ES2230566T3 - Inhibidores de la cisteina proteasa para el tratamiento de enfermedades alergicas mediadas por la inmunoglobulina e (ige). - Google Patents
Inhibidores de la cisteina proteasa para el tratamiento de enfermedades alergicas mediadas por la inmunoglobulina e (ige).Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A COMPUESTOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ALERGICAS COMO EL ASMA JUVENIL Y EL ECCEMA. LOS COMPUESTOS PUEDEN INHIBIR LA REACCION MEDIADA POR IGE FRENTE A LOS PRINCIPALES ALERGENOS AMBIENTALES Y OCUPACIONALES. PUEDEN TENER TAMBIEN UN EFECTO PROFILACTICO CONTRA LA ENFERMEDAD ALERGICA AL IMPEDIR LA SENSIBILIZACION ALERGICA FRENTE A ANTIGENOS AMBIENTALES Y OCUPACIONALES CUANDO SE ADMINISTRA A SUJETOS DE RIESGO (P. EJ., LOS QUE TIENEN RIESGO GENETICO DE ASMA Y LOS EXPUESTOS A ALERGENOS OCUPACIONALES EN EL LUGAR DE TRABAJO). LOS COMPUESTOS DE LA INVENCION PUEDEN SER UTILES TAMBIEN PARA LA INACTIVACION O ATENUACION DE LA ALERGENICIDAD DE LOS ALERGENOS IN SITU. LA INVENCION PRESENTA COMPUESTOS Y LIGANDOS NUEVOS PER SE, LAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN LOS COMPUESTOS, LOS PROCESOS PARA PRODUCIR LOS COMPUESTOS Y LAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y LOS METODOS DE UTILIZACION DE LOS COMPUESTOS Y LAS COMPOSICIONES EN EL TRATAMIENTO O LA PROFILAXIS DE ENFERMEDADESALERGICAS MEDIADAS POR IGE Y EN LA INACTIVACION O ATENUACION DE LOS ALERGENOS IN SITU. LA INVENCION PRESENTA TAMBIEN UN SISTEMA PARA REDUCIR O DESTRUIR LA VIABILIDAD DE LOS ORGANISMOS CAUSANTES DE ALERGIAS.
Description
Inhibidores de la cisteína proteasa para el
tratamiento de enfermedades alérgicas mediadas por la
inmunoglobulina E (IgE).
La presente invención se refiere a la utilización
de compuestos para el tratamiento de enfermedades alérgicas que
incluyen asma y eccema juveniles.
Los compuestos para utilizar en la presente
invención pueden inhibir la reacción mediada por IgE a los de
alérgenos ambientales y laborales más importantes. Pueden asimismo
poseer un efecto profiláctico contra la enfermedad alérgica
mediante la prevención de la sensibilización alérgica a antígenos
ambientales y laborales cuando se administran individuos de riesgo
(p.ej., los de riesgo genético al asma, y todos los expuestos a
alérgenos laborales en el lugar de trabajo). Los compuestos para
utilizar en la presente invención pueden ser asimismo útiles para
la inactivación o atenuación de la alergenicidad de los alérgenos
in situ. La presente invención proporciona una nueva
utilización de compuestos y ligandos, composiciones farmacéuticas
que contienen los compuestos para el tratamiento o profilaxis de
enfermedades alérgicas mediadas por IgE en la inactivación o
atenuación de los alérgenos in situ. La presente invención
proporciona medios para la reducción o destrucción de la viabilidad
de los organismos que causan alergias. Además, la presente invención
proporciona un compuesto específico para utilizar en el tratamiento
o profilaxis de las enfermedades alérgicas.
La presente invención se ha hecho posible
mediante la nueva comprensión por parte del solicitante del papel
del receptor de baja afinidad para IgE (FceRII), conocido asimismo
como CD23, en las enfermedades alérgicas mediadas por IgE.
Las múltiples funciones de CD23. CD23
juega un papel importante en la regulación de las respuestas
inmunes -particularmente en la regulación de las respuestas de IgE.
CD23 es una proteína de la superficie de la célula que se extiende
desde la membrana de plasma vía un tallo que se escinde
proteolíticamente durante las respuestas inmunes. Se ha demostrado
que CD 23 se escinde por Der p I; una proteasa que es el
alérgeno más importante del ácaro del polvo doméstico, aunque las
proteasas endógenas responsables de la escisión de CD 23 no se han
identificado hasta ahora. En la forma unida a la membrana, CD23
actúa como un receptor celular para IgE y se encuentra en diversos
tipos de células que incluyen las células B, células T, plaquetas,
eosinófilos, queratinocitos y asimismo en células que presentan
antígeno (incluyendo células dendríticas foliculares) que presentan
antígenos a los linfocitos T y B. El nivel de expresión de CD23 en
la superficie de la célula determina su funcionalidad y está
regulado por citocinas, notablemente IL4.
En su forma unida a la membrana, CD23 permite que
los eosinófilos se unan a los parásitos vía el IgE específico al
antígeno. Asimismo juega un papel regulador importante sobre los B
linfocitos (que producen anticuerpos). En presencia de IgE soluble,
probablemente en forma de inmunocomplejos con el alérgeno, la CD23
de la superficie de la célula se queda ocupada por IgE, comunicando
una señal inhibidora al B-linfocito. Se cree que
esto es un bucle de retroalimentación negativo importante en la
regulación de la síntesis de IgE. La ocupación del CD23 unida a la
membrana por IgE protege CD23 de escisión proteolítica, evitando la
liberación de formas "activas de citocina" de CD23 soluble
(véase anteriormente) que favorecen la producción de IgE como
opuesto a otras clases de inmunoglobulina.
CD23 interactúa asimismo con ligandos (o
"contraestructuras") más que con IgE. Mediante asociación de
CD23 sobre una célula B activada con CD21 (el tipo receptor del
complemento dos "CR2") sobre una célula dendrítica folicular
del nódulo linfático, CD23 de la superficie de la célula funciona
como una molécula de adhesión intercelular. Esta función de CD23 se
cree que es importante en el rescate de B linfocitos de centro
germinales de "apoptosis" (es decir, muerte celular
programada), permitiendo la supervivencia del anticuerpo que produce
clones que de otra manera se habrían destinado a morir. Existe
asimismo la evidencia que CD23 se asocia con las moléculas de
superficie celular responsables de presentar péptidos antigénicos a
T linfocitos (es decir, la clase HLA-moléculas II)
y puede de este modo influenciar la presentación de antígenos a T
linfocitos. Además, la presencia y el grado de expresión de CD23 en
células de Langerhans (un tipo de célula que presenta antígeno), y
su afinidad por los inmunocomplejos que comprenden alérgeno e IgE,
determinarán asimismo hasta qué medida tales complejos se procesan
y se presentan a T linfocitos. CD23 puede por lo tanto influenciar
la presentación de antígeno a tanto B como T linfocitos,
procedimientos que determinan el grado y naturaleza de las
respuestas inmunológicas a antígenos extraños.
Escisión proteolítica de CD23. La CD23
nativa (45 kDa) se puede escindir de la superficie de la célula
mediante digestión proteolítica en distintos sitios dentro de la
región del tallo para generar CD23 soluble (sCD23). El fragmento
soluble mayor es de 37 kDa. La escisión más próxima al dominio de
lectina distal de la membrana da fragmentos solubles de 33, 29 y 25
kDa que contienen el dominio de lectina y una cola de C terminal.
Algunas formas de sCD23 (notablemente la forma 37 kDa) son activas
sobre otras células. De este modo, Ghadieri et al. y
Bonnefoy et al. han demostrado que sCD23 (37 kDa) es un
estimulador potente de la desgranulación provocada por células
mamarias en concentraciones de nanogramos por ml. Además, las formas
mayores de sCD23 poseen asimismo actividades de citocina que
favorecen la producción de anticuerpos de subclases IgE e IgG4
asociadas con respuestas alérgicas, antiparasitarias y crónicas
inmunes. De hecho, en los experimentos in vitro se ha
mostrado que en presencia de IL4 sCD23 induce a las células B
productoras de IgE a diferenciarse en células de plasma (Liu;
Gordon). El papel regulador de CD23 sobre la síntesis de IgE se ha
confirmado asimismo in vivo utilizando anticuerpos a CD23
(que inhiben las respuestas IgE específicas a antígeno), y
utilizando CD23 de ratones de genes eliminados, en los que se
exageran las respuestas IgE específicas a antígeno.
Además de estos datos a partir de experimentos en
animales se han descrito niveles elevados de sCD23 y de linfocitos
de sangre periféricos positivos en CD23 en individuos atópicos
(Gordon et al.) (Ghadieri et al.) implicando CD23
como un factor regulador importante en las inmunorespuestas de
IgE.
A partir de estas consideraciones es evidente que
CD23 posee funciones reguladoras importantes que determinan la
calidad y cantidad de una inmunorespuesta, particularmente, que
afectan a la inmunidad humoral (es decir, la producción de
anticuerpos específicos). Además, la forma física de CD23 (es
decir, celular versus soluble) posee una influencia
fundamental sobre su función reguladora, particularmente en el caso
de las respuestas de IgE de B linfocitos. De este modo, CD23 en su
forma celular participa en la inhibición de retroalimentación
negativa de la síntesis de IgE. En contraste, en sus formas
solubles CD23 estimula la producción de IgE vía sus actividades de
citocina. El equilibrio entre formas celulares y solubles de CD23
se ve por lo tanto que posee un papel pivotal en la determinación
del carácter de una inmunorespuesta, en particular si IgE se
produce contra un antígeno particular, y asimismo cuanto IgE se
produce. Sin embargo, no se ha establecido hasta ahora la naturaleza
de las proteasas que provocan la escisión de CD23 y que determina
el equilibrio entre formas unida a la membrana y soluble, aunque la
teoría actual, apoyada solo por la evidencia circunstancial,
mantiene que CD23 es autocatalítica, y provoca su propia escisión de
la membrana de plasma.
Actividad proteolítica de ciertos alérgenos
ambientales y laborales. Los estudios en ratones y en el hombre
sugieren que la potencia sensibilizadora alérgica de los alérgenos
ambientales está, en algunos casos, relacionada con su actividad
proteolítica. De este modo, la papaína (una proteasa de cisteinilo
de la papaya) es un potente alérgeno en el hombre. Asimismo, la
bromelaína inhalada (una proteasa de cisteinilo de la piña) causa
alergias y asma laboral (Gailhoffer, 1988). Asimismo, el mayor
alérgeno del ácaro del polvo doméstico (Der p I), al
que son sensitivos muchos individuos asmáticos, posee actividad
proteolítica. Las enzimas proteolíticas de antígenos y parásitos
ambientales pueden influenciar la calidad de las respuestas de T
linfocito para favorecer la producción de IgE (revisada por
Finkelmann 1992) aunque no se ha establecido como lo hacen. De este
modo, las inyecciones diarias subcutáneas de ciertas cepas de
ratones con papaya resultan en un incremento dramático en IgE no
específico que se atenúa notablemente por una inactivación previa de
la actividad catalítica de la enzima. El aumento del total de IgE
por la papaína activa se asocia con la producción de citocinas
característica del subconjunto T_{H}2 de T linfocitos
colaboradores que están implicados en respuestas alérgicas y
antiparasitarias. Sin embargo, no se ha identificado el sustrato de
este mecanismo proteolítico por medio del cual la papaína eleva la
producción de IgE.
La enseñanza actual sostiene que CD23 se escinde
a partir de la membrana de plasma mediante una actividad
autoproteolítica putativa (es decir una actividad proteolítica del
mismo CD23 en si mismo sobre CD23 como sustrato). No se ha
propuesto más candidata proteasa (endógena o exógena) que la CD23.
Además, la actividad "autoproteolítica" putativa de CD23 no se
ha demostrado nunca. Por lo tanto, sorprendentemente, se ha
encontrado ahora que la proteasa exógena y el alérgeno Der p
I, en su forma elevadamente purificada, es muy efectiva y
específica en la escisión de CD23 de la membrana de plasma de B
linfocitos de cultivo. Ya que la escisión de CD23 es una etapa
reguladora importante que gobierna la síntesis de IgE, se deduce
que la actividad sensibilizadora alérgica potente de Der p I
(es decir, su alergenicidad) reside, en parte, en su habilidad para
escindir CD23 a partir de la superficie de la célula. Aunque se ha
especulado anteriormente que la actividad proteolítica de Der
p I podría estar relacionada a su alergenicidad, no se ha
ofrecido explicación para el mecanismo del acto proteolítico
putativo, ni se ha propuesto ningún candidato anteriormente como un
sustrato de esta actividad proteolítica.
Se ha demostrado que la escisión de CD23 por
(Gordon et al) está: i) estimulada por cisteína; ii)
inhibida por el inhibidor E64 de proteasa de cisteinilo específico;
y iii) no inhibida por el inhibidor
alfa-1-antitripsina de la proteasa
de tripsina (que inhibe diversas proteasas del tipo tripsina además
de la tripsina). El compuesto E64 es
L-trans-epoxisuccinil-leucilamido(4-guanidino)butano
(Sigma, Poole, UK).
Estos descubrimientos demuestran que Der p
I es de hecho una proteasa de cisteinilo según se ha sugerido
provisionalmente mediante estudios anteriores, y además que la
actividad de la proteasa de cisteinilo del Der p I es la
responsable de la escisión de CD23.
A partir de estas consideraciones, se deduce que
los compuestos de la presente invención que no son E64, todavía
capaces (como E64) de inhibir las proteasas de cisteinilo,
evitarían asimismo la escisión de CD23 por Der p I. Esto
incluiría la secuencia de péptido que comprende los sitios de
escisión de CD23 que se escinden por Der p I, y análogos de
los mismos. Este último incluiría análogos de
D-aminoácidos, incluyendo péptidos
"D-inversos" producidos exclusivamente de
D-aminoácidos pero de la secuencia inversa del sitio
de escisión natural -según se describe recientemente en Van
Regenmortal et al para análogos activos biológicamente de
CD4.
Ahora se ha demostrado que el inhibidor de
proteasa humano alfa-1-antitripsina,
más que inhibir Der p I, es un sustrato para Der p I
que llega a escindirse en el sitio específico. Desde el 17 de julio
de 1995, este sitio se ha identificado como "QVS/SGF"
(Kalsheker N. et al 1996). Se deduce que los péptidos
análogos (según se ha descrito anteriormente para los sitios de
escisión de CD23) y los no péptidos miméticos de este sitio pueden
ser asimismo inhibidores específicos de Der p I. Tales
compuestos de la presente invención pueden por lo tanto tener
utilizaciones según se describe anteriormente para los inhibidores
de Der p I (es decir, prevención de la escisión de CD23
in vivo por Der p I). Además, ya que Der p I es
una enzima digestiva extracorpórea del ácaro del polvo doméstico,
se deduce que los inhibidores de Der p I pueden causar que
el ácaro del polvo tenga "indigestión" (es decir, privación
nutricional) debido al fallo de esta enzima. De hecho, ya que la
comida de los ácaros del polvo doméstico se comprende
principalmente de escamas de piel humana (que contienen
alfa-1-antitripsina) puede ser
necesario para el Der p I que destruya o inactive la
alfa-1-tripsina para digerir las
escamas de piel. De este modo, los inhibidores de proteasa del
cisteinilo de Der p I se predice que tengan un efecto
"tóxico" (vía privación nutricional) en los ácaros del polvo
doméstico.
Los inhibidores de Der p I pueden ser
útiles para matar los ácaros del polvo doméstico in situ,
además de la atenuación de la alergenicidad (es decir, la actividad
sensibilizante) de Der p I. Se cree que estos efectos
sinergizarían resultando en un agente antiasmático elevadamente
eficaz para su aplicación a mobiliario (camas, alfombras, etc.) que
son el hábitat natural de los ácaros del polvo doméstico.
Se ha demostrado que el fragmento escindido
principal de la forma de CD23 45 kDa nativa liberado por Der
p I es indistinguible (mediante electroforesis de SDS) a partir
del fragmento de escisión de CD23 más importante que aparece de
forma natural: es decir, el fragmento 25 kDa. Sin embargo, el
análisis de secuencia del N terminal del fragmento liberado por
Der p I demuestra que el sitio de escisión "QVS/SGF"
reconocido por Der p I es distinto del sitio de escisión
natural que genera el fragmento 25 kDa.
Se generaron asimismo cantidades más pequeñas de
formas de CD23 mayores (presumiblemente "citocina activa") por
Der p I, indicando la existencia de sitios de escisión
adicionales más próximos a la membrana en la región del tallo. Se
ha identificado un sitio de escisión adicional en la región del
tallo del C terminal como SAE/SMG.
Se entendería asimismo que los inhibidores de la
actividad de escisión de CD23 de proteasas exógenas (tales como E64
y análogos) pueden asimismo inhibir la proteasa(s) endógena
que escinde CD23, si o no estas proteasas son idénticas, en la
especificidad a las proteasas exógenas tales como Der p I,
bromelaína y ciertos otros alérgenos ambientales con actividad
proteolítica.
En un aspecto, la presente invención se refiere a
la utilización de un compuesto inhibidor de la proteasa de
cisteinilo, que inhibe la actividad proteolítica del Der p
I, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o
profilaxis de enfermedades alérgicas.
En otro aspecto, la presente invención se refiere
a la utilización de un compuesto inhibidor de la proteasa de
cisteinilo, que inhibe la actividad proteolítica de Der p I,
en la fabricación de una preparación para la atenuación o la
inactivación de la alergenicidad de Der p I a partir de las
heces de ácaro de polvo en mobiliario tal como camas, alfombras, y
aspiradores.
En un aspecto adicional de la presente invención,
el compuesto inhibidor de la proteasa de cisteinilo se utiliza en
combinación con uno o más de un vehículo, adyuvante o
excipiente.
En un aspecto adicional de la presente invención,
el compuesto inhibidor de la proteasa de cisteinilo es capaz de
inhibir la escisión proteolítica de la CD23 unida a la membrana
in vivo.
En un aspecto adicional de la presente invención,
el compuesto inhibidor de la proteasa de cisteinilo es un sustrato
para Der p I y se selecciona de entre el grupo que consiste
en: análogos de E64, peptidomiméticos y miméticos de los
mismos.
En un aspecto adicional de la presente invención,
el compuesto inhibidor de la proteasa de cisteinilo se selecciona
de entre el grupo que consiste en: secuencias de péptidos y
análogos miméticos de los mismos que comprenden
sitio(s) de escisión que es/son capaz de ser escindido por Der p I.
sitio(s) de escisión que es/son capaz de ser escindido por Der p I.
En un aspecto adicional de la presente invención,
el compuesto inhibidor de la proteasa de cisteinilo es de la
fórmula general:
en la que X, Y y Z son N o
CH;
R1 es un grupo bloqueador para el nitrógeno N
terminal;
R2, R3 y R4 son cadenas laterales sobre X, Y y Z;
y
W es un grupo que reacciona irreversiblemente con
un tiol de cisteína activo de Der p I.
En un aspecto adicional de la presente invención,
X, Y y Z según se dan en la fórmula general anterior son CH y la
estereoquímica es exclusivamente de la configuración "S".
En un aspecto adicional de la presente invención,
X, Y y Z según se dan en la fórmula general anterior son nitrógeno
y I es un peptidomimético, un "azapéptido".
En un aspecto adicional de la presente invención,
R1 según se da en la fórmula general anterior representa un arilo
hidrofóbico opcionalmente sustituido seleccionado de entre el grupo
que comprende fenilo, naftilo o 2-naftilo o
9-antracilo no sustituidos; o un grupo heteroarilo
unido opcionalmente a través de un heteroátomo (O, S, N, P) al
carbonilo y cuando se une a través de N o P el heteroátomo puede
ser mono o diarilo o mono o diheteroarilo sustituido o en el que R1
representa un grupo alifático hidrofóbico de 3 carbonos o más,
lineales o ramificados unidos opcionalmente a través de un
heteroátomo (O, S, N, P) al carbonilo y cuando se unen a través de
N o P, el heteroátomo puede ser mono o disustituido.
En un aspecto adicional de la presente invención,
el fenilo opcionalmente sustituido es fenilo no sustituido o fenilo
que posee de 1 a 5 fluorosustituyentes o fenilo que posee de 1 a 3
sustituyentes en el que los sustituyentes se seleccionan
independientemente de entre el grupo que comprende alquilo
inferior, alcoxi inferior, nitro, halo, acetilo, benzoilo,
hidroxilo, amino, metilamino, -COOH, -CONH2, -COOR2 y NHCOR2 en el
que R2 es alquilo inferior.
En un aspecto adicional de la presente invención,
R1 según se da en la fórmula general anterior representa una cadena
alifática lineal o ramificada que es pivolilo,
n-butilo y variantes de los mismos hasta C8, fenilo,
radical difenilamino, 9-xantenilo, piperonilo,
radical fenilamino, terc-butoxi,
CF3-fenilo, un fenilo mono o disustituido, radical
difenilamino o 9-xantenilo en el que los
sustituyentes son un alquilo inferior, C1-3, alcoxi
inferior C1-3, fenilo mono 2 ó 3 amino o carboxi
sustituido.
En un aspecto adicional de la presente invención,
R2 según se da en la fórmula general anterior representa una cadena
lateral hidrofóbica lineal o ramificada que es alquilo, metilo
(Ala), ciclohexilmetilo; 2-metilpropilo, es decir
Leu; n-butilo, es decir Norleucina;
1-metiletilo, es decir Val;
1-metilpropilo, es decir Ile;
3-metilbutilo, es decir homoleucina; etilo, es decir
Abu; o la cadena hidrofóbica contiene un heteroátomo tal como N, O,
P, S y es 2-metiltioetilo (metionina),
4-aminobutilo, es decir Lys; o
etil-2-carboamida, es decir Gln; o
su cadena hidrofóbica es un radical fenilmetilo que contiene
opcionalmente un átomo de nitrógeno o está sustituido en el anillo
de fenilo con -OH, alcoxi, fenilo, o alquilo en el
C1-3.
En un aspecto adicional de la presente invención,
R2 según se da en la fórmula general anterior representa
bifenilmetilo, 1-metiletilo, es decir valina;
metilo, es decir alanina; o ciclohexilmetilo, es decir
ciclohexilalanina.
En un aspecto adicional de la presente invención,
R3 según se da en la fórmula general anterior representa un grupo
alquilo C1 opcionalmente sustituido con un heteroátomo, O, o f; o
R3 puede ser 4-aminobutilo, es decir Lys;
etil-2-carboxamida, es decir Gln; o
2-(metiltiooxi)etilo, es decir Met(O).
En un aspecto adicional de la presente invención,
R3 según se da en la fórmula general anterior representa metilo, es
decir, alanina.
En un aspecto adicional de la presente invención,
R4 según se da en la fórmula general anterior representa una cadena
lateral hidrofóbica lineal o ramificada cuyo alquilo, metilo (Ala);
ciclohexilmetilo; 2-metilpropilo, es decir Leu;
n-butilo, es decir Norleucina;
1-metiletilo, es decir Val;
1-metilpropilo, es decir Ile;
3-metilbutilo, es decir homoleucina; etilo, es decir
Abu; o su cadena hidrofóbica puede contener un heteroátomo tal como
N, O, P, S y es 2-metiltioetilo (metionina),
4-aminobutilo, es decir Lys; o
etil-2-carboamida, es decir Gln; o
la cadena hidrofóbica es un radical fenilmetilo que contiene
opcionalmente un átomo de nitrógeno o se puede sustituir en el
anillo de fenilo con -OH, alcoxi, fenilo, o alquilo en
C1-3; o la cadena hidrofóbica es
2-hidroxietilo, es decir Thr; o
2-fluoroetilo.
En un aspecto adicional de la presente invención,
R4 según se da en la fórmula general anterior representa
3-metilbutilo, es decir homoleu; ciclohexilmetilo,
es decir cha; 2-metilpropilo, es decir leucina; o
n-butilo, es decir norleucina.
En un aspecto adicional de la presente invención,
W según se da en la fórmula general anterior se selecciona de entre
el grupo que comprende:
\newpage
i)
ii)
iii)
iv)
v)
y E, según se da en las fórmulas
anteriores, se selecciona de entre el grupo que
comprende:
i) OAr o
SAr
ii)
iii)
heteroarilo
iv)
halógeno
v)
O ---
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}} ---
R
\newpage
vi)
O ---
\melm{\delm{\para}{R}}{P}{\uelm{\dpara}{O}} ---
R
vii)
O ---
\melm{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}{P}{\uelm{\dpara}{O}}
--- O ---
R
R, según se da en las fórmulas anteriores, se
selecciona de entre el grupo que comprende alquil o Ar;
Ar se selecciona de entre el grupo que comprende
arilo de heteroarilo opcionalmente sustituido;
e Y se selecciona de entre el grupo que comprende
ésteres, sulfonas, carboxilato, amidas, fosfonatos, cetonas,
sulfonatos, nitrilos, sulfonamidas y compuestos nitro.
En un aspecto adicional de la presente invención,
las enfermedades alérgicas incluyen asma o eccema juveniles.
En un aspecto adicional de la presente invención,
las enfermedades alérgicas incluyen asma o eccema.
En un aspecto adicional de la presente invención,
el compuesto inhibidor de la proteasa de cisteinilo se selecciona
de entre el grupo que consiste en:
Compuesto 3:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-bis(trifluorometil)benzoiloximetilcetona
Compuesto 4:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-dimetilbenzoiloximetilcetona
Compuesto 6:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-diclorobenzoiloximetilcetona
Compuesto 7:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucinabenzoiloximetilcetona
Compuesto 8:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,3,4,5,6-pentafluorobenzoiloximetilcetona
Compuesto 9:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-1,1-dimetilpropiloximetilcetona
Compuesto 10:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-N-(benziloxicarbonil)-D-serinil-(O-terc-butil)oximetilcetona
Compuesto 11:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-N-(benziloxicarbonil)-D-seriniloximetilcetona
Compuesto 12:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2-furanoximetilcetona
Compuesto 13:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-diclorofenilaciloximetilcetona
Compuesto 15:
N-(benzoilamino-L-valil-L-alanil-L-norleucil)-O-benzoilhidroxamato
Compuesto 16:
N-(N-benzoilamino-L-valil-L-alanil-L-norleucil)-O-2,6-dimetilbenzoilhidroxamato
Compuesto 23:
etil-(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 25:
1,1,1-trifluoroetil-(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-
enoato
enoato
Compuesto 26:
etil-(S)-(E)-3-((N-benzoil-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 27:
etil-(S)-(E)-3-((2-trifluorometil-N-benzoil-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 28:
etil-(S)-(E)-3-((piperoniloílamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 29:
etil-(S)-(E)-3-((fenilcarbamoílamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 30:
etil-(S)-(E)-3-((difenilcarbamoílamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 34:
etil-(S)-(E)-3-((xanten-9-oílamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 36:
(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilamino-L-valil)-L-alanil)amino-1-fenilsulfonil-5-metil-1-hexeno
Compuesto 38:
(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilamino-L-valil)-L-alanil)amino-1-metilsulfonil-5-metil-1-hexeno
Compuesto 40:
etil-(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilamino-L-valil)-L-alanil)amino-5-metilhexenilsulfonato
En un aspecto adicional de la presente invención
el compuesto inhibidor de la proteasa de cisteinilo es:
Compuesto 3:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-bis(trifluorometil)benzoiloximetilcetona.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona el compuesto nuevo
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-bis((trifluorometil)benzoiloximetilcetona.
En un aspecto adicional de la presente invención,
se proporciona
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-bis((trifluorometil)benzoiloximetilcetona
como adecuado para utilizar según cualquiera de las utilizaciones
anteriores.
Por lo tanto, en resumen, la presente invención
se basa en la apreciación que el alérgeno más importante de las
heces de ácaro de polvo doméstico (Der p I), es capaz de
escindir CD23 (el receptor de baja afinidad para IgE) de la
superficie de la célula de los B-linfocitos y
presumiblemente de otros tipos de células. Se demuestra que esta
actividad se estimula por la cisteína y se puede suprimir por el
inhibidor de la proteasa de cisteinilo bien conocido E64.
La presente invención se refiere particularmente
a la utilización de compuestos capaces de inhibir la escisión
proteolítica de CD23 a partir de la membrana de plasma de células
mediante proteasas exógenas (tales como Der p I), bromelaína
y ciertas proteasas y parásitos) y la utilización de compuestos
capaces de inhibir proteasas endógenas que escinden CD23 de la
célula.
Los compuestos pueden asimismo poseer un efecto
profiláctico contra la enfermedad alérgica -evitando la
sensibilización alérgica a los antígenos ambientales y laborales
cuando se administra a individuos de riesgo (es decir, los de
riesgo genético al asma, y los expuestos a los alérgenos
laborales).
Los compuestos se pueden asimismo utilizar para
la inactivación de la actividad proteolítica de los alérgenos
ambientales in situ (p. ej., alérgeno Der p I de las
heces de ácaro de polvo doméstico en camas, alfombras y
aspiradores). La inactivación de la actividad proteolítica de estos
alérgenos puede atenuar su alergenicidad (es decir, su capacidad
para provocar alergias y asma) que es debida a su capacidad para
escindir CD23 de la superficie de la célula.
Los compuestos pueden asimismo matar ácaros de
polvo doméstico mediante la privación nutricional.
La presente invención se describirá ahora por
medio de ejemplos no limitativos solo, con referencia a las figuras
1 a 8 en las que:
la figura 1 muestra la expresión de CD23 por
células B humanas 8866 RPMI utilizando el anticuerpo
anti-CD23 monoclonal de ratón marcado FITC;
la figura 2 muestra que el efecto proteolítico de
Der p I es específico para CD23;
la figura 3 muestra que Der p I escinde
preferentemente CD23 próximo al dominio de lectina;
la figura 4 muestra el farmacoforo de la proteasa
de cisteinilo de Der p I;
la figura 5 muestra las restricciones de
distancia del farmacoforo de la figura 4; y
la figura 6 muestra las restricciones del ángulo
del farmacoforo de la figura 4.
La figura 7 muestra el farmacoforo e ilustra como
el compuesto 8 encaja en el farmacoforo.
La figura 8 muestra el farmacoforo e ilustra como
el compuesto 40 encaja en el farmacoforo.
La figura 9 muestra el farmacoforo e ilustra como
el compuesto 25 encaja en el farmacoforo.
La figura 10 muestra las restricciones de
distancia y de ángulo entre los puntos
1-4-5 del farmacoforo de la figura
4.
La figura 11 muestra las restricciones de
distancia y de ángulo entre los puntos
1-2-4 del farmacoforo de la figura
4.
La figura 12 muestra las restricciones de
distancia y de ángulo entre los puntos
1-2-5 del farmacoforo de la figura
4.
La figura 13 muestra las restricciones de
distancia y de ángulo entre los puntos
1-2-3 del farmacoforo de la figura
4.
La figura 14 muestra las restricciones de
distancia y de ángulo entre los puntos
2-3-5 del farmacoforo de la figura
4.
La figura 15 muestra las restricciones de
distancia y de ángulo entre los puntos
2-4-5 del farmacoforo de la figura
4.
La figura 16 muestra las restricciones de
distancia y de ángulo entre los puntos
1-3-5 del farmacoforo de la figura
4.
La figura 17 muestra las restricciones de
distancia y de ángulo entre los puntos
2-3-4 del farmacoforo de la figura
4.
La figura 18 muestra las restricciones de
distancia y de ángulo entre los puntos
1-3-4 del farmacoforo de la figura
4.
La figura 19 muestra las restricciones de
distancia y de ángulo entre los puntos
3-4-6 del farmacoforo de la figura
4.
En la presente memoria se demuestra que Der
p I, el alérgeno más importante del ácaro de polvo doméstico
(Dermatophagoides pteronyssinus) escinde CD23 de la
superficie de células B humanas cultivadas (línea celular B 8866
RPMI). La escisión del receptor de la superficie de la célula B se
asoció con un incremento paralelo en sCD23 en el sobrenadante de
cultivo. Los experimentos de anticuerpo marcados y los ensayos de
inhibición de la proteasa demuestran claramente que el Der p
I es un proteasa de cisteína que escinde directamente un fragmento
25K de CD23. El efecto proteolítico de Der p I tiene una
especificidad para CD23, ya que no se afectaron ninguno de los otros
marcadores de células B probados (CD20, HLA-DR,
CD71 y CD49d). Estos datos sugieren que el Der p I provoca
respuestas de anticuerpo IgE en el 80% de los pacientes que sufren
de alergia al ácaro de polvo, mediante su habilidad para la
liberación proteolítica de sCD23, y sobrerregula de este modo la
síntesis de IgE.
Se ha purificado la afinidad de Der p I
del extracto de ácaro de polvo y se ha examinado su habilidad para
escindir proteolíticamente CD23 expresado en células B 8866 RPMI de
cultivo, utilizando CD23 (Bu38) antihumano monoclonal marcado FITC.
Los datos muestran que, en presencia de cisteína (5 mM), Der
p I escinde CD23 de la membrana de una forma dependiente de la
dosis, de ese modo se libera el sCD23 en el sobrenadante de cultivo
(Figs. 1a y 1b). La actividad proteolítica de Der p I se
inhibió por E64 (un inhibidor de la proteasa de cisteína), pero no
por alfa-1-antitripsina (un
inhibidor de la proteasa de serina), confirmando de ese modo la
naturaleza de la proteasa de cisteína de Der p I (Fig. 1c).
Se ha demostrado de hecho que el Der p I escinde
completamente la alfa-1-antitripsina
(proporción molar 1:10) para obtener un modelo de degradación (Fig.
1d) similar al generado por la papaína, una proteasa de cisteína
bien caracterizada. Sigue una descripción más detallada de la figura
1.
Se analizaron las células en un FACscan (Becton
Dickinson, Oxford, UK) con una fluorescencia lineal establecida a
660 voltios. Se utilizó para monitorizar las células el perfil de
fluorescencia (FL1) versus la dispersión directa (FSC), se
alteró la escala de amplificación según el nivel de fluorescencia.
Para cada muestra se recogieron 4000 resultados y se analizaron a
continuación utilizando el programa flowMATE (DAKO, High Wycombe,
UK). Los datos presentados son representativos de 3 experimentos
replicados, cada punto en a a c representa la media de las
determinaciones duplicadas. Fig. 1(a). Dependencia de la
dosis y de la cisteína de la escisión de CD23 por Der p I
(por el procedimiento de purificación véase Fig. 1(d) a
continuación). El Der p I se incubó previamente (15 min. a
37ºC) con o sin cisteína 5 mM y se añadió a 2-3 x
10^{5} células 8866 RPMI en un volumen total de 200 ml de 1640
RPMI + HEPES 10 mM. Se incubó la mezcla a continuación (1h a 37ºC)
y las células, recogidas por centrifugación, se lavaron con 1640
RPMI + HEPES 10 mM y se incubaron (30 min. a temperatura ambiente)
con anticuerpo monoclonal anti-CD23 conjugado FITC
(Bu38, The Binding Site, Birmingham, UK). Fig. 1(b). La
escisión de CD23 de la membrana se asoció con una liberación
paralela dependiente de la dosis de sCD23 en el sobrenadante de
cultivo. El sobrenadante se recogió de las células de cultivo 8866
RPMI tratadas con Der p I (según se ha descrito
anteriormente) y se diluyó 1/5 para la determinación de sCD23 por
ELISA (círculos abiertos) (The Binding Site, Birmingham, UK). En
esta ELISA no hubo reactividad cruzada entre Der p I y sCD23.
Fig. 1(c). El inhibidor específico de la clase de proteasas
de cisteína evita la escisión de CD23 de la membrana por Der
p I. E64
[L-trans-epoxisuccinil-leucilamido-(4-guanidino)butano]
(Sigma, Poole, UK) que inhibe completamente la escisión de CD23 por
Der p I mientras que no se podía demostrar dicho efecto de
inhibición con alfa-1-antitripsina,
un inhibidor de la proteasa de serina humana de aparición natural.
Cien ml de 5 g/ml de Der p l se incubó previamente (30
minutos a 37ºC) con 10 ml de E64 o de
alfa-1-antitripsina y se añadió a
continuación a las células 8866 RPMI (como se ha descrito
anteriormente). Las flechas indican el nivel de la expresión de CD23
en ausencia (flecha superior) y presencia (flecha inferior) de
Der p I. Fig. 1(d). El análisis de tinción con plata
SDS-PAGE (gel al 12%) de la preparación de Der
p l, la antitripsina alfa-1 humana y el efecto
de Der p l en la antitripsina alfa-1. Der
p l se purificó mediante cromatografía de afinidad utilizando
el anticuerpo anti-Der p I (4C1, Indoor Biotechnologies,
Clwyd, UK). La pureza de la preparación se confirmó por la
secuenciación de N terminal llevada a cabo sobre un secuenciador de
aminoácido automático (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
La secuencia obtenida
(Thr-Asn-Ala-Cys-Ser-Ile-Asn-Gly-Asn-Ala,
o TNACSINGNA SEC id nº.1) encaja con la secuencia publicada de
Der p I. La actividad de la preparación de la
alfa-1-antitripsina se determinó
mediante la valoración de sitio activo contra la quimotripsina (Dr.
David Lomas, comunicación personal). El gel muestra bandas únicas
para Der p I (carril 1) y
alfa-1-antitripsina (carril 2). La
incubación (2 h a 37ºC) de Der p I (0,25 mg) con
alfa-1-antitripsina (5 mg), en un
volumen total de 10 ml, resulta en la escisión de un gran fragmento
(flecha) de alfa-1-antitripsina
(carril 3). Este modelo está en concordancia con el generado por la
papaína. Los estándares de masa se indican en la izquierda.
Para investigar la especificidad enzimática de
Der p I para CD23, se monitorizó la expresión de otros
marcadores de células B siguiendo el tratamiento con 2,5 mg/ml
(concentración final) de Der p I. A esta concentración de
Der p I, que ha mostrado que proporciona una escisión máxima
de CD23 (Fig. 1a), no hubo pérdida significativa de expresiones de
CD20, HLA-DR, CD71 y CD49d. (Fig. 2). Sigue una
descripción más detallada de la figura 2.
Se trataron las células 8866 RPMI con 100 ml de 5
mg/ml de Der p I y la expresión del CD23 de la membrana se
monitorizó en paralelo con otros marcadores de superficie de
células B (CD20, HLA-DR, CD71 y CD49d). Estos
marcadores se detectaron utilizando anticuerpos
anti-CD20 (L27),
anti-HLA-DR (L243) (Becton
Dickinson, Oxford, UK), anti-CD71
(Ber-T9) (Dako, Buckinghamshire, UK) y
anti-CD49d (HP2,1) (Immunotech, Westbrook, ME,
Estados Unidos) respectivamente. Los resultados emparejados
representan la expresión de marcadores en ausencia (barras
abiertas) y en presencia (barras sólidas) de Der p I. Los
datos presentados son representativos de 3 experimentos replicados,
cada punto representa la media de determinaciones duplicadas.
Para adquirir una perspectiva en cuanto al sitio
de escisión de Der p I en CD23, se monitorizó el
procedimiento de escisión proteolítica utilizando anticuerpos
anti-CD23 monoclonales Bu3B y EBVCSI, que se dirigen
contra el dominio de lectina y la región del tallo respectivamente.
De este modo, Bu38 detecta todos los fragmentos inferiores a 25
kDa, mientras que EBVCSI reconoce solo fragmentos mayores de 25 kDa
(J. Gordon, comunicación personal). Los resultados muestran que
Der p I escinde CD23 en el sitio próximo al dominio de
lectina, ya que el anticuerpo EBVCS1 era todavía capaz de unirse a
la porción unida a la membrana residual del receptor (Fig. 3). Sin
embargo, a la concentración de Der p I mayor de 1 mg/ml
pareció asimismo que había alguna escisión de los fragmentos de
CD23 mayores de 25 kDa. Ya que la concentración más elevada de
Der p I (2,5 g/ml) resultó en una pérdida completa de la
unión de Bu38 y solo una pérdida parcial de la unión EBVCS1, el
sitio preferido de la escisión inicial de CD23 por Der p I
parece estar próximo al dominio de lectina. Sigue una descripción
más detallada de la figura 3.
Se trataron las células 8866 RPMI con Der
p I, según se ha descrito anteriormente, y se monitorizó la
expresión de CD23 de la membrana utilizando dos anticuerpos
anti-CD23 monoclonales: Bu38 (reconoce el dominio de
lectina) y EBVCS1 (reconoce la región del tallo entre fragmentos de
25 kDa). De este modo, Bu38 reconoce la molécula intacta y todos
los fragmentos solubles, mientras que EBVCS1 reconoce la molécula
intacta y la porción unida a la membrana residual después de la
escisión de fragmentos 25 kDa (sCD23) (J.Gordon, comunicación
personal). El experimento demuestra que Der p I, en las
concentraciones de hasta 1 mg/ml, libera preferentemente un
fragmento de 25 kDa de CD23. Los datos representados son
representativos de 3 experimentos replicados, cada punto representa
la media de determinaciones duplicadas.
El sitio de escisión preferido de CD23 que
proporciona aumento al fragmento de 25 kDa se ha identificado según
se detalla anteriormente.
CD23 soluble es una de las señales conocidas para
inducir que células B que producen IgE se conviertan en células de
plasma que se requieren para la producción de IgE. Por lo tanto la
naturaleza de las proteasas que escinden CD23 in vivo es de
considerable interés. Aunque se ha sugerido que CD23 posee
actividad proteolítica, no se era consciente de que las proteasas
escinden el CD23 de la membrana. Se ha demostrado que Der p
I, una proteasa de cisteína exógena, satisface esta función. El
Der p I provoca las respuestas del anticuerpo IgE en el 80%
de los pacientes que sufren de alergia al ácaro de polvo, y existe
evidencia in vivo que tales pacientes poseen niveles de
circulación elevados de sCD23. Este alérgeno onmipresente inhalado
es de forma clara elevadamente inmunogénico, y se cree que su
inmunogenicidad puede ser debida en parte a su actividad
enzimática. De hecho, se ha demostrado que la alergenicidad de la
papaína, una proteasa de cisteína que muestra la homología de la
secuencia con Der p I, está altamente relacionada con su
actividad enzimática.
La demostración de que Der p I escinde
proteolíticamente el CD23 de la membrana plantea la cuestión del
papel de IgE en los procedimientos alérgicos. En primer lugar, IgE
específico a Der p I podría dirigir Der p I a los B
linfocitos y otras células que soportan CD23 (p.ej., eosinófilos),
ayudando de este modo a construir una concentración elevada de este
alérgeno en la superficie de la célula. En segundo lugar, la unión
de IgE a CD23 puede proteger al receptor del ataque proteolítico
por Der p I.
Se disolvió extracto de ácaro crudo (-100 mg,
SmithKline-Beecham) en 5 ml de salino regulador de
fosfato (PBS; 50 mM de fosfato de potasio; pH 7,4 que contiene 150
mM de NaCl). Se purificó Der p I mediante cromatografía de
columna de afinidad utilizando anticuerpo 4C1 (Indoor Biotechnology,
Deeside, UK) inmovilizado sobre Sepharose 4B activada CNBr
(Pharmacia, Milton Keynes, UK). Se mezcló la preparación del crudo
con -2 ml de resina de afinidad durante 2 h a 4ºC y a continuación
se lavó con 2-3 volúmenes de PBS. Se llevó a cabo la
elución de la proteína unida utilizando glicina 5 mM que contenía
50% (v/v) de etilenglicol. Se recogieron las fracciones
(1-2 ml) y se neutralizaron con 0,8 ml de regulador
de fosfato de sodio 0,2M, pH 7,0. Las fracciones se juntaron y se
dializaron toda la noche contra 4 L de PBS seguido por una segunda
diálisis contra 2L de PBS durante 2-3 h. Se
concentró la proteína total según se requería mediante
ultrafiltración (MacroSep; Flowgen, UK).
Esta proteína obtenida de pureza superior a 95%
según se consideró mediante la electroforesis de gel de
poliacrilamida desnaturalizadora en presencia de dodecilsulfato de
sodio, cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa C4
(RP-HPLC) y cromatografía de exclusión de tamaño de
alta presión (HP-SEC) y no se pudo detectar otra
actividad de proteasa contaminante.
Utilizando el Der p I purificado, se
encontró sorprendentemente que se podían haber producido los
inhibidores a la enzima. Estos inhibidores son de la fórmula
general:
en la que X, Y y Z pueden ser N o
CH.
R_{1} es un grupo bloqueador para el nitrógeno
N terminal del aminoácido (T.Greene. Protective Groups in Organic
Synthesis).
R_{2}, R_{3} y R_{4} son cadenas laterales
sobre X, Y y Z.
W es un grupo que reacciona irreversiblemente con
un tiol de cisteína activa del Der p I.
Donde X e Y son CH, la estereoquímica es
exclusivamente la configuración "S", proporcionando residuos de
L-alfa-aminoácidos. Donde Z es CH,
la configuración puede ser "R" o "S" dependiendo de W,
pero el centro quiral se deriva estereoespecíficamente con
retención de la configuración del precursor del
L-alfa-aminoácido. Donde X, Y o Z
son nitrógeno, el residuo es peptidomimético, un
"azapéptido".
Preferentemente, R_{1} representa un grupo
arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido unido a través de un
heteroátomo (O, S, N, P) al carbonilo. Cuando se une a través de N
o P, el heteroátomo puede ser mono o diarilo o mono o diheteroarilo
sustituido.
Alternativamente, R_{1} representa un grupo
alifático hidrofóbico de 3 carbonos o más, opcionalmente lineal o
ramificado unido a través de un heteroátomo (O, S, N, P) al
carbonilo. Cuando se une a través de N o P, el heteroátomo puede
ser mono o disustituido.
Estos compuestos pueden ser asimismo arilo
opcionalmente sustituido, por ejemplo fenilo opcionalmente
sustituido, naftilo o 2-naftilo o
9-antracilo no sustituidos. Además, el fenilo
opcionalmente sustituido puede ser fenilo no sustituido o fenilo
que posee de 1 a 5 fluorosustituyentes o fenilo que posee de 1 a 3
sustituyentes donde los sustituyentes se seleccionan
independientemente de entre el grupo que comprende alquilo
inferior, alcoxi inferior, nitro, halo, acetilo, benzoilo,
hidroxilo, amino, metilamino, -COOH, -CONH_{2}, -COOR^{2} y
NHCOR^{2} en los que R^{2} es un alquilo inferior.
1-naftilo opcionalmente
sustituido incluye 1-naftilo no sustituido y
1-naftilo sustituido en la posición 2 con alquilo
inferior, alcoxi inferior o trifluorometilo.
Los heteroarilos sustituidos opcionalmente
incluyen un grupo aromático de 5 ó 6 miembros, opcionalmente
sustituido, que contiene de 1 a 4 heteroátomos elegidos de entre O,
S, N, un grupo 1 ó 2-naftilo o
9-antracilo que puede contener de 1 a 4
heteroátomos elegidos de entre O, S y N.
Más preferentemente R_{1} representa un radical
fenilo o difenilamino, 9-xantenilo, piperonilo,
radical fenilamino, terc-butoxi,
CF_{3}-fenilo, un fenilo mono o disustituido
donde el sustituyente es un alquilo inferior C1-3,
alcoxi inferior C1-3, fenilo mono 2 ó 3 amino o
carboxi sustituido. Estos criterios se aplicarán asimismo para el
radical difenilamino y 9-xantenilo. Además,
alifáticos de cadena lineal o ramificada tales como pivolilo,
n-butilo y variantes de los mismos hasta C8.
Preferentemente R_{2} representa una cadena
lateral hidrofóbica según se ha encontrado unida al C alfa de los
aminoácidos disponibles comercialmente. Hidrofóbico se refiere a un
alquilo de cadena lineal o ramificada (Metilo tal como Ala);
ciclohexilmetilo; 2-metilpropilo, es decir Leu;
n-butilo, es decir Norleucina;
1-metiletilo, es decir Val;
1-metilpropilo, es decir Ile;
3-metilbutilo, es decir homoleucina; etilo, es decir
Abu.
Alternativamente, la cadena hidrofóbica puede
contener un heteroátomo tal como N, O, S tal como
2-metiltioetilo (metionina),
4-aminobutilo, es decir Lys; o
etil-2-carboamida, es decir Gln.
Alternativamente, la cadena hidrofóbica puede ser
un radical fenilmetilo que contiene opcionalmente un átomo de
nitrógeno o puede estar sustituida en el anillo fenilo con -OH,
alcoxi, fenilo, o alquilo en el C1-3.
Más preferentemente R_{2} representa
bifenilmetilo, 1-metiletilo, es decir valina;
metilo, es decir alanina; o ciclohexilmetilo, es decir
ciclohexilalanina.
Preferentemente R_{3} representa un grupo
alquilo C1 opcionalmente sustituido con un heteroátomo, O o F.
Alternativamente, R_{3} puede ser 4-aminobutilo es
decir Lys; etil-2-carboxamida, es
decir Gln; 2-(metiltiooxi)etilo, es decir Met(O).
Más preferentemente, R_{3} representa metilo,
es decir alanina.
Preferentemente, R_{4} representa una cadena
lateral hidrofóbica definida y con residuos según se ha descrito
para R_{2}. Además, 2-hidroxietilo, es decir Thr;
o 2-fluoroetilo.
Más preferentemente, R_{4} representa
3-metilbutilo, es decir homoleu; ciclohexilmetilo,
es decir cha; 2-metilpropilo, es decir leucina; o
n-butilo, es decir norleucina.
Preferentemente W se selecciona de entre el grupo
que comprende:
i)
ii)
iii)
iv)
\newpage
v)
Preferentemente E se selecciona de entre el grupo
que comprende:
i) OAr o
SAr
ii)
iii)
heteroarilo
iv)
halógeno
v)
O ---
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}} ---
R
vi)
O ---
\melm{\delm{\para}{R}}{P}{\uelm{\dpara}{O}} ---
R
vii)
O ---
\melm{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}{P}{\uelm{\dpara}{O}}
--- O ---
R
Preferentemente R se selecciona de entre el grupo
que comprende alquilo y Ar.
Preferentemente Ar se selecciona de entre el
grupo que comprende arilo de heteroarilo opcionalmente
sustituido.
Preferentemente Y se selecciona de entre el grupo
que comprende éteres, sulfonas, carboxilatos, amidas, fosfonatos,
cetonas, sulfonatos, nitrilos, sulfonamidas y compuestos nitro.
Arilo opcionalmente sustituido es preferentemente
fenilo, bencilo o naftilo sustituidos opcionalmente. Fenilo
opcionalmente sustituido es preferentemente fenilo no sustituido o
fenilo que posee de 1 a 5 fluorosustituyentes o fenilo que posee de
1 a 3 sustituyentes en el que los sustituyentes se seleccionan
independientemente de entre el grupo que comprende alquilo inferior,
alcoxi inferior, nitro, halo, acetilo, benzoilo, hidroxi, amino,
metilamino, dimetilamino, dietilamino, metiltio, ciano,
trifluorometilo, fenilsulfonamidocarbonilo
(-CONHSO_{2}C_{6}H_{5}), -COOH, -CONH_{2}, -COOR_{2},
NHCOR_{2} en los que R_{2} es alquilo inferior y
2,3,5,6-tetrametil-4-carbaxi-fenil
(-C_{6}H_{5}(CH_{3})_{4}-COOH).
1-naftilo opcionalmente
sustituido incluye 1-naftilo no sustituido y
1-naftilo sustituido en la posición 2 con alquilo
inferior, alcoxi inferior o trifluorometilo.
Halógeno es preferentemente bromo, cloro o
flúor.
Alquilo es preferentemente un radical de
hidrocarburo alifático saturado, lineal o ramificado, que posee el
número de átomos de carbono especificado, o si no se ha
especificado número, posee hasta 8 átomos de carbono. El prefijo
"alq-"es asimismo indicativo de un radical que posee hasta 8
átomos de carbono en la porción de alquilo de ese radical, a menos
que se especifique lo contrario. Ejemplos de radicales alquilo
incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,
n-butilo, terc-butilo,
n-pentilo, n-hexilo y similares. Los
términos "alquilo inferior" y "alquilo de 1 a 4 átomos de
carbono" son, dentro del contexto de esta especificación,
sinónimos y se utilizan de manera indistinta.
Opcional u opcionalmente indica que el suceso o
circunstancia descrito posteriormente puede o no puede ocurrir, y
que la descripción incluye ejemplos en los que dicho suceso o
circunstancia ocurre y ejemplos en los que no. Por ejemplo,
"fenilo opcionalmente sustituido" significa que el radical
fenilo puede o no puede ser sustituido y que la descripción incluye
tanto radicales de fenilo no sustituidos como radicales de fenilo
en los que existe sustitución.
Estos inhibidores se ejemplificaron mediante los
ejemplos siguientes que se produjeron según se detalla.
Los inhibidores potenciales de Der p I se
sintetizaron según los procedimientos generales descritos a
continuación. Posterior a la síntesis se sometieron los compuestos
a electrospray o espectrometría de masas (MS)
MRLDI-TOF y se indican los resultados.
Compuesto
1
Se esponjó en diclorometano (40 ml) la resina
2-clorotritilcloruro (4,9 g, 1,05 mmol/g,
Novabiochem) y se añadió una suspensión de
Fmoc-L-norleucina y se agitó
durante 5 minutos. Se añadió durante 5 minutos una solución de
diisopropiletilamina en DCM (10 ml, 57 mmol en 30 ml) y la mezcla
que resultó se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se
añadió metanol (5 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante 10
minutos adicionales antes de que se filtrase y lavase la resina con
3 x DCM, 2 x DMF, 2 x 2-propanol, 2 x DMF, 2 x
2-propanol, metanol, 2 x éter y se secase al vacío
durante 24 horas.
Se desprotegió la resina cargada con
Fmoc-L-norleucina mediante
tratamiento con 20% de piperidina en DMF durante 4 horas. La resina
esponjada se filtró, se lavó con 5 x DMF, 2 x éter y se secó al
vacío durante 24 horas.
Se añadió la resina cargada con
L-Norleucina (5 mmoles) a una solución de
Fmoc-L-alanina (6,23 g, 20 mmoles),
hidroxibenzotriazol (3,0 g, 20 mmoles), hexafluorofosfato de
2-(1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(7,59 g, 20 mmoles) y diisopropiletilamina (6,97 ml, 40 mmoles) en
DMF (20 ml) y se dejó que se esponjara durante 4 horas con
agitación media. Se filtró la resina y se lavó con 4 x DMF, 2 x
éter y se secó al vacío toda la noche.
Las etapas (2) y (3) se llevaron a cabo
repetitivamente con Fmoc-L-alanina y
Fmoc-L-valina para proporcionar
tripéptido unido a la resina
H-L-alil-L-alanil-L-norleucina.
Se añadió la resina cargada con
L-valil-L-alanil-L-norleucina
(1 g, aprox. 1 mmoles) a una solución de ácido benzoico (0,488 g, 4
mmoles), hidroxibenzotriazol (0,6 g, 4 mmoles), hexafluorofosfato
de
2-(1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(1,52 g, 4 mmoles) y diisopropiletilamina (1,40 ml, Bmnol) en DMF (5
ml) y se dejó esponjar durante 6 horas con agitación media. La
resina se filtró y se lavó con 4 x DMF, 2 x éter y se secó al vacío
durante toda la noche.
Se trató la resina cargada con
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
(1,0 g, aprox. 1 mmoles) con una solución de ácido trifluoroacético
en diclorometano al 1% (20 ml) que contenía trietilsilano (320
\mul, 2 mmoles) durante 1 hora. La resina se eliminó mediante
filtración y se lavó con diclorometano (3 x 10 ml). La fase
orgánica se recogió, se evaporó y se trituró con éter para
proporcionar
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
(285 mg). Electrospray MS m/z 407 [MH^{+}].
Compuesto
2
Se suspendió
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
(140 mg, 0,34 mmoles) en TKF seco (3 ml) y se añadió DMF seca gota
a gota para proporcionar homogeneidad. La mezcla de reacción se
enfrió a -10ºC y se añadieron isobutilcloroformato (129 \mul, 1,0
mmoles) y N-metilmorfolina (109 \mul, 1,0 mmoles)
con agitación bajo argón. La mezcla se agitó durante 30 minutos
antes de que se añadiera una solución de diazometano en éter (5 ml,
aprox. 2 mmoles). La mezcla de reacción se dejó calentar a
temperatura ambiente durante 1 hora antes de que se añadiese gota a
gota una solución 1:1 de ácido acético y HBr al 50% (1 ml, 3,0 mmol
de HBr) y se agitase durante 15 minutos. La fase orgánica se diluyó
con acetato de etilo (40 ml), se lavó con agua (10 ml), agua salada
(10 ml) y bicarbonato sat. (2 x 10 ml), se secó sobre mgSO_{4} y
se eliminó el disolvente al vacío. Esto proporcionó un sólido
blanco descolorido (152 mg) que se podría purificar adicionalmente
según se requiere mediante HPLC preparativa. Electrospray MS m/z
482 [MH^{+}] y 484 [MH^{+}].
Compuesto
3
Se agitó sobre tamices moleculares a temperatura
ambiente durante 5 minutos una mezcla de fluoruro de potasio (0,1
mmol, 6 mg) y ácido
2,6-bis(trifluorometil)benzoico (0,066
mmol, 17 mg) en DMF seca (500 \mul). Se añadió a la mezcla de
reacción una solución de
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucinabromometilcetona
(0,033 mmol, 16 mg) en DMF seca (500 \mul) y se agitó la mezcla
de reacción durante 1 hora. La mezcla de reacción pasó a través de
un tapón de sílice corto y se lavó con metanol al 5% en
diclorometano. Se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el
residuo utilizando HPLC preparativa. El secado por congelación
proporcionó (6,4 mg) como un liofilizado blanco. Electrospray MS
m/z 660 [MH^{+}].
Se prepararon, de forma similar, los compuestos
siguientes.
Compuesto
4
(Electrospray MS m/z 552 [MH^{+}]) de
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
bromometilcetona y ácido 2,6-dimetilbenzoico.
Compuesto
5
(Electrospray MS m/z 540 [MH^{+}]) de
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
bromometilcetona y ácido 2-hidroxibenzoico.
Compuesto
6
(Electrospray MS m/z 592 [MH^{+}] y 594
[MH^{+}]) de
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
bromometilcetona y ácido 2,6-diclorobenzoico.
Compuesto
7
(Electrospray MS m/z 524 [MH^{+}])de
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
bromometilcetona y ácido benzoico.
Compuesto
8
(Electrospray MS m/z 614 [MH^{+}]) de
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
bromometilcetona y ácido
2,3,4,5,6-pentafluorobenzoico.
Compuesto
9
(Electrospray MS m/z 504 [MH^{+}]) de
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
bromometilcetona y ácido 1,1-dimetilpropanoico.
Compuesto
10
(Electrospray MS m/z 697 [MH^{+}]) de
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
bromometilcetona y
N-benziloxicarbonil-D-serinil-O-terc-butiléter.
Compuesto
11
(Electrospray MS m/z 641 [MH^{+}]) de
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
bromometilcetona y
N-benziloxicarbonil-D-serina.
Compuesto
12
(Electrospray MS m/z 514 [MH^{+}]) de
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
bromometilcetona y ácido 2-furancarboxílico.
Compuesto
13
(Electrospray MS m/z 606 [MH^{+}], 608
[MH^{-}]) de
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina
bromometilcetona y ácido
2,6-diclorofenilacético.
Se utilizaron las condiciones estándar de HPLC
preparativa para analizar estos compuestos así con el sistema de
HPLC preparativa C4 (Vydac, 22 x 250 mm) eluyendo a 10 ml por
minuto un gradiente de 5-95% (90% de acetonitrilo
(0,1% TFA)) durante 30 minutos.
Compuesto
14
Se añadió diazometano (0,3 mmoles) en éter 1,5 ml
a una suspensión de
Bz-Val-Ala-norLeu-OH
(50 mg, 0,12 mmoles) en THF (5 ml) en un recipiente de reacción de
plástico. Se observó la evolución de gas y se añadió a la solución
clara que resultó ácido acético (0,05 ml) y se evaporó la solución a
sequedad. Se disolvió el residuo en metanol (2 ml) y se añadió
hidroxilamina (2 mmoles) en metanol (2 ml) y se agitó la solución
durante 5 horas a temperatura ambiente. La solución se concentró,
se añadió agua (2 ml), y el sólido que resultó se filtró y se secó
para proporcionar 33 mg, 65%.
Compuesto
15
Se añadió cloruro de benzoílo (0,004 ml, 0,03
mmoles) a una solución de
Bz-Val-Ala-norLeu-NHOH
(10 mg, 0,022 mmoles) en piridina seca a -10ºC y se agitó durante 2
horas. Se evaporó la solución y se purificó según el procedimiento
descrito en la preparación de
etil-(S)-(E)-3-((N-benzoilvalilalanil)amino-6-metil-hept-2-enoato,
recogiendo el pico eluído a 25-27 min., y
liofilizando para proporcionar 0,5 mg, 5%.
Electrospray MS m/z 525 [MH^{+}].
Compuesto
16
Se añadió a una solución de ácido
2,6-dimetilbenzoico (4 mg, 0,024 mmoles) en DMF
seca (1 ml) enfriada a 0ºC
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
(3,2 mg, 0,023 mmoles), hexafluorofosfato de
O-7-azabenzotriazol-1-il-1,1,3,3-tetrametiluronio
(9 mg, 0,023 mmoles) y N-metilmorfolina (0,008 ml,
0,07 mmoles) y la solución se agitó durante 5 minutos. Se añadió el
ácido hidroxámico
Bz-Val-Ala-norLeu-NHOH
(10 mg, 0,02 mmoles) y la reacción se agitó toda la noche. La
solución se evaporó y se purificó según el procedimiento descrito
en la preparación de
etil-(S)-(E)-3-((N-benzoilvalilalanil)amino-6-metil-hept-2-enoato,
recogiendo el pico eluído a 26-28 min, y
liofilizando para proporcionar 0,9 mg, 6%.
Electrospray MS m/z 553 [M^{+}+H], 575
[M^{+}Na].
Compuesto
17
Se añadió a una solución enfriada previamente de
isobutilcloroformato (88 mmoles) en THF (65 ml) bajo nitrógeno
entre -10 y -15ºC durante 40 minutos una solución de
Boc-Leu-OH.H_{2}O (80,3 mmoles) y
N-metilmorfolina (88 mmoles) en THF (35 ml). La
reacción se agitó a -10ºC durante 1 hora después de dicho tiempo se
añadió N-metilmorfolina (88 mmoles) seguida de una
adición en porciones de hidrocloruro de
N,O-dimetilhidroxilamina (88 mmoles) entre -10ºC y
0ºC. La reacción se agitó a continuación a -10ºC durante 1 hora y a
continuación se dejó calentar hasta temperatura ambiente durante
toda la noche. El THF se eliminó a continuación al vacío y se
añadieron agua (50 ml) y acetato de etilo (200 ml). La fase
orgánica se lavó a continuación con 0,1 M de solución de ácido
cítrico (4 x 50 ml), a continuación con bicarbonato de sodio
saturado (4 x 50 ml), se secó sobre sulfato de magnesio y a
continuación se concentró al vacío para dar el producto.
Compuesto
18
Se añadió hidrocloruro de hidrógeno en dioxano
(4M, 75 ml) a
Boc-Leu-N(OMe)Me (33
mmoles) con enfriamiento y a continuación se agitó a temperatura
ambiente durante 1 hora. La solución se concentró a continuación al
vacío. Se añadió dietiléter (100 ml) y se concentró a sequedad tres
veces para dar el producto.
Compuesto
19
Se añadió a una solución enfriada previamente de
isobutilcloroformato (46 mmoles) en THF (30 ml) bajo nitrógeno
entre -10 y -15ºC durante 30 minutos una solución de
Boc-Ala-OH (46 mmoles) y
N-metilmorfolina (46 mmoles) en THF (20 ml). La
reacción se agitó a -10ºC durante 1 hora, después de dicho tiempo se
añadió gota a gota lentamente una solución de
N-metilmorfolina (46 mmoles) y
HCl.H2N-Leu-N(OMe)Me
(41,8 mmoles) en 1,4-dioxano (20 ml). La reacción se
dejó durante 1 hora a -10ºC y a continuación se dejó calentar hasta
temperatura ambiente. Después de concentrar la solución a vacío
elevado, se añadieron agua (50 ml) y acetato de etilo (200 ml). La
fase orgánica se lavó a continuación con una solución de ácido
cítrico 0,1 M (4 x 50 ml), a continuación con bicarbonato de sodio
saturado (4 x 50 ml), se secó sobre sulfato de magnesio y a
continuación se concentró al vacío para dar el producto.
Compuesto
20
Se añadió hidrocloruro de hidrógeno en dioxano
(4M, 80 ml) a
Boc-Ala-Leu-N(OMe)Me
(33 mmoles) con enfriamiento y a continuación se agitó a
temperatura ambiente durante 1,5 horas. La solución se concentró a
continuación al vacío. Se añadió a continuación dietiléter (100 ml)
y se concentró a sequedad tres veces para dar el producto.
Compuesto
21
Se añadió a una solución enfriada previamente de
isobutilcloroformato (46 mmoles) en THF (30 ml) bajo nitrógeno
entre -10 y -15ºC durante 30 minutos una solución de
Boc-Val-OH (46 mmoles) y
N-metilmorfolina (46 mmoles) en THF (20 ml). La
reacción se agitó a -10ºC durante 1 hora, después de dicho tiempo se
añadió gota a gota lentamente una solución de
N-metilmorfolina (46 mmoles) y
HCl.H2N-Ala-Leu-N(OMe)Me
(41,8 mmoles) en 1,4-dioxano (30 ml). La reacción se
dejó durante 1 hora a -10ºC y a continuación se dejó calentar hasta
temperatura ambiente. Después de concentrar la solución a vacío
elevado, se añadieron agua (50 ml) y acetato de etilo (200 ml). La
fase orgánica se lavó a continuación con una solución de ácido
cítrico 0,1 M (3 x 50 ml), a continuación con bicarbonato de sodio
saturado (3 x 50 ml), se secó sobre sulfato de magnesio y a
continuación se concentró al vacío para dar el producto.
Electrospray MS m/z 445 [MH^{+}].
Compuesto
22
Se enfrió una solución de hidruro de litio y
aluminio (4,5 mmoles) en THF (24,5 ml) entre -15 y -10ºC. Se añadió
a continuación
Boc-Val-Ala-Leu-N(OMe)Me
(2,2 mmoles) en THF (10 ml) muy lentamente para mantener la
temperatura baja. Después de 40 minutos se añadió acetato de etilo
(10 ml) lentamente a -15ºC y a continuación se dejó durante 10
minutos. Se añadió a continuación muy lentamente agua (2 ml), otra
vez a -15ºC y la reacción se dejó a continuación calentar hasta
temperatura ambiente. Se añadió a continuación una solución de ácido
cítrico (100 ml, 0,5M) y se extrajo el producto en acetato de
etilo. La fase de acetato de etilo se lavó con 100 ml de solución
de bicarbonato de sodio saturada, seguida de 100 ml de agua y a
continuación se secó sobre sulfato de magnesio. La solución se
concentró a continuación para dar el producto que posteriormente se
utilizó crudo.
Electrospray MS m/z 386 [MH^{+}].
Compuesto
23
Se añadió gota a gota una solución de
trietilfosfonacetato (420 mg, 1,9 mmoles) en THF (2 ml) durante 5
minutos a una suspensión de hidruro de sodio (46 mg, 1,9 mmoles) en
THF (4 ml) anhidro enfriada a 0ºC y la mezcla se agitó hasta que
cesó la evolución de gas. La solución se añadió gota a gota a una
solución de
Boc-Val-Ala-Leucil
aldehído (600 mg, 1,56 mmoles) en THF seco enfriado a -10ºC. La
mezcla de reacción se agitó durante 1 hora y se añadió cloruro de
amonio saturado (10 ml). Precipitó un sólido blanco que se eliminó
por filtración y el filtrado se dividió entre acetato de etilo y
agua. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio y se evaporó
para dar un aceite que se cristalizó de acetonitrilo/agua para
proporcionar el compuesto del título, 640 mg, 91%.
Electrospray MS m/z 456 [M^{+}+H], 356
[(M^{+}-^{t}BOC)+1].
Compuesto
24
Se disolvió en dioxano (10 ml)
etil-(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilaminovalilalanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
(455 mg, 1 mmoles) y se añadió agua seguida de hidróxido de litio
(126 mg, 3 mmoles). La solución se agitó durante 3 horas y se
añadió HCl 1M ac. hasta que el pH alcanzó la neutralidad. Se
eliminó el dioxano mediante evaporación rotativa y se ajustó el pH
a 4 con HCl 1M ac. El compuesto del título precipitó, se filtró y
se lavó con agua para proporcionar 420 mg, 98%.
Electrospray MS m/z 428 [M^{+}+H].
Compuesto
25
Se disolvieron en diclorometano seco (1 ml) el
ácido
(Boc-Val-Ala-Leu-OH)
(50 mg, 0,117 mg) y dimetilaminopiridina (29 mg, 0,24 mmoles) y se
enfrió a 0ºC. Se añadió sal del hidrocloruro de carbodiimida
soluble en agua (26 mg, 0,13 mmoles) en 0,5 ml de diclorometano y
la solución se agitó durante 5 minutos. Se añadió
1,1,1-trifluoroetanol (0,017 ml, 0,23 mmoles) en 0,5
ml de diclorometano y la reacción se dejó calentar a temperatura
ambiente después de 1 hora y la mezcla de reacción se agitó toda la
noche. La mezcla de reacción se lavó con 2 x 2 ml de solución de
ácido cítrico 0,5 M, 1 x 2 ml de agua, 1 x 2 ml de solución
saturada de bicarbonato de sodio, 1 x 2 ml de agua, se secó con
sulfato de magnesio y se evaporó a sequedad para dar el compuesto
del título.
Electrospray MS m/z 510 [M^{+}+H], 410
[(M^{+}-^{t}BOC)+1], 454
[(M^{+}-^{t}Bu)+1].
Compuesto
26
Se disolvió en HCl 4,0 M en dioxano (2 ml)
agitado a temperatura ambiente durante 30 minutos
etil-(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilaminovalilalanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
(16,6 mg, 0,036 mmoles) y se evaporó a sequedad. Se disolvió el
residuo en DMF (0,5 ml) y se añadió
N-metilmorfolina (7,36 mg, 0,073 mmoles) seguida de
cloruro de benzoílo (5,4 mg, 0,038 mmoles) en DMF 0,5 ml. La
reacción se agitó durante 2 horas, se diluyó con solución de ácido
trifluoroacético 0,1% (4 ml) y acetonitrilo (2 ml) y se inyectó
sobre un sistema de HPLC preparativa C4 (22 x 250 mm) eluyendo a 10
ml por minuto, monitorizando a 215 nm y un gradiente de sistema B
de 10-90% durante 25 minutos y manteniendo a 90%
durante 15 minutos. El sistema A = 0,1% de TFA en agua, sistema B =
90% de acetonitrilo, 10% de sistema A. Se recogió el pico que eluyó
a 26-28 minutos y se liofilizó hasta un sólido
blanco, proporcionando 4,5 mg, 27%.
Electrospray MS m/z 460 [M^{+}+H].
Se prepararon los compuestos siguientes, de
manera idéntica a lo anterior.
Compuesto
27
Se obtuvo un rendimiento de 3,7 mg, a 22%.
Electrospray MS m/z 528 [M^{+}+H].
Compuesto
28
Rendimiento 3,8 mg, 23%.
Electrospray MS m/z 504 [M^{+}+H].
Compuesto
29
Como en el procedimiento anterior, excepto que se
utilizó el isocianato de fenilo en lugar de un ácido
hidroclorhídrico, rendimiento 1,5 mg, 10%.
Electrospray MS m/z 475 [M^{+}+H].
Compuesto
30
Rendimiento 2,3 mg, 13%.
Electrospray MS m/z 551 [M^{+}+H].
Compuesto
31
Rendimiento 1 mg, 6%.
Electrospray MS m/z 510 [M^{+}+H].
Compuesto
32
Rendimiento 1,5 mg, 9%.
Electrospray MS m/z 512 [M^{+}+H].
Compuesto
33
Rendimiento 2,9 mg, 19%.
Electrospray MS m/z 469 [M^{+}+H].
Compuesto
34
Como en el procedimiento anterior, excepto que se
utilizó ácido xanten-9-carboxílico
(8,1 mg, 0,036 mmoles) en lugar del ácido hidroclorhídrico. El
acoplamiento de este ácido se efectuó utilizando hexafluorofosfato
de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(13,6 mg, 0,036 mmoles), como activador y
1-hidroxibenzotriazol (5,5 mg, 0,036 mmoles) como
catalizador en presencia de N-metilmorfolina (10,8
mg, 0,108 mmoles).
Rendimiento 1,7 mg, 9%.
Electrospray MS m/z 564 [M^{+}+H].
Compuesto
35
(Adaptado de I. Shahak, J. Almog,
Synthesis 145 (1970).)
Se disolvió en diclorometano (10 ml) dietilo de
feniltiometilfosfonato disponible comercialmente (1,0 ml, 4,1
mmoles). Se añadió ácido sulfúrico (10 ml, 25%) y se enfrió la
mezcla con hielo. Se añadió a continuación permanganato de potasio
sólido en porciones (3 x 0,5 g) con agitación, después de este
tiempo la reacción pareció completarse. Se añadió lentamente
metabisulfito de sodio sólido hasta que la mezcla se volvió
incolora. Esto se extrajo a continuación con acetato de etilo (x 3)
y los lavados orgánicos combinados se lavaron con solución saturada
de bicarbonato de sodio seguido de agua salada antes de secarlos
sobre sulfato de sodio. Los volátiles se eliminaron a continuación
al vacío. Se purificó el residuo mediante cromatografía de flash
sobre sílice eluyendo inicialmente con acetato de etilo/hexano 8/2
seguido de acetato de etilo puro. De esta manera se obtuvo el
producto deseado, dietilo de fenilsulfonilmetilfosfonato (1,0 g,
cuant.) como un sólido incoloro.
MS (MALDI-TOF): requerido
(M^{+}(C_{11}H_{27}O_{5}PS)+1) = 292; obtenido
(M^{+}+1) = 292.
Compuesto
36
Se disolvió en THF seco (10 ml) dietilo de
fenilsulfonilmetilfosfonato (38 mg, 129 mmoles) y a continuación se
enfrió a 0ºC bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió hidruro de
sodio (8 mg de una dispersión en aceite al 60%, 200 mmoles) y a
continuación la mezcla se agitó durante 15 minutos (efervescencia).
Se añadió a continuación a la solución resultante el aldehído
^{t}Boc-Val-Ala-Leueil
aldehído (50 mg, 129 mmoles) y la mezcla se agitó durante 60
minutos. La reacción se enfrió mediante la adición de ácido
clorhídrico diluido (0,1 M), seguido por una extracción con acetato
de etilo (x 3). La fase orgánica separada se lavó secuencialmente
con solución saturada de bicarbonato de sodio y agua salada antes
de secarla sobre sulfato de sodio. Se eliminaron los volátiles al
vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía flash sobre
sílice eluyendo con acetato de etilo/hexano 4/6. Se eluyó primero
un subproducto no identificado (12 mg) seguido por el producto
deseado
(S)-(E)-3-(terc-butoxicarbonil-amino-L-valil-L-alanil)amino-fenilsulfonil-5-metil-1-hexeno
(22 mg, 32%) como un sólido.
Electrospray MS m/z 546 [M^{+}+Na], 424
[(M^{+}-^{t}Boc)+1].
Compuesto
37
Se convirtió el dietilo de metiltiometilfosfonato
disponible comercialmente al compuesto del título utilizando el
procedimiento de I. Shahak y J. Almog, Synthesis 171
(1969).
Compuesto
38
Se disolvió en THF seco (5 ml) dietilo de
metilsulfonilmetilfosfonato (30 mg, 130 mmoles) y a continuación se
enfrió a 0ºC bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió hidruro de
sodio (7 mg de una dispersión en aceite al 60%, 175 mmoles) y se
agitó la mezcla durante 15 minutos (efervescencia). Se añadió a
continuación a la solución que resultó el aldehído
^{t}Boc-Val-Ala-Leucil
aldehído (50 mg, 129 mmoles) y la mezcla a continuación se agitó
durante 60 minutos. La reacción se enfrió por adición de ácido
clorhídrico diluido (0,1 M), seguido de una extracción con acetato
de etilo (x 3). La fase orgánica separada se lavó secuencialmente
con solución saturada de bicarbonato de sodio y agua salada antes
de secarla sobre sulfato de sodio. A continuación se eliminaron los
volátiles al vacío. Se purificó el residuo mediante cromatografía
flash sobre sílice eluyendo con acetato de etilo/hexano 8/2. Se
eluyó primero un subproducto no identificado (4 mg) seguido del
producto deseado
(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilamino-valil)alanil)amino-metilsulfonil-5-metil-1-hexeno
(24 mg, 40%) como un sólido.
Electrospray MS m/z 584 [M^{+}+Na], 362
[(M^{+}-^{t}Boc)+1].
Compuesto
39
Se preparó según el procedimiento B de L.Ghosez
et al. Tetrahedron 43, 5125 (1987).
Electrospray MS m/z 261 [M^{+}+H], 283
[(M^{+}+Na].
Compuesto
40
Se disolvió en THF seco (5 ml) etilo de
dietilfosforilmetansulfonato (36 ml, -138 mmoles) y a continuación
se enfrió a 0ºC bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió hidruro
de sodio (8 mg de una dispersión en aceite al 60%, 200 mmoles) y se
agitó la mezcla durante 15 minutos (efervescencia). Se añadió a
continuación a la solución que resultó el aldehído
^{t}Boc-Val-Ala-Leucil
aldehído (50 mg, 129 mmoles) y la mezcla se agitó durante 30
minutos. La reacción se enfrió por adición de ácido clorhídrico
diluido (0,1 M), seguido de una extracción con acetato de etilo (x
3). La fase orgánica separada se lavó secuencialmente con solución
de bicarbonato de sodio y agua salada antes de secarla sobre
sulfato de sodio. A continuación se eliminaron los volátiles al
vacío. Se purificó el residuo mediante cromatografía flash sobre
sílice eluyendo con acetato de etilo/hexano 1/1. El producto
deseado,
dietil-(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilaminovalil)alanil)amino-5-metilhexenilsufonato
(22 mg, 35%) se obtuvo como un sólido.
Electrospray MS m/z 492 [M^{+}+1], 392
[(M^{+}-^{t}Boc)+1].
Se llevaron a cabo rutinariamente en fosfato de
potasio 50 mM todos los ensayos de enzima de Der p I; pH
8,25 que contenía ácido etilendiamintetraacético (EDTA) 1 mM y
ditiotreitol (DTT) 1 mM. Se monitorizó la formación de producto con
respecto al tiempo midiendo el aumento en la emisión de
fluorescencia a 420 nm y la excitación a 320 nm. Se llevaron a cabo
todos los ensayos a 25ºC. Las soluciones concentradas de sustratos
diversos y/o inhibidores se llevaron a 100% de dimetilsulfóxido
(DMSO).
Las constantes cinéticas (K_{M} y k_{cat}) se
calcularon a partir de las velocidades iniciales de la reacción
enzimática en concentraciones de sustrato diferentes. Estos datos
se ajustaron, mediante análisis por regresión, a la ecuación de
Michaelis-Menten y se obtuvieron las constantes
cinéticas.
Esquema
1
Esquema
2
La reacción de la enzima y del inhibidor
comprende dos etapas. La primera es la unión de la enzima y el
inhibidor para producir el complejo inhibidor enzima (E\cdotI).
Esta etapa se asume que es rápida y reversible, relativa a las
otras etapas, y no ocurre reacción química. En este caso k_{1} es
la constante de velocidad de segundo orden para la formación de
complejo E\cdotI y k_{-1} es la constante de velocidad de
primer orden para la rotura de E\cdotI. La segunda etapa del
procedimiento, que ocurre a una velocidad k_{2}, es la formación
del complejo covalente enzima-inhibidor (EI) que
resulta en una inactivación irreversible de la enzima.
La práctica de las cinéticas de inactivación de
las enzimas se ha descrito mediante dos procedimientos estándar
aceptados (Esquemas 1 y 2). El primero (Esquema 1) es el
procedimiento de dilución descrito por Kitz, C.G. y Wilson, I.B.,
(1962), J. Biol. Chem., 237,
3245-3249. En este caso la enzima y el inhibidor se
incuban previamente durante un periodo de tiempo fijado antes de
enfriar esta reacción mediante la adición de un exceso de sustrato.
El segundo procedimiento (Esquema 2), es monitorizar la
inactivación de la enzima en presencia de sustrato y de inhibidores
irreversibles. Este procedimiento se ha descrito previamente (Tian,
W.-X. & Tsou, C.-L, (1982) Biochemistry, 21,
1028-1032; Morrison, J.F. & Walsh, C.T., (1988),
Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 61,
201-301) y las ecuaciones que describen las
cinéticas se muestran a continuación (Ecs. 1, 2 y 3). En ambos casos
la concentración de inhibidor utilizada es por lo menos 10 veces
mayor que la concentración de enzima para mantener las condiciones
de pseudo-primer orden.
Ec. 1k_{app}=
k_{2} [I]/1 + [S]/K_{M} ([I] +
K_{i})
Ec.
2[Producto] = v_{s}t +
(v_{o}-v_{s})[1-exp(-k_{app}t)]/k_{app}
+d
Ec. 3constante
de velocidad de segundo orden =
(k_{app}/[I])(1+[S]/K_{M})
La aparente inactivación de la constante de
velocidad (k_{app}) se calculó utilizando la Ec.2; en la que
v_{o} es la velocidad inicial de la reacción, v_{s} es la
velocidad de la reacción asintótica de estado estacionario, d es la
ordenada en el origen en el tiempo cero. La velocidad de segundo
orden se calculó utilizando la Ec. 3.
Se llevaron a cabo de forma rutinaria en fosfato
de potasio 50 mM los ensayos; pH 8,25 que contenía ácido
etilendiamintetraacético (EDTA) 1 mM y ditiotreitol 1 mM (DTT). El
sustrato fluorogénico utilizado para monitorizar la actividad de la
enzima de Der p I fue
2-aminobenzoilvalilalanilnorleucilseril-(3-nitro)tirosinilaspartilamida.
La formación de producto se monitorizó con respecto al tiempo
mediante la medición del aumento en la emisión de fluorescencia a
420 nm y de la excitación a 320 nm. Se llevaron a cabo los ensayos a
25ºC. Las soluciones concentradas de inhibidores diversos se
llevaron al 100% de dimetilsulfóxido.
Se llevaron a cabo las cinéticas de inactivación
para diversos inhibidores utilizando técnicas ya descritas. En el
procedimiento de dilución, generalmente se mezcló Der p I
100 nM y se incubó con 0,5-10 uM del inhibidor y se
tomaron alícuotas en puntos de tiempo dados (tiempo de muestreo) y
se determinó la actividad enzimática residual mediante una dilución
de diez veces en el regulador de ensayo que contenía cantidades
saturadas de sustrato. La actividad residual se relacionó con el
tiempo de muestreo y la curva se ajustó por cálculo de análisis de
regresión mínimo-cuadrática no lineal. En casos en
los que las constantes de velocidad de segundo orden fueron
superiores a 10^{5} M^{-1}s^{-1}, se utilizaron las
condiciones de segundo orden (es decir, cantidades equimolares de
enzima y de inhibidor). Por lo general se incubaron cantidades
estequiométricas de enzima y de inhibidor para intervalos de tiempo
dados (tiempo de muestreo) y la reacción cesó mediante una dilución
de diez veces de esta mezcla para cantidades saturadas de sustrato
en el regulador de ensayo. Se ajustó un gráfico de concentración de
enzima recíproca versus el tiempo de muestreo mediante cálculo de
análisis de regresión lineal mínimo-cuadrática para
obtener la constante de velocidad de inactivación de segundo
orden.
En casos en los que las cinéticas de inactivación
se calcularon en presencia de enzima, inhibidor y sustrato, se
utilizaron las condiciones siguientes. Generalmente se incubó a
25ºC durante 5 min. antes de la adición de la enzima (10 nM) una
solución que contenía sustrato 12,5 mM e inhibidor
0,1-10 mM para iniciar la reacción. En ausencia de
inhibidor, la formación de producto fue lineal con el tiempo. La
inactivación de la enzima se mostró mediante la curvatura hacia
abajo en el incremento de la fluorescencia. La constante de
velocidad de inactivación aparente (k_{app}) se determinó mediante
el ajuste de estas curvas a la ec. 2, utilizando el análisis de
regresión mínimo-cuadrático, y se determinó la
constante de velocidad de segundo orden utilizando la Ec.3.
Los compuestos para los que no se muestran los
datos de inhibición fueron intermedios clave en la formación de
compuestos adicionales o fueron demasiado inestables para ser
ensayados y por lo tanto fueron intermedios para compuestos más
estables.
Se proporcionó una colección de compuestos con
actividad biológica para Der p I como un equipo de
aprendizaje. Cada compuesto en el equipo de aprendizaje se sometió
a un análisis conformacional completo (J. Comp. Chem., 1995, 16,
171-187). Se generó un número representativo de
confórmeros durante un intervalo de energía dado superior a la
energía de conformación más baja (J. Chem. Inf. Comp. Sci., 1995,
35, 285-294 y J. Chem. Inf. Comp. Sci., 1995, 35,
295-304).
Esta información se utilizó para derivar un
farmacoforo (basado en las siete reglas de tipo de elemento
químico) (J. Chem. Inf. Comp. Sci., 1994, 34,
1297-1308) que se correlaciona con la actividad
biológica observada. Se asumió que las moléculas en el equipo de
aprendizaje todas actúan en el mismo objetivo de la misma manera de
acción.
Un farmacoforo que consiste en por lo menos los
elementos químicos siguientes define el motivo químico de
inhibidores potenciales de Der p I:
Un elemento aceptor de enlace de hidrógeno, tres
elementos hidrófobos (J. Comp. Chem., 1986, 7,
565-577) y un elemento donador de enlace de
hidrógeno.
Un elemento aceptor de enlace de hidrógeno encaja
con los tipos o grupos de átomo siguientes que son accesibles a la
superficie.
- \bullet
- nitrógenos sp o sp^{2} que poseen un par de electrones no compartido y una carga menor o igual a cero.
- \bullet
- oxígenos o azufres sp^{3} que poseen un par de electrones no compartido y una carga menor o igual a cero.
- \bullet
- aminas no básicas que poseen un par de electrones no compartido.
Un elemento donador de enlace de hidrógeno posee
las mismas reglas químicas, es decir, encaja con los mismos átomos
o grupos de átomos, como el aceptor de enlace de hidrógeno excepto
que incluye asimismo nitrógeno básico. No existe exclusión de
piridinas e imidazoles deficientes de electrones. Este elemento
encaja con los tipos de átomo o grupos de átomos siguientes:
- hidroxilos no ácidos
- tioles
- hidrógenos acetilénicos
- fracciones de NH (excepto hidrógenos de
tetrazoles y de trifluorometilsulfonamida)
Un elemento hidrófobo se define como un grupo de
átomos contiguos que no están adyacentes a una concentración de
carga (átomos cargados o átomos electronegativos), en una
conformación tal que los átomos poseen accesibilidad a la
superficie, incluyendo fenilo, cicloalquilo, isopropilo y metilo.
Esto puede asimismo incluir residuos que poseen un carácter
hidrofóbico parcial tal como las cadenas laterales lisil o
glutaminil de los aminoácidos.
El término "farmacoforo" utilizado en la
presente memoria no significa implicar ninguna actividad
farmacológica. El término se refiere a elementos químicos y a su
distribución en el espacio de tres dimensiones lo que constituye y
epitomiza los requisitos preferidos para la interacción molecular
con un receptor. Por ejemplo el receptor puede ser el sitio activo
catalítico de la proteasa de cisteína Der p I.
La figura 4 muestra gráficamente el farmacoforo
de Der p I. En la figura el aceptor de enlace de hidrógeno
se representa por una función de vector que consiste en dos
esferas. La esfera más pequeña (radio de por lo menos 1,6 Angstroms
hasta 2,6 Angstroms) define el centroide del aceptor de enlace de
hidrógeno sobre el ligante mientras la esfera mayor (radio de por lo
menos 2,2 Angstroms hasta 2,6 Angstroms) define el punto proyectado
del aceptor de enlace de hidrógeno desde el receptor. Estas dos
esferas están por lo menos a 3,0 Angstroms.
De forma similar, el donador de enlace de
hidrógeno se representa por una función de vector de dos esferas
definida de la misma manera que anteriormente para el aceptor de
enlace de hidrógeno.
Los elementos hidrófobos se representan mediante
esferas de por lo menos un radio de 1,6 Angstroms hasta 2,6
Angstroms.
Las posiciones absolutas centroides de esfera de
cada elemento se definen en tres dimensiones como sigue:
- \bullet
- hidrófobo 1 posee coordenadas cartesianas XYZ de -6,272, 3,372, -1,200
- \bullet
- hidrófobo 2 posee coordenadas de -3,320, -2,305, 0,906
- \bullet
- hidrófobo 3 posee coordenadas de -0,612, -4,088, -1,740
- \bullet
- coordenadas de origen del donador de enlace de hidrógeno de 0,007, 0,926, 4,168
- \bullet
- coordenadas del punto proyectado del donador de enlace de hidrógeno de -0,743, 0,926, 4,168
- \bullet
- coordenadas en el origen del aceptor de enlace de hidrógeno de 5,155, -0,25, -2,528
- \bullet
- coordenadas del punto proyectado del aceptor de enlace de hidrógeno de 7,143, 0,349, -4,426
Las restricciones de distancia se muestran en las
figuras 5 y 10 a 19. Las restricciones de ángulo se muestran en las
figuras 6 y 10 a 19.
Las tolerancias sobre todas las distancias entre
los elementos químicos es +/- 0,5 Angstroms y los ángulos
geométricos +/- 20 grados.
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26. Valerio, R. M., Bray, A. M. y
Maeji, N. J., Int. J. Pept. Prot. Res., 44,
158-165, 1994.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: PEPTIDE THERAPEUTICS LIMITED
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 321 CAMBRIDGE SCIENCE PARK
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: CAMBRIDGE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CAMBRIDGE
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: INGLATERRA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CB4 4WG
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 01223 423333
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 01223 423111
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Compuestos para utilizar en el tratamiento de enfermedades alérgicas mediadas por IgE.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: diskette
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPO).
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARÁCTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn
Ala}
Claims (25)
1. Utilización de un compuesto inhibidor de
proteasa de cisteinilo, que inhibe la actividad proteolítica de
Der p I, para la fabricación de un medicamento destinado al
tratamiento o profilaxis de enfermedades alérgicas.
2. Utilización de un compuesto inhibidor de
proteasa de cisteinilo, que inhibe la actividad proteolítica de
Der p I, para la fabricación de una preparación destinada a
atenuar o inactivar la alergenicidad de Der p I de heces de
ácaro de polvo en mobiliario tal como camas, alfombras y
aspiradores.
3. Utilización según las reivindicaciones 1 ó 2,
en la que el inhibidor de proteasa de cisteinilo se utiliza en
combinación con uno o más de un vehículo, adyuvante o
excipiente.
4. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que el compuesto posee una actividad
inhibidora de proteasa de cisteinilo y es capaz de inhibir la
escisión proteolítica de CD23 unida a la membrana in
vivo.
5. Utilización según la reivindicación 4, en la
que el compuesto es un sustrato para Der p I y se selecciona
de entre el grupo que consiste en: análogos de E64,
peptidomiméticos y miméticos de los mismos.
6. Utilización según la reivindicación 4, en la
que el compuesto se selecciona de entre el grupo que consiste en:
secuencias de péptidos y análogos y miméticos de los mismos
comprendiendo sitio(s) de escisión que es/son capaz de ser
escindido por Der p I.
7. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que el compuesto presenta la fórmula
general:
en la que X, Y y Z son N o
CH;
R1 es un grupo bloqueador para el nitrógeno N
terminal;
R2, R3 y R4 son cadenas laterales sobre X, Y y Z;
y W es un grupo que reacciona irreversiblemente con un tiol de
cisteína activo de Der p I.
8. Utilización según la reivindicación 7, en la
que X, Y y Z son CH y la estereoquímica es exclusivamente la
configuración "S".
9. Utilización según la reivindicación 7 ó 8, en
la que X, Y o Z son nitrógeno e I es un peptidomimético, un
"azapéptido".
10. Utilización según la reivindicación 7, 8 ó 9,
en la que R1 representa un arilo hidrofóbico opcionalmente
sustituido seleccionado de entre el grupo que comprende fenilo,
naftilo, o 2-naftilo o 9-antracilo
no sustituido; o un grupo heteroarilo unido opcionalmente a través
de un heteroátomo (O, S, N, P) al carbonilo y cuando se une a
través de N o P el heteroátomo puede ser mono o diarilo o mono o
diheteroarilo sustituido o en la que R1 representa un grupo
alifático hidrofóbico de 3 carbonos o más, lineal o ramificado,
unido opcionalmente a través de un heteroátomo (O, S, N, P) al
carbonilo y cuando se une a través de N o P, el heteroátomo puede
ser mono o disustituido.
11. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 10, en la que el fenilo opcionalmente
sustituido es un fenilo no sustituido o un fenilo que posee de 1 a
5 fluorosustituyentes o un fenilo que posee de 1 a 3 sustituyentes
en el que los sustituyentes se seleccionan independientemente de
entre el grupo que comprende alquilo inferior, alcoxi inferior,
nitro, halo, acetilo, benzoílo, hidroxilo, amino, metilamino,
-COOH, -CONH2, -COOR2, y NHCOR2 en el que R2 es un alquilo
inferior.
12. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 11, en la que R1 representa una cadena
alifática lineal o ramificada que es pivolilo,
n-butilo y variantes de las mismas hasta C8, fenilo,
radical difenilamino, 9-xantenilo, piperonilo,
radical fenilamino, terc-butoxi,
CF3-fenilo, un fenilo mono o disustituido, radical
difenilamino o 9-xantenilo en el que los
sustituyentes son un alquilo inferior, C1-3, alcoxi
inferior C1-3, fenilo mono 2 ó 3 amino o carboxi
sustituido.
13. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12, en la que R2 representa una cadena lateral
hidrofóbica lineal o ramificada que es alquilo, metilo (Ala);
ciclohexilmetilo; 2-metilpropilo, es decir Leu;
n-butilo, es decir Norleucina;
1-metiletilo, es decir Val;
1-metilpropilo, es decir Ile;
3-metilbutilo, es decir homoleucina; etilo, es decir
Abu; o la cadena hidrofóbica contiene un heteroátomo tal como N, O,
P, S y es 2-metiltioetilo (metionina),
4-aminobutilo, es decir Lys; o
etil-2-carboamida, es decir Gln; o
su cadena hidrofóbica es un radical fenilmetilo que contiene
opcionalmente un átomo de nitrógeno o está sustituido sobre el
anillo de fenilo con -OH, alcoxi, fenilo, o alquilo en
C1-3.
14. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 13, en la que R2 representa bifenilmetilo,
1-metiletilo, es decir valina; metilo, es decir
alanina; o ciclohexilmetilo, es decir ciclohexilalanina.
15. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 14, en la que R3 representa un grupo alquilo
C1 opcionalmente sustituido con un heteroátomo, O, o f; o R3 puede
ser 4-aminobutilo, es decir Lys;
etil-2-carboxamida, es decir Gln; o
2-(metiltiooxi)etilo, es decir Met(O).
16. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 15, en la que R3 representa metilo, es decir
alanina.
17. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 16, en la que R3 representa una cadena lateral
hidrofóbica lineal o ramificada cuyo alquilo, metilo (Ala);
ciclohexilmetilo; 2-metilpropilo, es decir Leu;
n-butilo, es decir Norleucina;
1-metiletilo, es decir Val;
1-metilpropilo, es decir Ile;
3-metilbutilo, es decir homoleucina; etilo, es decir
Abu; o su cadena hidrofóbica puede contener un heteroátomo tal como
N, O, P, S y es 2-metiltioetilo (metionina),
4-aminobutilo, es decir Lys; o
etil-2-carboamida, es decir Gln; o
la cadena hidrofóbica es un radical fenilmetilo que contiene
opcionalmente un átomo de nitrógeno o está sustituida en el anillo
fenilo con -OH, alcoxi, fenilo, o alquilo en C1-3;
o la cadena hidrofóbica es 2-hidroxietilo, es
decir, Thr; o 2-fluoroetilo.
18. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 17, en la que R4 representa
3-metilbutilo, es decir homoleu; ciclohexilmetilo,
es decir cha; 2-metilpropilo, es decir leucina; o
n-butilo, es decir norleucina.
19. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 18, en la que W se selecciona de entre el
grupo que comprende:
i)
ii)
iii)
iv)
v)
y E se selecciona de entre el grupo
que
comprende:
i) OAr o
SAr
ii)
iii)
heteroarilo
iv)
halógeno
v)
O ---
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}} ---
Rvi)
O ---
\melm{\delm{\para}{R}}{P}{\uelm{\dpara}{O}} ---
Rvii)
O ---
\melm{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}{P}{\uelm{\dpara}{O}}
--- O ---
RR se selecciona de entre el grupo que comprende
alquilo y Ar;
Ar se selecciona de entre el grupo que comprende
arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido;
e Y se selecciona de entre el grupo que comprende
ésteres, sulfonas, carboxilato, amidas, fosfonatos, cetonas,
sulfonatos, nitrilos, sulfonamidas y compuestos nitro.
20. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en la que las enfermedades alérgicas
incluyen asma o eccema juveniles.
21. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en la que las enfermedades alérgicas
incluyen asma o eccema.
22. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 19, en la que el compuesto se selecciona de
entre el grupo que consiste en:
Compuesto 3:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-bis(trifluorometil)benzoiloximetilcetona
Compuesto 4:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-dimetilbenzoiloximetilcetona
Compuesto 6:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-diclorobenzoiloximetilcetona
Compuesto 7:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucinabenzoiloximetilcetona
Compuesto 8:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,3,4,5,6-pentafluorobenzoiloximetilcetona
Compuesto 9:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-1,1-dimetilpropiloximetilcetona
Compuesto 10:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-N-(benziloxicarbonil)-D-serinil-(O-terc-butil)oximetilcetona
Compuesto 11:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-N-(benziloxicarbonil)-D-seriniloximetilcetona
Compuesto 12:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2-furanoximetilcetona
Compuesto 13:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-diclorofenilaciloximetilcetona
Compuesto 15:
N-(benzoilamino-L-valil-L-alanil-L-norleucil)-O-benzoilhidroxamato
Compuesto 16:
N-(N-benzoilamino-L-valil-L-alanil-L-norleucil)-O-2,6-dimetilbenzoilhidroxamato
Compuesto 23:
etil-(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 25:
1,1,1-trifluoroetil-(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-
enoato
enoato
Compuesto 26:
etil-(S)-(E)-3-((N-benzoil-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 27:
etil-(S)-(E)-3-((2-trifluorometil-N-benzoil-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 28:
etil-(S)-(E)-3-((piperoniloílamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 29:
etil-(S)-(E)-3-((fenilcarbamoílamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 30:
etil-(S)-(E)-3-((difenilcarbamoílamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 34:
etil-(S)-(E)-3-((xanten-9-oílamino-L-valil-L-alanil)amino-6-metil-hept-2-enoato
Compuesto 36:
(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilamino-L-valil)-L-alanil)amino-1-fenilsulfonil-5-metil-1-hexeno
Compuesto 38:
(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilamino-L-valil)-L-alanil)amino-1-metilsulfonil-5-metil-1-hexeno
Compuesto 40:
etil-(S)-(E)-3-((terc-butoxicarbonilamino-L-valil)-L-alanil)amino-5-metilhexenilsulfonato.
23. Utilización según la reivindicación 22, en la
que el compuesto es:
Compuesto 3:
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-bis(trifluorometil)benzoiloximetilcetona.
24.
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-bis(trifluorometil)benzoiloximetilcetona.
25. Compuesto para utilizar según la
reivindicación 20, que es
N-benzoil-L-valil-L-alanil-L-norleucina-2,6-bis(trifluorometil)benzoiloximetilcetona.
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