ES2236684T3 - Vacuna del virus vaccinia recombinante procedente del virus de la enfermedad de marek. - Google Patents

Abstract

LO QUE ES DESCRITO ES UN VARICELAVIRUS RECOMBINANTE, TAL COMO VIRUS VACUNA O VIRUS VARICELA DE AVE, QUE CONTIENE EL DNA AJENO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE MAREK. LO QUE TAMBIEN ES DESCRITO ES UNA VACUNA QUE CONTIENE LA VARICELA VIRUS RECOMBINANTE PARA INDUCIR UNA REACCION INMUNOLOGICA EN UN ANIMAL HUESPED INOCULADO CON LA VACUNA.

Description

Vacuna del virus vaccinia recombinante procedente del virus de la enfermedad de Marek.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un virus vaccinia modificado y a métodos para producir y utilizar el mismo. Más en particular, la invención se refiere a un virus vaccinia recombinante, virus que expresa productos génicos de un gen del virus de la enfermedad de Marek (MDV), y a vacunas que proporcionan inmunidad protectora frente a las infecciones por el MDV.

En esta solicitud se hace referencia a varias publicaciones. La cita completa de estas referencias se encuentra al final de la especificación, inmediatamente antes de las reivindicaciones. Estas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece esta invención.

Antecedentes de la invención

El virus vaccinia y más recientemente otros poxvirus han sido utilizados para la inserción y la expresión de genes foráneos. La técnica básica para insertar genes foráneos en poxvirus infecciosos vivos, implica la recombinación entre secuencias de ADN del poxvirus que flanquean a un elemento genético foráneo en un plásmido donante y secuencias homólogas presentes en el poxvirus de rescate (Piccini y col., 1987).

Específicamente, los poxvirus recombinantes son construidos en dos etapas conocidas en la técnica y análogas a los métodos para crear recombinantes sintéticos del virus vaccinia descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.603.112, patente cuya descripción se incorpora a la presente por referencia.

Primeramente, la secuencia génica de ADN que va a ser insertada en el virus, particularmente un marco de lectura abierto procedente de una fuente distinta de poxvirus, es colocada en una construcción plasmídica de E. coli en la cual se ha insertado ADN homólogo a una sección del ADN del poxvirus. Separadamente, la secuencia génica de ADN que va a ser insertada es ligada a un promotor. El enlace promotor-gen está situado en la construcción plasmídica de tal manera que el enlace promotor-gen está flanqueado en ambos extremos por ADN homólogo a una secuencia de ADN flanqueante de una región del ADN de pox que contiene un locus no esencial. La construcción plasmídica resultante es amplificada posteriormente mediante crecimiento en bacterias E. coli (Clewell, 1972) y aislada (Clewell y col., 1969; Maniatis y col., 1982).

En segundo lugar, el plásmido aislado que contiene la secuencia génica de ADN que va a ser insertada es transfectado a un cultivo celular, por ejemplo fibroblastos de embrión de pollo, junto con el poxvirus. La recombinación entre el ADN de pox homólogo del plásmido y el genoma vírico, respectivamente, proporciona un poxvirus modificado por la presencia, en una región no esencial de su genoma, de secuencias de ADN foráneo. El término ADN "foráneo" indica ADN exógeno, particularmente ADN procedente de una fuente distinta de poxvirus, que codifica productos génicos que no se producen normalmente por el genoma en el que está situado el ADN exógeno.

La recombinación genética es en general el intercambio de secciones homólogas de ADN entre dos hebras de ADN. En ciertos virus el ADN puede ser reemplazado por ARN. Secciones homólogas de ácido nucleico son secciones de ácido nucleico (ADN o ARN) que tienen la misma secuencia de bases nucleotídicas.

La recombinación genética puede tener lugar de manera natural durante la replicación o la producción de nuevos genomas víricos dentro de la célula huésped infectada. Por tanto, puede tener lugar una recombinación genética entre los genes víricos durante el ciclo de replicación del virus que ocurre en una célula huésped que está coinfectada con dos o más virus diferentes o con otras construcciones genéticas. Se utiliza de manera intercambiable una sección de ADN de un primer genoma en la construcción de la sección del genoma de un segundo virus coinfectante en el que el ADN es homólogo al del primer genoma vírico.

Sin embargo, la recombinación puede ocurrir también entre secciones de ADN de diferentes genomas que no son totalmente homólogos. Si una de tales secciones procede de un primer genoma homólogo a una sección de otro genoma excepto por la presencia en la primera sección de, por ejemplo, un marcador genético o un gen que codifica un determinante antigénico insertado en una porción del ADN homólogo, la recombinación puede seguir teniendo lugar y los productos de esa recombinación son detectables posteriormente por la presencia de ese marcador genético o de ese gen en el genoma vírico recombinante.

La expresión con éxito de la secuencia genética de ADN insertada por el virus infeccioso modificado requiere dos condiciones. Primero, la inserción debe ser en una región no esencial del virus con el fin de que el virus modificado permanezca viable. La segunda condición para la expresión del ADN insertado es la presencia de un promotor en una relación apropiada con el ADN insertado. El promotor debe estar colocado de tal manera que esté situado corriente arriba de la secuencia de ADN que va a ser expresada.

Se ha desarrollado un vector atenuado por la deleción secuencial de seis regiones no esenciales de la cepa Copenhagen del virus vaccinia. Se sabe que estas regiones codifican proteínas que pueden desempeñar una función en la virulencia del virus. Las regiones eliminadas son el gen TK, el gen hemorrágico, el gen de inclusión de tipo A, el gen de la hemaglutinina y el gen que codifica la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa, así como las secuencias C7L a K1L definidas previamente (Perkus y col., 1990). Las secuencias y las posiciones genómicas de estos genes en la cepa Copenhagen del virus vaccinia han sido definidas previamente (Goegel y col., 1990a,b). La cepa de vaccinia atenuada resultante es denominada NYVAC.

La tecnología para generar virus vaccinia recombinantes se ha extendido recientemente a otros miembros de la familia poxvirus que tienen un rango de huéspedes más restringido.

El virus de la viruela aviar (FPV) ha sido manipulado de manera ventajosa como vector para expresar antígenos de patógenos de las aves de corral. La proteína hemaglutinina de un virus de la influenza aviar virulento fue expresado en un FPV recombinante (Taylor y col., 1988a). Después de la inoculación del recombinante en pollos y pavos, se indujo una respuesta inmune que era protectora frente al desafío con un virus de la influenza virulento homólogo o heterólogo (Taylor y col., 1988a). Además, se han expresado las glicoproteínas de la superficie (fusión y hemaglutinina) de una cepa virulenta del virus de la Enfermedad de Newcastle en un vector FPV y se ha demostrado que inducen una respuesta inmune protectora (Taylor y col., 1990; Edbauer y col., 1990; Boursnell y col., 1990a,b).

El FPV es el virus prototípico del género Avipox de la familia Poxvirus. El virus causa una enfermedad en las aves de corral importante desde el punto de vista económico que ha sido bien controlada desde los años 1920 mediante la utilización de vacunas vivas atenuadas. La replicación de los virus avipox está limitada a las especies aviares (Esposito, 1991) y no hay descripciones en la literatura de que el virus cause una infección productiva en alguna especie no aviar, incluyendo el hombre. Esta restricción de huéspedes proporciona una barrera de seguridad inherente a la transmisión del virus a otras especies y hace de la utilización de FPV como vector de vacunación en las aves de corral una propuesta atractiva.

La enfermedad de Marek es una enfermedad linfoproliferativa de los pollos causada por la infección con el virus herpes MDV. La enfermedad se caracteriza por una infiltración de mononucleares en una o más de las áreas siguientes: nervios periféricos, gónadas, iris, diferentes vísceras, músculos y piel (Calnek y Witter, 1991). Existen tres serotipos relevantes: (1) Serotipo 1 que contiene MDVs oncogénicos, (2) Serotipo 2 que contiene MDVs no oncogénicos y (3) Serotipo 3 que contiene el virus herpes del pavo (HVT) estrechamente relacionado.

La biología del MDV ha sido revisada por Schat (1987). El modo de infección del MDV es mediante contacto directo o indirecto entre las aves, permitiendo la propagación del virus por la vía aérea. Después del contacto inicial, son claras tres fases de la infección vírica. La primera fase es definida como una infección citolítica temprana. Durante esta fase, tendrá lugar una infección productiva que tiene como resultado la liberación de virus libres de células en el epitelio del folículo de las plumas (FFE). Al mismo tiempo, tiene lugar una replicación no productiva en los órganos linfoides. Definida como una infección productiva-restrictiva, durante esta etapa tiene lugar la replicación del ADN y se expresan antígenos del MDV, pero los viriones producidos no tienen envoltura y por tanto no son infecciosos (Calnek y Witter, 1991). La infección productiva-restrictiva tiene como resultado la necrosis de linfocitos B acompañada por infiltración de macrófagos y granulocitos y la hiperplasia de las células reticulares que da lugar a un agrandamiento esplénico (Payne y col., 1976). Como resultado, las células T resultan activadas y expresan antígenos del MHC de clase II (Ia) (Schat, 1987). Las células T activadas, pero no las células T en reposo, se convierten entonces en susceptibles a la infección por MDV (Calnek y col., 1984, 1985). La inmunosupresión transitoria que está asociada con la infección citolí-
tica temprana es, por tanto, debida probablemente a la infección lítica de las células B del bazo y la bursa (Schat, 1987).

Después de esta fase, las aves infectadas entran en la segunda etapa definida como infección latente. Las células T infectadas, en las que está presente el genoma del virus, no producen antígenos víricos ni partículas víricas. Las infecciones latentes se establecen seis días aproximadamente después de la infección inicial del ave.

La tercera y última fase se caracteriza por una infección citolítica secundaria, inmunosupresión y formación de tumores. Este tipo de infección ocurre solamente con los virus del Serotipo 1 virulento. Tiene lugar una infección citolítica secundaria en el FFE y es ésta la única área en la que se producen virus infecciosos libres de células. La importancia de esta infección inflamatoria en la formación de tumores no está clara, sin embargo se cree que los linfocitos infectados de manera latente son atraídos hacia el FFE donde experimentan blastogénesis. Ésta puede ser un requisito para su transformación en células tumorales. Además, los linfocitos no infectados son atraídos hacia los lugares de infección en los que resultan infectados citolíticamente o se transforman en células tumorales (Schat, 1987). En este momento es a menudo evidente una inmunosupresión permanente. El cambio a partir de una infección latente se caracteriza también por la formación de tumores en órganos viscerales, nervios, músculos y piel (Payne y col., 1976; Payne, 1985) y las células tumorales expresan ahora varios antígenos del MDV.

Antes de la utilización de vacunas, el MDV constituía una enfermedad económicamente importante en la industria de las aves de corral. Las vacunas actuales son de tres tipos: (1) virus de Serotipo 1 altamente atenuados, (2) virus de Serotipo 2 naturalmente avirulentos o (3) los virus HVT serológicamente relacionados. Las más eficaces y las más extensamente utilizadas son las vacunas de HVT desarrolladas por Okazaki y col. (1970). Existen problemas en las estrategias actuales de vacunación causados por el manejo incorrecto de la vacuna, por la interferencia de los anticuerpos maternos y por el estrés asociado y las infecciones concurrentes. Además, la aparición de cepas de MDV muy virulentas contra las cuales la inmunización con HVT solo no es protectora, ha dado lugar a la inclusión de múltiples serotipos en las vacunas (revisado por Calnek y Witter, 1991).

Los aislados del MDV han sido clasificados como virus herpes gamma sobre la base de su predilección por los linfocitos. Sin embargo, en los años recientes se ha dedicado un esfuerzo considerable para conocer la organización genómica del MDV, y actualmente es obvio que existe más homología genética con los virus herpes alfa que con los virus herpes gamma (Ross y col., 1989, 1991). Utilizando este planteamiento, se han identificado varios antígenos importantes en la producción de una respuesta inmune. Entre estos antígenos están el homólogo de gB del HSV1 y el homólogo de gD de HSV. El homólogo de gB del HSV1 fue identificado por Ross y col. (1989). En otras enfermedades por virus herpes se ha demostrado que la glicoproteína gB induce respuestas inmunes humorales y mediadas por células y que confiere inmunidad protectora (Cantin y col., 1987; Marchioli y col., 1987; Guo y col., 1990). En las células infectadas por MDV, el antígeno B es un complejo de glicoproteínas con pesos moleculares de 100 kD, 60 kD y 49 kD (Calnek y Witter, 1991). El antígeno está localizado en la superficie y en el citoplasma de las células infectadas (Kato y Hirai, 1985) y se cree que induce anticuerpos neutralizantes (Ono y col., 1985). De manera similar, el homólogo de gD del HSV1 en MDV fue identificado por Ross y Binns (1991) y Ross y col. (1991). La gD del HSV ha demostrado ser un inmunógeno eficaz contra la infección por HSV (Paoletti y col., 1984; Cremer y col., 1985).

WO/A/9002803 describe la utilización de un vector vírico para expresar proteínas de MDV (esto es las glicoproteínas gB o gT). El vector utilizado es un vector virus herpes (HVC) para la inserción del ADN heterólogo, sin embargo en este documento no se presentan datos sobre la expresión o sobre vacunas con respecto a los virus herpes recombinantes. Piccini y col., Methods in Enzymology 153 (1987), 545-563, describen la utilización de virus vaccinia para expresar ADN heterólogo, sin embargo no está dirigido a virus vaccinia recombinantes para ser utilizados como vacunas para el tratamiento de la Enfermedad de Marek.

Aunque las estrategias actuales de vacunación contra el MDV han tenido bastante éxito, la aparición de cepas de MDV muy virulentas que no son controladas adecuadamente por las vacunas actuales de HVT, indica que la inclusión de múltiples inmunógenos de cepas muy virulentas en una vacuna puede proporcionar una respuesta inmune más amplia.

Puede apreciarse por tanto que la provisión de un poxvirus MDV recombinante, y de una vacuna basada en el recombinante que proporcione inmunidad protectora frente a las infecciones por MDV y en la que puedan expresarse múltiples inmunógenos del MDV, sería un avance muy deseable sobre el estado actual de la tecnología.

Objetos de la invención

Es por tanto un objeto de esta invención proporcionar virus vaccinia recombinantes, virus que expresan productos génicos del MDV, y proporcionar un método para producir tales virus vaccinia recombinantes.

Es un objeto adicional de esta invención proporcionar el clonaje y la expresión de secuencias codificadoras de MDV, particularmente de secuencias que codifican glicoproteínas antigénicamente relevantes de MDV, en vectores de virus vaccinia.

Es otro objeto de esta invención proporcionar una vacuna que sea capaz de producir anticuerpos neutralizantes del MDV y una inmunidad protectora frente a la infección por MDV.

Estos y otros objetos y ventajas de la presente invención serán obvios más fácilmente después de considerar lo que sigue.

Exposición de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a un virus vaccinia recombinante que contiene en el mismo una secuencia de ADN procedente de MDV en una región no esencial del genoma del virus vaccinia.

De acuerdo con la presente invención, el virus vaccinia recombinante expresa un antígeno de MDV. En particular, el ADN de MDV foráneo codifica una proteína estructural, especialmente una glicoproteína antigénicamente relevante, de MDV. De manera ventajosa, una pluralidad de glicoproteínas de MDV son coexpresadas en el huésped por el poxvirus recombinante.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una vacuna para inducir una respuesta inmunológica en un animal huésped inoculado con la vacuna, incluyendo dicha vacuna un vehículo y un virus vaccinia recombinante que contiene, en una región no esencial del mismo, ADN de MDV. De manera ventajosa, el ADN codifica y expresa una proteína estructural del MDV, particularmente una glicoproteína de MDV. Una pluralidad de glicoproteínas de MDV son coexpresadas en el huésped de manera ventajosa.

Breve descripción de las figuras

Se tendrá una mejor comprensión de la presente invención mediante referencia a las figuras acompañantes, en las cuales:

La Fig. 1 muestra esquemáticamente un método para la construcción del plásmido pSD460 para la deleción del gen de la timidina quinasa y la producción del virus vaccinia recombinante vP410.

La Fig. 2 muestra esquemáticamente un método para la construcción del plásmido pSD486 para la deleción de la región hemorrágica y la producción del virus vaccinia recombinante vP553.

La Fig. 3 muestra esquemáticamente un método para la construcción del plásmido pMP494\Delta para la deleción de la región ATI y la producción del virus vaccinia recombinante vP618.

La Fig. 4 muestra esquemáticamente un método para la construcción del plásmido pSD467 para la deleción del gen de la hemaglutinina y la producción del virus vaccinia recombinante vP723.

La Fig. 5 muestra esquemáticamente un método para la construcción del plásmido pMPCSK1\Delta para la deleción del agrupamiento de genes [C7L - K1L] y la producción del virus vaccinia recombinante vP804.

La Fig. 6 muestra esquemáticamente un método para la construcción del plásmido pSD548 para la deleción de la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa y la producción del virus vaccinia recombinante vP866 (NYVAC).

Descripción detallada de la invención

La invención está dirigida a un virus vaccinia recombinante que contiene en el mismo ADN que codifica un antígeno del virus de la Enfermedad de Marek en una región no esencial del genoma del virus vaccinia, donde se han eliminado el gen TK, la región hemorrágica, la región de los cuerpos de inclusión de tipo A, el gen de la hemaglutinina, la región C7L-K1L y la subunidad grande del gen de la ribonucleótido reductasa del genoma del virus vaccinia.

En particular, se aislaron genes del MDV que codifican proteínas estructurales de MDV, se caracterizaron y se insertaron en los recombinantes NYVAC (virus vaccinia).

Líneas celulares y cepas de virus

La cepa de virus vaccinia utilizada como rescate de las secuencias de MDV fue NYVAC (vP866). NYVAC es una cepa muy atenuada de virus vaccinia derivada de la cepa Copenhagen por deleción de 18 marcos de lectura abiertos que han sido implicados en la determinación de la virulencia del virus y en la restricción del rango de huéspedes. La selección de placas recombinantes y las amplificaciones del virus se llevaron a cabo en células de riñón de conejo (RK13, ATCC CCL37).

Los plásmidos pMDV517 y pUC13gB contienen secuencias de ADN que codifican las glicoproteínas gD y gB de MDV de la cepa RB1B. El plásmido pUC13gB contiene un fragmento de ADN de 3,9 kb de ADN genómico de MDV (cepa RB1B). El fragmento que contiene el gen de la gB del MDV es insertado en pUC13 como un fragmento EcoRI-SalI. La secuencia del fragmento insertado está descrita en Ross y col. (1989). El plásmido pMDV517 contiene un fragmento de ADN de 5,2 kb de ADN genómico de MDV (cepa RB1B). El fragmento que contiene el gen de la gD del MDV es insertado en el sitio de EcoRI de pUC13. La secuencia del fragmento está descrita en Ross y col. (1991).

Ejemplo 1 Cepa vacuna de vaccinia atenuado NYVAC

Con el fin de desarrollar una nueva cepa vacuna de vaccinia, la cepa vacuna Copenhagen del virus vaccinia fue modificada por la deleción de seis regiones no esenciales del genoma que codifican factores de virulencia conocidos o potenciales. Las deleciones secuenciales se detallan a continuación. Todas las denominaciones de los fragmentos de restricción de vaccinia, de los marcos de lectura abiertos y de las posiciones de nucleótidos se basan en la terminología descrita por Goebel y col. (1990a,b).

Los loci de deleción fueron también proyectados como loci receptores para la inserción de genes foráneos.

Las regiones eliminadas secuencialmente en NYVAC están enumeradas a continuación. Se enumeran también las abreviaturas y las denominaciones de los marcos de lectura abiertos de las regiones eliminadas (Goebel y col., 1990a,b) y la denominación del recombinante de vaccinia (vP) que contiene todas las deleciones mediante la deleción especificada.

(1)

gen de la timidina quinasa (TK; JR2) vP410;

(2)

región hemorrágica (u; B13R + B14R) vP553;

(3)

región de cuerpos de inclusión de tipo A (ATI; A26L) vP618;

(4)

gen de la hemaglutinina (HA; A56R) vP723;

(5)

región de genes del rango de huéspedes (C7L - K1L) vP804; y

(6)

subunidad grande, ribonucleótido reductasa (I4L) vP866 (NYVAC).

Clonaje y Síntesis de ADN. Los plásmidos fueron construidos, seleccionados y cultivados mediante procedimientos estándar (Maniatis y col., 1982; Perkus y col., 1985; Piccini y col., 1987). Las endonucleasas de restricción fueron obtenidas de GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD; New England Biolabs, Beverly, MA; y Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN. El fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli fue obtenido de Boehringer Mannheim Biochemicals. La exonucleasa BAL-31 y la ADN ligasa del fago T4 fueron obtenidas de New England Biolads. Los reactivos fueron utilizados según las especificaciones de los diferentes proveedores.

Los oligodesoxirribonucleótidos sintéticos fueron preparados en un sintetizador de ADN Biosearch 8750 o Applied Biosystems 380B según se describió previamente (Perkus y col., 1989). La secuenciación del ADN fue realizada por el método de la terminación de la cadena en didesoxi (Sanger y col., 1977) utilizando Sequenasa (Tabor y col., 1987) según se describió previamente (Guo y col., 1989). La amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la verificación de las secuencias (Engelke y col., 1988) fue realizada utilizando cebadores oligonucleotídicos sintetizados a medida y el Kit de Reactivos para la Amplificación de ADN GeneAmp (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) en un Ciclador Térmico de ADN automatizado de Perkin Elmer Cetus. Las secuencias de ADN en exceso fueron eliminadas de los plásmidos mediante digestión con endonucleasas de restricción seguido por digestión limitada con la exonucleasa BAL-31 y mutagénesis (Mandecki, 1986) utilizando oligonucleótidos
sintéticos.

Células, Virus y Transfección. Los orígenes y las condiciones del cultivo de la cepa Copenhagen del virus vaccinia han sido descritos previamente (Guo y col., 1989). La producción de virus recombinantes mediante recombinación, la hibridación in situ de filtros de nitrocelulosa y la selección por actividad \beta-galactosidasa se realizaron según se describió previamente (Panicali y col., 1982; Perkus y col., 1989).

Construcción del Plásmido pSD460 para la Deleción del Gen de la Timidina Quinasa (JR2). Haciendo referencia ahora a la Fig. 1, el plásmido pSD406 contiene J de HindIII de vaccinia (pos. 83359 - 88377) clonado en pUC8. El pSD406 fue cortado con HindIII y PvuII, y el fragmento de 1,7 kb del lado izquierdo de J de HindIII clonado en pUC8 cortado con HindIII/SmaI, formando pSD447. El pSD447 contiene el gen completo de J2R (pos. 83855 - 84385). El codón de inicio está contenido en un sitio de NlaIII y el codón de terminación está contenido en un sitio de SspI. La dirección de la transcripción está indicada por una flecha en la Fig. 1.

Con el fin de obtener un brazo flanqueante izquierdo, se aisló de pSD447 un fragmento HindIII/EcoRI de 0,8 kb, posteriormente se sometió a digestión con NlaIII y se aisló un fragmento HindIII/NlaIII de 0,5 kb. Los oligonucleótidos sintéticos hibridados MPSYN43/MPSYN44 (SEC ID Nº:1/SEC ID Nº:2)

1

fueron ligados con el fragmento HindIII/NlaIII de 0,5 kb en el vector plasmídico pUC18 cortado con HindIII/EcoRI, generando el plásmido pSD449.

Para obtener un fragmento de restricción conteniendo un brazo flanqueante derecho de vaccinia y secuencias del vector pUC, pSD447 fue cortado con SspI (parcial) en las secuencias de vaccinia y con HindIII en la unión pUC/vaccinia, y se aisló un fragmento del vector de 2,9 kb. Este fragmento del vector fue ligado con los oligonucleótidos sintéticos hibridados MPSYN45/MPSYN46 (SEC ID Nº:3/SEC ID Nº:4)

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2

generando pSD459.

Con el fin de combinar los brazos flanqueantes izquierdo y derecho en un plásmido, se aisló un fragmento HindIII/SmaI de 0,5 kb de pSD449 y se ligó con el vector plasmídico pSD459 cortado con HindIII/SmaI, generando el plásmido pSD460. El pSD460 fue utilizado como plásmido donante para la recombinación con el virus vaccinia parental de tipo salvaje de la cepa Copenhagen VC-2. Se sintetizó una sonda marcada con ^{32}P mediante extensión de los cebadores utilizando como molde MPSYN45 (SEC ID Nº:3) y el oligonucleótido 20mero complementario MPSYN47 (SEC ID Nº:5) (5' TTAGTTAATTAGGCGGCCGC 3') como cebador. El virus recombinante vP410 fue identificado mediante hibridación de placas.

Construcción del Plásmido pSD486 para la Deleción de la Región Hemorrágica (B13R + B14R). Haciendo referencia ahora a la Fig. 2, el plásmido pSD419 contiene G de SalI de vaccinia (pos. 160.774 - 173.351) clonado en pUC8. El pSD422 contiene el fragmento de SalI de vaccinia contiguo hacia la derecha, J de SalI (pos. 173.351 - 182.746) clonado en pUC8. Para construir un plásmido en el que se había eliminado la región hemorrágica, u, B13R - B14R (pos. 172.549 - 173.552), se utilizó pSD419 como fuente del brazo flanqueante izquierdo y se utilizó pSD422 como fuente del brazo flanqueante derecho. La dirección de la transcripción de la región u está indicada por una flecha en la Fig. 2.

Con el fin de eliminar secuencias no deseadas de pSD419, secuencias hacia la izquierda del sitio de NcoI (pos. 172.253) fueron eliminadas por digestión de pSD419 con NcoI/SmaI, seguido por la formación de extremos romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y ligadura, generando el plásmido pSD476. Se obtuvo un brazo flanqueante derecho de vaccinia mediante digestión de pSD422 con HpaI en el codón de terminación de B14R y mediante digestión con NruI 0,3 kb hacia la derecha. Este fragmento de 0,3 kb fue aislado y ligado con un fragmento del vector de HincII de 3,4 kb aislado de pSD476, generando el plásmido pSD477. La localización de la deleción parcial de la región u de vaccinia en pSD447 está indicada por un triángulo. Las restantes secuencias codificadoras de B13R en pSD477 fueron eliminadas por digestión con ClaI/HpaI, y el fragmento del vector resultante fue ligado con los oligonucleótidos sintéticos hibridados SD22mero/SD20mero (SEC ID Nº:6/SEC ID Nº:7)

3

generando pSD479. El pSD479 contiene un codón de inicio (subrayado) seguido por un sitio de BamHI. Con el fin de colocar la beta-galactosidasa de E. coli en el locus de deleción de B13-B14 (u) bajo el control del promotor de u, un fragmento de BamHI de 3,2 kb que contenía el gen de la beta-galactosidasa (Shapira y col., 1983) fue insertado en el sitio de BamHI de pSD479, generando pSD479BG. El pSD479BG fue utilizado como plásmido donante para la recombinación con el virus vaccinia vP410. El virus vaccinia recombinante vP533 fue aislado como una placa azul en presencia del sustrato cromogénico X-gal. En vP533 la región B13R - B14R está eliminada y ha sido sustituida por el gen de la beta-galactosidasa.

Con el fin de eliminar las secuencias de la beta-galactosidasa de vP533, se utilizó el plásmido pSD486, un derivado de pSD477 que contiene una región poliadaptadora pero no el codón de inicio en la unión de la deleción de u. Primeramente el fragmento del vector ClaI/HpaI de pSD477 referido anteriormente fue ligado con los oligonucleótidos sintéticos hibridados SD42mero/SD40mero (SEC ID Nº:8/SEC ID Nº:9)

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4

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generando el plásmido pSD478. A continuación, el sitio de EcoRI en la unión pUC/vaccinia fue destruido mediante digestión de pSD478 con EcoRI seguido por la producción de extremos romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y ligadura, generando el plásmido pSD478E^{-}. El pSD478E^{-} fue digerido con BamHI y HpaI y ligado con los oligonucleótidos sintéticos hibridados HEM5/HEM6 (SEC ID Nº:10/SEC ID Nº:11)

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generando el plásmido pSD486. El pSD486 fue utilizado como plásmido donante para la recombinación con el virus vaccinia recombinante vP533, generando vP553, que fue aislado como una placa clara en presencia de X-gal.

Construcción del Plásmido pMP494\Delta para la Deleción de la Región ATI (A26L). Haciendo referencia ahora a la Fig. 3, pSD414 contiene B de SalI clonado en pUC8. Con el fin de eliminar secuencias de ADN no deseadas hacia la izquierda de la región A26L, pSD414 fue cortado con XbaI dentro de las secuencias de vaccinia (pos. 137.079) y con HindIII en la unión pUC/vaccinia; posteriormente se hizo de extremos romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y se ligó, teniendo como resultado el plásmido pSD483. Para eliminar secuencias de ADN de vaccinia no deseadas a la derecha de la región A26L, pSD483 fue cortado con EcoRI (pos. 140.665 y en la unión pUC/vaccinia) y ligado, formando el plásmido pSD484. Para eliminar la región codificadora A26L, pSD484 fue cortado con NdeI (parcial) ligeramente corriente arriba del ORF de A26L (pos. 139.004) y con HpaI (pos. 137.889) ligeramente corriente abajo del ORF de A26L. El fragmento del vector de 5,2 kb fue aislado y ligado con los oligonucleótidos sintéticos hibridados ATI3/ATI4 (SEC ID Nº:12/SEC ID Nº:13)

\vskip1.000000\baselineskip

6

reconstruyendo la región corriente arriba de A26L y sustituyendo el ORF de A26L por una región poliadaptadora corta que contiene los sitios de restricción de BglII, EcoRI y HpaI, según se indicó anteriormente. El plásmido resultante fue denominado pSD485. Como los sitios de BglII y EcoRI en la región del poliadaptador de pSD485 no son únicos, los sitios de BglII y EcoRI no deseados fueron eliminados del plásmido pSD483 (descrito anteriormente) mediante digestión con BglII (pos. 140.136) y con EcoRI en la unión pUC/vaccinia, seguido por la creación de extremos romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y ligadura. El plásmido resultante fue denominado pSD489. El fragmento ClaI (pos. 137.198)/EcoRV (pos. 139.048) de 1,8 kb de pSD489 que contiene el ORF de A26L fue sustituido por el fragmento correspondiente ClaI/EcoRV de 0,7 kb que contiene el poliadaptador de pSD485, generándose pSD492. Los sitios de BglII y EcoRI en la región del poliadaptador de pSD492 son únicos.

Un casete de BglII de 3,3 kb que contenía el gen de la beta-galactosidasa de E. coli (Shapira y col., 1983) bajo el control del promotor de 11 kDa de vaccinia (Bertholet y col., 1985; Perkus y col., 1990) fue insertado en el sitio de BglII de pSD492, formando pSD493KBG. El plásmido pSD493KBG fue utilizado en la recombinación con el virus de rescate vP553. El virus vaccinia recombinante, vP581, que contenía beta-galactosidasa en la región de deleción de A26L, fue aislado como una placa azul en presencia de X-gal.

Con el fin de generar un plásmido para la eliminación de las secuencias de beta-galactosidasa del virus vaccinia recombinante vP581, la región del poliadaptador del plásmido pSD492 fue eliminada por mutagénesis (Mandecki, 1986) utilizando el oligonucleótido sintético MPSYN177 (SEC ID Nº:14)

(5' AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTATATAACTTATTTTTTGAATATAC 3'). En el plásmido resultante, pMP494\Delta, el ADN de vaccinia que abarca las posiciones (137.889 - 138.937) y que incluye el ORF completo de A26L, está eliminado. La recombinación entre el pMP494\Delta y el virus vaccinia recombinante que contiene beta-galactosidasa, vP581, tuvo como resultado el mutante de vaccinia por deleción vP618, que fue aislado como una placa clara en presencia de X-gal.

Construcción del Plásmido pSD467 para la Deleción del Gen de la Hemaglutinina (A56R). Haciendo referencia ahora a la Fig. 4, el fragmento de restricción G de SalI de vaccinia (pos. 160.744 - 173.351) cruza la unión A/B de HindIII (pos. 162.539). El pSD419 contiene el fragmento G de SalI de vaccinia clonado en pUC8. La dirección de la transcripción del gen de la hemaglutinina (HA) está indicada por una flecha en la Fig. 4. Secuencias de vaccinia derivadas de B de HindIII fueron eliminadas mediante digestión de pSD419 con HindIII en las secuencias de vaccinia y en la unión pUC/vaccinia seguido por ligadura. El plásmido resultante, pSD456, contiene el gen de la HA, A56R, flanqueado por 0,4 kb de secuencias de vaccinia hacia la izquierda y 0,4 kb de secuencias de vaccinia hacia la derecha. Las secuencias codificadoras de A56R fueron eliminadas cortando pSD456 con RsaI (parcial; pos. 161.090) corriente arriba de las secuencias codificadoras de A56R y con EagI (pos. 162.054) cerca del extremo del gen. El fragmento del vector RsaI/EagI de 3,6 kb procedente de pSD456 fue aislado y ligado con los oligonucleótidos sintéticos hibridados MPSYN59 (SEC ID Nº:15), MPSYN62 (SEC ID Nº:16), MPSYN60 (SEC ID Nº:17) y MPSYN61
(SEC ID Nº:18)

7

reconstruyendo las secuencias de ADN corriente arriba del ORF de A56R y sustituyendo el ORF de A56R por una región poliadaptadora según se indicó anteriormente. El plásmido resultante es pSD466. La deleción de vaccinia en pSD466 abarca las posiciones (161.185 - 162.053). El lugar de la deleción en pSD466 está indicado por un triángulo en la Fig. 4.

Un casete de BglII/BamHI (parcial) de 3,2 kb que contenía el gen de la beta-galactosidasa de E. coli (Shapira y col., 1983) bajo el control del promotor de 11 kDa de vaccinia (Bertholet y col., 1985; Guo y col., 1989) fue insertado en el sitio de BglII de pSD466, formando pSD466KBG. El plásmido pSD466KBG fue utilizado en la recombinación con el virus de rescate vP618. El virus vaccinia recombinante, vP708, que contenía beta-galactosidasa en la deleción de A56R, fue aislado como una placa azul en presencia de X-gal.

Las secuencias del gen de la beta-galactosidasa fueron eliminadas de vP708 utilizando el plásmido donante pSD467. El pSD467 es idéntico a pSD466, excepto en que los sitios de EcoRI, SmaI y BamHI fueron eliminados de la unión pUC/vaccinia por digestión de pSD466 con EcoRI/BamHI, seguido por la formación de extremos romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y ligadura. La recombinación entre vP708 y pSD467 tuvo como resultado un mutante de vaccinia por deleción recombinante, vP723, que fue aislado como una placa clara en presencia de X-gal.

Construcción del Plásmido pMPCSK1\Delta para la Deleción de Marcos de Lectura Abiertos (C7L - K1L). Con referencia ahora a la Fig. 5, se utilizaron los siguientes clones de vaccinia en la construcción de pMPCSK1\Delta. H de SalI de pSD420 es clonado en pUC8. F de KpnI de pSD435 es clonado en pUC18. El pSD435 fue cortado con SphI y vuelto a ligar, formando pSD451. En pSD451, las secuencias de ADN a la izquierda del sitio de SphI (pos. 27.416) en M de HindIII están eliminadas (Perkus y col., 1990). M de HindIII de pSD409 es clonado en pUC8.

Con el fin de proporcionar un sustrato para la deleción del agrupamiento de genes (C7L - K1L) de vaccinia, el gen de la beta-galactosidasa de E. coli fue insertado primeramente en el locus de deleción de M2L de vaccinia (Guo y col., 1990) según sigue. Para eliminar el sitio de BglII en pSD409, el plásmido fue cortado con BglII en las secuencias de vaccinia (pos. 28.212) y con BamHI en la unión pUC/vaccinia, y ligado posteriormente para formar el plásmido pMP409B. El pMP409B fue cortado en el único sitio de SphI (pos. 27.416). Las secuencias codificadoras de M2L fueron eliminadas por mutagénesis (Guo y col., 1990; Mandecki, 1986) utilizando un oligonucleótido sintético.

8

El plásmido resultante, pMP409D, contiene un único sitio de BglII insertado en el locus de deleción de M2L según se indicó anteriormente. Un casete de BamHI (parcial)/BglII de 3,2 kb, que contenía el gen de la beta-galactosidasa de E. coli (Shapira y col., 1983) bajo el control del promotor de 11 kDa (Bertholet y col., 1985) fue insertado en pMP409D cortado con BglII. El plásmido resultante, pMP409DBG (Guo y col., 1990), fue utilizado como plásmido donante para la recombinación con el virus vaccinia de rescate vP723. El virus vaccinia recombinante, vP784, que contenía el gen de la beta-galactosidasa insertado en el locus de deleción de M2L, fue aislado como una placa azul en presencia de X-gal.

Un plásmido en el que se habían eliminado los genes de vaccinia (C7L - K1L) fue ensamblado en pUC8 cortado con SmaI, HindIII y hecho de extremos romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli. El brazo flanqueante de la izquierda que constaba de secuencias de C de HindIII de vaccinia fue obtenido por digestión de pSD420 con XbaI (pos. 18.628) seguido por la formación de extremos romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y la digestión con BglII (pos. 19.706). El brazo flanqueante derecho que constaba de secuencias de K de HindIII de vaccinia fue obtenido por disgestión de pSD451 con BglII (pos. 29.062) y EcoRV (pos. 29.778). En el plásmido resultante, pMP581CK, se han eliminado las secuencias de vaccinia entre el sitio de BglII (pos. 19.706) en C de HindIII y el sitio de BglII (pos. 29.062) en K de HindIII. El lugar de la deleción de las secuencias de vaccinia en el plásmido pMP581CK está indicado por un triángulo en la Fig. 5.

Para eliminar el exceso de ADN en la unión de la deleción de vaccinia, el plásmido pMP581CK fue cortado en los sitios de NcoI en las secuencias de vaccinia (pos. 18.811; 19.655), tratado con la exonucleasa BAL-31 y sometido a mutagénesis (Mandecki, 1986) utilizando el oligonucleótido sintético MPSYN233 (SEC ID Nº:20)

5' TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT 3'.

En el plásmido resultante, pMPCSK1\Delta se han eliminado las secuencias de vaccinia en las posiciones 18.805 - 29.108, que abarcan 12 marcos de lectura abiertos de vaccinia (C7L - K1L). La recombinación entre pMPCSK1\Delta y el recombinante de vaccinia que contenía el gen de la beta- galactosidasa, vP784, tuvo como resultado el mutante de vaccinia por deleción vP804, que fue aislado como una placa clara en presencia de X-gal.

Construcción del Plásmido pSD548 para la Deleción de la Subunidad Grande, Ribonucleótido Reductasa (I4L). Haciendo referencia ahora a la Fig. 6, el plásmido pSD405 contiene I de HindIII de vaccinia (pos. 63.875 - 70.367) clonado en pUC8. El pSD405 fue digerido con EcoRV en las secuencias de vaccinia (pos. 67.933) y con SmaI en la unión pUC/vaccinia, y ligado, formando el plásmido pSD518. El pSD518 fue utilizado como fuente de todos los fragmentos de restricción de vaccinia utilizados en la construcción de pSD458.

El gen I4L de vaccinia se extiende desde la posición 67.371 hasta la 65.059. La dirección de la transcripción de I4L está indicada por una flecha en la Fig. 6. Con el fin de obtener un fragmento del vector plasmídico en el que se había eliminado una porción de las secuencias codificadoras de I4L, pSD518 fue digerido con BamHI (pos. 65.381) y HpaI (pos. 67.001) y hecho de extremos romos utilizando el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli. Este fragmento del vector de 4,8 kb fue ligado con un casete de SmaI de 3,2 kb que contenía el gen de la beta-galactosidasa de E. coli (Shapira y col., 1983) bajo el control del promotor de 11 kDa de vaccinia (Bertholet y col., 1985; Perkus y col., 1990), teniendo como resultado el plásmido pSD524KBG. El pSD524KBG fue utilizado como plásmido donante para la recombinación con el virus vaccinia vP804. El virus vaccinia recombinante, vP855, que contenía el gen de la beta-galactosidasa en una deleción parcial del gen I4L, fue aislado como una placa azul en presencia de
X-gal.

Para eliminar el gen de la beta-galactosidasa y el resto del ORF de I4L del virus vP855, se construyó el plásmido de deleción pSD548. Los brazos flanqueantes de vaccinia izquierdo y derecho fueron ensamblados separadamente en pUC8 según se detalla a continuación y se presenta esquemáticamente en la Fig. 6.

Con el fin de construir un vector plasmídico para aceptar el brazo flanqueante izquierdo de vaccinia, pUC8 fue cortado con BamHI/EcoRI y ligado con los oligonucleótidos sintéticos hibridados 518A1/518A2 (SEC ID Nº:21/SEC ID Nº:22)

9

formando el plásmido pSD531. El pSD531 fue cortado con RsaI (parcial) y BamHI y se aisló un fragmento del vector de 2,7 kb. El pSD518 fue cortado con BglII (pos. 64.459)/RsaI (pos. 64.994) y se aisló un fragmento de 0,5 kb. Los dos fragmentos fueron ligados entre sí formando pSD537, que contiene el brazo flanqueante completo de vaccinia a la izquierda de las secuencias codificadoras de I4L.

Con el fin de construir un vector plasmídico para aceptar el brazo flanqueante de vaccinia derecho, pUC8 fue cortado con BamHI/EcoRI y ligado con los oligonucleótidos sintéticos hibridados 518B1/518B2 (SEC ID Nº:23/SEC ID Nº:24)

10

formando el plásmido pSD532. El pSD532 fue cortado con RsaI (parcial)/EcoRI y se aisló un fragmento del vector de 2,7 kb. El pSD518 fue cortado con RsaI dentro de las secuencias de vaccinia (pos. 67.436) y EcoRI en la unión vaccinia/pUC, y se aisló un fragmento de 0,6 kb. Los dos fragmentos fueron ligados entre sí formando pSD538, que contiene el brazo flanqueante de vaccinia completo a la derecha de las secuencias codificadoras de I4L.

El brazo flanqueante derecho de vaccinia fue aislado como un fragmento EcoRI/BglII de 0,6 kb de pSD538 y ligado en el vector plasmídico pSD537 cortado con EcoRI/BglII. En el plásmido resultante, pSD539, el ORF de I4L (pos. 65.047 - 67.386) está sustituido por una región poliadaptadora que está flanqueada por 0,6 kb de ADN de vaccinia hacia la izquierda y 0,6 kb de ADN de vaccinia hacia la derecha, todo en un fondo de pUC. El lugar de la deleción en las secuencias de vaccinia está indicado por un triángulo en la Fig. 6. Con el fin de evitar la posible recombinación de secuencias del gen de la beta-galactosidasa de la porción de pSD539 derivada de pUC con secuencias del gen de la beta-galactosidasa del virus vaccinia recombinante vP855, el casete de deleción de I4L de vaccinia fue movido desde pSD539 a pRC11, un derivado de pUC del que se han eliminado todas las secuencias del gen de la beta-galactosidasa y han sido sustituidas por una región poliadaptadora (Colinas y col., 1990). El pSD539 fue cortado con EcoRI/PstI y se aisló el fragmento de 1,2 kb. Este fragmento fue ligado en pRC11 cortado con EcoRI/PstI (2,35 kb), formando pSD548. La recombinación entre pSD548 y el recombinante de vaccinia que contenía el gen de la beta-galactosidasa, vP855, tuvo como resultado el mutante de vaccinia por deleción vP866, que fue aislado como una placa clara en presencia de X-gal.

El ADN del virus vaccinia recombinante vP866 fue analizado mediante digestión de restricción seguido por electroforesis en un gel de agarosa. Los patrones de restricción fueron según lo esperado. Reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) (Engelke y col., 1988) utilizando vP866 como molde y cebadores que flanqueaban los seis loci de deleción detallados anteriormente, produjeron fragmentos de ADN de los tamaños esperados. El análisis de la secuencia de los fragmentos generados en la PCR alrededor de las áreas de las uniones de la deleción confirmó que las uniones eran según lo esperado. El virus vaccinia recombinante vP866, que contenía las seis deleciones producidas por ingeniería genética según se describió anteriormente, fue denominado vacuna vaccinia cepa "NYVAC".

Ejemplo 2 Construcciones de Plásmidos

Construcción de un Plásmido para la Inserción de gB de MDV en Virus Vaccinia. El plásmido pRW878, previamente descrito, fue digerido con HincII y el fragmento de 2,8 kpb que contenía la secuencia codificadora de gB de MDV unida al promotor H6 del virus vaccinia fue insertado en el sitio de SmaI del plásmido de inserción de vaccinia pSD553VC para derivar el plásmido pRW879. El plásmido pSD553VC es un plásmido de inserción que utiliza el sistema de selección del rango de huéspedes descrito en Perkus y col. (1989). En este plásmido, el gen K1L del virus vaccinia y las regiones poliadaptadoras están situados en los brazos flanqueantes de vaccinia Copenhagen, sustituyendo a la región ATI (marcos de lectura abiertos A25L y A26L) descrita en Goebel y col. (1990a,b). La región completa está en un vector pUC8 y los lugares de inserción están flanqueados por codones de parada de la traducción y por señales de parada de la transcripción. El plásmido pRW879 fue utilizado en la recombinación in vitro con NYVAC (vP866) como virus de rescate para derivar el recombinante vP935 que expresaba el gen de gB de
Marek.

Construcción de un Plásmido para la Inserción de gD de MDV en Virus Vaccinia. Se utilizaron cuatro reacciones de PCR para crear un plásmido de inserción. En la reacción 1, se utilizó el plásmido pRW880 como molde para derivar un fragmento que contenía la secuencia del promotor H6 del virus vaccinia ligada a la secuencia 5' de gD de MDV con el ATG del promotor solapando con el ATG de inicio del gen de gD de MDV. El plásmido pRW880 contiene la secuencia del promotor H6 previamente descrita ligada a un gen no pertinente en el locus de inserción de F16. Los cebadores utilizados en esta reacción fueron RW389 (SEC ID Nº:36) y RW390 (SEC ID Nº:37).

RW389: TGAGATATATCTAAAGAAGAATACTTTCATTACGATACAAACTTAAC

RW390: TAATATAATCTTTTATAC

En la segunda y en la tercera reacción de PCR, se utilizó pMDV517 como molde. El plásmido pMDV517 contiene un fragmento de ADN de 5,2 kb que contiene el gen de gD de MDV insertado en el sitio de EcoRI de pUC13. El objeto de las reacciones era cambiar dos señales internas TTTTTNT para eliminar la posibilidad de terminación prematura (Yuen y Moss, 1987). En la reacción 2, se utilizaron los oligonucleótidos RW386 (SEC ID Nº:38) y RW391 (SEC ID Nº:39) como cebadores para cambiar TTTTTTTTT por TTCTTCTTT.

RW386: CCGTTCAGCTTCTTCGTCAATGGTACAACACGGCTGTTAGAC

RW391: GAGCGGTCGACAAGCTTATAGGCGGGAATATGC

En la reacción 3, se utilizaron los oligonucleótidos RW387 (SEC ID Nº:40) y RW388 (SEC ID Nº:41) para cambiar la secuencia TTTTTTTGT por CTTCTTCGT.

RW387: TGTTGTACCATTGACGAAGAAGCTGAACGGTTTGCATAGTTTGTTATC

RW388: ATGAAAGTATTCTTCTTTAGATATATCTCATCCAC

Los productos de las tres reacciones de PCR fueron agrupados y cebados con RW390 (SEC ID Nº:37) y RW391 (SEC ID Nº:39) para una cuarta reacción de PCR. El producto de la última reacción de PCR fue cortado con NruI y HindIII, teniendo como resultado un fragmento de 1,2 kpb que contenía el extremo 3' del promotor H6 y la secuencia codificadora de gD de MDV. El plásmido pRW880 (derivación descrita más adelante) fue digerido con NruI y HindIII (que elimina el gen no pertinente dejando el extremo 5' del promotor H6), y ligado con el fragmento de 1,2 kb obtenido después de la digestión del producto de la última PCR. El plásmido resultante, pRW893, fue digerido posteriormente con NotI, liberando un fragmento de 1,4 kpb que contenía el gen de gD de MDV con el promotor H6 que fue insertado en el sitio de SmaI de pSD533VC previamente descrito para generar pRW894. El plásmido pRW894 fue utilizado en la recombinación in vitro con NYVAC (vP866) como virus de rescate para generar el recombinante vP1005 que expresaba el gen de gD de Marek.

Ejemplo 3 Desarrollo de un Recombinante basado en el Virus Vaccinia que Expresa Glicoproteínas de MDV

Los plásmidos previamente descritos fueron transfectados a células infectadas con NYVAC mediante la utilización del método de precipitación con fosfato de calcio previamente descrito (Panicali y Paoletti, 1982; Piccini y col., 1987). Las placas positivas fueron seleccionadas sobre la base de la hibridación con sondas radiomarcadas específicas de MDV y sometidas a rondas secuenciales de purificación de placas hasta que se consiguió una población pura. Las placas representativas de cada IVR fueron luego amplificadas y se estableció una solución madre de
virus.

Se llevó a cabo una inmunofluorescencia indirecta según está descrito en Taylor y col. (1990) utilizando un suero policlonal anti-MDV de pollo denominado #392 de pollo.

Las reacciones de inmunoprecipitación se realizaron según está descrito en Taylor y col. (1990) utilizando el reactivo descrito anteriormente.

NYVAC Recombinantes que Expresan Glicoproteínas de MDV. La transfección del plásmido pRW879 dio lugar al desarrollo del NYVAC recombinante vP935. El análisis de inmunofluorescencia indicó que se expresaba una proteína reconocida por suero inmune a MDV en la superficie de las células infectadas. El análisis de inmunoprecipitación utilizando el mismo suero inmune de pollo detectó la presencia de tres productos de expresión principales con pesos moleculares aproximados de 110 kDa, 64 kDa y 48 kDa. Estos tamaños corresponden a los productos esperados del gen de gB de MDV.

La transfección del plásmido pRW894 condujo al desarrollo del NYVAC recombinante vP1005. Un ensayo de inmunoselección de placas indicó que se expresaba una proteína reconocida por el suero inmune a MDV en la superficie de las células infectadas. El análisis de inmunoprecipitación indicaba la producción de dos productos con pesos moleculares de aproximadamente 45 kDa (correspondiente a la forma precursora de la proteína) y 65 kDa que representa la glicoproteína procesada.

Referencias

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Claims (13)

1. Un virus vaccinia recombinante que contiene en el mismo ADN que codifica una glicoproteína antigénica o una proteína estructural antigénica del virus de la enfermedad de Marek en una región no esencial del genoma del virus vaccinia, en el que el gen de TK, la región hemorrágica, la región de los cuerpos de inclusión de tipo A, el gen de la hemaglutinina, la región C7L - K1L y el gen de la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa han sido eliminados del genoma del virus vaccinia.

2. El virus vaccinia recombinante como en la reivindicación 1, en el que dicho ADN codifica una proteína estructural del virus de la enfermedad de Marek.

3. El virus vaccinia recombinante como en la reivindicación 2, en el que dicho ADN codifica una glicoproteína del virus de la enfermedad de Marek.

4. El virus vaccinia recombinante como en la reivindicación 3, en el que dicho ADN codifica la glicoproteína gB del virus de la enfermedad de Marek.

5. El virus vaccinia recombinante como en la reivindicación 3, en el que dicho ADN codifica la glicoproteína gD del virus de la enfermedad de Marek.

6. Una vacuna para inducir una respuesta inmunológica en un animal huésped inoculado con dicha vacuna, conteniendo dicha vacuna un vehículo y un virus vaccinia recombinante que contiene, en una región no esencial del mismo, ADN que codifica una glicoproteína antigénica o una proteína estructural antigénica del virus de la enfermedad de Marek en el que el gen de TK, la región hemorrágica, la región de los cuerpos de inclusión de tipo A, el gen de la hemaglutinina, la región C7L - K1L y el gen de la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa han sido eliminados del genoma del virus vaccinia.

7. La vacuna como en la reivindicación 6, en la que dicho ADN codifica y expresa una proteína estructural del virus de la enfermedad de Marek.

8. La vacuna como en la reivindicación 7, en la que dicho ADN codifica y expresa una glicoproteína del virus de la enfermedad de Marek.

9. La vacuna como en la reivindicación 8, en la que dicho ADN codifica y expresa la glicoproteína gB del virus de la enfermedad de Marek.

10. La vacuna como en la reivindicación 8, en la que dicho ADN codifica y expresa la glicoproteína gD del virus de la enfermedad de Marek.

11. La vacuna como en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde el animal huésped es un pollo.

12. Un proceso para la preparación del virus vaccinia recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende la transfección de células infectadas con virus vaccinia con

(a) un plásmido que contiene las secuencia codificadoras respectivas y

(b) plásmidos en los que se han eliminado los genes respectivos,

la selección, purificación y amplificación de las placas positivas para obtener el virus deseado.

13. Un proceso para la preparación de la vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, que comprende la combinación del vehículo y el virus vaccinia recombinante.