ES2244509T3 - Procedimiento para identificar estructuras diana celula-especificas. - Google Patents
Procedimiento para identificar estructuras diana celula-especificas.Info
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Abstract
Procedimiento para identificar estructuras diana célula-específicas, que comprende los siguientes pasos: a) aplicación automatizada de una solución reactiva Y1, que presenta al menos una molécula marcadora, sobre un objeto X1 que incluye células y/o membranas celulares extraídas de una muestra celular o tisular; b) interacción con la solución reactiva Y1 y detección automatizada de por lo menos un patrón de marcaje del objeto X1 marcado con la solución reactiva Y1; c) eliminación de la solución reactiva Y1 antes o después de la detección del patrón de marcaje y repetición de los pasos a) y b) con otras soluciones reactivas Yn (n= 2, 3...N), las cuales presentan dicha molécula marcadora, al menos una, y/o por lo menos otra molécula marcadora; d) reunir los patrones de marcaje detectados respectivamente mediante el paso b), estableciendo así un patrón de combinación molecular complejo del objeto X1; e) repetición de los pasos a) a d) con por lo menos otro objeto Xn (n= 2, 3...N), que presentaotras células y/u otras membranas celulares extraídas de otra muestra celular o tisular.
Description
Procedimiento para identificar estructuras diana
célula-específicas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para identificar estructuras diana
célula-específicas.
La identificación de estructuras diana
célula-específicas es de gran importancia en la
exploración de interacciones célula-célula, que
pueden conllevar innumerables efectos dentro de un organismo. En
particular, el conocimiento de estructuras diana específicas de
ciertas patologías es un requisito indispensable para poder
desarrollar fármacos eficaces que a la vez tengan pocos efectos
secundarios.
Se conoce el hecho de que los inmunocitos
(linfocitos) expresan combinaciones específicas de proteínas, a las
que se les denomina también patrón de combinación de proteínas, que
son responsables de la unión con las células endoteliales
localizadas en los vasos sanguíneos del cerebro y del tejido
muscular. Otras combinaciones de proteínas, en cambio, no llevan a
una unión con dichas células endoteliales. Sorprendentemente, estas
combinaciones específicas son constantes de forma interindividual,
presentando siempre las mismas funciones de unión. Por
consiguiente, los patrones específicos de combinación de proteínas
parecen representar un constante e interindividual código
linfocitario de unión de la superficie celular para superficies de
células endoteliales órgano-específicas,
representando dicho código una estructura diana
célula-específica. Por ende, las estructuras diana
célula-específicas pueden presentar patrones de
combinación de proteínas perfectamente específicos.
También las células tumorales invasivas disponen,
en sus superficies celulares, de patrones específicos de
combinación de proteínas, que originan un comportamiento invasivo
selectivo o, más precisamente, órgano-selectivo.
Por consiguiente, tales patrones de combinación de proteínas
representan estructuras diana para posibles fármacos.
Sin embargo, el requisito indispensable para
poder desarrollar tales fármacos altamente selectivos es conocer la
composición molecular de dichas estructuras diana.
Del estado de la técnica se conocen
procedimientos destinados a identificar estructuras diana, basados
en el análisis de perfiles de expresión genética de células o
tejidos patológicos en comparación con perfiles de expresión
genética de células o tejidos sanos. En estos procedimientos, tanto
los perfiles de expresión de proteínas como los perfiles de
expresión del ácido ribonucleico mensajero (ARNm o mRNA) van
encaminados a dar información sobre la aparición, en tejidos
patológicos o células patológicas, de nuevas proteínas, de
proteínas mal reguladas o de proteínas modificadas de manera
anormal (véase por ejemplo en: F. Lottspeich/H. Zorbas; Bioanalytik;
Spektrum Akademischer Verlag; Heidelberg, 1998).
Todos estos procedimientos, sin embargo, parten
de homogenados celulares, que tienen como base varios miles o
millones de células, puesto que estas cantidades de células son
necesarias para establecer perfiles de expresión del tipo arriba
mencionado. En los homogenados celulares, las células están
presentes en forma abierta para que las proteínas o las moléculas
de ARNm puedan ser extraídas y separadas mediante procedimientos
bioquímicos.
Sin embargo, estos procedimientos conocidos
tienen el inconveniente de que no son apropiados para identificar
patrones de combinación de proteínas, puesto que la producción de
homogenados de células y la subsiguiente realización de procesos de
extracción hacen que los componentes proteicos individuales de
semejantes patrones de combinación de proteínas queden
completamente separados, perdiéndose así las informaciones
esenciales relativas a su topología celular y tisular. Debido a la
destrucción de los compartimientos celulares es imposible, además,
obtener informaciones relativas a las combinaciones de proteínas
dentro de dichos compartimientos celulares y a su correlación
topológica relativa.
Otro inconveniente de los procedimientos
conocidos consiste en la imposibilidad de realizar análisis
bioquímicos a nivel de las células individuales, debido a lo cual no
se pueden averiguar las diferencias entre las células individuales
respecto a sus patrones de combinación de proteínas. Aparte de
ello, las proteínas que sólo están presentes en una cantidad
reducida no pueden ser detectadas por medio de los procedimientos
conocidos. Ello concierne particularmente a proteínas o
combinaciones proteicas específicas que, por ejemplo, se encuentran
solamente en pocas células, siendo éstas patogénicas y específicas
de determinadas patologías.
Otro inconveniente de los procedimientos
conocidos consiste en el hecho de que los pasos de preparación, a
los cuales el tejido o las células están sometidos desde su
extracción u obtención hasta el paso de aislamiento o
fraccionamiento de proteínas, pueden estar sujetos a una gran
variedad de condicionantes externos variables, los cuales son
difíciles de controlar y de estandarizar.
Un procedimiento automatizado para comprobar un
número arbitrario de clases, fragmentos y grupos de moléculas
contenidos en objetos a analizar, así como un dispositivo destinado
a ello están descritos en el documento
DE-A-19709348.
Por consiguiente, el objetivo de la presente
invención es poner a disposición un procedimiento del tipo arriba
indicado, mediante el cual se puedan identificar patrones de
combinación de proteínas célula-específicos y que
permita superar los referidos inconvenientes del estado de la
técnica.
Este objetivo es alcanzado mediante un
procedimiento que reúne las características de la presente
invención y que sirve para identificar estructuras diana
célula-específicas, comprendiendo este
procedimiento los siguientes pasos: (a) aplicación automatizada de
una solución reactiva Y1, que presenta al menos una molécula
marcadora, sobre un objeto X1 que incluya células y/o membranas
celulares extraídas de una muestra celular o tisular; (b)
interacción con la solución reactiva Y1 y detección automatizada de
por lo menos un patrón de marcaje del objeto X1 marcado con la
solución reactiva Y1; (c) eliminación de la solución reactiva Y1
antes o después de la detección del patrón de marcaje y repetición
de los pasos a) y b) con otras soluciones reactivas Yn (n= 2,
3...N), las cuales presentan dicha molécula marcadora, al menos
una, y/o por lo menos otra molécula marcadora; (d) reunir los
patrones de marcaje detectados respectivamente mediante el paso b),
estableciendo así un patrón de combinación molecular complejo del
objeto X1; (e) repetición de los pasos a) a d) con por lo menos
otro objeto Xn (n= 2, 3...N), que presenta otras células y/u otras
membranas celulares extraídas de otra muestra celular o tisular;
(f) averiguar por lo menos una diferencia entre el patrón de
combinación del objeto X1 y el patrón de combinación del objeto Xn;
(g) identificar por lo menos una solución reactiva Y1 o Yn, cuyo
patrón de marcaje produce dicha diferencia, por lo menos una,
averiguada mediante el paso O; y (h) seleccionar moléculas o
complejos moleculares, que son unidos a la molécula marcadora, al
menos una, de la solución reactiva Y1 o Yn identificada mediante
el paso g), de entre un homogenado de células y/o membranas
celulares provenientes de la muestra celular o tisular del objeto Xn
que muestra una diferencia de acuerdo con el paso f); y (i)
caracterización bioquímica de las moléculas o complejos
moleculares seleccionados de acuerdo con el paso h).
Gracias al procedimiento preconizado, se puede
realizar el análisis comparativo de los patrones de combinación de
proteínas de células individuales o de membranas celulares
individuales extraídas de distintas muestras celulares o tisulares,
pudiéndose identificar aquellas moléculas marcadoras que se unen,
por ejemplo, a un determinado patrón de combinación de proteínas o
a una zona determinada de semejante patrón de combinación de
proteínas de un primer objeto proveniente de una primera muestra
celular o tisular, a la vez que no se unen a un segundo objeto
proveniente de una segunda muestra celular o tisular. Es por medio
de estas moléculas marcadoras identificadas que, a continuación y
utilizando una parte de la primera muestra tisular y/o celular, se
pueden detectar o seleccionar, y posteriormente caracterizar,
aquellas zonas moleculares (moléculas o complejos moleculares del
patrón de combinación de proteínas que son unidas a las moléculas
marcadoras identificadas. De este modo es posible comprobar tanto
la composición molecular del patrón de combinación de proteínas
como la configuración de las moléculas dentro del patrón de
combinación de proteínas y la configuración del patrón de
combinación de proteínas dentro de un tejido o de una célula.
Un desarrollo particularmente ventajoso de la
presente invención prevé que, antes de realizar el paso h), el
homogenado utilizado en el paso h) sea fraccionado en componentes
de homogenado individuales mediante procedimientos de separación de
moléculas o de complejos moleculares, particularmente mediante
procedimientos de segregación de proteínas. De este modo se
simplifica extraordinariamente la tarea de seleccionar del
homogenado las moléculas o los complejos moleculares.
Otro desarrollo ventajoso del procedimiento
propuesto prevé que el objeto X1 presente células y/o membranas
celulares provenientes de una muestra celular o tisular extraída de
un paciente enfermo y que otro objeto Xn, por lo menos uno,
presente células y/o membranas celulares que procedan de una
muestra celular o tisular extraída de un paciente sano. De este
modo pueden identificarse estructuras diana específicas de
determinadas enfermedades o los correspondientes patrones de
combinación de proteínas, de tal manera que, gracias al
conocimiento de estos patrones de combinación de proteínas
específicos de determinadas patologías, pueden desarrollarse
fármacos altamente específicos, los cuales son casi completamente
libres de efectos secundarios debido a esta especificidad.
Otro desarrollo ventajoso de la presente
invención prevé que el procedimiento comprende el siguiente paso
paralelo: (x) establecer respectivamente un perfil de expresión de
proteínas de cada parte de muestra de las muestras celulares o
tisulares, cuyas células y/o membranas celulares forman parte de
los objetos X1 y Xn, y comparar el perfil de expresión de proteínas
atribuible al objeto X1 con el perfil de expresión de proteínas
atribuible al objeto Xn, comprobándose por lo menos una
diferencia.
Además, el procedimiento propuesto puede
comprender el siguiente paso, a realizar después del paso x): (y)
examinar por lo menos una proteína y/o por lo menos una
modificación de proteínas, que causa la diferencia comprobada en el
paso x), con respecto a una unión de la molécula marcadora, por lo
menos una, de la solución reactiva Y1 o Yn identificada mediante
el paso g). De este manera se puede determinar si las diferencias
comprobadas mediante la comparación de los perfiles de expresión
de proteínas representan artefactos resultantes del procedimiento
(véase arriba) o si realmente se trata de diferencias
significativas por haberse podido determinar también mediante el
procedimiento propuesto. Por consiguiente, el procedimiento
propuesto puede utilizarse también como procedimiento
complementario esencial de los procedimientos ya conocidos.
En otro desarrollo particularmente ventajoso de
la invención está previsto que por lo menos una molécula marcadora
utilizada en el paso a) y/o en el paso c) se una a por lo menos una
proteína y/o a por lo menos una modificación de proteínas, que es
responsable de la diferencia determinada mediante el paso x).
Algunos procedimientos conocidos permiten, por ejemplo, el
desarrollo de anticuerpos o ligandos que se unen a proteínas o
modificaciones de proteínas, que fueron determinadas como zonas de
estructuras diana mediante la comparación de perfiles de expresión
de proteínas. Utilizando estos anticuerpos o ligandos en el
procedimiento propuesto se puede examinar si las proteínas
determinadas mediante la comparación de perfiles de expresión de
proteínas generan o no patrones de combinación de proteínas.
Además, por lo menos una molécula marcadora
utilizada en el paso a) y/o en el paso c) puede estar conjugada
con fluorocromo. Gracias a un marcaje con fluorescencia de este
tipo es particularmente fácil detectar una molécula marcadora.
Aparte de ello, por lo menos una molécula
marcadora utilizada en el paso a) y/o en el paso c). puede ser un
anticuerpo, pudiendo este anticuerpo ser tomado de una biblioteca
de anticuerpos, pudiendo la biblioteca de anticuerpos ser una
biblioteca de anticuerpos ingenua ("naive antibody library")
o no ingenua. Las llamadas bibliotecas de anticuerpos ingenuas son
bibliotecas en las que los anticuerpos recogidos no presentan
ninguna especificidad conocida, mientras que los anticuerpos de
las bibliotecas de anticuerpos no ingenuas reconocen moléculas
conocidas, como por ejemplo proteínas o glucoproteínas. De ello
resulta que utilizando una biblioteca no ingenua y una vez
identificado un anticuerpo, se dispone de la información a qué
molécula o a qué moléculas se une este anticuerpo.
Además, por lo menos una molécula marcadora
utilizada en el paso a) y/o en el paso c) puede ser un ligando.
Dicho ligando puede ser tomado de una biblioteca de ligandos,
pudiendo la biblioteca de ligandos ser una biblioteca de ligandos
("ligand library") ingenua o no ingenua. Las denominaciones
"ingenuo" y "no ingenuo" se han de comprender de manera
análoga a lo descrito anteriormente.
Después de remover la solución reactiva de
acuerdo con el paso c) se puede continuar con un paso de lavado,
en el cual una solución de lavado es aplicada al objeto X1 y se
vuelve a remover tras un intervalo predeterminado. De esta manera
se evita que una solución reactiva recién aplicada sea contaminada
por una solución reactiva aplicada con anterioridad.
El paso d) puede realizarse ventajosamente
mediante fusiones de imagen computarizadas.
El procedimiento puede comprender,
particularmente tras el paso b), unos ciclos de blanqueo que pueden
ser repetidos indefinidamente. Con tales ciclos de blanqueo se
evita que los marcajes ya detectados sean detectados nuevamente en
un paso subsiguiente.
Más detalles, características y ventajas de la
invención se desprenden de la siguiente descripción de un ejemplo
de realización.
En este ejemplo de realización, una muestra
celular o tisular es dividida en dos partes de muestra. La primera
parte de la muestra sirve corno material de partida para la
elaboración de un homogenado destinado a la caracterización
bioquímica de proteínas de acuerdo con los procedimientos
conocidos. En particular, se utilizan procedimientos como la
electroforesis bidimensional en geles para establecer perfiles de
expresión de proteínas.
La segunda parte de la muestra es utilizada para
producir cortes de tejido o, en su caso, preparados celulares con
células intactas. Si esta segunda parte de la muestra es un bloque
de tejido, se producirá de este mismo un corte de tejido. Si, en
cambio, se trata de células en una suspensión, éstas son aplicadas
en forma intacta sobre una superficie, en particular sobre una
placa portaobjetos. El primer objeto obtenido de esta manera es
sometido a los siguientes pasos automatizados, que forman parte
del procedimiento descrito:
1. Tomar una primera solución reactiva Y1 con uno
o varios anticuerpos conjugados con fluorocromo provenientes de una
biblioteca de anticuerpos no ingenua;
2. Pipetear esta solución reactiva Y1 en el
primer objeto;
3. Incubar el objeto con esta solución reactiva
Y1 a una temperatura determinada, particularmente a temperatura
ambiental;
4. Remover esta solución reactiva;
5. Aplicar una o varias veces gotas de una
solución de lavado y después removerla;
6. Aplicar una solución tampón sobre el primer
objeto;
7. Detectar el patrón de distribución de la
fluorescencia, utilizándose, en el caso de emplear varios
fluorocromos, filtros para imágenes de fluorescencia para la
obtención de la imagen. Mediante este paso se determina si, y en
qué lugares, el anticuerpo o los anticuerpos muestran señales de
unión en la muestra. Se registran de manera digital e
indistintamente las señales positivas y las señales negativas para
cada punto de imagen (pixel) o, en su caso, para cada punto de
posición de las células o del tejido que forman parte del primer
objeto;
8. Aplicar otra solución de lavado mediante una
pipeta;
9. Blanquear la muestra por medio de una
excitación de fluorescencia, dándose por terminado el proceso de
blanqueo en el momento en que ya no se detecta ninguna
flurescencia;
10. Remover la otra solución de lavado;
11. Tomar una solución reactiva Y2 con uno o
varios anticuerpos también conjugados con fluorocromo y
provenientes de otra o la misma biblioteca de anticuerpos;
12. Pipetear la solución reactiva Y2 en el primer
objeto.
Este procedimiento se continúa mediante la
repetición de los pasos 1 a 10, utilizándose las soluciones
reactivas Y3, Y4, Y5..Yn, las cuales pueden contener anticuerpos o
ligandos' tomados de bibliotecas no ingenuas o ingenuas. De esta
manera, un mismo objeto puede ser examinado mediante una
biblioteca completamente ingenua o mediante una biblioteca
completamente no ingenua, o bien mediante una biblioteca mixta, en
parte no ingenua y en parte ingenua.
Cada uno de estos ciclos del procedimiento (pasos
1 a 10) es terminado por el registro de una imagen de contraste de
fase correspondiente o de una imagen de contraste por interferencia
diferencial.
De los respectivos patrones de marcaje
registrados mediante el paso 7, se determinan, mediante
sobreposiciones de imagen computarizadas, las combinaciones de
señales existentes y las combinaciones de señales no existentes,
que en su totalidad producen un patrón de combinación.
Este patrón de combinación determinado para el
primer objeto es comparado con otros patrones de combinación
resultantes de otras muestras o, en su caso, de otros voluntarios,
células o estados o patologías, que fueron analizados de acuerdo con
los mismos pasos estandarizados y arriba indicados del
procedimiento.
En caso de que esta comparación diese como
resultado combinaciones de señales inequívocas y específicas de la
muestra examinada o de un estado, una forma celular, una enfermedad
o una función determinada, ello significa que estas combinaciones
de señales se deben a interacciones moleculares específicas, es
decir selectivas, y por ello caracterizan el estado, la
enfermedad, la función o la forma celular. A las combinaciones de
señales comprobadas se pueden atribuir los respectivos anticuerpos
o ligandos.
A continuación, los anticuerpos y/o ligandos
identificados de esta manera son utilizados para "pescar" de
la primera parte de la muestra aquellas proteínas, glucoproteinas u
otras estructuras de carbohidratos que son capaces de unirse de
manera específica a estos ligandos o anticuerpos. A este efecto se
emplean los procedimientos conocidos en el campo de la bioquímica
analítica. Las moléculas que se identifican de este modo, pueden
ser especies moleculares individuales o complejos formados por
especies moleculares distintas. En ambos casos, dichas moléculas
representan estructuras diana altamente específicas,
particularmente para el desarrollo de fármacos.
Claims (14)
1. Procedimiento para identificar estructuras
diana célula-específicas, que comprende los
siguientes pasos:
- a)
- aplicación automatizada de una solución reactiva Y1, que presenta al menos una molécula marcadora, sobre un objeto X1 que incluye células y/o membranas celulares extraídas de una muestra celular o tisular;
- b)
- interacción con la solución reactiva Y1 y detección automatizada de por lo menos un patrón de marcaje del objeto X1 marcado con la solución reactiva Y1;
- c)
- eliminación de la solución reactiva Y1 antes o después de la detección del patrón de marcaje y repetición de los pasos a) y b) con otras soluciones reactivas Yn (n= 2, 3...N), las cuales presentan dicha molécula marcadora, al menos una, y/o por lo menos otra molécula marcadora;
- d)
- reunir los patrones de marcaje detectados respectivamente mediante el paso b), estableciendo así un patrón de combinación molecular complejo del objeto X1;
- e)
- repetición de los pasos a) a d) con por lo menos otro objeto Xn (n= 2, 3...N), que presenta otras células y/u otras membranas celulares extraídas de otra muestra celular o tisular;
- f)
- averiguar por lo menos una diferencia entre el patrón de combinación del objeto X1 y el patrón de combinación del objeto Xn;
- g)
- identificar por lo menos una solución reactiva Y1 o Yn, cuyo patrón de marcaje produce dicha diferencia, por lo menos una, averiguada mediante el paso f);
- h)
- seleccionar moléculas o complejos moleculares, que son unidos a la molécula marcadora, por lo menos una, de la solución reactiva Y1 o Yn identificada mediante el paso g), de entre un homogenado de células y/o membranas celulares provenientes de la muestra celular o tisular del objeto Xn que muestra una diferencia de acuerdo con el paso f); y
- i)
- caracterización bioquímica de las moléculas o complejos moleculares seleccionados de acuerdo con el paso h).
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que
antes de realizar el paso h), el homogenado
utilizado en el paso h) es fraccionado en componentes de
homogenado individuales mediante procedimientos de separación de
moléculas o de complejos moleculares, particularmente mediante
procedimientos de segregación de proteínas.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado por el hecho de que
el objeto X1 presenta células y/o membranas
celulares provenientes de una muestra celular o tisular extraída de
un paciente enfermo y que otro objeto Xn, por lo menos uno,
presenta células y/o membranas celulares que proceden de una muestra
celular o tisular extraída de un paciente sano.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado por el hecho de que
el procedimiento comprende el siguiente paso
paralelo:
x) establecer respectivamente un perfil de
expresión de proteínas de cada parte de muestra de las muestras
celulares o tisulares, cuyas células y/o membranas celulares
forman parte de los objetos X1 y Xn, y
comparar el perfil de expresión de proteínas
atribuible al objeto X1 con el perfil de expresión de proteínas
atribuible al objeto Xn, comprobándose por lo menos una
diferencia.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado por el hecho de que
el procedimiento comprende el siguiente paso, a
realizar después del paso x):
y) examinar por lo menos una proteína y/o por lo
menos una modificación de proteínas, que causa la diferencia
comprobada en el paso x), con respecto a una unión de la molécula
marcadora, por lo menos una, de la solución reactiva Y1 o Yn
identificada mediante el paso g).
6. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado por el hecho de que
que por lo menos una molécula marcadora utilizada
en el paso a) y/o en el paso c) se une a por lo menos una proteína
y/o a por lo menos una modificación de proteínas, que es
responsable de la diferencia determinada mediante el paso x).
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado por el hecho de que
por lo menos una molécula marcadora utilizada en
el paso a) y/o en el paso c) puede estar conjugada con
fluorocromo.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado por el hecho de que por lo
menos una molécula marcadora utilizada en el paso a) y/o en el paso
c) es un anticuerpo.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado por el hecho de que
el anticuerpo es tomado de una biblioteca de
anticuerpos, siendo la biblioteca de anticuerpos una biblioteca de
anticuerpos ingenua o no ingenua.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado por el hecho de que
por lo menos una molécula marcadora utilizada en
el paso a) y/o en el paso c) es un ligando.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado por el hecho de que
el ligando es tomado de una biblioteca de
ligandos, siendo la biblioteca de ligandos una biblioteca de
ligandos ingenua o no ingenua.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado por el hecho de que
después de remover la solución reactiva de
acuerdo con el paso c) se continúa con un paso de lavado, en el
cual una solución de lavado es aplicada al objeto X1 y se vuelve a
remover tras un intervalo predeterminado.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado por el hecho de que
el paso d) se realiza por medio de fusiones de
imagen computarizadas.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado por el hecho de que
el procedimiento comprende, particularmente tras
el paso b), unos ciclos de blanqueo que pueden ser repetidos
indefinidamente.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE10014685 | 2000-03-24 | ||
| DE10014685A DE10014685B4 (de) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen Zielstrukturen |
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| ES2244509T3 true ES2244509T3 (es) | 2005-12-16 |
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Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7306926B2 (en) * | 1998-07-01 | 2007-12-11 | Mtm Laboratories Ag | Method for detecting carcinomas in a solubilized cervical body sample |
| DE10043470B4 (de) | 2000-09-04 | 2006-01-19 | Mpb Meltec Patent- Und Beteiligungsgesellschaft Mbh | Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen Proteinen |
| US7306925B2 (en) * | 2001-11-09 | 2007-12-11 | Vanderbilt University | Phage antibodies to radiation-inducible neoantigens |
| DE50202704D1 (de) * | 2002-01-22 | 2005-05-12 | Mpb Meltec Patent Und Beteilig | Verfahren und Vorrichtung für die Probenvorbereitung zur Analyse von biologischen Proben |
| DK1388734T3 (da) * | 2002-08-01 | 2004-05-03 | Mtm Lab Ag | Metode til opløsningsbaseret diagnose |
| ATE289685T1 (de) * | 2003-08-25 | 2005-03-15 | Mtm Lab Ag | Verfahren zum nachweis von karzinomen in solubilisierten zervikalen körperproben |
| US20090305308A1 (en) * | 2005-03-21 | 2009-12-10 | Walter Schubert | Method for identifying cell-specific protein combination patterns |
| EP1722230A3 (en) * | 2005-04-27 | 2009-05-27 | MPB MelTec Patent- und Beteiligungsgesellschaft mbH | Method for detection of a disease-specific combinatorial molecular pattern motif in a tissue sample of a patient's skin |
| DE102006020844A1 (de) * | 2006-05-04 | 2007-11-08 | Adrian Schubert | Verfahren zur fuktionellen Annotation molekularer Netzwerke |
| US7741045B2 (en) * | 2006-11-16 | 2010-06-22 | General Electric Company | Sequential analysis of biological samples |
| US9201063B2 (en) * | 2006-11-16 | 2015-12-01 | General Electric Company | Sequential analysis of biological samples |
| US8305579B2 (en) | 2006-11-16 | 2012-11-06 | Thomas Pirrie Treynor | Sequential analysis of biological samples |
| US7629125B2 (en) * | 2006-11-16 | 2009-12-08 | General Electric Company | Sequential analysis of biological samples |
| DE102007056198B4 (de) * | 2007-11-21 | 2012-01-26 | Niels Grabe | Beurteilung der Wirkung eines endogenen oder exogenen Einflusses auf Epithelgewebe durch Kartierung des Gewebes mittels markierter histologischer Gewebeschnitte |
| US20090253163A1 (en) * | 2008-04-02 | 2009-10-08 | General Electric Company | Iterative staining of biological samples |
| US9677125B2 (en) * | 2009-10-21 | 2017-06-13 | General Electric Company | Detection of plurality of targets in biological samples |
| JP5978220B2 (ja) | 2010-10-29 | 2016-08-24 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 核酸ナノ構造バーコードプローブ |
| US8568991B2 (en) | 2011-12-23 | 2013-10-29 | General Electric Company | Photoactivated chemical bleaching of dyes |
| US9176032B2 (en) | 2011-12-23 | 2015-11-03 | General Electric Company | Methods of analyzing an H and E stained biological sample |
| JP2016513794A (ja) | 2013-03-06 | 2016-05-16 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | Ｈ＆ｅ染色された生体試料を分析する方法 |
| WO2015017586A1 (en) | 2013-07-30 | 2015-02-05 | President And Fellows Of Harvard College | Quantitative dna-based imaging and super-resolution imaging |
| JP6757255B2 (ja) | 2014-03-11 | 2020-09-16 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | プログラム可能な核酸プローブを用いた高スループット及び高度多重化イメージング |
| EP3037820A1 (en) | 2014-12-27 | 2016-06-29 | Miltenyi Biotec GmbH | Cell detection methods and reagents having a releasable labelling moiety |
| EP3332358A4 (en) | 2015-08-07 | 2019-05-29 | President and Fellows of Harvard College | SUPER-RESOLVED IMAGING OF PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS |
| JP2020504600A (ja) | 2016-12-09 | 2020-02-13 | アルティヴュー， インク． | 標識化核酸イメージング剤を使用した多重イメージングのための改善された方法 |
| EP3336546B1 (en) | 2016-12-13 | 2020-07-01 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Reversible cell labelling with conjugates having two releasable binding sites |
| EP3489684B1 (en) | 2017-11-27 | 2024-06-26 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Method for photobleaching stained cells |
| EP3953489A1 (en) | 2019-04-12 | 2022-02-16 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Conjugates having an enzymatically releasable detection moiety and a barcode moiety |
| WO2020216439A1 (en) | 2019-04-23 | 2020-10-29 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Reversible cell detection with conjugates having a linker for increased fluorescent brightness and an enzymatically releasable fluorescent moiety |
| JP2023500962A (ja) | 2019-11-11 | 2023-01-11 | ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲー | シリアルマルチチャネル顕微鏡 |
| EP3916393B1 (en) | 2020-05-27 | 2023-01-25 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Method for detection of cells by repetitive staining and destaining |
| US12146188B2 (en) | 2020-06-29 | 2024-11-19 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Method combining single cell gene expression mapping and targeted RNA or c-DNA sequencing using padlock oligonucleotides comprising a barcode region |
| CN116368169A (zh) | 2020-07-16 | 2023-06-30 | 美天施生物科技有限两合公司 | 包含π-共轭的基于1，1′-联萘的聚合物的荧光染料 |
| EP4204809A1 (en) | 2020-08-27 | 2023-07-05 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Releasable reagents for cell separation |
| US20230324399A1 (en) | 2020-09-07 | 2023-10-12 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Conjugates having an enzymmatically releasable detection moiety and a barcode moiety |
| CN114854838A (zh) | 2021-02-04 | 2022-08-05 | 美天施生物科技有限两合公司 | 结合靶向RNA或cDNA体外测序与原位测序的方法 |
| US20230138285A1 (en) | 2021-11-04 | 2023-05-04 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Bright and releasable labels for cell staining based on the conjugates with several sites of fluorophore release |
| US20230228745A1 (en) | 2022-01-17 | 2023-07-20 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Water-soluble ii-conjugated fluorescent 1,1 -binaphthyl-based polymers with tuneable absorption |
| US20230228746A1 (en) | 2022-01-17 | 2023-07-20 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Water-soluble M-conjugated fluorescent 1,1-binaphthyl-based tandem polymers |
| EP4257702A1 (en) | 2022-04-07 | 2023-10-11 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Method combining in situ target capture and spatial unique molecular identifier (sumi) identification with in vitro sequencing for high density spatial multiomics |
| US20230383343A1 (en) | 2022-05-30 | 2023-11-30 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Method Combining In Situ Target Amplification and Spatial Unique Molecular Identifier (SUMI) Identification Using RT-PCR |
| EP4343326B1 (en) | 2022-09-20 | 2025-03-12 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Biological conjugates having an photogenerated acidic or basic releasable detection moiety on top of biological tissues |
| EP4361286A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-01 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Method for determining the spatial localisation of rna strands on a surface |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340565C (en) * | 1989-06-29 | 1999-05-25 | Thomas B. Okarma | Device and process for cell capture and recovery |
| US5256542A (en) * | 1992-03-09 | 1993-10-26 | Tanox Biosystems, Inc. | Selecting low frequency antigen-specific single B lymphocytes with correction for background noise |
| US5275933A (en) * | 1992-09-25 | 1994-01-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Triple gradient process for recovering nucleated fetal cells from maternal blood |
| US5968753A (en) * | 1994-06-14 | 1999-10-19 | Nexell Therapeutics, Inc. | Positive and positive/negative cell selection mediated by peptide release |
| DE19709348C2 (de) * | 1996-05-29 | 1999-07-01 | Schubert Walter Dr Md | Automatisches Multi-Epitop-Ligand-Kartierungsverfahren |
| EP0810428B1 (de) * | 1996-05-29 | 2004-04-28 | Walter Dr. Schubert | Automatisierte Vorrichtung und Verfahren zum Messen und Bestimmen von Molekülen oder Teilen davon |
| CA2269744A1 (en) * | 1996-10-25 | 1998-05-07 | Peter Mose Larsen | Proteome analysis for characterization of up- and down-regulated proteins in biological samples |
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