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ES2243141B1 - Unidad de filtracion de celulas ensamblable. - Google Patents

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ES2243141B1
ES2243141B1 ES200401163A ES200401163A ES2243141B1 ES 2243141 B1 ES2243141 B1 ES 2243141B1 ES 200401163 A ES200401163 A ES 200401163A ES 200401163 A ES200401163 A ES 200401163A ES 2243141 B1 ES2243141 B1 ES 2243141B1
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Spain
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cell
cells
filtration unit
mouth
suction tube
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ES200401163A
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Jordi Petriz Gonzalez
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Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer
Original Assignee
Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer
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Abstract

Unidad de filtración de células ensamblable. La unidad comprende: (a) medios de sujeción para ensamblar la unidad al tubo de aspiración del inyector de células; (b) un cuerpo que soporta una malla filtrante y se ensambla al tubo de aspiración del inyector de células; y (c) una malla filtrante con un diámetro de poro menor que el diámetro del orificio de la embocadura. Es útil como accesorio en aparatos de citometría de flujo para evitar problemas de preoclusión/oclusión mediante filtración de muestras en continuo, justo en el momento de la inyección. Además, proporciona una alta estabilidad fluídica y por lo tanto, unas excelentes pureza de la separación y recuperación de la muestra.

Description

Unidad de filtración de células ensamblable.
Esta invención se refiere al campo de la filtración de muestras de células. En particular, se refiere a sistemas de filtración de células para su aplicación en analizadores de células.
La citometría de flujo es una técnica que permite examinar las propiedades físicas y químicas de las células vivas, microesferas u otras partículas biológicas cuando pasan en una corriente fluídica a través de aparatos de medida. El aparato utilizado, conocido como citómetro de flujo, utiliza la excitación por láser y la detección de señales para medir parámetros tales como tamaño, forma, contenido de ADN, receptores de superficie, actividad enzimática, permeabilidad de membrana y flujo de calcio. Algunos citómetros de flujo están también equipados para separar y recoger células o microesferas de interés. Los citómetros de flujo de alta resolución y los separadores celulares de velocidad ultrarrápida, tales como los citómetros de flujo modulares, tienen aplicaciones en investigación del cáncer y del SIDA, descubrimiento de fármacos, terapia génica y con células madre, genética prenatal, selección del sexo del ganado y desarrollo de nuevas variedades agrícolas.
En resumen, la citometría de flujo permite a los científicos medir múltiples parámetros en células vivas individuales, identificar células extremadamente minoritarias y entonces, si se desea, recoger estas células, todo ello a velocidad muy alta, sin comprometer la viabilidad celular. Además, con los nuevos avances, los citómetros de flujo son capaces de una automatización extensa, permitiendo su operación a distancia y a escala industrial.
La citometría de flujo tradicional tiene sus raíces en el mundo de la investigación biomédica. Como plataformas para estudiar las células vivas individuales, los citómetros de flujo son herramientas valiosas para la investigación de células T, células B, células madre, células nerviosas, cáncer, virus, bacterias, levaduras, mitocondrias, presentación de antígenos, expresión génica y transducción de señales.
Los primeros citómetros de flujo medían las características de las células por dispensación de células (o partículas) a través de un tubo capilar fino con un detector óptico-eléctrico acoplado a un microscopio. Pero esta técnica tenía el inconveniente de que las células de tamaño grande o los agregados de células bloqueaban el capilar. Los intentos de utilizar capilares anchos tienen como resultado efectos negativos de profundidad de enfoque en el punto de
examen.
El citómetro de flujo se puede acoplar a un separador de células. Los modernos separadores de células ofrecen la separación precisa requerida para aislar poblaciones de células escasas con elevada pureza y rendimiento. Los separadores de células de alta velocidad están diseñados para separar hasta 70,000 eventos por segundo, aproximadamente de 5 a 10 veces más rápido que otros instrumentos existentes. Las células separadas son viables, la pureza es superior al 99% a cualquier velocidad y el rendimiento se determina por estadísticas de Poisson. Los separadores de velocidad ultrarrápida pueden separar 5 x 10^{6} células de un 0.5% de población en 5 horas. Otros instrumentos pueden necesitar unas 10 horas o más para completar la misma separación.
Para cualquier separador, la preparación/recolec-
ción de la muestra es vital. Factores como la presencia o la ausencia de suero en la muestra, el medio en el que se recogen las células, el que las células se resuspendan en un medio fresco después de la separación o no, o la temperatura son cruciales. Las características físicas del tipo de células influyen en las condiciones de separación. Los tipos de células de menor o mayor tamaño pueden separarse más eficientemente a través de embocaduras de menor o mayor tamaño. La función de la embocadura es introducir la muestra dentro del fluido acompañante y mantener el flujo laminar a través de la embocadura. Las células frágiles (tales como células dendríticas) o las células en estado vulnerable (incluyendo las células apoptóticas) se pueden separar más satisfactoriamente a través de una embocadura mayor a presiones inferiores del instrumento y a menor velocidad de separación. Las células adherentes pueden requerir una embocadura mayor, así como aditivos al tampón de muestra para reducir los agregados y prevenir las oclusiones de la embocadura. Para acomodar la mayoría de tamaños de partículas se utilizan una serie de embocaduras de 50, 70, 80, 90, 100, 200, 300 y 400 \mum de diámetro.
Las muestras de células dan una gran cantidad de agregados, oclusiones, células muertas, etc. Una oclusión que se produce en la embocadura durante un análisis de rutina no presenta problemas importantes. Pero una oclusión similar desarrollada durante una separación en condiciones estériles puede arruinar el procedimiento de separación, al causar que células no deseadas se depositen en el tubo de recolección. Una embocadura obturada puede ser perjudicial, en lo que se refiere al alineamiento óptico. Una oclusión parcial también puede causar inestabilidad fluídica.
La causa mayor de oclusiones de la embocadura que se produce durante el curso de una separación es la liberación de ADN de las células muertas, puesto que el ADN es muy pegajoso.
Para minimizar la posibilidad de oclusiones en la embocadura, se requiere filtrar la muestra de células a través de un filtro de células antes de el/la análisis/separación. US 5.518.612 describe un filtro de células ensamblable útil para filtrar suspensiones y recoger el filtrado, utilizable en citometría de flujo.
Frecuentemente, para células pegajosas se necesita filtrar las muestras de células otra vez justo antes de la separación debido a que forman agregados cuando se dejan en reposo durante períodos largos de tiempo. Además, dado que las aplicaciones de la separación de células pueden necesitar condiciones estériles, es crucial evitar cualquier contaminación de la muestra. En estos casos es de importancia máxima evitar cualquier contacto entre el filtrado y la atmósfera de trabajo.
Otro problema general de la formación de oclusiones surge cuando la punta de la embocadura se obtura, ya que es difícil limpiarla con detergentes o lejías. La manera efectiva que normalmente se utiliza para limpiar oclusiones de la embocadura incluye desemsamblar la embocadura para sonicarla y romper la oclusión. Después de esta operación, la dispersión frontal de la luz ("forward scatter", FS), la dispersión lateral ("side scatter", SS), y la intensidad de fluorescencia no vuelven a ser exactamente las mismas que las que había en las muestras antes de la oclusión.
Los inventores han encontrado un sistema que soluciona varios de los problemas anteriormente mencionados evitando que las oclusiones alcancen el orificio de la punta de la embocadura. Así, la presente invención proporciona una unidad de filtración de células para el tubo de aspiración de un inyector de células específicamente diseñada para su aplicación en citometría de flujo, la cual supera los problemas de preoclusión/oclusión mediante la filtración continua de muestra, justo en el momento de su inyección. La unidad de filtración de células de la invención opera sin comprometer la velocidad de flujo del instrumento y la fluídica. Así, según un aspecto de la presente invención, se proporciona una unidad de filtración de células (ilustrada en la Fig. 1) que comprende: (a) medios de sujeción 2 para ensamblar la unidad de filtración de células al tubo de aspiración 1 del inyector de células; (b) un cuerpo 3 que soporta una malla filtrante 4 y se ensambla al tubo de aspiración 1 del inyector de células; y (c) una malla filtrante 4 con un diámetro de poro menor que el diámetro del orificio de la punta de la embocadura 7. Preferiblemente, el diámetro del orificio de la punta de la embocadura 7 está entre 50 y 400 \mum. Más preferiblemente el diámetro del orificio de la embocadura 7 es 50, 70, 100 o 150 \mum.
La superficie de filtración de la malla filtrante es proporcional a la sección del tubo de aspiración 1. Una superficie de la malla filtrante mayor que la sección del tubo de aspiración 1 facilita la velocidad de flujo y de entrada. También facilita la filtración de suspensiones sin incrementar la presión requerida para inyectar la muestra. Preferiblemente, la máxima presión de carga del sistema de filtración de células de la presente invención es 1033.5 x10^{3} N/m^{2}, la cual es compatible con todos los citómetros de flujo y separadores de células. Preferiblemente, la malla filtrante está hecha de nailon. Este material proporciona una combinación única de velocidad y baja adhesión de partículas, para minimizar la pérdida de muestra durante la inyección. La unidad de filtración de la invención permite eliminar agregados, partículas y precipitados mayores que el diámetro de poro de la malla.
El sistema de filtración de células de la presente invención proporciona un amplio abanico de características y capacidades que satisfacen los requerimientos más precisos y exigentes de análisis y separación. La filtración en continuo usando este sistema proporciona una alta estabilidad fluídica y por lo tanto, una pureza en la separación y una recuperación de la muestra excelentes.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. La siguiente realización particular se proporciona a modo de ilustración, y no se pretende que sea limitativa de la presente invención.
La Fig. 1 muestra un esquema particular de una unidad de filtración de células de acuerdo con la invención, así como la embocadura de un citómetro de flujo. Las otras partes del citómetro de flujo no están dibujadas y meramente se representan por una línea.
La unidad de filtración de células de la Fig. 1 básicamente comprende medios de sujeción 2, un cuerpo 3 y una malla filtrante 4. Tal como se ilustra en la Fig. 1 la unidad de filtración de células se ensambla al tubo de aspiración 1 del citómetro de flujo mediante los medios de sujeción, los cuales pueden ser rígidos o elásticos. Preferiblemente, los medios de sujeción son una abrazadera o un ensamblaje de forma cilíndrica o levemente cónica. El cuerpo 3 comprende una pared ancha que se extiende desde una parte superior abierta anular a una parte inferior en la que se encuentra la malla filtrante 4. Preferiblemente, el cuerpo tiene forma tubular y es de un plástico, el cual es impermeable al gas, no-tóxico e inerte respecto a las muestras de células. La malla filtrante 4 puede ser de nailon teniendo un diámetro de poro aproximadamente de 30 a 375 \mum dependiendo del diámetro del orificio de la punta de la embocadura 7. El tubo de aspiración 1 con la unidad de filtración de células ensamblada se introduce en el tubo 5, el cual contiene la muestra de células 6 para ser analizada/separada. Las flechas en la Fig.1 indican el sentido del flujo.

Claims (4)

1. Unidad de filtración de células para el tubo de aspiración (1) de un inyector de células en un aparato de citometría de flujo, que comprende:
(a) medios de sujeción (2) para ensamblar la unidad de filtración de células al tubo de aspiración (1) del inyector de células;
(b) un cuerpo (3) que soporta una malla filtrante (4) y se ensambla al tubo de aspiración (1) del inyector de células; y
(c) una malla filtrante (4) con un diámetro de
poro menor que el orificio de la punta de la embocadura (7).
2. Unidad de filtración de células según la reivindicación 1, donde el diámetro del orificio de la punta de la embocadura (7) está entre 50 y 400 \mum.
3. Unidad de filtración de células según la reivindicación 2, donde el diámetro del orificio de la punta de la embocadura (7) es 50, 70, 100 ó 150 \mum.
4. Unidad de filtración de células según la reivindicación 3, donde la malla filtrante (4) está hecha de nailon.
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