ES2241000T3 - Polipeptidos que tienen como objetivo la membrana de envoltura interior de plastidos; su fabricacion y su uso. - Google Patents
Polipeptidos que tienen como objetivo la membrana de envoltura interior de plastidos; su fabricacion y su uso.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE POLIPEPTIDOS CAPAZ DE DIRIGIRSE A LA MEMBRANA ENVOLTORIA INTERIOR PLASTIDA DE UNA PLANTA Y UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS PARA LA MISMA, ASI COMO UN GEN QUIMERICO QUE CONTIENE UN PROMOTOR DE GENES, UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA UN POLIPEPTIDO CAZA DE DIRIGIRSE A LA MEMBRANA ENVOLTORIA INTERIOR PLASTIDA DE UNA PLANTA, O UNA VARIANTE, O DERIVADO U HOMOLOGO DE LA MISMA, UNA SECUENCIA DE CODIFICACION Y UNA SECUENCIA DE TERMINACION. TAMBIEN SE DESCRIBE UN METODO PARA LA TRANSFORMACION DE PLANTAS, TALES COMO PATATAS Y TABACO, MEDIANTE LA UTILIZACION DE LA SECUENCIA OBJETIVO PARA AUMENTAR LA PRODUCCION DE ALMIDON. LA SECUENCIA OBJETIVO SE PUEDE UTILIZAR EN MUCHAS OTRAS APLICACIONES.
Description
Polipéptidos que tienen como objetivo la membrana
de envoltura interior de plástidos; su fabricación y su uso.
La presente invención se refiere a polipéptidos
que tienen como objetivo la membrana de envoltura interior de
plástidos, a la fabricación y al uso de los mismos.
Los plástidos son orgánulos presentes en todas
las plantas excepto algas azul-verdes, bacterias y
hongos. Tienen diversas funciones y formas, pero todos están unidos
por una envoltura de doble membrana. Los plástidos, incluyendo
amiloplastos, cromoplastos, leucoplastos y cloroplastos se derivan
de protoplástidos en las células meristemáticas de plantas. Los
protoplástidos se desarrollan a los diversos tipos de plástidos
dependiendo del tipo de célula, y su localización en la planta. Los
amiloplastos son plástidos que almacenan almidón en semillas,
tubérculos y otros tejidos de almacenamiento; los cromoplastos son
plástidos que contienen carotenoides coloreados brillantemente que
se encuentran en frutos, tales como tomates y naranjas, y en
flores; los leucoplastos son plástidos incoloros que se encuentran
en todas las otras células de plantas y están modificados a menudo
para el almacenamiento de alimento; los cloroplastos contienen los
pigmentos de fotosíntesis y realizan fotosíntesis.
Los cloroplastos son orgánulos complejos
consistentes en seis compartimentos que incluyen las membranas de
envoltura exterior e interior, el espacio intermembranas, el
estroma, la membrana tilacoide y la abertura tilacoide. En
consecuencia, se requiere información no sólo para la fijación de
objetivo de proteínas codificadas nucleares al cloroplasto sino
para escoger la localización intraorganular correcta. La mayoría
de las proteínas de cloroplastos codificadas nucleares se sintetizan
como precursores de mayor peso molecular con una presecuencia
N-terminal (Keegstra et al., 1989). La
presecuencia dirige la proteína a la superficie del cloroplasto en
la que interactúa con un receptor proteináceo de una manera
dependiente de la energía (Cline et al., 1985) y se
transloca seguidamente a través de la membrana de doble envoltura.
Dos métodos, reticulación de precursores al aparato de importación
(Perry y Keegstra, 1994; Wu et al., 1994) y el aislamiento
de complejos de translocación (Waegemann y Soll, 1991; Schnell et
al., 1994) han permitido la identificación de varios de los
componentes de la maquinaria de importación del cloroplasto. La
maduración de proteínas importadas tiene lugar en el estroma y se
cataliza por la peptidasa de tratamiento estromal (SPP; Oblong y
Lamppa, 1992).
Se ha estudiado bien la fijación de objetivo de
proteínas a la membrana tilacoide y a la abertura tilacoide (véase
de Boer y Weisbeek, 1991), pero ha habido pocos estudios de
fijación de objetivo a membrana de envoltura.
Muchos estudios han implicado la membrana de
envoltura exterior y no está claro qué parte de la proteína
proporciona la información de fijación de objetivo (Salomon et
al., 1990; Li et al., 1991; Ko et al., 1992;
Fischer et al., 1994). Sin embargo, un componente de la
envoltura exterior identificado recientemente de la maquinaria de
importación tiene una presecuencia N-terminal
(Hirsch et al., 1994).
También se ha estudiado la fijación de objetivo
de tres proteínas de la membrana de envoltura interior. Éstas
incluyen una proteína de 37 kD de función desconocida
(Dreses-Werringloer et al., 1991), la
proteína Btl de maíz identificada como un translocador de
metabolito de membrana de amiloplasto putativo (Sullivan et
al., 1991) y el translocador de fosfato. El translocador de
fosfato (PT) es la proteína de membrana de envoltura interior de
cloroplasto más abundante (Flügge y Heldt, 1979) y cataliza la
exportación de fotosintato a través de la membrana de envoltura
interior (Fliege et al., 1978). La proteína de PT madura
tiene aproximadamente 36 kD y es muy hidrófoba conteniendo siete
regiones que se extienden por la membrana putativas. Las tres
proteínas de la envoltura interior se sintetizan con presecuencias
N-terminales y su importación por cloroplastos
depende de la energía y es mediada por receptores (Flügge et
al., 1989; Dreses-Werringloer et al.,
1991; Li et al., 1992).
Las proteínas precursoras de PT de espinaca,
guisante, patata y tabaco tienen presecuencias de
72-84 residuos de aminoácidos (Flügge et al.,
1989; Willey et al., 1991; Schulz et al., 1993;
Knight y Gray, 1994), mientras que la presecuencia de la proteína
precursora de 37 kD tiene 21 residuos de aminoácidos
(Dreses-Werringloer et al., 1991). Se indica
que las presecuencias de ambas proteínas contienen aspectos, tales
como un contenido de hidroxil aminoácidos mayor y de arginina menor
así como el potencial de formar una \alpha-hélice
anfifílica, que las distingue de otras proteínas estromales o
tilacoide-objetivadas. Se sugirió que estas
presecuencias inusuales pueden ser responsables de la fijación de
objetivo de membrana de envoltura interior así como fijación de
objetivo de cloroplasto (Willey et al., 1991;
Dreses-Werringloer et al., 1991).
La presente invención ha resultado de la
identificación de residuos requeridos para fijación de objetivo de
envoltura del translocador de fosfato. Se produjo un número de
proteínas quiméricas que comprenden porciones del PT de membrana de
envoltura interior fusionado a la pequeña subunidad estromal de
ribulosa-1,5- bifosfato carboxilasa (SSU Rubisco) y
se determinó la localización de estas proteínas después de su
importación por cloroplastos aislados. Los resultados indican que
la presecuencia de PT contiene sólo información de fijación de
objetivo estromal y que la proteína de PT madura es responsable de
la fijación de objetivo de membrana de envoltura interior. Un
refinamiento adicional de las proteínas quiméricas muestra que la
región hidrófoba N-terminal de la proteína madura
puede dirigir una proteína estromal a la membrana de envoltura
interior, demostrando que la información de fijación de objetivo
está contenida dentro de esta región.
El trabajo descrito aquí demuestra que los
residuos de aminoácidos 24-45 (SEQ ID No. 1) del
tranlocador de fosfato proporcionan información suficiente para
dirigir una proteína a la membrana de envoltura interior.
Las secuencias capaces de fijar como objetivo la
envoltura interior de cloroplasto fijan también como objetivo la
envoltura de otros tipos de plástidos en células respectivas.
Un objeto de la presente invención es fijar como
objetivo la membrana de envoltura interior de plástidos de una
célula de planta.
Un objeto adicional es usar esta tecnología para
mejorar la síntesis y almacenamiento de almidón en plantas. Pueden
alterarse también otros procesos metabólicos en plástidos.
Así, según el método siguiente se proporciona una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende
la secuencia de aminoácidos PALTTGFFFFTWYFLNVIFNIL (SEQ ID No. 1), o
una secuencia de aminoácidos variante de la misma o un derivado de
la misma. La secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1 es del
translocador de fosfato de guisante. También se emplean por la
presente invención homólogos de otras especies, y variantes y
derivados de los mismos. El polipéptido es capaz de fijar como
objetivo una membrana de envoltura interior de plástido de una
célula de planta. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos es
una secuencia purificada.
La secuencia del polipéptido puede comprender uno
o más aminoácidos heterólogos unidos a la secuencia de aminoácidos
mostrada o una variante o derivado de la misma. Puede conservar uno
o más aminoácidos de la molécula de la que se deriva; por ejemplo,
el polipéptido puede comprender uno o más aminoácidos que flanquean
la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1 en el tranlocador de
fosfato de guisante, o un homólogo de otra especie.
Los aminoácidos unidos a la secuencia de fijación
de objetivo de membrana pueden formar un dominio de proteínas.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos forma un dominio
funcional. Los aminoácidos pueden comprender una secuencia derivada
de una proteína de transportador de membrana o translocador, una
enzima, por ejemplo, una enzima implicada en la biosíntesis o el
catabolismo, una proteína o polipéptido implicado en replicación de
ADN o transducción de señal, incluyendo una secuencia implicada en
el control del crecimiento de células y por ello el desarrollo de
la forma y función de la planta.
La envoltura interior de plástido es la principal
barrera de permeabilidad de los plástidos, y puede realizarse por
tanto la fijación de objetivo de proteínas del transportador o
translocador a la envoltura para cambiar la permeabilidad de la
membrana. Esto puede usarse para permitir la absorción en los
plástidos de compuestos que no se tranportarían normalmente o para
aumentar la absorción o emanación de compuestos que se transportan
normalmente pero a velocidades algo lentas. Las proteínas del
transportador (o sus genes) pueden ser de cualquier fuente (animal,
plantas, hongos, bacteriana). Un ejemplo específico es aumentar la
permeabilidad de membranas de amiloplasto de tubérculo de patata a
6-fosfato de glucosa fusionando un gen que codifica
un transportador de fosfato de 6-fosfato de
glucosa, por ejemplo, el codificado por el gen uhpT de
Escherichia coli (Friedrich y Kadner, 1987) a la secuencia de
fijación de objetivo, con el fin de alterar la producción de
almidón.
Se han descrito las proteínas del transportador
que transportan un intervalo enorme de moléculas, incluyendo
azúcares, aminoácidos, iones de metales, etc., y sus genes se han
aislado en muchos casos. La introducción de cualquiera de estos
transportadores en envolturas de plástido puede ser el punto de
partida para cambiar los procesos metabólicos en plástidos. Puede
ser posible conseguir plástidos para producir plásticos y otros
polímeros si pueden transportarse los monómeros a través de la
envoltura al plástido. Una ventaja de usar el cloroplasto es que es
la fuente principal de energía para la planta, y la energía puede
usarse directamente con fines de síntesis.
La envoltura del plástido también es el lugar de
diversas enzimas implicadas en la síntesis de lípidos, carotenoides
y tetrapirroles. Puede fijarse el objetivo de nuevas enzimas unidas
a la membrana a la envoltura para cambiar la capacidad
biosintética. La envoltura también está implicada en la replicación
de ADN en plástidos. Este proceso puede ser manipulable
introduciendo proteínas de bacterias u otros organismos. Se piensa
también que la envoltura de plástido se usa en vías de transducción
de señal que retransmiten información a otras partes de la célula.
Esto puede ser importante para controlar el crecimiento de células
y por ello el desarrollo de la forma y función de la planta.
La secuencia de fijación de objetivo descrita y
reivindicada aquí puede usarse para permitir cambios en los
constituyentes proteínicos de la membrana de envoltura y la
intervención en los procesos que continúan en la envoltura y
plástidos interiores. Puesto que los cloroplastos son la fuente
principal de energía útil en la planta, fijar como objetivo la
envoltura del cloroplasto es la clave para cambiar muchos procesos
en plantas.
También pueden fijarse como objetivos
amiloplastos y otros plástidos.
En principio, puede unirse a la secuencia de
fijación de objetivo cualquier secuencia de aminoácidos, incluyendo
un péptido o polipéptido, un dominio de proteínas o dominios de
proteínas que se pliegan independientemente. Esto puede ser en el
extremo C-terminal o N-terminal del
polipéptido o en ambos extremos, implicando secuencias de proteínas
idénticas, similares o diferentes. "Unión" implica
generalmente el uso de tecnología de ácidos nucleicos recombinantes
para generar un polipéptido de fusión por expresión a partir de
ácido nucleico codificante para él.
Una variante de secuencia de aminoácidos puede
comprender uno o más cambios, por ejemplo, mediante adición,
sustitución, inserción o supresión de uno o más aminoácidos, en
comparación con el tipo natural. Cualquiera de tales cambios no
debe generalmente anular la capacidad del polipéptido para realizar
su función, aunque puede aumentar o disminuir esta capacidad
dependiendo de la naturaleza del cambio. Un derivado tiene alguna
modificación en comparación con el polipéptido de origen natural,
que puede ser química. Ésta puede incluir la incorporación química
o enzimática de estructuras de hidratos de carbono, ácidos
nucleicos u otros compuestos químicos.
Pueden hacerse cambios en la secuencia de
aminoácidos, en comparación con el tipo natural, proporcionando y
manipulando un ácido nucleico codificante adecuado usado para
producir el polipéptido en un sistema de expresión.
La presente invención proporciona además un ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido capaz de fijar como objetivo una membrana de envoltura
interior de plástido como se proporciona aquí.
La secuencia de codificación de nucleótidos
comprende ventajosamente la secuencia SEQ ID No. 2, o una variante,
homólogo o derivado de la misma. Una variación, adición, inserción,
sustitución y/o supresión de secuencia de uno o más nucleótidos
puede o no verse reflejada en una alteración en la secuencia de
aminoácidos codificada, dependiente de la degeneración del código
genético.
El ácido nucleico puede comprender una secuencia
reguladora apropiada enlazada operativamente a la secuencia de
codificación para expresión del polipéptido. Puede decirse que la
expresión a partir de la secuencia de codificación está bajo el
control de la secuencia reguladora.
También se proporciona por la presente invención
un vector que comprende un ácido nucleico capaz de fijar como
objetivo una membrana de envoltura interior de plástido,
particularmente cualquier vector de expresión a partir del cual
pueda expresarse el polipéptido codificado en condiciones
apropiadas, y una célula hospedante que contenga tal vector o ácido
nucleico. Preferiblemente, el vector es adecuado para
transformación en un célula de planta. Preferiblemente, la célula
hospedante es una célula de planta.
Una forma conveniente de producción de un
polipéptido según la presente invención es expresar un ácido
nucleico que lo codifica. Por consiguiente, la presente invención
abarca también un método de fabricación de un polipéptido según la
presente invención, cuyo método comprende la expresión a partir del
ácido nucleico que codifica el polipéptido, in vitro o in
vivo. El ácido nucleico puede ser parte de un vector de
expresión. La expresión puede conseguirse convenientemente
desarrollando una célula hospedante, que contiene el ácido nucleico
apropiado, en condiciones que causan o permiten la expresión del
polipéptido. Los sistemas para clonar y expresar un polipéptido en
una variedad de células hospedantes diferentes son muy conocidos
para el experto en la técnica y no se repetirán aquí.
Un vector que comprende ácido nucleico según la
presente invención no necesita incluir un promotor, particularmente
si el vector ha de usarse para introducir el ácido nucleico en
células para recombinación en el genoma.
Así, un aspecto adicional de la presente
invención proporciona una célula hospedante que contiene ácido
nucleico como se describe aquí. Un aspecto adicional todavía
proporciona un método que comprende introducir tal ácido nucleico
en una célula hospedante. La introducción puede emplear cualquier
técnica disponible conocida por el experto.
El ADN puede transformarse en células de plantas
usando cualquier tecnología adecuada, tal como un vector de plásmido
Ti desactivado llevado por Agrobacterium que explote su capacidad
de transferencia de genes natural (documentos
EP-A-0270355,
EP-A-0116718, Bevan, M.W., Nucleic
Acid Res., 12, 8711-8721, 1984), bombardeo de
partículas o microproyectiles (documento US 5100792), documentos
EP-A-0444882,
EP-A-0434616, microinyección
(documentos WO 92/09696, WO 94/00583, EP 0331083, EP 0175966),
electroporación (documentos EP 0290395, WO 87/06614) u otras formas
de absorción directa de ADN (documentos DE 4005152, WO 90/12096, US
4684611).
En una realización preferida, el ácido nucleico
de la invención se integra en el genoma de una célula hospedante y
una planta regenerada a partir de él.
La elección particular de una tecnología de
transformación vendrá determinada por su eficacia para transformar
ciertas especies de plantas, así como por la experiencia y
preferencia de la persona que practique la invención con una
metodología particular de elección. Será evidente para la persona
experta que la elección particular de un sistema de transformación
para introducir ácido nucleico en células de plantas no es esencial
para, o una limitación, de la invención.
La presente invención proporciona un gen
quimérico según la reivindicación 1.
La secuencia de nucleótidos también puede ser
conocida aquí como secuencia de fijación de objetivo.
Ventajosamente, la secuencia de nucleótidos
comprende la secuencia SEQ ID No. 2, o una variante, homólogo o
derivado de la misma.
\newpage
Según se usa aquí, un gen quimérico es una
molécula de ADN recombinante que comprende secuencias de más de un
organismo.
La presente invención proporciona además un
método para fijar el objetivo de una proteína o polipéptido a la
membrana de envoltura interior de plástido de un plástido de una
planta según la reivindicación 13.
Preferiblemente, la secuencia de codificación del
gen quimérico es una secuencia transportadora requerida para cambiar
una característica de planta particular, con el fin de alterar o
cambiar una característica de planta particular.
Ventajosamente, la secuencia transportadora es la
secuencia de codificación para el translocador de fosfato de hexosa.
La fijación de objetivo del translocador de fosfato de hexosa a la
membrana de envoltura interior de plástido debe dar como resultado
un aumento de la producción de almidón en la planta transformada.
También puede translocarse glucosa de ADP.
Otras secuencias transportadoras adecuadas
podrían ser secuencias para translocadores para compuestos
intermedios en cualquiera de las siguientes: síntesis de almidón,
biosíntesis de pigmentos, biosíntesis de aceites y biosíntesis de
lípidos.
La presente invención proporciona también una
planta transformada que comprende un gen quimérico de la presente
invención. La planta transformada puede ser una especie
dicotiledónea, tal como patata, tabaco, algodón, lechuga, melón,
calabacera, pepino, guisante, colza, soja, remolacha azucarera o
girasol, o una especie monocotiledónea, tal como trigo, cebada,
centeno, arroz o maíz.
También se proporcionan plantas que comprenden
una célula de planta según la invención, junto con cualquier parte o
propágulo de la misma, semilla, progenie de autofecundación o
híbrida y descendientes y clones, y cualquier parte o propágulo de
los mismos.
Con el fin de que la invención pueda entenderse
fácilmente y llevarse a efecto fácilmente, se hará referencia ahora,
a modo de ejemplo, a las Figuras que se acompañan, en las que:
Panel A, pPT-S; panel B,
pS-S. Se muestran representaciones esquemáticas de
proteínas precursoras (parte superior). Caja rayada clara, proteína
madura de SSU; caja blanca, proteína madura de PT; caja oscura,
proteína madura de SSU; caja rayada oscura, presecuencia de SSU. Se
sometieron a electroforesis proteínas (10 \mug) de cada fracción
en geles de SDS-15% de poliacrilamida, fijadas en
ácido trifluoroacético del 5% (p/v) a ebullición durante 5 min, se
incubaron en Amplify (Amersham International) durante 15 min, se
secaron y se expusieron a Hyperfilm-\betamax
(Amersham International). (C) Se cuantificó proteína importada en
sub-fracciones de cloroplasto por exploración de los
fluorógrafos con un densitómetro de exploración láser Molecular
Dynamics 300A. En el diagrama de barras que muestra la
cuantificación de la proteína importada, se aplica lo siguiente:
barra oscura, pPT-S importada; barra blanca,
pS-S importada; P, proteína precursora; I,
productos importados; S, fracción estromal; E, fracción de
envoltura; ET, fracción de envoltuta-tilacoide
mezclada; T, fracción de tilacoide. Este tipo de descripción de los
diagramas de barras en las Figuras que se acompañan se continúa
después.
Panel A, pPT-S; Panel B,
pPT-PT. Se muestran representaciones esquemáticas de
las proteínas precursoras (parte superior). Caja rayada oscura,
presecuencia de SSU; caja blanca, proteína madura de PT; caja
rayada clara, presecuencia de PT; rayas, regiones de extensión de
membrana putativas. (i) Se importaron proteínas precursoras por
cloroplastos de guisante para producir productos importados. (ii) Se
aislaron subfracciones de cloroplasto como se describe en la Figura
1, se sometieron a electroforesis proteínas (10 \mug) de cada
fracción en geles de SDS-15% de poliacrilamida y la
proteína importada se visualizó por autorradiografía. (iii) Se
visualizó proeína de PT endógena en subfracciones de cloroplasto
por inmunomanchas con anticuerpos contra la proteína E30 de
espinaca. (iv) Se cuantificó la proteína importada y la proteína de
PT endógena en subfracciones de cloroplasto por exploración (ii) y
(iii) como se describe en la Figura 1. En los diagramas de barras:
barras oscuras, proteína importada; barras blancas, PT endógeno; P,
proteína precursora; I, productos de importación; S, fracción
estromal; E, fracción de envoltura; ET, fracción de
envoltura-tilacoide mezclada; T, fracción de
tilacoide.
Panel A, pPTMS1-S; panel B,
pPTMS1+2-S; panel C,
pS-PTMS1-S; panel D,
pS-PTMS1+2-S. Se muestran
representaciones esquemáticas de las proteínas precursoras (parte
superior). Caja rayada clara, presecuencia de PT; caja blanca,
proteína madura de PT; caja oscura, proteína madura de SSU; caja
rayada oscura, presecuencia de SSU; rayas, regiones de extensión de
membrana putativas. (i), (ii), (iii) y (iv) son idénticos a los
descritos en la Figura 2. En los diagramas de barras: barras
oscuras, proteína importada; barras claras, PT endógeno; P,
proteína precursora; I, productos de importación; S, fracción
estromal; E, fracción de envoltura; ET, fracción de
envoltura-tilacoide mezclada; T, fracción de
tilacoide.
Panel A, pS-+MS-S; panel B,
pS-MS+-S; panel C,
pS-MS-S. Se muestran
representaciones esquemáticas de las proteínas precursoras (parte
superior). Caja rayada oscura, presecuencia de SSU; caja oscura,
proteína madura de SSU; caja clara, proteína madura de PT; raya,
extensión de membrana (MS) putativa; letras, secuencia de
aminoácidos; + y -, cargas de residuos de aminoácidos. (i), (ii),
(iii) y (iv) son idénticos a los descritos en la Figura 2 excepto
que se muestra en B(ii) y B(iii) electroforesis de 30
\mug de proteína estromal. En el diagrama de barras: barras
oscuras, proteína importada; barras claras, PT endógeno; P,
proteína precursora; I, productos de importación; S, fracción
estromal; E, fracción de envoltura; ET, fracción de
envoltura-tilacoide mezclada; T, fracción de
tilacoide; Sx3, carga de 3 pliegues de fracción estromal.
Panel A, pPT-PT; panel B,
pS-PT; panel C,
pS-PTMS1-S; panel D,
pS-+MS-S; panel E, pS-MS+-S; panel
F, pS-MS-S. Se importaron proteínas
precursoras por cloroplastos de guisante y se aisló una fracción de
envoltura total como se describe en la Figura 1. Se sometió a
electroforesis un volumen igual de envolturas (C) y envolturas
lavadas con NaOH 0,1 M (W) en geles de SDS-15% de
poliacrilamida y las proteínas importadas se visualizaron por
autorradiografía.
Panel A, pPT-PT; panel B,
pS-PT; panel C,
pS-PTMS1-S; panel D,
pS-+MS-S; panel E, pS-MS+-S; panel
F, pS-MS-S. Se importaron proteínas
precursoras, se lisaron hipertónicamente cloroplastos y se aislaron
subfracciones de cloroplasto por centrifugación con gradiente de
densidad de sacarosa como se describe en Métodos. Se sometió a
electroforesis proteína (10 \mug) de cada fracción en geles de
SDS-15% de poliacrilamida, se visualizó la proteína
importada por autorradiografía (i) y proteína de PT endógena por
detección inmune (ii) como se describe en la Figura 2. En el
diagrama de barras: I, productos de importación; S, fracción
estromal; OE; fracción de envoltura exterior; IE, fracción de
envoltura interior; T, fracción de tilacoide.
Se compraron compuestos radioquímicos de Amersham
International (Amersham, R.U.) y se obtuvieron enzimas para técnicas
de ADN recombinante de Amersham International o de Boehringer
Mannheim R.U. (Lewes, R.U.). Se sintetizaron oligonucleótidos en las
instalaciones del Cambridge Centre for Molecular Recognition. Se
germinaron y desarrollaron semillas de guisante (Pisum
sativum var. Feltham First) como se describe por Knight y Gray
(1994).
El plásmido pPPT8 es un derivado de pSP64
(Promega, Madison, WI, EE.UU.) con el cADN de PT de guisante clonado
en el lugar de restricción de EcoRI en orientación de sentido con
respecto al promotor de SP6 (Willey et al., 1991). Para
producir la construcción pSPT-S, se clonó en pUBR
digerido con EcoRI-PstI un fragmento de restricción
de EcoRI-PstI de 260 pb de pPPT8 que codifica la
presecuencia de PT del residuo de 73 aminoácidos y residuos de 4
aminoácidos de la proteína madura de PT. Este último (pUBR) se
produjo clonando un fragmento de restricción de
BamHI-PstI de 690 pb de pSMS58 (Anderson y Smith,
1986) que codifica la proteína madura de SSU Rubisco en pUBS
digerido de modo similar (lugar de clonación múltiple de Bluescript
KS+ en pUC18). Para producir la construcción pPT-S,
se cortaron de pPPT8 un fragmento de restricción de
HindIII-PstI de 260 pb que codifica la presecuencia
de PT y los primeros residuos de 2 aminoácidos de la proteína
madura de PT y se sustituyeron con un fragmento de restricción de
HindIII-PstI de 210 pb de pSPTP19 (Anderson y Smith,
1986) que codifica la presecuencia de SSU Rubico de un residuo de
57 aminoácidos.
Para producir la construcción
pPTMS1-S, se usó la reacción en cadena de polimerasa
(PCR) para introducir un lugar de restricción de SphI enmarcado a
401 pb del extremo 5' del cADN de PT de guisante. El cebador de
sentido era equivalente al cebador de determinación de secuencia de
SP6 (Boehringer Mannheim) y el cebador antisentido era el
oligonucleótido 5'-CGC GGC ATG CAG ATC TTC
TTG TTG AGG AT-3'. La porción subrayada del cebador
representa el lugar de restricción usado para clonar. La reacción
contenía 10 ng de ADN de plantilla (pPPT8), 1 \muM de cada
cebador, 200 \muM cada uno de dATP, TTP, dCTP, dGTP (Pharmacia
Biosystems Ltd., Milton Keynes, R.U.), 1x de tampón de Taq
polimerasa y 2 unidades de Taq polimerasa AmpliTaq
(Perkin-Elmer Cetus, Beaconsfield, R.U.). La
reacción fue a 95ºC durante 2 min, a 32ºC durante 1 min y a 72ºC
durante 3 min, durante 2 tandas, seguidas por 10 tandas a 95ºC
durante 2 min, a 42ºC durante 1 min y a 72ºC durante 3 min. El
producto de 500 pb que codifica la presecuencia de PT y los
primeros residuos de 49 aminoácidos de la proteína madura de PT se
digirieron con SphI y EcoRI y se clonaron en pUBR digerido con
SphI-EcoRI. Un fragmento de restricción de
BamHI-EcoRI de 1,1 kpb de esta construcción, que
codifica pPTMS1-S, se clonó después en pSP65
digerido con BamHI-EcoRI (Promega). La construcción
pPTMS1+2-S se produjo usando PCR para introducir un
lugar de restricción de SphI enmarcado a 533 pb del extremo 5' del
cADN de PT de guisante. Se usaron las mismas condiciones de PCR que
las de la producción de pPTMS1-S, excepto que el
cebador antisentido fue el oligonucleótido 5'-CGC
GGC ATG CTC AGC AAC TTC AGC AGG TT-3'. La porción
subrayada del cebador representa el lugar de restricción usado para
clonar. El producto de 632 pb que codifica la presecuencia de PT y
los primeros residuos de 93 aminoácidos de la proteína de PT madura
se digirieron con SphI y EcoRI y se clonaron en pUBR digerido con
SphI-EcoRI. Un fragmento de restricción de
BamHI-EcoRI de 1,2 kpb de esta construcción, que
codifica pPTMS1+2-S, se clonó después en pSP65
digerido con BamHI-EcoRI.
Para producir la construcción
pS-PTMS1-S, un fragmento de
restricción de PstI-BamHI de 830 pb de la
construcción pPTMS1-S que codifica los residuos de
aminoácidos 3 a 49 de la proteína madura de PT incorporado enmarcado
a la proteína madura de SSU Rubisco del residuo de 123 aminoácidos
se clonó en pSPTP19 digerido con PstI-BamHI. La
construcción pS-PTMS1+2-S se produjo
digiriendo la construcción pPTMS1+2-S con PstI y
BamHI para liberar un fragmento de restricción de 958 pb, que
codifica los residuos de aminoácidos 3 a 93 de la proteína de PT
madura incorporada enmarcada a la proteína madura de SSU Rubisco,
que se clonó en pSPTP19 digerido con PstI-
BamHI.
BamHI.
Para producir la construcción
pS-+MS-S, se usó PCR para introducir un lugar de
restricción de SphI enmarcado a 271 pb y un lugar de restricción de
PstI enmarcado a 388 pb del extremo 5' del cADN de PT de guisante.
El cebador de sentido fue el oligonucleótido 5'-GCG
CGC ATG CCC GAT TCC GCT GGT GAA G-3' y el
cebador antisentido fue el oligonucleótido 5'-GCC
GCT GCA GCG AGG ATG TTG AAA ATC AC-3'. Las
porciones subrayadas de los cebadores representan los lugares de
restricción usados para clonar. La reacción contenía 10 ng de ADN de
plantilla (pPPT8), 1 \muM de cada cebador, 200 \muM cada uno de
dATP, TTP, dGTP, dCTP, 1x de tampón de polimerasa de pfu
(Stratagene, La Jolla, CA) y 0,025 unidades/\mul de polimerasa de
ADN de pfu clonada (Stratagene). La reacción fue a 95ºC durante 1
min, a 30ºC durante 1 min y a 72ºC durante 5 min, seguido por 17
tandas a 95ºC durante 1 min, a 60ºC durante 1 min y a 72ºC durante 5
min. El producto de 137 pb que codifica los residuos de aminoácidos
7 a 45 de la proteína de PT madura se digirió con SphI y PstI y se
clonó en pSPTP19 digerido con SphI-PstI para
producir pS-+MS.
Para producir la construcción
pS-MS+-S, se usó PCR para introducir los lugares de
SphI enmarcados a 323 pb y 401 pb del extremo 5' del cADN de PT de
guisante. El cebador de sentido fue el oligonucleótido
5'-GCG CGC ATG CCA GCT CTT ACT
ACC-3' y el cebador antisentido fue el
oligonucleótido 5'-CGC GGC ATG CAG ATC TTC
TTG TTG AGG AT-3'. Las porción subrayada de los
cebadores representa el lugar de restricción usado para clonar. Las
condiciones de reacción fueron idénticas a las usadas para producir
pS-+MS-S. El producto de PCR de 98 pb que codifica
los residuos de aminoácidos 24 a 49 de la proteína de PT madura se
digirió con SphI y se clonó en pSS19 digerido con SphI para producir
pS-MS+-S. El pSS19 tiene un lugar de restricción de
SphI único entre las regiones que codifican la presecuencia de SSU
Rubisco y la proteína madura, y se hizo clonando un fragmento de
SphI-BamHI de 690 pb de
pS-PTMS1-S en pSPTP19 digerido con
SphI-BamHI.
Para producir la construcción
pS-MS-S, se usó PCR para introducir
un lugar de restricción de SphI enmarcado a 323 pb y un lugar de
PstI enmarcado a 388 pb del extremo 5' del cADN de PT de guisante.
El cebador de sentido fue el oligonucleótido 5'-GCG
GGC ATG CCA GCT CTT ACT ACC-3' y el cebador
antisentido fue el oligonucleótido 5'-GCC GCT GCA
GGC GAG GAT GTT GAA AAT CAC-3'. La porción
subrayada de los cebadores representa los lugares de restricción
usados para clonar. Las condiciones de reacción fueron idénticas a
las usadas para producir pS-+MS-S. El producto de
PCR de 87 pb que codifica los residuos de aminoácidos 24 a 45 de la
proteína de PT madura se digirió con SphI y PstI y se clonó en
pSPTP19 digerido con SphI-PstI para producir
pS-MS. Un fragmento de PstI-BamHI de
690 pb de pSMS58 que codifica la proteína madura de SSU Rubisco se
clonó en el pS-MS digerido con
PstI-BamHI para producir
pS-MS-S.
Se sintetizaron precursores de proteínas
quiméricas por transcripción usando polimerasa de
SP6-ARN seguida por traducción en un sistema de
germen de trigo en presencia de [35S]metionina. Una reacción
típica contenía 8 \mug de ADN plásmido, 50 unidades de polimerasa
de SP6 (Epicentre Technologies, Madison, WI), 0,5x sales de
transcripción (Promega), 80 \mug/ml de albúmina de suero de
bovino, ditiotreitol 8 mM, 40 \muM cada uno de ATP, CTP, UTP y GTP
8 \muM, 2 unidades de RNasin (Boehringer Mannheim), Cap 45 \muM
(m7G(5')ppp(5')G, Boehringer Mannhim) en un volumen
de 22 \mul durante 30 min a 42ºC. Se añadió GTP adicional (40
\muM) y se incubó la reacción a 42ºC durante 30 min más. Se
tradujeron típicamente 20 \mul de la reacción de transcripción en
un sistema de germen de trigo (Amersham International) que contenía
20,7 \mul de extracto de germen de trigo, acetato potásico 83 mM,
50 \muM cada uno de aminoácido (menos metionina) y 60 \muCi
(1.000 Ci/mmol) de [35S]metionina en un volumen de 110
\mul a 25ºC durante 30 min.
Se prepararon cloroplastos de guisante intactos
como se describe por Madueño et al., 1992). Se realizaron
reacciones de importación rutinariamente a 25ºC durante 30 min
(Madueño et al., 1992) y cloroplastos de guisante intactos
contenidos equivalentes a 200 \mug de clorofila, 109 \mul de la
reacción de traducción, metionina 1 mM y ATP 5 mM en un volumen
final de 600 \mul de tampón de importación (Hepes 50
mM-KOH pH 8,0, sorbitol 330 mM). Al final de la
incubación, se añadió termolisina a razón de 100 \mug/ml y se
incubó en hielo durante 30 min. Se reaislaron cloroplastos intactos
(Madueño et al., 1992) y 5 \mug de clorofila se sometieron
a electroforesis en un gel de SDS-15% de
poliacrilamida (Laemmli, 1970).
Para aislar las membranas de envoltura total, se
trató la reacción de importación (véase antes, 200 \mug de
clorofila/600 \mul de reacción) con termolisina (100 \mug/ml)
tras lo que se reaislaron cloroplastos intactos, se lavaron una vez
en sacarosa 0,8 M en tampón de lisis (Tricina 10
mM-NaOH pH 7,6, EDTA 2 mM) y se resuspendieron
finalmente a razón de 8 mg de clorofila/ml en sacarosa 0,8 M en
tampón de lisis. Se añadieron cloroplastos adicionales (100 \mug
de clorofila) a los cloroplastos marcados y se lisaron los
cloroplastos diluyendo hasta 0,3 mg de clorofila/ml con tampón de
lisis. Se fraccionaron cloroplastos (1,15 ml) por centrifugación
(rotor Beckman SW40, 75.000 x g, 60 min, 4ºC) mediante el gradiente
de etapas de sacarosa discontinuo descrito por Douce et al.
(1973), excepto que todas las soluciones de sacarosa fueron en
tampón de lisis. Se recogieron cuatro fracciones. El estroma estaba
en los 1,15 ml superiores del gradiente, las envolturas en la
interfase de sacarosa 0,6 M/o,93 M, tilacoides mezclados en la
interfase de sacarosa 0,93 M/1,2 M y los tilacoides en la interfase
de sacarosa 1,2 M/1,5 M. Las membranas se diluyeron con tampón de
lisis, se globulizaron por centrifugación (100.000 x g, rotor
Beckman SW40, 60 min, 4ºC) y se resuspendieron en sacarosa 0,3 M en
tampón de lisis.
Cuando las envolturas se trataron con álcali, la
fracción de membrana de envoltura total aislada se resuspendió en
50 \mul de tampón de lisis. La mitad de las membranas se
globulizó a 2,11 kg/cm^{2} durante 15 min en una Beckman Airfuge,
se resuspendió en NaOH 0,1 M (100 \mul), se incubó en hielo
durante 30 min, se globulizaron las membranas, se lavaron una vez
en tampón de lisis y se resuspendieron finalmente en tampón de
lisis (25 \mul).
Para separar las membranas de envoltura interior
y exterior, la reacción de importación contenía 100 \mug de
clorofila y los mismos constituyentes de antes en un volumen total
de 600 \mul. Después del tratamiento con termolisina (100
\mug/ml, 30 min, 4ºC), se reaislaron cloroplastos intactos, se
lavaron una vez con tampón de importación y se resuspendieron a
razón de 1 mg de clorofila/ml en sacarosa 0,6 M en tampón de lisis.
Se lisaron cloroplastos por un procedimiento de
congelación-descongelación (Keegstra y Yousif, 1986)
y se añadieron cloroplastos no radiomarcados (400 \mug de
clorofila) lisados de modo similar. Se diluyeron cloroplastos hasta
sacarosa 0,3 M y 0,5 mg de clorofila/ml con tampón de lisis y se
estratificaron 0,95 ml en un gradiente de etapas de sacarosa
discontinuo (Keegstra y Yousif, 1986). El gradiente se centrifugó
en un rotor Beckman SW40 a 75.000 x g durante 3 h a 4ºC y se
recogieron cuatro fracciones. El estroma estaba en los 0,95 ml
superiores del gradiente, las envolturas exteriores en la interfase
de sacarosa 0,46 M/0,8 M, las membranas interiores en la interfase
de sacarosa 0,8 M/1,0 M y los tilacoides en la interfase de sacarosa
1,0 M/1,5 M. Las membranas se diluyeron con tampón de lisis, se
globulizaron por centrifugación (100.000 x g, rotor Beckman SW40,
90 min, 4ºC) y se resuspendieron como antes.
Se estimó la proteína por un procedimiento de
Lowry modificado (Peterson, 1977) y se sometieron a electroforesis
10 \mug de proteína en geles de SDS-15% de
poliacrilamida (Laemmli, 1970). Se transfirieron las proteínas
(Towbin et al., 1979) a nitrocelulosa (Schleicher y Schuell)
y se detectaron proteínas radiomarcadas por exposición a
Hyperfilm-Bmax (Amersham International). Los mismos
filtros se sondaron con anticuerpos para la proteína de membrana de
envoltura interior de espinaca de 30 kD (E30; Joyard et al.,
1982). Se detectaron anticuerpos unidos usando el sistema ECL según
las instrucciones del fabricante (Amersham International). La
cantidad de proteína importada y PT endógeno (E30) se cuantificó por
autorradiografías de exploración con un densitómetro de exploración
láser Molecular Dynamics 300 A.
Para determinar si la presecuencia del
translocador de fosfato contiene información para fijar el objetivo
de la proteína madura a la envoltura del cloroplasto, se produjo la
proteína quimérica pPT-S (representada
esquemáticamente en la Figura 1A). Esta proteína comprende la
presecuencia del residuo de 73 aminoácidos y los primeros residuos
de 4 aminoácidos de la proteína de PT madura fusionados a la pequeña
subunidad situada estromalmente de ribulosa-1,
5-bifosfato carboxilasa. Se produjo una proteína
precursora (P) de aproximadamente 25 kD en un sistema de traducción
de germen de trigo cebado con el transcripto de
pPT-S (Figura 1, pista P). Las proteína precursora
se importó mediante cloroplastos de guisante aislados y se elaboró
a una proteína de aproximadamente 15 kD (Figura 1A, pista I). Estos
tamaños están en estrecha concordancia con los calculados para el
precursor (23 kD) y la proteína madura (15 kD), si se usó el lugar
de división de PT
(P-C-P-A),
conservado durante la producción de esta construcción. La eficacia
de la importación de pPT-S con relación a SSU
Rubisco (pS-S) se muestra en la Tabla 1. La
sustitución de la presecuencia de SSU Rubisco auténtica por la del
PT sólo redujo marginalmente la eficacia de la importación de
pS-S. La importación de pPT-S fue
83% de pS-S (Tabla 1).
Se lisaron hipotónicamente cloroplastos y se
aislaron el estroma (S), una fracción de envoltura total (E), una
fracción de envoltura-tilacoide mezclada (ET) y una
fracción de membrana de tilacoide (T) en un gradiente de sacarosa
discontinuo (Figura 1A). Como testigo, se realizó un
fraccionamiento idéntico después de importar el precursor de la SSU
Rubisco (pS-S, Figura 1B). La distribución de la
pPT-S importada era idéntica a pS-S
(Figura 1C). La cuantificación de proteína importada en la Figura 1C
se representa como densidad (cantidad de proteína importada) en
cada fracción y da tal cual una indicación del enriquecimiento en
una fracción particular. También se muestran cuantificaciones
subsiguientes sobre esta base (Figuras 2-4). La
mayoría de las pPT-S y pS-S
importadas estaba en la fracción estromal pero también estaban
presentes niveles bajos en las fracciones de envoltura y
envoltura-tilacoide. Esto es debido probablemente a
la captura de estroma durante la lisis de cloroplasto y vesiculación
de membrana. El lavado de membranas no separó esta contaminación
(véase leyenda en la Figura 1). Estos datos sugieren que la
presecuencia de PT contiene información de fijación de objetivo
estromal y que el translocador de fosfato maduro es responsable de
la fijación de objetivo de envoltura-membrana.
Si la proteína de PT madura contiene información
de fijación de objetivo de la envoltura, la sustitución de la
presecuencia de PT por la de la SSU Rubisco no haría diferencia en
la localización de la proteína importada. Para ensayar esta
hipótesis, se produjo la proteína quimérica pS-PT
(mostrada esquemáticamente en la Figura 2A). Esta proteína
comprende la presecuencia de SSU Rubisco del residuo de 57
aminoácidos fusionada a los residuos de aminoácidos 3 a 330 de la
proteína de PT madura. La traducción del transcripto de
pS-PT produjo una proteína precursora de 36 kD
(Figura 2A(i), pista P) que se elaboró a una proteína de
aproximadamente 32 kD tras importación por cloroplastos de guisante
(Figura 2A(i), pista I). Esta proteína migra más rápido de lo
esperado; sin embargo, la proteína de PT de guisante madura normal
migra también anómalamente (32 kD; Figura 2B(i), pista I) en
comparación con el tamaño esperado de 36 kD (Willey et al.,
1991), en este sistema de gel.
Para determinar la localización de la proteína
quimérica importada, se fraccionaron cloroplastos y se aislaron
(Figura 2A(ii)) el estroma (S), las envolturas (E),
envolturas-tilacoides mezclados (ET) y membranas de
tilacoides (T). Como testigo, se realizó un procedimiento de
fraccionamiento idéntico en cloroplastos después de importar la
proteína precursora de PT (pPT-PT, Figura
2B(ii)). Se encontró proteína en las fracciones E y ET con un
poco en T y nada en S. La distribución de pS-PT era
idéntica a la de pPT-PT importada y la proteína de
PT endógena (Figura 2A), lo que sugiere fuertemente que la proteína
de pT madura contiene información de fijación de objetivo de la
envoltura. La sustitución de la presecuencia de PT por la de la SSU
Rubisco tenía un efecto significativo sobre la eficacia de la
importación de la proteína precursora quimérica. La importación de
pS-PT fue el 25% de la proteína de translocador de
fosfato auténtica (Tabla 1). Esto sugiere que la presecuencia,
aunque no parezca afectar a la fijación de objetivo (véase Figura
2), afecta a la eficacia del proceso de importación.
Se valoró la proteína de PT endógena por
electroforesis de fracciones en SDS- PAGE, manchado a nitrocelulosa
y sometiéndose el mismo filtro a autorradiografía para detectar
proteína importada y sondándose con anticuerpos elevados contra la
proteína de PT de espinaca (E30; Joyard et al., 1982). El PT
importado comigraba con la banda superior (32 kD) del doblete de la
proteína de PT endógena en la Figura 2B(iii). Una
cuantificación de esto y proteína importada se muestra en la Figura
2B(iv). Se juzgó necesaria la valoración de la proteína de
PT endógena porque se encontró una gran proporción (aproximadamente
el 85%) de la proteína de PT importada en la fracción de membrana
de tilacoide. Esto no es debido a equivocar el objetivo de la
proteína de PT durante la importación, sino a la contaminación de
la fracción de tilacoide con membranas de envoltura. Se ha
encontrado un nivel similar de contaminación por otros
investigadores (Murakami y Strotmann, 1978); Andrews et al.,
1985, Li et al., 1992) y se confirmó por una valoración de
la distribución del marcador de membrana de envoltura galactosil
transferasa (Douce y Joyard, 1979) que mostró una distribución
idéntica a la de las proteínas de PT endógena e importada (datos no
mostrados). La proteína de PT endógena, determinada sondando con
anticuerpos de E30, se usó a continuación como patrón interno en
experimentos de importación de construcciones quiméricas.
Para definir qué región de la proteína de PT
madura contiene información de fijación de objetivo de envoltura, se
produjeron cuatro proteínas quiméricas que contenían la región
N-terminal del PT. Las primeras dos proteínas
contenían la presecuencia de PT y la primera o la primera y la
segunda regiones de extensión de membrana putativas
N-terminales de la proteína de PT madura fusionadas
a la proteína madura de SSU Rubisco. La proteína quimérica
pPTMS1-S contiene la presecuencia y los residuos 1
a 49 del PT maduro (Figura 3A), mientras que
pPTMS1+2-S contiene la presecuencia y los residuos 1
a 93 de la proteína de PT madura (Figura 3B). En el segundo grupo
de construcciones, la primera o la primera y la segunda extensiones
de membrana N-terminales de la proteína de PT madura
se pusieron entre la presecuencia de SSU Rubisco y la proteína
madura para producir pS-PTMS1-S
(residuos de aminoácidos 3-49, Figura 3C) o
pS-PTMS1+2-S (residuos de
aminoácidos 393, Figura 3D). La traducción de los transcriptos en
un sistema de germen de trigo produjo proteínas precursoras de 28
kD para pPTMS1-S, 33 kD para
pPTMS1+2-S, 26 kD para
pS-PTMS1-S y 31 kD para
pS-PTMS1+2-S (Figura
3A(i)-D(i), pista P). Éstas están
todas próximas a sus tamaños esperados; 20 kD para
pPTMS1-S y
pS-PTMS1-S (Figura 3A(i) y
3C(i), pista I) y 25 kD para pPTMS1+2-S y
pS-PTMS1+2-S (Figura 3B(i) y
3D(i), Pista I). Nuevamente, la eficacia de importación de
estas proteínas quiméricas pareció reducirse cuando se sustituyó la
presecuencia de PT auténtica por la de SSU Rubisco. La importación
de pPTMS1-S y pPTMS1+2-S era
equivalente a pPT-PT, mientras que la importación
de pS-PTMS1-S y
pS-PTMS1+2-S era el 38% del nivel de
PT (Tabla 1).
Se aislaron subfracciones de cloroplasto después
de importar estas proteínas quiméricas para determinar si había
tenido lugar fijación de objetivo de la envoltura. La distribución
de proteína importada (Figura
3A(ii)-3D(ii)) y proteína de PT
endógena (Figura 3A(iii)-3D(iii))
dentro de las subfracciones de cloroplasto indicó que las cuatro
proteínas importadas estaban asociadas con la membrana de envoltura
del cloroplasto (Figuras
3A(iv)-3D(iv)). Estos resultados
confirman el hallazgo previo de los inventores de que no se requiere
la presecuencia de PT para fijación de objetivo de envoltura y
muestran, lo que es más importante, que la región
N-terminal de la proteína de translocador de
fosfato madura (residuos de aminoácidos 3-49) puede
dirigir una proteína de objetivo fijado estromalmente de manera
normal a la envoltura de cloroplasto.
La región N-terminal de la
proteína de translocador de fosfato madura, capaz de causar la
asociación de la SSU Rubisco con la membrana de envoltura de
cloroplasto, comprende una región de extensión de membrana
\alpha-helicoidal potencial (residuos de
aminoácidos 24-45) flanqueada por regiones
hidrófilas. La región hidrófila N-terminal a la
\alpha-hélice contiene 3 residuos de aminoácidos
cargados negativamente (Asp7, Glu11, Glu12) y 2 cargados
positivamente (Lys13, Arg22), mientras que están situados 2 residuos
cargados positivamente (Lys47, Lys48) C-terminales a
la extensión de membrana putativa. Para definir adicionalmente las
regiones implicadas en fijación de objetivo a la membrana de
envoltura, se produjeron proteínas quiméricas que contenían
diferentes regiones de la proteína de PT situadas entre la
presecuencia y regiones maduras de la SSU. El precursor de la
proteína quimérica, pS-+MS-S, que contiene los
residuos de aminoácidos del 7 al 45 del PT maduro, que incluye la
extensión de membrana putativa y los 16 residuos de aminoácidos
hidrófilos N-terminales a ella, tenía una masa
molecular de 27 kD (Figura 4A(i), pista P). Este precursor
se importó por cloroplastos de guisante aislados y se elaboró a un
producto principal de 20 kD y un producto secundario de 14 kD
(Figura 4A(i), pista I). El precursor y el producto
elaborado principal eran próximos a sus tamaños pronosticados de 25
kD y 19 kD respectivamente. La importación de esta proteína
quimérica era el 13% de la proteína de PT auténtica (Tabla 1).
Después de importar la proteína de 20 kD, se asoció con la fracción
de envoltura que tiene una distribución próxima a la de la proteína
de pT endógena valorada por manchas de Western (Figura
4A(ii)-(iv)). Esto sugiere que no se requería la región
hidrófila C- terminal a la región de extensión de membrana hidrófoba
para fijar el objetivo a la membrana de envoltura interior, pero
puede tener efecto en la eficacia de este procedimiento.
La proteína quimérica precursora,
pS-MS+-S, que contiene los residuos de aminoácidos
24 a 49, que incluye la región de extensión de membrana putativa y
los residuos de 4 aminoácidos C-terminales a ella,
tenía una masa molecular de aproximadamente 25 kD (Figura
4B(i), pista P). Esto es próximo al tamaño pronosticado de
24 kD. Se importó el precursor, aunque algo ineficazmente (16% del
nivel de pPT-PT; Tabla 1), por cloroplastos de
guisante aislados (Figura 4B(i), pista I), para producir un
cierto número de productos de tamaño variable desde el precursor (25
kD) hasta aproximadamente 19 kD. Éste último es próximo al tamaño
pronosticado de la proteína madura. Cuando se fraccionaron
cloroplastos después de importar pS-MS+-S, el
precursor (25 kD) y proteínas de aproximadamente 21 kD y 20 kD se
asociaron con las membranas de envoltura (Figura 4B(ii)
& (iii)), mientras que se encontró en la fracción estromal un
grupo de proteínas de aproximadamente 23 kD y una proteína de 19 kD.
Estas proteínas pueden verse más claramente con una carga mayor de
la fracción estromal (Figura 4B(ii), pista Sx3). Estos datos
sugieren que, después de importar esta proteína quimérica, el
subgrupo de productos elaborados asociados con la membrana de
envoltura es diferente claramente de los encontrados en la fracción
estromal. Se mostró seguidamente que este subgrupo no estaba
integrado en la membrana de envoltura (véase Figura 5).
El precursor de la proteína quimérica,
pS-MS-S, que contiene únicamente la
región de extensión de membrana hidrófoba putativa (residuos de
aminoácidos 24- 45) sin los residuos hidrófilos flanqueantes, tenía
una masa molecular de 23 kD, idéntica a su tamaño pronosticado
(Figura 4C(i), pista P). Esta proteína quimérica, al igual
que pS-MS+-S, era importada ineficazmente por
cloroplastos de guisante (9% del nivel de pPT-PT;
Tabla 1) y dio como resultado la producción de un cierto número de
productos resistentes a proteasa de tamaño variable desde el
precursor sin elaborar (23 kD) hasta aproximadamente 18 kD. Después
de fraccionamiento, se asociaron todos estos productos con la
membrana de envoltura (Figura 4C(ii) & (iii)). Esto
sugiere que la extensión de membrana N-terminal de
la proteína de translocador de fosfato madura es el único requisito
para fijar objetivo de envoltura.
Los productos elaborados múltiples observados
después de importar las proteínas quiméricas
pS-MS+-S y pS-MS-S
sugieren que ha tenido lugar alguna elaboración no específica dentro
de la presecuencia de SSU. Esto se ha observado a menudo después de
importar proteínas de fisión en cloroplastos (Li et al.,
1992) y la importación de un mutante de SSU Rubisco con una
alteración en el término C de la presecuencia mostró producir un
número de productos de tamaños similares a los observados en este
estudio (Ostrem et al., 1989). Debido a éstos productos, no
se intentó la cuantificación del fraccionamiento después de la
importación de pS-MS+- y
pS-MS-S (Figuras 4B & C).
Para ensayar si las proteínas quiméricas
importadas se integraban en la envoltura, o se asociaban
simplemente con la membrana de envoltura debido a su naturaleza
hidrófoba, se lavaron membranas de envoltura aisladas con NaOH 0,1
M. La resistencia al tratamiento con NaOH es una indicación de que
el polipéptido ha penetrado en el núcleo hidrófobo de la envoltura
(Steck y Yu, 1973). Los resultados de tales tratamientos se
muestran en la Figura 5 y se cuantifica en la Tabla 2 la
resistencia al tratamiento con NaOH en comparación con la proteína
de PT auténtica. Las proteínas quiméricas pS-PT y
pS-PTMS1-S se integraron en la
membrana de envoltura en la misma extensión que la proteína de PT
auténtica. El porcentaje de PT importado auténtico recuperado en
las membranas de envoltura tratadas con NaOH fue el 35% del testigo
sin lavar (véase Tabla 2). La razón para esta reducción es
desconocida, pero puede ser debida a la ineficacia de globulización
de membranas de envoltura después del tratamiento con NaOH. Otros
investigadores han obtenido resultados muy similares después de
extraer membranas de envoltura con NaOH 0,1 M (Waegemann y Soll,
1991). Los productos asociados con la envoltura de la importación
de pS-+MS-S y
pS-MS-S se integraron también en la
membrana de envoltura aunque en menor extensión que la de la
proteína de PT auténtica, mientras que los productos asociados con
la envoltura de la importación de pS-MS+-S se
separaron por lavado de la membrana por el tratamiento con NaOH.
Los experimentos previos sugieren que la región
hidrófoba N-terminal de la proteína de translocador
de fosfato madura puede fijar el objetivo de la SSU Rubisco a la
envoltura del cloroplasto. Para determinar si la fijación de
objetivo era a la membrana de envoltura interior, se determinó la
posición sub-envoltura de cinco de las proteínas
quiméricas importadas (Figura 6). Los cloroplastos se lisaron
hipertónicamente para permitir la separación de las membranas de
envoltura interior y exterior.
La proteína precursora de PT
(pPT-PT) se importó por cloroplastos de guisante y
se aislaron subfracciones de cloroplasto incluyendo el estroma (S),
las membranas de envoltura exterior (OE), envoltura interior (IE) y
de tilacoide (T). La distribución de proteínas de PT importada y
endógena en estas fracciones fue muy similar (Figura 6A), pero
sugirió que había un nivel bajo de contaminación de la envoltura
interior de la fracción de envoltura exterior. También se ha
encontrado contaminación por otros investigadores (Block et
al., 1983; Li et al., 1992). Se ve la misma distribución
para pS-PT importada (Figura 6B) que confirma
resultados previos (Figura 2), que sugerían fuertemente que la
información de fijación de objetivo ded PT está situada en la
proteína madura. Una comparación de la
pS-PTMS1-S importada y la proteína
de PT endógena (Figura 6C) sugiere que, aunque la fijación de
objetivo era a la membrana de envoltura interior, se encontró una
porción considerable de la proteína importada en la fracción
estromal. Esta forma era apenas visible en la fracción estromal en
experimentos previos de fraccionamiento de la envoltura total
(Figuras 3A). La razón de esta diferencia es desconocida.
El producto principal después de la importación
de pS--+MS-S (20 kD) estaba asociado con la membrana
de envoltura interior (Figura 6D). La separación de las membranas de
envoltura interior y exterior después de la importación de
pS-MS+-S mostraba asociación de la proteína
precursora (26 kD) y un compuesto intermedio de elaboración de
aproximadamente 21 kD con la membrana de envoltura interior. Los
compuestos intermedios de elaboración restantes y una proteína de
aproximadamente 18 kD, de tamaño próximo a la proteína MS+-S madura,
estaban situados estromalmente (Figura 6E). Un tratamiento con NaOH
de la fracción de envoltura total sugiere que estas proteínas
asociadas con la envoltura no estaban integradas en la membrana
(véase Figura 5). Cuando se separaron los residuos de aminoácidos
cargados circundantes (pS-MS-S;
Figura 6F), la proteína madura (MS-S, promosticada
ser de 18 kD) estaba asociada con la membrana de envoltura
interior. Esto sugiere que el único requisito para fijar el objetivo
de la SSU Rubisco de situación estromal normalmente a la membrana de
envoltura interior es la región hidrófoba
N-terminal de la proteína de translocador de
fosfato madura.
Los resultados proporcionados aquí han demostrado
claramente que la presecuencia del translocador de fosfato no es
responsable de la fijación de objetivo de envoltura. El análisis de
las presecuencias del PT y una proteína de la membrana de envoltura
interior de 37 kD sugirieron la presencia de características que
distinguen éstas de otras proteínas de objetivo fijado estromal o
de tilacoide, y se sugirió así que la presecuencia podría ser
responsable de la fijación de objetivo de envoltura (Willey et
al., 1991, Dreses-Werringloer et al.,
1991). Éste no es el caso claramente para la presecuencia del
translocador de fosfato y se ha demostrado de modo similar para la
proteína codificada por Bt1 de la envoltura de amiloplasto de maíz
(Li et al., 1992). La sustitución de la presecuencia de PT
reduce sin embargo la eficacia de la importación, sugiriendo la
coevolución de la presecuencia de PT para ajustarse a esta proteína
pasajera muy hidrófoba. Podría fijarse el objetivo de la subunidad
8 de Neurospora crassa F1Fo ATPasa, otra proteína muy
hidrófoba, a la mitocondria usando sólo la presecuencia de la
subunidad 9 igualmente hidrófoba de la ATPasa (Gearing y Nagley,
1986). Los presentes datos indican que la presecuencia de PT
funciona como una señal de importación del cloroplasto y no de
fijación de objetivo de la envoltura. La información para fijar el
objetivo del PT a la membrana de envoltura interior debe residir por
tanto dentro de la proteína madura.
La región hidrófoba N-terminal
del translocador de fosfato maduro puede fijar el objetivo y causar
la integración de la SSU Rubisco en la membrana de envoltura
interior.
Se prepararon dos construcciones genéticas
quiméricas, pMS1-uhpT y pMS1+2-uhpT,
y se pusieron bajo el control de dos promotores diferentes.
Ambas construcciones se prepararon a partir de
los plásmidos pPTMS1-S y pPT MS1+2-S
y pBST. Se han construido pPTMS1-S y pPT
MS1+2-S en el vector pSP65 (Promega) y consisten en
el péptido de tránsito del translocador de fosfato de guisante
(Willey et al., 1991) y bien la primera o bien la primera y
la segunda extensiones de membrana putativas del translocador de
fosfato maduro incorporado (enmarcado) a la SSU Rubisco de guisante
(Anderson et al., 1986). Se construyó pBST en el vector,
pBluescript KS+ (Stratagene), y contiene un fragmento de uhpT
(Friedrich y Kadner, (1987)), el translocador de fosfato de azúcar
de E. coli.
Se prepararon pMS1-uhpT y
pMS1+2-uhpT digiriendo pPTMS1-S y
pPTMS1+2-S con EcoRI y BamHI y clonando el inserto
en pBCSK+ (Stratagene) digerido con EcoRI BamHI. Este plásmido se
digirió después con SphI y BamHI para separar la secuencia que
codifica la SSU Rubisco y se clonó en su lugar un fragmento de SphI
BamHI de uhpT. Este fragmento de SphI BamHI de uhpT se preparó
usando PCR para introducir enmarcados lugares de restricción de
SphI, EcoRI y BamHI. El cebador de sentido fue
5'-CGC GCG CAT GCT GGC TTT CTT AAA CCA
GG-3', en el que la porción subrayada representa el
lugar de SphI, y el cebador antisentido fue
5'-CGG GAT CCG AAT TCT TAT GCC ACT GTC AAC
TGC TH-3', en el que la porción subrayada
representa los lugares de BamHI y EcoRI respectivamente.
La construcción genética quimérica se digirió con
EcoRI y se clonó en el lugar de EcoRI del plásmido palindrómico
pRL424. Los insertos se digirieron subsiguientemente con BamHI y se
clonaron en pROK2 (pBIN19 (Bevan, M.W. NAR anterior) digerido con
BamHI que contenía el promotor de CAMV 35S y terminador nos)
o pFW4101 (que contenía el promotor de patatina) después de separar
GUS. El pFW4101 se depositó en la National Collection of Industrial
and Marine Bacteria, Aberdeen, R.U. el 5 de Julio de 1990 con el
número de admisión NCIMB 40306.
Se prepararon membranas de envoltura de
cloroplasto moliendo 0,2 g de disco de hoja en 1 ml de
Tricine-NaOH 10 mM enfriado con hielo pH 7,5, EDTA 2
mM en un mortero enfriado con hielo. Se separaron restos de la pared
celular y almidón por centrifugación a 2.000 x g durante 30 h a
4ºC. El sobrenadante se estratificó en un gradiente de densidad de
sacarosa discontinuo consistente en 9 ml de sacarosa 0,6 M, Tricine
10 mM y 4 ml de sacarosa 1,0 M, contenido en un tubo de
ultracentrífuga Beckman ULTRA-CLEAR® de 14 mm x 95
mm y se sometió a ultracentrifugación a 113.600 x g durante 2 h a
4ºC. La interfase enriquecida en membrana de envoltura entre la
sacarosa 0,6 M y 1,0 M se transfirió a un tubo
ULTRA-CLEAR® limpio y se lavó con 14 ml de
Tricine-NaOH 10 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM. Se aislaron
las membranas por ultracentrifugación a 192.000 x g durante 1 h a
4ºC. El glóbulo de membrana se resuspendió en 50 \mul de
Tricine-NaOH 10 mM pH 7,5, EDTA 2 mM y se guardó a
-20ºC hasta usar. Las proteínas de envoltura se sometieron a
SDS-PAGE en una parte alícuota de 10 \mul de
resuspensión de membrana.
Se sometieron partes alícuotas de resuspensión de
membrana a SDS-PAGE usando una prueba en gel de
resolución del 12% de poliacrilamida a 80 v durante 2 h. Se
empaparon los geles en tampón de transferencia (14,4% de glicina,
0,3% de Tris, 0,1% de SDS, 20% de metanol) durante 30 min antes de
transferir, y se transfirieron las proteínas a nitrocelulosa usando
un sistema de manchado semiseco, a 8 v durante 1 h. La membrana se
bloqueó durante la noche a 4ºC en 3% de albúmina de suero de bovino
(BSA) o 5% de leche en polvo desnatada (Marvel) disueltos en
solución salina tamponada con fosfato (PBS = 0,8% de NaCl, 0,02% de
KCl, 0,144% de Na_{2}HPO_{4}, 0,024% de KH_{2}PO_{4} (todo
en p/v) que contenía 0,1% de Tween-20. La membrana
se enjuagó con 0,1% de Tween-20 en PBS durante 5 min
y se sondó después con anticuerpo principal (1:5.000) en 1% de BSA,
0,1% de Tween-20 en PBS durante aproximadamente 3 h
a temperatura ambiente. El anticuerpo principal se separó mediante
3 lavados (1 x 15 min, 2 x 5 min) en 0,1% de
Tween-20 en PBS y se añadió a las membranas
anticuerpo secundario conjugado a biotina (1:1.000) en 1% de BSA,
0,1% de Tween-20 en PBS, y se incubó a temperatura
ambiente durante aproximadamente 1 h. El anticuerpo secundario se
separó mediante 3 lavados con 0,1% de Tween-20 en
PBS (1 x 15 min, 2 x 5 min) y se incubó la membrana con
estreptavidina peroxidasa de rábano picante, 1% dee BSA, 0,1% de
Tween-20 en PB (1:5.000) durante una hora más. Se
lavó la membrana 3 veces en 0,1% de Tween-20 en PBS
(1 x 15 min, 2 x 5 min) y una vez en PBS (5 min). Se detectó el
anticuerpo usando el sistema ECL (Amersham International),
aplicando 4 ml de los reactivos 1 y 2 ECL a la superficie de la
membrana durante 1 min. La membrana se escurrió después, se cubrió
en película de pegado y se expuso a
Hyperfilm-ECL.
Tabaco: Se transfirieron construcciones genéticas
quiméricas en vectores binarios a la cepa LBA4404 de
Agrobacterium tumefaciens (Ooms et al., 1981) por
electroporación (Shen y Forde, 1989) y las cepas resultantes se
usaron para infectar discos de hojas de tabaco (Nicotiana
tabacum c. Samsun) esencialmente según Horsch et al.,
(1989). Las plantas regeneradas se diseccionaron de hojas con callo
y se mantuvieron en cultivo estéril en medio MS que contenía 200
\mug/ml de carbenicilina y 100 \mug/ml de canamicina y se
subcultivaron cada 2 semanas. Las plantas transgénicas enraizadas
obtenidas en 10-12 semanas se transfirieron a tierra
y se aclimataron en un propagador antes de crecer en una cámara de
ambiente controlado (Fisons Sanyo). Se permitió florecer a las
plantas, se cogieron las inflorescencias para asegurar la
autopolinización y se recogió la semilla resultante como generación
T_{1}. El análisis de las hojas de estas plantas mostró que el
translocador de fosfato de azúcar estaba transportado a la
envoltura interior.
Patata: Se usaron métodos de transformación
mediada por Agrobacterium tumefaciens para infectar discos de
hojas de patata (Solanum tuberosum cv. Prairie)
esencialmente según Horsch et al., (1989). Se permitieron
crecer discos infectados en medio MS que contenía 3% de sacarosa
durante 3 días y se seleccionaron transformantes en medios
descritos por Blundy et al., (1991). Se indujo callo en
medio MS suplementado con 2,5 mg/l de bencilaminopurina, 0,1 mg/l de
ácido naftalenoacético, 10 mg/l de ácido giberélico (GA_{3}), 500
mg/l de claforan y 50 mg/ml de canamicina. Se transfirieron callos
a medio MS que contenía 2,5 mg/l de bencilaminopurina y 10 mg/l de
GA_{3} para inducir retoños. Se cortaron los retoños y se
cultivaron en medio MS líquido sin hormonas y se subcultivaron cada
2 semanas. Se transfirieron retoños fuertes a medio MS sólido sin
hormonas para hacerlos robustos. Se indujeron microtubérculos
poniendo esquejes nodales de los retoños robustos en medio MS
suplementado con 6% de sacarosa, 2,5 mg/l de cinetina y 180 mg/ml
de ancimidol. Se indujeron tubérculos después de
5-6 semanas de incubación en la oscuridad a
19ºC.
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\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No. 1
PALTTGFFFTWYFLNVIFNIL
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No. 2
5'-CCAGCTCTTACTACCGGTTTTTTCTTCTTCACTTGGTACTTCTTGAATGTGATTTTCAACATCCTC
| Proteína testigo | Proteína | Eficacia de la importación^{a} |
| pS-S^{b} | pS-S | 100 |
| pPT-S | 83 | |
| pPT-PT^{c} | pPT-PT | 100 |
| pS-PT | 25 | |
| pPTMS1-S | 100 | |
| pPTMS1+2-S | 100 | |
| pS-PTMS1-S | 38 | |
| pS-PTMS1+2-S | 38 | |
| pS-+MS-S^{d} | 13 | |
| pS-MS+-S^{d} | 16 | |
| pS-MS-S^{d} | 9 | |
| a) \hskip0,6cm \begin{minipage}[t]{150mm} El % de proteína precursora importada en una localización resistente a proteasa después de la importación por cloroplastos de guisante, durante 30 min, se valoró por cuantificación de autorradiografías por densitometría de exploración láser. Se muestra la eficacia con relación a la importación de proteína testigo.\end{minipage} | ||
| b) c) \hskip0,27cm \begin{minipage}[t]{150mm} La eficacia de la importación de pS-S fue el 18% y la pPT-PT fue el 8% de la proteína precursora de entrada.\end{minipage} | ||
| d) \hskip0,6cm Todos los productos importados se incluyeron en la cuantificación. |
| Proteína | Proteína en envolturas lavadas (% del nivel de pPT-PT) |
| pPT-PT | 100 |
| pS-PT | 97 |
| pS-PTMS1-S | 103 |
| pS-+MS-S | 57 |
| pS-MS+-S | 0 |
| pS-MS-S | 34 |
La proteína importada se cuantificó por
exploración como se describe en la Figura 1. La asociación de
proteína quimérica importada con envolturas tratadas con NaOH se
expresa como % del nivel asociado del testigo
(pPT-PT).
Claims (32)
1. Un gen quimérico que comprende un promotor,
una secuencia de codificación para una proteína quimérica y una
secuencia de terminador, comprendiendo la proteína quimérica un
polipéptido de fijación de objetivo y un polipéptido heterólogo,
siendo capaz el polipéptido de fijación de objetivo de fijar como
objetivo una membrana de envoltura interior de plástido de una
planta y consistiendo esencialmente en una región hidrófoba amino
terminal de una proteína de translocador de fosfato madura.
2. Un gen quimérico según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido heterólogo confiere un carácter identificable
a una planta transformada.
3. Un gen quimérico según las reivindicaciones 1
o 2, en el que el polipéptido de fijación de objetivo es una región
hidrófoba terminal de una proteína de translocador de fosfato
madura de la membrana de envoltura interior de un plástido.
4. Un gen quimérico según las reivindicaciones 1,
2 o 3, en el que el polipéptido de fijación de objetivo comprende
la SEQ. ID No. 1 o una variante, derivado u homólogo de la
misma.
5. Un gen quimérico según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el polipéptido de fijación
de objetivo comprende la SEQ. ID No. 1.
6. Un gen quimérico según las reivindicaciones 1
o 2, en el que la secuencia de codificación para una proteína
quimérica comprende la SEQ. ID No. 2 o una variante, derivado u
homólogo de la misma.
7. Un gen quimérico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la secuencia de codificación para
una proteína quimérica comprende la SEQ. ID No. 2.
8. Un gen quimérico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el polipéptido heterólogo
comprende un gen informador.
9. Un gen quimérico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el polipéptido heterólogo es un
polipéptido transportador capaz de cambiar una característica de la
planta identificable.
10. Un gen quimérico según la reivindicación 9,
en el que el polipéptido transportador es un translocador de fosfato
de hexosa.
11. Un gen quimérico según la reivindicación 9,
en el que el polipéptido transportador es un translocador de ADP
glucosa.
12. Un gen quimérico según la reivindicación 9,
en el que el polipéptido transportador es un translocador para un
compuesto intermedio para una cualquiera de los siguientes:
síntesis de almidón, síntesis de pigmentos, biosíntesis de aceites
o biosíntesis de lípidos.
13. Un método para fijar el objetivo de una
proteína o polipéptido a la membrana de envoltura interior de un
plástido de una planta, que comprende introducir un gen quimérico
que comprende un promotor, una secuencia de codificación para una
proteína quimérica y una secuencia de terminador en una célula de
planta, comprendiendo la proteína quimérica un polipéptido de
fijación de objetivo y un polipéptido heterólogo, siendo capaz el
polipéptido de fijación de objetivo de fijar como objetivo una
membrana de envoltura interior de plástido y consistiendo
esencialmente en una región hidrófoba amino terminal de una
proteína de translocador de fosfato madura.
14. Un método según la reivindicación 13, en el
que el polipéptido heterólogo confiere un carácter identificable a
una planta transformada.
15. Un método según las reivindicaciones 13 o 14,
en el que el polipéptido de fijación de objetivo es una región
hidrófoba amino terminal de una proteína de translocador de fosfato
madura de la membrana de envoltura interior de un plástido.
16. Un método según las reivindicaciones 13 o 14,
en el que el polipéptido de fijación de objetivo comprende la SEQ.
ID No. 1 o una variante, derivado u homólogo de la misma.
17. Un método según las reivindicaciones 13, 14 o
15, en el que el polipéptido de fijación de objetivo comprende la
SEQ. ID No. 1.
18. Un método según las reivindicaciones 13 o 14,
en el que la secuencia de codificación para una proteína quimérica
comprende la SEQ. ID No. 2 o una variante, derivado u homólogo de
la misma.
\newpage
19. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17, en el que la secuencia de codificación
para una proteína quimérica comprende la SEQ. ID No. 2.
20. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 19, en el que el polipéptido heterólogo se
deriva de una proteína de transportador de membrana o translocador,
o una enzima, proteína o polipéptido implicados en replicación de
ADN o transducción de señal.
21. Un método según la reivindicación 20, en el
que el polipéptido heterólogo afecta al crecimiento de células y al
desarrollo de la forma y función de la planta.
22. Un método según la reivindicación 20, en el
que la proteína transportadora es de animal, de planta, fúngica o
bacteriana.
23. Un método para fijar el objetivo de una
proteína o polipéptido a la membrana de envoltura interior de un
plástido de una planta según la reivindicación 13, en el que el gen
quimérico usado en el método es según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12.
24. Un vector que comprende un gen quimérico
según alguna de las reivindicaciones 1-12.
25. Un vector según la reivindicación 24, en el
que la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ. ID. No. 2.
26. Una planta transformada que comprende un gen
quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
27. Una planta transformada de la reivindicación
26, en la que la planta es dicotiledónea.
28. La planta transformada de la reivindicación
27, en la que la planta es patata, tabaco, algodón, lechuga, melón,
calabacera, pepino, guisante, colza, soja, remolacha azucarera o
girasol.
29. La planta transformada de la reivindicación
26, en la que la planta es monocotiledónea.
30. La planta transformada de la reivindicación
29, en la que la planta es trigo, cebada, centeno, arroz o
maíz.
31. Una célula de planta que comprende un gen
quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
32. Un propágulo, semilla, progenie de
autofecundación o híbrida de una planta y descendientes y clones de
una planta, que comprende cada uno un gen quimérico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
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