ES2237800T3

ES2237800T3 - Identificacion de genes del citomegalovirus humano implicados en la retro-regulacion de la expresion de las cadenas pesadas de la clase i del cmh.

Info

Publication number: ES2237800T3
Application number: ES97936334T
Authority: ES
Inventors: Klaus Frueh; Young Yang; Kwangseog Ahn
Original assignee: Ortho McNeil Pharmaceutical Inc
Current assignee: Janssen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-07-31
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2017-07-31
Also published as: AU730351B2; ATE288764T1; US6033671A; DE69732498T2; EP0966301B1; PT966301E; AU3903297A; WO1998004285A1; DE69732498D1; EP0966301A4; EP0966301A1

Abstract

LA REGION GENOMICA US DEL CITOMEGALOVIRUS HUMANO CODIFICA UNA FAMILIA DE GENES HOMOLOGOS ESENCIAL PARA LA INHIBICION DE LA PRESENTACION DEL ANTIGENO INDUCIDO POR EL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD DE CLASE I (MHC) OBSERVADO EN INFECCIONES VIRALES. AQUI SE MUESTRA QUE US3 Y US6 CODIFICAN GLICOPROTEINAS RESIDENTES EN ER QUE EVITAN EL TRANSPORTE INTRACELULAR DE LAS MOLECULAS DE CLASE I DEL MHC POR MEDIO DE DIFERENTES MECANISMOS. US3 RETIENE LOS HETERODIMEROS ESTABLES DE CLASE I DEL CMH EN ER QUE SE CARGAN CON PEPTIDOS MIENTRAS QUE ESTAN RETENIDOS EN EL ER. US6 EVITA EL ENSAMBLAJE DE LAS MOLECULAS DE CLASE I DEL MHC CON LA MICROGLOBULINA BE 2 LO QUE DA COMO RESULTADO QUE LAS CADENAS PESADAS LIBRES DEJAN EL ER. ESTOS GENES TIENEN UN GRAN POTENCIAL PARA EVITAR LAS REACTIVIDADES INMUNOLOGICAS NO DESEADAS DESENCADENADAS POR LAS MOLECULAS DE CLASE I DEL MHC.

Description

Identificación de genes del citomegalovirus humano implicado en la retro-regulación de la expresión de las cadenas pesadas de la clase I del CMH.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con genes de citomegalovirus humanos ("HCMV") recombinantes cuyas proteínas codificadas regulan decrecientemente la expresión de las cadenas pesadas de la clase I del MHC celular.

Antecedentes de la invención

El citomegalovirus humano (HCMV) es un beta-herpesvirus que causa una enfermedad clínicamente grave en adultos inmunocomprometidos e inmunosuprimidos, así como en algunos niños infectados in utero o perinatalmente (Alford, C.A. y W.J. Britt, 1990, Cytomegalovirus, pp. 1981-2010, en D.M. Knipe y B.N. Fields (ed.), Virology, 2ª ed., Raven Press, New York). En células infectadas con citomegalovirus humano (HCMV), la expresión de las cadenas pesadas de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad ("MHC") celular es regulada decrecientemente. Se secuenció el genoma de ADNdh de 230 kb de HCMV (Chee, M.S., A.T. Bankier, S. Beck, R. Bohni, C.M. Brown, R. Cerny, T. Horsnell, C.A. Hutchinson, T. Kouzarides, J.A. Martignetti, E. Preddie, S.C. Satchwell, P. Tomlinson, K. Weston y B.G. Barrell, 1990, Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD 1 69, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154: 125-169) y tiene al menos 200 marcos abiertos de lectura ("ORF"). Se desconocen las funciones de la mayoría de estos 200 genes. Se conoce o se ha predicho la función de algunas proteínas HCMV debido a su homología con otras proteínas víricas (especialmente de virus herpes simplex) y celulares. Sin embargo, para la mayoría de los ORF HCMV, las funciones de las proteínas que codifican son desconocidas.

Diversos investigadores han mostrado que la infección por HCMV da lugar a la regulación decreciente de las cadenas pesadas de la clase I del MHC celular (Browne, H., M. Churcher y T. Minson, 1992, Construction and characterization of a human cytomegalovirus mutant with the UL18 (class I homolog) gene deleted, J. Virol. 66: 6784-6787; Beersma, M.F.C., M.J.E. Bijlmakers y H.L. Ploegh, 1993, Human cytomegalovirus down-regulates HLA class I expression by reducing the stability of class I H chains, J. Immunol. 151: 4455-4464; Yamashita, Y., K. Shimokata, S. Mizuno, H. Yamaguchi e Y. Nishiyama, 1993, Down-regulation of the surface expression of class I MHC antigens by human cytomegalovirus, Virology 193: 727-736). Se define la regulación decreciente como reducción en la síntesis, en la estabilidad o en la expresión superficial en superficie de las cadenas pesadas de la clase I del MHC. Dicho fenómeno ha sido descrito para algunos otros virus ADN, incluyendo adenovirus, citomegalovirus murinos y virus herpes simplex (Anderson, M., S. Paabo, T. Nilsson y P.A. Peterson, 1985, Impaired intracellular transport of class I MHC antigens as a possible means for adenoviruses to evade immune surveillance, Cell 43: 215-222; Burgert y Kvist, 1985, Cell, 41: 987-997; del Val, M., K. Munch, M. Reddehasse y U. Koszinowski, 1989, Presentation of CMV immediate-early antigen to cytotoxic T lymphocytes is selectively prevented by viral genes expressed in the early phase, Cell 58: 305-315; Campbell, A.E., J.S. Slater, V.J. Cavanaugh y R.M. Stenberg, 1992, An early event in murine cytomegalovirus replication inhibits presentation of cellular antigens to cytotoxic T lymphocytes, J. Virol. 66: 3011-3017; Camp-bell, A.E., J.S. Slater, 1994, Down-regulation of major histocompatibility complex class I synthesis by murine cytomegalovirus early gene expression, J. Virol. 68: 1805-1811; York, I.A., C. Roop, D.W. Andrews, S.R. Riddell, F.L. Graham y D.C. Johnson, 1994, A cytosolic herpes simplex virus protein inhibits antigen presentation to CD8 + T lymphocytes, Cell 77: 525-535). En los sistemas de los adenovirus y de los virus herpes simplex, el producto de un gen vírico que no es indispensable para la replicación in vitro es suficiente para causar la regulación decreciente de las cadenas pesadas de la clase I del MHC (Anderson, M., S. Paabo, T. Nilsson y P.A. Peterson, 1985, Impaired intracellular transport of class I MHC antigens as a possible means for adenoviruses to evade immune surveillance, Cell 43: 215-222; Burgert y Kvist, 1985, antes citado). WO 96/04383 describe mutantes de HCMV que no regulan decrecientemente la expresión de la cadena pesada de la clase I del MHC. El/los gen(es) implicado(s) en la regulación decreciente de las cadenas pesadas de la clase I por el citomegalovirus murino no han sido identificados hasta la fecha.

El HCMV causa infecciones benignas, pero persistentes, en individuos inmunocompetentes, que implican un equilibrio entre el control inmune del virus y su escape inmune (Rinaldo, C.R. (1990), Annu. Rev. Med. 41, 331-338). Las células T citotóxicas juegan un papel fundamental en la defensa inmune frente a la mayoría de los virus, ya que las células infectadas pueden lisarse al acoplarse los receptores de las células con las moléculas de la clase I del MHC que presentan péptidos derivados de virus (Townsend, A. y Bodmer, H. (1989), Ann. Rev. Liiiitiui ol. 7, 601-624). Sin embargo, la infección por HCMV evita que las células T reconozcan antígenos víricos o autoantígenos si se sintetizan dentro de la célula, pero no si se da el epitopo específico como un péptido (Hengel, H., Esslin-er, C., Pool, J., Goulmy, E. y Koszlnowski, U.H.(1995), J. Gen. Virol. 76, 2987-2997), lo que es consistente con la interferencia del HCMV con el conjunto de la clase I del MHC y un transporte peptídico. En células no infectadas, las cadenas pesadas (CP) de la clase I del MHC recién sintetizadas se asocian con la \beta2-microglobulina (\beta2m) en el retículo endoplásmico. A continuación, los heterodímeros se asocian con TAP, un transportador peptídico dirigido por ATP, y adquieren péptidos de 8-10 aminoácidos de longitud importados del citosol (Heemels, M.-T. y Ploegh, H. (1995), Ann. Rev. Biochem. 64, 463-491). El complejo trimérico es entonces transportado a la superficie celular siempre que los péptidos se unan con suficiente afinidad. Por el contrario, las CP se degradan selectivamente inmediatamente después de la síntesis en células infectadas por HCMV (Warren, A.P., Ducroq, D.H., Lehner, P.J. y Borysiewicz, L.K. (1994), J. Virol. 68, 1822-2829; Yamashita, Y., Shimokata, K., Saga, S., Mizuno, S., Tsurumi, T. y Nishiyama, Y. (1994), J. Virol. 68, 7933-7943; Beersma, M.F.C., Bijlmakers, M.J.E. y Ploegh, H. (1993), J. Iinm tiol. 151, 4455-4464). El análisis de deleciones ha revelado que al menos dos loci dentro de la región US prescindible para el crecimiento del genoma de HCMV median en dicha degradación independientemente (Jones, T.R., Hanson, L.K., Sun, L., Slater, J.S., Stenberg, R.M. y Campbell, A.E. (1995), Journal of Virology 69, 4830-41). Se identificó uno de los genes responsables como US 11, ya que los transfectantes US11 reproducían fielmente la degradación vírica de las CP. Es interesante el hecho de que las CP parecen ser exportadas al citosol para su degradación en transfectantes US11 (Wiertz, E.J.H.J., Jones, T.R., Sun, L., Bogyo, M., Geuze, H.J. y Ploegh, H.L. (1996), Cell 84, 769-779).

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método de control de la regulación decreciente de la expresión de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en una célula infectada por citomegalovirus que utiliza los genes US3 y/o US6 recombinantes o sus productos proteicos del citomegalovirus humano.

La presente invención también proporciona una vacuna que utiliza los genes de citomegalovirus humano mutante recombinante o sus productos proteicos, así como un método de inmunización de un individuo frente a citomegalovirus que emplea el citomegalovirus humano mutante recombinante. Un marco abierto de lectura de vacuna de HCMV viva atenuada US3 y/o US6 provocará una mejor respuesta inmune que uno que contenga esta región génica, en base a la falta de regulación decreciente de la clase I por parte del primero. Por lo tanto, un virus que carezca de esta región es un inmunógeno superior.

La presente invención proporciona también un método de prevención o reducción de la susceptibilidad al citomegalovirus agudo en un individuo administrando una cantidad inmunogénica del gen, de los productos génicos y/o del citomegalovirus humano mutante recombinante.

La presente invención proporciona también un vector de terapia génica en donde se puede incorporar el marco abierto de lectura US3 y/o US6 del gen del HCMV implicado en la regulación decreciente de las cadenas pesadas de la clase I del MHC a vectores adenovíricos o vectores de terapia génica basados en virus similares para minimizar la respuesta inmune. Esto permitirá utilizar adenovirus recombinantes o vectores de terapia génica basados en virus similares para uso en terapia génica.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Cuatro genes US evitan la expresión superficial de la clase I del MHC independientemente. Se analizó la expresión superficial de heterodímeros de la clase I del MHC reactivos con W6/32 o de transferrina por FACS 72 horas tras la transfección con los genes US indicados. Las líneas discontinuas son de transfecciones no inducidas (+ tetraciclina). Las líneas continuas son de transfecciones inducidas durante 48 horas.

Figura 2, Paneles A y B: Transporte intracelular del receptor de transferrina y de la clase I del MHC en células HeLa transfectadas con US3 y US11. Panel A) Se cultivaron células HeLa establemente transfectadas o no transfectadas que contenían el transactivador regulable por tet (Gossen, M. y Bujard, H. (1992), Proc. Natl. Acad. USA 89, 5547-5551) durante 24 horas en ausencia de tetraciclina para inducir la expresión de US3 y US11 y se marcaron biosintéticamente durante 15 minutos (bandas con números impares), seguido de 30 minutos de rastreo (bandas con números pares). Se inmunoprecipitaron los lisados con anticuerpo anti-receptor de transferrina (bandas 1, 2, 5, 6, 9 y 10) o antisuero anti-clase I del MHC K455 (bandas 3, 4, 7, 8, 11 y 12). Se indica el tamaño del patrón de peso molecular en kDa. Panel B) No se trataron los inmunoprecipitados de la clase I del MHC de células HeLa no transfectadas o transfectadas con US3 biosintéticamente marcadas como antes (bandas con números impares) o se trataron con EndoH (bandas con números pares) antes de la SDS-PAGE. (EndoHs, EndoHr indica CP sensibles o resistentes a EndoH, respectivamente). Los inmunoprecipitados de las bandas 1, 2, 5 y 6 fueron sólo marcados con pulsos, mientras que las bandas 3, 4, 7 y 8 corresponden a un rastreo de 30 minutos. Sólo se muestra la parte del gel que exhibe la CP.

Figura 3: US3, pero no US11, coinmunoprecipita con la clase I del MHC. Las líneas celulares indicadas fueron cultivadas en ausencia de tetraciclina durante 24 horas antes de marcar durante 30 minutos y de lisar en digitonina al 1%. Los anticuerpos específicos para la clase I del MHC usados para las inmunoprecipitaciones fueron K355 (bandas 1, 5, 6, 11 y 12) y K455 (bandas 2, 7, 8, 13 y 14). Se obtuvieron resultados similares usando los anticuerpos W6/32 y BBM.1. Se inmunoprecipitaron US3 y US11 usando anti-US3-N (bandas 3, 9 y 10) y anti-US11-N (bandas 4, 15 y 16). Se trataron las bandas 6, 8, 10, 12, 14 y 16 con EndoH antes de la SDS-PAGE. Las bandas 1-4 eran de un gel diferente. A la derecha de (>), es aparente una proteína débil sensible a EndoH que se corresponde en tamaño a US11. (*) marca un producto de ayustamiento alternativo putativo de US3. El peso molecular para US3 y US11 glicosilados era de 22 kDa y de 28,5 kDa, respectivamente, y, después del tratamiento con endoH, de 19 kDa y de 25 kDa, respectivamente.

Figura 4, Paneles A y B: Termoestabilidad de moléculas de la clase I del MHC retenidas con US3. Panel A) Se indujeron células HeLa no transfectadas, transfectadas con US3 o transfectadas con ICP47 (Friih, K., Ahn, K., Djaballah, H., Semp6, P., van Endert, P.M., Tamp6, R., Peterson, P.A. y Yang, Y. (1995), Nature 375, 415-418) por eliminación de la tetraciclina durante 24 horas antes de marcar durante 15 minutos, seguido de los tiempos de rastreo indicados. Se mantuvieron los lisados en NP40 al 1% a 40ºC o se incubaron durante 1 hora a 37ºC antes de la inmunoprecipitación con W6/32. Obsérvese que las moléculas de la clase I del MHC en células HeLa migran más lentamente tras el rastreo debido a modificaciones de carbohidratos en el Golgi (véase la Fig. 1). Los lisados de células transfectadas con ICP47 contienen moléculas de la clase I del MHC tanto retenidas en el RE como expresadas en superficie, pero ambas poblaciones son inestables, lo que indica falta de péptidos estabilizantes (las bandas 17 y 18 son de un gel diferente). Panel B) Se muestra la razón de \beta2m coprecipitado por W6/32 tras estímulo de temperatura para cada punto temporal. Los puntos de datos son la media de tres experimentos (\pm desviación estándar).

Figura 5: Hay ausencia de heterodímeros de la clase I del MHC, pero no de cadenas pesadas libres, en transfectantes US6. Análisis de pulsos/rastreo de células HeLa o de células HeLa transfectadas con US6 inducidas durante 48 horas por eliminación de la tetraciclina. Se marcaron las células durante 15 minutos y se cazó el marcaje durante 0, 15, 40 y 75 minutos. Se detectaron los heterodímeros con mab W6/32, cantidad total de moléculas de la clase I del MHC con antisuero K455 y cadenas pesadas libres con mab HC10 según se indica. Antes de la SDS-PAGE, todas las muestras fueron tratadas con EndoH.

Figura 6: Se muestra la translocación peptídica en células HeLa transfectadas con US. Se midió la translocación del péptido yodado RYNATGRL en el RE de células HtTa no transfectadas o establemente transfectadas con US3 (Ahn y col., 1996a), US11 (Ahn y col., 1996a), ICP47 (Früh y col., 1995) o US6 tras haber eliminado la tetraciclina durante 24 horas (-tet) para inducir la expresión. Se activaron 0,15 U de estreptolisina O (Murex) durante 10 min. a 37ºC en 100 \mul de tampón de ensayo de transporte (Neefjes y col., 1993) que contenía 4 mM de DTT y 10 mM de ATP fresco. Se resuspendieron células HeLa transfectadas o no transfectadas (2x10^{6}) en esta solución y, después de añadir 2x10^{6} cpm de RYNATGRL marcado, se incubaron las células a 37ºC durante 25 min. Se realizó la precipitación con ConA según se ha descrito (Neefjes y col., 1993). Como control, no se añadió ATP y se eliminó el ATP residual por medio de Apirasa en células HtTa no transfectadas antes de medir el transporte peptídico. Se presentan los resultados como la media de experimentos por duplicado (\pm desviación estándar).

Figura 7: US6 es responsable de la inhibición de TAP durante la infección por HCMV. Se midió la translocación de una librería de péptidos informadores en células HFF infectadas con mutantes de HCMV que contenían deleciones de múltiples genes en la región IRS1-US11 (A) o sólo con deleción de US6 (B). Se realizaron ensayos de transporte peptídico según se ha descrito en la sección de materiales y métodos. Como control, se midió la recuperación de péptidos después de 0 min. de incubación o después de añadir sICP47. Los mutantes de HCMV IRS1-US6, US2-US11 y US6-US11, así como US6, han sido descritos previamente (Jones y col., 1995).

Figura 8: Localización subcelular de US6. Se transfectaron transitoriamente células HtTa con US6 y se cultivaron en ausencia de tetraciclina durante 48 h. Se visualizó US6 usando anti-US6N y conjugado de cabra-anti-conejo-rodamina (Cappel). Se tiñó la calnexina con AF8 (Sugita y Brenner, 1994) y se visualizó con cabra-anti-ratón-FITC (Cappel). Las células no transfectadas que expresan calnexina, pero no US6, están indicadas por flechas. Se fotografió el mismo campo microscópico a las longitudes de onda de excitación de la rodamina (panel superior), de la fluoresceína (panel inferior) o de ambas (panel central).

Figura 9: El dominio luminal de US6 es suficiente para la retención en el RE y se muestra la regulación decreciente de la clase I del MHC. Se transfectaron transitoriamente células HtTa con las construcciones indicadas en ausencia de tetraciclina. A las 36 h de la transfección, se monitorizó la expresión superficial de la clase I del MHC por citofluorometría usando mab W6/32. Los resultados están representados gráficamente en el panel de la izquierda como el número de células frente a la fluorescencia media (escala log). El panel de la derecha muestra los derivados de US6 inmunoprecipitados con anti-US6N de lisados NP40 de células HtTa transfectadas transitoriamente marcadas durante 30 min. (bandas 1 y 2) y rastreadas durante 4 h (bandas 3 y 4). Las bandas 2 y 4 fueron tratadas con EndoH antes de la SDS-PAGE. El panel superior de la derecha fue inmunoprecipitado con anti-CD8 y el resto de las inmunoprecipitaciones fueron llevadas a cabo con anti-US6N. El transporte intracelular de CD8 está indicado por el cambio de peso molecular debido a la adición de ácido siálico. Como CD8 no contiene carbohidratos ligados a N, no resulta afectado por EndoH. En comparación con las células HtTa no transfectadas, la actividad de transporte de péptidos se redujo entre un 50 y un 63% en todos los transfectantes, excepto para CD8-US6, donde no se observó
reducción.

Figura 10: El dominio luminal de US6 interacciona con TAP. No se transfectaron células HtTa (banda 1) o se transfectaron con CD4E19.pCMUII (Jackson y col., 1990) (banda 2) o pUHG10.3-US6E19 (bandas 3-7). A los dos días de la transfección, se marcaron las células metabólicamente durante 16 h y se solubilizaron las proteínas en digitonina al 1% y se inmunoprecipitaron con antisuero anti-TAP1 (banda 1) o anti-E19 (Nilsson y col., 1989) (bandas 2-7) y se separaron en SDS-PAGE (bandas 1-7). Se disolvió una fracción del precipitado anti-E19 de células transfectadas con US6-E19 en SDS al 1% y se volvió a precipitar con anti-TAP1 (banda 8), anti-TAP2 (banda 9), K455 (13) (anti-clase I (Andersson y col., 1985)) (banda 10) o anti-US6N (banda 11). (Las bandas 1-7 y 8-11 son de diferentes geles, por ello la movilidad ligeramente diferente de \beta2m). Antes de la inmunoprecipitación, se cultivaron las células durante 24 h sin tetraciclina (bandas 1-3) o con 0,0001, 0,001, 0,01 ó 0,1 \mug/ml de tetraciclina (bandas 4-7) para conseguir reducir los niveles de expresión de US6E19. Las proteínas que son parte del complejo TAP/clase I, así como CD4E19, están indicadas a la izquierda. El resto de las bandas proteicas inmunoprecipitan de manera no específica, ya que están presentes en todas las precipitaciones. Las células fueron tratadas durante 24 h con interferon-g (1.000 U/ml) antes del marcaje para aumentar la expresión de TAP.

Figura 11: Unión peptídica a TAP en células HeLa transfectadas con US6. Se cultivaron células HtTa no transfectadas o células HtTa transfectadas con US6 ó ICP47 en presencia o ausencia de tetraciclina antes de la permeabilización con SLO y de la incubación con el péptido fotorreactivo KYWANATRSGL junto con 1 \muM de His-ICP47 recombinante purificado, según se ha descrito (Ahn y col., 1996b). Tras entrecruzamiento UV, se precipitaron las moléculas de TAP heterodiméricas con antisuero anti-TAP1 y se separaron en SDS-PAGE. Se indica la posición relativa de TAP1 y TAP2.

Descripción detallada de la invención

La subregión del genoma de HCMV que contiene los ORF US2-US5 comprende las bases 193.119-195.607. Se ha propuesto que US2 y US3 codifican glicoproteínas de membrana (Chee, M.S., A.T. Bankier, S. Beck, R. Bohni, C.M. Brown, R. Cerny, T. Horsnell, C.A. Hutchinson, T. Kouzarides, J.A. Martignetti, E. Preddie, S.C. Satchwell, P. Tomlinson, K. Weston y B.G. Barrell, 1990, Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD 1 69, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154: 125-169). US3 es un gen ayustado diferencialmente que se expresa a través de todo el ciclo replicativo del virus y codifica una proteína con actividad trans-activante transcripcional (Tenney, D.J. y A.M. Colberg-Poley, 1991, Human cytomegalovirus UL3638 and US3 immediate-early genes: temporally regulated expression of nuclear, cytoplasmic and polysome-associated transcripts during infection, J. Virol. 65: 6724-6734; Colberg-Poley, A.M., L.D. Santomenna, P.P. Harlow, P.A. Benfield y D.J. Tenney, 1992, Human cytomegalovirus US3 and UL36-38 immediate-early proteins regulate gene expression, J. Virol. 66: 95-105; Tenney, D.J., L.D. Santomenna, K.B. Goudie y A.M. Colberg-Poley, 1993, The human cytomegalovirus US3 immediate-early protein lacking the putative transmembrane domain regulates gene expression, Nucl. Acids Res. 21: 2931-2937; Weston, K., 1988, An enhancer element in the short unique region of human cytomegalovirus regulates the production of a group of abundant immediate early transcripts, Virology 162: 406-416). También están presentes varios ORF más pequeños en esta subregión (entre los ORF US3 y US5), pero sus características de expresión o sus funciones no han sido descritas. Gretch, D.R. y M.F. Stinski, 1990 (Transcription of the human cytomegalovirus glycoprotein gene family in the short unique component of the viral genome, Virology 174: 522-532), describieron que hay un ARNm precoz de 1,0 kb transcrito a partir de esta región del genoma del HCMV, pero no se hizo su mapa con precisión. Se ha mostrado previamente que la expresión del gen US2 es suficiente para la regulación decreciente de la clase I del MHC en este locus (US2-US5).

Otra subregión del HCMV, que es también suficiente para la reducción de las cadenas pesadas de la clase I del MHC, contiene los genes US10 y US11, en las bases 199.083-200.360. Sin embargo, para el producto génico US10, la expresión de US10 no es suficiente para la regulación decreciente de la expresión de las cadenas pesadas. Se demuestra aquí que la expresión de US3 y US6 es suficiente para provocar la regulación decreciente de las cadenas pesadas de la clase I del MHC en células no infectadas establemente transfectadas en ausencia de otras proteínas del HCMV.

La expresión del ARN y de las proteínas de US11 comienza precozmente y procede a lo largo de todo el curso de la infección (Jones, T.R. y Muzithras, V.P. 1991, Fine mapping of transcripts expressed from the US6 gene family of human cytomegalovirus strain AD 169, J. Virol. 65: 2024-2036). US11 codifica una glicoproteína de 32 kDa (gpUS11) que tiene residuos de azúcar ligados a N que son sensibles a la endoglicosidasa H. Los experimentos de inmunofluorescencia muestran que gpUS11 no está presente sobre la superficie celular, pero se detecta en el citoplasma de células infectadas por HCMV. Así, gpUS11 se retiene en el retículo endoplásmico o en el cis-Golgi. Las características del gpUS11 de HCMV son similares a las de la glicoproteína de 25 kDa (E3-19K) codificada a partir de la región E3 del adenovirus tipo 2. Ad E3-19K no es esencial para la replicación del virus. Se ha visto que contiene residuos de azúcar ligados a N sensibles a la endoglicosadasa H, que se retiene en el retículo endoplásmico y que se une a las cadenas pesadas de la clase I del MHC, evitando así su transporte a la superficie celular 9 (Anderson, M., S. Paabo, T. Nilsson y P.A. Peterson, 1985, Impaired intracellular transport of class I MHC antigens as a possible means for adenoviruses to evade immune surveillance, Cell 43: 215-222; Burgert, H.G. y S. Kvist, 1985, An adenovirus type 2 glycoprotein blocks cell surface expression of human histocompatibility class I antigens, Cell 41: 987-997). Contrariamente a Ad E3-19K, no se detectó una asociación directa entre gpUS11 y las cadenas pesadas de la clase I (es decir, por coinmunoprecipitación).

La identificación de la región génica US2-US11 como la región del genoma de HCMV necesaria para la regulación decreciente de las cadenas pesadas de la clase I del MHC es significativa en varios sentidos. Como se ha mencionado anteriormente, la expresión de esta región del genoma a lo largo de todo el curso de la infección actúa interfiriendo con una respuesta inmune mediada por células efectiva. La expresión en superficie de las moléculas de la clase I del MHC es necesaria para la presentación del antígeno para activar y expandir las poblaciones de precursores de linfocitos T citotóxicos (LTC) (Schwartz, R.H., 1985, T lymphocyte recognition of antigen in association with gene products of the major histocompatibility complex, Ann. Rev. Immunol. 3: 237-261). Además, también se necesitan para el reconocimiento buscado por los LTC (Zinkernagel, R.M. y P.C. Doherty, 1980, MHC restricted cytotoxic T cells: studies on the biological role of polymorphic major transplantation antigens determining T cell restriction specificity, Adv. Immuno. 27: 51-177). En MCMV, los LTC contra la proteína mayor inmediata-precoz son protectores frente a la infección letal por este virus. Sin embargo, en individuos infectados por HCMV, la frecuencia de LTC contra la proteína inmediata-precoz, IEI, está descrita como extremadamente rara (Gilbert, M.J., S.R. Riddell, C-R. Li y P.D. Greenberg, 1993, Selective interference with class I major histocompatibility complex presentation of the major immediate-early protein following infection with human cytomegalovirus, J. Virol. 67: 3461-3469). Estudios recientes han mostrado que los péptidos EI son más eficientemente presentados por células infectadas con HCMV tratado con interferon \gamma que por células infectadas no tratadas (Gilbert, M.J., S.R. Riddell, C-R. Li y P.D. Greenberg, 1993, Selective interference with class I major histocompatibility complex presentation of the major immediate-early protein following infection with human cytomegalovirus, J. Virol. 67: 3461-3469). El interferon \gamma provoca una mayor expresión superficial de proteínas de la clase I del HCMV. Así, el aumento de la expresión de cadenas pesadas de la clase I en células infectadas por HCMV puede ser importante en la generación eficiente de LTC específicos para IE o de LTC contra otros antígenos importantes del HCMV. Un mutante HCMV suprimido de la región génica de US3 y/o US6 tendría este efecto, ya que las cadenas pesadas de la clase I no son reguladas decrecientemente cuando las células están infectadas con este mutante. Por lo tanto, una deleción de esta región del genoma vírico es importante en el desarrollo de una vacuna HCMV para inducir una respuesta inmune anti-HCMV efectiva.

La elucidación de los productos génicos US3 y US6 como suficientes para la regulación decreciente de la clase I es significativa por varias razones, en base al hecho de que las proteínas de la clase I median en la activación y el reconocimiento de células diana por linfocitos T citotóxicos, el participante primario en la respuesta inmune celular. US3 y US6, como genes o quizá como proteínas, pueden incorporarse a estrategias de tratamiento clínico cuando es indeseable la expresión de la clase I del MHC celular: vectores de terapia génica (por ejemplo, vectores adenovíricos) y para reducir el rechazo de aloinjertos. US3 y US6 pueden ser usados como herramientas para identificar otras proteínas celulares que pueden interaccionar con las cadenas pesadas de la clase I y así afectar a la estabilidad, el procesamiento y el transporte a la superficie celular de las proteínas de las cadenas pesadas de la clase I. En una estrategia de vacuna HCMV usando un virus vivo, la eliminación de US3 o de US6, o de ambos, puede dar un virus que es un mejor inmunógeno que un virus que contenga estos genes.

Se puede preparar una composición farmacéutica que contenga un mutante de HCMV recombinante en donde se ha suprimido la región del genoma de HCMV capaz de regular decrecientemente la expresión de la clase I del MHC en células infectadas. La región suprimida del genoma de HCMV es preferiblemente el marco abierto de lectura US3, US6 o ambos. Se puede utilizar un estabilizador u otro vehículo apropiado en la composición farmacéutica.

Como se ha discutido antes, el mutante de HCMV recombinante de la presente invención del que se ha suprimido una región del genoma de HCMV capaz de regular decrecientemente la expresión de la clase I del MHC puede ser usado en una vacuna para la prevención de las infecciones por citomegalovirus. La región suprimida del genoma del HCMV es preferiblemente el marco abierto de lectura US3, el US6 o ambos. La vacuna consiste en una cantidad efectiva del mutante de HCMV recombinante en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se puede añadir eventualmente un adyuvante a la vacuna.

Se puede desarrollar un método de inmunización de un individuo frente a citomegalovirus administrando al individuo una cantidad inmunogénica de un mutante de HCMV recombinante que esté desprovisto de la secuencia génica capaz de regular decrecientemente la expresión de la clase I del MHC. La secuencia génica que ha sido suprimida es preferiblemente la región que contiene el marco abierto de lectura US3, el US6 o ambos.

Se puede desarrollar un método de prevención o reducción de la susceptibilidad en un individuo al citomegalovirus agudo administrando al individuo una cantidad inmunogénica de un mutante de HCMV recombinante que esté desprovista de la secuencia génica capaz de regular decrecientemente la expresión de la clase I del MHC. La secuencia génica que ha sido suprimida es preferiblemente la región que contiene el marco abierto de lectura US3, el US6 o ambos.

La regulación decreciente de la expresión de la clase I del MHC en una célula infectada por citomegalovirus puede ser controlada por un método que consiste en las etapas de identificar una secuencia génica capaz de regular decrecientemente el complejo de histocompatibilidad mayor y de suprimir la secuencia génica identificada del genoma de citomegalovirus.

Como se ha discutido antes, la secuencia génica implicada en la regulación decreciente de las cadenas pesadas de la clase I del MHC puede ser incorporada a vectores adenovíricos o vectores de terapia génica basados en virus similares para minimizar la respuesta inmune y permitir el uso de los vectores en terapia génica. Un vector de terapia génica basado en virus consiste en la secuencia génica del marco abierto de lectura de US3. Otro vector de terapia génica basado en virus consiste en la secuencia génica del marco abierto de lectura de US6. Otro vector de terapia génica basado en virus consiste en las secuencias génicas de US3 y US6, respectivamente.

Con objeto de identificar otros genes inmunosupresores en la región US del HCMV, hemos clonado US2 a US11 y los hemos expresado en células HeLa. Demostramos aquí que cuatro genes, US2, US3, US6 y US11, son independientemente capaces de prevenir la expresión en superficie de las moléculas de la clase I del MHC. Mostramos además que US3 conserva las moléculas de la clase I del MHC en el RE, mientras que US6 previene la asociación de \beta2m con la cadena pesada.

Se facilitan los siguientes ejemplos para ilustrar la presente invención sin, no obstante, limitar la presente invención a ellos.

Ejemplo 1 Constructos de ADN

Se amplificaron genes codificantes para US2, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10 y US11 por reacción en cadena de polimerasa usando el cósmido genómico de HCMV pCM 1052 como plantilla (Fleckenstein, B., Muller, I. y Collins, J. (1982), Gene 18, 39-46). Todos los cebadores del extremo 5' contenían el sitio de restricción SacII CCGCGG, seguido de la secuencia CCACCATG, correspondiente a una señal consenso de iniciación (Kozak, M. (1984), Nucleic Acid Res. 12, 857-872). El codon de iniciación representaba los tres primeros nucleótidos de los marcos abiertos de lectura respectivos para todos los genes, excepto para US4, que no contiene un codon de iniciación por sí mismo. Los siguientes 20-30 nucleótidos que se hibridan al ADN US fueron sintetizados según la secuencia de HCMV (Chee, M.S., Bankier, A.T., Beck, S., Bohni, R., Brown, C.M., Cerny, R., Horsnell, T., Hutchinson 111, C.A., Kouzarides, T., Marti-netti, J.A., Preddle, E., Satchwell, S.C., Tomlinson, P., Weston, K.M. y Barrell, B.G. (1990), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154, 125-169) para todas las secuencias de US, excepto para US7, donde se introdujo una mutación silenciosa substituyendo la G de la posición 6 de la región codificante con una T para eliminar un sitio de reconocimiento Bam HI. Todos los cebadores 3' contenían los últimos 20 a 30 nucleótidos de las secuencias codificantes, seguido de un codon de parada y de un sitio de restricción Bam HI. Se insertaron fragmentos de ADN amplificado como Sac II/Bam HI en el vector de expresión inducible por tetraciclina pUHGIO-3 (Gossen, M. y Bujard, H. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5547-5551).

Transfecciones y líneas celulares estables

Se transfectaron células HeLa que contenían el transactivador regulable por tetraciclina (Gossen, antes citado) por el método del fosfato de calcio. Para establecer líneas celulares estables, se cotransfectaron construcciones pUHG.10-3.US con un plásmido que confería resistencia a la ouabaína (Yang, Y., Frueh, K., Ahn, K. y Peterson, P.A. (1995), J. Biol. Chem. 270, 27687-27694). Se seleccionaron clones estables en presencia de ouabaína (1 \muM) durante 24 horas cada semana. Se rastrearon las colonias de una sola célula por análisis FACS en cuanto a la reducción inducible por tetraciclina de la expresión superficial de la clase I del MHC y por inmunoprecipitación en cuanto a la expresión de los genes US respectivos.

Ejemplo 2 Anticuerpos

Se produjeron antisueros de conejo específicos para US3, US6 y US11 contra los siguientes péptidos sintéticos indicados por la posición del primer aminoácido en la secuencia codificante respectiva: US3-N, 16-35, US3-C,78-97, US6-N, US6-C, US11-N, 16-36, US11-C,100-118.

Se produjeron antisueros específicos para la clase I del MHC K455 y K355 contra heterodímeros de la clase I humanos purificados o contra la \beta2-microglobulina humana, respectivamente (Andersson, M., Paabo, S., Nilsson, T. y Peterson, P.A. (1985), Cell 43, 215-222). K455 reconoce las CP y \beta2m en formas ensambladas y no ensambladas. K355 y el anticuerpo monoclonal BBM.1 (Brodsky, F.M., Parham, P., Barnstable, C.J., Crumpton, M.J. y Bodmer, W.F. (1979), Immunol. Rev. 47, 3) reconocen sólo el complejo de CP y \beta2m (Brodsky, antes citado). El anticuerpo monoclonal HCIO reconoce sólo las cadenas pesadas libres (Stam, N.J., Spits, H. y Ploegh, H.L. (1986), J. Immunol. 137, 2299-2306). Para la detección del receptor de transferrina metabólicamente marcado, usamos el mab H68 (White, S., Miller, K., Hopkins, C. y Trowbridge, I.S. (1992), Bioch. Biophys. Acta 1136, 28-34). Se detectó el receptor de transferrina superficial usando un anticuerpo comercial marcado con FITC (Pharmingen).

Marcaje metabólico e inmunoprecipitación

Se privó de metionina a transfectantes de células HeLa durante 30 minutos en medio deficiente en metionina antes de marcar con pulsos durante 15 ó 30 minutos usando 0,5 mCi de ^{35}S-metionina (TranS-label, Amersham). Se rastreó el marcaje durante varios tiempos con DMEM que contenía un 10% de FCS. Después de un lavado con PBS frío, se lisaron las células usando NP40 al 1% en PBS o digitonina al 1% en PBS durante 30 minutos a 4ºC. Se llevaron a cabo las inmunoprecipitaciones y la SDS-PAGE como se ha descrito (Yang, Y., Waters, J.B., Froh, K. y Peterson, P.A. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4928-32). Para el tratamiento con EndoH, se digirieron los inmunoprecipitados con 3 mU de EndoH (Boehringer Mannheim) durante 16 horas a 37ºC en NaOAc 50 mM, pH 5,6, SDS al 0,3% y 2-mercaptoetanol 150 mM.

Análisis FACS

Se tiñeron 10^{5} células HeLa con W6/32 (1:100) o con FITC anti-receptor de transferrina (1:10) durante 1 hora, seguido de tres lavados con PBS, con un 1% de BSA. Se visualizó el W6/32 unido con conjugado de IgG de cabra anti-conejo y fluoresceína (Cappel). El control negativo fue sólo el conjugado de IgG de cabra anti-conejo y fluoresceína.

Infecciones víricas

Se obtuvo HCMV de tipo salvaje, cepa AD169, de la American Type Culture Collection y se construyeron mutantes de HCMV como se ha descrito previamente (Jones y col. 1995). Se cultivaron células fibroblásticas de prepucio humano ("HFF") como monocapas adherentes en medio de Eagle modificado de Dulbecco ("DMEM") suplementado con un 10% de suero de ternera fetal, penicilina, estreptomicina y glutamina 2 mM. Se infectaron las monocapas de células HFF (10^{7} células) con HCMV de tipo salvaje o mutantes de HCMV a una m.d.i. (multiplicidad de infección) de 5 en 10 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero de ternera fetal, penicilina, estreptomicina y glutamina 2 mM. A las 2 horas de la infección, se retiró el medio y se añadieron 50 ml del mismo medio. Se cultivaron las células durante 3 días. Se valoró la infección por el efecto citopático observado en la mayoría de las células a las 72 horas de la infección.

Transfecciones y líneas celulares estables

Se transfectaron células HeLa que contenían el transactivador regulable tetraciclina (células HtTa) (Gossen y Bujard, 1992) con 24 \mug de ADN plasmídico por precipitación con Ca^{2+}/PO_{4}^{-} como se está descrito (Jackson y col., 1990). Para los experimentos transitorios, se incubaron 10^{6} células HtTa con la solución de transfección durante 16 h antes de lavar tres veces con PBS para eliminar la tetraciclina. Se analizaron los transfectantes 48 horas después de la inducción. Para establecer una línea celular estable que expresara US6, se cotransfectó pUHG10.3-US6 con un plásmido que confería resistencia a la ouabaína (Yang y col., 1995). Se seleccionaron los clones estables añadiendo ouabaína (1 \muM) durante 24 h cada semana. Se rastrearon las colonias de una sola célula por citofluorometría en cuanto a reducción inducible por tetraciclina de la expresión en superficie de la clase I del MHC. Se han descrito previamente transfectantes estables que expresan US3, US11 ó ICP47 (Ahn y col., 1996a; Früh y col., 1995).

Marcaje metabólico e inmunoprecipitación

Para los experimentos de pulsos/rastreo, se privó a 10^{6} células de metionina durante 30 min. antes de marcar con pulsos durante los tiempos indicados usando 0,5 mCi de ^{35}S-metionina (TranS-label, Amersham). Se rastreó el marcaje durante varios tiempos con DMEM que contenía un 10% de FCS. Para un marcaje óptimo de TAP, se marcaron las células durante 16 h con 0,4 mCi en DMEM que contenía un 1% de FCS dializado usando una membrana de 12 kD de corte. Después de marcar, se lavaron las células una vez con PBS frío y se lisaron usando NP40 (Sigma) al 1% en PBS o digitonina (Calbiochem) al 1% en PBS durante 30 minutos a 4ºC. Se llevaron a cabo las inmunoprecipitaciones y los geles SDS como se ha descrito (Yang y col. 1992). Para el tratamiento con EndoH, se digirieron los inmunoprecipitados con 3 mU de EndoH (Boehringer Mann-heim) durante 16 horas a 37ºC en NaOAc 50 mM, pH 5,6, SDS al 0,3% y 2-mercaptoetanol 150 mM.

Inmunofluorescencia y citofluorometría

Para la inmunofluorescencia, se fijaron células HeLa transfectadas transitoriamente en paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1%, seguido de incubación con antisueros US6-N y mab AF8 durante 1 h. Se visualizó el anticuerpo unido de conejo o de ratón conjugado de IgG de cabra anti-conejo y fluoresceína o anti-ratón de cabra y rodamina, respectivamente (Cappel). Se realizó el análisis citofluorométrico usando IgG de cabra anti-conejo FITC para detectar W6/32 específico para heterodímeros de la clase I del MHC humano (Parham, 1983).

Ensayos de transporte peptídico

Se desprendieron las monocapas de células HFF infectadas por HCMV con tripsina/EDTA, se lavaron dos veces con tampón de transporte (KCl 130 mM, NaCl 10 mM, CaCl_{2} 1 mM, EGTA 2 mM, MgCl_{2} 2 mM, Hepes 5 mM, pH 7,3 con KOH) a 4ºC y se permeabilizaron después (10^{7} células/ml) en tampón de transporte que contenía 4 U/ml de estreptolisina O (SLO) durante 20 min. a 37ºC. Se valoró la permeabilización por exclusión de azul tripán. Se incubaron las células impermeabilizadas (10^{6} células/muestra en tubos Eppendorf) durante 10 min. a 37ºC con 10 ml de una librería de péptidos radioyodados (Heemels y col., 1993) y 10 ml de un sistema generador de ATP (ATP 50 mM, UTP 250 mM, fosfato de creatina 2,5 mM y 8U de creatina fosfokinasa) en un volumen total de 100 ml a 37ºC. Cuando estuvo indicado, se añadió el 87-mero ICP47 a la mezcla de translocación en 10 ml a una concentración final de 10 mM. Se finalizó la translocación peptídica añadiendo 1 ml de tampón de finalización (tampón de transporte + EDTA 10 mM, azida sódica al 0,02%) helado. Se centrifugaron las muestras a 14.000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se añadió 1 ml de tampón de lisis (NP40 al 0,5%, MgCl_{2} 5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) helado. Después de 20 minutos, se eliminaron los núcleos por centrifugación a 14.000 r.p.m. y se incubó el sobrenadante con agitación suave durante 1 hora con 100 ml de perlas de Con A Sepharose a 4ºC. Se lavaron las perlas tres veces con tampón de lisis y se cuantificó la radiactividad por espectrometría g.

Los heterodímeros de la clase I del MHC quedan retenidos en el retículo endoplásmico en células HeLa transfectadas con US3

Para estudiar qué genes US interfieren con la expresión superficial de la clase I del MHC, clonamos la región codificante amplificada por PCR de US2 a US11 en el vector de expresión regulable por tetraciclina pUHG.10-3 y células HeLa que contenían transactivador tet (HtTa) transfectadas transitoriamente. Como se esperaba por los datos previos, observamos una reducción de la expresión superficial de la clase I del MHC en transfectantes US11, mientras que la expresión superficial de los receptores de transferrina no resultó afectada (Fig. 1). Además, observamos efectos similares para US2, US3 y US6.

Transfectamos establemente células HeLa con US3 y, como control, US11, y comparamos el transporte intracelular de los receptores de transferrina y de las moléculas de la clase I del MHC en cualquiera de los transfectantes por marcaje metabólico e inmunoprecipitación. Ni US3 ni US11 afectaban al transporte de los receptores de transferrina a la superficie de la célula, ya que la única especie de proteína de 95 kDa observada tras el marcaje biosintético durante 15 minutos se convirtió en una especie proteica de mayor peso molecular correspondiente a la forma resistente a EndoH (Wiertz, antes citado) en el período de rastreo de 30 minutos. Las CP de la clase I del MHC recién sintetizadas exhiben también un cambio de peso molecular aparente en las células HeLa no transfectadas después de un rastreo de 30 minutos (Fig. 2A, banda 4) y adquieren resistencia a la EndoH, lo que indica transporte a través del compartimento del Golgi (Fig. 2B, banda 4). Sin embargo, en células HeLa transfectadas con US3 o US11, el transporte intracelular de las CP de la clase I del MHC quedó inhibido, aunque su síntesis inicial, su translocación y su glicosilaciónn no resultaron afectadas (Fig. 2A, compárense las bandas 3, 7 y 11). En transfectantes US11, las CP se degradaron en 30 minutos de rastreo, mientras que \beta2m no resultó afectado (Fig. 2A, banda 12), lo que es consistente con las observaciones previas (Wiertz, antes citado). Por el contrario, las moléculas de la clase I del MHC no se degradaron durante el período de rastreo de 30 minutos en células transfectadas con US3 (Fig. 2A, banda 8), sino que permanecieron en el RE, según indica su sensibilidad a la EndoH (Fig. 1B, banda 8). Estos resultados sugerían que US3 evitaba que las moléculas de la clase I del MHC abandonaran el RE por un mecanismo diferente de US11.

US3 se asocia con heterómeros de la clase I del MHC

La sensibilidad a EndoH observada para las moléculas de la clase I del MHC en células transfectadas con US3 sugería que el US3 se asociaba a las moléculas de la clase I del MHC. Sin embargo, no se observó coprecipitación de US3 ó US11 con las moléculas de la clase I del MHC cuando se solubilizaron las células con NP40 (Fig. 2A; véase también la Fig. 4A). Por lo tanto, solubilizamos metabólicamente transfectantes US3 marcados con el más suave detergente digitonina antes de la inmunoprecipitación con la clase I del MHC o con antisueros específicos para US3 (Fig. 3). En estas condiciones, los antisueros anti-CP y anti-\beta2m coprecipitaron ambos una proteína de 22 a 23 kDa de transfectantes US3, pero no de células HeLa (Fig. 3; compárense las bandas 1 y 2 con las 5 y 7). La proteína de 22 kDa comigraba con un US3 detectado por el antisuero US3-N (Fig. 3, banda 9; para control, véase la banda 3). Como US3 se glicosila potencialmente, digerimos inmunoprecipitados con EndoH antes de la SDS-PAGE (Fig. 3, bandas 6, 8 y 10). Como se ha observado anteriormente, el peso molecular de las CP de la clase I del MHC se redujo en aproximadamente 3 kDa por tratamiento en EndoH en transfectantes US3. Además, el peso molecular aparente de la proteína de 22-23 kDa coprecipitada con anticuerpos específicos para la clase I del MHC se redujo a 19 kDa. Se observó exactamente la misma reducción en el peso molecular para US3 inmunoprecipitado por US3-N (Fig. 3, banda 10). Junto con el hecho de que US3 sin la secuencia de señal putativa tiene un peso molecular predicho de 19,9 kDa, estos hallazgos claramente identifican la proteína coprecipitada por anticuerpos de la clase I del MHC como US3 glicosilado. Más aún, la sensibilidad a EndoH de US3 indica que US3 no se transporta a través del compartimento del Golgi, lo que confirma nuestros resultados de inmunofluorescencia. En el experimento inverso, sólo coinmunoprecipitaron cantidades menores de moléculas de la clase I del MHC por US3-N (Fig. 3, bandas 9 y 10). Esto podría indicar, o bien que la mayor parte del US3 no se une a la clase I del MHC en estas células transfectadas, o bien que el US3-N destruye o no reconoce el complejo. Una proteína adicional de 17,5 kDa (indicada mediante *) inmunoprecipitó por el US3-N, pero no por cualquiera de los anticuerpos anti-clase I. Esta proteína parece estar glicosilada, ya que su peso molecular cambió a 13,5 kDa tras el tratamiento con EndoH. El producto de 13,5 kDa podría ser generado por ayustamiento alternativo de transcriptos de US3, lo que ha mostrado dar lugar a varios ARN US3 alternativos en células infectadas por HCNW (Weston, K. (1988), Virology 162, 406-16), que comparten el extremo 5', permitiendo la translocación y la glicosilación (Tenney, D.J., Santomenna, L.D., Goudie, K.B. y Colberg-Poley, A.M. (1993), Nucleic Acids Res. 21, 2931-7). Por lo tanto, es posible que la glicoproteína de 17,5 kDa corresponda a una forma de US3 que carezca del dominio de transmembrana. Las reprecipitaciones de inmunoprecipitados US3-N con US3-C están de acuerdo con esta suposición. El hallazgo de que la proteína de 17,5 kDa no coprecipita por ninguno de los anticuerpos anti-clase I usados en este experimento sugiere que sólo la glicoproteína US3 de longitud completa se asociaba con las moléculas de la clase I del MHC. Los datos sugieren además que US3 se asocia en el RE con heterómeros de la clase I del MHC o que, alternativamente, se une a la CP libre o a \beta2m sin evitar un mayor ensamblaje de la cadena polipeptídica respectiva con su compañera, así como con péptidos.

Como no se ha demostrado una asociación de US11 con las CP hasta la fecha, usamos las mismas condiciones de marcaje y de lisis para inmunoprecipitar moléculas de la clase I del MHC de células transfectadas con US11 (Fig. 3, bandas 11-16). Todas las CP detectadas en células US11 eran sensibles a EndoH (Fig. 3, bandas 11 y 14), al igual que la propia proteína US11 de 29 kDa, que fue inmunoprecipitada por US11-N (Fig. 3, bandas 15 y 16). La reducción del peso molecular de US11 a 25 kDa por tratamiento con EndoH es consistente con un peso molecular predicho de 25,3 kDa. Aunque una débil banda de proteína sensible a EndoH del tamaño de US11 coinmunoprecipitó por los antisueros específicos para la clase I (indicada por >) de transfectantes US11, lo que sugiere que US11 se asocia a la clase I de MHC, la cantidad de US11 unido a las moléculas de la clase I del MHC marcadas era mucho menor que la observada para US3. Es posible que la solubilización con detergente destruya un complejo de US11 y clase I o que ninguno de los anticuerpos fuera capaz de reconocer dicho complejo. La explicación más probable, sin embargo, es que US11 interaccione con las moléculas de la clase I del MHC sólo muy transitoriamente, seguido de la rápida degradación de las CP tanto libres como ensambladas.

Las moléculas de la clase I del MHC retenidas por US3 adquieren péptidos

Para identificar si US3 retiene moléculas de la clase I del MHC antes o después de la carga peptídica, monitorizamos la carga de péptidos sometiendo complejos de la clase I del MHC solubilizados con NP40 a elevadas temperaturas, seguido de inmunoprecipitación con anticuerpos específicos de conformación (Townsend, A., Elliot, T., Cerundolo, V., Foster, L., Barber, B. y Tse, A. (1990), Cell 62, 285). Como control, usamos células HeLa transfectadas con la proteína ICP47 del virus Herpes simplex, que bloquea la translocación al RE de péptidos que se unen a la clase I del MHC (Hill, A., Jugovic, P., York, I., Rus, G., Bennink, J., Yewdell, J., Ploegh, H. y Johnson, D. (1995), Nature 375, 411-415; Frueh, K. y col. (1995), Nature 375, 415-418). En consecuencia, las moléculas de la clase I del MHC de células transfectadas con ICP47 se separan tras incubación a 37ºC durante 60 minutos, según se monitoriza por inmunoprecipitación con el mab específico de heterómeros W6/32 (Fig. 4, bandas 17 y 18). Por el contrario, aproximadamente un 85% de las moléculas de la clase I del MHC reactivas con W6/32 eran termoestables en células HeLa en todos los puntos temporales (Fig. 4A y B). Sin embargo, en transfectantes US3, la proporción de moléculas de la clase I del MHC termoestables aumentaba durante el período de rastreo de dos horas, según se muestra (Fig. 4A y B), lo que indica que las moléculas de la clase I del MHC adquieren péptidos a una velocidad mucho más lenta en transfectantes US3 en comparación con las células de tipo salvaje. Concluimos que US3 se asocia con moléculas de la clase I del MHC antes de la carga peptídica y que esta asociación hace más lenta, pero no evita, la carga peptídica. Como no había evidencia de ningún aumento en la degradación de las CP en los transfectantes US3 en comparación con las células HeLa durante el período de rastreo de dos horas, concluimos también que la retención por US3 no induce degradación de las CP, como se observa para US11.

US6 evita el ensamblaje de las CP con \beta12m

Transfectamos establemente células HeLa con US6 y comparamos el transporte intracelular de moléculas de la clase I del MHC con células HeLa no transfectadas por marcaje metabólico e inmunoprecipitación (Fig. 5). En células HeLa, se pueden detectar grandes cantidades de cadenas pesadas libres inmediatamente después del pulso (banda 17), la mayoría de las cuales se convierten en material reactivo con W6/32 durante el período de rastreo. Por el contrario, casi no se detectó población heterodimérica reactiva con W6/32 en transfectantes US6 a lo largo de todo el experimento, lo que indica que US6 afectaba a la formación de heterodímeros. Sin embargo, se observó menos reducción en transfectantes US6 para la clase I total y para las cadenas pesadas libres. Así, US6 parece afectar selectivamente a la formación de heterodímeros, mientras que no afecta a la síntesis y al transporte de una población de cadenas pesadas libres reactivas con HC1O. Concluimos que US6 funciona de forma diferente a US3, ya que no retiene las moléculas de la clase I. Más aún, US6 difiere de US11 en que evita la formación de heterodímeros.

US6 previene la translocación peptídica por el TAP

Como ICP47 inhibe a TAP, examinamos si US6 afectaba directamente a la translocación peptídica. Usando un ensayo establecido que monitoriza la translocación peptídica independiente de la unión a la clase I de MHC por precipitación con ConA de péptidos glicosilados al entrar en el RE (Neefjes y col., 1993), comparamos la actividad de TAP en células HtTa no transfectadas o en células establemente transfectadas con US3, US11, ICP47 o US6 (Fig. 6). No se observó diferencia significativa en la cantidad de péptidos glicosilados entre células US3 y US11 no inducidas o inducidas (Fig. 6) o células U373 transfectadas con US2. Por el contrario, la actividad de transporte de péptidos estaba completamente inhibida en células que expresan US6, de forma similar a los transfectantes ICP47 o tras eliminación del ATP. Dado que la translocación peptídica estaba inhibida independientemente de la carga de la clase I del MHC, concluimos que la carga peptídica y el transporte alterado de la clase I del MHC son sucesos corriente debajo de la inhibición del TAP por US6.

US6 inhibe a TAP en células infectadas por HCMV

Recientemente, se demostró que el transporte de TAP se inhibía durante la infección por HCMV (Hengel y col., 1996). Más aún, la translocación peptídica quedó restaurada tras deleción de un fragmento de 15 kb que se extiende de US1 a US15. Para investigar si US6 solo o en combinación con otros genes codificados en esta región es responsable de la inhibición de TAP durante la infección por HCMV, analizamos la actividad de transporte peptídico en células infectadas con una serie de mutantes de HCMV (Jones y col., 1995) que contenían las deleciones IRS1-US6, US2-US11 y US6-US11 (Fig. 7A). Se infectaron células HFF con HCMV de tipo salvaje o con los mutantes de deleción durante 72 horas a una m.d.i. de 5 y se midió la translocación peptídica por recuperación de una librería de péptidos informadores marcados con ^{125}I glicosilados. Contrariamente al HCMV de tipo salvaje, ninguno de estos mutantes de deleción inhibía la translocación de péptidos mediada por TAP en células HFF infectadas, mientras que la translocación peptídica resultaba bloqueada cuando se añadió una versión sintética de ICP47 (sICP47) (Fig. 7A). Como el gen común ausente de todos estos virus mutantes es US6, se construyó un mutante de deleción que carecía de este gen. Se infectaron células HFF durante 72 horas a una m.d.i. de 5 con el mutante que carecía del gen US6. Como se muestra en la Fig. 4B, la ausencia del producto génico US6 restauró la translocación peptídica dependiente de TAP en células HFF. Estos resultados demuestran claramente que US6 es únicamente responsable de la inhibición de la translocación peptídica en células infectadas por HCMV.

Localización subcelular de US6

La similitud funcional observada entre ICP47 y US6 contrasta con su diferente estructura proteica predicha. ICP47 es una proteína soluble que contiene 89 aminoácidos y que se localiza en el citosol (Früh y col., 1995; York y col., 1994), mientras que el marco abierto de lectura US6 codifica para una glicoproteína de transmembrana de tipo I predicha de 184 aminoácidos con algún grado de homología de secuencia con los ORF US2-US11 (Ahn y col., 1996a; Chee y col., 1990). Para estudiar la localización subcelular de US6, produjimos anticuerpos anti-péptido contra el dominio luminal predicho de US6 y comparamos por análisis de inmunofluorescencia su localización intracelular con la de la calnexina, un acompañante residente en el RE (Degen y Williams, 1991). Cuando se sondaron células HeLa transfectadas transitoriamente con US6 con antisuero US6-N, se observó una tinción perinuclear para las células transfectadas, pero no las células no transfectadas (Fig. 8, flechas). Se observó un patrón similar tanto para las células transfectadas como para las no transfectadas con el anticuerpo monoclonal específico para la calnexina AF8 (Fig. 8, panel inferior). Más aún, la cotinción indicó que ambas proteínas se localizaban en el mismo compartimento (Fig. 8, panel central). Así, concluimos que US6 es una glicoproteína residente en el RE, según se observa para US3 (Ahn y col., 1996a), US11 (Wiertz y col., 1996a) y una subpoblación de US2 (Wiertz y col., 1996b).

El dominio luminal del RE de US6 es responsable de la inhibición de TAP

Como no se ha observado previamente la inhibición de TAP por una proteína residente en el RE, quisimos saber si US6 inhibe a TAP y/o queda retenido en el RE a través de su dominio citoplásmico, de transmembrana o luminal. Por lo tanto, construimos una serie de proteínas de fusión y examinamos su localización y transporte intracelular, así como su capacidad para reducir la expresión superficial de la clase I del MHC y la translocación peptídica (Fig. 9). Cuando se substituyó el dominio citoplásmico de CD8 con el de US6, los niveles superficiales de la clase I del MHC permanecieron inalterados (Fig. 9, CD8US6). Más aún, la cola citoplásmica de US6 era incapaz de evitar el transporte intracelular de CD8, contrariamente a las colas citoplásmicas de una serie de proteínas residentes en el RE (Jackson y col., 1990). Así, parece que la cola citoplásmica de US6 no es suficiente para la retención en el RE o para la inhibición de TAP. Para examinar si el dominio luminal de US6 solo inhibiría el transporte de péptidos, substituimos tanto el dominio de transmembrana predicho como la cola citoplásmica de US6 con los de CD8 y E19 de adenovirus, respectivamente. La proteína de fusión resultante, US6E19, permanecía sensible a EndoH y regulaba decrecientemente la expresión superficial de la clase I del MHC como resultado de la inhibición de TAP (Fig. 9). Es interesante que la retención en el RE, así como la inhibición de TAP, se observaran también para la construcción US6E19D, que contiene una deleción en la señal de retención en el RE de la cola E19 (Jackson y col., 1990). Estos resultados sugerían que el dominio luminal de US6 es responsable tanto de la retención en el RE como de la inhibición de TAP. Para examinar si el dominio luminal necesita anclarse en la membrana para inhibir a TAP, fusionamos el dominio luminal de US6 a la secuencia KDEL, que retiene proteínas solubles en el RE. Además, truncamos el dominio luminal US6 introduciendo un codon de parada en la posición del aminoácido 139, es decir, antes del dominio de transmembrana predicho. Como se muestra en la Fig. 9, tanto US6KDEL como US6STOP permanecían sensibles a EndoH y eran ambos capaces de prevenir la translocación peptídica y, por lo tanto, la expresión superficial de la clase I. Concluimos que el dominio luminal de US6 es responsable tanto de la inhibición de la translocación peptídica como de la retención en el RE de US6.

Asociación de US6 con el complejo TAP/clase I

Parecía probable que la inhibición de TAP y/o la retención en el RE implicara una interacción directa entre US6 y TAP. Sin embargo, ninguno de los dos antisueros anti-US6 coinmunoprecipitó TAP de lisados incluso cuando se usaron detergentes suaves para la solubilización. Esto podría ser debido a la posibilidad de que estos antisueros no sean capaces de reconocer un complejo US6/TAP porque sus epitopos están implicados en la unión a TAP. Por lo tanto, usamos un antisuero contra la cola citoplásmica E19 para inmunoprecipitar US6E19 de lisados de digitonina de células HeLa transfectadas transitoriamente. Modulamos las concentraciones intracelulares de US6E19 y de TAP usando tetraciclina o interferon \gamma, respectivamente. Para el control, inmunoprecipitamos el complejo TAP/clase I de células HeLa usando antisuero anti-TAP1, que coprecipita tanto las CP de la clase I del MHC como \beta2m (Fig. 10, banda 1) y al menos dos proteínas adicionales (flechas) con pesos moleculares correspondientes a la calrreticulina (banda superior) y a la tapasina (banda inferior), las dos de las cuales se cree están implicadas en la unión de la clase I a TAP (Sadasivan y col., 1996). Ninguna de estas proteínas coprecipitó por el anti-E19 de lisados de digitonina de células transfectadas con CD4E19 (banda 2). Por el contrario, las subunidades TAP, así como las CP de la clase I y \beta2m, coprecipitaron con US6E19, según se ve por reprecipitación con los respectivos anticuerpos (Fig. 10, bandas 8-11). Las dos proteínas adicionales también coprecipitaron por anti-E19, lo que indica que US6 no altera el complejo TAP/clase I. Lo que es interesante, cantidades crecientes de complejo TAP/clase I coprecipitaron al reducir los niveles de expresión de US6E19 (bandas 3-7). Interpretamos este resultado como indicación de una unión saturable específica de US6, ya que, en la saturación, la razón de US6 libre frente a US6 unido a TAP aumenta con la concentración intracelular de US6. A altos niveles de expresión, precipitará relativamente más US6 no unido si se usan cantidades limitantes del antisuero específico para E19, como es el caso del experimento mostrado en la Fig. 10. Se hizo una observación muy similar con ICP47, donde la mayoría de ICP47 permanece libre en el citosol tras la sobreexpresión, mientras que la mayor parte de ICP47 se une a TAP a bajas concentraciones (Früh y col., 1995). Como la unión a TAP es saturable, es improbable que US6 quede retenido en el RE por unión a TAP, ya que US6E19 no adquiere resistencia a EndoH independientemente de sus niveles de expresión (Fig. 9 y 10). Sin embargo, la interacción de US6 con el complejo TAP/clase I podría ser necesaria para bloquear la translocación peptídica por
TAP.

US6 no inhibe la unión peptídica a TAP

La asociación de US6 con la porción luminal de TAP contrasta con ICP47, que se aproxima a TAP desde el citosol. Estos modos diferentes de interacción podrían reflejarse en diferentes mecanismos moleculares de inhibición del TAP. Demostramos previamente que ICP47 no inhibe la unión de ATP a TAP, sino que compite con péptidos por la unión al sitio de unión al substrato de TAP (Ahn y col., 1996b). De igual modo, no observamos una inhibición de la unión de ATP a TAP en células que expresan US6. Para estudiar si US6 interferiría con la unión peptídica, añadimos péptidos marcados portadores de un fotoentrecruzante a células permeabilizadas con SLO que expresaban US6 (Fig. 11). Como control, usamos células HeLa transfectadas con ICP47 y no transfectadas. De acuerdo con nuestras observaciones previas (Ahn y col., 1996b), los péptidos no pudieron entrecruzarse con TAP aislado de células que expresaban ICP47 (Fig. 11, banda 8) o de células HeLa tratadas con His-ICP47 recombinante purificado (Fig. 11, banda 3). Por el contrario, la expresión de US6 no evitó la unión peptídica (banda 5). Más aún, la unión de ICP47 a TAP no fue efectuada por US6, ya que His-ICP47 inhibía la unión peptídica en células que expresaban US6 (banda 6). Concluimos que US6 interacciona con un dominio diferente de TAP en comparación con ICP47 y que US6 inhibe a TAP por un mecanismo diferente.

Nuestro estudio muestra que HCMV previene la presentación de antígeno de la clase I del MHC por el esfuerzo concertado de varias proteínas codificadas en la región US. Cuatro proteínas, US2, US3, US6 y US11, afectan específicamente al trasporte intracelular de moléculas de la clase I del MHC, pero no de otras glicoproteínas. Se ha descrito con anterioridad la degradación de cadenas pesadas mediada por US11 (Jones, T.R. y col. (1995), J. Virol. 69, 4830-4841; Wiertz, E.J. y col. (1996), Cell, 84, 769-779). Más aún, por nuestros resultados, puede deducirse que US2 funciona de forma similar a US11, ya que un mutante de deleción de HCMV que sólo contiene US2, US3, US4 y US5 es capaz de degradar las cadenas pesadas (Jones, T.R. y col. (1995), antes citado) y nuestros resultados excluyen US3, US4 y US5. El destino de las moléculas de la clase I del MHC difiere de las líneas celulares transfectadas con US11, reteniendo US3 heterotrímeros de la clase I del MHC totalmente ensamblados, mientras que la expresión de US6 previene la formación de heterodímeros.

La infección por HCMV causa problemas importantes de salud en individuos inmunosuprimidos. Dichas infecciones son el resultado de una recurrencia de una infección latente o son causadas por virus presente en el tejido transplantado. Para eliminar el HCMV del donante o del receptor o de ambos antes de un trasplante, sería útil inducir una respuesta inmune contra el virus. La expresión de las proteínas US evita muy probablemente que el sistema inmune detecte infecciones en curso. Este escape inmune podría ser potencialmente revertido desarrollando compuestos que evitan la interacción de las proteínas US con las moléculas de la clase I del MHC. Así, las proteínas US son blancos potenciales de los fármacos. Nuestros resultados identifican US3 y US6 como blancos potenciales, además de US2 y US11. Como US3 podría expresarse durante la fase latente, podría ser un objetivo más importante activar una respuesta inmune contra la fase latente del virus.

Para la terapia génica, se introducen vectores víricos que expresan el gen de interés en el paciente o en el animal experimental. El objetivo principal de este procedimiento es conseguir la expresión estable a largo plazo del gen sano introducido. Sin embargo, un obstáculo importante a la terapia génica es la rápida pérdida de expresión del gen recombinante, que se asocia con el desarrollo de una respuesta inflamatoria vigorosa. Para vectores adenovíricos con deleción EI, la inflamación es iniciada por LTC específicos de vectores, según muestran experimentos de transferencia pasiva, y depende de la presentación de la clase I del MHC, ya que las células transducidas no fueron eliminadas en ratones \beta2m -/- (Yang, Y., Ertl, C.J. y Wilson, J.M. (1994), Iinmuizit-l, 433-442). Así, parece posible que, introduciendo proteínas víricas que previenen la presentación de la clase I del MHC, se pudieran evitar dichas respuestas inflamatorias no deseadas. Ciertamente, la expresión constitutiva de E19 reducía la respuesta de LTC específicos de vectores (Lee, M.G., Abina, M.A., Haddada, H. y Perricaudet, M. (1995), Gene Ther. 2, 256-61). Introduciendo ICP47, así como proteínas US, en dichos vectores, se podría reducir aún más dicha respuesta de LTC, ya que la presentación del antígeno por la clase I del MHC se inhibiría a varios niveles. Las proteínas víricas aquí descritas podrían ser útiles en situaciones adicionales en las que no se desea reactividad de los LTC. M. Horwitz y colaboradores han demostrado recientemente que la expresión transgénica de la región E3 del adenovirus, que contiene E19, de acción similar a US3, en las células de los islotes pancreáticos prolongaba la supervivencia de islotes trasplantados a través de barreras haplotípicas (Horwitz, M.S., Tufariello, J., Grunhaus, A. y Fejer, G. (1995), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199, 195-211). Así, las proteínas aquí descritas podrían ser útiles en trasplantes, por ejemplo, en xenotrasplantes de animales transgénicos.

Finalmente, es útil inducir LTC específicos de péptidos in vitro, de forma similar a las líneas celulares con deleción de TAP (De Bruijn, M.L., Schumacher, T.N., Nieland, J.D., Ploegh, H.L., Kast, W.M. y Mellef, C.J. (1991), Eur. J. Immunol. 21, 2963-70). Podría ser posible unir \beta2m a las moléculas de la clase I del MHC libres que alcanzan la superficie celular en células transfectadas con US6. De forma similar a las células que carecen de TAP funcional, dichas moléculas tendrían que ser eficazmente cargadas con péptidos sintéticos específicos para el respectivo haplotipo de la clase I del MHC. Dichas células presentadoras de antígeno monoespecíficas son excelentes estimuladores para inducir LTC primarios específicos de péptidos in vitro (De Bruijn, M.L., Schumacher, T.N., Nieland, J.D., Ploegh, H.L., Kast, W.M. y Mellef, C.J. (1991), Eur. J. Immunol. 21, 2963-70). Esto debería facilitar la generación de células T citotóxicas específicas para un antígeno dado, un requisito previo para vacunas basadas en células T contra el cáncer o las infecciones víricas.

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Claims

1. Un mutante de citomegalovirus (HCMV) recombinante consistente en un genoma del que se ha suprimido una secuencia génica capaz de regular decrecientemente la expresión de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), donde la secuencia génica suprimida está en el marco abierto de lectura US3 y/o US6 solamente.

2. Una composición farmacéutica que contiene el mutante de citomegalovirus (HCMV) recombinante de la reivindicación 1 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. Una composición vacunal para uso en la prevención de infecciones por citomegalovirus que consiste en una cantidad efectiva del mutante de citomegalovirus (HCMV) recombinante de la reivindicación 1 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. La composición vacunal de la reivindicación 3, que además incluye un adyuvante.

5. El mutante de citomegalovirus (HCMV) recombinante de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de la reivindicación 2 para la prevención de la infección por citomegalovirus.

6. El mutante de citomegalovirus (HCMV) recombinante de la reivindicación 1 o la vacuna de la reivindicación 3 ó de la reivindicación 4 para uso en:

: la inmunización de un individuo frente al citomegalovirus o

: la prevención o reducción de la susceptibilidad al citomegalovirus agudo.

7. Un método de producción de un mutante de citomegalovirus recombinante según la reivindicación 1, consistente en las siguientes etapas:

(a): identificar una secuencia génica en la región del genoma del citomegalovirus que contiene el marco abierto de lectura US3 y/o US6 sólo, que es capaz de regular crecientemente la expresión de la clase I del MHC, y

(b): suprimir la secuencia génica identificada del genoma del citomegalovirus.

8. Un vector de terapia génica basado en virus que contiene una secuencia génica del genoma del citomegalovirus humano, donde dicha secuencia génica del genoma del citomegalovirus humano es el marco abierto de lectura de US3 y/o US6 solamente.

9. Uso del mutante de citomegalovirus (HCMV) recombinante de la reivindicación 1 ó de la composición farmacéutica de la reivindicación 2 para la preparación de un medicamento para la prevención de la infección por citomegalovirus.