ES2235330T3 - Analogos de saponionas triterpenicas que tienen actividad ayuvante. - Google Patents
Analogos de saponionas triterpenicas que tienen actividad ayuvante.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a compuestos químicos nuevos en los que un resto lipofílico tal como un lípido, un ácido graso, polietilen glicol o terpeno se fija covalentemente a la saponina triterpénica no acilada o desacilada por el intermediario de un grupo carbonilo presente en el ácido 3-O-glucurónico de la saponina triterpénica. La fijación de un resto lipofílico al ácido 3-O-glucurónico de una saponina, tal como la Quillaja desacilsaponina, la luciosida P, o saponina de de la Gypsophila, de la Saponaria y de Acanthophyllum incrementa sus efectos adyuvantes obre la inmunidad inducida por los humores y las células. Adicionalmente, la fijación de un grupo lipofílico al residuo ácido 3-=-glucurónico de la no o des-acilsaponina da un análogo de la saponina más fácil de purificar, menos tóxica, más estable químicamente y que posee propiedades adyuvantes iguales o superiores a las de la saponina original.
Description
Análogos de saponinas triterpénicas que tienen
actividad adyuvante.
La presente invención se refiere al campo de los
agentes adyuvantes e inmunoestimuladores. Más particularmente, la
invención se refiere a nuevos conjugados de saponina
triterpénica-lipófilo.
Las saponinas son compuestos glicosídicos que se
producen como metabolitos secundarios. Están ampliamente
distribuidas entre plantas superiores y en algunos vertebrados
marinos del filo Echinodermata (ApSimon et al., Stud. Org. Chem.
17:273-286 (1984)). A causa de su actividad
antimicrobiana, las saponinas vegetales son defensas químicas
eficaces contra microorganismos, particularmente hongos (Price
et al., CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr.
26:27-135 (1987)). Las saponinas son
responsables de las propiedades tóxicas de muchos invertebrados
marinos (ApSimon et al., Stud. Org. Chem.
17:273-286 (1984)). La estructura química de
las saponinas confiere una amplia serie de actividades
farmacológicas y biológicas, incluyendo algunas actividades
inmunológicas potentes y eficaces. Además, algunos miembros de esta
familia de compuestos tienen propiedades espumantes (una
característica de identificación), propiedades tensioactivas (que
son responsables de su actividad hemolítica), actividad de unión al
colesterol, tóxicas para los hongos, molusquicidas,
anticonceptivas, de retraso del crecimiento, expectorantes,
antiinflamatorias, analgésicas, antivirales, cardiovasculares,
inhibidoras de enzimas y antitumorales (Hostettmann, K., et al.,
Methods Plant Biochem. 7:435-471 (1991);
Lacaille-Dubois, M.A. & Wagner, H.,
Phytomedicine 2:363-386 (1996); Price, K.R.,
et al., CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr.
26:27-135 (1987)).
Estructuralmente, las saponinas constan de
cualquier aglicona (sapogenina) unida a una o más cadenas de
azúcar. En algunos casos, las saponinas pueden estar aciladas con
ácidos orgánicos tales como acético, malónico, angélico y otros
(Massiot, G. & Lavaud. C., Stud Nat. Prod Chem.
15:187-224 (1995)) como parte de su estructura.
Estas estructuras complejas tienen pesos moleculares que varían de
600 a más de 2.000 daltons. La distribución asimétrica de sus restos
hidrófobos (aglicona) e hidrófilos (azúcar) confiere un carácter
anfipático a estos compuestos que es responsable en gran medida de
sus propiedades de tipo detergente. Por consiguiente, las saponinas
pueden interaccionar con el componente de colesterol de membranas
celulares animales para formar poros que pueden conducir a la
destrucción de la membrana y la muerte celular, tal como la
hemólisis de células sanguíneas.
Las saponinas pueden clasificarse de acuerdo con
su composición de aglicona como se muestra a continuación:
1. Glicósidos de triterpeno
2. Glicósidos esteroides
3. Glicósidos alcaloides esteroides.
Los glicósidos alcaloides esteroides, o
glicoalcaloides, comparten muchas propiedades físicas y biológicas
con los glicósidos esteroides, pero los glicósidos alcaloides
habitualmente se consideran por separado porque su estructura
esteroidea contiene nitrógeno. Frecuentemente, las agliconas tienen
substituyentes metilo que pueden oxidarse a grupos hidroximetilo,
aldehído o carboxilo; estos restos pueden participar en algunas de
las actividades biológicas de las saponinas. A partir de ciertos
estudios extensivos de las saponinas, está claro que las saponinas
triterpénicas no sólo son las más predominantes en la naturaleza,
sino que también son las que tienen propiedades biológicas y
farmacológicas más interesantes.
Las saponinas tienen una o más cadenas de azúcar
lineales o ramificadas unidas a la aglicona por medio de un enlace
éter o éster glicosídico. En algunas saponinas también se ha
detectado la presencia de azúcares acilados. De acuerdo con la
cantidad de cadenas de azúcar unidas a la aglicona, las saponinas
pueden ser saponinas monodesmosídicas (con una sola cadena de
azúcar) o saponinas bidesmosídicas (con dos cadenas de azúcar). En
las saponinas monodesmosídicas, la cadena de azúcar típicamente
está unida por un enlace éter glicosídico en el C-3
de la aglicona. Además de la cadena de azúcar unida a
C-3, las saponinas bidesmosídicas tienen una
segunda cadena de azúcar unida al C-28 (saponinas
triterpénicas) o al C-26 (saponinas esteroides) por
un enlace éster. Debido a la susceptibilidad típica de los ésteres,
las saponinas bidesmosídicas se convierten fácilmente en sus formas
monodesmosídicas por hidrólisis suave (Hostettmann, K., et al.,
Methods Plant Biochem. 7:435-471 (1991)) (figura
2). Aparentemente, las saponinas monodesmosídicas son
significativamente más activas biológicamente en plantas que sus
formas bidesmosídicas. Por ejemplo, en Hedera helix, la
transformación enzimática de la hederasaponina C bidesmosídica a su
forma monodesmosídica (a-hederina) da como resultado
un producto con una alta actividad antibiótica (Wagner, H. &
Horhammer, L., Pharmacognosy and Phytochemistry,
Springer-Verlag, Berlín (1971)). En general, las
saponinas monodesmosídicas también tienden a ser más hemolíticas
que las saponinas bidesmosídicas. Esta propiedad parece tener buena
correlación con su actividad antifúngica. Presumiblemente, las
saponinas alteran la permeabilidad de membranas celulares por
interacción con los esteroles unidos a la membrana de hongos
ocasionando la muerte del organismo (Price, K.R., et al., CRC
Crit. Rev. Food Sci. Nutr 26:27-135 (1987)).
Por consiguiente, parece ser que la serie de hospedadores de hongos
patógenos de plantas se determina funcionalmente por su capacidad
para destoxificar enzimáticamente las saponinas del organismo
hospedador (Bowyer, P., et al., Science
267:371-374 (1995)). Sin embargo, las saponinas
de Quillaja aciladas parecen ser excepcionales, ya que sus formas
monodesmosídicas son agentes hemolíticos significativamente menos
eficaces que sus formas bidesmosídicas aciladas y no aciladas
(Pillion, D.D., et al., J. Pharm. Sci.,
84:1276-1279 (1996)). Lo más probable es que las
saponinas bidesmosídicas funcionen como formas útiles para el
almacenamiento y/o transporte de estos compuestos hasta el momento
en el que se requieran las formas monodesmosídicas biológicamente
activas para la defensa de las plantas (Hostettmann, K., et al.,
Methods Plant Biochem. 7:435-471 (1991));
Osbourn, A. E., et al., Adv. Exp. Med. Biol.,
404:547-555 (1996)). En contraste, en animales,
las saponinas bidesmosídicas pueden tener actividades biológicas y
farmacológicas potentes que no están relacionadas en absoluto con
ningún aspecto de la fisiología vegetal.
Los adyuvantes de saponina de la corteza del
árbol Quillaja saponaria Molina (saponinas de
Quillaja) son productos química e inmunológicamente bien
caracterizados (Dalsgaard, K. Arch. Gesamte Virusforsch
44:243 (1974); Dalsgaard, K., Acta Vet. Scand. 19 (Suppl.
69):1 (1978); Higuchi, R. et al., Phytochemistry 26:229
(1987): ibid. 26:2357 (1987); ibid. 27:1168 (1988);
Kensil. C. et al., J. Immunol. 146:431 (1991); Kensil et
al., Patente de Estados Unidos Nº 5.057.540 (1991); Kensil
et al., Vaccines 92:35 (1992); Bomford, R. et al.,
Vaccine 10:572 (1992); y Kensil, C. et al., Patente de
Estados Unidos Nº 5.273.965 (1993)).
Estos adyuvantes de saponina son una familia de
estructuras de glicósido triterpénico O-acilado muy
relacionadas. Tienen un triterpeno de aglicona (ácido quillaico),
con cadenas de azúcar ramificadas unidas en las posiciones 3 y 23,
y un grupo aldehído en la posición 23. Una característica típica de
las saponinas de Quillaja es la presencia de restos aciloil acilo
unidos al grupo hidroxi C-3 de una fucopiranosa
unida por un enlace éster en la posición 28 del ácido quillaico.
Estos restos acilo se han identificado como ácido
3,5-dihidroxi-6-metiloctanoico,
ácido
3,5-dihidroxi-6-metiloctanoico,
5-O-a-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-a-L-arabinofuranósido
y
5-O-a-L-arabinofuranósido.
Higuchi, R. et al. (Phytochemistry 26:229
(1987); ibid 27:1168 (1988), y Kensil, C. et al.
(Patente de Estados Unidos Nº 5.057.540, Ibid., Vaccine
92:35 (1992), y Patente de Estados Unidos Nº 5.273.965 (1993))
han demostrado que el enlace 3-O-glicosídico entre el resto
fucosilo y el resto aciloil acilo puede escindirse por una
hidrólisis alcalina suave para producir desacilsaponinas. Estas
desacilsaponinas de las saponinas de Quillaja son más hidrófilas
que las saponinas originales. Aparentemente, la desacilación de las
saponinas de Quillaja tiene como resultado una pérdida significativa
de la actividad adyuvante, como se ha medido por la producción de
anticuerpos y la respuesta CTI (Kensil et al., Patente de
Estados Unidos Nº 5.057.540, columna 22, líneas 35 a 49; Kensil
et al., Vaccines 92:35 (1992); y Kensil et
al., Patente de Estados Unidos Nº 5.273.965, columna 7, línea
62).
Se ha descubierto que las saponinas de Quillaja
son una mezcla de aproximadamente 20 glicósidos triterpenoides
estructuralmente muy relacionados con diferencias mínimas entre
ellos (Higuchi, R. et al., Phytochemistry 26:229 (1987);
ibid., 26:2357 (1987); ibid., 27:1169 (1988); Kensil
et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.057.540 (1991); Kensil
et al., Vaccines 92:35 (1992)), haciendo difícil su
separación. Su grupo triterpenoide lleva el grupo aldehído
responsable de inducir la inmunidad de células T, mientras que sus
restos carbohidrato parecen potenciar la inmunidad humoral (quizás
por su interacción con receptores de linfocitos) de un modo similar
a ciertos polisacáridos (Bohn J. y J. BeMiller, Carbohydrate
Polymers 28:3 (1995)). En efecto, la publicación de la
solicitud PCT WO 90/03184 describe que las saponinas con su
aldehído triterpenoide reducido a alcohol aún son capaces de
inducir una respuesta de anticuerpos. De forma similar, otros
componentes de las saponinas de Quillaja, los grupos
aciloil-acilo, parecen jugar un papel en la
adyuvancia. También hay razones para sospechar que su resto aciloil
acilo, formado por un ácido carboxílico monoterpénico, en parte es
responsable de algunas de las propiedades tóxicas observadas con
varias de las saponinas de Quillaja purificadas (Kensil, C. et
al., J. Immunol. 146:431 (1991)). De este modo, sería de
interés comercial desarrollar saponinas de Quillaja modificadas que
sean más fáciles de purificar, potencialmente menos tóxicas, más
estables químicamente y con propiedades adyuvantes iguales o mejores
que las saponinas originales.
El sistema inmune puede mostrar tanto inmunidad
específica como no específica (Klein, J., et al., Immunology
(2nd), Blackwell Science Inc., Boston (1997)). Generalmente,
los linfocitos B y T, que muestran receptores específicos en sus
superficies celulares para un antígeno dado, producen inmunidad
específica. El sistema inmune puede responder a diferentes antígenos
de dos formas: 1) inmunidad mediada humoral, que incluye
estimulación de células B y producción de anticuerpos o
inmunoglobulinas [también están implicadas otras células en la
generación de una respuesta de anticuerpo, por ejemplo, células
presentadoras de antígeno (APC; incluyendo macrófagos), y células T
adyuvantes (Th1 y Th2)], y 2) inmunidad mediada por células (CMI),
que implica generalmente células T, incluyendo linfocitos T
citotóxicos (CTL), aunque también están implicadas otras células en
la generación de una respuesta de CTL (por ejemplo, células Th1 y/o
Th2 y APC).
La inmunidad no específica incluye varias células
y mecanismos tales como fagocitosis (la ingestión de partículas
extrañas o antígenos) por macrófagos o granulocitos, y la actividad
de las células asesinas naturales (NK), entre otras. La inmunidad
no específica se basa en mecanismos menos avanzados en la evolución
(por ejemplo, fagocitosis, que es un mecanismo de defensa del
hospedador importante) y no muestra el carácter adquirido de
especificidad y memoria, señales características de una respuesta
inmune específica. La inmunidad no específica es más innata de
sistemas vertebrados. Además, las células implicadas en inmunidad
no específica interaccionan de manera importante con células B y T
para producir una respuesta inmune. Las diferencias clave entre
inmunidad específica y no específica están basadas en la
especificidad de células B y T. Estas células adquieren
predominantemente su capacidad de respuesta después de la
activación con un antígeno específico y tienen mecanismos para
manifestar memoria en caso de una exposición futura a ese antígeno
específico. Como resultado, la vacunación (que implica especificidad
y memoria) es un protocolo eficaz para proteger contra patógenos
perjudiciales.
Un componente crítico de las vacunas inactivadas,
incluyendo las vacunas de subunidad, es un adyuvante. Los
adyuvantes son compuestos no inmunogénicos que, cuando se
administran con un antígeno (mezclado o proporcionado antes de la
administración del antígeno), potencian o modifican la respuesta
inmune a ese antígeno particular. De este modo, las respuestas
inmunes humorales y/o mediadas por células son más eficaces cuando
se administra un antígeno con un adyuvante. Además, el adyuvante
puede alterar la calidad de la respuesta inmune afectando a las
subclases (isotipos) de inmunoglobulinas producidas (IgG1, IgG2,
IgG3 e IgG4 para las IgG humanas; IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 para
IgG de ratón), así como sus afinidades. Una respuesta regulada por
células Th1 en ratones inducirá IgG1, IgG2a, IgG2b y en menor
medida IgG3, y también favorecerá una respuesta CMI a un antígeno.
Si la respuesta de IgG a un antígeno está regulada por células de
tipo Th2 potenciará predominantemente la producción de IgG1
e
IgA.
IgA.
Los adyuvantes que se han usado para potenciar
una respuesta inmune incluyen compuestos de aluminio (denominados
en general "alumbre"), emulsiones de aceite en agua (que
contienen a menudo otros compuestos), adyuvante completo de Freund
(CFA, una emulsión de aceite en agua que contiene organismos
Mycobacterium tuberculosis inactivados por calor y secados),
y adyuvante de pertussis (una suspensión salina de organismos
Bordetella pertussis inactivados). Generalmente, se cree que
estos adyuvantes tienen su mecanismo de acción produciendo un
depósito de antígeno y permitiendo una liberación lenta del
antígeno al sistema inmune, y produciendo inflamación no específica
que se considera responsable de su actividad observada (Cox, J. C.,
et al., Vaccine 15:248-256 (1997)). Se ha
demostrado que algunas saponinas tienen diferentes tipos de
actividades de estimulación inmune, incluyendo actividad adyuvante.
Estas actividades se han revisado previamente (Shibata, S., New
Nat. Prod Plant Pharmacol. Biol. Ther. Act., Proc. Int. Congr.
1st, 177-198 (1977); Price, K.R., et al. CRC
Crit. Rev. Food Sci. Nutr 26:27-135 (1987);
Schöpke, Th., & Hiller. K., Pharmazie
45:313-342 (1990);
Lacaille-Dubois, M.A., et al., Phytomedicine
2:363-386 (1996)).
La publicación de la solicitud PCT WO 93/05789
describe conjugados en los que proteínas poco inmunogénicas se
acoplan de manera covalente a una fracción de saponina de
Quillaja acilada y purificada a través del grupo carboxilo
del ácido 3-O-glucurónico. La adición de saponinas de
Quillaja libres a estos conjugados inducía una respuesta inmune
mayor sugiriendo (i) que la saponina de Quillaja unida de manera
covalente sirve como un sitio de asociación para moléculas de
saponina adicionales y (ii) que el efecto adyuvante depende de la
cantidad de saponinas asociadas con el antígeno proteico.
La publicación de la solicitud PCT WO 90/03184
describe un complejo inmunoestimulador (ISCOM) que comprende al
menos un lípido y al menos una saponina, y que puede incluir
opcionalmente adyuvantes además de la saponina. Se cree que estas
matrices son útiles como agentes inmunomoduladores y vacunas. El
lípido y la saponina están en una asociación física, en lugar de
unidos de manera covalente entre sí. La saponina preferida es Quil
A (un extracto de saponina de Quillaja). La referencia
enseña adicionalmente que es beneficioso añadir adyuvantes (además
de Quil A) a la matriz ISCOM. La referencia enseña que un adyuvante
que carece de propiedades hidrófobas apropiadas puede modificarse
para comprender un dominio hidrófobo para la incorporación en la
matriz ISCOM.
Bomford, R. et al., Vaccine
10:572-577 (1992) enseña que los lípidos pueden
mezclarse con una diversidad de saponinas para formar ISCOM. La
referencia enseña que las saponinas de Quillaja, las
saponinas de Gypsophila y las saponinas de Saponaria
eran las únicas saponinas ensayadas que tenían actividad
adyuvante.
Sigue existiendo la necesidad de adyuvantes que
tengan más adyuvancia y menos toxicidad.
La presente invención se refiere a nuevos
compuestos químicos, denominados en este documento conjugados de
saponina-lipófilo, en los que
(1) una saponina triterpénica no acilada o
desacilada que tiene un resto de ácido 3-O-glucurónico está
unida de manera covalente a:
(2) un compuesto que tiene un dominio lipófilo,
tal como un ácido graso, una amina grasa, fosfolípido, terpeno o
polietilenglicol, entre otros;
donde (1) se acopla a (2) a través del átomo de
carbono carboxílico presente en el resto de ácido
3-O-glucurónico de la saponina triterpénica.
La presente invención también se refiere a
composiciones farmacéuticas y veterinarias que comprenden uno o más
de los conjugados de saponina-lipófilo y uno o más
diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Estas composiciones pueden emplearse como inmunopotenciadores en
animales y en seres humanos.
La presente invención también se refiere a
vacunas que comprenden uno o más antígenos, y un conjugado de
saponina-lipófilo.
La presente invención también se refiere al
aumento de la potenciación de una respuesta inmune en un mamífero,
que comprende la administración de una cantidad eficaz de un
conjugado de saponina-lipófilo para potenciar la
respuesta inmune de un mamífero a uno o más antígenos.
La presente invención también se refiere a un
método de vacunación, que comprende administrar uno o más
antígenos, y un conjugado de saponina-lipófilo.
La figura 1 ilustra estructuras químicas
representativas para las saponinas derivadas de Quillaja,
Gypsophila y Saponaria.
La figura 2 ilustra estructuras químicas
representativas de (a) una saponina de Acanthophyllum
squarrosum y (b) lucyoside P.
La figura 3 demuestra la comparación de la
respuesta inmune primaria de IgG anti-OVA inducida
por OVA sola y en presencia de alumbre, saponina de Quillaja y
diferentes dosis de saponina de Quillaja desacilada, y de un
conjugado de saponina de Quillaja-lipófilo
(GPI-0100), el ejemplo 3 de la presente
invención.
La figura 4 muestra las titulaciones de punto
final típicas para la inmunización con el antígeno OVA en presencia
de adyuvante completo de Freund, saponina de Quillaja, conjugado de
saponina de Quillaja-lipófilo de la presente
invención, alumbre y OVA sola. La absorbancia debida a la unión del
anticuerpo específico de antígeno se representó como una función
del logaritmo de la dilución del suero.
La figura 5 demuestra la comparación del
logaritmo de las titulaciones de punto final para la respuesta
inmune de IgG anti-OVA secundaria inducida por OVA
sola, y en presencia de alumbre, saponina de Quillaja y diversas
dosis de conjugado de saponina de Quillaja-lipófilo
(GPI-0100).
La figura 6 muestra los efectos de alumbre,
saponina de Quillaja y diferentes dosis de conjugado de saponina de
Quillaja-lipófilo de la presente invención
(GPI-0100), sobre la producción de isotipos de IgG.
Los logaritmos de las titulaciones de punto final se determinaron
usando anticuerpos específicos para cada isotipo.
La figura 7 demuestra la comparación de las
respuestas proliferativas in vitro inducidas por linfocitos
T aislados de ratones inmunizados dos veces con OVA sola, o en
presencia de alumbre, saponina de Quillaja, dosis diferentes de
saponina de Quillaja desacetilada, y conjugado de saponina de
Quillaja-lipófilo de la presente invención
(GPI-0100). El grado de cebado se determinó por
estimulación de esplenocitos con 2 o 10 \mug de OVA y midiendo los
cambios de incremento en la incorporación de
^{3}H-timidina (incorporación de
\Delta^{3}H-TdR, c.p.m.).
La presente invención se refiere a nuevos
compuestos químicos, denominados en este documento conjugados de
saponina-lipófilo, que comprenden:
(1) una saponina triterpénica no acilada o
desacilada que tiene un resto de ácido 3-O-glucurónico,
unida de manera covalente a:
(2) un resto lipófilo, por ejemplo, uno o más
ácidos grasos, aminas grasas, aminas alifáticas, alcoholes
alifáticos, mercaptanos alifáticos, terpeno o
polietilenglicoles;
donde (2) está unido a (1) por medio del átomo de
carbono carboxílico presente en el resto de ácido
3-O-glucurónico de la saponina triterpénica, directamente o
a través de un grupo de unión apropiado.
La unión de un resto lipófilo al ácido
3-O-glucurónico de una saponina, tal como desacilsaponinas
de Quillaja, desacilsaponinas de Willd de Silene
jenisseenis, lucyoside P y saponinas de Gypsophila Saponaria y
Acanthophyllum squarrosum potencia sus efectos adyuvantes
sobre la inmunidad humoral y la inmunidad mediada por células.
Adicionalmente, la unión de un resto lipófilo al resto de ácido
3-O-glucurónico de una saponina no acilada o desacilada
produce un análogo de saponina que es más fácil de purificar, menos
tóxico, químicamente más estable, y que tiene propiedades adyuvantes
iguales o mejores que la saponina original.
En su realización más amplia, la presente
invención se refiere a una o más saponinas modificadas, donde
dichas saponinas modificadas (a) tienen una estructura central de
aglicona triterpénica (tal como ácido quillaico, gipsogenina y
otros) con cadenas de azúcar ramificadas unidas a las posiciones 3
y 28, y un grupo aldehído unido o acoplado en la posición 4; (b)
están sin acilar originalmente o requieren la eliminación de un
grupo acilo o aciloílo que está unido a un sacárido en la posición
28 de la aglicona triterpénica; y (c) tienen un resto lipófilo
unido de manera covalente, directamente o a través de un resto de
unión, al ácido carboxílico del ácido glucurónico en la posición 3
de la aglicona triterpénica.
Las expresiones "resto lipófilo" y "un
resto de una molécula lipófila", como se usan en este documento,
se refieren a un resto que se une por interacción covalente de un
grupo funcional adecuado de uno o más compuestos que son no polares
o tienen un dominio no polar con el resto 3-O-glcA de
una saponina. El resto lipófilo puede ser una porción de un
compuesto anfipático. Un compuesto anfipático es un compuesto cuyas
moléculas contienen tanto dominios polares como dominios no
polares. Los tensioactivos son ejemplos de compuestos anfipáticos.
Los tensioactivos típicamente tienen una porción no polar que
habitualmente es un alquilo, arilo o estructura terpénica. Además,
un tensioactivo tiene una porción polar, que puede ser aniónica,
catiónica, anfótera o no iónica. Son ejemplos de grupos aniónicos
carboxilato, fosfato, sulfonato y sulfato. Son ejemplos de dominios
catiónicos sales de amina y sales de amonio cuaternario. Los
tensioactivos anfóteros tienen tanto un dominio aniónico como un
dominio catiónico. Los dominios no iónicos típicamente proceden de
un grupo carboxi de ácido graso e incluyen derivados de sacárido y
polioxietileno.
Un resto lipófilo también puede comprender dos o
más compuestos que tienen dominios no polares, donde cada uno de
los compuestos se ha unido completamente a un grupo de unión, que,
a su vez, está unido de manera covalente al ácido
3-O-glucurónico.
Varios compuestos que contienen grupos lipófilos,
tales como aminas y alcoholes alifáticos, ácidos grasos,
polietilenglicoles y terpenos, pueden añadirse al resto
3-O-glcA de desacilsaponinas y al resto 3-O-glcA de
saponinas no aciladas. El resto lipófilo puede ser una estructura
alifática o cíclica que puede estar saturada o insaturada. A modo
de ejemplo, pueden unirse de manera covalente a saponinas no
aciladas o desacilsaponinas ácidos grasos, terpenoides, aminas
alifáticas, alcoholes alifáticos, mercaptanos alifáticos,
glicosil-ácidos grasos, glicolípidos, fosfolípidos y mono- y
diacilgliceroles. La unión puede realizarse mediante un grupo
funcional en un resto lipófilo que reacciona de manera covalente
con el resto ácido del resto de ácido 3-glucurónico,
o una funcionalidad ácida activada en esta posición. Como
alternativa, puede emplearse un enlazador bifuncional para conjugar
el resto lipófilo al resto 3-O-glcA de la saponina.
Los ácidos grasos útiles incluyen ácidos grasos
C_{6}-C_{24}, preferiblemente ácidos grasos
C_{7}-C_{18}. Los ejemplos de ácidos grasos
útiles incluyen ácidos grasos saturados tales como ácido láurico,
mirístico, palmítico, esteárico, araquídico, behénico y
lignocérico; y ácidos grasos insaturados tales como los ácidos
palmitoleico, oleico, linoleico, linolénico y araquidónico.
Las aminas alifáticas, alcoholes alifáticos y
mercaptanos alifáticos útiles incluyen aminas y alcoholes y
mercaptanos (RSH) que tienen un grupo alifático de cadena lineal o
ramificada, saturado o insaturado, que tiene de aproximadamente 6 a
aproximadamente 24 átomos de carbono, preferiblemente de 6 a 20
átomos de carbono, más preferiblemente de 6 a 16 átomos de carbono,
y mucho más preferiblemente de 8 a 12 átomos de carbono. Los
ejemplos de aminas alifáticas útiles incluyen octilamina,
nonilamina, decilamina, dodecilamina, hexadecilamina, esfingosina y
fitoesfingosina. Los ejemplos de alcoholes alifáticos útiles
incluyen octanol, nonanol, decanol, dodecanol, hexadecanol, alcohol
quimílico y alcohol selaquílico.
Los terpenoides útiles incluyen retinol, retinal,
bisabolol, citral, citronelal, citronelol y linalool.
Los mono- y diacilgliceroles útiles incluyen
gliceroles mono- y di-esterificados, donde los
grupos acilo incluyen de 8 a 20 átomos de carbono, preferiblemente
de 8 a 16 átomos de carbono.
Los polietilenglicoles útiles tienen la fórmula
H-(O-CH_{2}-CH_{2})_{n}OH,
donde n, el número de unidades de óxido de etileno, es de 4
a 14. Los ejemplos de polietilenglicoles útiles incluyen PEG 200
(n=4), PEG 400 (n=8-9) y PEG 600
(n=12-14).
Son éteres de alcohol graso de polietilenglicol
útiles aquellos en los que las unidades de óxido de etileno
(n) están comprendidas entre 1 y 8, y el grupo alquilo tiene
de 6 a 18 átomos de carbono.
Una cadena lateral con características
anfipáticas, es decir, distribución asimétrica de los grupos
hidrófilos e hidrófobos, facilita (a) la formación de micelas así
como una asociación con antígenos y (e) la accesibilidad del
aldehído triterpénico a los receptores celulares. También es posible
que la presencia de un grupo carboxilo cargado negativamente en
dicha cadena lateral pueda contribuir a la repulsión de los grupos
triterpeno, permitiéndoles de esta manera un mayor grado de
libertad rotacional. Este último factor podría aumentar la
accesibilidad de receptores celulares al grupo carbonilo de
formación de imina.
Las desacilsaponinas y saponinas no aciladas
pueden unirse directamente al resto lipófilo o pueden unirse a
través de un grupo de unión. Por la expresión "grupo de unión"
se entiende una o más moléculas bifuncionales que pueden usarse para
acoplar de manera covalente las desacilsaponinas, saponinas no
aciladas o mezclas de las mismas a la molécula lipófila. El grupo
enlazador se une de manera covalente al grupo de ácido carboxílico
del resto de ácido 3-O-glucurónico en la estructura central
de triterpeno, y a un grupo funcional apropiado presente en la
molécula lipófila.
Son ejemplos no limitantes de grupos enlazadores
que pueden usarse para unir la saponina y la molécula lipófila
alquilendiaminas
(NH_{2}-(CH_{2})_{n}-NH_{2}), donde n
es de 2 a 12; aminoalcoholes
(HO-(CH_{2})_{r}-NH_{2}), donde r es de
2 a 12; y aminoácidos que opcionalmente están protegidos en el
carboxi; etilen y polietilenglicoles
(H-(O-CH_{2}-CH_{2})_{n}-OH,
donde n es 1-4), aminomercaptanos y ácidos
mercaptocarboxílicos.
La presente invención es útil con cualquier
saponina que cumpla los requisitos estructurales descritos
anteriormente por las razones descritas en este documento.
La expresión "saponina no acilada" o
"saponina sin acilo", como se emplea en este documento, se
refiere a una saponina que carece de un grupo acilo o aciloílo
unido a un resto oligosacárido que por sí mismo está unido a la
posición 28 del triterpeno.
La expresión "desacilsaponina" o "saponina
desacilada", como se emplea en este documento, se refiere a una
saponina que se ha modificado para retirar un grupo acilo o
aciloílo de un resto oligosacárido que por sí mismo está unido en la
posición 28 del triterpeno.
Quillaja, Gypsophila y Saponaria
son saponinas útiles, teniendo todas ellas agliconas triterpénicas
con un grupo aldehído unido o acoplado a la posición 4,
oligosacáridos ramificados unidos por un enlace éster en la posición
28, y un ácido 3-O-glucurónico (3-O-glcA) que en
Quillaja y Gypsophila está unido a oligosacáridos
ramificados. Las saponinas de Q. Saponaria y S.
jenisseenis incluyen restos acilo, mientras que la saponina de
Gypsophila, Saponaria y Acanthophyllum no incluye
restos acilo. Cada una de estas saponinas no aciladas o desaciladas
es útil en la presente invención.
Otras saponinas triterpénicas también son útiles
para la preparación de los conjugados de lípido que son el objeto
de esta solicitud. Estas nuevas saponinas tienen características
estructurales similares a las saponinas de Quillaja
saponaria Molina, Gypsophila sp., o Saponaria
officinalis; es decir, tienen un resto aldehído y un resto de
ácido glucurónico unido a sus agliconas. Estas saponinas
adicionales son la saponina bidesmosídica, squarroside A, aislado
de Acanthophyllum squarrosum; la saponina lucyoside P; y dos
saponinas aciladas aisladas de Silene jenisseensis Willd. A
continuación se proporciona una breve descripción de estos
compuestos:
Squarroside A es una saponina
bidesmosídica que contiene dos cadenas de oligosacárido unidas a
C-3 y C-28 de su gipsogenina
aglicona. De forma similar a la saponina de gypsophila, tiene un
grupo aldehído unido al C-4 de la aglicona, y un
resto de ácido glucurónico en C-3. Además, contiene
un resto de fucosa acetilado en C-28. Se ha
demostrado que squarroside A tiene actividad inmunomoduladora como
se midió por un ensayo linfoproliferativo in vitro. Estos
efectos immunomoduladores aparentemente no específicos eran
dependientes de la dosis: tenían un efecto supresor a
concentraciones en el intervalo de \mug y un efecto estimulante
en el intervalo de pg.
Lucyoside P es una saponina bidesmosídica
que tiene un resto carbohidrato unido a C-3 y a
C-28 de su ácido quillaico de aglicona, y un grupo
aldehído en C-4. Lucyoside P tiene un resto de
ácido glucurónico en C-3.
Se han aislado dos saponinas aciladas de
la Caryophyllacea Silene jenisseensis. Estas
saponinas tienen carbohidratos unidos a C-3 y
C-28 de su ácido quillaico de aglicona. Los restos
de carbohidrato unidos a C-3 y C-28
son ácido glucurónico y fucosa, respectivamente. El resto de fucosa
está acilado con un grupo p-metoxicinamoílo para producir
glicósidos triterpénicos de trans- y
cis-p-metoxicinamoílo. Aunque estas saponinas
tienen un grupo aldehído, no tienen actividad inmunoestimuladora
aparente como se detectó por un ensayo de quimioluminiscencia de
granulocitos in vitro. Sin embargo, es posible que el resto
de p-metoxicinamoílo esté interfiriendo con la actividad del
oxígeno reactivo necesaria para producir quimioluminiscencia.
Todas las saponinas descritas previamente se han
aislado hasta la pureza. Sin embargo, las saponinas aciladas de
Silene jenisseensis se han obtenido sólo como una mezcla de
las formas isoméricas cis y trans. De manera similar
a la saponina de Q. saponaria, estas saponinas aciladas de
Silene jenisseensis se desacilan fácilmente por una
hidrólisis alcalina suave con KOH \sim 0,2 N durante 1 hora a
temperatura ambiente. La saponina desacilada se modifica después
por uno de los procedimientos descritos en este documento para
producir análogos con actividades immunoestimuladoras y
adyuvantes.
Un grupo preferido de compuestos para uso en la
presente invención son saponinas de Quillaja desaciladas que se han
conjugado con un resto lipófilo mediante reacción química con el
grupo carboxílico del ácido 3-O-glucurónico.
De este modo, una realización preferida de la
presente invención se refiere a compuestos de fórmula II.
o una sal farmacéuticamente
aceptable de los mismos;
donde
R^{1} es glucosa o hidrógeno; R^{2} es apiosa
o xilosa, preferiblemente apiosa; X es S, O, NH o un grupo de
unión; y R^{3} es un resto de una molécula lipófila.
Los valores preferidos de X incluyen O y NH.
Además, se prefieren varios grupos de unión bifuncionales. Los
ejemplos útiles incluyen
-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-,
-NH-CH(COOH)-CH_{2}-NH-,
-NH-CH_{2}-CH(COOH)-NH.,-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-NH-,
-O-
(CH_{2})_{r}-NH-, -S-(CH_{2})_{r}-NH-, -S-(CH_{2})_{r}-C(O)-, -NH-CH_{2}-C(O)-, -O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-, -NH-NH-C(O)-CH_{2}-, -NH-C(CH_{3})_{2}-C(O)- y -NH-NH-C(O)-(CH_{2})_{r}-C(O)-NH-N =, donde r, en cada caso, es de 2 a 5.
(CH_{2})_{r}-NH-, -S-(CH_{2})_{r}-NH-, -S-(CH_{2})_{r}-C(O)-, -NH-CH_{2}-C(O)-, -O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-, -NH-NH-C(O)-CH_{2}-, -NH-C(CH_{3})_{2}-C(O)- y -NH-NH-C(O)-(CH_{2})_{r}-C(O)-NH-N =, donde r, en cada caso, es de 2 a 5.
Los grupos R^{3} preferidos incluyen los restos
de ácidos grasos, terpenoides, aminas alifáticas, alcoholes
alifáticos, mercaptanos alifáticos, polietilenglicoles,
glicosil-ácidos grasos, derivados mono- y
poli-alquilenoxi de 2 a 4 átomos de carbono de
ácidos grasos y alcoholes grasos, glicolípidos, fosfolípidos y
mono-, di- y tri-acilgliceroles que pueden unirse de
manera covalente al grupo carbonilo de 3-O-glcA o a un grupo
funcional adecuado en un enlazador bifuncional.
Los ejemplos útiles de restos R^{3} incluyen
restos de ácido araquidónico, ácido caprílico, retinal, decanal,
caprilaldehído, nonilamina, nonanol, dodecilamina, dodecanol, octil
glucopiranósido, ácido láurico, lauril mercaptano, esfingosina,
dihidroesfingosina, 4-octilbenzaldehído, vitamina A
y conjugado de glucosamina-ácido ricinoleico.
De manera similar, el resto de ácido carboxílico
del ácido 3-glucurónico de la saponina
Gypsophilia, Saponaria y Acanthophyllum, la saponina
lucyoside P, y la saponina desacilada de S. Jenisseenis
puede modificarse para proporcionar conjugados donde el ácido ha
reaccionado con un reactivo adecuado para formar un enlace amida o
éster a un resto lipófilo, directamente o mediante un enlazador
adecuado, como se describe con más detalle en este documento. El
ácido glucurónico de este modo se convierte en
-C(O)-X-R^{3}, donde X y
R^{3} son como se han definido anteriormente.
Los conjugados de
saponina-lipófilo que se forman haciendo reaccionar
saponinas de Gypsophilia y Saponaria, se representan
por las fórmulas III y IV, respectivamente:
donde X y R^{3} son como se han
definido
anteriormente.
La hidrólisis alcalina suave de la mezcla de
saponinas de Quillaja da como resultado la ruptura del enlace
28-O-éster y la desacilación de las saponinas, produciendo
dos productos principales muy relacionados que se diferencian en un
solo resto glucopiranosilo (Higuchi, R. et al., Phytochemistry
26:229 (1987); ibid., 26:2357 (1991); ibid.,
27:1169 (1988); Kensil et al., Patente de Estados Unidos
Nº 5.057.540 (1991); Kensil et al., Vaccines 92:35
(1992)). Estas dos desacilsaponinas principales, que pueden
separarse por procedimientos cromatográficos, son más hidrófilas y
tienen menos adyuvancia que las saponinas precursoras. Sin embargo,
la reducción de más de 20 especies de saponina de Quillaja a
solamente dos compuestos ofrece una fuente práctica de materiales
de partida para el desarrollo y producción de adyuvantes
semisintéticos.
Los materiales de partida preferidos incluyen
saponinas de Quillaja desaciladas representadas por la fórmula
I:
donde R^{1} es glucosa o
hidrógeno; y R^{2} es apiosa o xilosa. En una realización
preferida, usando los procedimientos de aislamiento descritos en
este documento, se pueden aislar dos saponinas de Quillaja
desaciladas DS-1 y DS-2, y
emplearse individualmente o como una mezcla. DS-1 se
refiere a un compuesto de fórmula I donde R^{1} es H; y R^{2}
es apiosa o xilosa. DS-2 se refiere a un compuesto
de fórmula I donde R^{1} es glucosa; y R^{2} es apiosa o
xilosa.
Entre el 60%-70% de las saponinas de Quillaja
desaciladas totales, que representan la fracción
DS-2, tienen un resto de glucosa en R^{1}. El otro
30% a 40% de saponinas de Quillaja desaciladas (en las que el
producto derivado de QS-21 es el predominante), que
representa DS-1, no tienen ningún resto de glucosa
en su resto carbohidrato. El resto de glucosa adicional confiere
mayor hidrofilia a DS-2, que en HPLC de fase
inversa eluye antes que DS-1. La mayoría de las
saponinas de Quillaja tienen apiosa en la posición R^{2}, excepto
una pequeña porción de QS-21 que tiene xilosa en
lugar de apiosa. El substituto de xilosa debe encontrarse
principalmente en la fracción DS-1. Se prefiere usar
la mezcla completa de DS-1 y DS-2
para preparar conjugados.
Como el resto 3-O-glcA en las saponinas de
Quillaja puede modificarse sin alterar la adyuvancia, este grupo
carboxilo ofrece un único sitio para la modificación química de las
desacilsaponinas. Sin desear limitarse por ninguna teoría, la
incorporación de una cadena lipófila o anfífila al 3-O-glcA
substituye funcionalmente el grupo 28-O-acilo retirado de
saponinas de Quillaja por la hidrólisis alcalina. Esta modificación
produce neosaponinas con propiedades fisicoquímicas y adyuvancia
diferentes comparables o mejores que las de las saponinas de
Quillaja originales. Esta modificación también puede usarse con las
saponinas no aciladas de Gypsophila sp., Saponaria
officinalis y las saponinas squarroside y lucyoside P para
mejorar su efecto adyuvante en la inmunorrespuesta primaria.
Las desacilsaponinas y saponinas no aciladas
pueden unirse a la molécula lipófila o anfífila preparando un éster
activo de ácido glucurónico, seguido de la reacción del éster
activo con un grupo funcional nucleófilo en la molécula de enlace o
lipófila. Los ejemplos de los ésteres activos que pueden usarse en
la práctica de la invención incluyen el glucuronato de
N-hidroxisuccinimida,
sulfo-N-hidroxisuccinimida,
hidroxibenzotriazol y p-nitrofenol. Los ésteres activos
pueden prepararse haciendo reaccionar el grupo carboxi de la
saponina con un alcohol en presencia de un agente de deshidratación
tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC),
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(EDC), y metioduro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(EDCI). La molécula de enlace lipófila/anfífila después se mezcla
con el éster activado en solución acuosa para dar el conjugado.
Cuando se desea un grupo de enlace entre la
saponina y la molécula lipófila o anfífila, el éster activo del
glucuronato de saponina se prepara como se ha descrito
anteriormente y se hace reaccionar con el grupo de enlace, por
ejemplo, 2-aminoetanol, una alquilendiamina, un
aminoácido tal como glicina o un aminoácido con el carboxi
protegido tal como terc-butil éster de glicina. Si el
enlazador contiene un grupo carboxi protegido, el grupo protector se
retira y se prepara el éster activo del enlazador (como se ha
descrito anteriormente). El éster activo después se hace reaccionar
con la molécula lipófila para dar el conjugado. Como alternativa,
la molécula lipófila puede derivatizarse con anhídrido succínico
para dar un conjugado de lipófilo-succinato que
puede condensarse en presencia de EDC o EDCI con un derivado de
saponina-enlazador que tiene un grupo amino o
hidroxilo libre en el enlazador.
También es posible preparar un conjugado de
saponina-enlazador que comprende un enlazador con
un grupo amino libre (derivado de una alquilendiamina) y reticular
el grupo amino libre con un agente de reticulación heterobifuncional
tal como
4-(N-maleimidociclohexano)-1-carboxilato
de sulfosuccinimidilo que posteriormente reaccionará con los grupos
sulfhidrilo del compuesto de tiol lipófilo. Los ejemplos de dichos
enlazadores incluyen aminoalcoholes tales como
2-aminoetanol y diaminas tales como etilendiamina,
1,2-propilendiamina,
1,5-pentanodiamina,
1,6-hexanodiamina y similares. La molécula lipófila
después puede acoplarse al enlazador formando primero el derivado
succinado con anhídrido succínico seguido de condensación con el
conjugado de saponina-enlazador con DCC, EDC o
EDCI.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a un análogo de saponina en el que se ha añadido un grupo
biotinilo al 3-O-glcA de una saponina desacilada o una
saponina no acilada, tal como saponina gypsophila y saponaria. La
incorporación de un grupo biotinilo permite la unión de avidina o
estreptavidina que se ha marcado con un marcador detectable tal como
un grupo radiactivo, fluorescente, paramagnético u otro tipo de
señal o grupo indicador. El marcaje de estos compuestos permite su
detección in vivo o in vitro para fines de
diagnóstico. Por ejemplo, puede emplearse un sistema FACS para la
detección y determinación de células T con receptores de la
superficie celular para el análogo de saponina. La presencia de
estos receptores indica qué células podrían estimularse
potencialmente por grupos de formación de imina para producir una
respuesta inmune. La unión de la avidina o estreptavidina marcada
podría tener lugar antes o después de que el análogo de saponina
biotinilada se haya unido a los receptores de la superficie
celular.
Los conjugados de la presente invención, así como
los materiales de partida útiles, pueden prepararse de acuerdo con
los siguientes procedimientos. Los esquemas a los que se hace
referencia se presentan al final de la sección de descripción,
antes de las reivindicaciones.
Hay dos procedimientos que se basan en hidrólisis
alcalina suave para preparar las desacilsaponinas de
Quillaja. El primer procedimiento, descrito por Higuchi, R.
et al. (Phytochemistry 26:229 (1987),
incorporado por completo como referencia en este documento)
comienza con un extracto alcohólico de corteza de Quillaja y las
dos desacilsaponinas (1 y 2) se separan por procedimientos
cromatográficos (véase el esquema 1). Este método produce malas
recuperaciones de los dos productos.
Un segundo procedimiento, descrito por Kensil, C.
et al. (Patente de Estados Unidos Nº 5.057.540, incorporado
por completo como referencia en este documento) comienza con
saponinas de Quillaja parcialmente purificadas por ultrafiltración
o por cromatografía en gel (Dalsgaard. Arch. Gesamte Virusforsch
44:243 (1974); Acta Vet. Scand. 19. (Suppl. 69):1
(1978)). Las desacilsaponinas 1 (DS-1) y 2
(DS-2) se resuelven por métodos cromatográficos.
Este procedimiento produce buenas recuperaciones de los dos
productos.
En el esquema 2 se muestra un esquema adicional
para la preparación y aislamiento de desacilsaponinas 1 y 2.
Las desacilsaponinas 1 y 2 se separan antes de su
modificación química. En algunos casos, dependiendo de la
toxicidad, reproducibilidad, eficacia y aspectos de regulación
potenciales, sería posible usar la mezcla modificada de 1 y 2 como
adyuvante.
También puede formarse una saponina desacilada a
partir de una saponina de S. jenisseensis por hidrólisis
básica. Véase el esquema 3. La reacción de hidrólisis da como
resultado la retirada de un grupo
trans-p-metoxicinamoílo.
Los ácidos grasos son adecuados para modificar el
resto 3-O-glcA de desacilsaponinas. Ciertos ácidos grasos
insaturados, tales como el ácido araquidónico, tienen una serie de
dobles enlaces que imponen una estructura rígida similar a los
terpenoides, y son preferidos. Otros ejemplos de ácidos grasos
preferidos incluyen ácido caprílico, ácido caproico, ácido cáprico,
ácido linoleico, ácido palmítico, ácido ricinoleico, ácido oleico,
ácido palmitoleico, ácido pelargónico, ácido láurico e ácido
eicosapentanoico.
Usando los procedimientos de carbodiimida o de
anhídrido mixto, se puede acoplar una diamina a un solo ácido
monocarboxílico por un enlace amida para producir un producto con
un grupo amino libre. Este grupo -NH_{2} después se acopla al -
COOH del 3-O-glcA de las desacilsaponinas usando el método de
carbodiimida. El producto final es una desacilsaponina con un ácido
graso añadido al resto 3-O-glcA.
A continuación se proporcionan protocolos
generales para formar conjugados de ácido
graso-desacilsaponina de la presente invención.
Un ácido graso, tal como ácido caprílico o
araquidónico, puede activarse a su éster de
N-hidroxisuccinimida (NHS) por reacción con NHS y
diciclohexilcarbodiimida (DCC) en un alcohol, tal como etanol,
dimetilformamida (DMF) u otro disolvente orgánico conveniente. La
reacción, realizada con mezcla en la oscuridad a una temperatura de
0 a 4ºC, tiene, para cada mol de ácido graso, aproximadamente un
mol de DCC y de 1,5 a 2,0 moles de NHS. Después de 4 a 6 horas de
reacción, se retira la diciclohexilurea precipitada por filtración y
el filtrado se añade a un disolvente orgánico que contiene una
diamina en un exceso molar de 5 a 10 veces en relación con el ácido
graso. La diamina preferiblemente es etilendiamina o
propilendiamina. Se deja que la reacción continúe con mezcla en la
oscuridad a una temperatura de 0 a 4ºC durante aproximadamente 8
horas. El producto, una diamina acoplada a un solo resto de ácido
graso por un enlace amida estable, puede separarse de los otros
reactivos por extracción selectiva, precipitación y/o
cromatografía.
Otro procedimiento para la preparación de un
ácido graso-diamina es la técnica de anhídrido
mixto: se disuelven ácido araquidónico y tri-n-butilamina en
dioxano, usando aproximadamente 2 moles de la amina por cada mol del
ácido. A la solución enfriada se le añade clorocarbonato de
isobutilo (1 mol por mol de ácido graso) por mezcla y se hace
reaccionar durante un periodo de 0,5 a 1 hora. Esta mezcla se añade
en una porción a dioxano que contiene un exceso molar de 8 a 10
veces de diamina y se deja reaccionar durante 4 horas con agitación
y enfriamiento. El ácido graso-diamina puede
extraerse y separarse por precipitación y/o cromatografía. El ácido
graso modificado se usa para la adición a las desacilsaponinas.
El carboxilo del resto 3-O-glcA de las
desacilsaponinas se activa por el procedimiento de carbodiimida
como se ha descrito anteriormente. La reacción, realizada en DMF,
dioxano u otro disolvente polar, tiene por cada mol de
desacilsaponina aproximadamente un mol de DCC y de 1,5 a 2,0 moles
de NHS. La reacción se realiza en la oscuridad a una temperatura de
0 a 4ºC durante un periodo de 4 a 6 horas, y el precipitado de
diciclohexilurea se retira por filtración. El filtrado se añade a
una solución de DMF o dioxano que contiene el producto de ácido
graso-diamina en una cantidad aproximadamente
equimolar con respecto a las desacilsaponinas; y posteriormente se
hace reaccionar a 25ºC durante aproximadamente 8 horas. El
producto, un conjugado que consta de una desacilsaponina que tiene
un resto de ácido graso añadido al resto de 3-O-glcA, se
separa por extracción diferencial, precipitación y/o cromatografía.
El conjugado aislado se disuelve en agua y se liofiliza.
Los terpenos tienen características estructurales
algo similares a los grupos aciloil acilo de las saponinas de
Quillaja. De este modo, los terpenos y los compuestos derivados de
terpenos (terpenoides) son moléculas lipófilas adecuadas para
conjugarse con los restos 3-O-glcA de desacilsaponinas. Los
terpenoides útiles incluyen un grupo funcional que es capaz de
reaccionar con la desacilsaponina o un enlazador bifuncional. Los
grupos funcionales típicos con esta propiedad que se encuentran en
terpenoides incluyen funcionalidades alcohol, aldehído y cetona.
Retinal, un aldehído de vitamina A que tiene un importante papel en
la inmunidad, es un ejemplo de dicho compuesto. Una sola molécula
de diamina se acopla a una de retinal, produciendo un retinal con un
grupo amino libre. Este producto se añade a la saponina desacilada
usando el método de carbodiimida.
A una solución metanólica que contiene retinal y
un exceso molar de 10 veces de etilendiamina se le añade
cianoborohidruro sódico disuelto en metanol a una solución
metanólica que contiene retinal y un exceso molar de 10 veces de
etilendiamina. Se deja que la reacción continúe durante
aproximadamente 8 horas para reducir las bases de Schiff
reversibles a un enlace alquilamina estable. El pH se ajusta si es
necesario con un ácido orgánico tal como ácido acético o
trifluoroacético. El producto retinal-diamina se
recupera por extracción selectiva del disolvente, precipitación y/o
cristalización.
El carboxilo del resto 3-O-glcA de las
desacilsaponinas se activa por el procedimiento de carbodiimida
como se ha descrito anteriormente. La reacción, realizada en DMF,
dioxano u otro disolvente adecuado, tiene por cada mol de
desacilsaponina aproximadamente 1 mol de DCC y de 1,5 a 2,0 moles de
NHS. Después de la reacción en la oscuridad a una temperatura de 0
a 4ºC durante un periodo de 4 a 6 horas, la diciclohexilurea
precipitada se retira por filtración. El filtrado se añade a DMF o
dioxano que contiene el producto de retinal-diamina
en una cantidad equimolar con respecto a las desacilsaponinas, y la
mezcla se deja reaccionar a 25ºC durante aproximadamente 8 horas. El
producto, una desacilsaponina que contiene un resto de retinal
añadido al resto de 3-O-glcA, se separa por extracción del
disolvente, precipitación y/o cromatografía. La neosaponina aislada
se disuelve en agua y se liofiliza.
Pueden añadirse grupos alifáticos de una amina a
desacilsaponinas de Quillaja por acoplamiento del grupo amino al
-COOH del resto 3-O-glcA formando un enlace amida. El
carboxilo del resto 3-O-glcA de las desacilsaponinas se
activa por el procedimiento de carbodiimida descrito anteriormente.
La reacción, realizada en DMF, dioxano u otro disolvente, tiene
para cada mol de desacilsaponina aproximadamente un mol de DCC y de
1,5 a 2,0 moles de NHS. Esta mezcla se deja reaccionar en la
oscuridad a una temperatura de 0 a 4ºC durante un periodo de 4 a 6
horas, y la diciclohexilurea precipitada se retira por filtración.
El filtrado se añade a una solución de DMF o dioxano que contiene la
amina alifática en una cantidad equimolar con respecto a las
desacilsaponinas; y se deja reaccionar a 25ºC durante
aproximadamente 8 horas. El producto, una desacilsaponina conjugada
con una cadena alifática a través del resto 3-O-glcA de la
desacilsaponina, se separa por extracción diferencial,
precipitación y/o cromatografía. El conjugado aislado se disuelve en
agua y se liofiliza.
Uno de los restos aciloílo de las saponinas de
Quillaja se une a un disacárido para formar la estructura
[5-O-a-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-a-L-arabinofuranosil-3,5-
dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoílo].
Esta estructura se une por un enlace éster al grupo
C3-hidroxilo del resto fucopiranosilo (figura 1).
De este modo, otra modificación química es un conjugado que tiene un
resto lipófilo glicosilado añadido al resto 3-O-glcA de
desacilsaponinas.
Se mezcla un ácido graso que contiene un grupo
alcohol, tal como el ácido ricinoleico insaturado, disuelto en
acetona seca, con cloruro de tosilo disuelto en acetona. Mientras
se agita la mezcla de reacción, se añade piridina o trietilamina
para neutralizar el HCl liberado. El cloruro de tosilo convierte el
grupo hidroxilo en un sulfonato activo. El sulfonato se separa de
los otros reactivos por extracción u otro procedimiento adecuado.
El sulfonato activo se mezcla con glucosamina en DMF u otro
disolvente apropiado a pH 9,5. Los sulfonatos son buenos grupos
salientes que, después de la reacción con el grupo amino de
glucosamina, formarán enlaces estables entre la amina y el carbono
que lleva el grupo OH inicial. Los sulfonatos pueden substituirse
por otros buenos grupos salientes que se conocen en la técnica. El
producto glucosamina-ácido ricinoleico se recupera por extracción,
precipitación u otro procedimiento. Este producto se activa por el
método de carbodiimida y se hace reaccionar con una diamina, de un
modo equivalente al descrito anteriormente para la formación del
producto ácido graso-diamina.
El conjugado de glucosamina-ácido ricinoleico que
lleva un grupo amina libre, introducido por reacción con una
diamina usando el método de carbodiimida, se deja reaccionar con la
desacilsaponina usando otra vez la reacción de carbodiimida o el
método de anhídrido mixto, habiéndose descrito los dos métodos
anteriormente para la adición del producto ácido
graso-diamina a desacilsaponinas. El conjugado
resultante se recupera por extracción, precipitación y/o
cromatografía. El conjugado se disuelve en agua y se liofiliza. El
conjugado consta de glucosamina-ácido ricinoleico unido de manera
covalente al resto 3-O-glcA de la desacilsaponina.
Una cadena lateral con características
anfipáticas, es decir, una distribución asimétrica de grupos
hidrófilos e hidrófobos, facilita (a) la formación de micelas, así
como una asociación con antígenos, y (b) la accesibilidad del
aldehído triterpénico a receptores celulares. También es posible que
la presencia de un grupo carboxilo cargado negativamente en dicha
cadena lateral pueda contribuir a la repulsión de los grupos
triterpeno, permitiendo de este modo que tengan un mayor grado de
libertad rotacional. Este último factor aumentaría la accesibilidad
de receptores celulares al grupo carbonilo de formación de
imina.
A 0,05 moles (9,9 ml) de
N-octil-monooxietileno disuelto en
50 ml de dimetilformamida (DMF) se les añade con agitación un
equivalente (0,05 moles) de NaH lavado con pentano para formar un
alcóxido. La solución de alcóxido se añade con agitación a 35 ml de
DMF más 2,0 moles (15,6 ml) de epiclorhidrina. Se hace reaccionar a
menos de 60ºC y se sigue la reacción por TLC. Se detiene la
reacción por la adición de 250 ml de agua. Se extrae la solución
acuosa 3 veces con 90 ml de cloruro de metileno cada vez para el
reparto del N-octil-monooxietileno
activado. Se seca la fase de disolvente orgánico combinado sobre
sulfato de magnesio, y se retira el disolvente en un evaporador
rotatorio. El resto con aspecto de jarabe es el producto activado
(11). Se controla la pureza por TLC y, si es necesario, se purifica
por cromatografía en gel de sílice (véase el esquema 4).
Se prepara una solución reciente de
n-octil-monooxietileno epoxilado
disolviendo el resto con aspecto de jarabe (11) (<0,05 moles) en
30 ml de tampón fosfato potásico 0,2 M, pH 7,8-8,4,
en DMF al 50%. Se añade (11) en pequeñas alícuotas y con agitación
a 0,10 moles (12,10 g) de L-cisteína recién disuelta
en 60 ml del tampón fosfato potásico 0,2 M, pH
7,8-8,4 en DMF al 50%. Si es necesario, se ajusta
el pH de la solución de cisteína a pH 7,8-8,4 con
KOH 1 M o ácido fosfórico 1 M. Se deja reaccionar durante una noche
a 35-40ºC con agitación moderada en una atmósfera
de nitrógeno. El derivado de
N-octil-monooxietileno cisteinilo
(12) (peso molecular 351,34) se concentra por evaporación rotatoria
y se extrae con tolueno o, si es soluble, con cloroformo. El exceso
de cisteína y otras sales deben permanecer en la fase acuosa o
precipitar en el disolvente orgánico. Se filtra la fase orgánica y
se extrae dos veces con agua para retirar el fosfato potásico. Se
seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio. Si es necesario,
para retirar el exceso de cisteína o para cambiar los disolventes
(por ejemplo: de tolueno a cloroformo), se usa cromatografía en gel
de sílice. Se retira el disolvente por evaporación rotatoria. El
producto (12) debe ser un residuo con aspecto de jarabe. Se
controla la pureza por TLC en gel de sílice o por HPLC frente a
(11) y cisteína (véase el esquema 4).
A 0,4 mg (\sim 240 moles) de saponinas de
Quillaja desaciladas disueltas en 10 ml de DMF/piridina (60:40,
v/v) se les añaden 480 \mumoles (100 mg) de
diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 480 \mumoles (56 mg) de
N-hidroxisuccinimida (NHS). Se deja que la reacción
continúe con mezcla durante una noche a temperatura ambiente.
(Protegido de la humedad). Se añaden 50 mg más de DCC y 28 mg de
NHS, y se deja que continúe la reacción durante otra hora. Se enfría
la reacción a \sim 0-4ºC durante una hora y se
filtra a través de un filtro de vidrio muy fino para retirar el
subproducto insoluble de diciclohexilurea de DCC. Se retira la
piridina en un evaporador rotatorio y se añaden 40 ml de acetato de
etilo frío (EtOAc) para precipitar el derivado de
DS-saponina:NHS (13). Después de
1-2 horas en un congelador, se recoge el derivado
precipitado por filtración en un papel de filtro de vidrio fino, y
el precipitado se lava en el papel de filtro con EtOAc adicional.
El producto (13) puede almacenarse al vacío sobre un desecante
fuerte (véase el esquema 5).
Se disuelve el derivado de
DS-saponina:NHS (13) (se supone un rendimiento del
100% de \sim 240 \mumoles) en \sim 5 ml de DMF/piridina
(60:40, v/v). A la solución de (13) se le añaden 0,20 g (\sim 0,5
moles) del derivado (12) disuelto en 5 ml de piridina para producir
un exceso molar de \sim 2 veces sobre (13). Se protege de la
humedad y se deja reaccionar durante 8-12 horas a
temperatura ambiente para producir el análogo de saponina con una
cadena lateral de n-octil-monooxietileno
cisteinilo (14). Se controla el progreso de la reacción por TLC
usando
n-butanol-piridina-agua,
3:2:1, como disolvente, y yodo o carbonización para la detección.
En un evaporador rotatorio se retira la piridina de la mezcla de
reacción, se añaden \sim 30 ml de EtOAc frío, y se almacena en un
congelador durante 3-5 horas para precipitar (14).
Se recoge el precipitado (14) por filtración en un papel de filtro
de vidrio fino, y se lava el precipitado con EtOAc para retirar el
residuo (12), que debe ser soluble en EtOAc. Si es necesario, (14)
se purifica por cromatografía en gel de sílice. Se disuelve el
análogo de saponina en agua y se liofiliza. Se analiza (14) por HPLC
y se confirma por espectrometría de masas (véase el esquema 6).
La síntesis de un análogo de saponina de Quillaja
que tiene un brazo lateral no cargado tiene en común las etapas (1)
y (3) con la síntesis descrita anteriormente. Las etapas (2) y (4)
son bastante similares y se describen en este documento.
Se disuelve el resto con aspecto de jarabe (11,
preparado de acuerdo con la etapa i, anterior) (> 0,05 moles) en
30 ml de carbonato potásico 0,2 N en acetonitrilo. Se añade (11) en
pequeñas alícuotas y con agitación a 0,40 moles (26,7 ml) de
etilendiamina disuelta en 60 ml de piperazina 0,2
M-carbonato potásico 0,2 N. La reacción se realiza
a temperatura ambiente durante una noche con agitación. Se
neutraliza con HCl, se concentra por evaporación rotatoria y el
derivado de N-octil-monooxietileno
etilendiamina (15) (peso molecular 332,30) se disuelve
preferiblemente en cloroformo, y si no en tolueno. (La sal
etilendiamina.HCl puede ser insoluble en los disolventes orgánicos,
particularmente si está hidratada.) Si la sal etilendiamina.HCl es
insoluble en el disolvente orgánico, se filtra a través de un
filtro de vidrio fino y la fase orgánica se extrae con agua para
retirar la etilendiamina residual. La fase orgánica se seca
añadiendo sulfato de magnesio seco. En caso de que no se pueda
retirar la etilendiamina por extracción con disolvente, o si el
disolvente necesita cambiarse (tal como de tolueno a cloroformo),
se usa cromatografía en gel de sílice. El disolvente se retira en
un evaporador rotatorio. El producto debe ser un resto con aspecto
de jarabe. Su pureza se controla por TLC o HPLC frente a (11) y
etilendiamina (véase el esquema 6).
El derivado de DS-saponina:NHS
(13, preparado de acuerdo con la etapa iii, anterior) (se supone un
rendimiento del 100%, \sim 240 \mumoles) se disuelve en \sim
5 ml de DMF/piridina (60:40, v/v). Se añaden a (13) 0,33 g (1 mmol)
del derivado (15) disuelto en 5 ml de piridina para producir un
exceso molar de \sim 40 veces sobre (13). Se deja reaccionar
durante 8-12 horas a temperatura ambiente
(protegido de la humedad) para producir el análogo de saponina con
una cadena lateral de N-octil-monooxietileno
etilendiamina (16). Se controla el progreso de la reacción por TLC
o HPLC. Se retira la piridina en un evaporador rotatorio de la
mezcla de rotación, se añaden aproximadamente 30 ml de EtOAc frío,
y se almacena en un congelador durante 3-5 horas
para precipitar (16). Se recoge el precipitado (16) por filtración
en un papel de filtro de vidrio fino y el precipitado se lava con
EtOAc para retirar el residuo (15), que debe ser soluble en EtOAc.
Si es necesario, (16) se purifica por cromatografía en gel de
sílice. El análogo de saponina se disuelve en agua y se liofiliza.
Se analiza (16) por HPLC y se confirma por espectrometría de masas
(véase el esquema
7).
7).
El tolueno puede retirarse por evaporación
rotatoria a presión reducida (pe_{760} 110,6ºC). La DMF se puede
retirar por evaporación rotatoria a presión reducida (pe_{39}
76ºC, pe_{37} 25ºC).
Los derivados de
N-octil-monooxietileno de ácido
2,3-diaminopropiónico y etilendiamina deben ser
solubles en varios disolventes orgánicos, tales como alcoholes,
cetonas y disolventes aromáticos, pero insolubles en éter de
petróleo. Durante la extracción de fases orgánicas con agua, hay una
posibilidad de formación de emulsiones debido a las propiedades
detergentes de los derivados de
N-octil-monoetileno. Estas emulsiones pueden
romperse calentando la suspensión o centrifugando.
Los análogos de saponina deben ser insolubles en
EtOAc, alcoholes tales como etanol e isopropanol y acetona.
Como se indicó anteriormente, las saponinas
triterpénicas no aciladas de Gypsophila y Saponaria
tienen un efecto adyuvante significativo sobre la inmunorrespuesta
secundaria. Sin embargo, a diferencia de las saponinas de Quillaja,
sus efectos sobre la inmunorrespuesta primaria son de escasa
importancia. Se contempla que la adición de un resto de ácido graso
a estas saponinas mejorará su adyuvancia durante la
inmunorrespuesta primaria temprana. Se proporciona una fuerte
evidencia circunstancial del papel propuesto para los grupos de
ácido graso en la adyuvancia única de saponinas de Quillaja por
QS-7, una de estas saponinas (Kensil, C. et al.,
J. Immunol 146:431 (1991); Kensil et al., Patente de
Estados Unidos Nº 5.057.540 (1991)). Esta saponina, que es muy
hidrófila, tiene (a) un tiempo de retención comparable al de las
saponinas de Quillaja desaciladas y (b) carece de una
arabinosa que es el resto glicosilo asociado con el resto aciloil
acilo de las saponinas de Quillaja. Estas características sugieren
firmemente que QS-7 no está acilado. Esta saponina
también tiene diferentes actividades que las saponinas de
Quillaja aciladas. QS-7 es no tóxico, no
hemolítico y tiene un comportamiento parecido a las saponinas de
Quillaja desaciladas. Aunque QS-7 potencia la
inmunidad humoral, sus efectos sobre el perfil de isotipos de
anticuerpos son diferentes de los observados con
QS-21. Estas propiedades sugieren que el resto
aciloílo es responsable de la adyuvancia característica, así como
de la toxicidad observada con las otras saponinas de Quillaja. De
este modo, es de esperar que la adición de un resto lipófilo
apropiado a saponinas adyuvantes no aciladas potencie sus efectos
adyuvantes sobre la inmunidad humoral o mediada por células, y
además limite la toxicidad observada con saponinas de
Quillaja. Esto último es un requisito crucial para la
aplicación satisfactoria de estos adyuvantes a vacunas
pediátri-
cas.
cas.
Las propiedades adyuvantes e immunoestimuladoras
de algunas saponinas aparentemente tienen ciertos requisitos
estructurales, incluyendo (a) una aglicona triterpénica con un
grupo aldehído unido o acoplado en la posición 4, y (b) cadenas de
azúcar ramificadas en las posiciones 3 y/o 28 de la aglicona. El
papel del grupo triterpénico podría facilitar la unión al colesterol
en membranas celulares, con alguna implicación posterior del grupo
aldehído. Las cadenas de azúcar ramificadas parecen ser importantes
para la estimulación de la inmunidad humoral, como se indica por la
ausencia de adyuvancia de las saponinas de Quillaja modificadas por
oxidación con peryodato.
Se ha postulado que la adyuvancia de saponinas de
Quillaja puede requerir una asociación próxima de saponina:antígeno
y que sus grupos acilo facilitan esta asociación potenciando su
hidrofobia. También se ha demostrado que aumentando el número de
moléculas de saponina de Quillaja asociadas con una saponina
conjugada a una proteína se obtiene una mayor adyuvancia.
Aparentemente, las moléculas de saponina de Quillaja se mantienen
juntas por interacciones hidrófobas entre sus restos acilo formando
una estructura de tipo micela. La comparación de la adyuvancia de
saponinas de Quillaja con la de saponinas no aciladas de
Gypsophila oldhamiana y Saponaria officinalis ha
mostrado actividades algo similares. Sin embargo, las saponinas de
Quillaja inducen una inmunorrespuesta primaria mucho mayor
(Bomford, R. et al., Vaccine 10:571 (1992)). Este
descubrimiento sugiere que los restos acilo hidrófobos de las
saponinas de Quillaja mejoran las propiedades adyuvantes intrínsecas
de sus desacilsaponinas.
Una comparación de las estructuras de saponinas
de Quillaja, Gypsophila y Saponaria muestra
varias similitudes (figura 1). Todas ellas tienen agliconas de
triterpeno con un grupo aldehído en la posición 23, oligosacáridos
ramificados unidos por un enlace éster en la posición 28 y un ácido
3-O-glucurónico (3-O-glcA) que en Quillaja y
Gypsophila está unido a oligosacáridos ramificados. Sin
embargo, las saponinas de Quillaja son las únicas con restos
aciloil acilo. Ciertos estudios estructura/función de las saponinas
de Quillaja han demostrado que la presencia del grupo
23-aldehído, la integridad de las cadenas de
oligosacárido y los grupos 28-O-acilo son críticos para
conseguir una adyuvancia completa. El resto 3-O-glcA
aparentemente puede modificarse sin la pérdida de adyuvancia. De
hecho, el resto glicósido de 3-O-glcA se ha usado para
conjugar saponinas de Quillaja a antígenos (Kensil, C. et al.,
Vaccines 92:35 (1992)). La comparación de las actividades
adyuvantes de estas saponinas demuestra que las saponinas de
Quillaja inducen una inmunorrespuesta primaria significativamente
mejor, pero que todas ellas inducen inmunorrespuestas secundarias
fuertes (tabla 1). Este efecto diferencial sugiere un papel
principal para los restos aciloil acilo de las saponinas de
Quillaja en la inmunorrespuesta primaria. La inmunorrespuesta
primaria significativamente menor inducida por las desacilsaponinas
de Quillaja, en comparación con las inducidas por sus saponinas
aciladas, proporciona una confirmación de este papel propuesto.
Las modificaciones de las saponinas de
Gypsophila y Saponaria pueden realizarse de un modo
similar al descrito anteriormente para desacilsaponinas de
Quillaja usando el carboxilo del resto 3-O-glcA como
el sitio de adición de nuevos restos a las saponinas. Estas
neosaponinas con un nuevo resto lipófilo en sus estructuras debería
tener mejores propiedades adyuvantes que las moléculas de saponinas
originales.
Otras saponinas triterpénicas no aciladas, tales
como squarroside A, lucyoside P y saponina desacilada de S.
jenisseensis, también tienen los requisitos estructurales
para las propiedades de adyuvancia e inmunoestimulación. Por
ejemplo, se ha demostrado que la saponina squarroside A (figura 2)
tiene actividad inmunomoduladora, como se mide por un ensayo
linfoproliferativo in vitro. De este modo, estas saponinas
pueden modificarse por la adición de cadenas lipófilas a su resto
de ácido 3-O-glucurónico para producir neosaponinas con
propiedades adyuvantes mejoradas.
Los adyuvantes inmunes son compuestos que, cuando
se administran a un individuo o se ensayan in vitro,
aumentan la respuesta inmune a un antígeno en un sujeto al que se
le administra el antígeno o potencian ciertas actividades de las
células del sistema inmune. Algunos antígenos son débilmente
inmunogénicos cuando se administran solos o son tóxicos para un
sujeto a concentraciones que provocan respuestas inmunes útiles en
un sujeto. Un adyuvante inmune puede potenciar la respuesta inmune
del sujeto al antígeno haciendo que el antígeno sea más
inmunogénico. El efecto adyuvante también puede dar como resultado
la capacidad de administrar una dosis más baja de antígeno para
conseguir una respuesta inmune útil en un sujeto.
Los adyuvantes inmunes pueden modificar o
"inmunomodular" la red de citoquinas, regulando positivamente
la respuesta inmune. Junto con esta inmunomodulación, también hay
una selección de qué célula, T, Th1 o Th2, organizará esta respuesta
inmune. Las respuestas Th1 inducirán anticuerpos de fijación al
complemento y reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado
asociadas con IL-2, IL-12 e
interferón \gamma. La inducción de la respuesta CTL parece estar
asociada con una respuesta Th1. Las respuestas Th2 están asociadas
con altos niveles de IgE, y las citoquinas IL-4,
IL-5, IL-6 e IL-10.
Las saponinas que contienen aldehído inducen una fuerte respuesta
Th1. Sin embargo, algunos de sus análogos pueden inducir una
respuesta Th2.
La actividad inductora de inmunógenos de los
compuestos y composiciones de la presente invención puede
determinarse por varios métodos conocidos. Para medir la actividad
inmunogénica puede usarse el aumento de la titulación de
anticuerpos contra un antígeno particular tras la administración de
una composición de la presente invención. (Dalsgaard, K. Acta
Veterinia Scandinavica 69:1-40 (1978)). Un
método requiere la inyección intradérmica a ratones
CD-1 de una composición de ensayo que incluye uno o
más antígenos exógenos. Dos semanas después, se recogen sueros de
los ratones y se ensayan por ELISA con respecto a la presencia de
anticuerpos anti-inmunógeno.
Las composiciones de la invención son útiles como
vacunas para inducir inmunidad activa hacia antígenos en sujetos.
Puede tratarse cualquier animal que pueda experimentar los efectos
beneficiosos de las composiciones de la presente invención dentro
del alcance de los sujetos. Los sujetos son preferiblemente
mamíferos, y más preferiblemente seres humanos.
Los conjugados de
saponina-lipófilo de la presente invención pueden
emplearse como un solo adyuvante o, como alternativa, pueden
administrarse junto con adyuvantes que no son saponinas. Dichos
adyuvantes que no son saponinas útiles con la presente invención
incluyen adyuvantes oleosos (por ejemplo, adyuvante completo e
incompleto de Freund), liposomas, sales minerales (por ejemplo,
AlK(SO_{4})_{2},
AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH_{4}(SO_{4}),
sílice, alumbre, Al(OH)_{3},
Ca_{3}(PO_{4})_{2}, caolín y carbono), polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli IC y poli AU), polímeros (por ejemplo, polímeros de bloque no iónicos, polifosfacenos, cianoacrilatos, polimerasa-(DL-lactida-co-glicósido), entre otros, y ciertas substancias naturales (por ejemplo, lípido A y sus derivados, cera D de Micobacterium tuberculosis, así como substancias encontradas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, y miembros del género Brucella), albúmina de suero bovino, toxoide diftérico, toxoide tetánico, edestina, hemocianina de lapa californiana, toxina A de Pseudomonas, coleragenoide, toxina colérica, toxina de pertussis, proteínas virales y proteínas eucariotas tales como interferones, interleuquinas o factor de necrosis tumoral. Dichas proteínas pueden obtenerse a partir de fuentes naturales o recombinantes de acuerdo con métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Cuando se obtienen de fuentes recombinantes, el adyuvante que no es una saponina puede comprender un fragmento de proteína que comprende al menos la porción inmunoestimuladora de la molécula. Otras macromoléculas inmunoestimuladoras conocidas que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen, pero sin limitación, polisacáridos, ARNt, polímeros sintéticos no metabolizables, tales como polivinilamina, ácido polimetacrílico, polivinilpirrolidona, policondensados mixtos (con peso molecular relativamente alto) de ácido 4',4-diaminodifenilmetano-3,3'-dicarboxílico y ácido 4-nitro-2-aminobenzoico (véase Sela, M., Science 166:1365-1374 (1969)) o glicolípidos, lípidos o carbohidratos.
Ca_{3}(PO_{4})_{2}, caolín y carbono), polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli IC y poli AU), polímeros (por ejemplo, polímeros de bloque no iónicos, polifosfacenos, cianoacrilatos, polimerasa-(DL-lactida-co-glicósido), entre otros, y ciertas substancias naturales (por ejemplo, lípido A y sus derivados, cera D de Micobacterium tuberculosis, así como substancias encontradas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, y miembros del género Brucella), albúmina de suero bovino, toxoide diftérico, toxoide tetánico, edestina, hemocianina de lapa californiana, toxina A de Pseudomonas, coleragenoide, toxina colérica, toxina de pertussis, proteínas virales y proteínas eucariotas tales como interferones, interleuquinas o factor de necrosis tumoral. Dichas proteínas pueden obtenerse a partir de fuentes naturales o recombinantes de acuerdo con métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Cuando se obtienen de fuentes recombinantes, el adyuvante que no es una saponina puede comprender un fragmento de proteína que comprende al menos la porción inmunoestimuladora de la molécula. Otras macromoléculas inmunoestimuladoras conocidas que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen, pero sin limitación, polisacáridos, ARNt, polímeros sintéticos no metabolizables, tales como polivinilamina, ácido polimetacrílico, polivinilpirrolidona, policondensados mixtos (con peso molecular relativamente alto) de ácido 4',4-diaminodifenilmetano-3,3'-dicarboxílico y ácido 4-nitro-2-aminobenzoico (véase Sela, M., Science 166:1365-1374 (1969)) o glicolípidos, lípidos o carbohidratos.
Las saponinas modificadas químicamente de la
presente invención muestran efectos adyuvantes cuando se
administran en un amplio intervalo de dosificaciones y un amplio
intervalo de proporciones con respecto a uno o más antígenos
particulares a administrar.
Las saponinas modificadas químicamente pueden
administrarse individualmente o mezcladas con otros adyuvantes
substancialmente puros para conseguir una potenciación de la
respuesta inmune a un antígeno. Las saponinas modificadas
químicamente pueden ser saponinas modificadas substancialmente
puras, o pueden estar en forma de una mezcla de saponinas
modificadas químicamente. Los conjugados de
saponina-lipófilo de la presente invención pueden
utilizarse para potenciar la respuesta inmune a uno o más
antígenos. Los antígenos típicos adecuados para las composiciones
que provocan respuestas inmunes de la presente invención incluyen
antígenos obtenidos de cualquiera de los siguientes: virus, tales
como influenza, virus de la leucemia felina, virus de la
inmunodeficiencia felina, VIH-1,
VIH-2, rabia; sarampión, hepatitis B, fiebre aftosa;
bacterias tales como ántrax, difteria, enfermedad de Lyme o
tuberculosis; o protozoos, tales como Babeosis bovis o
Plasmodium. El antígeno puede ser proteínas, péptidos,
polisacáridos o mezclas de los mismos. Las proteínas y péptidos
pueden purificarse a partir de una fuente natural, sintetizarse por
medio de síntesis en fase sólida, o pueden obtenerse por medio de
genética recombinante. El antígeno puede comprender un fragmento
proteico que comprende una o más regiones inmunogénicas de la
molécula.
Los conjugados de saponina de la presente
invención pueden utilizarse para potenciar la respuesta inmune
contra antígenos producidos por el uso de vacunas de ADN. Las
secuencias de ADN en estas vacunas que codifican el antígeno pueden
estar "desnudas" o contenidas en un sistema de liberación, tal
como liposomas. Las vacunas típicas que usan esta estrategia son
vacunas virales, tales como influenza, herpes, citomegalovirus,
VIH-1, HTLV-1, VIF, vacunas de
cáncer y vacunas de parásitos. Los conjugados de saponina pueden
administrarse junto con el ADN en un momento anterior y/o posterior
que la administración de ADN.
Las células cancerosas tienen antígenos
característicos en sus superficies, tales como el factor de
crecimiento epidérmico truncado, la proteína de unión a folato,
mucinas epiteliales, melanoferrina, antígeno carcinoembrionario,
antígeno de membrana específico de próstata,
HER2-neu, que son candidatos a usar en vacunas
terapéuticas contra el cáncer. Como los antígenos tumorales son
componentes normales o están relacionados con componentes normales
del cuerpo, el sistema inmune a menudo no puede organizar una
respuesta inmune eficaz contra esos antígenos para destruir las
células tumorales. Para conseguir dicha respuesta, pueden
utilizarse saponinas de Quillaja y conjugados de
saponina-lipófilo. Los adyuvantes de saponina
triterpenoide que contienen un aldehído funcionan por reacción con
grupos amino de la proteína o proteínas receptoras presentes en
ciertas células T, y formando bases de Schiff. Como resultado de
esta reacción, ciertas proteínas exógenas pueden entrar en la vía
de procesamiento de antígenos endógenos, conduciendo a la producción
de células T citolíticas o citotóxicas (CTL). Este efecto adyuvante
único induce la producción de CTL específicas de antígeno que
buscan y destruyen las células tumorales que llevan en su
superficie el antígeno o antígenos tumorales usados para la
inmunización. Los conjugados de saponina de la presente invención
también pueden usarse con antígenos tumorales de carbohidrato, tales
como gangliósidos, el antígeno de
Thomsen-Friedenreich (T), y otros.
Los conjugados de saponina de la presente
invención también pueden administrarse solos para potenciar el
sistema inmune para el tratamiento de enfermedades infecciosas
crónicas, especialmente en pacientes inmunodeprimidos. En la Patente
de Estados Unidos Nº 5.508.310 se describen ejemplos de
enfermedades infecciosas para cuyo tratamiento terapéutico o
profiláctico pueden emplearse conjugados de la presente invención.
La potenciación del sistema inmune por conjugados de saponina
también puede ser útil como medida preventiva para limitar los
riesgos de infecciones nosocomiales y/o postquirúrgicas.
La administración de los compuestos útiles en el
método de la presente invención puede ser por vía parenteral,
intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranasal o cualquier otro
medio. La dosificación administrada puede ser dependiente de la
edad, peso, tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, y naturaleza
del antígeno administrado. En general, los conjugados
saponina/antígeno pueden administrarse sobre un amplio intervalo de
dosificaciones y un amplio intervalo de proporciones con respecto
al antígeno que se está administrando. La dosis inicial puede
continuarse por una dosificación de refuerzo después de un periodo
de aproximadamente 4 semanas para potenciar la respuesta
inmunogénica. También pueden administrarse dosificaciones de
refuerzo adicionales.
Los conjugados de
saponina-lipófilo de la presente invención pueden
emplearse en formas tales como cápsulas, soluciones líquidas,
emulsiones, suspensiones o elixires para administración oral, o
formas líquidas estériles tales como soluciones, emulsiones o
suspensiones. Preferiblemente se usa cualquier vehículo inerte, tal
como solución salina o solución salina tamponada con fosfato, o
cualquier vehículo en el que los compuestos usados en el método de
la presente invención tengan propiedades de solubilidad adecuadas
para uso en los métodos de la presente invención.
Los conjugados de
saponina-lipófilo de la presente invención pueden
emplearse en asociación con liposomas, donde la saponina puede
estar en una o en las dos bicapas del liposoma, asociada
ligeramente con el material lipídico en una preparación de
liposomas (donde los conjugados no están dentro de una bicapa, pero
están asociados de otro modo con lípidos), y en algunos casos,
atrapada dentro de las bicapas de los liposomas: véase, por
ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.235.877 de
Fullerton.
La invención también proporciona un kit para la
inmunización de un individuo que comprende un soporte
compartimentalizado para recibir en su interior uno o más medios de
envase donde el primer envase contiene un conjugado de
saponina-lipófilo de la invención. El kit también
puede incluir al menos otro medio de envase que contiene un
adyuvante de saponina u otro adyuvante como se ha descrito en este
documento.
Como se ha indicado anteriormente, los análogos
de saponina biotinilados son reactivos útiles para identificar y
determinar qué células del sistema inmune tienen receptores capaces
de reaccionar con saponinas formadoras de imina. Estas saponinas
(tales como las de Quillaja, Gypsophila y Saponaria) reemplazan el
ligando B7.1 coestimulador que se expresa en APC y reacciona con el
receptor CD28 en células T. Tras la coestimulación con B7.1 o un
adyuvante de saponina formador de imina, las células T se activan
para formar CTL específicas de antígeno. El uso de estos análogos
de saponina señalizados permite la determinación del progreso del
proceso de respuesta inmune midiendo cualitativa o
cuantitativamente la presencia de células T que tienen receptores en
la superficie celular que pueden unirse a saponinas desaciladas o
no aciladas.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no
limitantes, del método y composiciones de la presente invención.
Dentro del espíritu y alcance de la invención se incluyen otras
modificaciones y adaptaciones adecuadas de la diversidad de
condiciones y parámetros normalmente encontrados y evidentes para
los especialistas en la técnica.
Los materiales de partida de saponina
triterpénica requeridos pueden obtenerse a partir de preparaciones
comerciales de saponinas de Quillaja saponaria Molina, que
están aciladas. A modo de ejemplo, se pueden usar dos tipos de
preparaciones comerciales:
(a) Saponina de Quillaja (calidad práctica,
obtenidas de Fisher Scientific), contienen aproximadamente un 25%
(p/p) de saponinas y un 75% (p/p) de contaminantes solubles en
agua, es decir, oligosacáridos, taninos, etc.; y
(b) Saponinas de Quillaja dializadas o Quil A
(obtenidas en Accurate Chemicals o Sigma Chemical Co.) son >80%
(p/p) de saponinas con un contaminante o contaminantes insolubles
en metanol.
Las saponinas de Quillaja de calidad práctica
pueden purificarse adicionalmente del siguiente modo:
A. Una preparación de saponina de calidad
práctica (1) se disuelve en agua a una concentración del
20-25% (p/v) y el pH se ajusta a aproximadamente 4
con ácido acético 1 N para formar una solución turbia. La solución
turbia se vierte en un saco de diálisis convencional y se dializa
frente a 3-4 cambios de 25-50
volúmenes de agua durante 24 horas. El agua se cambia cada
4-8 horas de diálisis. El dializado después se
liofiliza, produciendo una preparación de color blanco. Después de
la diálisis, la preparación de saponina (2) contiene un
contaminante (quizás pigmentos o taninos) que es insoluble en
metanol. Rendimiento: \pm25% del peso inicial de la preparación
de saponina de calidad práctica, que representa aproximadamente un
95% (p/p) de las saponinas originales.
B. Se extrae un gramo de preparación de saponina
seca (2) con 50 ml de metanol a 60ºC durante 20-25
minutos. La suspensión se filtra y el material no disuelto se
reextrae con 30 ml de metanol a 60ºC durante 20-25
minutos. Los filtrados metanólicos transparentes se reúnen y se
llevan a sequedad con un evaporador rotatorio. La preparación de
saponina extraída con metanol (3) carece de contaminantes
insolubles en metanol. Los rendimientos son de hasta el 70% de la
preparación (2).
Los grupos acilo de las saponinas de Quillaja se
retiran por hidrólisis alcalina suave para producir cuatro
desacilsaponinas distintas (siendo dos isómeros), más ácido
3,5-dihidroxi-6-metiloctanoico,
y ácido
3,5-dihidroxi-6-metiloctanoico
5-O-a-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-a-arabinofuranósido.
A modo de ejemplo, los siguientes métodos de hidrólisis alcalina
son útiles para preparar estas saponinas desaciladas (4).
(i) Se hierven saponinas extraídas con metanol
(3) (60 mg/ml) con Na_{2}CO_{3} al 6% en metanol al 50% durante
1 hora, y la mezcla de reacción se neutraliza con Dowex
50W-X8 H (un intercambiador catiónico fuertemente
ácido sintético que es una resina sulfonada de
poliestireno-divinilbenceno) y se filtra. El
filtrado se concentra con un evaporador rotatorio, y se divide entre
acetato de etilo y agua. La fase acuosa incluirá la mayor parte de
las desacilsaponinas, mientras que la fase orgánica de EtOAc
contendrá la mayor parte de los ácidos octanoicos. Se retira el
EtOAc de la fase acuosa pasando gas nitrógeno o usando un
evaporador rotatorio, y se liofiliza la solución de desacilsaponina
acuosa (4).
(ii) Se resuspenden saponinas extraídas con
metanol (3) (0,1 g) en 3 ml de n-propanol al 90%. Esta
suspensión/solución se ajusta a NaOH 0,5 N por medio de la adición
de una solución madre de NaOH 5 N y se mezcla durante 2 horas a
temperatura ambiente (20-25ºC). La suspensión se
centrifuga 5 minutos a 50 x g para producir un sobrenadante
ligeramente coloreado, que se desecha, y un precipitado granulado
parduzco. El precipitado se lava 3 veces, resuspendiéndolo con 3 ml
de n-propanol al 90% y centrifugando a 50 x g. El sedimento
resultante de desacilsaponinas (4) se redisuelve en 3 ml de agua y
se liofiliza.
Como alternativa, las saponinas extraídas con
metanol (3) se disuelven en agua para formar una solución que tiene
20 mg/ml de saponinas y la solución se ajusta a una concentración
final de trietilamina 0,15 M, pH 12. Después de 1 hora a
40-50ºC, se termina la hidrólisis alcalina añadiendo
ácido acético a pH 7,0. La mezcla de reacción se extrae con acetato
de etilo para retirar la trietilamina y algunos productos de
hidrólisis. Las desacilasaponinas (4) deben permanecer en la fase
acuosa. Otro procedimiento es disolver (3) (10 mg/ml) en amoniaco
concentrado, agitar la solución durante 5 horas a temperatura
ambiente y retirar el amoniaco en una corriente de nitrógeno. La
solución acuosa se extrae con 80 ml de acetato de etilo y la fase
orgánica se desecha. La fase acuosa que contiene las
desacilsaponinas se congela y se liofiliza.
Se dializa una solución al 5% de saponina de
gypsophila en bruto en ácido acético 10 mM en un saco de diálisis
que tiene un límite de peso molecular de aproximadamente 2000
daltons frente a 20 volúmenes de ácido acético 10 mM a 4ºC. La
solución de ácido acético se cambia dos veces después de 4 horas.
(Esta etapa retira el polisacárido y algunos contaminantes de bajo
peso molecular). La solución dializada se concentra en un
evaporador rotatorio y se liofiliza. Se extrae un gramo de la
saponina de gypsophila dializada dos veces con 50 ml de metanol
puro (MeOH) a temperatura ambiente durante 24 horas cada vez y se
filtra. Si hay material no disuelto, se extrae una vez con 50 ml de
MeOH:agua (40/60) a temperatura ambiente y se filtra para retirar
la materia insoluble. Los filtrados se combinan y se concentran a
aproximadamente 40ºC en un evaporador rotatorio para producir un
extracto de saponina con aspecto de jarabe (I). Se disuelve el
extracto en agua para producir una solución de saponina al 5%, y
esta solución se extrae dos veces con 0,5 volúmenes de acetato de
etilo. La fase acuosa se somete a cromatografía en Fractogel TSK
HW-40F, eluyendo con un gradiente del 0 al 50%
(v/v) de MeOH en agua que contiene Na_{2}CO_{3} 0,05 M. Se
analizan muestras por TLC en gel de sílice usando
n-butanol:ácido acético:agua (4/1/5) como disolvente, y se
visualiza la saponina con la reacción de Liebermann:Burchard. Como
alternativa, la saponina de (I) se puede precipitar añadiendo 5
volúmenes de acetato de etilo y se puede fraccionar por
cromatografía en gel de sílice usando cloroformo:MeOH:agua (64:40:8)
como disolvente. Pueden prepararse análogos de saponina de
gypsophila usando los mismos procedimientos desarrollados para las
saponinas de Quillaja desaciladas.
Puede añadirse una amina alifática con 6 a 20
átomos de carbono, preferiblemente una amina alifática con 9 o 12
átomos de carbono, al carboxilo del resto de ácido glucurónico de
desacilsaponinas (4) para producir desacilsaponinas conjugadas (5)
usando el método de carbodiimida. Se puede usar DCC
(diciclohexilcarbodiimida), o EDC soluble en agua
(1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida,
con o sin NHS (N-hidroxisuccinimida) o
sulfo-NHS soluble en agua. La reacción se realiza en
disolventes orgánicos, tales como dioxano, DMF (dimetilformamida),
THF (tetrahidrofurano), DMSO (dimetilsulfóxido), alcoholes y
piridina, solos o en mezclas anhidras o con agua. La presencia de
agua se impone por las propiedades de solubilidad de las
desacilsaponinas de Quillaja, que pueden ser solubles en
metanol al 50%, en n-propanol al 50%, DMSO acuoso y DMF, así
como THF anhidro o dioxano, y otros disolventes con propiedades
similares.
(a) A 100 mg (60 \mumoles) de desacilsaponinas
(4) disueltos en 1 ml de n-propanol al 50% se les añade 1 ml
de solución de dodecilamina 0,6 M (6 \mumoles) en
n-propanol al 50%. Después se ajusta el pH a un valor
comprendido entre 5 y 7 con ácido fosfórico 3 N. Se agitan 600
\mumoles de EDC seco (95 mg) en la solución resultante y se
mezclan durante 6-8 horas (de 0ºC a 10ºC). Se
añaden 300 \mumoles (47 mg) más de EDC y se deja que la reacción
continúe durante una noche a una temperatura de 0ºC a 10ºC. La
reacción se puede detener retirando la alquilamina libre con una
resina tipo Dowex 50. (La resina también puede retirar la acilurea
de EDC.) La resina se retira por filtración. El filtrado que
contiene las desacilsaponinas conjugadas (5) se mezcla con 5
volúmenes de n-propanol para precipitar (5). El precipitado
se recoge, se disuelve en agua, se dializa y se liofiliza.
(b) Si las desacilsaponinas son solubles en
piridina anhidra, sola o con THF anhidro, la reacción se puede
realizar con DCC. Se disuelven 100 mg de (4) (60 \mumoles) en
piridina y/o THF usando no menos de 1 ml pero no más de 5 ml.
Posteriormente se añade 1 ml de una solución de dodecilamida 0,3 M
(300 \mumoles) en piridina y/o THF a la mezcla de reacción,
seguido de 300 \mumoles de DCC seca. La mezcla se deja reaccionar
con mezcla durante una noche a una temperatura de 0ºC a 10ºC.
Durante la reacción, se forma diciclohexilurea insoluble; y ésta se
retira por centrifugación. El sobrenadante que contiene las
desacilsaponinas conjugadas (5) se diluye con 10 volúmenes de EtOAc
para precipitar (5). El EtOAc que contiene la alquilamina libre, la
DCC residual y la piridina y/o THF se desecha. El precipitado se
lava con EtOAc, se disuelve en agua y se vuelve a extraer con EtOAc
antes de retirar el EtOAc y liofilizarlo.
(b) A 100 mg (60 \mumoles) de desacilsaponinas
(4) disueltas en 1 ml de n-propanol al 50% se les añaden 0,2
ml de una solución de dodecilamina 0,6 M (120 \mumoles) en
n-propanol al 50%. El pH de la mezcla se ajusta a pH
5-7 con ácido fosfórico 3 N (se evitan los ácidos
carboxílicos). Se añaden 120 \mumoles de EDC seco (10 mg) y 120
\mumoles de sulfo-NHS (26 mg) a la mezcla de
reacción con agitación y se deja que la reacción continúe durante
una noche a una temperatura de 0 a 10ºC. Se añaden 5 volúmenes de
n-propanol para precipitar las desacilsaponinas conjugadas
(5). Se recoge el precipitado, se disuelve en agua, se dializa y se
liofiliza.
(b) Si las desacilsaponinas son solubles en
piridina anhidra sola o mezclada con THF anhidro, la reacción puede
realizarse con DCC. Se disuelven 100 mg de (4) (6 \mumoles) en
piridina y/o THF, usando no menos de 1 ml pero no más de 50 ml de
disolvente. Se añaden 0,4 ml de una solución de dodecilamina 0,3 M
(120 \mumoles) en piridina y/o THF a la solución de
desacilsaponina, seguido de 120 \mumoles de DCC seca y 120
\mumoles de NHS seca. Se deja que la mezcla reaccione con mezcla
durante 1 noche a una temperatura de 0ºC a 10ºC. Se forma
diciclohexilurea insoluble, que se retira por centrifugación. El
sobrenadante que contiene las desacilsaponinas conjugadas (5) se
diluye con 10 volúmenes de EtOAc para precipitar (5) y para retirar
la alquilamina libre, la DCC residual y la NHS. El precipitado se
disuelve en agua y se extrae con EtOAc antes de la concentración
con un evaporador rotatorio y la liofilización. La modificación se
confirma por espectro de masas.
Otra realización preferida de la invención es una
en la que se introducen 2 o más cadenas hidrófobas en el grupo
carboxilo del resto de ácido 3-O-glucurónico de una saponina
desacilada o no acilada. Esta adición de múltiples cadenas
lipófilas puede realizarse usando diferentes estrategias químicas,
incluyendo las descritas más adelante. Preferiblemente, una molécula
que incluye dos o tres cadenas laterales lipófilas se une
covalentemente al ácido 3-O-glucurónico, directamente o por
medio de un enlazador bifuncional.
A 0,35 g (210 mmol) de desacilsaponinas (4)
disueltas en 3 ml de DMF anhidra/piridina (60:40, v/v) a
temperatura ambiente se les añaden 280 mmol de derivado de ácido
graso de fosfatidiletanolamina (dipalmitoílo, diestearoílo y otros)
en DMF/piridina. A esta mezcla de reacción se le añaden
400-600 mmol de DCC seca
(0,08-0,125 g) y 400 mmol de NHS seca (0,05 g) y se
deja reaccionar con mezcla durante 2-16 horas a
temperatura ambiente. La mezcla de reacción se enfría a 4ºC durante
1 hora y se filtra para retirar la diciclohexilurea insoluble, un
subproducto de DCC. Al filtrado que contiene las desacilsaponinas
conjugadas se le añaden 10 volúmenes de etanol frío para precipitar
las desacilsaponinas conjugadas y para retirar la DCC residual, la
NHS y el derivado de ácidos grasos de fosfatidiletanolamina libre.
Después de 2-4 horas a 0,4ºC, el conjugado de
saponina precipitado se recoge por filtración. El precipitado se
lava en el papel de filtro con 10-20 ml de acetato
de etilo. Los conjugados de saponina precipitados después se
disuelven en 10 ml de agua y esta solución se extrae con 1 volumen
de acetato de etilo. El acetato de etilo se retira de la solución
acuosa usando un evaporador rotatorio y la mezcla se liofiliza.
A 0,63 g (2,5 mmol) de cloruro de miristoílo
disuelto en 25 ml de acetonitrilo se les añaden 2,10 g (10 mmol) de
diclorhidrato 2,4-diaminobutírico más 2,00 g de
carbonato potásico. La mezcla se deja reaccionar con agitación
durante 12-16 horas a 65ºC. Posteriormente, la
mezcla de reacción se seca a presión reducida y el residuo se
disuelve en acetato de etilo, se extrae con agua y se extrae otra
vez con agua saturada con sulfato de magnesio. La fase orgánica se
seca sobre sulfato de magnesio anhidro. El sulfato de magnesio se
retira por filtración. El filtrado se disuelve a presión reducida,
y se controla la pureza del compuesto por TLC en gel de sílice. Si
es necesario, el derivado de dimiristoílo se purifica por
cromatografía en gel de sílice.
A 0,40 g (240 mmol) de desacilsaponinas (4)
disueltas en 5 ml de DMF anhidra/piridina (60:40, v/v) a
temperatura ambiente se les añaden 2 ml de DMF/piridina que
contiene 0,23 g de derivado de dimiristoílo. Posteriormente, se
añaden 480-720 mmol de DCC seca
(0,10-0,15 g) y 480 mmol de NHS seca
(aproximadamente 0,06 g) con mezcla, y se dejan reaccionar con
mezcla durante 12-16 horas a temperatura ambiente.
La mezcla de reacción se enfría a 4ºC durante 1 hora y se filtra
para retirar la diciclohexilurea insoluble, un subproducto de DCC.
Al filtrado que contiene las desacilsaponinas conjugadas se le
añaden 10 volúmenes de etanol frío para precipitar las
desacilsaponinas conjugadas y retirar la DCC residual, la NHS y el
derivado de miristoílo libre. Después de 2-4 horas
a 0-4ºC, se recoge el conjugado de saponina
precipitado por filtración. El precipitado se lava en el papel de
filtro con 20-30 ml de acetato de etilo. El
conjugado de saponina precipitado se disuelve en 20 ml de agua y la
solución se extrae con 1 volumen de acetato de etilo. El acetato de
etilo se retira de la solución acuosa usando un evaporador
rotatorio y se liofiliza. La pureza de la muestra se controla por
TLC en gel de sílice. Si es necesario, la desacilsaponina conjugada
puede purificarse por cromatografía en gel de sílice.
A 0,50 g (2,5 mmol) de ácido cítrico disuelto en
20 ml de acetonitrilo o piridina se les añaden con mezcla 3,60 g
(15 mmol) de 1-hexadecilamina. A esta solución se
le añaden 35 mmol de DCC seca (7,20 mg) y 35 mmol de NHS (4,00 g), y
la mezcla se deja reaccionar durante una noche a temperatura
ambiente. La mezcla de reacción se enfría a 4ºC durante una hora y
se filtra para retirar la diciclohexilurea insoluble. El disolvente
se retira a presión reducida en un evaporador rotatorio. El residuo
seco se disuelve en alcohol y la alquilamina residual se retira con
una resina fuertemente ácida (Dowex 50). La pureza del producto se
controla por TLC en gel de sílice. Si es necesario, el producto se
purifica por cromatografía en gel de sílice. El derivado de ácido
cítrico- tripalmitoílo (1,87 g, 2 mmol) se disuelve en 20 ml de
acetonitrilo, se añaden 2,5 mmol de
1,1'-carbonildiimidazol (CDI) (0,40 g) y la mezcla
se deja reaccionar durante 4 horas a temperatura ambiente en
condiciones anhidras. Después se añade un exceso de 5 veces de
etilendiamina (10 mmol, aproximadamente 0,65 ml) a la mezcla de
reacción y se deja reaccionar durante otras 2-3
horas a temperatura ambiente). Posteriormente, se añade agua al 10%
para destruir el CDI residual, y se retira el disolvente a presión
reducida. Los productos de reacción se disuelven en un disolvente
adecuado, por ejemplo, metanol o cloroformo, y se purifican por
cromatografía en gel de sílice. Las fracciones que contienen el
derivado de ácido cítrico-tripalmitoílo aminado
(peso molecular aproximadamente 1019,7) se combinan, y el
disolvente se retira a presión reducida.
El conjugado de saponina desacilada se prepara
haciendo reaccionar en piridina/DMF (40:60, v/v) un mol de
desacilsaponina con 1,5 moles del derivado de ácido
cítrico-tripalmitoílo aminado usando el método de
DCC/NHS descrito anteriormente. Después de la filtración para
retirar la diciclohexilurea insoluble, la saponina conjugada se
precipita con varios volúmenes de acetato de etilo, se redisuelve
en agua y se liofiliza.
La invención descrita no se limita a cadenas
hidrófobas lineales como restos lipófilos. También pueden emplearse
compuestos cíclicos y heterocíclicos no aromáticos y aromáticos,
tales como triterpenoides y esteroides como resto lipófilo. Como
ejemplo, en este documento se describe la preparación de un
derivado esteroide. A 2 mmol de ácido desoxicólico (0,79 g) en 10 ml
de piridina se les añaden con mezcla 10 mmol (0,67 ml) de
etilendiamina, seguido de 4 mmol de DCC seca (0,82 g) y 4 mmol de
NHS (0,50 g). Se deja que la mezcla reaccione durante una noche a
25ºC. Después, la reacción se enfría, el subproducto de DCC
insoluble se filtra, y el disolvente se retira a presión reducida.
Los productos se disuelven en un volumen pequeño de
cloroformo-metanol (3:2, v/v) o disolvente similar,
y el producto aminado se separa de la etilendiamina por
cromatografía en gel de sílice. El disolvente se retira a presión
reducida.
El conjugado de saponina desacilada se prepara
haciendo reaccionar 1 mol de desacilsaponina con 2 moles del
derivado de ácido desoxicólico aminado usando el método de DCC/NHS
descrito anteriormente. La saponina conjugada se precipita con
alcohol, se redisuelve en agua y se liofiliza.
El efecto adyuvante puede evaluarse aumentando
las titulaciones de anticuerpos específicos de antígeno debido a la
adición de un adyuvante potencial en la formulación de
inmunización. El aumento de las titulaciones se debe a un aumento
de las concentraciones de anticuerpo y/o a un aumento de la afinidad
antígeno/anticuerpo. Los efectos adyuvantes de las saponinas se han
medido previamente por medio del aumento de la titulación de
anticuerpos neutralizadores en vacunas contra la fiebre aftosa en
cobayas (Dalsgaard, K., Archiv. for die gesamte. Virusforschung
44:243.254 91974)), el aumento de la titulación de anticuerpos
de precipitación contra BSA (medidos por inmunodifusión radial) en
cobayas vacunados con mezclas de BSA/saponina (Dalsgaard, K.,
Acta Veterinaria Scandinavica 69:1-40
(1978)), así como por el aumento en la titulación de anticuerpos
anti-hemocianina de lapa californiana (KLH) (medido
por ELISA) en ratones inmunizados con KLH/saponina (Scott et al.
Int. Archs. Allergy appl. Immun. 77:409-412
(1985)).
La evaluación del efecto adyuvante puede
determinarse por medio del aumento de los anticuerpos
anti-OVA después de la inmunización con
OVA/saponinas, OVA/saponinas desaciladas u OVA/análogos de
saponina, en comparación con la inmunización con OVA en ausencia de
saponina. La actividad adyuvante en la fracción conjugada de
saponinas se mide de la siguiente manera: se inmunizan por vía
intradérmica ratones CD2F1 (de 8-10 semanas) con la
siguiente formulación: 20 \mug de OVA (Sigma) y adyuvante de la
presente invención o saponina de Quillaja (a dosis que varían de 10
a 2500 \mug), o saponina de Quillaja (a una dosis de 10 \mug)
en 200 \mul de PBS. Las dos inmunizaciones se administran a
intervalos de dos semanas. A los ratones de control se les inyecta
PBS o PBS con OVA, más 200 \mug de hidróxido de aluminio. Los
sueros se recogen dos semanas después de la inmunización. El
anticuerpo anti-OVA se determina por ELISA: se
recubren placas Immulon II durante una noche a 4ºC con 100 ml de una
solución de OVA (10 mg/ml en PBS) en filas, A, C, E y G. Las placas
se lavan dos veces con PBS. La unión no específica se evita
incubando durante 1,5 horas a 37ºC con 100 \mul de diluyente
(hidrolizado ácido de caseína al 2% (Oxiod, p/v) en PBS) por
pocillo en todos los pocillos. Las placas se lavan cuatro veces con
tensioactivo Tween 20 al 0,05% en agua destilada. Se incuban sueros
a diluciones de 1:20, 1:100, 1:500, 1:2500, 1:12.500, 1:62.500,
1:312.500 y 1:1.562.500 en las filas A+B, C+D, E+F y G+H,
respectivamente (100 \mul/pocillo) durante 1 hora a temperatura
ambiente. Las placas se lavan como se ha descrito anteriormente. Se
incuba anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con
peroxidasa de rábano picante de Boehringer-Mannheim
(1/5000 en OVA al 5% en diluyente) durante 30 minutos a temperatura
ambiente (100 \mul por pocillo, todos los pocillos). Las placas
se lavan como se ha descrito anteriormente. El grado de reacción de
la peroxidasa se determina por reacción con
2,2'-ázido-bis(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfonato
(30 minutos de reacción a temperatura ambiente, absorbancia medida
a 450 nm) o con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (10
minutos de reacción, la unión de anticuerpo no específico con
respecto a la unión de anticuerpo total se elimina restando la
absorbancia del pocillo negativo con respecto al antígeno de la
absorbancia del pocillo positivo con respecto al antígeno para cada
dilución de suero). La IgG producida durante la respuesta inmune
primaria se determina interpolando los valores de absorbancia
obtenidos con una dilución de suero 1:20 en una curva de calibrado.
La curva de calibrado se construye usando cantidades conocidas de un
anticuerpo monoclonal IgG anti-OVA que se procesa
simultáneamente con las muestras de suero inmune. La respuesta
inmune de IgG anti-OVA secundaria se determina a
partir de las titulaciones de punto final de la siguiente manera: la
absorbancia debida a la unión específica de antígeno se representa
como una función del logaritmo de la dilución de suero y la
titulación de punto final se estima a partir de la dilución de
suero produciendo una absorbancia de 0,25. Se obtienen titulaciones
de punto final de 3,6 o menos se obtienen con sueros de
inmunizaciones sin un adyuvante, y las titulaciones de punto final
cercanas o superiores a 5,0 con diferentes adyuvantes. Las
saponinas de Quillaja saponaria Molina dializadas a una
dosis de adyuvante de 10 \mug aumentan las titulaciones en casi
dos órdenes de magnitud en comparación con OVA en PBS. La respuesta
inmune primaria de inmunizaciones con OVA mas saponinas de Quillaja
desaciladas produce niveles de IgG inferiores a los inducidos por
OVA en PBS.
Se ensayó la adyuvancia de un conjugado, como el
preparado en el ejemplo 3, a dosis de 10, 50 y 250 \mug. El
conjugado demostró un buen efecto adyuvante dependiente de la dosis
sobre la producción de IgG anti-OVA durante la
respuesta inmune primaria y secundaria (figuras 3, 4, 5 y 6). Este
conjugado produce titulaciones de punto final que se aproximan a
las inducidas por saponina de Quillaja, es decir, de 4,70 a 5,85. A
diferencia de lo que ocurre con las saponinas de Quillaja, este
conjugado estimula preferentemente la producción de IgG1. No se
observaron efectos secundarios negativos con este conjugado en el
intervalo de dosis ensayado: de 10 a 250 \mug.
En muchas vacunas virales, y probablemente en
vacunas para el cáncer, el adyuvante usado con los antígenos
proteicos provocan una inmunidad mediada por células específica
fuerte (CMI) o una respuesta inmune de células T con producción de
linfocitos T citotóxicos (CTL). Actualmente, las saponinas de
Quillaja son los únicos adyuvantes capaces de inducir inmunidad de
células T (Newman et al., J. Immuno. 148:2357 (1992)). Los
otros adyuvantes, incluyendo muramil dipépetidos, glucanos,
moduladores inmunes tales como IL-2 y otros, sólo
son capaces de estimular una respuesta inmune humoral contra
proteínas exógenas (Cod, J.C., y Coulter, A.R., Vaccine
15:248 (1997)), que tendría poco valor en el caso de vacunas
para el cáncer y algunas vacunas virales. La desacilación de
saponinas de Quillaja tiene como resultado productos no tóxicos,
pero sin actividad adyuvante, medida por la producción de
anticuerpos (Kensil et al., Vaccines 92:35 (1992)) y
respuesta de CTL (Kensil et al., en Saponins Used in
Traditional and Modern Medicine; Kamasaki, K., Waller. G.R.,
Eds. Plenum, N.Y., in press). Debido a su estimulación de
inmunidad humoral y de células T, así como su toxicidad
insignificante, los análogos semisintéticos o conjugados de
saponina-lipófilo de la presente invención son
adecuados para la preparación de vacunas virales o para el cáncer.
La inmunidad de células T inducida por estos adyuvantes puede
ensayarse in vitro por (i) transformación de blastos, que
mide la respuesta de proliferación de células T sensibilizadas a
antígenos, o (ii) medición de la potenciación de cebado de CTL a un
antígeno proteico.
El efecto adyuvante sobre la inmunidad de células
T se mide por un ensayo de proliferación celular de acuerdo con el
siguiente protocolo. Se inmunizan ratones hembra C57BL/6 de 6 a 8
semanas de edad dos veces por vía subcutánea con la siguiente
formulación: 20 \mug de OVA (Sigma) y un adyuvante de la presente
invención o saponinas de Quillaja desaciladas (a dosis que varían de
10 a 250 \mug) o saponinas de Quillaja (a una dosis de 10 \mug)
en 200 \mul de PBS. Las dos inmunizaciones se administran a
intervalos de dos semanas. En los ratones de control se inyecta PBS
o PBS con OVA, más 200 \mug de hidróxido de aluminio. Dos semanas
después de la segunda inmunización, se retiran los bazos y se
rompen por extrusión a través de una malla de nylon. Las células se
lavan y se resuspenden en medio RPMI 1640 con suero de ternero
fetal inactivado por calor al 10%, 100 \mug/ml de estreptomicina,
100 \mug/ml de penicilina, 10 \mug/ml de gentamicina,
L-glutamina 2 mM y 2-mercaptoetanol
2 x 10^{-5} M. Se distribuyen 2 x 10^{5} células de bazo en
volúmenes de 100 \mul en pocillos de placas de microtitulación, y
se cultivan por triplicado con medio solo (para usar como efecto de
fondo), 3 \mug/ml de concavalina A, 2 \mug/ml de OVA o 10
\mug/ml de OVA. Después de 72 horas en cultivo, las células se
someten a pulsos con 1\muCi de timidina tritiada
(^{3}H-timidina, Amersham International) durante
16 horas y se recogen usando un recolector semiautomático Skatron
(Sterling, VA). La cantidad de marcador que se incorpora en el ADN
celular se determina por recuento de centelleo líquido. La
proliferación celular se expresa como la diferencia (\Delta cpm)
en la ^{3}H-timidina incorporada entre los
esplenocitos estimulados con 2 o 10 \mug de OVA in vitro.
Como se determinó a partir de la incorporación de
^{3}H-timidina en presencia de OVA, los
linfocitos T de ratones inmunizados con OVA más saponinas de
Quillaja muestran una respuesta proliferativa que es
significativamente superior a la observada con alumbre. Las células
T de ratones inmunizados con OVA y diferentes dosis de saponinas de
Quillaja desaciladas mostraron una respuesta proliferativa que era
menor que la observada con alumbre. Los linfocitos T de ratones
inmunizados con OVA más 50 o 250 \mug de conjugado de saponina
mostraron una respuesta proliferativa in vitro (\Delta
c.p.m.) que era similar o considerablemente superior a la observada
con saponinas de Quillaja (Figura 7).
Se añadió una diamina alifática con 2 a 6 átomos
de carbono al grupo carboxilo del resto de ácido glucurónico de
saponinas de gypsophila, saponaria o las saponinas de Quillaja
desaciladas usando el método de carbodiimida descrito en el ejemplo
2. La adición del grupo de biotina se consiguió uniendo un derivado
de éster activo (S-NHS) de biotina (Pierce) al grupo
amino libre del derivado de diamina alifática con 2 a 6 átomos de
carbono de la saponina.
Se incuban linfoblastos, glóbulos blancos o
células cultivadas en PBS a 37ºC con saponina biotinilada, con o
sin cianoborohidruro sódico. Después de la incubación, las células
se lavan con PBS que contiene BSA, y se recogen por centrifugación.
A las células lavadas y resuspendidas se les añade una avidina o
estreptavidina conjugada con FITC (xx mg/ml) y la mezcla se incuba
durante xx minutos a xx ºC. Las células se lavan con PBS que
contiene suero de ternero fetal al 10%, y las muestras se analizan
por microscopía de fluorescencia y por citometría de flujo. Las
células incubadas con saponina biotinilada sin cianoborohidruro se
usan para proporcionar una medición del efecto de fondo. Las
células incubadas en presencia de cianoborohidruro proporcionan una
medición de las células T con receptores de la superficie celular
CD28 que son capaces de unirse a saponinas que forman imina
(incluyendo las que están biotiniladas). Estas células son
susceptibles de coestimulación por B7.1 y de este modo de
activación.
Esquema
1
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Esquema
2
\newpage
Esquema
3
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Esquema
4
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Esquema
5
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Esquema
6
\newpage
Esquema
7
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Esquema
8
Claims (28)
1. Un conjugado de saponina
triterpénica-lipófilo, que comprende
una saponina triterpénica no acilada o desacilada
que incluye un resto de ácido 3-glucurónico; y
un resto lipófilo;
donde dicha saponina y dicho resto lipófilo están
unidos de manera covalente entre sí, directamente o a través de un
grupo enlazador, y donde dicha unión directa o unión a dicho
enlazador tiene lugar a través de un enlace covalente entre el
carbono carboxilo de dicho resto de ácido
3-glucurónico y un grupo funcional adecuado en el
resto lipófilo o grupo enlazador.
2. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 1, donde
dicha saponina triterpénica (a) tiene una estructura central de
aglicona triterpénica con cadenas de azúcar ramificadas unidas en
las posiciones 3 y 28, y un grupo aldehído enlazado o unido en la
posición 4; y (b) originalmente está sin acilar o requiere que se
retire un grupo acilo o aciloílo que está unido a un sacárido en la
posición 28 de la aglicona triterpénica.
3. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde dicha saponina triterpénica tiene un ácido
quillaico o estructura central de gipsogenina.
4. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 1, 2 o 3,
donde dicha saponina desacilada o no acilada se selecciona entre el
grupo compuesto por desacilsaponina de Quillaja,
desacilsaponina de S. jenisseensis, saponina de
Gypsophila, saponina de Saponaria, saponina de
Acanthophyllum y saponina de lucyoside P.
5. El conjugado de
saponina-lipófilo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde dicho resto lipófilo comprende uno o
más restos de un ácido graso, terpenoide, amina alifática, alcohol
alifático, derivado de mono- o poli-alquilenoxi con
2 a 4 átomos de carbono de un ácido graso, derivado de mono- o
poli-alquilenoxi con 2 a 4 átomos de carbono de un
alcohol graso, glicosil-ácido graso, glicolípido, fosfolípido,
mono- o di-acilglicerol, mercaptanos alifáticos o
fosfoglicérido.
6. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 5, donde
dicho resto lipófilo comprende los restos de uno o más ácidos grasos
con 6 a 24 átomos de carbono.
7. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 6, donde
dicho resto lipófilo es el resto de un ácido graso de 14 a 24 átomos
de carbono.
8. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 6, donde
dicho ácido graso es ácido láurico, mirístico, palmítico, esteárico,
araquídico, behénico, lignocérico, palmitoleico, oleico, linoleico,
linolénico o araquidónico.
9. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 5, donde
dichas aminas alifáticas, alcoholes alifáticos o mercaptanos
alifáticos tienen de 6 a 20 átomos de carbono.
10. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 9, donde
dicho resto lipófilo es el resto de nonilamina o dodecilamina.
11. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 5, donde
dicho resto lipófilo es el resto de retinal A o glucosamina-ácido
ricinoleico.
12. El conjugado de
saponina-lipófilo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, donde dicha saponina triterpénica no
acilada o desacilada se une directamente a dicho resto lipófilo
mediante un enlace covalente entre el resto de ácido
3-glucurónico de la saponina triterpénica y un grupo
funcional reactivo del resto lipófilo.
13. El conjugado de
saponina-lipófilo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, donde dicha saponina triterpénica no
acilada o desacilada se une a dicho resto lipófilo mediante un
enlazador bifuncional que tiene un primer grupo funcional que forma
un enlace entre el resto de ácido 3-glucurónico de
la saponina triterpénica y un segundo grupo funcional que forma un
enlace con un grupo funcional reactivo del resto lipófilo.
14. El conjugado de
saponina-lipófilo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, donde dicho grupo enlazador se selecciona
entre el grupo compuesto por
-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-,
-NH-CH(COOH)-CH_{2}-CH-,
-NH-CH_{2}-CH(COOH)-NH-,
-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-NH-,
-O-(CH_{2})_{r}-NH-,
-S-(CH_{2})_{r}-NH-,
-S-(CH_{2})_{r}-C(O)-,
-NH-CH_{}-C(O)-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-NH-NH-C(O)-CH_{2}-,
-NH-C(CH_{3})_{2}-C(O)-
y
-NH-NH-C(O)-(CH_{2})_{r}-C(O)-NH-N=,
donde r, en cada caso, es de 2-5.
15. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 1, donde
dicho conjugado se representa por la fórmula II:
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo;
donde
R^{1} es glucosa o hidrógeno; R^{2} es apiosa
o xilosa; X es S, O, NH o un grupo de unión; y R^{3} es un resto
lipófilo.
16. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 1, donde
dicho conjugado se representa por la fórmula III:
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo;
donde
X es S, O, NH o un grupo de unión; y
R^{3} es un resto lipófilo.
17. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 1, donde
dicho conjugado se representa por la fórmula IV:
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo;
donde
X es S, O, NH o un grupo de unión; y
R^{3} es un resto lipófilo.
18. El conjugado de
saponina-lipófilo de las reivindicaciones
15-17, donde X es un grupo de unión, y dicho grupo
de unión es una molécula bifuncional, o donde X es NH, O o S.
19. El conjugado de
saponina-lipófilo de cualquiera de las
reivindicaciones 15-18, donde R^{3} es un resto
lipófilo seleccionado entre el grupo compuesto por ácido graso,
terpenoide, amina alifática, alcohol alifático, mercaptano
alifático, derivado de mono- o poli-alquilenoxi con
2 a 4 átomos de carbono de un ácido graso, derivado de mono- o
poli-alquilenoxi con 2 a 4 átomos de carbono de un
alcohol graso, polietilenglicol, glicosil-ácido graso, glicolípido,
fosfolípido, monoacilglicerol y diacilglicerol.
20. El conjugado de
saponina-lipófilo de la reivindicación 18 o 19 donde
X es S, O, NH un grupo de unión seleccionado entre el grupo
compuesto por
-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-,
-NH-CH(COOH)-CH_{2}-NH-,
-NH-CH_{2}-CH(COOH)-NH-,
-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-NH-,
-O-(CH_{2})_{r}-NH-,
-S-(CH_{2})_{r}-NH-,
-S-(CH_{2})_{r}-C(O)-,
-NH-CH_{2}-C(O)-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-NH-NH-C(O)-CH_{2}-,
-NH-C(CH_{3})_{2}-C(O)-
y
-NH-NH-C(O)-(CH_{2})_{r}-C(O)-NH-N=,
donde r, en cada caso, es de 2-5.
21. Un conjugado de
saponina-lipófilo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-20 para uso en medicina.
22. Un conjugado de
saponina-lipófilo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-20 para uso como una vacuna.
23. Una composición farmacéutica, que
comprende
uno o más conjugados de
saponina-lipófilo de cualquiera de las
reivindicaciones 1-22, y
un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
24. La composición farmacéutica de la
reivindicación 23, que comprende además un antígeno.
25. Una vacuna, que comprende:
- (a)
- uno o más conjugados de saponina-lipófilo de cualquiera de las reivindicaciones 1-21;
- (b)
- una cantidad inmunológicamente eficaz de un antígeno; y
- (c)
- un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
26. El uso de un conjugado de
saponina-lipófilo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-21 en la preparación de un
medicamento para potenciar una respuesta inmune en un animal.
27. El uso de un conjugado de
saponina-lipófilo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-21 en la preparación de un
medicamento para potenciar una respuesta inmune a un antígeno en un
animal.
28. El uso de un conjugado de
saponina-lipófilo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-21 en la preparación de una
vacuna.
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