ES2245964T3 - Metodo, reactivos, cartucho y dispositivo para determinar el fibrinogeno. - Google Patents
Metodo, reactivos, cartucho y dispositivo para determinar el fibrinogeno.Info
- Publication number
- ES2245964T3 ES2245964T3 ES01123538T ES01123538T ES2245964T3 ES 2245964 T3 ES2245964 T3 ES 2245964T3 ES 01123538 T ES01123538 T ES 01123538T ES 01123538 T ES01123538 T ES 01123538T ES 2245964 T3 ES2245964 T3 ES 2245964T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sample
- fibrinogen
- thrombin
- reagent
- coagulation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 title claims abstract description 220
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 title claims abstract description 220
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 title claims abstract description 220
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 174
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- FBPFZTCFMRRESA-ZXXMMSQZSA-N D-iditol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-ZXXMMSQZSA-N 0.000 title 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims abstract description 115
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims abstract description 115
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 76
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 70
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 60
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 42
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 25
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 230000035602 clotting Effects 0.000 claims abstract description 20
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims abstract description 16
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 130
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 130
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 32
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 claims description 30
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical group CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N bivalirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N 0.000 claims description 10
- 108010055460 bivalirudin Proteins 0.000 claims description 10
- 229960001500 bivalirudin Drugs 0.000 claims description 10
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 claims description 10
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 10
- 108010087765 Antipain Proteins 0.000 claims description 9
- SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N antipain Chemical group NC(N)=NCCC[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N 0.000 claims description 9
- HQRHFUYMGCHHJS-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HQRHFUYMGCHHJS-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 8
- -1 Polysaccharide sulfate Chemical class 0.000 claims description 8
- KSXQTGMWWMBCIP-VXMGFIRPSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r)-6-oxo-1,2,4,5-tetrasulfooxy-6-[3-[[(2r,3s,4r,5r)-2,3,5,6-tetrasulfooxy-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trisulfooxy-6-(sulfooxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexanoyl]amino]propylamino]hexan-3-yl]oxy-3,5-disulfooxy-6-(sulfooxymethyl)oxan- Chemical group O([C@H]([C@H](OS(O)(=O)=O)COS(=O)(=O)O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](OS(O)(=O)=O)C(=O)NCCCNC(=O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O1)OS(O)(=O)=O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)[C@@H]1O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]1OS(O)(=O)=O KSXQTGMWWMBCIP-VXMGFIRPSA-N 0.000 claims description 8
- 229960003856 argatroban Drugs 0.000 claims description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 108010062266 glycyl-glycyl-argininal Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N argatroban Chemical compound OC(=O)[C@H]1C[C@H](C)CCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NS(=O)(=O)C1=CC=CC2=C1NC[C@H](C)C2 KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 6
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 5
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims description 4
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 4
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 3
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 150000003950 cyclic amides Chemical class 0.000 claims 3
- XPRCPVGCTGELMN-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-(4-carbamimidoylphenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 XPRCPVGCTGELMN-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 2
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 claims 2
- RIBOZFDUYGSFPW-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-(4-carbamimidoylphenyl)propanamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 RIBOZFDUYGSFPW-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 1
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 21
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 116
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 38
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 9
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 9
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 8
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 7
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 7
- 229940123900 Direct thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 4
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 108010025801 glycyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 3
- KXNPVXPOPUZYGB-IOVMHBDKSA-N (2R,4R)-1-[(2S)-5-(diaminomethylideneamino)-2-[(3-methyl-1,2,3,4-tetrahydroquinolin-8-yl)sulfonylamino]-1-oxopentyl]-4-methyl-2-piperidinecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C[C@H](C)CCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NS(=O)(=O)C1=CC=CC2=C1NCC(C)C2 KXNPVXPOPUZYGB-IOVMHBDKSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940099563 lactobionic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- WSPBFCKHMXMESR-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-(4-aminophenyl)propanamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N)C=C1 WSPBFCKHMXMESR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- JYPCXBJRLBHWME-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Arg Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229940098704 Heparin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000748245 Villanova Species 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000012042 active reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 1
- 229940127217 antithrombotic drug Drugs 0.000 description 1
- 229950010335 aprosulate sodium Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007836 assay cartridge Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-prolyl-L-arginine Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002607 heparin antagonist Substances 0.000 description 1
- CXKOATPJKFZCEL-HPXJARCXSA-A hexadecasodium;[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r)-6-oxo-1,2,4,5-tetrasulfonatooxy-6-[3-[[(2r,3s,4r,5r)-2,3,5,6-tetrasulfonatooxy-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trisulfonatooxy-6-(sulfonatooxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexanoyl]amino]propylamino]hexan-3-yl]oxy-3,5-dis Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].O([C@H]([C@H](OS([O-])(=O)=O)COS(=O)(=O)[O-])[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](OS([O-])(=O)=O)C(=O)NCCCNC(=O)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@H](O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](COS([O-])(=O)=O)O1)OS([O-])(=O)=O)[C@@H](COS([O-])(=O)=O)OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H](COS([O-])(=O)=O)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@H]1OS([O-])(=O)=O CXKOATPJKFZCEL-HPXJARCXSA-A 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011850 initial investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012622 synthetic inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
- G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un método para determinar el fibrinógeno en una muestra sospechosa de contener fibrinógeno, comprendiendo poner en contacto una muestra sospechosa de contener fibrinógeno con un inhibidor de trombina y trombina, y determinando el tiempo de coagulación, donde la concentración de fibrinógeno de la muestra es inversamente proporcional al tiempo de coagulación.
Description
Método, reactivos, cartucho y dispositivo para
determinar el fibrinógeno.
La presente invención está relacionada con el
campo de la determinación de componentes de fluidos biológicos, y
más concretamente, está relacionada con los métodos, reactivos,
cartuchos de prueba y los dispositivos útiles para determinar el
fibrinógeno en muestras fisiológicas, preferiblemente en muestras de
sangre completa no diluida y en plasma sanguíneo no diluido.
El reconocimiento del papel potencial del
fibrinógeno en trastornos cardiovasculares ha aumentado la necesidad
de ensayos de fibrinógeno simples y fiables. Los métodos para
determinar el fibrinógeno previamente existentes dentro de la
materia incluyen los ensayos de fibrinógeno dependientes del tiempo
de coagulación, que determinan el tiempo de coagulación de una
muestra diluida y correlacionan el tiempo de coagulación con la
concentración de fibrinógeno en una muestra en la que el tiempo de
coagulación es inversamente proporcional a la cantidad de
fibrinógeno. Además, los ensayos de proteínas totales se han
realizado para determinar la cantidad de proteína en un coagulo, que
está correlacionada con una concentración inicial de fibrinógeno. El
primer tipo de técnica requiere una dilución para poder disminuir el
índice de coagulación y así facilitar la obtención de resultados
significativos, mientras que el segundo tipo de técnica requiere
aislar un coágulo a partir de la muestra, lavar el coágulo, y
determinar el contenido proteico. En vista del deseo de minimizar la
manipulación de fluidos biológicos, como la sangre, existe una
necesidad de métodos de ensayo mejorados que minimicen la
manipulación de la muestra. Así, es particularmente deseable tener
un ensayo que pueda utilizar una muestra no diluida, pero que evite
los problemas causados por una coagulación rápida.
La necesidad de métodos de ensayo mejorados que
minimizan la manipulación de muestras está demostrada en la patente
estadounidense 5.292.664, Fickenscher, que revela una prueba y un
reactivo para determinar el fibrinógeno en muestras de plasma no
diluidas. El método de Fickenscher incluye la adición de un gran
exceso de trombina, o una proteasa con una actividad análoga, para
asegurar la conversión inmediata de todo el fibrinógeno de la
muestra a monómeros de fibrina. En una realización preferida del
método de Fickenscher, se añade un inhibidor de heparina para evitar
la inhibición de la trombina. Sin embargo, la agregación de los
monómeros de fibrina se ralentiza por la adición de un inhibidor de
la agregación de fibrina, ralentizando por lo tanto la formación de
coágulos. El tiempo de coagulación a una concentración constante de
un inhibidor de la agregación de la fibrina puede estar
correlacionado con la concentración de fibrina, y por lo tanto,
llevar a una determinación del nivel de fibrinógeno en la muestra
original. Así, el método de Fickenscher de inhibición de coagulación
fomenta una reacción inicial en la cadena de coagulación, seguida
por una inhibición de la siguiente reacción. Este método requiere
que la muestra esté combinada con un inhibidor de la agregación de
fibrina con prioridad a la adición del exceso de trombina, si no la
coagulación tendrá lugar demasiado rápido como para permitir que el
método sea útil.
La información sobre el papel fisiológico del
fibrinógeno y ensayos anteriores es abundante y está fácilmente
disponible, a la par que conocida por aquéllos expertos en la
materia. Se puede encontrar más información respecto a los
antecedentes en: National Committee for Clinical Laboratory
Standards, Procedure for the Determination of Fibrinogen in Plasma;
Approved Guideline. NCCLS document H30-A. (ISBN
1-56238-221-7),
NCCLS, 771 East Lancaster Avenue, Villanova, Pennsylvania (19085
(1994); Patente estadounidense 5.563.041 y patente canadiense
2.252.983.
Existe una necesidad de un ensayo de fibrinógeno
de un solo paso para sangre no diluida completa y los reactivos y
dispositivos correspondientes. El término "un solo paso" se
refiere a los pasos de la manipulación de la muestra del ensayo,
como el número de manipulaciones necesarias para determinar el
fibrinógeno en una muestra. También existe una necesidad de ensayos
de fibrinógeno dependiente del tiempo de coagulación en los que el
tiempo de coagulación de la muestra es menor que aproximadamente
trescientos segundos para las muestras que contengan un gran rango
de concentraciones de fibrinógeno y en los que las diferencias
clínicamente significativas en la concentración del fibrinógeno de
la muestra se correlacionen con diferencias fáciles de medir y
fiables en cuanto al tiempo de coagulación.
También existe una necesidad de reactivos para
ensayos de fibrinógeno que sean estables, de coste efectivo,
fácilmente disponibles, que puedan ser usados en una forma seca y
puedan disolverse por la muestra de interés, y que proporcionen
resultados coherentes entre unas muestras y otras. También es
deseable que los contenedores de la muestra y otras superficies que
entran en contacto con las muestras, particularmente las muestras de
sangre, sean desechables y proporcionen oportunidades mínimas de
contacto humano con la muestra. Así, existe también la necesidad de
un cartucho útil en un dispositivo de determinación del tiempo de
coagulación automatizado, que satisfaría todas o la mayoría de estas
necesidades. También existe la necesidad de un dispositivo
automatizado que informe directamente de la cantidad de fibrinógeno
en una muestra.
La presente invención incluye un método, un
reactivo, un cartucho de prueba y un dispositivo para determinar el
fibrinógeno en una muestra fisiológica, como la sangre completa o
plasma sanguíneo no diluido. El método, reactivo, cartucho de prueba
y dispositivo utilizan la trombina y un inhibidor de trombina. Con
la trombina y el inhibidor de trombina añadidos, se mide el tiempo
de coagulación de una muestra. Puesto que el tiempo de coagulación
de una muestra de sangre o plasma sanguíneo es inversamente
proporcional a la concentración de fibrinógeno, el tiempo de
coagulación puede usarse para determinar la concentración de
fibrinógeno de la muestra por referencia a los tiempos de
coagulación de estándares de fibrinógeno que se han puesto en
contacto con cantidades constantes de ingredientes activos
reactivos.
En una realización preferida de la presente
invención, la muestra fisiológica no está diluida, como por ejemplo
una muestra de sangre completa o una muestra de plasma sanguíneo sin
diluir. Preferiblemente, la actividad de la trombina añadida, así
como la actividad de la trombina endógena en muestras de sangre, es
inhibida en el ensayo, lentificando así el índice de conversión de
fibrinógeno en la muestra a fibrina. En una realización preferida,
el tiempo de coagulación es suficientemente lento en muestras que
contienen el rango de concentraciones de fibrinógeno de interés
clínico, cosa que permite que las diferencias en el tiempo de
coagulación puedan relacionarse fácilmente con los diferentes
niveles de fibrinógeno. En una realización preferida, se usa un
reactivo del ensayo que contiene una cantidad predeterminada de
trombina y un inhibidor de trombina que ralentiza, pero no para, la
actividad enzimática de la trombina respecto a la conversión de
fibrinógeno en fibrina.
En una realización preferida, se proporciona un
dispositivo para determinar la concentración de fibrinógeno en la
muestra, incluyendo un cartucho que incorpora un reactivo de la
presente invención, incluyendo trombina y un inhibidor de trombina.
En una realización, se proporcionan el cartucho de prueba y el
reactivo, y pueden utilizarse en un ensayo de un solo paso para
determinar el fibrinógeno en una muestra de sangre completa no
diluida.
En otra realización, la cartucho de la prueba y
el reactivo se usan en un ensayo de dos pasos para determinar el
fibrinógeno en plasma sanguíneo no diluido; siendo el primer paso la
adición de un material detectable, como por ejemplo, pero no
exclusivamente, partículas de látex como sucedáneo para los
eritrocitos que serían detectados en una muestra de sangre completa,
y siendo el segundo paso idéntico al ensayo de un solo paso para
determinar el fibrinógeno en sangre completa.
En una realización preferida, el dispositivo de
la presente invención incluye un procesador para convertir el tiempo
de coagulación de la muestra en concentración de fibrinógeno en la
muestra. El dispositivo incluye preferiblemente un indicador o algún
tipo de utensilio que permita una fácil lectura para poder informar
automáticamente de la concentración de fibrinógeno en la muestra al
operador del dispositivo, y opcionalmente puede también proporcionar
el tiempo de coagulación de la muestra. En una realización
alternativa, se proporciona un reactivo y un método que pueden ser
usados en un ensayo de un solo paso utilizando un fibrómetro para
determinar el fibrinógeno en una muestra de plasma sanguíneo no
diluido o una muestra de sangre completa no diluida, donde el tiempo
de coagulación de una muestra se basa en el tiempo necesario, tras
el contacto de la muestra con el reactivo, para que la sonda del
fibrómetro detecte un grado predeterminado de resistencia al
movimiento en la muestra. El tiempo de coagulación es luego usado
para determinar la cantidad de fibrinógeno en la muestra.
Así, una realización de la presente invención es
un dispositivo de uso en la determinación de fibrinógeno en una
muestra susceptible de contener fibrinógeno, comprendiendo un
recipiente para poner en contacto la muestra sospechosa de contener
fibrinógeno con un reactivo que provoca la conversión de fibrinógeno
en fibrina, causando así la coagulación, un sensor para detectar un
grado de coagulación predeterminado, un temporizador para determinar
la cantidad de tiempo para alcanzar un grado de coagulación
determinado, un procesador que convierte el tiempo de coagulación en
cantidad de fibrinógeno de una muestra, y un visualizador que puede
informar de la cantidad de fibrinógeno en la muestra.
Preferiblemente, el dispositivo incluye también un reactivo que
provoca la conversión de fibrinógeno en fibrina, donde el reactivo
incluye trombina y un inhibidor de trombina. El visualizador puede
ser electrónico o puede ser una impresora que imprime los
resultados. El visualizador también puede informar del tiempo de
coagulación, así como de otros parámetros.
Los inhibidores de trombina preferidos (también
referidos aquí como moduladores de la actividad de la trombina) para
su uso en la invención incluyen un sulfato de polisacárido, por
ejemplo el sulfato de dextrano; un péptido con propiedades
inhibidoras de trombina adecuadas, por ejemplo
Gly-Pro-Ala o
Gly-Gly-Arg; una xantina, por
ejemplo la cafeína; un polianetolsulfato; un polivinilsulfato; ácido
bislactobiónico (p.ej. aprosulato); una benzamidina, por ejemplo una
amida cíclica de 4-amidinofenilalanina, como la
N\alpha-(\beta-naftilsulfonilglicil)-4-amidinofenilalanina
piperidida; varios inhibidores de proteasa como la antipaína ;
hirudina; hirulog; bivalirudina y argatroban. Los análogos de estos
inhibidores preferidos que actúan de acuerdo con la presente
invención también están aquí incluidos.
Un reactivo preferido utiliza el inhibidor de
trombina y la trombina a concentraciones
pre-optimizadas que pueden usarse para determinar
el fibrinógeno en muestras que contienen fibrinógeno en
concentraciones por encima de la escala fisiológica de interés
clínico. Preferiblemente, el reactivo puede usarse para determinar
las concentraciones de fibrinógeno de forma fiable en muestras que
contienen entre 100 mg/dl y 400 mg/dl de fibrinógeno. Tal y como se
usa aquí, la "escala normal" de concentración de fibrinógeno se
refiere a las concentraciones de fibrinógeno entre aproximadamente
100 mg/dl y alrededor de 400 mg/dl de fibrinógeno, mientras que
"escala inferior" se refiere a las concentraciones de
fibrinógeno entre aproximadamente 0,5 mg/dl y alrededor de 100 mg/dl
de fibrinógeno, y "escala superior" se refiere a
aproximadamente entre 400 mg/dl y alrededor de 2000 mg/dl de
fibrinógeno. En una realización, las concentraciones de fibrinógeno
que van entre 0,5 mg/dl y 2000 mg/dl pueden determinarse con el
ensayo, el reactivo, el cartucho de prueba y el dispositivo de la
presente invención. Las muestras que contienen escalas inferiores y
superiores de concentraciones de fibrinógeno pueden determinarse por
condiciones de ensayo optimizadoras.
En otro aspecto, la presente invención incluye un
dispositivo nuevo con cartucho de uso en el dispositivo de
determinación del tiempo de coagulación, preferiblemente con la
capacidad de convertir automáticamente el tiempo de coagulación de
una muestra en concentración de fibrinógeno de la muestra, así como
un indicador, un visualizador electrónico o un dispositivo de
lectura que proporcione la concentración de fibrinógeno.
Opcionalmente, el indicador puede proporcionar el tiempo de
coagulación además de la concentración de fibrinógeno,
convirtiéndose así en un indicador multifuncional que puede usarse
en otros ensayos de tiempo de coagulación.
En una realización, la cartucho incluye un
receptáculo que contiene un puerto de alimentación, una unidad de
cámara, y un puerto de salida. El cartucho también comprende
preferiblemente una primera unidad capilar para bombeo independiente
(es decir, acompañando o transportando) de un líquido, por ejemplo,
una muestra de sangre no diluida, a partir del puerto de
alimentación hasta la unidad de cámara. Además, el cartucho
preferido incluye preferiblemente una segunda unidad capilar
operativamente conectada y posicionada entre la unidad de cámara y
el puerto de salida para bombear independientemente un líquido desde
la unidad de cámara hacia el puerto de salida. El puerto de
alimentación, una primera unidad capilar (en caso de estar
presente), un unidad de cámara, una segunda unidad capilar (en caso
de estar presente), y un puerto de salida están presentes en una vía
capilar continua.
En una realización, el reactivo compuesto por
trombina y un inhibidor de trombina adecuado, se encuentran
contenidos dentro de la vía capilar para su uso en el ensayo de la
presente invención. El reactivo inhibidor de la trombina y la
trombina pueden estar formulados en una matriz de tampón HEPES. Un
estabilizante, como la albúmina, puede también estar presente en el
reactivo. En otra realización, el cartucho contiene el reactivo
trombina y es utilizada en el ensayo de la presente invención
haciendo pasar a través del cartucho una muestra que contiene
fibrinógeno y un inhibidor de trombina adecuado. En una realización
alternativa, el reactivo del cartucho comprende también sucedáneos
de eritrocitos, por ejemplo partículas de látex, en la cámara del
reactivo, que se mezclan con la muestra, preferiblemente una muestra
como el plasma sanguíneo o sangre sintética sin partículas
fácilmente detectables.
En otra realización alternativa, los reactivos y
el ensayo de la presente invención pueden utilizarse con técnicas
químicas húmedas tradicionales. Por ejemplo, en una realización, se
usa un fibrómetro para medir el tiempo de coagulación del
fibrinógeno compuesto por muestras mezcladas con reactivos
solubilizados de la presente invención.
La presente invención, junto con las ventajas y
los objetos guía, puede comprenderse mejor en referencia a la
descripción detallada a continuación, en conexión también con las
Figuras adjuntas.
La figura 1 es un diagrama de cajas de un
dispositivo compuesto por un recipiente de reacción, un sensor de
coagulación, un temporizador, un procesador y un indicador.
Las figuras 2A y 2B son vistas de planos y
secciones transversales del cartucho de la presente invención.
La figura 3 es un diagrama de cajas de un
dispositivo que incorpora la cartucho de la presente invención con
relación a un procesador y un indicador.
En una realización preferida, un reactivo de
determinación de fibrinógeno es formulado para incluir cantidades
efectivas de trombina e inhibidor de trombina, que, cuando una
cantidad efectiva del reactivo entra en contacto con una muestra que
contiene fibrinógeno dentro del rango de interés, causa por lo menos
un grado de coagulación dentro de un periodo de tiempo
predeterminado. Preferiblemente, se alcanza un grado de coagulación
predeterminado en menos de 300 segundos.
En una realización alternativa, el reactivo de
determinación de fibrinógeno contiene trombina, pero no el inhibidor
de trombina, y el reactivo de inhibición de trombina se proporciona
por separado para mezclar con muestras antes del contacto con el
reactivo de determinación de fibrinógeno de contacto con la
trombina.
El reactivo preferido está deshidratado (es
decir, es sustancialmente anhidro) para facilitar su almacenaje y
transporte, y puede hidratarse fácilmente con muestras acuosas, como
sangre y plasma sanguíneo. La cantidad de trombina puede variar en
el reactivo. En una realización, cuando suficiente reactivo está
mezclado con la muestra como para causar coagulación de acuerdo con
la presente invención, la muestra contiene entre alrededor de 1U/ml
y aproximadamente 100U/ml de trombina.
La trombina adecuada puede obtenerse a partir de
fuentes comerciales, como el Calbiochem. La trombina es
preferentemente humana o bovina.
Los inhibidores de trombina preferidos (también
llamados aquí moduladores de la actividad de la trombina) para el
uso en la invención incluyen un sulfato de polisacárido, por ejemplo
el sulfato de dextrano; un péptido con propiedades inhibidoras de
trombina adecuadas, por ejemplo
Gly-Pro-Ala o
Gly-Gly-ARg; una xantina, por
ejemplo, cafeína, un polianetosulfato; un polivinilsulfato; un ácido
bis-lactobiónico (apresulato); una benzamidina, por
ejemplo una amida cíclica de 4-aminofenilalanina
como
N\alpha-(\beta-naftilsulfoniglicil)-4-amidinofenilalanina
piperidida; un inhibidor de serin proteasa como la antipaína;
hirudina; hirulog; bivalirudina; y argatroban.
En el presente, uno de los inhibidores de
trombina preferibles es el sulfato de dextrano. El sulfato de
dextrano adecuado está disponible comercialmente a partir de varias
fuentes, como Sigma y Sachibo. Un sulfato de dextrano preferido
tiene un peso molecular (PM) entre aproximadamente 5000 Daltons (Da)
y alrededor de 50000 Da (\sim5000Da \leq PM \leq
\sim50000Da), con un sulfato de dextrano particularmente
preferido, teniendo un peso molecular de entre aproximadamente
5000Da y 10000Da. La cantidad de sulfato de dextrano puede variar en
el reactivo, sin embargo, se prefiere tener suficiente reactivo
mezclado con la muestra de forma que la muestra contenga entre 0,01
mg/ml y alrededor de 25 mg/ml de sulfato de dextrano. El reactivo
puede usarse en forma seca, como para su uso en un cartucho de la
presente invención. Aquí, la cantidad de un ingrediente concreto en
un "reactivo del cartucho" o "reactivo seco" se refiere a
las concentraciones del ingrediente en la solución del reactivo
antes de la deshidratación para formar el reactivo del cartucho o el
reactivo seco.
Otro inhibidor de trombina preferido es el ácido
bis-lactobiónico. Aún más preferiblemente, el ácido
bis-lactobiónico es uno conocido como aprosulato
sódico, esto es, un derivado de la
bis-lactobionamida. Este compuesto es un polianión
sintético con conocidas actividades anticoagulantes potentes.
(Sugidachi A, Breiter N, Ogawa T, Asai F, Koike H, In vitro
effects of aprosulate sodium, a novel anticoagulant, on platelet
activation: posible mechanism for antiplatelet actino. Thromb
Haemost 1996 Nov;76(5):786-90). Lutipold
Pharmaceuticals ha puesto disponible comercialmente el aprosulato.
En un ensayo preferido de la presente invención, una cantidad
suficiente del aprosulato con reactivo se combina con una muestra
para que el aprosulato esté presente en la muestra en 10 mg/ml hasta
50 mg/ml.
Tal como se usa aquí, los residuos de aminoácidos
en un péptido están representados generalmente por abreviaturas de 3
letras estándares conocidas por aquéllos expertos en la materia
(p.ej. Ala para alanina, Arg para arginina, Gly para glicina, Pro
para prolina; ver página 60 del Dorland's Illustrated Medical
Dictionary, 27ª ed., Philadelphia, W.B. Saunders Co., (1988)).
También se incluyen los análogos de los inhibidores preferidos que
actúan de acuerdo con la presente invención.
Los inhibidores de trombina preferidos de la
presente invención son inhibidores de trombina directos, y por lo
tanto ralentizan o inhiben directamente la conversión enzimática del
fibrinógeno en fibrina. Los inhibidores de trombina directos
preferidos son inhibidores competitivos que interactúan en el sitio
activo de la trombina.
Un reactivo preferido comprende un inhibidor de
trombina y trombina a concentraciones
pre-optimizadas que puede usarse para determinar el
fibrinógeno en muestras que contienen fibrinógeno en concentraciones
por encima del rango fisiológico normal de interés clínico.
Preferiblemente, el reactivo puede usarse para determinar de forma
fiable las concentraciones de fibrinógeno en muestras que contienen
entre aproximadamente 100 mg/dl y alrededor de 400 mg/dl de
fibrinógeno. Las cantidades de fibrinógeno mayores y menores en las
muestras pueden determinarse usando los ensayos y los reactivos de
la presente invención. Se cree que optimizando la composición de los
reactivos de la presente invención, los niveles de fibrinógeno
pueden determinarse oscilando entre aproximadamente 0,5 mg/dl y
alrededor de 2000 mg/dl, aunque la determinación de rangos elevados
y bajos de concentraciones de fibrinógeno pueden requerir una
variación en las composiciones de reactivos para resultados
óptimos.
Se puede encontrar más información sobre la
trombina y los inhibidores de trombina en: Sturzebecher, Jorg et
al., "Interactions of Thrombin with
Benzamidina-based Inhibitors", Biol. Chem.
Hoppe-Seyler, Vol. 373, pp.
491-496, Julio 1992; Dodt, Johanes et al.,
"Thrombin Inhibitors of Bloodsucking Animals", Seminars In
Thrombosis And Hemostasis, Vol. 22, nº 2, pp.
203-208, 1996; Matsuo, Takefumi, et al.,
"Development of Argatroban, a Direct Thrombin Inhibitor, and Its
Clinical Application", Seminars In Thrombosis And
Hemostasis, Vl. 23, nº 6, pp. 517-522, 1997;
Hursting, Marcie et al., "Novastan ® (Marca de
Argatroban): A Small Molecule, Direct Thrombin Inhibitor",
Seminars In Thrombosis and Hemostasis, Vol. 23 nº 6, pp.
503-516, 1997; Okamoto, Shosuke, et al.,
"Enzyme Controlling Medicines: Introduction", Seminars In
Thrombosis And Hemostasis, Vol. 23, nº 6, pp.
493-501, 1997; Preissner, Klaus, et al.,
"Thrombin Regulation by Physiological Inhibitors: The Role of
Vitronectin", Seminars in Thrombosis And Hemostasis, Vol.
22, nº 2, pp. 165-172, 1997; Leung, Lawrence,
"Application of Combinatorial Libraries and Protein Engineering to
the Discovery of Novel Anti-Thrombotic Drugs",
Thrombosis and Haemostasis, F.K. Schattauer
Verlagsgesellschaft mbH (Stuttgart) 74(1) pp.
373-376, 1995; Stone, Stuart, et al.,
"Thrombin Inhibitors As Antithrombotic Agents: The Importance of
Rapid Inhibition", J. Enzyme Inhibition, Vol 9, pp
3-15, 1995; Shafer, Jules, "Cardiovascular
Chemotherapy: anticoagulants", Current Opinion in Chemical
Biology, Vol. 2, pp. 458-465, 1998; Maraganore,
John, "Pre-clinical and Clinical Studies On
Hirulog: A Potent and Specific Direct Thrombin Inhibitor", in The
Design of Synthetic Inhibitors of Thrombin, Ed., G. Claeson, et
al., New York, Plenum Press, pp. 227-236, 1993;
Matsuo, Takefumi, et al., "Clinical Application of the
Synthetic Thrombin Inhibitor, Argatroban
(MD-805)" Seminars In Thrombosis And
Hemostasis, Vol. 18, nº 2, pp. 155-160, 1992;
Sanderson, P. et al., "Thrombin Inhibitor Design",
Current Medicinal Chemistry, Vol. 5, pp.
289-304, 1998; Topol, Eric, "Evolution of Improved
Antithrombotic and Antiplatelet Agents: Genesis of the Comparison of
Abciximab Complications with Hirulog [and back-up
Abciximab] Events Trial (CACHET)", The American Journal of
Cardiology, Vol. 82(8B), pp. 63P-68P, 22
Oct, 1998; y White, Harvey, "Clinical Trials of Direct Thrombin
Inhibitors In Acute Ischaemic Syndromes", Thrombosis and
Haemostasis, F. K. Schatteur Verlagsgesellschaft mbH (Stuttgart)
78(1) pp. 364-366, 1997.
En una realización preferida, el reactivo de
determinación de fibrinógeno de la presente invención comprende
trombina e inhibidor de trombina en una matriz de un tampón
adecuado, como el HEPES o el PSB. Un estabilizante, como la
albúmina, puede también estar presente en el reactivo. Un reactivo
sustancialmente seco o anhidro puede formarse usando una combinación
de trombina e inhibidor de trombina junto con otros componentes
diseñado para incrementar la vida en almacenamiento y la actuación
del reactivo. Por ejemplo, un reactivo para usar en el cartucho de
prueba tendría que ser fácilmente aplicable al camino del flujo del
cartucho y/o a la cámara del reactivo, tener una consistencia
uniforme, ser fácilmente hidratado por una muestra y mezclado con la
misma, y ser estable para un almacenaje durante una duración de
tiempo comercialmente razonable. En algunos casos, los agentes de
cartucho, como la sacarosa, y los agentes humectantes (p.ej. los
surfactantes) pueden usarse para facilitar la manipulación y
optimizar la actuación del reactivo.
Para determinar qué inhibidores de trombina
proporcionan resultados óptimos con los ensayos de la presente
invención, se puso en contacto muestras, que contenían
concentraciones diferentes de fibrinógeno, con un reactivo
coagulante, que contenía un candidato o candidatos de inhibidor de
trombina concretos y trombina. Mientras que los inhibidores de
trombina preferidos aminoraban el índice de conversión del
fibrinógeno a fibrina, es importante resaltar que el tiempo total
del ensayo no debe ser tan lento como para resultar impráctico para
el uso rutinario. Así, es preferible que la conversión de una
muestra de fibrinógeno a fibrina sea sustancialmente completa en
menos de 300 segundos. Sin embargo, las muestras que contienen
diferentes concentraciones de fibrinógeno dentro de un rango de
interés deben correlacionarse con diferencias en tiempo de
coagulación fácilmente medibles y fiables, concretamente para el
rango fisiológico normal de fibrinógeno encontrado en sangre de
mamíferos, preferiblemente en sangre humana. Las composiciones de
reactivos pueden requerir una optimización para las muestras
sospechosas de tener un rango bajo o elevado de concentraciones de
fibrinógeno.
Para facilitar la selección de inhibidores de
trombina óptimos, se realizó varios experimentos utilizando
soluciones de trombina estándar o reactivos secos, que se pusieron
en contacto con muestras estándar cuyas concentraciones de
fibrinógeno eran conocidas, y candidatos de inhibidores de trombina
a concentraciones conocidas que iban variando. Entre los criterios
cualitativos para determinar los candidatos de inhibidores de
trombina preferidos se incluía una comparación de los resultados de
la muestra estándar con concentración de fibrinógeno conocida que
contenía un inhibidor de trombina añadido con una muestra estándar
idéntica que no contenía el inhibidor de trombina añadido. Los
criterios cuantitativos para determinar la cantidad óptima de
inhibidor de trombina necesaria para realizar un ensayo de acuerdo
con la presente invención, incluyen la preparación de varios grupos
de estándares de fibrinógeno, cada grupo de estándares formado por
un rango de fibrinógeno que se esperaba que fuera de interés. Por
ejemplo, de 3 a 5 muestras pueden comprender un grupo de estándares
de fibrinógeno en el que las muestras individuales tienen
concentraciones de fibrinógeno diferentes oscilando entre 50 y 400
mg/dl. Cada muestra, en un primer grupo de estándares, se pone en
contacto con un inhibidor de trombina concreto a una primera
concentración conocida y con una primera concentración conocida de
trombina. Cada muestra, en un segundo grupo de estándares, se pone
en contacto con el mismo inhibidor de trombina a una segunda
concentración conocida y con trombina a la primera concentración. El
resto de grupos se ponen en contacto de la misma forma con
inhibidores de trombina a una tercera, cuarta y/o quinta
concentración y con trombina a la primera concentración. El tiempo
de coagulación de las muestras se comparara para determinar la
composición óptima del reactivo.
La concentración de fibrinógeno de una muestra es
inversamente proporcional al tiempo de coagulación de la muestra. En
una realización, los tiempos de coagulación de los estándares se
determinan tras el contacto con una cantidad fija de un reactivo
estandarizado de la presente invención que contiene trombina y un
inhibidor de trombina. La cantidad o concentración de fibrinógeno en
una muestra sospechosa de contener fibrinógeno puede determinarse
por comparación de su tiempo de coagulación tras el contacto con el
reactivo estandarizado con los tiempos de coagulación de los
estándares. Tal como se usan aquí, las expresiones "determinar el
fibrinógeno" o "determinación de fibrinógeno" se refieren a
la determinación de o bien el fibrinógeno total en una muestra o la
concentración de fibrinógeno en una muestra. De la misma manera,
"muestra de fibrinógeno" puede usarse para referirse a la
concentración o a la cantidad total de fibrinógeno en una
muestra.
Si el reactivo de determinación de fibrinógeno no
contiene un inhibidor de trombina, el fibrinógeno de la muestra se
determina añadiendo a la muestra un reactivo inhibidor que contenga
un inhibidor de trombina en una cantidad efectiva antes de poner en
contacto la muestra con una cantidad efectiva de trombina
conteniendo reactivo de determinación de fibrinógeno para causar la
coagulación. El tiempo de coagulación de las muestras se compara con
el de los estándares para determinar el fibrinógeno.
En una realización preferida de la presente
invención, el ensayo de fibrinógeno de la presente invención está
optimizado para el uso de un modulador de trombina concreto para
determinar las concentraciones de fibrinógeno en muestras que son
menores, iguales, o superiores que los rangos de concentraciones de
fibrinógeno fisiológicas normales de mamíferos. Por ejemplo, usando
una concentración constante de trombina y una concentración
constante de un inhibidor de trombina concreto, los tiempos de
coagulación se pueden determinar para varias muestras estándar que
contienen diferentes cantidades de fibrinógeno.
Los ensayos con muestras sospechosas de contener
concentraciones de fibrinógeno en rangos elevados pueden producir
resultados más precisos y exactos utilizando un primer reactivo que
contiene una combinación de un inhibidor de trombina concreto y
trombina, mientras que los ensayos de muestras sospechosas de
contener concentraciones de fibrinógeno en rangos bajos pueden
utilizar un segundo reactivo que a su vez puede usar o bien una
cantidad diferente de inhibidor de trombina y/o trombina, o usar un
inhibidor de trombina diferente.
Los experimentos de optimización y de fibrinógeno
descritos anteriormente pueden realizarse en un ensayo húmedo, en el
que la muestra de interés se combina en un recipiente con un
inhibidor de trombina y trombina. Se usa un sensor para detectar la
coagulación o un grado predeterminado de coagulación, y el
temporizador se usa para medir el tiempo necesario para conseguir el
grado predetrminado de coagulación. Se puede usar un fibrómetro
comercialmente disponible para determinar cuándo se alcanza un grado
predeterminado de coagulación (el fibrómetro BBL es adecuado; se
puede encontrar más información sobre el equipo de fibrómetro en BD
Biosciences, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, New Jersey, USA). La
concentración de fibrinógeno de la muestra se determina midiendo el
tiempo que necesita para alcanzar un grado predeterminado de
coagulación tras entrar en contacto la muestra con una cantidad
conocida de un inhibidor conocido y trombina, y comparando el tiempo
de coagulación con el de los estándares que se pusieron en contacto
con la misma cantidad del mismo inhibidor y trombina.
En la Figura 1 se muestra un diagrama de cajas
de un dispositivo de ensayo húmedo. Se utiliza un recipiente de
reacción para poner en contacto la muestra sospechosa de contener
fibrinógeno con, por lo menos, un reactivo que causa la conversión
de fibrinógeno en fibrina, causando así la coagulación. El reactivo
preferido es un reactivo optimizado de la presente invención, que
comprende un inhibidor de trombina y trombina. Un sensor detecta la
coagulación, o un grado predeterminado de coagulación, y un
temporizador mide el tiempo necesario para alcanzar un grado de
coagulación predeterminado. En una realización preferida, un
procesador convierte el tiempo de coagulación en concentración de
fibrinógeno, que se imprime en un indicador. El indicador puede ser
electrónico o de impresión. El tiempo de coagulación, así como otros
parámetros, pueden también mostrarse en el indicador (esto es, el
paciente, el nombre del doctor, etc.).
En una realización preferida, los reactivos de la
presente invención se usan en un dispositivo modificado para
determinar los tiempos de coagulación, como los descritos en las
patentes estadounidenses nº 4,756,884 y 5,039,617, que describen un
dispositivo integrado que contiene un reactivo seco
pre-dispensado en una vía capilar que puede usarse
para medir el tiempo de coagulación de muestras de sangre. El
cesionario de la presente invención comercializa actualmente un
sistema bajo la designación de CoaguChek® Pro y CoaguChek® Plus
(disponible por Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis,
Indiana), cuyo cartucho desechable se modificó para su uso en el
ensayo del a presente invención. El sistema de
cartucho-reactivo utilizado en el sistema CoaguChek®
Plus utiliza una muestra de sangre para solubilizar un reactivo
dentro de la cartucho y para mover el reactivo con la sangre a
través de las vías del cartucho durante la reacción de coagulación.
El tiempo de coagulación se determina por un detector que percibe el
índice de flujo de las células sanguíneas (p.ej. células sanguíneas
rojas) o sucedáneos de células sanguíneas (p.ej. partículas o gotas
de látex) a través del capilar. En una realización alternativa, el
reactivo del cartucho puede usarse húmedo.
Se puede encontrar descrito un método, un
reactivo y un cartucho de prueba para determinar el tiempo de
coagulación en la solicitud provisional con número de serie
60/152,450, archivada el 3 de septiembre de 1999, y titulada
Method, Reagent And Test Cartridge For Determining Clotting
Time, ahora patente estadounidense nº 6,699,718. En una
realización preferida, los reactivos de la presente invención se
aplican al capilar de una cartuchos de prueba usando las mismas
técnicas descritas en la solicitud mencionada. La presente invención
también contempla la determinación de fibrinógeno en plasma
sanguíneo y sangre sintética, donde los sucedáneos de células
sanguíneas se mezclan con la muestra antes de pasar a través del
capilar.
Un cartucho de prueba preferido, de acuerdo con
la presente invención, se muestra en la Figura 2A. El cartucho
comprende un receptáculo que puede configurarse para usar con un
instrumento para la determinación del ensayo, como un dispositivo
CoaguChek® Plus de determinación de tiempo de coagulación
(disponible por Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis,
Indiana, USA). Por ejemplo la muesca en el receptáculo 10 se
proporciona para permitir la retención del dispositivo (p.ej.,
mediante una captura activada con un muelle) en estabilidad para
resistir una manipulación mecánica y proporcionar las
características necesarias para fluir del medio de ensayo y detectar
la señal percibible. Se proporciona el puerto de entrada 20 para el
acceso de una muestra de sangre al capilar interno del dispositivo.
La primera vía capilar 30 transporta la sangre a la cámara del
reactivo 40 que contiene el reactivo 45. En la realización mostrada,
el receptáculo 10 se proporciona con superficies transparentes en la
ubicación del capilar 30 para que esta sección de la vía capilar
pueda utilizarse para medir el movimiento (y el cese de movimiento)
de la muestra (p.ej. sangre) usando un detector de patrones de
moteado electrónico. La muestra, ahora mezclada con el reactivo 45,
sale de la cámara 40 y entra en la unidad 50 de fluido capilar, que
conecta con la cámara 40 al respiradero 60. La unidad de fluido
capilar es una vía capilar con voluta alargada que proporciona una
longitud de vía suficiente para que el flujo se mantenga durante el
tiempo necesario para medir el tiempo de coagulación.
Una vista transversal de la realización mostrada
en la Figura 2A se puede observar en la Figura 2B. Esta vista
transversal está cogida a lo largo de las líneas B-B
de la figura 2A. La construcción del receptáculo 10 a partir de los
dos platos, 12 y 14, es evidente en esta vista transversal. El plato
12 es esencialmente un plato liso que se ha soldado al plato 14, que
contiene surcos y otras depresiones en su superficie superior, que
formarán las cámaras internas y los capilares del dispositivo. Las
dos piezas de plástico 12 y 14 se han soldado conjuntamente tras
haber sido adecuadamente alineadas (p.ej. puestas en el registro).
"Registro" se usa aquí en el sentido de referirse a un
alineamiento adecuado de las depresiones presentes en las
superficies de las dos piezas que se usan para formar los capilares
y las cámaras internas. Un registro adecuado puede ayudarse por una
inyección moldeando las dos piezas para proporcionar proyecciones en
una pieza que no encaja en los agujeros o depresiones (depresiones
que no sean capilares o formadoras de cámaras) en la segunda
pieza.
Una única depresión convoluta utilizada para
formar cámaras y canales capilares está presente en la superficie
del plato 12. Una vista transversal mostrada en la Figura 2 corta la
depresión en 6 puntos separados, algunos de los cuales (51, 52, 53,
54 y 55) son parte de la unidad de flujo capilar 50, mientras que
los demás puntos tendrán como resultado la formación del capilar 30
con un principio más grande y la cámara de reacción 40 cuando los
platos 12 y 14 se sueldan unidos.
El sistema de cartucho-reactivo
usado en el sistema CoaguChek® Plus utiliza una muestra de sangre
para solubilizar un reactivo dentro del cartucho y desplazar el
reactivo con la sangre a través de las vías del cartucho durante la
reacción de activación de la coagulación. En una realización
alternativa, el reactivo del cartucho puede usarse húmedo. También
se anticipa que el reactivo puede aplicarse a matrices
tridimensionales, lo que aumenta el área de superficie, como el
papel, gel, esponjas y microcápsulas. Así, una realización
alternativa, un material de matriz, como el gel, puede contener el
reactivo en una forma húmeda. En una realización preferida, la
cartucho es desechada tras su uso.
Cuando el reactivo se proporciona dentro de
cartuchos de prueba, el reactivo puede presentar o bien una relación
difusiva o no difusiva con la superficie de la cartucho, esto es,
adherido, absorbido, adsorbido o unido covalentemente, de forma que
el reactivo puede disolverse en el fluido o puede mantenerse fijo en
la superficie. Donde los reactivos están unidos por difusión (unión
débil y no covalente), pueden darse varias situaciones. Una
situación es en la que el frente líquido disuelve el reactivo
completamente, de forma que el frente líquido recibe una
concentración elevada del reactivo y la mayoría de la reacción tiene
lugar en el frente líquido. Una segunda situación sería con un
exceso de reactivo de solubilidad limitada. En esta situación, el
reactivo puede estar presente en el medio líquido a una
concentración uniforme sustancial. Una tercera situación es en la
que se da una deficiencia de reactivo de solubilidad limitada, de
forma que únicamente la primera porción del fluido tendrá una
concentración de reactivo relativamente constante. Es preferible
dispersar el líquido que contiene los reactivos disueltos sobre la
superficie de la cámara del reactivo. El líquido se esparce sobre la
superficie de la cámara y se seca con aire de baja humedad. Así, en
una realización preferida, el reactivo está sustancialmente
deshidratado. Se puede usar diversos agentes humectantes y
divergentes para optimizar las condiciones de la reacción.
Para asegurar la reproducibilidad de la
distribución, se pueden utilizar varias técnicas para introducir el
reactivo en la cámara. Donde el cartucho se produce como dos partes
que encajan, el reactivo se puede pulverizar, untar, introducir en
la cámara como un líquido, liofilizar o evaporar, adsorber, conjugar
covalentemente, o similares. El reactivo activo puede combinarse con
varios estabilizantes, excipientes, tampones u otros aditivos
implicados en la reacción. Por ejemplo, HEPES es un tampón
preferido, y la albúmina se añade preferiblemente como un
estabilizante de trombina.
Para mejorar la mezcla, se puede utilizar
diversos métodos mecánicos o ultrasónicos para agitar la muestra y
los reactivos, donde los medios de mezcla pueden ser internos o
externos. Se puede utilizar vibradores, transductores ultrasónicos,
barras magnéticas u otros métodos mecánicos de mezcla, disruptores
de flujo, barreras o deflectores de mezcla, directores de flujo, o
similares. La forma concreta en la que se produce la agitación, si
se proporciona, variará ampliamente en función del grado de
agitación necesario, el diseño del cartucho, etc.
El reactivo debe no estar recubierto o unido a la
superficie del cartucho, pero puede proporcionase como un gel o una
esponja soluble, o alternativamente, absorbido en una esponja
insoluble, una membrana, un papel (p.ej. papel de filtro) o gel
introducido dentro de la unidad de reacción. De esta forma, el
fluido puede pasar a través de la estructura de espuma disolviendo
el reactivo para formar la mezcla de reacción.
El reactivo puede proporcionarse de forma líquida
en microcápsulas. El reactivo líquido puede liberarse de las
microcápsulas aplicando presión a las paredes de la unidad de
reacción, lo que provoca una rotura de las microcápsulas y la
liberación del reactivo líquido.
El dispositivo de determinación del tiempo de
coagulación y el cartucho descritos anteriormente se usan para
determinar el tiempo de coagulación de una muestra sospechosa de
contener fibrinógeno mediante la adición de la muestra por el puerto
de entrada 20. El tiempo de coagulación se determina detectando una
reducción en el índice de flujo de una muestra a través de un
capilar. El tiempo de coagulación se asocia generalmente con la
parada del flujo o cuando el flujo se ha parado sustancialmente. Tal
como se usa aquí, el tiempo de coagulación indica el tiempo
necesario para que el índice de flujo disminuya por debajo de un
índice predeterminado en un dispositivo de tipo capilar (esto es
generalmente cuando el índice de flujo disminuye por debajo del
nivel de detección del dispositivo utilizado), o la cantidad de
tiempo necesario para un grado predeterminado de coagulación para
ocurrir en un análisis químico húmedo. En una realización preferida,
el tiempo de coagulación de una muestra pasando a través de un
cartucho está correlacionado con la concentración de fibrinógeno de
una muestra usando los cartuchos estandarizados. Los cartuchos
estandarizados se fabrican basándose en pruebas anteriores de
cartuchos de reactivos estándares con muestras que contienen un
rango de concentraciones de fibrinógeno. En una realización
preferida, el dispositivo del tiempo de coagulación utilizará un
cartucho estándar, y proporcionará la lectura de la concentración de
fibrinógeno automáticamente basada en el tiempo de coagulación de la
muestra. En una realización preferida, el dispositivo incluye un
procesador para convertir el tiempo de coagulación de la muestra en
concentración de fibrinógeno de la muestra.
Con referencia a la figura 3, se ilustra un
diagrama de cajas de un dispositivo que incorpora un cartucho de la
presente invención con relación a un procesador y a un dispositivo
de lectura. El procesador convierte el tiempo de coagulación en
concentración de fibrinógeno, y preferiblemente incluye una memoria
para guardar los datos de los estándares y las muestras. Una
característica opcional es un indicador del tiempo de coagulación.
El indicador del tiempo de coagulación puede proporcionarse mediante
el mismo indicador que proporciona la concentración de fibrinógeno.
Preferiblemente, un detector de flujo está en conexión operable con
el procesador que convierte el tiempo de coagulación de la muestra
en concentración de fibrinógeno, lo que a su vez está en conexión
operable con un dispositivo de lectura que proporciona la
concentración de fibrinógeno al operador del dispositivo, y
opcionalemnte proporciona también el tiempo de coagulación. Los
dispositivos y circuitos adecuados que pueden modificarse o
programarse para convertir un primer resultado numérico (es decir,
tiempo de coagulación) en un segundo resultado numérico (es decir,
concentración de fibrinógeno) están ampliamente disponibles.
En una realización, un software/firmware y
microprocesador adecuados para correlacionar el tiempo de
coagulación de una muestra con su concentración de fibrinógeno se
proporcionan en un dispositivo modificado de CoaguChek® Plus, junto
con el dispositivo de lectura o el indicador que proporciona la
concentración de fibrinógeno de la muestra. El indicador puede
también proporcionar el tiempo y otros parámetros, e información,
como el identificador del paciente, el nombre del doctor, e
información sobre la aseguradora. El software de almacenaje y
recuperación de datos apropiado se proporciona preferiblemente para
analizar y almacenar los datos sobre las muestras y los estándares.
De esta manera, se proporciona un dispositivo multifuncional en una
realización que puede usarse para ensayos de fibrinógeno así como
otros ensayos dependientes del tiempo de coagulación.
Para preparar cartuchos estandarizados, que
pueden usarse para vincular el tiempo de coagulación a la
concentración de fibrinógeno de la muestra, fue necesario preparar
primero o ensayar varios reactivos que contenían trombina y
candidatos para inhibidor de trombina para determinar los reactivos
óptimos del cartucho. Esto se realizó inicialmente utilizando el
ensayo húmedo con un fibrómetro descrito anteriormente para
determinar los candidatos de inhibidor de trombina adecuados antes
de preparar y estudiar las cartuchos que contienen el reactivo
seco.
Se proporciona los siguientes ejemplos mediante
la ilustración y explicación y no se deben entender como limitantes
del alcance de la presente invención. Además, se puede utilizar
varios métodos para vincular el tiempo de coagulación de una muestra
con una concentración de fibrinógeno. Una realización usa el tiempo
de coagulación de estándares para generar gráficas del tiempo de
coagulación frente a la concentración de fibrinógeno, contra el cual
se puede comparar el tiempo de coagulación de una muestra. En una
realización alternativa, el tiempo de coagulación de estándares que
contienen concentraciones de fibrinógeno variables, puede estar
sujeto a análisis estadísticos para generar un algoritmo para
calcular directamente la concentración de fibrinógeno de una muestra
a partir de su tiempo de coagulación. En una realización preferida,
el dispositivo del tiempo de coagulación puede programarse con un
algoritmo, que está basado en un tamaño de muestra concreto mezclado
con una cantidad fija de reactivo de coagulación estandarizado, para
producir automáticamente la concentración de fibrinógeno de una
muestra a partir de su tiempo de coagulación (esto es, el tiempo
necesario para alcanzar un grado de coagulación predeterminado).
En una realización alternativa, el dispositivo de
almacenaje de datos y el procesador pueden usarse para comparar de
forma automática los tiempos de coagulación de una serie de
estándares con el de la muestra que contiene una cantidad de
fibrinógeno desconocida. El procesador incluye preferiblemente una
programación estadística para calcular los algoritmos para
diferentes tipos de estándares y muestras.
Se desarrolló un ensayo de cribado para
determinar si un candidato a inhibidor de trombina concreto podía
ser útil en el ensayo de la presente invención. Se emprendió una
investigación inicial para determinar si un polisacárido sulfatado,
como el sulfato de dextrano, inhibiría de forma suficiente la
actividad de la trombina en las muestras que contienen el rango
fisiológico normal de concentraciones de fibrinógeno.
Materiales y métodos: Una solución salina
(PBS)-albúmina fosfotamponada se realizó de la forma
siguiente:
\newpage
| Ingrediente | Concentración | Fuente |
| NaCl | 0,145 M | Aldrich 22351-4 |
| KCl | 2,7 mM | Sigma P4504 |
| Na_{2}HPO_{4} | 16,9 mM | Aldrich 22199-6 |
| NaH_{2}PO_{4} | 2,5 mM | Aldrich 22352-2 |
| Albúmina | 4,0 g/dl | Sigma A7030 |
| PH | 7 |
La solución de PBS-albúmina se
usó para fabricar soluciones de trabajo de sulfato de dextrano
estándar (S.D.), trombina y fibrinógeno de la forma siguiente:
- 1)
- 0,5 mg/ml de solución de trabajo de sulfato de dextrano (S.D.). Se obtuvo el sulfato de dextrano (de PM 10000) a partir de Sigma®;
- 2)
- 100 U/ml de solución de trabajo de trombina; la trombina se obtuvo a partir de Calbiochem (605206 - plasma humano, ó 605157 - bovino); y
- 3)
- soluciones de trabajo de fibrinógeno con concentraciones de fibrinógeno que oscilan entre 6 y 24 mg/ml de fibrinógeno; el fibrinógeno se obtuvo a partir de Calbiochem (341578).
Procedimiento de ensayo de cribado utilizando un
fibrómetro: Se utilizó un fibrómetro BBL para determinar los tiempos
de coagulación de las soluciones de ensayo. Las soluciones se ensayo
se hicieron añadiendo los siguientes componentes en el orden
siguiente:
- 1.
- 200 \mul de solución de trabajo de S.D.,
- 2.
- 50 \mul de solución de trabajo de trombina,
- 3.
- 50 \mul de solución de trabajo de fibrinógeno.
Inmediatamente después de la adición del tercer
componente (esto es, la solución de trabajo de fibrinógeno), se
activó el fibrómetro, lo que resultó en la liberación de la sonda
dentro del vaso que contiene la solución de reacción. La sonda se
agitó hasta que se alcanzó una resistencia suficiente al movimiento
correspondiente a un grado predeterminado de coagulación. Un
indicador mostró el tiempo de la activación de la sonda hasta que se
alcanzó el grado predeterminado de coagulación.
La dilución de las soluciones de trabajo que
contenían de 6 a 24 mg/ml de fibrinógeno en las mezclas de reacción
tuvo como resultado soluciones con concentraciones de fibrinógeno en
el rango de 100 a 400 mg/dl, lo que abarca el rango de concentración
fisiológica normal de fibrinógeno.
Resultados para concentraciones variables de
fibrinógeno: La tabla siguiente compara las concentraciones de
fibrinógeno de las soluciones con los tiempos de coagulación tras el
contacto con un reactivo que contiene sulfato de dextrano (10000Da)
y trombina.
| Concentración de Fibrinógeno | Tiempo de coagulación |
| del ensayo final (mg/dl) | (segundos) |
| 100 | 22,8 |
| 200 | 11,8 |
| 250 | 9,8 |
| 400 | 1,2 |
Si no había sulfato de dextrano presente en la
mezcla de reacción del ensayo, el tiempo de coagulación era de
aproximadamente 0,6 segundos (tiempo en el que la sonda se sumergía
en el recipiente de ensayo).
De esta manera, se descubrió que el sulfato de
dextrano es un reactivo inhibidor de la trombina útil en el ensayo
de fibrinógeno de la presente invención. Se cree que la sangre
completa y el plasma sanguíneo normal de mamíferos, como la sangre
humana y el plasma sanguíneo humano, tienen los mismos atributos de
coagulación sustancialmente que las muestras de las pruebas
anteriores. Así, el ensayo de la presente invención, utilizando un
reactivo que comprende niveles optimizados o predeterminados de
trombina y un inhibidor de trombina adecuados pueden usarse para
analizar fibrinógeno en sangre no diluida y en plasma no
diluido.
En una realización preferida, utilizando un
reactivo compuesto por trombina y sulfato de dextrano 10000 Da como
inhibidor de trombina, las muestras se combinan con una cantidad
suficiente del reactivo para alcanzar una concentración de trombina
de entre aproximadamente 1 U/ml y 100 U/ml y una concentración de
sulfato de dextrano entre aproximadamente 0,1 mg/ml y 20,0
mg/ml.
Utilizando el método del Ejemplo 1, se puso en
contacto 15 mg/ml de benzamidina (Sigma B6506) en una solución de
PBS-albúmina (concentración final) con muestras que
contenían diferentes cantidades de fibrinógeno. Los resultados se
muestran en la tabla siguiente:
| Concentración de fibrinógeno | Tiempo de coagulación |
| de la muestra (mg/dl) | (media, en segundos), n = 2 |
| 100 | 242 |
| 200 | 139 |
| 400 | 93 |
Variando la concentración de benzamidina en la
mezcla de reacción resultante, se descubrió que era más efectiva
cuando estaba presente en la muestra con una cantidad de entre
aproximadamente 5 y 50 mg/ml.
Otros candidatos a inhibidores de trombina se
estudiaron con la técnica del "ensayo húmedo" con fibrómetro
del ejemplo 1. Aquéllos que se encontró que eran efectivos para ser
usados en la presente invención incluyen, sulfato de dextrano (50000
Da - Dextralip 50), y antipaína. Preferiblemente el Dextralip 50
está presente en la mezcla de reacción de la muestra en una cantidad
que va de aproximadamente 0,75 a 5 mg/ml, y la antipaína está
presente en una cantidad que oscila entre 0,5 y 1 mg/ml.
Se construyó un cartucho de ensayo como se
describe anteriormente en el que la cámara del reactivo estaba
cubierta con un reactivo seco que contenía trombina en una matriz de
tampón HEPES. Las muestras líquidas que contenían gotas de látex
como sucedáneos de células sanguíneas y varios niveles de
fibrinógeno se introdujeron en el cartucho que contenía dentro el
dispositivo CoaguChek® Plus. Justo antes de introducir la muestra en
el dispositivo, el modulador de
trombina en concreto que se estaba estudiando se añadió a la muestra. Se estudió varios moduladores de trombina de esta manera.
trombina en concreto que se estaba estudiando se añadió a la muestra. Se estudió varios moduladores de trombina de esta manera.
Se hizo una solución base de HEPES, pH = 7,4, a
partir de los siguientes ingredientes:
| Ingrediente | Concentración | Fuente |
| Tampón HEPES | 200 mM | Calbiochem 391338 |
| Cloruro de sodio | 50 mM | Aldrich 22351-4 |
| Albúmina de suero bobino (estabilizante) | 0,2 g/dl | Sigma A7030 |
| Triton X-100 (agente humectante) | 0,02 g/dl | Boehringer Mannheim 789-704 |
| Sacarosa (agente de cartucho) | 16 g/dl | Sigma S8501 |
| Azul de bromofenol | 0,2 g/dl | Sigma B6131 |
| Azida de sodio | 0,3 g/dl | Aldrich 19,993-1 |
Se fabricó una solución de trombina añadiendo
trombina (Calbiochem 605157 bovino) a la solución base HEPES,
resultando una concentración de 67 unidades/ml de trombina.
Se utilizó un 10% de la solución en peso de
esferas de poliestireno con un diámetro medio de 3,27 \mum (Bang
Laboratories P0032700) como un sucedáneo de células sanguíneas para
soluciones de plasma o sangre sintética ("solución de esferas de
plástico").
Se preparó cartuchos de ensayo aplicando 3
microlitros de la solución de trombina y secando la solución. Para
cada ejemplo se utilizó un cartucho de "trombina" fresca.
Para cada ejemplo se colocó un cartucho de
trombina en un dispositivo CoaguChek® Plus. Las muestras de prueba
se prepararon combinando 35 \mul de solución de trabajo de
fibrinógeno (ver ejemplo 2), 5 \mul de una solución que contenía
el inhibidor que se estudiaba (ver la tabla de inhibidores de
trombina de más abajo), y 7 \mul de la solución de esferas de
plástico. La muestra de prueba se aplicó en el puerto de entrada del
cartucho, y la se calculó el tiempo de coagulación de la muestra.
Cuando no había presente ningún inhibidor, el tiempo de coagulación
era menor que 10 segundos. Así, los inhibidores efectivos
aumentarían el tiempo de coagulación por encima de los 10 segundos,
pero preferiblemente por debajo de los 300 segundos.
La siguiente tabla identifica los ejemplos no
limitantes de varios inhibidores que se mostraron efectivos
utilizando el procedimiento anterior:
| Inhibidor de trombina | Concentración en reactivo |
| Sulftato de dextrano -10000Da | 2, 8,5 y 21 mg/ml |
| Sulftato de dextrano -5000Da | 5 mg/ml |
| Sulftato de dextrano -50000Da | 5 mg/ml |
| (Dextralip ® 50) | |
| Benzamidina | 4 y 11 mg/ml |
| Gly-Gly-Arg | 0,85 y 1,3 mg/ml |
| Gly-Pro-Arg | 0,2 y 0,85 mg/ml |
| Cafeína | 0,85, 1,6 y 8,5 mg/ml |
| Polivinilsulfato | 0,25, 0,5 y 5 mg/ml |
| Polianetolsulfato | 0,5 y 5 mg/ml |
| Aprosulato | 21 y 43 mg/ml |
Todos los inhibidores anteriores lentificaron el
tiempo de coagulación de la muestra a más de 10 segundos y menos de
300 segundos para las muestras con concentraciones de fibrinógeno
entre 50 y 400 mg/dl, y permitieron que el tiempo de coagulación se
correlacionara con la concentración de fibrinógeno.
Los cartuchos que contienen el reactivo de
trombina seco se utilizaron para los siguientes experimentos. Se
preparó soluciones estándar de acuerdo con el ejemplo 3, excepto por
el hecho de que la concentración del inhibidor de trombina era fija,
y las concentraciones de fibrinógeno variaron.
La siguiente tabla proporciona los tiempos de
coagulación para las muestras que contienen una cantidad fija de
sulfato de dextrano (10000Da), pero varían las cantidades de
fibrinógeno tras aplicar las muestras de tamaños estándar en el
puerto de alimentación de los cartuchos que contienen trombina.
\newpage
| \begin{minipage}[t]{150mm} Tiempo de coagulación de las soluciones de fibrinógeno que contienen 21 mg/ml de sulfato de dextrano (10000Da)\end{minipage} | |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Concentración de fibrinógeno (mg/ml) en una solución de ensayo combinado\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Tiempo de coagulación (segundos) tras la aplicación al puerto de alimentación del cartucho conteniendo reactivo de trombina\end{minipage} |
| 100 | 157,5 |
| 102 | 81,9 |
| 204 | 28,6 |
La siguiente tabla proporciona los tiempos de
coagulación para muestras que contienen una cantidad fija del
péptido Gly-Pro-Arg pero varían las
cantidades de fibrinógeno tras aplicar las muestras de tamaños
estándar en el puerto de alimentación de los cartuchos que contienen
trombina.
| \begin{minipage}[t]{150mm} Tiempo de coagulación de las soluciones de fibrinógeno que contienen 0,85 mg/dl del péptido Gly-Pro-Arg\end{minipage} | |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Concentración de fibrinógeno (mg/ml) en una solución de ensayo combinado\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Tiempo de coagulación (segundos) tras la aplicación al puerto de alimentación del cartucho conteniendo reactivo de trombina\end{minipage} |
| 100 | 239,6 |
| 102 | 44,1 |
| 204 | 9,9 |
La siguiente tabla proporciona los tiempos de
coagulación para muestras que contienen una cantidad fija de cafeína
pero varían las cantidades de fibrinógeno tras aplicar las muestras
de tamaños estándar en el puerto de alimentación de los cartuchos
que contienen trombina.
| \begin{minipage}[t]{150mm} Tiempo de coagulación de las soluciones de fibrinógeno que contienen 1,6 mg/ml de cafeína\end{minipage} | |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Concentración de fibrinógeno (mg/ml) en una solución de ensayo combinado\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Tiempo de coagulación (segundos) tras la aplicación al puerto de alimentación del cartucho conteniendo reactivo de trombina\end{minipage} |
| 100 | 88,8 |
| 200 | 30,0 |
| 400 | 24,8 |
La siguiente tabla proporciona los tiempos de
coagulación para muestras que contienen una cantidad fija de
aprosulato pero varían las cantidades de fibrinógeno tras aplicar
las muestras de tamaños estándar en el puerto de alimentación de los
cartuchos que contienen trombina.
| \begin{minipage}[t]{150mm} Tiempo de coagulación de las soluciones de fibrinógeno que contienen 43 mg/ml de aprosulato\end{minipage} | |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Concentración de fibrinógeno (mg/ml) en una solución de ensayo combinado\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Tiempo de coagulación (segundos) tras la aplicación al puerto de alimentación del cartucho conteniendo reactivo de trombina\end{minipage} |
| 76 | 149,1 |
| 153 | 85,5 |
| 306 | 21,4 |
Se prepararon cartuchos adicionales en los que
los inhibidores específicos se combinaron con la solución de
trombina, la solución de trombina/inhibidor de trombina depositada
en el cartucho, y se secó. Se preparó un reactivo de sulfato de
trombin-dextrano (TDS) combinando la solución de
base HEPES descrita anteriormente con trombina y sulfato de dextrano
para producir una solución de reactivo que contiene 67 unidades/ml
de trombina y 57 mg/ml de sulfato de dextrano (10000Da). El reactivo
TDS (3 microlitros) se aplicó a los cartuchos y se secó. Las
muestras del ensayo con fibrinógeno para estos cartuchos comprendían
40 \mul de la solución de trabajo de fibrinógeno con 7 \mul de
la solución de esferas de plástico. El tiempo de coagulación de las
muestras de la prueba de fibrinógeno en los cartuchos de TDS se
proporciona en la siguiente tabla.
| \begin{minipage}[t]{150mm} Tiempo de coagulación de las soluciones de fibrinógeno que contienen sulfato de dextrano y trombina\end{minipage} | |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Concentración de fibrinógeno (mg/ml) en una solución de ensayo combinado\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Tiempo de coagulación (segundos) tras la aplicación al puerto de alimentación del cartucho\end{minipage} |
| 99 | 69,9 |
| 198 | 40,0 |
| 396 | 26,7 |
Los cartuchos adicionales se prepararon
utilizando aprosulato como inhibidor específico. Se preparó un
reactivo de trombina-aprosulato (TA) combinando la
solución de base de HEPES descrita anteriormente con trombina y
aprosulato para producir una solución de reactivos que contiene 67
unidades/ml de trombina y 20 g/dl de aprosulato. El reactivo TA
(3microlitros) se aplicó en los cartuchos y se secó. Las muestras de
la prueba de fibrinógeno para estos cartuchos comprendían 40 \mul
de solución de trabajo de fibrinógeno combinada con 7 \mul de la
solución de esferas de plástico. El tiempo de coagulación de las
muestras de la prueba de fibrinógeno en los cartuchos de TA se
proporciona en la tabla siguiente.
| \begin{minipage}[t]{150mm} Tiempo de coagulación de las soluciones de fibrinógeno que contienen aprosulato y trombina\end{minipage} | |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Concentración de fibrinógeno (mg/ml) en una solución de ensayo combinado\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Tiempo de coagulación (segundos) tras la aplicación al puerto de alimentación del cartucho (n = 2)\end{minipage} |
| 25,5 | 275 |
| 102 | 134 |
| 204 | 41 |
| 408 | 24 |
La sensibilidad óptima sobre el rango más amplio
de concentraciones de fibrinógeno puede alcanzarse optimizando las
condiciones del ensayo para el modulador de trombina específico.
Esto puede realizarse sin experimentación excesiva por alguien con
conocimientos ordinarios en la materia siguiendo los procedimientos
expuestos aquí y modificando los diferentes parámetros. El reactivo
óptimo depende de si se usa el fibrómetro o el dispositivo del
cartucho.
Se ha descubierto que los ejemplos no limitantes
de inhibidores de trombina son efectivos en experimentos con uno o
los dos ensayos anteriores (es decir, húmedo y de cartucho),
incluyen sulfato de dextrano (PM 5000-50000), los
péptidos Gly-Pro-Ala y
Gly-Gly-Arg; cafeína;
polianetolsulfato, polivinilsulfato, ácido
bis-lactobiónico (aprosulato), benzamidina, y
antipaína. La determinación de qué análogos de estos compuestos y
qué otros compuestos pueden ser útiles en la presente invención
puede realizarse usando los métodos expuestos anteriormente.
Así, estos diferentes inhibidores pueden usarse
con muestras de sangre completa y muestras de plasma sanguíneo de la
misma forma que las soluciones de trabajo de los ejemplos.
El ejemplo 5 demuestra que la sangre completa no
diluida, más que la sangre sintética con partículas de látex como
sucedáneo de células sanguíneas, puede introducirse en los cartuchos
de la presente invención en un ensayo de un solo paso para
determinar su fibrinógeno. El plasma sanguíneo no diluido, tras la
combinación con partículas de látex u otro sucedáneo de células
sanguíneas (como primer paso), puede introducirse en los cartuchos
de la muestra en un ensayo de dos pasos para determinar su
fibrinógeno.
En una realización alternativa, el plasma
sanguíneo puede ser analizado en un ensayo de un solo paso
combinando un sucedáneo de células sanguíneas, por ejemplo gotas de
látex, con el reactivo en la cámara de reactivo del cartucho. El
plasma sanguíneo se mezclará con el reactivo/partícula y pasará a
través del capilar. Para optimizar el ensayo, el detector puede
moverse de forma distal de la cámara del reactivo.
Así, los nuevos reactivos, dispositivos, y
ensayos se proporcionan para la determinación de fibrinógeno en
muestras fisiológicas. Preferiblemente, el uso del cartucho de
prueba de la presente invención no requiere dilución de la muestra y
ninguna o mínima adición de reactivo antes de la inserción de la
muestra en el cartucho. Por ejemplo, la sangre completa sin diluir
puede añadirse directamente en el pocillo de muestra del cartucho, y
así puede obtenerse directamente una lectura de la concentración de
fibrinógeno, mientras que el fibrinógeno en plasma sanguíneo sin
diluir puede determinarse en el mismo tipo de cartucho por adición
de un sucedáneo de célula sanguínea.
La anterior descripción de las realizaciones
preferidas debe verse a modo de ejemplo y no limitativo. Por
ejemplo, mientras que las realizaciones preferidas utilizan sangre
sin diluir, también se puede usar de la misma manera muestras
diluidas. Otros métodos de relacionar el tiempo de coagulación con
la concentración de fibrinógeno pueden usarse, por ejemplo,
adiciones estándar, donde el tiempo de coagulación de las muestras
sospechosas de contener fibrinógeno se determina siguiendo la
adición de cantidades conocidas pero que van variando de fibrinógeno
a alícuotas de la muestra del mismo tamaño. Además, mientras que las
pruebas de inhibidores de trombina concretos se han ilustrado aquí,
hay que entender que otros compuestos con actividad similar están
también incluidos en el alcance de la invención.
Claims (47)
1. Un método para determinar el fibrinógeno en
una muestra sospechosa de contener fibrinógeno, comprendiendo poner
en contacto una muestra sospechosa de contener fibrinógeno con un
inhibidor de trombina y trombina, y determinando el tiempo de
coagulación, donde la concentración de fibrinógeno de la muestra es
inversamente proporcional al tiempo de coagulación.
2. El método de la reivindicación 1, donde la
muestra es sangre o plasma.
3. El método de la reivindicación 2, donde la
muestra no está diluida.
4. El método de la reivindicación 1, donde el
inhibidor de trombina y la trombina están combinados en un único
reactivo.
5. El método de la reivindicación 1, donde el
inhibidor de trombina se añade a la muestra antes de añadir la
trombina.
6. El método de la reivindicación 1, donde la
muestra está en contacto con trombina suficiente, por lo que la
muestra comprende entre aproximadamente 1 U/ml y alrededor de 100
U/ml de trombina.
7. El método de la reivindicación 1, donde dicho
inhibidor de trombina comprende por lo menos un compuesto
seleccionado a partir del grupo compuesto por un sulfato de
polisacárido, un péptido con propiedades inhibidoras de trombina,
una xantina, un polianetolsulfato; un polivinilsulfato, un ácido
bis-lactobiónico, una benzamidina, un inhibidor de
serin proteasa, hirudina, hirulog, bivalirudin, y argatroban.
8. El método de la reivindicación 7, donde dicho
sulfato de polisacárido es sulfato de dextrano.
9. El método de la reivindicación 8, donde dicho
sulfato de dextrano tiene un peso molecular entre aproximadamente
5000Da y alrededor de 50000Da.
10. El método de la reivindicación 8, donde dicha
muestra está en contacto con suficiente sulfato de dextrano como
para comprender entre aproximadamente 0,01 mg/ml y alrededor de 25
mg/ml de sulfato de dextrano.
11. El método de la reivindicación 7, donde dicha
xantina es cafeína.
12. El método de la reivindicación 11, donde
dicha muestra está en contacto con suficiente cafeína como para
comprender entre aproximadamente 0,85 y alrededor de 8,5 mg/ml de
cafeína.
13. El método de la reivindicación 7, donde dicha
benzamidina es una amida cíclica de
4-amidino-fenilalanina.
14. El método de la reivindicación 13, donde
dicha amida cílica de 4-amidinofenialalnina es
N\alpha-(\beta-naftilsulfonilglicil)-4-amidinofenil-alanina
piperidida.
15. El método de la reivindicación 14, donde
dicha muestra está en contacto con suficiente benzamidina como para
comprender entre aproximadamente 4 y alrededor de 11mg/ml de
benzamidina.
16. El método de la reivindicación 7, donde dicho
inhibidor de serin proteasa es antipaína, y donde dicha muestra está
en contacto con suficiente antipaína como para comprender entre
aproximadamente 0,5 mg/ml y alrededor de 1,0 mg/ml de antipaína.
17. El método de la reivindicación 7, donde dicho
péptido es por lo menos un compuesto seleccionado del grupo
compuesto por Gly-Gly-Arg y
Gly-Pro-Ala.
18. El método de la reivindicación 17, donde
dicha muestra está en contacto con suficiente péptido como para
comprender entre aproximadamente 0,85 y alrededor de 1,3 mg/ml de
GlyGly-Arg cuando
Gly-Gly-Arg es el péptido y entre
alrededor de 0,2 y aproximadamente 0,85 mg/ml de
Gly-Pro-Ala cuando
Gly-Pro-Ala es el péptido.
19. El método de la reivindicación 1, donde dicho
inhibidor de trombina es el ácido
bis-lactobiónico.
20. El método de la reivindicación 1, donde dicho
inhibidor de trombina es un aprosulato, y dicha muestra está en
contacto con suficiente aprosulato como para comprender entre
aproximadamente 10 y alrededor de 50 mg/ml de aprosulato.
21. El método de la reivindicación 1, donde el
tiempo de coagulación se aplica a un algoritmo predefinido para
determinar el fibrinógeno.
22. El método de la reivindicación 21, donde el
tiempo de coagulación se compara con un grupo de tiempos
predeterminados, cada uno de esos tiempos predeterminados está
correlacionado con una concentración de fibrinógeno, donde el
fibrinógeno de la muestra puede estar determinado.
23. El método de la reivindicación 1, donde el
tiempo de coagulación de la muestra se determina detectando una
reducción en el flujo de la muestra a través de una cámara.
24. El método de la reivindicación 1, donde la
trombina y el inhibidor de trombina están contenidos dentro de una
cámara en un cartucho de prueba;
- La muestra se añade a la cámara y se mezcla con la trombina y con el inhibidor de trombina, el cartucho de prueba incluye un capilar a través del cual se hace fluir la muestra y el reactivo, y donde el tiempo de coagulación se determina detectando la reducción en el índice de flujo de dicha muestra a través de dicho capilar.
25. El método de la reivindicación 24,
comprendiendo también el paso de la conversión del tiempo de
coagulación de la muestra en concentración de fibrinógeno.
26. El método de la reivindicación 1, donde la
cantidad de trombina y de inhibidor de trombina combinada con la
muestra se selecciona para producir tiempos de coagulación menores
que trescientos segundos para muestras que contengan entre
aproximadamente 100 mg/dl de fibrinógeno y alrededor de 400 mg/dl de
fibrinógeno, y permite correlacionar las diferencias detectables en
los tiempos de coagulación de diferentes muestras con diferencias
significativas clínicas en la concentración de fibrinógeno.
27. El método de la reivindicación 24, donde
dicha muestra es plasma sanguíneo, y donde el sucedáneo de células
rojas se añade a dicha muestra.
28. Un reactivo para usar en la determinación de
fibrinógeno en una muestra sospechosa de contener fibrinógeno, donde
dicho reactivo comprende un inhibidor de trombina y trombina, donde
dicho inhibidor de trombina comprende, por lo menos, un compuesto
seleccionado del grupo compuesto por sulfato de dextrano con un peso
molecular entre aproximadamente 5000Da y alrededor de 50000Da, un
péptido con propiedades inhibidoras de la trombina, una xantina, un
polietolsulfato, un polivinilsulfato, un ácido
bis-lactobiónico, una benzamidina, un inhibidor
serin proteasa, hirudina, hirulog, bivalirudin, y argatroban.
29. El reactivo de la reivindicación 28, donde la
muestra es sangre completa o plasma sanguíneo.
30. El reactivo de la reivindicación 28, donde la
muestra es sangre completa no diluida o plasma sanguíneo no
diluido.
31. El reactivo de la reivindicación 28, donde
dicha xantina es cafeína.
32. El reactivo de la reivindicación 28, donde
dicha benzamidina es una amida cíclica
4-amidinofenilalanina.
33. El reactivo de la reivindicación 32, donde
dicha amida cíclica de 4-amidinofenilalanina es
N\alpha-(\beta-naftilsulfonilglicil)-4-amidinofenil-alanina
piperidida.
34. El reactivo de la reivindicación 28, donde
dicho inhibidor de la serin proteasa es antipaína.
35. El reactivo de la reivindicación 28, donde
dicho péptido es por lo menos un compuesto seleccionado del grupo
compuesto por Gly-Gly-Arg y
Gly-Pro-Ala.
36. El reactivo de la reivindicación 28, donde
dicho inhibidor de trombina es un ácido
bis-lactobiónico.
37. El reactivo de la reivindicación 28, donde
dicho reactivo es un reactivo seco que se hidrata por la
muestra.
38. El reactivo de la reivindicación 28,
comprendiendo también sucedáneos de células rojas.
39. El reactivo de la reivindicación 28,
comprendiendo también un estabilizante y un tampón.
40. Una cartuchos de prueba para usar en la
determinación de fibrinógeno en una muestra, compuesto por un
receptáculo que contiene un puerto de alimentación, una cámara y un
puerto de salida donde dichos puerto de alimentación, cámara y
puerto de salida están presentes en una vía capilar continua; y el
reactivo de la reivindicación 28 en dicha vía capilar.
41. La cartuchos de prueba de la reivindicación
40, donde dicho reactivo es seco y puede hidratarse por la
muestra.
42. Una cartuchos de prueba para usar en la
determinación de fibrinógeno en una muestra que contenga un
inhibidor de trombina, comprendiendo:
- un receptáculo que contiene un puerto de alimentación, una unidad de cámara y un puerto de salida, dichos puerto de alimentación, unidad de cámara y puerto de salida están presentes en una vía capilar continua; y
- un reactivo en dicha vía capilar, donde dicho reactivo comprende trombina.
43. Un dispositivo para usar en la determinación
de fibrinógeno de una muestra compuesto por:
- el cartucho de prueba de la reivindicación 40 ó 42; y
- un detector de flujo para determinar el tiempo de coagulación en la muestra.
44. El dispositivo de la reivindicación 43,
comprendiendo también un procesador para convertir el tiempo de
coagulación de la muestra en concentración de fibrinógeno.
45. El dispositivo de la reivindicación 44,
comprendiendo también una impresora para imprimir la concentración
de fibrinógeno.
46. El dispositivo de la reivindicación 45, donde
la impresora también imprime los tiempos de coagulación.
47. Un dispositivo para usar en la determinación
de fibrinógeno en una muestra sospechosa de contener fibrinógeno,
compuesto por:
- un reactivo que comprende trombina y un inhibidor de trombina, y que provoca la conversión de fibrinógeno a fibrina, causando así coagulación,
- un recipiente para poner en contacto una muestra sospechosa de contener fibrinógeno con el reactivo,
- un sensor para detectar un grado de coagulación predeterminado,
- un temporizador para determinar la cantidad de tiempo para alcanzar un grado predeterminado de coagulación,
- un procesador que convierte el tiempo de coagulación en la cantidad de fibrinógeno en una muestra, y un indicador que puede informar de la cantidad de fibrinógeno en una muestra.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/678,950 US6448024B1 (en) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | Method, reagent, cartridge, and device for determining fibrinogen |
| US678950 | 2000-10-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2245964T3 true ES2245964T3 (es) | 2006-02-01 |
Family
ID=24724998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01123538T Expired - Lifetime ES2245964T3 (es) | 2000-10-03 | 2001-09-29 | Metodo, reactivos, cartucho y dispositivo para determinar el fibrinogeno. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6448024B1 (es) |
| EP (1) | EP1195608B1 (es) |
| AT (1) | ATE300054T1 (es) |
| DE (1) | DE60112017T2 (es) |
| ES (1) | ES2245964T3 (es) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003267147A1 (en) * | 2002-09-10 | 2004-04-30 | Placor, Inc. | Method and device for monitoring platelet function |
| US7291310B2 (en) * | 2002-12-17 | 2007-11-06 | The Regents Of The University Of Michigan | Microsystem for determining clotting time of blood and low-cost, single-use device for use therein |
| DE10325173B4 (de) * | 2003-06-04 | 2007-11-08 | Stief, Thomas, Dr.med. | Nachweisverfahren für Fibrinogen und/oder Fibrinogen-Derivate |
| US7439069B2 (en) | 2004-02-27 | 2008-10-21 | Nippoldt Douglas D | Blood coagulation test cartridge, system, and method |
| US7422905B2 (en) | 2004-02-27 | 2008-09-09 | Medtronic, Inc. | Blood coagulation test cartridge, system, and method |
| US7399637B2 (en) | 2004-04-19 | 2008-07-15 | Medtronic, Inc. | Blood coagulation test cartridge, system, and method |
| EP1672369A1 (de) * | 2004-12-16 | 2006-06-21 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Bestimmung von Blutkoagulationsparametern, insbesondere in Durchflussmesssystemen |
| WO2006116361A2 (en) * | 2005-04-25 | 2006-11-02 | Placor Inc. | Methods and devices for monitoring platelet function |
| WO2008070324A2 (en) * | 2006-10-25 | 2008-06-12 | Placor, Inc. | Methods and devices for monitoring platelet function |
| JP5539332B2 (ja) * | 2008-05-22 | 2014-07-02 | エシコン・インコーポレイテッド | タンパク質アッセイ |
| US8448499B2 (en) | 2008-12-23 | 2013-05-28 | C A Casyso Ag | Cartridge device for a measuring system for measuring viscoelastic characteristics of a sample liquid, a corresponding measuring system, and a corresponding method |
| US9522396B2 (en) | 2010-12-29 | 2016-12-20 | S.D. Sight Diagnostics Ltd. | Apparatus and method for automatic detection of pathogens |
| PH12014500054A1 (en) * | 2011-07-07 | 2014-03-24 | Revo Biologics Inc | Formulations that stabilize proteins |
| US8900822B2 (en) * | 2011-11-21 | 2014-12-02 | Ethicon, Inc. | Fibrinogen assay |
| CN104169719B (zh) | 2011-12-29 | 2017-03-08 | 思迪赛特诊断有限公司 | 用于检测生物样品中病原体的方法和系统 |
| US9518905B2 (en) | 2012-01-16 | 2016-12-13 | Abram Scientific, Inc. | Methods, devices, and systems for measuring physical properties of fluid |
| JP2013145238A (ja) * | 2013-03-04 | 2013-07-25 | Sekisui Medical Co Ltd | 血液凝固反応における血液凝固時間延長剤 |
| WO2014188405A1 (en) | 2013-05-23 | 2014-11-27 | Parasight Ltd. | Method and system for imaging a cell sample |
| IL227276A0 (en) | 2013-07-01 | 2014-03-06 | Parasight Ltd | A method and system for obtaining a monolayer of cells, for use specifically for diagnosis |
| CN105659151B (zh) | 2013-08-26 | 2018-06-29 | 思迪赛特诊断有限公司 | 数码显微系统与方法 |
| JP2014197019A (ja) * | 2014-06-30 | 2014-10-16 | 積水メディカル株式会社 | 血液凝固反応における血液凝固時間延長剤 |
| US10482595B2 (en) | 2014-08-27 | 2019-11-19 | S.D. Sight Diagnostics Ltd. | System and method for calculating focus variation for a digital microscope |
| US10539579B2 (en) | 2014-09-29 | 2020-01-21 | C A Casyso Gmbh | Blood testing system and method |
| US10288630B2 (en) | 2014-09-29 | 2019-05-14 | C A Casyso Gmbh | Blood testing system and method |
| US10175225B2 (en) | 2014-09-29 | 2019-01-08 | C A Casyso Ag | Blood testing system and method |
| US10816559B2 (en) | 2014-09-29 | 2020-10-27 | Ca Casyso Ag | Blood testing system and method |
| US9897618B2 (en) | 2014-09-29 | 2018-02-20 | C A Casyso Gmbh | Blood testing system |
| JP6058726B2 (ja) * | 2015-03-30 | 2017-01-11 | 積水メディカル株式会社 | 血液凝固反応における血液凝固時間延長剤 |
| US10295554B2 (en) | 2015-06-29 | 2019-05-21 | C A Casyso Gmbh | Blood testing system and method |
| JP6952683B2 (ja) | 2015-09-17 | 2021-10-20 | エス．ディー．サイト ダイアグノスティクス リミテッド | 身体試料中の実体を検出する方法および装置 |
| WO2017096287A1 (en) * | 2015-12-03 | 2017-06-08 | Ca Casyso Ag | Blood testing system and method |
| US11112400B2 (en) * | 2016-01-16 | 2021-09-07 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Blood characteristic measurement |
| WO2017168411A1 (en) | 2016-03-30 | 2017-10-05 | S.D. Sight Diagnostics Ltd | Image processing device for identifying blood parasites |
| US11307196B2 (en) | 2016-05-11 | 2022-04-19 | S.D. Sight Diagnostics Ltd. | Sample carrier for optical measurements |
| CN109564209B (zh) | 2016-05-11 | 2022-05-31 | 思迪赛特诊断有限公司 | 对样品实施的光学测量 |
| US10473674B2 (en) | 2016-08-31 | 2019-11-12 | C A Casyso Gmbh | Controlled blood delivery to mixing chamber of a blood testing cartridge |
| US10843185B2 (en) | 2017-07-12 | 2020-11-24 | Ca Casyso Gmbh | Autoplatelet cartridge device |
| EP3710810B1 (en) | 2017-11-14 | 2023-09-06 | S.D. Sight Diagnostics Ltd. | Sample carrier for optical measurements |
| CN114787685A (zh) | 2019-12-12 | 2022-07-22 | 思迪赛特诊断有限公司 | 人工生成彩色血液涂片图像 |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3311287A1 (de) | 1983-03-28 | 1984-10-04 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur fotometrischen bestimmung der aktivierten partiellen thromboplastinzeit und reagenz dazu |
| DE3407280A1 (de) | 1984-02-28 | 1985-09-19 | Gödecke AG, 1000 Berlin | Testsatz zur bestimmung der aktivierten partiellen thromboplastinzeit (ptt) mit erhoehter heparinempfindlichkeit |
| DE3504405A1 (de) | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Bestimmung von prokallikrein |
| US4666831A (en) | 1985-02-19 | 1987-05-19 | The Liposome Company, Inc. | Lipid-dependent diagnostic assays |
| US5164598A (en) | 1985-08-05 | 1992-11-17 | Biotrack | Capillary flow device |
| US4756884A (en) | 1985-08-05 | 1988-07-12 | Biotrack, Inc. | Capillary flow device |
| US4946775A (en) | 1985-09-05 | 1990-08-07 | Yin E Thye | Composition, kit and method for assaying heparin and a method for making the composition |
| US4755461A (en) | 1986-04-17 | 1988-07-05 | Bio/Data Corporation | Tableted blood plasma microconcentrated thromboplastin coagulation reagent |
| US5039617A (en) | 1989-04-20 | 1991-08-13 | Biotrack, Inc. | Capillary flow device and method for measuring activated partial thromboplastin time |
| AT395597B (de) | 1991-01-25 | 1993-01-25 | Immuno Ag | Reagens zur bestimmung von faktor viii-aktivitaet |
| US5254350A (en) | 1991-07-22 | 1993-10-19 | Helena Laboratories Corporation | Method of preparing a thromboplastin extract |
| JP3180824B2 (ja) | 1991-08-30 | 2001-06-25 | シスメックス株式会社 | 血液凝固試薬 |
| DE4133946A1 (de) | 1991-10-14 | 1993-04-15 | Behringwerke Ag | Funktioneller test und reagenz zur bestimmung von fibrinogen |
| DE59309374D1 (de) | 1992-05-15 | 1999-03-25 | Immuno Ag | Reagens zur Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) |
| AT399055B (de) * | 1992-05-15 | 1995-03-27 | Immuno Ag | Verfahren zur bestimmung von fibrinogen |
| US5443959A (en) | 1992-09-09 | 1995-08-22 | Tokuyama Corporation | Method of assaying fibrinogen, dry reagent therefor, and process for the preparation thereof |
| US5472852A (en) | 1993-09-15 | 1995-12-05 | Oklahoma Medical Research Foundation | Assay for detection of selective Protein C inhibition by patients |
| CA2152954A1 (en) | 1993-11-04 | 1995-05-11 | Dade Behring Inc. | Tetrahydroxyquinone as an activator component for activated partial thromboplastine time test of blood coagulation and as a detector of blood coagulation disorders |
| DE4344919A1 (de) | 1993-12-30 | 1995-07-06 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Bestimmung der Thrombozytenaggregation |
| US5589571A (en) | 1994-10-28 | 1996-12-31 | Cor Therapeutics, Inc. | Process for production of inhibited forms of activated blood factors |
| US5705395A (en) | 1994-11-14 | 1998-01-06 | The Scripps Research Institute | Method for diagnosis of thrombotic disorders |
| DE19749197A1 (de) | 1997-11-07 | 1999-05-12 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verfahren zur Bestimmung des antikoagulatorischen Potentials einer Probe |
| WO1999038997A1 (fr) | 1998-01-30 | 1999-08-05 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. | Procede de mesure de l'activite du cofacteur ii de l'heparine et boite de reactifs y relative |
| SE9803616D0 (sv) | 1998-10-22 | 1998-10-22 | Nybohov Dev Ab | Sedelhanteringsmaskin |
| US6699718B1 (en) | 1999-09-03 | 2004-03-02 | Roche Diagnostics Corporation | Method, reagent and test cartridge for determining clotting time |
-
2000
- 2000-10-03 US US09/678,950 patent/US6448024B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-09-29 AT AT01123538T patent/ATE300054T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-09-29 DE DE60112017T patent/DE60112017T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-29 EP EP01123538A patent/EP1195608B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-29 ES ES01123538T patent/ES2245964T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1195608A1 (en) | 2002-04-10 |
| DE60112017D1 (de) | 2005-08-25 |
| DE60112017T2 (de) | 2006-04-20 |
| US6448024B1 (en) | 2002-09-10 |
| ATE300054T1 (de) | 2005-08-15 |
| EP1195608B1 (en) | 2005-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2245964T3 (es) | Metodo, reactivos, cartucho y dispositivo para determinar el fibrinogeno. | |
| JP5628409B2 (ja) | 試験液の凝固特性を測定するための組成物 | |
| EP1208383B1 (en) | Method, reagent and test cartridge for determining clotting time | |
| ES2354086T3 (es) | Determinación de la actividad de trombina en sangre completa. | |
| ES2881861T3 (es) | Sensores para evaluar la coagulación en muestras de fluidos | |
| EP2153235B1 (en) | Methods of measuring inhibition of platelet aggregation by thrombin receptor antagonists | |
| JP2010518371A (ja) | 被験液の凝固特性の測定における診断用組成物及びその使用 | |
| ES2400668T3 (es) | Procedimiento y dispositivo para la determinación de la función plaquetaria y de las condiciones de flujo | |
| ES2599929T3 (es) | Método diagnóstico in vitro para evaluar la enfermedad de von Willebrand y un mayor riesgo hemorrágico asociado con la enfermedad de von Willebrand y los trastornos adquiridos o congénitos de la función trombocítica | |
| CN104914253B (zh) | 一种纤维蛋白原的检测方法 | |
| ES2378544T3 (es) | Activación selectiva de plaquetas para el seguimiento de terapia con antagonistas de ADP | |
| US20250065321A1 (en) | Pipette tip and uses and methods thereof | |
| US20080038764A1 (en) | COMPOSITIONS, KIT AND ONE-STEP METHOD FOR MONITORING COMPOUNDS HAVING ANTI-FACTOR Xa AND/OR ANTI FACTOR IIa ACTIVITIES | |
| JPH0365958B2 (es) | ||
| ES2322931T3 (es) | Preparacion de esferas para pruebas de diagnostico. | |
| WO2017000971A1 (en) | Diagnostic kit for viscoelastic analysis and uses and methods thereof | |
| CN108152517A (zh) | 一种测试活化部分凝血活酶时间的装置和方法 | |
| JP7359538B2 (ja) | フィブリノゲン測定試薬 | |
| ES2377437T3 (es) | Procedimiento para determinar la actividad de coagulación total de una muestra de sangre o plasma | |
| US5627038A (en) | Factor IX chromogenic assay | |
| Meyers et al. | Equine Hemostasis: Description, Evaluation, and Alteration | |
| CN119506395A (zh) | 一种检测全血或血浆纤维蛋白原含量的方法和试剂 | |
| CN110514823A (zh) | 一种血小板抑制率检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |