremia plasmática es una clara indicación del fracaso de la terapia, los datos de la carga vírica no proporcionan ninguna información sobre la causa del fracaso.

El fracaso de las terapias puede ser debido a varios factores. Estos incluyen una actividad antivírica del régimen insuficiente, variaciones individuales en el metabolismo y la farmacodinamia del fármaco, dificultades en el seguimiento del régimen de dosificación, requerimientos de interrupción del tratamiento debido a la toxicidad y resistencia vírica al fármaco. Además, puede desarrollarse una resistencia al fármaco en un paciente tratado con una terapia antirretrovírica subóptima, o un paciente puede estar infectado con un VIH-1 resistente al fármaco. Aunque puede que la resistencia al fármaco no sea la razón principal del fracaso de la terapia, en muchos casos cualquier situación que permita la replicación vírica en presencia de un inhibidor establece la etapa para la selección de variantes resistentes.

Más específicamente, los retrovirus tales como el VIH no tienen mecanismos de corrección de la lectura cuando sintetizan nuevas hebras de ácidos nucleicos. Los errores que se producen durante el proceso de incorporar los nucleótidos durante la elongación de la cadena no son corregidos. Esto permite la continua generación de numerosas variantes genéticas en una población vírica en replicación. Las estimaciones son que hay 3 x l0^{-5} mutaciones por nucleótido por ciclo de replicación del VIH, y el tipo de mutación por sustitución es por supuesto aleatoria en cualquier localización. Consecuentemente, dada la frecuencia de los errores y la alta tasa a la que se replica el virus, es probable que se produzcan virtualmente todos los cambios genéticos posibles en un periodo de tiempo muy corto. Más importante, los cambios genéticos pueden alterar la configuración de la RT y de las moléculas de la proteasa de una forma tal que ya no son susceptibles de inhibición por parte de los compuestos que han sido desarrollados contra ellas. Si la terapia antirretrovírica está en curso, y si la replicación vírica no puede ser completamente suprimida, la selección de dichas variantes genéticas es inevitable. La población vírica se hará resistente al (los) fármaco(s) administrado(s). Claramente, la supresión eficaz de la población vírica es vital para un tratamiento eficaz. La resistencia vírica a un fármaco puede definirse como cualquier cambio en el virus que mejora su replicación en presencia de un inhibidor. La resistencia a fármacos del VIH-1 se describió inicialmente en 1989, e implicó a pacientes que habían sido tratados con una monoterapia de zidovudina, que representaba la única opción de tratamiento en ese momento. Véase Larder, B. A. y col., Science 243, 1731-1734 (1989). La resistencia se detectó fenotípicamente in vitro: en numerosos pacientes, los aislados víricos requirieron concentraciones de zidovudina 100 veces mayores para inhibir la replicación en la misma magnitud que los aislados del pretratamiento en el mismo individuo. Subsiguientemente, se caracterizó la base genética de la resistencia a la zidovudina.

El surgimiento de la resistencia se observa prácticamente siempre durante el curso del tratamiento de pacientes con un único fármaco antirretrovírico. De forma similar, el paso in vitro de cultivos víricos a través de varias rondas de replicación en presencia de compuestos antirretrovíricos conduce a la selección de virus cuyo ciclo de replicación ya no es susceptible a los compuestos usados.

También se ha observado desarrollo de resistencias con la introducción de una terapia doble de combinación de NRTI, así como durante la administración de los NNRTIs y PIs más potentes. Los agentes antirretrovíricos individuales difieren en la tasa a la que se desarrolla la resistencia: la selección de las variantes resistentes puede producirse a las semanas de tratamiento, o la resistencia puede surgir tras un periodo de tratamiento más largo. El grado de susceptibilidad puede englobar el intervalo completo desde una leve reducción en la susceptibilidad hasta una resistencia completa, dependiendo del tipo de mutación(es) portada(s) por el virus y del tipo y la concentración del compuesto usado.

Un amplio análisis genético de los aislados víricos resistentes producido mediante una selección in vivo o in vitro ha revelado que la resistencia es causada generalmente por mutaciones que alteran la secuencia de nucleótidos en algún(os) sitio(s) específico(s) del genoma vírico. Los patrones mutacionales que se han observado y referido para el VIH-1 y que se han correlacionado con la resistencia a fármacos son muy diversos: algunos agentes antirretrovíricos sólo requieren un único cambio genético, mientras que otros requieren múltiples mutaciones para que aparezca la resistencia. Se ha recopilado un resumen de las mutaciones en el genoma del VIH correlacionadas con la resistencia a fármacos. Véase Schinazi, R. F., Larder, B. A. y Meliors, J. W. 1997, Int. Antiviral News, 5, 129-142 (1997). Adicionalmente, también ha quedado disponible una lista electrónica con las mutaciones en http://hiv-web.lanl.gov o http://www.viralresistance.com.

Debería mencionarse que el grado de susceptibilidad de una variante genética a un compuesto antirretrovírico se expresa en este documento con respecto al virus natural (secuencia de referencia del VIH III/B/LAI) según se encuentra, por ejemplo, en GenBank, cuya secuencia se incorpora a este documento como referencia. Las susceptibilidades se expresan generalmente como proporciones de los valores de la CI_{50} o la CI_{90} (siendo el valor de la CI_{50} o la CI_{90} la concentración de fármaco a la cual se inhibe la replicación de respectivamente el 50% o el 90% de la población vírica). Adicionalmente, la mutación genética se escribe normalmente con respecto al virus natural, es decir, K101N se refiere a la sustitución de una lisina en el codón 101 por una asparagina. Sin embargo, las mutaciones de la invención no dependen del ejemplo natural enumerado con objeto de estar dentro de la práctica de la invención. Por ejemplo, la mutación 101N se refiere a una asparagina en el codón 101 independientemente de si había una lisina en el 101 antes de la mutación.

Por supuesto, los fármacos antirretrovíricos se administran durante períodos de tiempo más largos, en su mayoría en combinación entre sí, y dado que se están desarrollando nuevos antirretrovíricos y añadiéndose a los fármacos actuales, se están descubriendo nuevas variantes genéticas correlacionadas con la resistencia. Es de particular importancia que la combinación de agentes antirretrovíricos puede influir en las características de la resistencia. Por ejemplo, se seleccionaron diferentes mutaciones correlacionadas con la resistencia a los NNRTI en una terapia de combinación con NNRTI-zidovudina y se seleccionaron diferentes mutaciones correlacionadas con la resistencia a los NRTI en una terapia de combinación doble con NRTI. En el último caso, el resultado es una resistencia a varios fármacos de alto nivel a todos los NRTIs. Las alteraciones en la susceptibilidad también pueden orientarse hacia la sensibilidad en lugar de hacia la resistencia durante la terapia de combinación doble, según demuestra la inversión de la resistencia a ZDV en pacientes tratados con ZDV/3TC. En este caso, el efecto está mediado por la interacción mutacional entre M184V y sustituciones de resistencia a ZDV. En pacientes con una terapia de combinación doble, el tiempo hasta la resistencia puede verse afectado, según se muestra para la resistencia a la ZDV en combinaciones ZDV/3TC o ZDV/NNRTI. Los estudios también demostraron que la resistencia a uno de los agentes de la combinación (en estos casos, lamivudina o el NNRTI) puede aparecer más regularmente/frecuentemente que la resistencia al otro (aquí, zidovudina). Además, una vez que se ha desarrollado la resistencia vírica, las opciones con la terapia natural pueden ser rigurosamente restringidas debido a una resistencia cruzada dentro de cada clase de fármaco. Según los modelos de la dinámica de replicación de virus y las tasas de mutación discutidas anteriormente, parecería que el cambio de una población de virus a mutante (resistente) en unas condiciones de una incompleta supresión de la replicación vírica en presencia de inhibidores es sólo una cuestión de tiempo. Por lo tanto, un factor clave para prevenir la resistencia es mantener una completa (máxima) supresión de la replicación vírica.

En vista de la prevalencia de la resistencia vírica y de su papel en el fracaso de las terapias, la prevención del desarrollo de resistencias debe ser una meta clave en la supervisión de las terapias antirretrovíricas. Recientemente, el interés se ha dirigido a la caracterización de alteraciones en la susceptibilidad vírica a fármacos para una mejor supervisión clínica. Dado el significativo papel jugado por la existencia y la continua evolución de la resistencia a fármacos antirretrovíricos, la correcta elección del régimen de tratamiento es muy importante. Esto es tan importante para el tratamiento inicial como para cuando se requiere un cambio en la terapia con objeto de minimizar el surgimiento de la resistencia y mejorar el pronóstico a largo plazo del paciente. La elección del régimen terapéutico estará apoyada por el conocimiento del perfil de resistencia de la población de virus circulante. Adicionalmente, las combinaciones de terapias tendrán una oportunidad mayor de ser eficaces si incluyen agentes que tengan un potencial demostrado de supresión de una población de virus en particular. Por lo tanto, pueden evitarse los innecesarios efectos secundarios y costes relacionados con los fármacos a los que el virus del paciente es resistente. Sin embargo, hasta la fecha, la comprensión de la correlación entre las mutaciones del VIH y la resistencia a fármacos y el efecto de las combinaciones con varios fármacos sobre las características de la resistencia ante agentes individuales es insuficiente para conseguir muchas de estas metas.

Para conseguir estas y otras ventajas, y según el propósito de la invención, contenido y ampliamente descrito en este documento, la presente invención, en un aspecto, proporciona un sistema informático que comprende una base de datos que correlaciona la presencia de al menos una mutación en una transcriptasa inversa del VIH y la resistencia de al menos una cepa del VIH a un inhibidor de la transcriptasa (RTI); y/o una base de datos que correlaciona la presencia de al menos una mutación en una proteasa del VIH y la resistencia de al menos una cepa del VIH a un inhibidor de la proteasa (PI). Más específicamente, la base de datos comprende un conjunto de registros correspondientes a una correlación entre una mutación y una resistencia a un fármaco.

Las correlaciones de la presente invención entre una mutación y una resistencia a un fármaco son: si la mutación en la transcriptasa inversa del VIH es 88E, 101H, 101N, 101P, 101Q, 101T, 103H, 103S, 179I, 179E, 181V, 190E, 190S, 190T, o la combinación de 103R y 179D, o cualquier combinación de estas mutaciones, la cepa del VIH es resistente a al menos un NNRTI; si la mutación en la transcriptasa inversa del VIH es 69S-[S-S], 184G, 184L, 215V, 44D, 44A o 118I, o cualquier combinación de las mismas, la cepa de VIH es resistente a al menos un NRTI; y si la mutación en la proteasa es 88T y/o la combinación de las mutaciones 33F y 90M, o cualquier combinación de las mismas, la cepa de VIH es resistente a al menos un PI.

En otra forma de realización, la invención concibe un procedimiento para evaluar la eficacia de una terapia antirretrovírica de un paciente infectado por el VIH que comprende: tomar una muestra de un paciente infectado por el VIH; determinar si la muestra comprende al menos un ácido nucleico que codifica para la transcriptasa inversa del VIH con al menos una mutación descrita en este documento o una proteasa del VIH con al menos una mutación descrita en este documento; y usar la presencia del ácido nucleico para evaluar la eficacia de la terapia antivírica.

En una forma de realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para identificar fármacos eficaces contra las cepas del VIH resistentes a los NNRTI o NRTI, comprendiendo el procedimiento las etapas de: proporcionar al menos una cepa del VIH que comprende una transcriptasa inversa del VIH que contiene al menos una mutación descrita en este documento, determinar la respuesta fenotípica del fármaco a la cepa del VIH y usar la respuesta fenotípica para determinar la eficacia del fármaco. En una forma de realización adicional más, la invención proporciona un procedimiento para identificar fármacos eficaces contra las cepas del VIH resistentes a los PI, en el que la cepa del VIH comprende una proteasa del VIH que contiene al menos una mutación descrita en este documento, determinar la respuesta fenotípica de dicho fármaco a dicha cepa del VIH y usar la respuesta fenotípica para determinar la eficacia del fármaco.

En otra forma de realización, la invención proporciona el fármaco identificado usando los procedimientos de la invención.

La invención también proporciona un procedimiento para diseñar una terapia para tratar a pacientes infectados con el VIH que comprende: tomar una muestra de un paciente infectado por el VIH; determinar si la muestra comprende al menos un ácido nucleico que codifica para una transcriptasa inversa del VIH con al menos una mutación descrita en este documento, o una proteasa del VIH con al menos una mutación descrita en este documento; y usar la presencia del ácido nucleico para diseñar una terapia para el paciente.

La invención también incluye complejos aislados de una transcriptasa inversa de VIH resistentes a al menos un NNRTI o a al menos un NRTI que comprenden al menos una mutación descrita anteriormente y un complejo aislado de una proteasa del VIH con resistencia a los PI que comprende al menos una mutación descrita anteriormente. Objetos y ventajas adicionales de la invención se establecerán en parte en la descripción que sigue, y en parte serán evidentes de la descripción, o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Los objetos y ventajas de la invención se realizarán y alcanzarán mediante los elementos y combinaciones particularmente señalados en las reivindicaciones anexas.

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior precedente como la siguiente descripción detallada son únicamente ejemplares y explicativas, y no son restrictivas de la invención, según se reivindica.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: frecuencia de las mutaciones en la RT procedentes de muestras clínicas resistentes a varios nucleósidos y no MDR. Las barras blancas (MDR) representan la frecuencia global de mutaciones en la RT encontradas en muestras del VIH-1 que tienen un aumento > 4 veces en el valor de la CI_{50} en al menos cuatro de los análogos de nucleósidos probados. Las barras rayadas (no MDR) muestran la frecuencia de mutación de aislados que no eran resistentes cruzados a cuatro o más de los nucleósidos. Las mutaciones individuales analizadas en esta población de 892 muestras están indicadas con el código de aminoácidos de letra única. 69+ indica inserciones de aminoácidos en el codón 69.

Figura 2: susceptibilidad a los análogos de nucleósidos de variantes recombinantes del VIH procedentes de pacientes MDR. Los virus recombinantes se produjeron a partir de muestras de plasma de pacientes según se describe en el Ejemplo 2, y se comprobó su susceptibilidad a (a) d4T, (b) ddC y (c) ddI. El coeficiente de aumento medio en los valores de la CI_{50} (coeficiente de resistencia media) con respecto a los controles naturales se muestran para los grupos de virus con diferentes genotipos, es decir, el agregado (n=27) de resistencia a varios fármacos del codón 151-M, los virus con 69D/N (n=195), o 75M (n=43) en un trasfondo de mutaciones de resistencia a AZT y 3TC y mutantes de inserción (n=45) del codón 69 en un trasfondo de mutaciones de resistencia a AZT. Las barras de error indican los errores estándar. Nótese que el número total (n=3l0) es mayor que las 302 muestras MDR descritas porque una pequeña minoría eran mutantes dobles 69D/N y 75M y están representados en ambos grupos.

Figura 3: antecedentes terapéuticos de tres pacientes cuyos aislados de VIH-1 desarrollaron inserciones en el codón 69. Las terapias con análogos de nucleósidos (AZT, 3TC, ddC, ddI o d4T) se muestran como barras horizontales, indicando el periodo de tiempo en el que cada paciente (1, 2 ó 3) recibió un tratamiento en particular. El punto temporal en el que se obtuvieron las muestras de plasma para los análisis genotípicos y fenotípicos se muestra mediante las flechas junto con la inserción específica en el codón 69 detectada. Cualquier otra terapia, aparte de la de nucleósidos, que puedan estar recibiendo estos pacientes, no se indica en esta figura.

Descripción detallada de la invención

Ahora se hará referencia detalladamente a las formas de realización actualmente preferibles de la invención. La invención, en un aspecto, proporciona nuevas mutaciones o perfiles mutacionales de los genes de la transcriptasa inversa y/o de la proteasa del VIH-1 correlacionados con una resistencia fenotípica a fármacos anti-VIH. Más particularmente, la presente invención también se refiere al uso de la caracterización genotípica de una población objetivo del VIH y la subsiguiente correlación de esta información con la interpretación fenotípica, con objeto de correlacionar los perfiles mutacionales del virus con la resistencia a fármacos. La invención también se refiere a procedimientos de utilización de los perfiles mutacionales de la invención en bases de datos, desarrollo de fármacos, es decir, diseño de fármacos y modificación de fármacos, diseño de terapias y tratamientos, supervisión clínica y análisis diagnósticos.

Sin limitarse a la teoría, la invención utiliza una metodología de combinación que implica pruebas de resistencia genotípica y fenotípica para correlacionar mutaciones con fenotipos de resistencia. Sin la combinación específica de las tecnologías mencionadas anteriormente, esta correlación entre la mutación y la resistencia no se habría detectado. Además de la observación de estos perfiles genotípicos y fenotípicos en aislados procedentes de la práctica clínica rutinaria, se generaron mutantes dirigidos para confirmar que estas mutaciones forman realmente la base de este patrón de resistencia a fármacos. La resistencia del VIH a los fármacos antirretrovíricos puede determinarse a nivel genotípico identificando las mutaciones en el genoma del VIH-1 e infiriendo la resistencia del VIH-1 a los fármacos antirretrovíricos mediante la búsqueda de patrones mutacionales conocidos para correlacionarlos con la resistencia. Alternativamente, la resistencia del VIH a los fármacos antirretrovíricos puede determinarse a nivel fenotípico cultivando el virus en presencia de los inhibidores y midiendo hasta qué magnitud inhibe el fármaco la replicación vírica. En este caso, se mide el efecto de todas las interacciones mutacionales, los efectos de los cambios genéticos todavía desconocidos o no identificados previamente, el efecto del genotipo de trasfondo, etc., sobre el fenotipo.

Los ensayos para la detección de mutaciones en el VIH-1 se basan en la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de secuencias genómicas víricas. Estas secuencias amplificadas se analizan entonces usando técnicas de hibridación o de secuenciación. Los ensayos basados en hibridación incluyen PCR con cebadores específicos, que usan oligonucleótidos sintéticos diseñados para permitir un cebado selectivo de la síntesis del ADN. Véase Larder, B. A. y col., AIDS 5, 137-144 (1991); Richman, D.D. y col., J. Infect. Dis. 164, 1075-1081 (1991); Gingeras, T. R. y col., J. Infect. Dis. 164, 1066-1074 (1991). Sólo cuando las secuencias del cebador coinciden con la secuencia objetivo (natural o mutante) en el extremo 3', es posible la amplificación de las secuencias objetivo, y se producen fragmentos de ADN. El conocimiento de las secuencias de cebadores permite inferir la secuencia del aislado vírico en investigación, pero sólo para la región cubierta por las secuencias del cebador. Otros ensayos basados en hibridación incluyen hibridación diferencial [Eastman, P. S. y col., J. Acq. Imm. Def. Syndr. Human Retrovirol. 9, 264-273 (1995); Holodniy, M. y col., J. Virol. 69, 3510-3516 (1995); Eastman, P. S. y col., J. Clin. Micro. 33, 2777-2780 (1995)]; Ensayo de Sonda de Línea (LiPAJ HIV-11 RT, Innogenetics) [Stuyver, L. y col., Antimicrob. Agents Chemotherap. 41, 284-291 (1997)]; y tecnología GeneChip (Affymetrix) [D'Aquila, R. T., Clin. Diagnost. Virol. 3, 299-316 (1995); Fodor, S. P. A. y col., Nature 364, 555-556 (1993); Fodor, S. P. A., Nature 227, 393-395(1997)]. Por otro lado, los ensayos de secuenciación del ADN proporcionan información sobre todos los nucleótidos en la región secuenciada. Las secuencias objetivo son amplificadas mediante PCR. El análisis de las secuencias se basa principalmente en la incorporación de nucleótidos didesoxi terminadores de la cadena (sin los grupos hidroxilo 3') en secuencias de ADN en elongación, y análisis por electroforesis en gel de las moléculas resultantes. La mayoría de las tecnologías de secuenciación están semiautomatizadas y usan cebadores marcados fluorescentemente o ddNTPs para "leer" la secuencia a partir de un gel de poliacrilamida.

Los ensayos de fenotipado miden la capacidad de un virus en replicación de crecer en presencia de inhibidores específicos en comparación con un virus de referencia sensible natural. Consecuentemente, estos ensayos miden directamente el grado de resistencia o de susceptibilidad vírica a unos inhibidores específicos. Algunos ensayos de fenotipado aplicables incluyen, pero no se limitan a: el ensayo del antígeno p24 de PBMC (células mononucleares sanguíneas periféricas -peripheral blood mononuclear cells-), que fue el primer ensayo estandarizado para la determinación de la resistencia vírica a fármacos en aislados clínicos del VIH-1 [Japour, A. J. y col., Antimicrob. Agents Chemother. 37, 1095-1101 (1993); Kusumi, K. y col., J. Virol. 66, 875-885 (1992)]; y el Ensayo de Virus Rrecombinante (RVAs) que se describió inicialmente como un medio alternativo para evaluar la resistencia fenotípica a inhibidores de la RT [Kellam, P. y Larder, B. A., Antimicrob. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994); Hertogs, K. y col., 5th International Workshop on HIV Drug Resistance, Whistler, Canadá, Resumen 64 (1996); Hertogs, K. y col., Antimicrob. Agents Chemother. 42, 269-275 (1998); Hertogs, K. y col., International Workshop on HIV Drug Resistance, Treatment Strategies and Eradication, St. Petersburg, Florida, EE.UU., Resumen 43 (1997); y Pauwels, R. y col., 2nd International Workshop on HIV Drug Resistance and Treatment Strategies, Lake Maggiore, Italia, Resumen 51
(1998)].

Como es el caso en los ensayos de genotipado, el ensayo de virus recombinante comienza con la amplificación de secuencias víricas objetivo mediante la PCR. Los amplicones se incorporan en un clon provírico de laboratorio con secuencias homólogas a las que están presentes en el amplicón eliminado. Esto genera una reserva de virus quiméricos. Se comprueba la capacidad de los virus de crecer en presencia de diferentes concentraciones de fármacos. Los resultados se obtienen calculando los valores de las CI_{50} para cada inhibidor, y refiriendo los resultados como valores CI_{50}, expresados en concentraciones \muM, o calculando la proporción de los valores de las CI_{50} para el virus quimérico con respecto a los valores de las CI_{50} hallados para un virus de laboratorio susceptible natural comprobado en paralelo. En el último caso, la resistencia se expresa como "coeficiente de resistencia" en comparación con una cepa de VIH-1 susceptible natural.

Con objeto de satisfacer la necesidad de pruebas de alto volumen y un tiempo corto de rotación para una prueba individual, la última generación de ensayos de fenotipado ha sufrido modificaciones adicionales. El uso de sistemas de genes informadores para las pruebas de susceptibilidad permite la implementación de automatización y estandarización en el laboratorio. Véase Pauwels y col., J. Virol. Methods 20, 309-321 (1998); Paulous, S. y col., International Workshop on VIH Drug Resistance, Treatment Strategies and Eradication, St. Petersburg, Florida, EE.UU., Resumen 46 (1997); y Deeks, S. G. y col., 2nd International Workshop on VIH Drug Resistance and Treatment Strategies, Lake Maggiore, Italia, Resumen 53 (1998).

Adicionalmente, también hay ensayos que permitan la comprobación simultánea de la susceptibilidad de la proteasa y de la transcriptasa inversa a gran escala. El ensayo Antivirogram J (Virco) (WO97/27480) se basa en la recombinación homóloga de secuencias gag/PR/RT de VIH-1 procedentes de pacientes en un clon provírico de VIH-1 con las secuencias gag/PR/RT correspondientemente eliminadas. Véase Pauwels y col., J. Virol. Methods 20, 309-321 (1998). Los virus recombinantes resultantes replicadores competentes se analizan en un ensayo celular basado en un gen informador en presencia de varias concentraciones de fármacos antirretrovíricos. Las señales del gen informador específicas del VIH-1 se generan como resultado de la replicación vírica en las células objetivo. Se usan ópticas automatizadas de alta resolución para monitorizar la replicación vírica en curso a nivel de una única célula. Todos los inhibidores de las proteasas y transcriptasas inversas del VIH-1 disponibles actualmente se analizan en un ensayo de susceptibilidad en placa única de microtitulación. Un ensayo similar (ViroLogic) se basa en la unión enzimática de secuencias PR/RT procedentes de pacientes en el correspondientemente eliminado vector provírico portador de un gen indicador, el de la luciferasa, insertado en el gen de la cubierta eliminado del VIH-1. Véase Deeks, S. G. y col., 2nd International Workshop on HIV Drug Resistance and Treatment Strategies, Lake Maggiore, Italia, Resumen 53 (1998). También puede encontrarse más información relativa a estas técnicas en Hertogs y col., Recent Res. Dev. Antimicrob. Agents Chemother., 3 (Punto 1) 83-104 (1999); Hertogs y col., Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3) 568-573 (2000); y Larder y col., Antimicrob. Agents Chemother., 43 (8) 1961-1967 (1999), cuyas descripciones se incorporan al presente documento como referencia.

Para resumir, el desarrollo de ensayos de genotipado y fenotipado de alto rendimiento ha permitido el establecimiento de una base de datos que contiene los datos de resistencia fenotípica y las secuencias genotípicas de más de 30.000 aislados clínicos. Los análisis de los datos correlativos y los análisis mutacionales de los agregados de la base de datos permite una búsqueda de patrones mutacionales con la resistencia acompañante. La Tabla 1, a continuación, enumera las mutaciones de aparición más habitual correlacionadas con la resistencia que aparecen en aislados clínicos tras el tratamiento con fármacos antirretrovíricos.

TABLA 1 Ejemplos de mutaciones de aparición habitual correlacionadas con la resistencia que aparecen en aislados clínicos tras el tratamiento con fármacos antirretrovíricos

		Inhibidores de la Proteasa
	D30N	Nelfinavir
Mutaciones Primarias:	M46L, V82A	Indinavir
	G48V, L90M	Saquinavir
	V82A	Ritonavir
	I50V	Amprenavir
Mutaciones Secundarias:	\begin{minipage}[t]{100mm} L101/F/R/V, K20R/M, L24I, V32I, L33F, M36I, M46I, I47V, I54V/L, L63P, A71V/T, G73S V77I, V82A/F/T/S, I84V, N88D, L90M\end{minipage}
Mutaciones Compensadoras:	\begin{minipage}[t]{100mm} En un trasfondo mutacional resistente a PI, las mutaciones en el (los) sitio(s) de escisión gag pueden restaurar parcialmente la eficacia replicadora vírica\end{minipage}
	Inhibidores de la Transcriptasa Inversa
Mutaciones NRTI:	\begin{minipage}[t]{100mm} M41L, K65R, D67N, T69D, K70R, L74V, V75T/M, M184V, L210W, T215Y/F, K219Q/E\end{minipage}
Mutaciones MDR:	\begin{minipage}[t]{100mm} A62V, V75I, F77L, F116Y, Q151M T69S con inserciones relacionadas de 1 a 3 aminoácidos entre los codones 68 y 70 de la RT\end{minipage}
Mutaciones NNRTI:	\begin{minipage}[t]{100mm}A98G, L100I, K101E, K103N/T, V106A, Vl08I, VI79D/E, Yl81C/I Y188C/L/H, G190A, P225H, P236L\end{minipage}
Mutaciones de Inversión:	\begin{minipage}[t]{100mm}M184I/V disminuye el efecto de las mutaciones de resistencia a la zidovudina de M41L y T215Y.\end{minipage}
	\begin{minipage}[t]{100mm}L74V disminuye el efecto de la mutación de resistencia a la zidovudina T215Y.\end{minipage}
	\begin{minipage}[t]{100mm}K65R en un ambiente mutacional (D67N, K70R, T215Y y K219Q) disminuye la resistencia a la zidovudina. \end{minipage}
	\begin{minipage}[t]{100mm} Y181C disminuye el efecto de la mutación de resistencia a la zidovudina T215Y.\end{minipage}

La invención contempla mutaciones correlacionadas con la resistencia en cualquier tipo de terapia para el tratamiento del VIH, incluyendo, pero no limitándose a, mutaciones que confieren resistencia a los Inhibidores de la Proteasa y a los Inhibidores de la Transcriptasa Inversa (NRTIs, NtRTIs y NNRTIs) además de Mutaciones Resistentes a Varios Fármacos.

En una forma de realización, la invención contempla mutaciones que confieren resistencia a los Inhibidores de la Proteasa (PIs). La Tabla 1 enumera dos categorías de mutaciones para todos los PIs: mutaciones primarias y secundarias. Las mutaciones primarias pueden ser el principal contribuyente al desarrollo de resistencia a un fármaco en particular. Las mutaciones secundarias aparecen bien después, durante el curso de la terapia y también dan lugar a resistencia, o bien ya están presentes como polimorfismos naturales en un aislado vírico sin tratamiento previo con PI. Muchas mutaciones secundarias aumentan la resistencia a varios inhibidores PI simultáneamente. Esto puede dar lugar a una amplia resistencia cruzada a esta clase de inhibidores, aunque pueden existir sutiles efectos fenotípicos diferentes en estas mutaciones secundarias.

Sin limitarse a la teoría, las mutaciones que aparecen en el gen de la proteasa pueden deteriorar la eficacia de escisión de la poliproteína por parte de la proteasa. Se han encontrado mutaciones compensadoras en los sitios de escisión gag que permiten una escisión más eficaz de los sitios por parte de las proteasas que han mutado. Numerosos estudios de aislados clínicos procedentes de pacientes tratados con proteasa que han adquirido mutaciones correlacionadas con una resistencia a los PI han mostrado mutaciones en los sitios gag p7/p1 y/o p1/p6 que elevaron significativamente la eficacia replicadora de los virus mutantes.

Otras mutaciones dentro de la práctica de la invención pueden conferir resistencia a los NRTIs y a los NNRTIs. Por ejemplo, las mutaciones que típicamente confieren resistencia al NRTI zidovudina son M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y y K219Q. Las mutaciones múltiples en la transcriptasa inversa del VIH-1 también pueden conferir una resistencia de alto nivel a la zidovudina y a otros NRTIs. Las mutaciones múltiples, cuando están presentes, pueden actuar sinérgicamente, y la susceptibilidad disminuye según aumenta el número de mutaciones correlacionadas con la resistencia. Por ejemplo, las mutaciones correlacionadas con la resistencia a didanosina son L74V, K65R. La resistencia a lamivudina también está correlacionada con el surgimiento de las mutaciones M184V y M184I, que confieren unos niveles de resistencia muy altos. Además de una resistencia de bajo nivel a didanosina y a zalcitabina. También pueden haber presente una resistencia de bajo nivel a lamivudina en ausencia de la mutación 184, mientras que la resistencia al abacavir se correlaciona con las mutaciones K65R, L74V, Y115F y M184V.

Otra forma de realización de la invención se refiere a mutaciones de resistencia a varios fármacos (MDR) y particularmente MDRs a los NRTIs. Por ejemplo, la constelación mutacional de la RT A62V, V75T, F77L, F116Y y Q151M provoca conjuntamente resistencia a todos los análogos de nucleósidos. Las mutaciones que confieren resistencia a los inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (NNRTIs) también están contempladas por la invención. Por ejemplo, algunas mutaciones correlacionadas con la resistencia a la nevirapina son A98G, L100I, K103N, V106A, V108I, Y181C/I, Y188C y G190A. Estas mutaciones son K103/N/T, Y181C y P236L para la delavirdina, y para la resistencia a efavirenz, las mutaciones son L100I, K101E, K103N, V108I, V179D, Y18lC e Y188L.

Otro aspecto de la invención concierne a las mutaciones de inversión. Por ejemplo, la mutación M184V de resistencia a lamivudina disminuye el efecto de las mutaciones de resistencia a zidovudina M41L y T215Y, mientras que la mutación L74V de resistencia a didanosina disminuye el efecto de la mutación T215Y de resistencia a zidovudina. Tanto si los efectos de inversión descritos son fenotípicamente significativos como si no, puede depender, sin embargo, de las combinaciones de mutaciones que haya presentes.

En otra forma de realización, las mutaciones pueden aumentar la sensibilidad a los inhibidores. Por ejemplo, la mutación P236L de delavirdina aumenta la sensibilidad de este mutante a una inhibición por parte de nevirapina, y la mutación de resistencia a lamivudina Ml84V provoca una susceptibilidad aumentada al adefovir y a PMPA por encima de la secuencia no mutante. Esta sensibilidad aumentada parece reflejarse en un resultado del tratamiento mejorado.

Algunas mutaciones nuevas de la transcriptasa inversa (Tabla 2a) y de la proteasa (Tabla 2b) del VIH-1 dentro de la práctica de la invención, y su resistencia fenotípica a fármacos correlacionada, incluyen, pero no se limitan a, las mostradas en la Tabla 2.

TABLA 2a Nuevas mutaciones de la RT y la resistencia a fármacos correlacionada

Mutación de la transcriptasa	Resistente a:	Mutación de la transcriptasa	Resistente a:
inversa		inversa
88E	NNRTI	44D	NRTI
K101H	NNRTI	44A	NRTI
K101N	NNRTI	I181	NRTI
K101P	NNRTI	M184G	NRTI
K101Q	NNRTI	M184L	NRTI
K101T	NNRTI	215V	NRTI
K103H	NNRTI
K103S	NNRTI
K103S + K101P	NNRTI
K103R + K179D	NNRTI

TABLA 2a (continuación)

Mutación de la transcriptasa	Resistente a:	Mutación de la transcriptasa	Resistente a:
inversa		inversa
V179I	NNRTI
V179E	NNRTI
Y181V	NNRTI
G190E	NNRTI
G190S	NNRTI
G190T	NNRTI

TABLA 2b Nuevas mutaciones de la proteasa y la resistencia a fármacos correlacionada

Mutación de la proteasa	Resistente a:
33F + 90M	PI
88T	PI

La existencia de una única mutación o de cualquier combinación de las mutaciones de la Tabla 1 puede conferir resistencia a uno o más tratamientos de la clase correlacionada. Por ejemplo, las mutaciones 88E, K101H, K101N, K101P, K101Q, K101T, K103H, K103S, K103S + K101P, K103R + K179D, V179I, V179E, Y181V, G190E, G190S y G190T son MDRs y confieren resistencia a múltiples NNRTIs, mientras que las mutaciones M184G y M184L sólo se ha encontrado que confieren resistencia a 3TC, y la mutación 215V sólo se ha encontrado que confiere resistencia a AZT. Asimismo, la mutación de la proteasa en 88T confiere resistencia a nelfinavir, mientras que la combinación de mutaciones de la proteasa 33F + 90M confiere resistencia a amprenavir. Sin embargo, si se utilizan las herramientas apropiadas, tales como las descritas en este documento, por ejemplo, el Vircogen, se puede tomar la mutación identificada y la resistencia correlacionada con una clase de tratamiento, según proporciona la Tabla 2, y cribar buscando otros tratamientos aplicables dentro del especificado. Por lo tanto, la invención también prevé que las mutaciones enumeradas y la nueva combinación de mutaciones, provista con la clase de fármaco correlacionada, pueda usarse para predecir nuevos fenotipos de resistencia, tales como la resistencia a PIs, NRTIs o NNRTIs, adicionales o una resistencia MDR. Adicionalmente, la existencia de una combinación de mutaciones puede conferir un mismo o diferente perfil de resistencia a un fármaco.

La invención también proporciona otras nuevas mutaciones y/o mutaciones de combinación y su resistencia a fármacos correlacionada. En particular, un objeto de la presente invención es las mutaciones E44D, E44A y V118I. Cada mutación puede ser capaz independientemente de generar resistencia a un NRTI (3TC).

En otra forma de realización, la invención proporciona una correlación entre cualquier combinación de dos o más de las mutaciones de la RT del VIH E44D, E44A, V118I y/o M184V y la resistencia a uno o más NRTIs, y más específicamente a ZDV y/o 3TC. Anteriormente, sólo se había correlacionado una mutación de metionina a valina o isoleucina en la posición 184 de la transcriptasa inversa del VIH con una resistencia fenotípica significativa a un NRTI (lamivudina). En una forma de realización adicional, una o más de las mutaciones E44D, E44A y V118I, en combinación con una o más de las mutaciones 41L, 67N, 69D, 70R, 210W, 211K, 214F, 215Y, 215F, 219Q y 219E pueden conferir resistencia a uno o más NRTIs, y más específicamente a ZDV y/o 3TC.

Otro aspecto de la invención es un grupo de mutaciones MDR con una, dos o tres inserciones y/o reordenamientos de aminoácidos entre los codones 67 y 70 de la RT, siendo preferiblemente las inserciones 69S-[S-S] o 69S-[S-G]. Estos patrones de mutaciones pueden correlacionarse con una resistencia fenotípica de alto nivel a varios nucleósidos o a varios fármacos. Los mutantes de inserción del codón 69 pueden estar solos o en combinación con otras mutaciones. Otras mutaciones y/o reordenamientos preferibles entre los codones 67 y 70 de la RT se muestran en la Tabla 3. (Los datos de resistencia para varias de estas mutaciones y combinaciones se muestran en la Tabla 4.) Estas mutaciones también pueden conferir resistencia solas o en combinación con otras mutaciones.

En otra forma de realización, las mutaciones y/o reordenamientos entre los codones 67 y 70 de la RT confieren resistencia (MDR) en combinación con una o más de las mutaciones 62V, 210W y/o 215Y.

TABLA 3 Espectro de la heterogeneicidad genética observada entre los codones 67 y 70 de la RT en muestras clínicas que contienen inserciones de aminoácidos.

Secuencia de aminoácidos				n
D67	S68	T69	X	X		K70

D	S	S	-	-		K/R	4
G	Y	T	D	-		R	1
D/E	S	S	S	S		K/R	16
D/E	S/N	S	S	G		K	10
D/E	S	S	E	E		K	3
D/E	S/N	S	S	A		K	3
D/E	S	S	V	G		K/R	2
D	S	S	A	G		K	1
D	S	A	S	G		K	1
D67	S68	X	X	X	T69	K70

D/E	S	S	V	-	T	K	2
D	S	S	T	-	T	K	1
D/E	S	S	S	-	T	K	3
S	S	S	S	G	T/A	-	1
G	S	G	G	G	T	-	1

Los residuos de los aminoácidos naturales se muestran en los encabezamientos principales, y las inserciones de aminoácidos están marcadas como una "X". También se muestran las muestras que sólo tienen la sustitución Thr69Ser. Los residuos de aminoácidos alternativos se muestran en varias posiciones para diferentes muestras, o donde se detectaron nucleótidos mixtos en una misma muestra. Las posiciones en las que no se observó ningún aminoácido están indicadas por un guión (-).

TABLA 4 Susceptibilidad a los análogos de nucleósidos de variantes del VIH-1 construidas mediante mutagénesis dirigida

Genotipo mutante	Coeficientes de aumento en la CI_{50}
	d4t	AZT	3TC	1592	ddI	ddC
69-S-[S-S]	2,3	2,2	6,2	2,6	1,7	2,1
210W, 215Y	1,1	10	3,8	1,5	1,2	1,2
210W, 215Y, 62V	0,7	8	1,3	0,7	0,5	0,8
69-S-[S-S], 210W, 215Y	4,8	220	20	4,6	2,1	4,2
69-S-[S-S], 210W, 215Y, 62V	5,2	>2500	15	5,4	1,8	2,7

Se crearon mutaciones en la RT del VIH-1 mediante mutagénesis dirigida, y la RT mutante se transfirió entonces al trasfondo del virus natural HXB2-D. Las mutaciones específicas creadas en este trasfondo están indicadas. La susceptibilidad a nucleósidos de los virus mutantes (el coeficiente de aumento en los valores de la CI_{50} con respecto al control del virus natural HXB2-D) se evaluó según se describe en "Methods". Estos datos representan los valores medios de dos determinaciones independientes. Los valores medios de las CI_{50} para los virus de control naturales en estos experimentos fueron como sigue: AZT, 0,04 \muM, d4T, 2,39 \muM, 3TC, 1,67 \muM, ddI, 4,6 \muM, ddC, 1,41 \muM y 1592U89, 2,9 \muM.

La presente invención también concibe procedimientos para usar las correlaciones de la invención. En una forma de realización, la invención proporciona una base de datos que comprende la correlación entre: la presencia de al menos una mutación en una transcriptasa inversa del VIH y la resistencia de al menos una cepa del VIH a un inhibidor de la transcriptasa inversa (RTI); o la presencia de al menos una mutación en una proteasa del VIH y la resistencia de al menos una cepa del VIH a un inhibidor de la proteasa (PI).

En una forma de realización adicional, la base de datos puede ayudar al médico a desarrollar un programa de tratamiento o a determinar la terapia o terapia de combinación para el VIH apropiada. Por ejemplo, el sistema de ensayo genotípico VircoGENJ es una herramienta diagnóstica para controlar la resistencia a fármacos del VIH-1. El sistema puede usarse para estudiar el desarrollo de resistencia en ensayos clínicos de fármacos anti-VIH-1, para una supervisión clínica mejorada de los pacientes infectados por el VIH-1 y para estudiar los aspectos epidemiológicos de la resistencia a fármacos. Permite una rápida determinación de la sensibilidad al fármaco de la población de VIH-1 circulante en el plasma de pacientes que han sido expuestos a fármacos antirretrovíricos o que han sido infectados con cepas del VIH-1 resistentes a los fármacos.

La invención también proporciona un procedimiento para controlar la resistencia a fármacos del VIH-1 usando un procedimiento como el usado en el VircoGEN®, que combina en una prueba la determinación de la secuencia genética del material genético del VIH-1 procedente de pacientes y la interpretación de las variaciones en la secuencia encontradas en la cepa de VIH del paciente con respecto a la posible existencia de resistencia a fármacos antivíricos. En una forma de realización, se evalúan las mutaciones relacionadas con la resistencia a los diferentes inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa zidovudina, (AZT), didanosina (ddI), zalcitabina (ddC), estavudina (d4T), lamivudina (3TC) y abacavir, el inhibidor nucleótido de la transcriptasa inversa adefovir (PMEA), de los inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa nevirapina, delavirdina y efavirenz, y de los inhibidores de la proteasa saquinavir, ritonavir, indinavir y nelfinavir. La interpretación del genotipo puede basarse en listas de mutaciones relacionadas con la resistencia a fármacos, publicadas en revistas con revisores externos.

Los procedimientos para controlar la resistencia a fármacos del VIH-1 también pueden usarse en combinación con las pruebas de resistencia fenotípica a fármacos de aislados víricos. Por ejemplo, en una forma de realización, se utiliza una prueba fenotípica que se basa en la construcción de cepas quiméricas del VIH-1 formadas por secuencias de genes de la proteasa (PR) y de la transcriptasa inversa (RT) que son aisladas y amplificadas a partir de ARN vírico del paciente. Estas cepas pueden recombinarse subsiguientemente en linfocitos T CD4+ con un constructo de ADN isogénico de laboratorio estándar (HXB2) del VIH-1 del cual se han eliminado las secuencias del gen PR/RT. Las cepas recombinantes pueden entonces hacerse crecer en presencia de los fármacos antivíricos mencionados anteriormente, y la susceptibilidad de los aislados víricos puede expresarse como el valor del cambio en el coeficiente de la CI_{50} del fármaco de los aislados del paciente con respecto a la CI_{50} del fármaco de una cepa natural del laboratorio de referencia.

En una forma de realización, se prepara la muestra que se va a probar a partir de un paciente, y el ensayo genotípico se realiza mediante análisis automatizados de la secuencia completa de basados en la población (ABI). Por lo tanto, el procedimiento de secuenciación usado puede proporcionar información sobre todos los nucleótidos en la región secuenciada. Los resultados de la secuenciación pueden ser referidos como cambios de aminoácidos en posiciones del gen de la proteasa y del gen de la transcriptasa inversa en comparación con la secuencia de referencia natural. Los cambios incluidos en el informe de genotipado pueden limitarse a mutaciones en posiciones conocidas por manifestar una resistencia a fármacos relacionada con polimorfismos. Los polimorfismos en las posiciones no relacionadas con la resistencia a fármacos no son necesarios.

En otra forma de realización adicional, puede generarse un informe que muestre la región del virus del paciente que ha sido secuenciada, las mutaciones detectadas por la prueba y/o una interpretación de los datos obtenidos. La interpretación puede incluir los fármacos antirretrovíricos, el (los) fármaco(s) para el (los) que se ha identificado una mutación relacionada con una resistencia conocida y/o hasta qué punto las mutaciones observadas son indicativas de una resistencia a los fármacos.

El conocimiento de los genotipos y de los fenotipos correlacionados, junto con el conocimiento del sitio catalítico para nuevos compuestos en el objetivo vírico también puede utilizarse para confeccionar la construcción de nuevas moléculas y la implementación de nuevos tratamientos (de combinación) para el VIH.

En otra forma de realización, la invención concibe un procedimiento para evaluar la eficacia de la terapia antirretrovírica en un paciente infectado por el VIH que comprende: tomar una muestra de un paciente infectado por el VIH; y determinar si la muestra comprende al menos un ácido nucleico que codifica para una transcriptasa inversa del VIH con al menos una mutación o para una proteasa del VIH con al menos una mutación. La muestra puede ser una muestra plasmática, células sanguíneas u otro tejido. Adicionalmente, la invención tiene el potencial de mejorar el análisis de la resistencia genotípica del VIH y puede, en principio, dar lugar a una mejor terapia y, en ciertas condiciones, incluso salvar vidas.

En una forma de realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para identificar o diseñar fármacos eficaces frente a VIH resistente a NNRTI o NRTI, comprendiendo el procedimiento las etapas de proporcionar al menos una cepa de VIH que comprende un ácido nucleico que codifica para una transcriptasa inversa del VIH que contiene al menos una mutación, y determinar la respuesta fenotípica de la cepa del VIH a un fármaco. En otra forma de realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para identificar fármacos eficaces frente a cepas del VIH resistentes a PI, en la que la cepa del VIH comprende una proteasa del VIH que contiene al menos una mutación, y determinar la respuesta fenotípica de dicha cepa del VIH a dicho fármaco. La invención también es útil para la interpretación de la resistencia de aislados de VIH. También puede usarse en el análisis de la secuencia completa del VIH. Además, la invención tiene aplicaciones en análisis del VIH basados en hibridación o en el diseño, desarrollo, comprobación y comercialización de fármacos. En una forma de realización adicional, la invención incluye los fármacos diseñados mediante los procedimientos de la invención.

La invención también proporciona un procedimiento para diseñar una terapia para el tratamiento de pacientes infectados con el VIH que comprende correlacionar la presencia de una transcriptasa inversa del VIH con al menos una mutación descrita anteriormente con la resistencia a al menos un NNRTI o a al menos un NRTI, o correlacionar la presencia de una proteasa del VIH con al menos una mutación con la resistencia a al menos un PI.

La identificación de las mutaciones comparativas de la invención puede dar lugar a programas de tratamiento con fármacos antirretrovíricos mejorados. Según se esquematizó anteriormente, existe una amplia evidencia que demuestra que una respuesta virológica baja a la terapia con fármacos puede estar correlacionada con la existencia de una resistencia vírica genotípica y/o fenotípica a uno, varios, o en el peor de los casos, todos los fármacos antirretrovíricos disponibles. Como consecuencia, las pruebas de resistencia que usan las correlaciones de la invención pueden usarse como una herramienta para identificar aquellos fármacos que ya no contribuyen a la disminución de la carga vírica plasmática.

Ejemplos Ejemplo 1 La identificación de nuevos patrones mutacionales en una transcriptasa inversa del VIH y la resistencia fenotípica correlacionada

Se obtuvieron muestras plasmáticas a partir de individuos infectados por el VIH-1 procedentes de prácticas clínicas rutinarias en Europa y EE.UU., y se enviaron al laboratorio en hielo seco y se almacenaron a -70ºC hasta su análisis. El análisis fenotípico se realizó usando el ensayo del virus recombinante. Véase Kellam, P. y B. A. Larder, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 23-30 (1994); Hertogs, K. y col., Agents Chemother. 42: 269-276 (1998); Pauwels, R. y col., Abstracts of the 2nd International Workshop on HIV Drug Resistance and Treatment Strategies, Resumen 51, Lake Maggiore, Italia, (1998). En resumen, se amplificaron las secuencias codificantes de la proteasa (PR) y de la transcriptasa inversa (RT) a partir de ARN vírico procedente de pacientes, con cebadores específicos para el VIH-1. Tras una recombinación homóloga de los amplicones en un clon provírico sin PR/RT, los virus recombinantes resultantes se recogieron, se valoraron y se usaron para una prueba de susceptibilidad in vitro a fármacos antirretrovíricos. Los resultados de este análisis se expresaron como valores de coeficiente de resistencia, que reflejan el coeficiente de aumento en la CI_{50} (\muM) media de un fármaco en particular cuando se prueba con aislados de virus recombinantes procedentes de un paciente, con respecto a la CI_{50} (\muM) media del mismo fármaco obtenida cuando se prueba con un aislado de un virus de referencia natural (IIIB/LAI). El análisis genotípico se realizó mediante análisis automatizados de la secuencia completa basados en la población (ABI). Los resultados del análisis genotípico se refieren como cambios de aminoácidos en las posiciones cercanas al gen de la transcriptasa inversa comparados con la secuencia de referencia natural (HXB2). El análisis del agregado mediante el programa informático de interpretación VircoGEN^{J} (Virco Ltd, Cambridge, Reino Unido) permitió la detección de la existencia de un patrón mutacional en la base de datos que contiene las secuencias genéticas de los aislados clínicos y su relación con los correspondientes perfiles de resistencia de los mismos aislados. Véase Pauwels, R. y col., 2nd International Workshop on HIV Drug Resistance and Treatment Strategies, Lake Maggiore, Italia, Resumen 51, (1998). Para los estudios de modelado, las mutaciones se generaron en el gen de la RT HXB2, una cepa de laboratorio del VIH-1 natural, usando el kit QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene®, Stratagene Cloning systems, La Jolla, California, EE.UU.

Análisis de los aislados clínicos

La Tabla 5 informa sobre la frecuencia de las mutaciones 44D/A, 118I, 184V, 215Y y 41L en la RT de aislados clínicos con varios niveles de resistencia fenotípica a zidovudina (ZDV) y lamivudina (3TC). Los aislados mutantes aquí descritos se obtuvieron de un conjunto de asilados clínicos.

TABLA 5 Frecuencia de las mutaciones correlacionadas con la resistencia a ZDV y 3TC en aislados clínicos susceptibles o resistentes a ZDV y/o 3TC en comparación con una muestra de aislados totalmente susceptibles

Frecuencia (%) de las mutaciones
Clase^{a} de	Mutaciones correlacionadas	Mutaciones correlacionadas con	Nº de
resistencia	con la resistencia a ZDV	la resistencia a 3TC	muestras
	41L	215Y	184V	44D/A	1181
ZDV (< 4),
3TC (< 4)	4,5	4,8	0	1,3	3,1	314
ZDV (< 4),
3TC (> 10)	18,3	18,8	90	1,3	6,3	240
ZDV (> 10),

TABLA 5 (continuación)

Frecuencia (%) de las mutaciones
Clase^{a} de	Mutaciones correlacionadas	Mutaciones correlacionadas con	Nº de
resistencia	con la resistencia a ZDV	la resistencia a 3TC	muestras
	41L	215Y	184V	44D/A	1181
3TC (< 4)	59, 5	68,9	0	14,9	18,9	74
ZDV (> 10),
3TC (\geq 4, <50)	77	72,2	4	30,2	39,7	126
ZDV (> 10),
3TC (\geq 50)	77,5	66,9	84,1	28,5	37,8	151
^{a} \begin{minipage}[t]{150mm} La resistencia (entre paréntesis) se expresa como el coeficiente de aumento en la CI_{50} media del fármaco relativa a la CI_{50} media del mismo fármaco para una cepa de laboratorio de VIH-l natural de referencia.\end{minipage}

Aislados que son susceptibles (WT) tanto a ZDV como a 3TC (n=195): la frecuencia de cualquiera de las seis mutaciones enumeradas anteriormente fue baja.

Aislados que son resistentes a ZDV (> 10 veces, n=220): la Tabla 5 muestra que las mutaciones correlacionadas con la resistencia a ZDV 215Y, 41L y 70R tenían una frecuencia alta en esta categoría y en todas las categorías de resistencia a 3TC. La mutación 184V era la mutación predominante en la clase de alta resistencia a 3TC (> 50 veces), mientras que 184V era poco frecuente en el grupo de resistencia intermedia a 3TC y estaba ausente en el grupo de baja resistencia y en el grupo susceptible a 3TC. Las mutaciones 44D/A e 118I estaban presentes en todas las categorías de resistencia a 3TC.

Aislados que son resistentes a 3TC (> 10 veces, n=295): la Tabla 5 muestra que la frecuencia de la mutación de alto nivel correlacionada con la resistencia a 3TC 184V, era alta en todas las categorías de resistencia a ZDV (baja, intermedia y alta), y era la mutación predominante en el grupo susceptible y resistente intermedio a ZDV. Según aumentaba la resistencia a ZDV también lo hacía la frecuencia de las mutaciones correlacionadas con la resistencia a ZDV 41L, 70R y 215Y, mientras que la frecuencia de la mutación 184V disminuía. La frecuencia de las mutaciones 44D/A e 118I también aumentaba sustancialmente al aumentar la resistencia a ZDV.

Hasta ahora, los resultados muestran que la resistencia baja e intermedia a 3TC no estaba relacionada con la presencia de la mutación 184V. De hecho, esta mutación estaba prácticamente ausente en estas clases. La Tabla 5 indica además que las mutaciones 44D/A y 118I estaban presentes con alta frecuencia sólo en presencia de las mutaciones de resistencia a ZDV 215Y, 41L y 70R. En los aislados que eran susceptibles a ZDV, la frecuencia de las mutaciones correlacionadas con la resistencia a ZDV era baja, y 44A/D y 118I también eran poco frecuentes, a pesar de que la resistencia a 3TC era más de 10 veces mayor. En este grupo, la alta frecuencia de 184V justificó la resistencia a 3TC.

Análisis de los mutantes generados mediante mutagénesis dirigida

La Tabla 6 muestra los cambios de codones introducidos en un trasfondo natural HXB2 junto con los valores de los coeficientes de resistencia obtenidos cuando se probaron diferentes mutantes en el ensayo de susceptibilidad a fármacos. Los seis mutantes portadores de la mutación 184V eran altamente resistentes a 3TC. Dos de ellos portaban tanto 44D/A como 118I, mientras que todos salvo uno (SDM23) portaba mutaciones correlacionadas con la resistencia a ZDV.

TABLA 6 Mutaciones correlacionadas con la resistencia a 3TC y ZDV y resistencia fenotípica en mutantes con mutaciones dirigidas

1

2

\newpage

Todos los mutantes siguieron el patrón de resistencia o de susceptibilidad a ZDV predicho. Al mismo tiempo se generaron tres mutantes con un cambio en el codón 44, tres con un cambio en el codón 118 y tres con un cambio en los codones 44 y 118. En cada uno de estos tres grupos, dos mutantes portaban también cambios en posiciones correlacionadas con la resistencia a ZDV, mientras que un mutante permaneció natural en esos codones. Los valores de resistencia a fármacos enumerados en la Tabla 6 muestran claramente que la presencia de mutaciones en los codones 44 y 118, individual o conjuntamente, puede causar una resistencia intermedia a 3TC (de 8 a 32 veces), distinguible de la alta resistencia a 3TC (> 62 veces) causada por la mutación 184V. Además, la resistencia intermedia a 3TC sólo se observó cuando se producían mutaciones en las posiciones 44 y/o 118 en un trasfondo resistente a ZDV (41L, 67N, 210W, 215Y) mientras que la resistencia causada por la mutación 184V obviamente no estaba relacionada con la resistencia a ZDV.

La relación entre la presencia de cambios en las posiciones 44 ó 118 de la RT de muestras clínicas y la terapia antirretrovírica

Como puede deducirse a partir de la Tabla 6, los cambios en las posiciones 44 y 118 pueden producirse en muestras de virus con o sin la sustitución M184V, pero aparecían con una mayor incidencia en las muestras con resistencia a ZDV. Era por tanto interesante considerar los tratamientos antirretrovíricos administrados a pacientes con asilados de VIH que contenían 44D o 118I. Se identificaron un subconjunto de 86 muestran con 44D y 88 muestras con 118I procedentes de pacientes cuyos antecedentes antirretrovíricos estaban disponibles. Aunque no era posible extraer conclusiones relativas a la incidencia de los cambios en 44 ó 118 a partir de este subconjunto según los antecedentes de tratamiento, ya que este no era una estudio aleatorio, estos análisis arrojaron no obstante algo de luz sobre las condiciones que pueden dar lugar a mutaciones en estas posiciones.

Para el subconjunto 44D, 50/86 de las muestras procedían de pacientes que estaban recibiendo lamivudina en el momento de tomar la muestra y 5 pacientes de este subconjunto no habían recibido nunca 3TC antes ni hasta la fecha de la toma de la muestra. Los 5 pacientes habían recibido zidovudina/didanosina en algún momento y todos los aislados de VIH eran naturales en la posición 184. La experiencia con el tratamiento de zidovudina era amplia, según se esperaba debido a los antecedentes. Todos los pacientes excepto uno habían recibido zidovudina en combinación con otros NRTIs, y 70/86 también habían recibido una monoterapia con zidovudina en el pasado. El paciente del que se informó que no había recibido un tratamiento previo con zidovudina había recibido estavudina. Esta muestra contenía 41L y 215Y.

Los resultados para el subconjunto 118I eran similares a los de las 55/88 muestras procedentes de pacientes que estaban recibiendo lamivudina en el momento de tomar la muestra, y a los de 2 pacientes que nunca habían recibido lamivudina (ambos habían recibido zidovudina más didanosina). La mayoría de los pacientes, 83/88, había recibido zidovudina en combinación con otros NRTI's, y 70 también habían recibido una monoterapia con zidovudina. Los 5/88 pacientes sin tratamiento previo con zidovudina habían recibido estavudina. Para unos pocos pacientes había disponibles muestras consecutivas que mostraban la evolución de 44D o de 118I.

Estos resultados indican que las mutaciones E44D/A y V118I en la RT del VIH-1 confieren un nivel de resistencia entre bajo e intermedio a 3TC cuando se producen en aislados clínicos que poseen un trasfondo de resistencia a ZDV. El análisis del agregado de los aislados clínicos caracterizados genotípica y fenotípicamente, y los resultados del experimento de mutagénesis dirigida confirman que, de hecho, las mutaciones en los codones 44 y 118 están correlacionadas con un nivel bajo e intermedio de resistencia a 3TC, con la restricción de que estén presentes las mutaciones correlacionadas con la resistencia a ZDV. Adicionalmente, el análisis de las muestras clínicas cuyos antecedentes terapéuticos estaban disponibles y con una amplia exposición previa a ZDV, confirmó los resultados obtenidos de nuestro gran conjunto de datos clínicos, que las mutaciones 44D/A y 118I aparecían en el contexto de mutaciones ZDV.

Las mutaciones 44D/A y 118I eran capaces, cada una independientemente, de generar resistencia a 3TC. El experimento de mutagénesis dirigida no indica la existencia de efectos sinérgicos entre los dos mutantes con respecto a sus efectos fenotípicos sobre la resistencia a 3TC.

Ejemplo 2 Determinación de la base genética de la resistencia a varios nucleósidos del VIH-1

Este estudio se diseñó para investigar la aparición de resistencia a varios nucleósidos del VIH-1 en un número relativamente grande de muestras clínicas, y para determinar la base genética de esta resistencia. Se prospectaron 892 muestras de VIH-1 en nuestra base de datos de resistencia procedentes de pacientes con fracaso en la terapia usando un ensayo fenotípico estandarizado recombinante y mediante un análisis de la secuencia de ADN. La resistencia a varios nucleósidos se correlacionó con complejos patrones mutacionales en la región codificante de la RT. Se obtuvieron muestras plasmáticas de pacientes que habían recibido una terapia antirretrovírica. La selección se realizó según una carga vírica > 1000 copias de ARN de VIH-1/ml, y para el propósito de este estudio, los pacientes con este nivel plasmático de VIH-1 se consideraron como una terapia fracasada.

Se extrajo el ARN vírico de 200 \mul de plasma del paciente usando el kit de extracción de ARN QIAamp Viral RNA Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), según las instrucciones del fabricante. Se produjo ADNc que englobaba parte del gen pol usando transcriptasa inversa Expand® (Boehringer Mannheim) según se describió previamente. Véase Hertogs K. y col., Antimicrob. Agents Chemother. 42: 269-276 (1998). Entonces se amplificó un fragmento de 2,2 kb que codificaba las regiones de la proteasa y de la RT mediante una reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR) usando los cebadores de PCR y las condiciones según se describió. Id. Este material genético se usó subsiguientemente en ambos experimentos de fenotipado y genotipado. Se co-transfectaron células MT-4 (Harada S., y col., Science 229: 563-566 (1985) con los fragmentos del gen pol de la PCR y el clon molecular del VIH-1 sin proteasa ni RT, pGEM3\DeltaPRT, según se describió. Véase Hertogs K. y col., Antimicrob. Agents Chemother. 42: 269-276 (1998). Esto dio como resultado virus recombinantes viables que contenían proteasa/RT del fragmento de PCR del donante. Se determinó la susceptibilidad fenotípica a los análogos de nucleósidos usando un ensayo de protección del efecto citopático vírico (CPE) en células MT4 según se describió. Id. Los valores del coeficiente de resistencia se dedujeron dividiendo la CI_{50} media del virus recombinante de un paciente por la CI_{50} media del virus de control natural (cepa HXB2-D). Los productos de la PCR obtenidos a partir de las muestras plasmáticas del paciente se genotiparon mediante análisis de la secuencia basado en los didesoxinucleótidos. Las muestras se secuenciaron usando el kit Big Dye terminator (Applied Biosystems) y se resolvieron en un secuenciador de ADN ABI 377.

Las mutaciones en la región codificante de la RT se crearon mediante mutagénesis dirigida de un fragmento de la enzima de restricción natural HXB2-D EcoRI-Pstl que englobaba el gen pol del VIH, y se clonó en pGEM3 (Promega). Los cambios de nucleótidos simples y múltiples se introdujeron en la RT usando el kit de mutagénesis ExSite (Strategene). Todos los clones mutantes se verificaron mediante análisis de la secuencia de ADN de la RT completa. Se prepararon fragmentos de PCR a partir de los clones mutados, y las regiones codificantes alteradas de la RT se transfirieron al trasfondo genético HXB2-D del VIH-1 mediante recombinación homóloga según se describió anteriormente. Subsiguientemente se determinó la susceptibilidad de estos virus recombinantes a los análogos de nucleósidos mediante el ensayo de protección CPE en células MT-4. Id.

Análisis de susceptibilidad fenotípica

Se usó el ensayo de virus recombinante (Antivirogram®) para determinar simultáneamente la susceptibilidad de las muestras a AZT, 3TC, d4T ddI y ddC. A partir de este análisis se identificaron 302 muestras con aumentos de cuatro veces o mayores en la CI_{50} (con respecto al virus de control natural) en al menos cuatro de estos inhibidores. Por lo tanto, había presente un número sustancial de virus MDR en la población de la muestra.

Análisis genotípico de muestras resistentes a varios nucleósidos

El análisis genotípico se realizó en las 892 muestras mediante la secuenciación de los didesoxinucleótidos. Se observaron patrones complejos de mutaciones múltiples en las regiones codificantes de la RT en las muestras MDR. Estos incluían combinaciones de mutaciones de resistencia a AZT y 3TC (particularmente 41L, 67N, 210W y 215Y con 184V/I) más mutaciones en los codones 69 (T69A/N) y/o 75 (V75M). En la figura 1 se muestra una comparación de la incidencia de mutaciones específicas de la RT en muestras MDR frente a muestras no MDR en la población escrutada. Este análisis resaltó la incidencia del agrupamiento mutacional del codón 151 en el grupo MDR. Además, en el grupo MDR también era prevalente una nueva familia de inserciones y reordenamientos de aminoácidos entre los codones 67 y 70. Estos dos patrones de mutaciones se correlacionaban con un alto nivel de resistencia fenotípica a varios nucleósidos (figura 2), teniendo 27 muestras el agrupamiento del codón 151 y teniendo 45 muestras inserciones y reordenamientos (típicamente una sustitución T69S, seguida de la inserción de dos aminoácidos). Los coeficientes de aumento medio en la CI_{50} de d4T, ddI y ddC para estos diferentes grupos se muestran en la figura 2. Este análisis indicó que los mutantes de inserción del codón 69 tenían un alto grado de resistencia a d4T y ddC (> 10 veces), lo que también se observó en el agrupamiento del codón 151. Sin embargo, las muestras con mutaciones de resistencia a AZT y 3TC más T69A/N o V175M sólo mostraron unos pequeños niveles de resistencia a estos fármacos (figura 2). No sorprendentemente, los cuatros grupos mostrados en la figura 2 eran altamente resistentes a AZT y 3TC (coeficiente de aumento medio en la CI_{50} de AZT de > 500 veces y > 30 veces para 3TC). Esto se debía a que muchas muestras MDR contenían mutaciones que conferían resistencia a AZT (por ejemplo, 41L, 67N, 210W y 215Y) y resistencia a 3TC (Met184V/I).

Espectro de las diferentes inserciones observadas en la región de la RT entre los codones 67 y 70

La amplia variedad de inserciones en la región de la RT entre los codones 67 y 70 se resumen en la Tabla 3.

El grupo más grande (n=16) tenía una sustitución T69S seguida de una inserción de dos residuos de S. El siguiente grupo más grande (n=10) también tenía una sustitución T69S, pero en este caso una inserción diferente de S-G. Las muestras con varios dobles aminoácidos diferentes insertados después de la 69Ser también se identificaron. Además, también se observaron inserciones de dos o tres aminoácidos entre los codones 68 y 69. Las posiciones de estas inserciones se basaron en el hecho de que T69 y L70 eran contiguos. En algunas muestras se observaron raramente sustituciones en el codón 67 (A67G/S/G), en lugar de la habitual mutación 67N de resistencia a AZT. En dos muestras se observó la deleción del codón 70 (tras la inserción de tres residuos entre los codones 68 y 69), y se observó una sustitución simple de T69S sin una inserción en cuatro muestras (Tabla 3). Los residuos insertados no mostraron ningún patrón obvio en términos de uso del codón. Por ejemplo, las inserciones S-S raramente eran repeticiones directas del codón S69, lo que sugiere que unas simples reiteraciones de S69 no pueden justificar la aparición de estas inserciones en la RT.

Patrones de terapia de pacientes con respecto a las inserciones en el codón 69

Las inserciones en el codón 69 siempre estaban presentes en un trasfondo de mutaciones de resistencia a AZT, especialmente T215Y/F. Esto puede no ser sorprendente, dado que los antecedentes terapéuticos de muchos de los pacientes cuyas muestras se analizaron en este estudio revelaron un patrón común de terapia con AZT, seguido de una terapia de combinación con nucleósidos e inhibidores de la proteasa (datos no mostrados). La figura 3 muestra los patrones de tratamiento típicos de tres pacientes, indicando el momento en el que se obtuvieron las muestras para los análisis virológicos. A partir de estos antecedentes no fue posible determinar de forma precisa el(los) análogo(s) de nucleósidos responsables de la selección de inserciones en el codón 69. Las muestras secuenciales del paciente 1 revelaron una interesante transición de 69S-[S-S] a 69S-[S-G] durante un periodo de terapia de combinación con 3TC/d4T.

Análisis de la susceptibilidad de variantes del VIH-1 construidas mediante mutagénesis dirigida

Para investigar la trascendencia de los patrones mutacionales observados correlacionados con virus MDR construimos una serie de virus mediante mutagénesis dirigida con cambios específicos en un trasfondo genético definido (HXB2-D). T69A o V75M en un trasfondo de mutaciones AZT confirieron poca o ninguna resistencia a 3TC, d4T, ddI o ddC. También se construyeron variantes con 69S-[S-S], sola o junto con mutaciones de resistencia a AZT (210W y 215Y). Además, se investigó el papel potencial de A62V, una sustitución también correlacionada frecuentemente con las inserciones, añadiendo esta mutación a un trasfondo de 69S-[S-S] más 210W/215Y. En la Tabla 4 se resumen los datos de susceptibilidad a seis análogos de nucleósidos. Estos datos mostraron que la inserción 69S-[S-S] aislada no confería una resistencia a varios nucleósidos. De hecho, este virus sólo tuvo una significativa disminución en la susceptibilidad a 3TC. Por el contrario, las variantes con el inserto más mutaciones de resistencia a AZT habían disminuido la susceptibilidad a AZT, 3TC, d4T, ddC y abacavir (4-[(2-amino-6-cilopropil-amino)-9H-purin-9-il]-2-ciclopentén-l-metanol, 1592U89), confirmando que las 69 inserciones más las mutaciones AZT conferían el fenotipo MDR.

Claims

1. Un sistema informático dirigido por un programa informático, en el que el programa informático correlaciona la presencia de al menos una mutación en una transcriptasa inversa del VIH y la resistencia de al menos una cepa del VIH a un inhibidor de la transcriptasa inversa, caracterizado porque: el programa informático usa un primer conjunto de registros correspondientes a una correlación entre al menos una primera mutación elegida entre 88E, 101H, 101N, 101P, 101Q, 101T, 103H, 103S, 179I, 179E, 181V, 190E, 190S, 190T o la combinación de 103R y 179D, y la resistencia a al menos un inhibidor no nucleósido de la transcriptasa inversa; y un segundo conjunto de registros correspondientes a una correlación entre al menos una segunda mutación elegida entre 69S-[S-S], 184G, 184L, 215V, 44D, 44A o 118I, y la resistencia a al menos un inhibidor nucleósido de la transcriptasa inversa.

2. El sistema informático según la reivindicación 1, en el que dicha al menos una primera mutación es 103S y dicho inhibidor de la transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional 101P.

3. El sistema informático según la reivindicación 1, en el que dicha al menos una segunda mutación se elige entre 44D, 44A o 118I, y dicha transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional elegida entre 41L, 67N, 69D, 70R, 210W, 211K, 214F, 215Y, 215F, 219Q o 219E.

4. El sistema informático según la reivindicación 3, en el que dicha al menos una segunda mutación es una combinación de mutaciones elegida entre 118I y 44D; 118I y 44A; y 118I, 44A y 44D.

5. El sistema informático según la reivindicación 1, en el que dicha al menos una segunda mutación es 69S-[S-S] y dicha transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional elegida entre 62V, 210W, 215Y.

6. Un sistema informático dirigido por un programa informático en el que el programa informático correlaciona la presencia de al menos una mutación en una proteasa del VIH y la resistencia de al menos una cepa del VIH a un inhibidor de la proteasa, caracterizado porque el programa informático usa una base de datos que comprende un primer conjunto de registros correspondientes a una correlación entre al menos una primera mutación elegida entre 88T y la combinación de las mutaciones 33F y 90M.

7. Un procedimiento para evaluar la eficacia de una terapia antivírica de un paciente infectado por el VIH que comprende:

(i) determinar si una muestra tomada de un paciente infectado por el VIH comprende al menos un ácido nucleico elegido entre:

(a): un primer ácido nucleico que codifica para una transcriptasa inversa del VIH con al menos una mutación elegida entre 88E, 101H, 101N, 101P, 101Q, 101T, 103H, 103S, 179I, 179E, 181V, 190E, 190S, 190T y la combinación de las mutaciones 103R y 179D, en el que la presencia de dicha al menos una mutación se correlaciona con la resistencia a al menos un NNRTI;

(b): un segundo ácido nucleico que codifica para una transcriptasa inversa del VIH con el menos una mutación elegida entre 69S-[S-S], 184G, 184L, 215V, 44D, 44A, y 118I, en el que la presencia de dicha al menos una mutación se correlaciona con la resistencia a al menos un NRTI; y

(c): un tercer ácido nucleico que codifica para una proteasa del VIH con al menos una mutación elegida entre 88T y la combinación de las mutaciones 33F y 90M, en el que la presencia de dicha al menos una mutación se correlaciona con la resistencia a al menos un PI; y

(ii) usar la presencia de dicho de dicho al menos un ácido nucleico para evaluar la eficacia de dicha terapia antivírica.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha al menos una mutación de dicho primer ácido nucleico es 103S, y dicha transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional 101P.

9. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha al menos una mutación de dicho segundo ácido nucleico se elige entre 44D, 44A y 118I, y dicha transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional elegida entre 41L, 67N, 69D, 70R, 210W, 211K, 214F, 215Y, 215F, 219Q y 219E.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha al menos una mutación de dicho segundo ácido nucleico es una combinación de mutaciones elegida entre 118I y 44D; 118I y 44A; y 118I, 44A y 44D.

11. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha al menos una mutación de dicho segundo ácido nucleico es 69S-[S-S] y dicha transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional elegida entre 62V, 210W, 215Y.

12. Un procedimiento para identificar un fármaco eficaz frente a cepas del VIH resistentes a NNRTI, que comprende:

(a) proporcionar al menos una cepa del VIH que comprende una transcriptasa inversa del VIH que contiene al menos una mutación elegida entre 88E, 101H, 101N, 101P, 101Q, 101T, 103H, 103S, 179I, 179E, 181V, 190E, 190S, 190T o la combinación de las mutaciones 103R y 179D;

(b) determinar una respuesta fenotípica a dicho fármaco de dicha cepa del VIH; y

(c) usar dicha respuesta fenotípica para determinar la eficacia de dicho fármaco.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha respuesta fenotípica se determina usando el ensayo de virus recombinante.

14. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicha al menos una mutación es 103S y dicha transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional 101P.

15. Un procedimiento para identificar un fármaco eficaz frente a cepas del VIH resistentes a NRTI, que comprende:

(a) proporcionar al menos una cepa del VIH que comprende una transcriptasa inversa del VIH que contiene al menos una mutación elegida entre 69S-[S-S], 184G, 184L, 215V, 44D, 44A o 118I;

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicha respuesta fenotípica se determina usando el ensayo de virus recombinante.

17. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicha al menos una mutación se elige entre 44D, 44A y 118I y dicha transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional elegida entre 41L, 67N, 69D, 70R, 210W, 211K, 214F, 215Y, 215F, 219Q o 219E.

18. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicha al menos una mutación es una combinación de mutaciones elegida entre 118I y 44D; 118I y 44A; o 118I, 44A y 44D.

19. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicha al menos una mutación es 69S-[S-S] y dicha transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional elegida entre 62V, 210W o 2l5Y.

20. Un procedimiento para identificar un fármaco eficaz frente a cepas del VIH resistentes a PI que comprende:

(a) proporcionar al menos una cepa del VIH que comprende una proteasa del VIH que contiene al menos una mutación elegida entre 88T o la combinación de las mutaciones 33F y 90M,

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que dicha respuesta fenotípica se determina usando el ensayo de virus recombinante.

22. Un procedimiento para diseñar una terapia para el tratamiento de un paciente infectado por el VIH que comprende:

(b): un segundo ácido nucleico que codifica para una transcriptasa inversa del VIH con al menos una mutación elegida entre 69S-[S-S], 184G, 184L, 215V, 44D, 44A, y 118I, en el que la presencia de dicha al menos una mutación se correlaciona con la resistencia a al menos un NRTI; y

(ii) usar la presencia de dicho de dicho al menos un ácido nucleico para diseñar la terapia para dicho paciente.

23. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicha al menos una mutación de dicho primer ácido nucleico es 103S, y dicha transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional 101P.

24. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicha al menos una mutación de dicho segundo ácido nucleico se elige entre 44D, 44A y 118I, y dicha transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional elegida entre 41L, 67N, 69D, 70R, 210W, 211K, 214F, 215Y, 215F, 219Q y 219E.

25. El procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha al menos una mutación de dicho segundo ácido nucleico se elige entre una combinación de mutaciones elegida entre 118I y 44D; 118I y 44A; y 118I, 44A y 44D.

26. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicha al menos una mutación de dicho segundo ácido nucleico es 69S-[S-S] y dicha transcriptasa inversa del VIH comprende además al menos una mutación adicional elegida entre 62V, 210W, 215Y.

27. Un procedimiento para determinar la sensibilidad a un fármaco de una población de VIH circulante en un paciente que comprende:

(a) determinar una secuencia genética de material genético del VIH a partir de una muestra tomada de un paciente infectado por el VIH;

(b) determinar si hay al menos una mutación presente en la secuencia genética;

(c) identificar si la mutación coincide con una mutación relacionada con la resistencia a un fármaco elegida entre

(i): 88E, 101H, 101N, 101P, 101Q, 101T, 103H, 103S, 179I, 179E, 181V, 190E, 190S, 190T y la combinación de las mutaciones 103R y 179D, en el que la presencia de dicha mutación se correlaciona con la resistencia a al menos un inhibidor no nucleósido de la transcriptasa inversa;

(ii): 69S-[S-S], 184G, 184L, 215V, 44D, 44A y 118I, en el que la presencia de dicha mutación se correlaciona con la resistencia a al menos un inhibidor nucleósido de la transcriptasa inversa; y

(iii): 88T y la combinación de las mutaciones 33F y 90M, en el que la presencia de dicha mutación se correlaciona con la resistencia a al menos un PI; y

(d) generar un informe que enumera fármacos antivíricos para los que se han identificado las mutaciones relacionadas con la resistencia a fármacos de la etapa (c), en el que el informe se usa para determinar la sensibilidad a un fármaco de una población de VIH circulante en el paciente.