ES2243141B1 - Unidad de filtracion de celulas ensamblable. - Google Patents
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Abstract
Unidad de filtración de células ensamblable. La unidad comprende: (a) medios de sujeción para ensamblar la unidad al tubo de aspiración del inyector de células; (b) un cuerpo que soporta una malla filtrante y se ensambla al tubo de aspiración del inyector de células; y (c) una malla filtrante con un diámetro de poro menor que el diámetro del orificio de la embocadura. Es útil como accesorio en aparatos de citometría de flujo para evitar problemas de preoclusión/oclusión mediante filtración de muestras en continuo, justo en el momento de la inyección. Además, proporciona una alta estabilidad fluídica y por lo tanto, unas excelentes pureza de la separación y recuperación de la muestra.
Description
Unidad de filtración de células ensamblable.
Esta invención se refiere al campo de la
filtración de muestras de células. En particular, se refiere a
sistemas de filtración de células para su aplicación en
analizadores de células.
La citometría de flujo es una técnica que
permite examinar las propiedades físicas y químicas de las células
vivas, microesferas u otras partículas biológicas cuando pasan en
una corriente fluídica a través de aparatos de medida. El aparato
utilizado, conocido como citómetro de flujo, utiliza la excitación
por láser y la detección de señales para medir parámetros tales
como tamaño, forma, contenido de ADN, receptores de superficie,
actividad enzimática, permeabilidad de membrana y flujo de calcio.
Algunos citómetros de flujo están también equipados para separar y
recoger células o microesferas de interés. Los citómetros de flujo
de alta resolución y los separadores celulares de velocidad
ultrarrápida, tales como los citómetros de flujo modulares, tienen
aplicaciones en investigación del cáncer y del SIDA, descubrimiento
de fármacos, terapia génica y con células madre, genética prenatal,
selección del sexo del ganado y desarrollo de nuevas variedades
agrícolas.
En resumen, la citometría de flujo permite a los
científicos medir múltiples parámetros en células vivas
individuales, identificar células extremadamente minoritarias y
entonces, si se desea, recoger estas células, todo ello a velocidad
muy alta, sin comprometer la viabilidad celular. Además, con los
nuevos avances, los citómetros de flujo son capaces de una
automatización extensa, permitiendo su operación a distancia y a
escala industrial.
La citometría de flujo tradicional tiene sus
raíces en el mundo de la investigación biomédica. Como plataformas
para estudiar las células vivas individuales, los citómetros de
flujo son herramientas valiosas para la investigación de células T,
células B, células madre, células nerviosas, cáncer, virus,
bacterias, levaduras, mitocondrias, presentación de antígenos,
expresión génica y transducción de señales.
Los primeros citómetros de flujo medían las
características de las células por dispensación de células (o
partículas) a través de un tubo capilar fino con un detector
óptico-eléctrico acoplado a un microscopio. Pero
esta técnica tenía el inconveniente de que las células de tamaño
grande o los agregados de células bloqueaban el capilar. Los
intentos de utilizar capilares anchos tienen como resultado efectos
negativos de profundidad de enfoque en el punto de
examen.
examen.
El citómetro de flujo se puede acoplar a un
separador de células. Los modernos separadores de células ofrecen
la separación precisa requerida para aislar poblaciones de células
escasas con elevada pureza y rendimiento. Los separadores de
células de alta velocidad están diseñados para separar hasta 70,000
eventos por segundo, aproximadamente de 5 a 10 veces más rápido que
otros instrumentos existentes. Las células separadas son viables,
la pureza es superior al 99% a cualquier velocidad y el rendimiento
se determina por estadísticas de Poisson. Los separadores de
velocidad ultrarrápida pueden separar 5 x 10^{6} células de un
0.5% de población en 5 horas. Otros instrumentos pueden necesitar
unas 10 horas o más para completar la misma separación.
Para cualquier separador, la
preparación/recolec-
ción de la muestra es vital. Factores como la presencia o la ausencia de suero en la muestra, el medio en el que se recogen las células, el que las células se resuspendan en un medio fresco después de la separación o no, o la temperatura son cruciales. Las características físicas del tipo de células influyen en las condiciones de separación. Los tipos de células de menor o mayor tamaño pueden separarse más eficientemente a través de embocaduras de menor o mayor tamaño. La función de la embocadura es introducir la muestra dentro del fluido acompañante y mantener el flujo laminar a través de la embocadura. Las células frágiles (tales como células dendríticas) o las células en estado vulnerable (incluyendo las células apoptóticas) se pueden separar más satisfactoriamente a través de una embocadura mayor a presiones inferiores del instrumento y a menor velocidad de separación. Las células adherentes pueden requerir una embocadura mayor, así como aditivos al tampón de muestra para reducir los agregados y prevenir las oclusiones de la embocadura. Para acomodar la mayoría de tamaños de partículas se utilizan una serie de embocaduras de 50, 70, 80, 90, 100, 200, 300 y 400 \mum de diámetro.
ción de la muestra es vital. Factores como la presencia o la ausencia de suero en la muestra, el medio en el que se recogen las células, el que las células se resuspendan en un medio fresco después de la separación o no, o la temperatura son cruciales. Las características físicas del tipo de células influyen en las condiciones de separación. Los tipos de células de menor o mayor tamaño pueden separarse más eficientemente a través de embocaduras de menor o mayor tamaño. La función de la embocadura es introducir la muestra dentro del fluido acompañante y mantener el flujo laminar a través de la embocadura. Las células frágiles (tales como células dendríticas) o las células en estado vulnerable (incluyendo las células apoptóticas) se pueden separar más satisfactoriamente a través de una embocadura mayor a presiones inferiores del instrumento y a menor velocidad de separación. Las células adherentes pueden requerir una embocadura mayor, así como aditivos al tampón de muestra para reducir los agregados y prevenir las oclusiones de la embocadura. Para acomodar la mayoría de tamaños de partículas se utilizan una serie de embocaduras de 50, 70, 80, 90, 100, 200, 300 y 400 \mum de diámetro.
Las muestras de células dan una gran cantidad de
agregados, oclusiones, células muertas, etc. Una oclusión que se
produce en la embocadura durante un análisis de rutina no presenta
problemas importantes. Pero una oclusión similar desarrollada
durante una separación en condiciones estériles puede arruinar el
procedimiento de separación, al causar que células no deseadas se
depositen en el tubo de recolección. Una embocadura obturada puede
ser perjudicial, en lo que se refiere al alineamiento óptico. Una
oclusión parcial también puede causar inestabilidad fluídica.
La causa mayor de oclusiones de la embocadura
que se produce durante el curso de una separación es la liberación
de ADN de las células muertas, puesto que el ADN es muy
pegajoso.
Para minimizar la posibilidad de oclusiones en
la embocadura, se requiere filtrar la muestra de células a través
de un filtro de células antes de el/la análisis/separación. US
5.518.612 describe un filtro de células ensamblable útil para
filtrar suspensiones y recoger el filtrado, utilizable en citometría
de flujo.
Frecuentemente, para células pegajosas se
necesita filtrar las muestras de células otra vez justo antes de la
separación debido a que forman agregados cuando se dejan en reposo
durante períodos largos de tiempo. Además, dado que las
aplicaciones de la separación de células pueden necesitar
condiciones estériles, es crucial evitar cualquier contaminación de
la muestra. En estos casos es de importancia máxima evitar
cualquier contacto entre el filtrado y la atmósfera de trabajo.
Otro problema general de la formación de
oclusiones surge cuando la punta de la embocadura se obtura, ya que
es difícil limpiarla con detergentes o lejías. La manera efectiva
que normalmente se utiliza para limpiar oclusiones de la embocadura
incluye desemsamblar la embocadura para sonicarla y romper la
oclusión. Después de esta operación, la dispersión frontal de la luz
("forward scatter", FS), la dispersión lateral ("side
scatter", SS), y la intensidad de fluorescencia no vuelven a ser
exactamente las mismas que las que había en las muestras antes de
la oclusión.
Los inventores han encontrado un sistema que
soluciona varios de los problemas anteriormente mencionados
evitando que las oclusiones alcancen el orificio de la punta de la
embocadura. Así, la presente invención proporciona una unidad de
filtración de células para el tubo de aspiración de un inyector de
células específicamente diseñada para su aplicación en citometría
de flujo, la cual supera los problemas de preoclusión/oclusión
mediante la filtración continua de muestra, justo en el momento de
su inyección. La unidad de filtración de células de la invención
opera sin comprometer la velocidad de flujo del instrumento y la
fluídica. Así, según un aspecto de la presente invención, se
proporciona una unidad de filtración de células (ilustrada en la
Fig. 1) que comprende: (a) medios de sujeción 2 para ensamblar la
unidad de filtración de células al tubo de aspiración 1 del
inyector de células; (b) un cuerpo 3 que soporta una malla filtrante
4 y se ensambla al tubo de aspiración 1 del inyector de células; y
(c) una malla filtrante 4 con un diámetro de poro menor que el
diámetro del orificio de la punta de la embocadura 7.
Preferiblemente, el diámetro del orificio de la punta de la
embocadura 7 está entre 50 y 400 \mum. Más preferiblemente el
diámetro del orificio de la embocadura 7 es 50, 70, 100 o 150
\mum.
La superficie de filtración de la malla
filtrante es proporcional a la sección del tubo de aspiración 1.
Una superficie de la malla filtrante mayor que la sección del tubo
de aspiración 1 facilita la velocidad de flujo y de entrada. También
facilita la filtración de suspensiones sin incrementar la presión
requerida para inyectar la muestra. Preferiblemente, la máxima
presión de carga del sistema de filtración de células de la
presente invención es 1033.5 x10^{3} N/m^{2}, la cual es
compatible con todos los citómetros de flujo y separadores de
células. Preferiblemente, la malla filtrante está hecha de nailon.
Este material proporciona una combinación única de velocidad y baja
adhesión de partículas, para minimizar la pérdida de muestra
durante la inyección. La unidad de filtración de la invención
permite eliminar agregados, partículas y precipitados mayores que
el diámetro de poro de la malla.
El sistema de filtración de células de la
presente invención proporciona un amplio abanico de características
y capacidades que satisfacen los requerimientos más precisos y
exigentes de análisis y separación. La filtración en continuo
usando este sistema proporciona una alta estabilidad fluídica y por
lo tanto, una pureza en la separación y una recuperación de la
muestra excelentes.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí
como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. La
siguiente realización particular se proporciona a modo de
ilustración, y no se pretende que sea limitativa de la presente
invención.
La Fig. 1 muestra un esquema particular de una
unidad de filtración de células de acuerdo con la invención, así
como la embocadura de un citómetro de flujo. Las otras partes del
citómetro de flujo no están dibujadas y meramente se representan
por una línea.
La unidad de filtración de células de la Fig. 1
básicamente comprende medios de sujeción 2, un cuerpo 3 y una malla
filtrante 4. Tal como se ilustra en la Fig. 1 la unidad de
filtración de células se ensambla al tubo de aspiración 1 del
citómetro de flujo mediante los medios de sujeción, los cuales
pueden ser rígidos o elásticos. Preferiblemente, los medios de
sujeción son una abrazadera o un ensamblaje de forma cilíndrica o
levemente cónica. El cuerpo 3 comprende una pared ancha que se
extiende desde una parte superior abierta anular a una parte
inferior en la que se encuentra la malla filtrante 4.
Preferiblemente, el cuerpo tiene forma tubular y es de un plástico,
el cual es impermeable al gas, no-tóxico e inerte
respecto a las muestras de células. La malla filtrante 4 puede ser
de nailon teniendo un diámetro de poro aproximadamente de 30 a 375
\mum dependiendo del diámetro del orificio de la punta de la
embocadura 7. El tubo de aspiración 1 con la unidad de filtración
de células ensamblada se introduce en el tubo 5, el cual contiene
la muestra de células 6 para ser analizada/separada. Las flechas en
la Fig.1 indican el sentido del flujo.
Claims (4)
1. Unidad de filtración de células para el tubo
de aspiración (1) de un inyector de células en un aparato de
citometría de flujo, que comprende:
(a) medios de sujeción (2) para ensamblar la
unidad de filtración de células al tubo de aspiración (1) del
inyector de células;
(b) un cuerpo (3) que soporta una malla
filtrante (4) y se ensambla al tubo de aspiración (1) del inyector
de células; y
(c) una malla filtrante (4) con un diámetro
de
poro menor que el orificio de la punta de la embocadura (7).
poro menor que el orificio de la punta de la embocadura (7).
2. Unidad de filtración de células según la
reivindicación 1, donde el diámetro del orificio de la punta de la
embocadura (7) está entre 50 y 400 \mum.
3. Unidad de filtración de células según la
reivindicación 2, donde el diámetro del orificio de la punta de la
embocadura (7) es 50, 70, 100 ó 150 \mum.
4. Unidad de filtración de células según la
reivindicación 3, donde la malla filtrante (4) está hecha de
nailon.
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20051116 Kind code of ref document: A1 |
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FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2243141B1 Country of ref document: ES |
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FA2A | Application withdrawn |
Effective date: 20070706 |