ES2239253T3 - Inhibicion de stat-1. - Google Patents

Abstract

Uso de oligonucleótidos de ADN de cadena doble, oligonucleótidos antisentido de cadena sencilla, vectores de expresión antisentido u oligonucleótidos de interferencia de ARN de cadena doble para la inhibición de la actividad de STAT-1 para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de complicaciones cardiovasculares, tales como la reestenosis después de una angioplastia percutánea o la estenosis de derivaciones venosas, la reacción del injerto frente al huésped, el daño por isquemia- reperfusión en operaciones quirúrgicas o trasplante de órganos, reacciones inmunológicas de hipersensibilidad, especialmente la rinitis alérgica, las alergias a medicamentos y alimentos, especialmente urticaria y celiaquía (esprúe), el eccema de contacto y las enfermedades del complejo inmune, especialmente alveolitis, artritis, glomerulonefritis y vasculitis alérgica, enfermedades inflamatorias de cartílago y hueso, especialmente artrosis, gota, ostitis y osteomielitis, la polineuritis, así como enfermedades inflamatorias agudas o subagudas causadas por infección y, especialmente, postinfecciosas, especialmente bronquitis, endocarditis, hepatitis, miocarditis, nefritis, pericarditis, peritonitis y pancreatitis, incluido el choque séptico.

Description

Inhibición de STAT-1.

La presente invención se refiere al uso de inhibidores del factor de transcripción STAT-1 para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de complicaciones cardiovasculares, tales como la reestenosis después de una angioplastia percutánea o la estenosis de derivaciones venosas, la reacción del injerto frente al huésped, el daño por isquemia-reperfusión en operaciones quirúrgicas o trasplante de órganos, reacciones inmunológicas de hipersensibilidad, especialmente la rinitis alérgica, las alergias a medicamentos y alimentos, especialmente urticaria y celiaquía (esprúe), el eccema de contacto y las enfermedades del complejo inmune, especialmente alveolitis, artritis, glomerulonefritis y vasculitis alérgica, enfermedades inflamatorias de cartílago y hueso, especialmente artrosis, gota, ostitis y osteomielitis, la polineuritis, así como enfermedades inflamatorias agudas o subcutáneas causadas por infección y, especialmente, postinfecciosas, especialmente bronquitis, endocarditis, hepatitis, miocarditis, nefritis, pericarditis, peritonitis y pancreatitis, incluido el choque séptico.

Un objetivo esencial de la descodificación del genoma humano consiste en identificar genes causantes de enfermedades (debido al modo de acción de sus productos) o alteraciones causantes de enfermedades en la estructura de estos genes (polimorfismos) y en asignarlos a un cuadro clínico. De este modo resulta muy próximo un tratamiento causal de la mayoría de las enfermedades si se admite que éstas son causadas por un número definido de productos génicos expresados en exceso, en cantidades insuficientes o de forma errónea. De hecho se conoce ya el defecto génico, generalmente singular (enfermedad monogenética), para una serie de enfermedades hereditarias (por ejemplo, la mucoviscidosis), mientras que la situación es mucho más compleja para otras enfermedades (por ejemplo, la hipertensión). Éstas obviamente no son el resultado de un solo defecto génico sino de múltiples (enfermedad poligenética), que predisponen a las personas afectadas a desarrollar la enfermedad cuando se suman determinados factores ambientales. Independientemente de esta limitación, la intervención selectiva en la expresión de uno o varios genes ofrece la posibilidad de realizar un tratamiento causal y no únicamente sintomático.

Los factores de transcripción son proteínas de unión al ADN que se asocian en el núcleo celular a la región promotora de uno o varios genes, regulando de este modo su expresión, es decir, la nueva formación de las proteínas que son codificadas por estos genes. Además del control fisiológicamente importante de los procesos de desarrollo y diferenciación en el cuerpo humano, los factores de transcripción poseen un elevado potencial para causar enfermedades, sobre todo cuando activan la expresión génica en el momento equivocado. Adicionalmente, los factores de transcripción (dado el caso los mismos) pueden bloquear genes con una función protectora y actuar de forma predispuesta para la generación de una enfermedad. A este respecto, el principio terapéutico de anti-factor de transcripción descrito a continuación pretende inhibir genes causantes de enfermedades y activar, en cambio, genes protectores.

La inflamación es una reacción de defensa del organismo y de sus tejidos frente a estímulos nocivos con el fin de reparar el daño o, al menos, limitarlo localmente, así como de eliminar la causa del daño (por ejemplo, bacterias o cuerpos extraños que hayan penetrado). Los desencadenantes de una inflamación pueden ser microorganismos (bacterias, virus, hongos o parásitos), cuerpos extraños (polen, cristales de asbesto o de silicato), destrucción de tejido por daño mecánico, noxas químicas e influencias físicas, así como desencadenantes endógenos (células tumorales destruidas, sangre extravasal, reacciones autoinmunes) o cristales de sustancias precipitadas en el cuerpo (ácido úrico, oxalato y fosfato cálcico, colesterol).

La rápida activación de las células cebadas (en el tejido) o de los granulocitos basófilos en la sangre es un ejemplo del desencadenamiento de una muy fuerte reacción inflamatoria aguda y característica de reacciones inmunológicas de hipersensibilidad de tipo temprano (alergia humoral de tipo I). Si el organismo ya ha entrado en contacto previamente con un antígeno (o alergeno en el caso de hipersensibilidad), se han sensibilizado como reacción a ello linfocitos B que en cooperación con células T auxiliares de tipo 2 (células Th2) CD4 positivas, también sensibilizadas previamente, se transforman en células plasmáticas y forman anticuerpos de tipo IgE contra el antígeno. En este proceso de diferenciación, la coestimulación de los linfocitos B a través del receptor CD40 por medio de las células Th-2 que expresan el ligando correspondiente (CD154) tiene una importancia crucial. Si los anticuerpos IgE cargados de antígeno se unen a los receptores correspondientes (tipo Fc_{\varepsilon}) en las células cebadas, éstas liberan diferentes mediadores de la inflamación, en especial histamina, interleucina-8, leucotrienos y el factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha). La consecuencia es la atracción de flogocitos profesionales, en especial granulocitos eosinófilos y neutrófilos, así como monocitos, pero también linfocitos T, al lugar del suceso (quimiotaxis). Al mismo tiempo se produce una vasodilatación y un aumento de la permeabilidad, sobre todo dependiente de histamina, de las células endoteliales que revisten las paredes de los vasos.

Debido a la vasodilatación, la velocidad de flujo disminuye, lo que facilita a los leucocitos atraídos la toma de contacto físico con las células endoteliales. Estas células endoteliales, ya activadas por la exposición a citocinas (por ejemplo, TNF-\alpha), expresan en su superficie luminal intensificadamente selectinas (por ejemplo, selectina E) que provocan un desplazamiento de los leucocitos por las células endoteliales y, con ello, la activación de otras moléculas de adhesión adicionales (integrinas, por ejemplo la molécula de adhesión intercelular 1 [ICAM-1] o la molécula de adhesión vascular 1 [VCAM-1]). Los leucocitos pueden adherirse ahora a la pared vascular (marginación), y el aumento de la permeabilidad condicionado por la histamina (relajación del conjunto de células endoteliales) favorece su migración posterior al espacio extravasal (diapédesis). Al mismo tiempo penetra una mayor cantidad de líquido rico en proteínas (exudado inflamatorio) en el intersticio y se genera un edema. Debido a la creciente presión en el tejido y mediante otros mediadores adicionales formados por las flogocitos, se estimulan las terminales nerviosas adyacentes, las cuales provocan dolores y, con ello, informan del daño tisular.

Los granulocitos que han migrado hacia el lugar de la inflamación y los monocitos diferenciados en macrófagos tratan de eliminar los causantes de la inflamación mediante fagocitosis o lisis, durante lo cual se liberan, entre otras cosas, enzimas proteolíticas y radicales de oxígeno, que también pueden dañar el tejido sano adyacente. Especialmente la activación de los macrófagos puede contribuir de múltiples maneras (por ejemplo, por liberación de citocinas adicionales, tales como interleucina-1\beta o interleucina-6) a que la reacción inflamatoria, inicialmente local, incluya al organismo completo en forma de una respuesta de fase aguda. Las características típicas de una respuesta de fase aguda son somnolencia, cansancio y fiebre, una mayor liberación de leucocitos desde la médula ósea (leucocitosis), la detección de proteínas de fase aguda en la sangre (por ejemplo, proteína C reactiva), la estimulación del sistema inmune, así como una pérdida de peso debida a una alteración del metabolismo.

Si la causa de la inflamación se puede eliminar, sigue el proceso de cicatrización de la herida, durante el cual se repara el tejido dañado. En el caso más favorable se produce una restitución completa (restitutio ad integrum), las lesiones más grandes o una producción excesiva de tejido conjuntivo (especialmente de colágeno) dan como resultado la formación de una cicatriz que, dependiendo del tejido afectado, está asociada dado el caso con considerables trastornos funcionales. Si la causa no puede ser eliminada inmediatamente (cuerpos extraños o infección de la herida), se retrasa la cicatrización de la herida, intensificándose al mismo tiempo la inmigración y actividad de los fagocitos, con la consecuencia de la destrucción del tejido (necrosis) y hasta la formación de cavidades (absceso). El resultado es casi siempre una reconstrucción del tejido cubierta de cicatrices, con la pérdida correspondiente de la función. Si no se logra limitar localmente esta inflamación causada por agentes patógenos, ésta se extiende a través del sistema linfático por todo el organismo, con la consecuencia de una sepsis con desenlace dado el caso fatal (choque séptico).

La cicatrización de la herida también se ve perjudicada cuando los procesos inflamatorio y de cicatrización se encuentran en equilibrio. El resultado es una inflamación crónica que puede ser fibrosante (síntesis excesiva de colágeno) o granulomatosa (organización de flogocitos en un tejido de granulación) y que en general tiene como consecuencia una destrucción continua y una creciente limitación de la función del tejido afectado.

Además de la reacción inflamatoria general descrita, que puede degenerar en una enfermedad crónica, existen enfermedades inflamatorias que en cuanto a la patogénesis en la que están basadas presentan puntos en común pero también diferencias distintivas. Dos enfermedades inflamatorias de este tipo son, por ejemplo, las complicaciones tras intervenciones cardiológicas quirúrgicas y las reacciones inmunológicas de hipersensibilidad, a las que se dedica más espacio en la descripción debido a su enorme importancia clínica y variabilidad.

El ensanchamiento mecánico asistido por un catéter con globo (angioplastia percutánea) o la realización de un puente en arterias estenosadas por arteriosclerosis con la ayuda de derivaciones venosas siguen constituyendo en pacientes con trastornos de la circulación coronaria o periférica el tratamiento a elegir para la protección ante un infarto o un fallo orgánico inminente. No obstante, la tasa de reobstrucción (reestenosis) de las arterias ensanchadas mecánicamente y (en la mayoría de los casos) dotadas de un soporte vascular metálico (malla intraarterial) es inaceptablemente alta, con 20 a 50% en el plazo de 6 meses. También la tasa de obstrucción de las derivaciones venosas aortocoronarias o periféricas, con 50 a 70% después de 5 años, es más que insatisfactoria, especialmente ante el riesgo periprocedural o postoperatorio para los pacientes tratados. Probablemente debido al daño mecánico de la pared vascular (en este caso son afectadas igualmente las células endoteliales y las células vasculares de músculo liso), la reestenosis tras una angioplastia muestra, especialmente en el estadio temprano, un pronunciado componente inflamatorio que, entre otras cosas, se caracteriza por la infiltración de flogocitos profesionales (sobre todo monocitos y linfocitos T) en la pared vascular. También la estenosis fibroproliferativa (intima hiperplasia) de derivaciones venosas aortocoronarias o periféricas parece basarse en una reacción inflamatoria que es causada especialmente por noxas mecánicas y físicas. También se sabe desde hace tiempo que en el denominado daño por isquemia-reperfusión en el marco de intervenciones quirúrgicas o trasplantes de órganos se produce un daño tisular condicionado por la inflamación, en el que especialmente la interacción de las células endoteliales con los flogocitos profesionales (sobre todo granulocitos, pero también monocitos y células T), así como la liberación de sustancias que dañan el tejido (radicales de oxígeno, citocinas), desempeñan un papel crucial.

En relación con las complicaciones cardiovasculares mencionadas es importante que existan mecanismos protectores, sobre todo en las células endoteliales y de músculo liso de la pared vascular, que ayuden a limitar la extensión de la reacción inflamatoria y la reconstrucción adaptiva siguiente del tejido. Entre ellos se encuentran, por ejemplo, la síntesis de monóxido de nitrógeno (NO) por medio de la NO sintasa en las células endoteliales. El NO, probablemente en calidad de antagonista endógeno del radical de oxígeno superóxido, inhibe, entre otras cosas, la expresión de quimiocinas proinflamatorias (por ejemplo, la proteína qimiotáctica de monocitos 1, MCP-1) y de moléculas de adhesión (por ejemplo, ICAM-1) en las células endoteliales, la expresión de receptores para factores de crecimiento en las células de músculo liso (por ejemplo, el receptor de endotelina B), así como la liberación de factores de crecimiento por parte de los leucocitos. A este respecto, es fácil de deducir que un daño tanto mecánico como funcional del endotelio (por ejemplo, por una reducción inducida por citocinas de la expresión de la NO sintasa en estas células) se opone a los procesos de inflamación y de reconstrucción fibroproliferativa de la pared vascular siguiente basados en las complicaciones cardiovasculares mencionadas.

Todos los intentos realizados hasta ahora para restringir con medicamentos la reestenosis tras una angioplastia no han logrado el efecto deseado en la mayoría de los pacientes. Actualmente se favorecen dos principios terapéuticos locales: La braquiterapia vascular ya autorizada, un procedimiento para restringir el crecimiento celular mediante una corta irradiación radiactiva del segmento vascular ensanchado, y las mallas intraarteriales que liberan medicamentos (drug-eluting stents) y que todavía se encuentran en la fase de ensayo clínico. En este procedimiento se usan mallas intraarteriales recubiertas de polímeros que están "impregnadas" con medicamentos inhibidores del crecimiento (citostáticos, inmunosupresores), los cuales son liberados lentamente en un periodo de tiempo de varias semanas. Estudios clínicos más recientes demuestran que ambas estrategias terapéuticas, a pesar de unos resultados iniciales prometedores, no carecen de problemas, en parte graves (por ejemplo, trombosis en la malla intraarterial con el riesgo de un infarto).

Además de la reacción inmunológica de incompatibilidad de tipo I ya descrita, existen en principio cuatro formas de alergia o trastornos de la regulación inmunológica adicionales. La reacción de tipo 1 misma, una vez realizada la alergización, se puede dividir en principio en dos fases: La rápida liberación y neoformación de mediadores de la inflamación activos en los vasos por parte de las células cebadas cargadas con IgE y la reacción tardía mediada por los granulocitos eosinófilos y neutrófilos atraídos. La reacción de tipo 1 en total puede transcurrir de forma local o generalizada, dependiendo de la exposición al alergeno. Los alergenos presentes en el aire de respiración provocan reacciones en el tracto respiratorio, típicamente con edema de la mucosa e hipersecreción (rinopatía alérgica, fiebre del heno), así como broncoespasmos (asma), los alergenos alimentarios, en cambio, provocan en primer lugar síntomas gastrointestinales, tales como náuseas, vómitos y diarrea. La piel reacciona a alergenos con picor, hinchazón y urticaria, así como con dermatitis atópica (neurodermitis). Si, por el contrario, el alergeno penetra directamente en el torrente sanguíneo (por ejemplo, infusión de productos sanguíneos, medicamentos) o si la exposición al alergeno es especialmente fuerte, resulta una reacción inmediata sistémica que dado el caso conlleva una caída de la tensión arterial amenazadora para la vida (choque anafiláctico).

En la reacción de tipo II, el centro de atención lo constituyen las células de efecto antigénico (por ejemplo, células sanguíneas exógenas) o proteínas extracelulares (por ejemplo, alteración inducida por medicamentos en la superficie de una célula endógena). Tras la alergización se forman, en el segundo contacto, anticuerpos de tipo IgG e IgM específicos del alergeno que se unen en gran número a la superficie de la célula alergénica (opsonización). De este modo se activa el sistema del complemento (formación de un complejo de ataque en la membrana) y una subpoblación de linfocitos especiales, las células asesinas naturales (células NK). El resultado es una destrucción de la célula alergénica por citolisis. Una reacción similar se desencadena cuando se adhieren autoanticuerpos a estructuras endógenas, como, por ejemplo, la membrana basal de los capilares del glomérulo, provocando así una glomerulonefritis de progresión rápida con una inminente insuficiencia renal. Además de las células T auxiliares de tipo 1 (células Th1, véase más adelante), las células NK activadas son los productores principales de interferón \gamma, una citocina que intensifica masivamente la reacción inflamatoria, especialmente por medio de la activación de macrófagos.

La reacción de tipo III se caracteriza por la formación y deposición de complejos inmunes (complejos antígeno/anticuerpo), con la activación siguiente del sistema del complemento y de fagocitos (granulocitos, macrófagos). Circulan por la sangre y se depositan sucesivamente sobre todo en los capilares de los glomérulos renales, pero también en las articulaciones o en la piel. La reacción inflamatoria provocada de este modo puede tener como consecuencia, entre otras cosas, una glomerulonefritis (complejo inmune), dolores articulares, así como urticaria. También las infecciones pueden desencadenar una reacción de tipo III sistémica si el sistema inmune no logra eliminar por completo los agentes patógenos (por ejemplo, estreptococos). Las reacciones de tipo III locales típicas son la denominada reacción de Arthus tras la vacuna en la piel o la alveolitis alérgica exógena por la deposición de complejos antígeno/anticuerpo en el pulmón (por ejemplo, pulmón de los criadores de palomas). También el lupus eritematoso sistémico es una reacción de tipo III, aunque en el sentido de una enfermedad autoinmune causada por la formación de autoanticuerpos.

La reacción de tipo IV, al contrario que las reacciones de hipersensibilidad antes mencionadas, no es humoral sino asociada a células, y en general alcanza su máximo después de varios días (tipo de reacción retardada o delayed type hypersensitivity, hipersensibilidad de tipo retardado). Los desencadenantes son sobre todo proteínas de organismos extraños que han penetrado (bacterias, virus, hongos y parásitos), otras proteínas extrañas (por ejemplo, gliadina del trigo en el caso de celiaquía), así como haptenos (medicamentos, metales [por ejemplo, níquel en el caso de dermatitis de contacto], cosméticos y componentes vegetales). También el rechazo primario de órganos trasplantados es una reacción de tipo IV. El antígeno es fagocitado por macrófagos (tisulares), procesado y presentado a células T auxiliares nativas (CD4 positivas); la sensibilización de las células T auxiliares dura varios días. Durante el segundo contacto, las células T auxiliares así sensibilizadas se convierten en células Th1; en este proceso, la coestimulación mediada por CD154 de la célula presentadora de antígeno (ésta expresa el receptor CD40) desempeña un papel importante, puesto que a través de esta vía de señalización se produce la liberación de la interleucina-12 por parte de los macrófagos. La interleucina-12 induce la diferenciación y proliferación de las células T auxiliares. Las células Th1, por su parte, estimulan, a través de determinados factores de crecimiento (por ejemplo, GM-CSF), la formación de monocitos en la médula ósea, los reclutan con la ayuda de determinadas quimiocinas (por ejemplo, MIF) y los activan a través de la liberación de IFN-\gamma. La muy fuerte reacción inflamatoria resultante de ello puede destruir extensamente tejido endógeno (por ejemplo, tuberculosis) o trasplantado. En el rechazo de trasplantes intervienen, además, células T citotóxicas CD8 positivas (citolisis) que, al igual que las células Th1 CD4 positivas, sólo son capaces de reconocer su objetivo (la superficie celular extraña) y de "armarse" de forma correspondiente mediante la presentación previa del antígeno.

En un trastorno de la regulación inmunológica similar a la reacción de tipo IV se basa, por ejemplo, la artritis reumatoide o la esclerosis múltiple (células Th1 autorreactivas), así como la diabetes mellitus (células T citotóxicas autorreactivas). Además de una predisposición genética correspondiente (proteínas del MHC, desequilibrio entre Th1/Th2), probablemente también intervienen en estas enfermedades autoinmunes, además de los superantígenos bacterianos (por ejemplo, agentes patógenos de la tuberculosis), células T dirigidas contra determinados antígenos del agente patógeno (por ejemplo, estreptococos) que reaccionan de forma cruzada con autoantígenos (endógenos) (mimetismo molecular). Las reacciones de tipo V, en cambio, son provocadas, entre otras cosas, por autoanticuerpos activadores o bloqueantes de receptores de hormonas (por ejemplo, tireotropina en la enfermedad de Basedow) o de neurotransmisores (por ejemplo, acetilcolina en la miastenia grave).

Comparable al rechazo de trasplantes, aunque en sentido inverso, es la enfermedad del injerto frente al huésped (GVHD), que en el curso de los trasplantes de médula ósea alogénicos (entre individuos no idénticos genéticamente) aparece en aproximadamente 40% de los receptores. En la fase aguda, que dura hasta seis meses, las células T del donante transferidas con las células troncales atacan al organismo huésped, la reacción inflamatoria resultante, dado el caso grave, se manifiesta preferentemente en la piel, en el tracto gastrointestinal y en el hígado.

Para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias agudas se usan por regla general, dependiendo de la causa supuesta, antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDs, entre otras cosas inhibición de la síntesis de prostaglandina) y/o antiinfecciosos (eliminación de bacterias, hongos o parásitos) o agentes quimioterapéuticos antivirales, dado el caso también localmente glucocorticoides (inhibición general de la expresión génica). En el caso de enfermedades inflamatorias graves o crónicas recurrentes se administran sistémicamente glucocorticoides o inmunosupresores (inhibición de la activación de células T) o citostáticos, tales como metotrexato. Esto también es válido para el trasplante de órganos o de médula ósea. A pesar de su efecto terapéutico indiscutible, la administración sistémica de los medicamentos mencionados puede provocar efectos adversos graves, especialmente en el caso del uso prolongado. Así, por ejemplo, hasta un 25% de los pacientes que toman metotrexato durante 2 o más años desarrollan una cirrosis hepática grave. Los principios activos más recientes, usados especialmente en enfermedades inflamatorias crónicas recurrentes, bloquean el efecto proinflamatorio del TNF\alpha: Anticuerpos contra la citocina misma o su receptor, antagonistas de receptores de bajo peso molecular, así como una proteína receptora soluble, preparada por recombinación, que capta la citocina. Sin embargo, aumentan los datos acerca de una mayor incidencia de enfermedades infecciosas bajo el tratamiento con la proteína receptora (entre otras cosas, tuberculosis), y aproximadamente 40% de los pacientes parece no responder al tratamiento (non-responder). También para el anticuerpo contra TNF\alpha humanizado autorizado existen advertencias correspondientes sobre la aparición de infecciones, que llegan hasta la sepsis, entre 2 y 4 años después del comienzo del tratamiento. Además, ambos principios activos están contraindicados en el caso de un avance agudo de la inflamación. Asimismo están autorizados antagonistas de receptores de bajo peso molecular para leucotrienos, que se usan sobre todo en el tratamiento del asma, así como inhibidores de la ciclooxigenasa 2, un nuevo grupo de antiinflamatorios no esteroideos (NSAID) con unos efectos adversos gastrointestinales considerablemente reducidos en comparación con los NSAID clásicos. Asimismo existe una serie de anticuerpos, generalmente humanizados, o estrategias basadas en oligonucleótidos antisentido contra moléculas de adhesión de leucocitos o de células endoteliales, receptores de citocinas de células T auxiliares o anticuerpos IgE que se encuentran en diferentes fases de los ensayos clínicos. Si se prescinde de los glucocorticoides y los antiinfecciosos como grupo, los medicamentos mencionados tienen en común que se dirigen específicamente contra una molécula diana terapéuticamente relevante.

Por lo tanto, la presente invención se propone el objetivo de proporcionar agentes para la prevención o el tratamiento de complicaciones cardiovasculares, tales como la reestenosis después de una angioplastia percutánea o la estenosis de derivaciones venosas, la reacción del injerto frente al huésped, el daño por isquemia-reperfusión en operaciones quirúrgicas o trasplante de órganos, reacciones inmunológicas de hipersensibilidad, especialmente la rinitis alérgica, las alergias a medicamentos y alimentos, especialmente urticaria y celiaquía (esprúe), el eccema de contacto y las enfermedades del complejo inmune, especialmente alveolitis, artritis, glomerulonefritis y vasculitis alérgica, enfermedades inflamatorias de cartílago y hueso, especialmente artrosis, gota, ostitis y osteomielitis, la polineuritis, así como enfermedades inflamatorias agudas o subcutáneas causadas por infección y, especialmente, postinfecciosas, especialmente bronquitis, endocarditis, hepatitis, miocarditis, nefritis, pericarditis, peritonitis y pancreatitis, incluido el choque séptico, que constituyen una estrategia terapéuticamás amplia (conscientemente no monoespecífica) y, con ello, posiblemente más eficaz.

El objetivo se alcanza mediante el objeto definido en la reivindicación.

La invención se explica con más detalle mediante las siguientes figuras:

La Figura 1 muestra la inhibición de la expresión estimulada por citocinas de CD40 (a, c, d y e), selectina E y MCP-1 (a) y de la inducción por el ligando de CD40 de la expresión de la interleucina 12p40 (b) en células endoteliales humanas en cultivo por neutralización del factor de transcripción STAT-1 con la ayuda de un elemento cis señuelo correspondiente (SEC. ID. Nº: 33). (a) Análisis representativo por RT-PCR de la expresión de ARNm de selectina E, MCP-1 y CD40 (más la valoración densitométrica ("intensidad"), expresada en % del control estimulado y referida al patrón interno EF-1) en células endoteliales que se preincubaron durante 4 horas con un elemento cis señuelo de STAT-1 (SEC. ID. Nº: 33) o de NF-\kappaB (10 \muM) y a continuación se incubaron durante 9 horas con 100 U/ml del factor de necrosis tumoral \alpha y 1.000 U/ml de interferón \gamma. (b) Análisis representativo por RT-PCR de la expresión de ARNm de la interleucina 12p40 (más la valoración densitométrica ("intensidad"), expresada en % del control estimulado y referida al patrón interno rp132) en células endoteliales que se preincubaron durante 4 horas con un elemento cis señuelo de STAT-1 (10 \muM; SEC. ID. Nº: 33) y a continuación se incubaron durante 12 horas con aproximadamente 670.000 células P3xTB.A7/ml (estas células de mieloma de ratón expresan de forma estable el ligando de CD40 humano, CD154) y 1.000 U/ml de interferón \gamma. (c) Análisis representativo por RT-PCR de la expresión de ARNm de CD40 (más la valoración densitométrica ("intensidad"), expresada en % del control estimulado y referida al patrón interno EF-1) en células endoteliales que se preincubaron durante 4 horas con un elemento cis señuelo de STAT-1 (SEC. ID. Nº: 33) o el oligonucleótido control correspondiente (STAT-1-25mut) (concentración 10 \muM) y a continuación se incubaron durante 9 horas con 100 U/ml del factor de necrosis tumoral \alpha y 1.000 U/ml de interferón \gamma. (d) Resumen estadístico de 5 ensayos independientes sobre el efecto del elemento cis señuelo de STAT (ID de SEC. NO: 33) en la expresión de ARNm de CD40 estimulada por citocinas en las células endoteliales en cultivo (*P<0,05 frente a las células control estimuladas). (e) Análisis representativo por transferencia Western más la valoración densitométrica ("intensidad", expresada en % del control estimulado y referida al patrón interno actina \beta) del efecto del elemento cis señuelo de STAT-1 (SEC. ID. Nº: 33) en la expresión de la proteína CD4 estimulada por citocinas en las células endoteliales en cultivo tras 24 h. En ensayos adicionales se obtuvieron resultados comparables.

La Figura 2 muestra la inhibición de la expresión del gen CD40 inducida por citocinas en células endoteliales humanas en cultivo mediante la infrarregulación basada en oligonucleótidos antisentido de la expresión del factor de transcripción STAT-1. (a) Expresión de la proteína CD40 o STAT-1 en condiciones de reposo y tras incubar las células durante 14 horas con 100 U/ml del factor de necrosis tumoral \alpha y 1.000 U/ml de interferón \gamma. La parte izquierda de la imagen muestra el resumen estadístico de 2 a 4 ensayos con diferentes lotes de células, la parte derecha de la imagen muestra en cada caso un análisis representativo por transferencia Western más la valoración densitométrica ("intensidad"), expresada en % del control estimulado y referida al patrón interno actina \beta (*P<0,05 respecto a las células no estimuladas). (b) Inhibición comparable de la expresión de las proteínas CD40 y STAT-1 en células endoteliales estimuladas mediante un tratamiento previo de 24 horas con un oligonucleótido antisentido de STAT-1 (1 \muM; SEC. ID. Nº: 33). Resumen de 2 ensayos (parte izquierda de la imagen; *P<0,05 respecto a las células control estimuladas) y análisis representativo por transferencia Western (parte derecha de la imagen).

La Figura 3 muestra la inhibición de la expresión del factor de transcripción IRF-1 en la línea celular monocítica THP-1 (a), así como de la isoforma inducible de la NO sintasa en células humanas de músculo liso en cultivo (b) por neutralización del factor de transcripción STAT-1 con la ayuda de un elemento cis señuelo (SEC. ID. Nº: 33). (a) Análisis representativo por transferencia Western más la valoración densitométrica ("intensidad"), expresada en % del control estimulado y referida al patrón interno actina \beta. Las células THP-1 en cultivo se preincubaron durante 4 horas con el elemento cis señuelo (10 \muM) y a continuación se incubaron durante 3 horas con 100 U/ml del factor de necrosis tumoral \alpha y 1.000 U/ml de interferón \gamma. (b) Parte izquierda de la imagen: Resumen estadístico de 3 ensayos con diferentes lotes de células humanas de músculo liso en cultivo que se preincubaron durante 4 horas con un elemento cis señuelo de STAT-1 (SEC. ID. Nº: 33), de NP-\kappaB o de GATA-2 (10 \muM) y a continuación se incubaron durante 9 horas con 1.000 U/ml de interferón \gamma, 60 U/ml de interleucina-1\beta, 100 U/ml del factor de necrosis tumoral \alpha y 1 \mug/ml de lipopolisacárido bacteriano. Análisis por RT-PCR de la expresión de ARNm para la isoforma inducible de la NO sintasa (*P<0,05 respecto a las células estimuladas = 100%). Parte derecha de la imagen: Resumen estadístico de 3 ensayos con diferentes lotes de células y análisis representativo por transferencia Western de la inhibición de la expresión estimulada por citocinas de la proteína NO sintasa (tras 20 horas de exposición) por preincubación con el elemento cis señuelo de STAT-1 (SEC. ID. Nº: 33) o de NF-\kappaB (*P<0,05 respecto a las células estimuladas = 100%).

La Figura 4 muestra la neutralización de STAT-1 endógeno en extractos de núcleos celulares de la línea celular monocítica THP-1 por diferentes elementos cis señuelo (SEC. ID. Nº: 17, 25, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y los oligonucleótidos control mutados STAT-1-19 mut y STAT-1-25 mut). Análisis representativo por EMSA. Las células THP-1 en cultivo se incubaron durante 3 horas con 1.000 U/ml de interferón \gamma y a continuación se usaron para la preparación de extractos nucleares. El extracto de núcleos celulares se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente junto con el oligonucleótido SIE de cadena doble marcado con [^{32}P] (Santa Cruz Biotechnologie, Heidelberg, Alemania) y los elementos cis señuelo o los oligonucleótidos control correspondientes y a continuación se sometieron al análisis de cambio de movilidad electroforética.

La Figura 5 muestra el efecto de los elementos cis señuelo de STAT-1 seleccionados (SEC. ID. Nº: 17, 31, 35, 37) en la expresión de ARNm de selectina E y de MCP-1 en células humanas de músculo liso procedentes de la vena tímica. Las células en cultivo (pasada 2) se preincubaron durante 4 horas con los elementos cis señuelo correspondientes (10 \muM) y a continuación se incubaron durante 9 horas con 100 U/ml del factor de necrosis tumoral \alpha y 1.000 U/ml de interferón \gamma. Análisis representativo por RT-PCR, en ensayos adicionales se lograron unos resultados comparables.

La Figura 6 muestra esquemáticamente la estructura del vector de expresión pCI/Stat 1 AS de STAT-1 antisentido en forma de un mapa génico.

La Figura 7 muestra el resultado de la neutralización de STAT-1 en células endoteliales humanas en cultivo mediante diferentes elementos cis señuelo (SEC. ID. Nº: 17,19,27,33 y 39). Análisis representativo por EMSA más la valoración densitométrica ("intensidad"). Las células endoteliales en cultivo se incubaron durante 4 horas con los oligonucleótidos señuelo (10 \mumol/l) y a continuación se estimularon durante 30 min con 100 U/ml del factor de necrosis tumoral \alpha y 1.000 U/ml de interferón \gamma. Para el análisis EMSA se usaron los extractos nucleares de las células estimuladas y el oligonucleótido SIE de cadena doble marcado con [^{32}P] (Santa Cruz Biotechnologie, Heidelberg, Alemania).

La Figura 8 muestra la valoración histológica del efecto que presenta un oligonucleótido señuelo de STAT-1 (STAT-1 cons, 10 nmoles, SEC. ID. Nº: 19) pero no un oligonucleótido control mutado (STAT-1 mut, 10 nmoles, SEC. ID. Nº: 61) sobre la dermatitis de contacto inducida por DNCB en cobayas macho (original x400, resultado típico de un total de 17 cobayas estudiadas).

Los inventores han caracterizado los factores de transcripción que intervienen en el aumento mediado por citocinas de la expresión de productos génicos proinflamatorios (CD40, selectina E, la isoforma inducible de la NO sintasa, interleucina-12 [p40], MCP-1) en células endoteliales y de músculo liso humanas, así como en monocitos. Se observó que cuando se estimulan las células endoteliales en cultivo con TNF\alpha o CD154 en combinación con IFN\gamma se produce un sinergismo entre los factores de transcripción factor nuclear \kappaB (NF-\kappaB) y transductor de señales y activador de la transcripción-1 (STAT-1). Lo mismo ocurría con las células de músculo liso y los monocitos en cultivo.

El IFN\gamma solo era capaz de aumentar la expresión de CD40 en las células endoteliales humanas pero no la de la selectina E o de la interleucina-12. Para la expresión de estos dos productos génicos, escasamente o no expresados de forma constitutiva por las células endoteliales, resulta esencial la estimulación simultánea de las células con TNF\alpha (selectina E) o CD154 (interleucina-12). Para el aumento mediado por INF\gamma de la expresión de CD40, pero no de la selectina E, en las células endoteliales y los monocitos es necesario asimismo la expresión de novo de otro factor de transcripción, el factor regulador de interferón-1 (IRF-1). En el marco de estos estudios se observó que la expresión de la proteína IRF-1 es bastante más débil cuando las células se monoestimulaban con IFN\gamma, y especialmente con TNF\alpha, que en presencia de ambas citocinas. Por consiguiente, los factores de transcripción NF-\kappaB y STAT-1 actúan sinérgicamente también en la transcripción del gen de IRF-1 (Ohmori y col., J. Biol. Chem. (1997), 272, 14899).

STAT-1 (número de acceso al banco de genes NM007315 y XM010893 ó httg://transfac.gbf.de/cgi-bin/qt/getEntry.
pl?t0149) pertenece a un grupo de factores de transcripción que comprende al menos 6 miembros. El producto del gen STAT-1 es expresado por la mayoría de las células de forma constitutiva, pero generalmente está presente en el citoplasma como proteína monomérica inactiva (tamaño 91 kDa). La fosforilación de la tirosina de esta subunidad p91 y el posterior ensamblamiento (dimerización) de dos de estas subunidades p91 (denominado STAT-1\alpha) permite el transporte del factor de transcripción, ahora activo, al núcleo celular. También es posible la heterodimerización con la subunidad p84 de STAT-1\beta (producto del ayuste diferencial del mismo gen). La fosforilación de las subunidades presentes de forma constitutiva se lleva a cabo en función del estímulo mediante quinasas de Jano citoplasmáticas. Ambas quinasas de Jano (Jak1 y Jak2) son estimuladas por IFN\alpha (mejor: reclutadas por el receptor de interferón); el estímulo fisio(pato)lógico más importante para la activación de STAT-1, el IFN\alpha, en cambio, sólo estimula Jak2. También diferentes factores de crecimiento y hormonas peptídicas (por ejemplo, angiotensina II) activan STAT-1; además de las tirosínquinasas intrínsecas del receptor (de factores de crecimiento), también interviene aquí una proteínquinasa activada por mitógenos (MAP quinasa). Al contrario que STAT-1\alpha, STAT-1\beta no presenta ninguna actividad transactivadora, es decir, estimuladora de la expresión génica.

STAT-1 interviene en la expresión de una serie de productos génicos potencialmente proinflamatorios en leucocitos, células endoteliales y células de músculo liso, realizándose generalmente la activación del factor de transcripción de forma dependiente de IFN\gamma. Una excepción es, en particular, la expresión dependiente de STAT-1 de la interleucina-6 en células vasculares de músculo liso estimuladas por angiotensina II (Schicffer y col., Circ. Res. (2000), 87, 1195).

Un aspecto de la presente invención consiste en el uso de inhibidores de la actividad del factor de transcripción STAT-1 para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de complicaciones cardiovasculares, tales como la reestenosis después de una angioplastia percutánea o la estenosis de derivaciones venosas, la reacción del injerto frente al huésped, el daño por isquemia-reperfusión en operaciones quirúrgicas o trasplante de órganos, reacciones inmunológicas de hipersensibilidad, especialmente la rinitis alérgica, las alergias a medicamentos y alimentos, especialmente urticaria y celiaquía (esprúe), el eccema de contacto y las enfermedades del complejo inmune, especialmente alveolitis, artritis, glomerulonefritis y vasculitis alérgica, enfermedades inflamatorias de cartílago y hueso, especialmente artrosis, gota, ostitis y osteomielitis, la polineuritis, así como enfermedades inflamatorias agudas o subcutáneas causadas por infección y, especialmente, postinfecciosas, especialmente bronquitis, endocarditis, hepatitis, miocarditis, nefritis, pericarditis, peritonitis y pancreatitis, incluido el choque séptico, para reducir la expresión dependiente de STAT-1 de productos génicos proinflamatorios en el marco de la reacciones inflamatorias.

Las proteínas, entre las cuales también se cuenta STAT-1, se pueden inhibir en su actividad de la manera más diversa. Así, por ejemplo, se pueden usar anticuerpos anti-STAT-1, así como sustancias naturales o sintéticas que reducen la interacción de STAT-1 con el ADN, es decir, la actividad de transactivación. Asimismo se podrían inhibir las vías de señalización que conducen a la activación de STAT-1 (Jak1, Jak2, tirosina quinasas de receptores, MAP quinasas). Los procedimientos preferidos para la inhibición específica de la actividad de STAT-1 son:

1. La neutralización del factor de transcripción activado mediante un oligonucleótido señuelo,

2. la inhibición de la expresión de la proteína STAT-1 con la ayuda de un oligonucleótido antisentido,

3. la inhibición de la expresión de la proteína STAT-1 con la ayuda de un vector de expresión antisentido y

4. la inhibición de la expresión de la proteína STAT-1 mediante el uso de oligonucleótidos de ARN de cadena doble (interferencia de ARNcd).

La expresión "oligonucleótido señuelo" o "elemento cis señuelo" usada en la presente memoria designa una molécula de ADN de cadena doble o un oligonucleótido de ADN de cadena doble, respectivamente. Las dos cadenas de ADN presentan una secuencia complementaria. En la presente invención, el elemento cis señuelo presenta una secuencia que es equivalente o similar a la secuencia de unión al núcleo para el STAT-1 natural en el genoma y a la que se une el factor de transcripción STAT-1 en la célula. De este modo, el elemento cis señuelo actúa de molécula para la inhibición competitiva (mejor: neutralización) de STAT-1.

Un procedimiento preferido para la inhibición específica de la actividad de STAT-1 consiste en el uso de oligonucleótidos de ADN de cadena doble, denominados también elemento cis señuelo u oligonucleótido señuelo, que contienen un sitio de unión para STAT-1. El suministro exógeno de un gran número de sitios de unión para el factor de transcripción a una célula, especialmente de un número mucho mayor que el que está presente en el genoma, genera una situación en la que la mayoría de un factor de transcripción determinado se une específicamente al elemento cis señuelo correspondiente y no a sus sitios de unión diana endógenos. Esta estrategia para la inhibición de la unión de los factores de transcripción a su sitio de unión endógeno también se denomina silenciamiento. El silenciamiento (mejor: neutralización) de los factores de transcripción usando elementos cis señuelo se usó con éxito para inhibir el crecimiento de células. En este caso se usaron fragmentos de ADN que contenían sitios de unión específicos de factores de transcripción para el factor de transcripción E2F (Morishita y col., PNAS (1995), 92, 5855).

La secuencia de un ácido nucleico que se usa para evitar la unión del factor de transcripción STAT-1 es, por ejemplo, la secuencia a la que STAT-1 se une de forma natural en la célula. STAT-1 se une específicamente al motivo con la secuencia 5'-NNNSANTTCCGGGAANTGNSN-3', en la que N = A, T, C o G y S = C o G. Para una unión eficaz de STAT-1 es importante la coincidencia exacta con las bases subrayadas y la distancia entre estas bases. Por lo tanto, el elemento cis señuelo de acuerdo con la invención puede presentar la siguiente secuencia consenso undecamérica de unión al núcleo: 5'-NTTNCBGDAAN-3' (ID. de SEC: NO: 1), en la que B = C, G o T, D = A, G, o T y N = A, T, C o G. El elemento cis señuelo también puede ser mayor que la secuencia undecamérica de unión al núcleo y se puede prolongar en el extremo 5' y/o en el extremo 3'. Las mutaciones correspondientes en la zona de la secuencia de unión al núcleo conducen a la pérdida de la unión de STAT-1 al oligonucleótido señuelo.

Puesto que el elemento cis señuelo es un ácido nucleico de cadena doble, el oligonucleótido de ADN de acuerdo con la invención comprende en cada caso no sólo la secuencia sentido o directa sino también la secuencia antisentido o inversa complementaria. Los oligonucleótidos de ADN de acuerdo con la invención preferidos presentan las siguientes secuencias undecaméricas de unión al núcleo para STAT-1:

5'-ATTACCGGAAG-3' (SEC. ID. Nº: 3),

5'-ATTCCGGTAAG-3' (SEC. ID. Nº: 5),

5'-ATTCCTGGAAG-3' (SEC. ID. Nº: 7),

5'-ATTCCTGTAAG-3' (SEC. ID. Nº: 9),

5'-GTTCCAGGAAC-3' (SEC. ID. Nº: 11),

5'-GTTCCCGGAAG-3' (SEC. ID. Nº: 13),

5'-GTTCCGGGAAC-3' (SEC. ID. Nº:15),

no representándose aquí las secuencias complementarias correspondientes. El elemento cis señuelo, sin embargo, también puede presentar una secuencia distinta de la secuencia anterior y ser más larga que un undecámero.

Se prefieren especialmente las siguientes secuencias:

(SEC. ID. Nº: 17): 5'-TGTGAATTACCGGAAGTGAGA-3', 21-mero, 2 sitios de unión,

(SEC. ID. Nº: 19): 5'-TGTGAATTACCGGAAGTG-3', 18-mero, 2 sitios de unión,

(SEC. ID. Nº: 21): 5'-AGTCAGTTCCAGGAACTGACT-3', 21-mero, 2 sitios de unión,

(SEC. ID. Nº: 23): 5'-ATGTGAGTTCCCGGAAGTGAACT-3', 23-mero, 2 sitios de unión,

(SEC. ID. Nº: 25): 5'-ACAGTTCCGGGAACTGTC-3', 19-mero, 2 sitios de unión,

(SEC. ID. Nº: 27): 5'-GACAGTTCCGGGAACTGTC-3', 19-mero, 2 sitios de unión,

(SEC. ID. Nº: 29): 5'-GTGTATTCCGGTAAGTGA-3', 18-mero, 2 sitios de unión,

(SEC. ID. Nº: 31): 5'-TTATGTGAATTCCTGGAAGTG-3', 21-mero, 2 sitios de unión,

(SEC. ID. Nº: 33): 5'-CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG-3', 25-mero, 2 sitios de unión,

(SEC. ID. Nº: 35): 5'-TGTGAATTCCTGTAAGTGAGA-3', 21-mero, 2 sitios de unión,

(SEC. ID. Nº: 37): 5'-TGCATATTCCTGTAAGTG-3', 18-mero, 2 sitios de unión,

(SEC. ID. Nº: 39): 5'-ATATTCCTGTAAGTG-3', 15-mero, 2 sitios de unión,

La observación "2 sitios de unión" se refiere a las cadenas sentido y antisentido. Esta enumeración de las secuencias preferidas no es concluyente. El experto apreciará que se pueden usar numerosas secuencias como inhibidor de STAT-1, siempre que cumplan las condiciones antes expuestas de la secuencia consenso undecamérica de unión al núcleo y presenten una afinidad por STAT-1.

La afinidad de la unión de una secuencia de ácidos nucleicos a STAT-1 se puede determinar usando el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) (Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Krzesz y col. (1999) FEBS Lett. 453, 191). Este sistema de ensayo es adecuado para el control de calidad de los ácidos nucleicos que se pretenden usar en el procedimiento de la presente invención o para determinar la longitud óptima de un sitio de unión. También es adecuado para la identificación de otras secuencias que se unen a STAT-1. Para un EMSA pensado para el aislamiento de nuevos sitios de unión, lo más adecuado son versiones de STAT-1 purificadas o expresadas por recombinación que se usan en varios ciclos alternantes de multiplicación por PCR y selección mediante el EMSA (Thiesen y Bach (1990) Nucleic Acids Res. 18, 3203).

Los genes de los que se sabe que contienen sitios de unión a STAT-1 en su promotor o sus regiones potenciadoras o en los que ya existe una comprobación funcional para el significado de STAT-1 durante su expresión y que por eso son posibles objetivos para el silenciamiento específico mediante el procedimiento de la presente invención son, además de los genes de CD40, selectina E, NO sintasa inducible, interleucina-12 (p40) y MCP-1, otros genes proinflamatorios adicionales, por ejemplo el IFN\gamma mismo, la citocina interleucina-6, las moléculas de adhesión ICAM-1, PECAM-1 (molécula de adhesión plaquetaria al endotelio-1), RANTES (expresada y secretada normalmente por las células T y regulada después de la activación; secretada en forma soluble por linfocitos T) y VCAM-1, las quimiocinas interleucina-8, IP-10 (proteína inducible por interferón-10) y Mig (monocina inducida por interferón gamma), así como las proteínas del MHC I y II. En este caso da igual si la expresión de estos genes se regula directa o indirectamente (por ejemplo, mediante la expresión de IRF-1 dependiente de STAT-1) mediante
STAT-1.

Si en las células endoteliales humanas se usa un oligonucleótido señuelo de acuerdo con la invención contra STAT-1, la expresión de CD40 inducida por citocinas (tanto en la monoestimulación con IFN\gamma como en la combinación de IFN\gamma y TNF\alpha) se inhibe claramente en más del 50% pero no con un oligonucleótido control correspondiente. Esto también es válido para la expresión de selectina E y MCP-1 o interleucina-12 (p40) cuando la estimulación de las células se lleva a cabo con IFN\gamma y TNF\alpha o CD154, respectivamente. También la reducción basada en nucleótidos antisentido de la expresión de la proteína STAT-1 inhibe la expresión de CD40 inducida por citocinas en las células endoteliales humanas en la misma medida que el oligonucleótido señuelo. Por lo tanto, la supresión de la actividad de STAT-1 tiene como consecuencia una inhibición muy significativa de la expresión de un grupo de productos génicos proinflamatorios en las células endoteliales humanas. A este respecto, hay que contar en esta estrategia terapéutica con una clara disminución de la interacción endotelio/leucocitos (selectina E, MCP-1) pero también de la interacción de células presentadoras de antígeno (por ejemplo, macrófagos y linfocitos B) con linfocitos T (CD40, interleucina-12) en el marco de las enfermedades inflamatorias. Del mismo modo, esto también es válido para la reducción mostrada de la expresión inducida por citocinas de los productos génicos mencionados, incluida la NO-sintasa inducible, en las células humanas de músculo liso.

El procedimiento de la presente invención modula la transcripción de un gen o de genes de tal manera que el gen o los genes, por ejemplo la selectina E, se expresen menos o nada. La expresión reducida o suprimida significa en el marco de la presente invención que la tasa de transcripción está reducida en comparación con las células que no se tratan con un oligonucleótido de ADN de cadena doble de acuerdo con la invención. Una reducción de este tipo se puede determinar, por ejemplo, mediante la técnica de transferencia Northern (Sambrook y col., 1989) o RT-PCR (Sambrook y col., 1989). Una disminución de este tipo es típicamente una disminución de al menos 2 veces, en especial de al menos 5 veces, en particular de al menos 10 veces. La pérdida de activación se puede lograr, por ejemplo, cuando STAT-1 actúa como activador de la transcripción de un determinado gen, y por este motivo el silenciamiento del activador conduce a la pérdida de la expresión del gen diana.

Además, el procedimiento de la presente invención permite la desinhibición de la expresión de un gen, siempre que ésta sea bloqueada por un factor de transcripción activo de forma constitutiva o (tras la estimulación correspondiente de la célula) activado. Un ejemplo de ello es la desinhibición de la expresión del gen de la preproendotelina 1 en células endoteliales nativas de la vena yugular de conejo mediante un elemento cis señuelo contra el factor de transcripción proteína de unión a CCAAT/potenciador (Lauth y col., J. Mol. Med. (2000), 78, 441). Por esta vía se puede desinhibir la expresión de genes cuyos productos ejercen un efecto protector contra, por ejemplo, enfermedades inflamatorias. Así, por ejemplo, la isoforma endotelial de la NO sintasa, cuyo producto NO desempeña un papel crucial en la supresión de la expresión de moléculas de adhesión proinflamatorias y de quimiocinas en células endoteliales, se infrarregula mediante IFN\gamma (Rosenkranz-Weiss y col. (1994) J. Clin. Invest. 93, 1875). Un elemento cis señuelo contra STAT-1 puede revertir este efecto indeseado impidiendo la unión de STAT-1 al sitio de unión correspondiente en el promotor del gen de la NO sintetasa endotelial.

En una forma de realización preferida, el elemento cis señuelo de acuerdo con la invención contiene uno o varios, preferentemente 1, 2, 3, 4 ó 5, muy preferentemente 1 ó 2 sitios de unión a los que se une STAT-1 específicamente. Los ácidos nucleicos se pueden preparar sintéticamente, mediante procedimientos enzimáticos o en células. Los procedimientos individuales son del estado de la técnica y son conocidos para el experto.

La longitud del oligonucleótido de ADN de cadena doble es al menos tan grande como una secuencia usada que se une específicamente a STAT-1. Habitualmente, el nucleótido de ADN de cadena doble usado se elige entre aproxi-
madamente 11 y 65 pb, preferentemente entre aproximadamente 13 a 28 pb y muy preferentemente entre 16 y 23 pb.

En general, los oligonucleótidos son degradados rápidamente en la célula por endo- y exonucleasas, en especial por DNasas y RNasas. Por este motivo, los oligonucleótidos de ADN se pueden modificar para estabilizarlos frente a la degradación, de manera que se mantiene una elevada concentración de los oligonucleótidos en la célula durante un periodo de tiempo prolongado. Una estabilización de este tipo se puede obtener típicamente introduciendo uno o varios enlaces internucleotídicos modificados.

Un oligonucleótido de ADN estabilizado con éxito no contiene necesariamente una modificación en cada enlace internucleotídico. Preferentemente están modificados los enlaces internucleotídicos en los extremos correspondientes de ambos oligonucleótidos del elemento cis señuelo. Pueden estar modificados los últimos seis, cinco, cuatro, tres, dos o el último, o uno o varios enlaces internucleotídicos dentro de los últimos seis enlaces internucleotídicos. Asimismo se pueden introducir en el ácido nucleico diferentes modificaciones de los enlaces internucleotídicos y ensayar los oligonucleótidos de ADN de cadena doble generados en cuanto a la unión a STAT-1 específica de secuencia usando el sistema de ensayo EMSO rutinario. Este sistema de ensayo permite determinar la constante de unión del elemento cis señuelo y determinar así si la afinidad ha sido alterada por la modificación. Se pueden seleccionar los elementos cis señuelo modificados que todavía presentan una unión suficiente, significando una unión suficiente al menos aproximadamente 50% o al menos aproximadamente 75% y muy preferentemente aproximadamente 100% de la unión del ácido nucleico no modificado.

En los elementos cis señuelo con un enlace internucleotídico modificado que todavía muestran una unión suficiente se puede comprobar si son más estables en la célula que los elementos cis señuelo no modificados. Las células "transfectadas" con los elementos cis señuelo de acuerdo con la invención son analizados en diferentes momentos en cuanto a la cantidad de elementos cis señuelo todavía presentes. Para ello se usa preferentemente un elemento cis señuelo marcado con un colorante fluorescente (por ejemplo, rojo de Texas) o un elemento cis señuelo marcado radiactivamente (por ejemplo, ^{32}P), con microscopía de fluorescencia digital, o autorradiografía o escintigrafía siguiente, respectivamente. Un elemento cis señuelo modificado con éxito presenta una semivida en la célula superior a la de un elemento cis señuelo no modificado, preferentemente de al menos aproximadamente 48 horas, más preferentemente de al menos aproximadamente 4 días, lo más preferentemente de al menos aproximadamente 7 días.

En Uhlmann y Peyman ((1990) Chem. Rev. 90, 544) se resumen enlaces internucleotídicos modificados adecuados. Los restos fosfato internucleotídicos y/o los puentes sin fósforo modificados en un ácido nucleico que se pueden usar en un procedimiento de la presente invención contienen, por ejemplo, fosfonato de metilo, tioato de fósforo, ditioato de fósforo, amidato de fósforo, ésteres de fosfato, mientras que los enlaces internucleotídicos análogos sin fósforo contienen, por ejemplo, puentes de siloxano, puentes de carbonato, puentes de éster carboximetílico, puentes de acetamidato y/o puentes de tioéter. Cuando se usan enlaces internucleotídicos modificados con tioato de fósforo, éstos preferentemente no deberían encontrarse entre las bases citosina y guanina, puesto que esto puede producir una activación de las células diana del elemento cis señuelo.

Otra forma de realización adicional de la invención consiste en la estabilización de los ácidos nucleicos mediante la introducción de características estructurales en el ácido nucleico que aumentan la semivida del ácido nucleico. Tales estructuras, que contienen ADN en forma de horquilla y de campana, se dan a conocer en el documento US 5.683.985. Se pueden introducir simultáneamente restos fosfato internucleotídicos y/o puentes sin fósforo modificados junto con las estructuras mencionadas. Los ácidos nucleicos resultantes se pueden ensayar respecto a la unión y la estabilidad en el sistema de ensayo antes descrito.

La secuencia de unión al núcleo no sólo puede estar presente en un elemento cis señuelo sino también en un vector. En una forma de realización preferida, el vector es un vector plasmídico y, en especial, un vector plasmídico que es capaz de replicarse autosómicamente, por medio de lo cual aumenta la estabilidad del ácido nucleico de cadena doble introducido.

Un elemento cis señuelo de la presente invención es absorbido rápidamente por la célula. Una absorción suficiente se caracteriza por la modulación de la expresión de uno o varios genes que pueden ser modulados por STAT-1. El elemento cis señuelo de la presente invención modula preferentemente la transcripción de un gen o genes al cabo de aproximadamente 4 horas después del contacto con la célula, más preferentemente al cabo de aproximadamente 2 horas, al cabo de aproximadamente 1 hora, al cabo de aproximadamente 30 minutos y lo más preferentemente al cabo de aproximadamente 10 minutos. Una mezcla típica que se usa en un ensayo de este tipo contiene 20 \mumoles/l de elemento cis señuelo.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento para la modulación de la transcripción de al menos un gen en las células que intervienen en el suceso inflamatorio, especialmente en células endoteliales, células epiteliales, leucocitos, células de músculo liso, queratinocitos o fibroblastos, comprendiendo el procedimiento el paso de la puesta en contacto de las células mencionadas con una mezcla que contiene uno o varios ácido(s) nucleico(s) de cadena doble que son capaces de unirse al factor de transcripción STAT-1 de forma específica de secuencia. Un procedimiento preferido es, por ejemplo, el tratamiento ex vivo de una donación de médula ósea que contiene linfocitos T antes de introducirla en el cuerpo del receptor.

Los elementos cis señuelo de acuerdo con la invención también pueden administrarse a los pacientes en una composición o usarse en el procedimiento de acuerdo con la invención. La composición (denominada en lo sucesivo mezcla) que contiene los elementos cis señuelo de acuerdo con la invención se pone en contacto con las células diana (por ejemplo, células endoteliales, células epiteliales, leucocitos, células de músculo liso, queratinocitos o fibroblastos). La finalidad de esta puesta en contacto es la transferencia de los elementos cis señuelo que se unen a STAT-1 a la célula diana (es decir, la célula que expresa productos génicos proinflamatorios de forma dependiente de STAT-1). Por este motivo se pueden usar en el marco de la presente invención ácidos nucleicos modificados y/o aditivos o coadyuvantes de los que se sabe que aumentan la penetración a través de la membrana (Uhlmann y Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 544).

En una forma de realización preferida, una mezcla de acuerdo con la invención contiene esencialmente sólo ácido nucleico y tampón. Una concentración adecuada de los elementos cis señuelo se encuentra en el intervalo de al menos 0,1 a 100 \muM, preferentemente en 10 \muM, añadiéndose uno o varios tampones adecuados. Un ejemplo de un tampón de este tipo es la solución de Ringer, que contiene 145 mmoles/l de Na^{+}, 5 mmoles/l de K^{+}, 156 mmoles/l de Cl^{-}, 2 mmoles/l de Ca^{2+}, 1 mmol/l de Mg^{2+}, 10 mmoles/l de Hepes, 10 mmoles/l de D-glucosa, pH 7,4.

En otra forma de realización de la invención, la mezcla contiene adicionalmente al menos un aditivo y/o coadyuvante. Con los aditivos y/o coadyuvantes, tales como lípidos, lípidos catiónicos, polímeros, liposomas, nanopartículas, aptámeros de ácido nucleico, péptidos y proteínas que están unidos al ADN o moléculas sintéticas de péptido/ADN, se pretende, por ejemplo, aumentar la introducción de ácidos nucleicos en la célula, dirigir la mezcla únicamente a un subgrupo de células, evitar la degradación del ácido nucleico en la célula, facilitar el almacenamiento de la mezcla de ácidos nucleicos antes del uso. Ejemplos de péptidos y proteínas o moléculas sintéticas de péptido/ADN son, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ligandos y moléculas de adhesión, que pueden estar todos modificados o no modificados.

Los aditivos que estabilizan los elementos cis señuelo en la célula son, por ejemplo, sustancias que condensan ácido nucleico, tales como polímeros catiónicos, poli-L-lisina o polietilenimina.

La mezcla que se usa en el procedimiento de la presente invención se administra preferentemente de forma local por inyección, catéter, supositorio, aerosoles (espray para nariz o boca, inhalación), trocares, proyectiles, geles plurónicos, polímeros que liberan medicamentos de forma sostenida o cualquier otro dispositivo que permita el acceso local. También la administración ex vivo de la mezcla usada en el procedimiento de la presente invención permite un acceso local.

La inhibición de la actividad de STAT-1, sin embargo, no sólo puede realizarse a nivel de proteína en los procedimientos antes descritos, sino que se puede provocar ya antes o durante la traducción de la proteína del factor de transcripción. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención consiste en facilitar un inhibidor de la expresión de la proteína STAT-1 como agente terapéutico. Este inhibidor es preferentemente una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla, un denominado oligonucleótido antisentido. Los oligonucleótidos antisentido pueden inhibir la síntesis de un gen diana en tres niveles diferentes: en la transcripción (impidiendo la síntesis de ARNhn), el procesamiento (ayuste) del ARNhn para proporcionar el ARNm y en la traducción del ARNm a proteína en los ribosomas. El procedimiento de inhibición de la expresión de genes mediante oligonucleótidos es el estado de la técnica y bien conocido para los expertos. Como oligonucleótido antisentido se puede usar una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla con cualquier secuencia, siempre que el oligonucleótido antisentido sea capaz de inhibir la expresión de la proteína STAT-1. Preferentemente, el oligonucleótido antisentido contra STAT-1 usado en el procedimiento de acuerdo con la invención presenta la secuencia 5'-TACCACTGAGACATCCTGCCAC-3' (SEC. ID. Nº: 41) y forma un puente sobre el codón de iniciación. Otras secuencias preferidas para los oligonucleótidos antisentido son 5'-AACATCATTGGCACGCAG-3' (SEC. ID. Nº: 42) y 5'-GTGAACCTGCTCCAG-3' (SEC. ID. Nº: 43). El oligonucleótido antisentido puede ser una molécula de ADN, una molécula de ARN o una molécula híbrida de ADN/ARN de cadena sencilla. El oligonucleótido antisentido puede presentar además uno o varios enlaces internucleotídicos modificados, por ejemplo tal como se describió para el elemento cis señuelo. En el caso de un oligonucleótido antisentido estabilizado mediante enlaces internucleotídicos modificados por tioato de fósforo se ha de observar especialmente que entre las bases citosina y guanina no se haya introducido un enlace internucleotídico modificado con tioato de fósforo, puesto que esto produce una activación similar a la del IFN\gamma, especialmente de células inmunocompetentes (por ejemplo, células endoteliales) y, con ello, contrarrestaría, al menos en parte, el efecto terapéutico deseado.

También los oligonucleótidos antisentido de acuerdo con la invención se pueden usar y administrar a los pacientes en una composición. La composición puede constar de aditivos y coadyuvantes estabilizadores que, por ejemplo, facilitan la introducción de los oligonucleótidos antisentido en la célula o que, por ejemplo, dirigen la composición únicamente a un subgrupo de células o que, por ejemplo, evitan la degradación de los oligonucleótidos antisentido en la célula o que, por ejemplo, facilitan el almacenamiento de los oligonucleótidos antisentido antes del uso.

El oligonucleótido antisentido no sólo se puede administrar en forma de molécula de ácido nucleico de cadena sencilla sino que también puede estar presente en un vector. En una forma de realización preferida, el vector es un vector plasmídico y, en especial, un vector plasmídico que es capaz de replicarse autosómicamente, por medio de lo cual aumenta la estabilidad del ácido nucleico de cadena sencilla introducido.

Por lo tanto, otro aspecto más de la presente invención consiste en un vector de expresión antisentido que, tras la transfección en las células diana, es expresado por éstas e inhibe específicamente la expresión de STAT-1. En este caso puede tratarse de cualquier vector de expresión eucariota disponible en el estado de la técnica. Preferentemente se trata del plásmido pCI de la empresa Promega (nº de catálogo E1731), número de acceso al banco de genes U47119) en el que, por ejemplo, se ha clonado en sentido inverso (3'\rightarrow5') un segmento del gen de STAT-1 que comprende 2350 pb (-121 a +2229, número de acceso al banco de genes XM010893). Este segmento del gen de STAT-1 está flanqueado por dos sitios de corte EcoR 1 y contiene un sitio de corte Xho 1. Su expresión se encuentra bajo el control del promotor de CMV. El plásmido completo (denominación pCI/Stat-1 AS) comprende 6.365 pb.

Otro procedimiento preferido para la inhibición de la actividad de STAT-1 a nivel de la traducción del ARNm a la proteína del factor de transcripción consiste en la interferencia de ARNdc, como se describe en Fire (1999) Trends Genet. 15, 358, y Elbashir y col. (2001) Nature 411, 494. En este procedimiento se introduce en la célula un ARN de cadena doble que comprende exactamente 21 nucleótidos y cuya secuencia es idéntica a un segmento del ARNm que codifica la proteína diana (STAT-1). A continuación se forma un complejo de proteínas, aún no conocido en detalle, que disocia específicamente el ARNm diana, evitando así su traducción. No se puede usar un ARN de cadena doble más largo puesto que provoca en las células diana una respuesta que es comparable a la reacción de las células a una infección (vírica) y que, por lo tanto, contrarrestaría el efecto terapéutico pretendido. El oligonucleótido de ARNcd de interferencia presenta generalmente uno o varios enlaces internucleotídicos modificados, por ejemplo tal como se describió anteriormente para el elemento cis señuelo.

La mezcla que contiene los oligonucleótidos de ARNcd de interferencia de acuerdo con la invención se pone en contacto con las células diana (por ejemplo, células endoteliales, células epiteliales, leucocitos, células de músculo liso, queratinocitos o fibroblastos). Generalmente se usan aditivos o coadyuvantes de los que se sabe que aumentan la penetración a través de la membrana (Uhlmann y Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 544).

Las siguientes figuras y ejemplos sirven únicamente de explicación y de ningún modo limitan el alcance de la invención.

1. Cultivo celular

Se aislaron células endoteliales humanas de venas del cordón umbilical mediante un tratamiento de 30 min a 37ºC con 1,6 U/ml de dispasa en una solución de Tyrode modificada con Hepes y se cultivaron en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos recubiertas de gelatina (2 mg/ml de gelatina en HCl 0,1 M durante 30 min a temperatura ambiente) en 1,5 ml de medio M199 (Gibco Life Technologies, Karlsruhe, Alemania) que contenía 20% de suero bovino fetal, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina, 10 U/ml de nistatina, Hepes 5 mM y TES 5 mM, 1 \mug/ml de heparina y 40 \mug/ml del factor de crecimiento endotelial. Se identificaron por su morfología de adoquín típica, la inmunotinción positiva para el factor von Willebrandt (vWF) y la detección fluorimétrica (FACS) de PECAM-1 (CD31), así como por la inmunotinción negativa para la actina \alpha de músculo liso (Krzesz y col. (1999) FEBS Lett. 453, 191).

La línea celular de monocitos humanos THP-1 (ATCC TIB 202) se cultivó en medio RPMI 1640 (Life Technologies) que contenía 10% de suero bovino fetal, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y 10 U/ml de nistatina. Las células de músculo liso humanas se aislaron de venas tímicas preparadas con la ayuda de la técnica del explante (Krzesz y col. (1999) FEBS Lett. 453, 191) y se cultivaron en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos recubiertas de gelatina (véase anteriormente) en 1,5 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía 15% de suero bovino fetal, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y 10 U/ml de nistatina. Se identificaron por inmunotinción positiva para la actina \alpha de músculo liso.

2. Análisis por RT-PCR

Se aisló el ARN endotelial total con el kit Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) y a continuación se realizó una síntesis de ADNc con un máximo de 3 \mug de ARN y 200 U de transcriptasa inversa Superscript^{TM} II (Life Technologies) en un volumen total de 20 \mul según las instrucciones del fabricante. Para el ajuste de la carga de ADNc se usaron 5 \mul (aproximadamente 75 ng de ADNc) de la solución de ADNc resultante y de la pareja de cebadores (Gibco) para la PCR del factor de elongación 1 (EF-1) con 1 U de la Taq DNA polimerasa (Gibco) en un volumen total de 50 \mul. El EF-1 sirvió de patrón interno para la PCR. Los productos de la PCR se separaron en geles de agarosa al 1,5% que contenían 0,1% de bromuro de etidio, y la intensidad de las bandas se determinó densitométricamente con un sistema de cámaras CCD y el software One-Dscan para el análisis del gel de Scanalytics (Billerica, MA, EE.UU.) para adaptar el volumen del ADNc en el análisis de PCR posteriores.

Todas las reacciones de PCR se realizaron individualmente para cada pareja de cebadores en un termociclador Hybaid OmnE (AWG; Heidelberg, Alemania). Las condiciones de PCR individuales para el ADNc de células endoteliales humanas del cordón umbilical fueron las siguientes: CD40 (tamaño del producto 381 pb, 25 ciclos, temperatura de adición 60ºC, (cebador directo) 5'-CAGAGTTCACTGAAACGGAATGCC-3' (SEC. ID. Nº: 44), (cebador inverso) 5'-TGCCTGCCTGTTGCACAACC-3' (SEC. ID. Nº: 45)); selectina E (tamaño del producto 304 pb, 33 ciclos, temperatura de adición 60ºC, (cebador directo) 5'-AGCAAGGCATGATGTTAACC-3' (SEC. ID. Nº: 46), (cebador inverso) 5'-GCATTCCTCTCTTCCAGAC-3' (SEC. ID. Nº: 47)); EF-1 (tamaño del producto 220 pb, 22 ciclos, temperatura de adición 55ºC, (cebador directo) 5'-TCTTAATCAGTGGTGGAAG-3' (SEC. ID. Nº: 48), (cebador inverso) 5'-TTTGGTCAAGTTGTTTCC-3' (SEC. ID. Nº: 49)); IL-12p40 (tamaño del producto 281 pb, 30 ciclos, temperatura de adición 62ºC, (cebador directo) 5'-GTACTCCACATTCCTACTTCTC-3' (SEC. ID. Nº: 50), (cebador inverso) 5'-TTTGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3' (SEC. ID. Nº: 51)); rp132 (tamaño del producto 368 pb, 20 ciclos, temperatura de adición 60ºC, (cebador directo) 5'-GTTCATCCGGCACCAGTCAG-3' (SEC. ID. Nº: 52), (cebador inverso) 5'-ACGTGCACATGAGCTGCCTAC-3' (SEC. ID. Nº: 53)); MCP-1 (tamaño del producto 330 pb, 22 ciclos, temperatura de adición 63ºC, (cebador directo) 5'-GCGGATCCCCTCCAGCATGAAAGTCTCT-3' (SEC. ID. Nº: 54), (cebador inverso) 5'-ACGAATTCTTGGGTTGTGGAGTGAG-3' (SEC. ID. Nº: 55)).

3. Ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)

Los extractos nucleares y los oligonucleótidos consenso de cadena doble marcados con [^{32}P] (Santa Cruz Biotechnologie, Heidelberg, Alemania), la electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, la autorradiografía y el análisis de superdesplazamiento se realizaron según se describe en Krzesz y col. (1999) FEBS Lett. 453, 191. Se usó un oligonucleótido de ADN de cadena doble con la siguiente secuencia de la cadena sencilla (la secuencia de unión al núcleo está subrayada): SIE, 5'-GTGCATTTCCCGTAAATCTTGTC-3' (SEC. ID. Nº:56). Para el análisis del desplazamiento de STAT-1 endógeno en los extractos nucleares de células THP-1 estimuladas con citocinas (línea celular premonocítica humana) por los diferentes elementos cis señuelo se eligió en la preparación de unión para EMSA una relación de 30:1 (elemento cis señuelo de STAT-1:oligonucleótido SIE marcado con [^{32}P] (11 fmol)).

4. Técnica del oligonucleótido señuelo

Los oligonucleótidos señuelo de cadena doble se prepararon a partir de los oligonucleótidos complementarios de cadena sencilla unidos por tioato de fósforo (Eurogentec, Colonia, Alemania) como se describe en Krzesz y col. (1999) FEBS Lett. 453, 191. Las células endoteliales humanas en cultivo se preincubaron durante 4 horas a una concentración de 10 \muM del oligonucleótido señuelo correspondiente. Éstas eran las condiciones que se optimizaron previamente mediante EMSA y el análisis por RT-PCR. Después, generalmente se sustituyó el medio que contenía el oligonucleótido señuelo por medio reciente. Las secuencias de cadena sencilla de los oligonucleótidos fueron las siguientes (las letras subrayadas indican las bases unidas por tioato de fósforo, todas en sentido 5'-3'):

GATA-2,

\hskip0,5cm

CACTTGATAACAGAAAGTGATAACTCT (SEC. ID. Nº: 57)

NF-\kappaB,

\hskip0,5cm

AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC (SEC. ID. Nº: 58);

STAT-1,

\hskip0,5cm

CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTC (SEC. ID. Nº: 33);

STAT-1-19mut,

\hskip0,5cm

GACAGTGCAGTGAACTGTC (SEC. ID. Nº: 59);

STAT-1-25mut,

\hskip0,5cm

CATGTTATGCAGACCGTAGTAAGTG (SEC. ID. Nº: 60). 5. Técnica del oligonucleótido antisentido (ODN)

Para una preparación antisentido se añadieron 15 \mul de lipofectina (Gibco Life Technologie, Karlsruhe, Alemania) a 100 \mul de medio de cultivo OPTI-MEM® y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente (TA) (solución A). A continuación se añadió el ODN antisentido (Eurogentec, Colonia, Alemania) a 100 \mul de medio de cultivo OPTI-MEM® en una concentración final de 0,5 \muM (solución B). Tras combinar las soluciones A y B siguió otra incubación durante 15 minutos (TA). Al comienzo del ensayo se añadieron 0,8 ml del medio de cultivo celular convencional para el cultivo de células endoteliales (sin heparina ni factor de crecimiento endotelial) al tubo Eppendorf que contenía los complejos lipofectina/ODN antisentido, y el medio de cultivo celular para el cultivo de células endoteliales se sustituyó por el medio de antisentido/lipofectina. Después de 4 horas se retiró el medio de antisentido/lipofectina y se sustituyó por medio de cultivo celular reciente (con heparina y factor de crecimiento endotelial). La secuencia del ODN antisentido de STAT-1 era 5'T*A*CCA*C*T*G*A*G*A*C*A^{*} T*CC*T*GCC*A*C-3' (* base modificada con fosforotioato; SEC. ID. Nº: 41).

6. Análisis por transferencia Western

Las células endoteliales humanas del cordón umbilical y las células de músculo liso de la vena tímica se disgregaron congelando en nitrógeno líquido y descongelando a 37ºC cinco veces seguidas (elemento de calentamiento, Kleinfelden). Se prepararon extractos de proteína según se describe en Hecker y col. (1994) Biochem. J. 299, 247. Se separaron 20 a 30 \mug de proteína con la ayuda de una electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes y en presencia de SDS según el protocolo convencional y se transfirieron a una membrana de transferencia de fluoruro de polivinilideno BioTrace^{TM} (Pall Corporation, Rossdorf, Alemania). Para la detección inmunológica de las proteínas se usaron los siguientes anticuerpos primarios: proteína CD40 (policlonal, dilución 1:2.000, Research Diagnostics Inc. Flanders NJ, EE.UU.), proteína STAT-1 (monoclonal, dilución 1:5.000, BD Transduction Laboratories, Heidelberg, Alemania), proteína IRL-1 (policlonal, dilución 1:2.000, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania), proteína iNOS (policlonal, dilución 1:3.000, BD Transduction Laboratories, Heidelberg, Alemania). Las bandas de proteína se detectaron tras la adición de un anti-IgG de conejo acoplado a peroxidasa o, cuando se usó el anticuerpo primario monoclonal, mediante un anti-IgG de ratón correspondiente (1:3.000, Sigma, Deisenhofen, Alemania) con la ayuda del procedimiento de quimiluminiscencia (sustrato de quimiluminiscencia SuperSignal, Pierce Chemical, Rockford, IL, EE.UU.) y autorradiografía siguiente (Hyperfilm^{TM} MP, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra). La aplicación y transferencia de cantidades de proteína iguales se mostró, después de "remojar" la membrana de transferencia (5 minutos en NaOH 0,2 N, después lavado 3x10 minutos con H_{2}O), mediante la detección de bandas de proteína iguales de actina \beta con un anticuerpo primario monoclonal y un anti-IgG de ratón acoplado a peroxidasa (ambos de Sigma-Aldrich, dilución 1:3.000).

7. Análisis estadístico

Salvo que se indique lo contrario, todos los datos en las figuras y en el texto se dan como valor medio \pm SEM de n experimentos. La valoración estadística se realizó con el test t de Student para datos no apareados con un valor P<0,05, que se consideró estadísticamente significativo.

8. Detección del efecto del oligonucleótido señuelo en experimentos con animales 8.1. Ratón

Para determinar la eficacia de la estrategia terapéutica basada en oligonucleótidos señuelo desarrollada en la presente solicitud, se realizó para la indicación de artritis inducida por antígeno un estudio de prueba de concepto experimental con animales en ratón, con 8 a 10 animales por grupo (modelo véase Henzgen y col., Exp. Toxicol. Pathol. (1996), 48, 255). Una administración única de 0,25 nmoles del oligonucleótido señuelo de STAT-1 (SEC. ID. Nº: 33) directamente en la articulación (inyección intraarticular) redujo muy significativamente, en un periodo de tiempo de 3 a 14 días, la hinchazón de la articulación inducida por antígeno (en un 35%), la intensidad de la reacción inflamatoria (en un 70%), la destrucción de la articulación (en un 80%), la puntuación total de la artritis (en un 70%) y la concentración de citocinas proinflamatorias en el suero (por ejemplo, interleucina-6 en un 80%). El oligonucleótido control correspondiente, en cambio, no presentó ningún efecto terapéutico.

Además, cabe señalar en este estudio que la dermatitis de contacto provocada en la piel 14 días después de la inducción de la artritis (reacción de tipo IV) - el antígeno se inyecta otra vez en los animales por vía subcutánea - también estaba inhibida muy significativamente en los ratones tratados con el oligonucleótido señuelo (en un 35%).

8.2. Cobayas

Tras una doble sensibilización de las cobayas (Hartley, macho, peso corporal 350 g) durante un periodo de tiempo de 7 días (día 1 en una oreja, día 2 en la otra oreja con 50 \mul cada vez de una solución de DNCB al 10% en 50% de acetona/50% de aceite de oliva; día 7 refuerzo en la piel de la nuca con 15 \mul de una solución de DNCB al 2% en 95% de acetona/5% de aceite de oliva) se provoca en el día 13 la dermatitis de contacto mediante una nueva administración de 2,4-dinitroclorobenceno (DNCB; 10 \mul de una solución al 0,5% de DNCB en 95% de acetona/5% de aceite de oliva) sobre una o varias áreas de aproximadamente 1 cm^{2} de la espalda afeitada de los animales y 24 horas después se valora macroscópica e histológicamente. La dermatitis de contacto así inducida se caracteriza histológicamente (tinción Giemsa) por una pronunciada formación de edemas y espongiosis en la zona de la epidermis, un aumento de células apoptóticas, así como por una masiva infiltración de leucocitos (Figura 8). La administración intradérmica de un oligonucleótido señuelo de STAT-1 (SEC. ID. Nº: 19), pero no la de un oligonucleótido control mutado (5'-TGTGGACCGTAGGAAGTG-3', SEC. ID. Nº: 61), 1 hora antes de la exposición final a DNCB condujo a una clara reducción de los parámetros histológicos mencionados, es decir, en total a una disminución significativa de la reacción inflamatoria.

<110> Avontec GmbH

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<120> Inhibición

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<130> HEC-004 PCT

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<140> desconocido

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<141> 2002-10-02

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<150> DE 101 48 886.6

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<151> 2001-10-04

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 61

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 11

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<221> misc-feature

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<220>

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<223> g,a,c or t

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nttncbgdaa n

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11

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<210> 2

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<211> 11

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<222> (11)..(11)

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<223> g,a,c or t

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ntthcvgnaa n

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11

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<212> ADN

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<212> ADN

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attccggtaa g

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<211> 11

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<212> ADN

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<213> Artificial

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cttacaggaa t

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<210> 11

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<211> 11

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<212> ADN

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gttccaggaa c

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttcctggaa c

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttcccggaa g

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttccgggaa c

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttccgggaa c

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttcccggaa c

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgaattac cggaagtgag a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctcacttcc ggtaattcac a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgaattac cggaagtg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacttccggt aattcaca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtcagttcc aggaactgac t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtcagttcc tggaactgac t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211>23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtgagttc ccggaagtga act

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agttcacttc cgggaactca cat

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211>18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagttccgg gaactgtc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacagttccc ggaactga

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacagttccg ggaactgtc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacagttccc ggaactgtc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211>18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgtattccg gtaagtga

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcacttaccg gaatacac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatgtgaat tcctggaagt g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacttccagg aattcacata a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgttatgc atattcctgt aagtg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacttacagg aatatgcata acatg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgaattcc tgtaagtgag a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctcacttac aggaattcac a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcatattcc tgtaagtg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacttacagg aatatgca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atattcctgt aagtg

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacttacagg aatat

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211>22

\vskip0.400000\baselineskip

<212>ADN/ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taccactgag acatcctgcc ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN/ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacatcattg gcacgcag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN/ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgaacctgc tccag

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN/ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagagttcac tgaaacggaa tgcc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcctgcctg ttgcacaacc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcaaggcat gatgttaacc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcattcctct cttccagagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcttaatcag tggtggaag

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttggtcaag ttgtttcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtactccaca ttcctacttc tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211>22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttgggtcta ttccgttgtg tc

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212>ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttcatccgg caccagtcag

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgtgcacat gagctgccta c

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcggatcccc tccagcatga aagtctct

\hfill

28

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<210> 55

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgaattctt cttgggttgt ggagtgag

\hfill

28

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcatttcc cgtaaatctt gtc

\hfill

23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacttgataa cagaaagtga taactct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agttgagggg actttcccag gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<219> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

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\vskip0.400000\baselineskip

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gacagtgcag tgaactgtc

\hfill

19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgttatgc agaccgtagt aagtg

\hfill

25

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtggaccgt aggaagtg

\hfill

18

Claims (1)

1. Uso de oligonucleótidos de ADN de cadena doble, oligonucleótidos antisentido de cadena sencilla, vectores de expresión antisentido u oligonucleótidos de interferencia de ARN de cadena doble para la inhibición de la actividad de STAT-1 para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de complicaciones cardiovasculares, tales como la reestenosis después de una angioplastia percutánea o la estenosis de derivaciones venosas, la reacción del injerto frente al huésped, el daño por isquemia-reperfusión en operaciones quirúrgicas o trasplante de órganos, reacciones inmunológicas de hipersensibilidad, especialmente la rinitis alérgica, las alergias a medicamentos y alimentos, especialmente urticaria y celiaquía (esprúe), el eccema de contacto y las enfermedades del complejo inmune, especialmente alveolitis, artritis, glomerulonefritis y vasculitis alérgica, enfermedades inflamatorias de cartílago y hueso, especialmente artrosis, gota, ostitis y osteomielitis, la polineuritis, así como enfermedades inflamatorias agudas o subagudas causadas por infección y, especialmente, postinfecciosas, especialmente bronquitis, endocarditis, hepatitis, miocarditis, nefritis, pericarditis, peritonitis y pancreatitis, incluido el choque séptico.