ES2230157T3

ES2230157T3 - Aislamiento de celulas precursoras y su uso para la reparacion de tejidos.

Info

Publication number: ES2230157T3
Application number: ES00965662T
Authority: ES
Inventors: Frank Luyten; Cosimo De Bari; Francesco Dell'accio
Original assignee: Tigenix NV
Current assignee: Tigenix NV
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2020-10-06
Also published as: AU7634400A; ATE283349T1; EP1282690B1; CA2386506C; US7863045B2; US20110158960A1; DE60016288D1; US20090123927A1; EP1282690B9; PT1282690E; CA2386506A1; WO2001025402A1; DE20023640U1; DE60016288T2; EP1282690A1; DK1282690T3

Abstract

Método para identificar positivamente células precursoras de esqueleto aisladas o expandidas, viables, capaces de realizar su función, y pluripotentes, que han entrado en una vía de diferenciación post-natal que conduce a los tejidos esquelético o conectivo y que comprende las etapas de a) aislar las células de mamífero en un cultivo celular in vitro, y b) detectar la presencia de la expresión del marcador embrionario positivo CDMP-1.

Description

Aislamiento de células precursoras y su uso para la reparación de tejidos.

La presente invención está relacionada con el campo de la ingeniería de tejidos y, más específicamente, con la identificación de poblaciones de células precursoras del esqueleto para la reparación de tejidos conectivos, incluyendo tejidos esqueléticos in vivo.

Antecedentes de la invención

El cartílago es un tejido compuesto por un componente de tipo celular, los condrocitos, y por una matriz extracelular normalmente rica en colágeno tipo II y proteoglicanos altamente sulfatados. Esta última propiedad confiere al cartílago sus peculiares características histoquímicas consistentes en teñirse fuertemente con azul alcián a pH bajo (0,2-2,5) y metacromasia con azul de toluidina y safranina O. La abundancia del colágeno tipo II, proteína de enlace y el proteoglicano agrecán, junto con la presencia de colágenos menores tales como el colágeno tipo IX y el tipo XI, son el sello distintivo del tejido cartilaginoso. En mamíferos en fase post-natal, el cartílago contribuye a la estructura de diversos órganos y sistemas tales como la superficie articular de articulaciones diartroidales y otras estructuras asociadas a las articulaciones tales como los meniscos, la oreja, la nariz, la laringe, la tráquea, los bronquios, estructuras de las válvulas cardíacas, parte de las costillas, sincondrosis, entesis, etc. En algunos de los lugares mencionados (por ejemplo, entesis, los anillos fibrosos de los discos intervertebrales, los meniscos, la inserción de ligamentos, etc.), debido a la abundancia de colágenos (mayoritariamente colágeno tipo I), se le llama fibrocartílago. En otras partes (por ejemplo el pabellón de la oreja, la epiglotis, etc.) es especialmente rico en elastina, llamándosele cartílago elástico. En todas las otras estructuras incluyendo el cartílago articular, debido a su aspecto claro y semi-transparente se le llama cartílago hialino.

Durante el desarrollo embrionario de los huesos largos, las células del mesénquima se agregan y se diferencian para formar la base de cartílago, la cual proporciona el molde para lo futuros huesos largos. Estas plantillas de cartílago en desarrollo evolucionan experimentando la formación de hueso endocondral mediante una cascada de acontecimientos que incluyen la hipertrofia de los condrocitos, invasión vascular, mineralización y, finalmente, sustitución por hueso, excepto en una capa fina en los extremos de los elementos óseos que se diferenciarán en superficies articulares o articulaciones diartrodiales. En estas partes, el tejido cartilaginoso permanece hialino a lo largo de la vida del individuo. Resulta bien conocido que, con el envejecimiento, el cartílago articular sufre un proceso de senectud, viéndose afectado tanto en sus propiedades mecánicas como en su elasticidad intrínseca.

La terapia actual para la pérdida de cartílago consiste en su sustitución con un material prostético tal como la silicona para prótesis cosméticas o aleaciones metálicas para la mejora de articulaciones. La colocación de aparatos prostéticos, no obstante, es una forma muy artificial de reparación, habitualmente asociada a la pérdida del hueso subyacente sin recuperación de la función completa permitida por el tejido cartilaginoso original. Las complicaciones graves a largo plazo asociadas a la presencia de un cuerpo extraño permanente pueden incluir la infección, la erosión y la inestabilidad. El implante de hueso esterilizado o polvo de hueso con acero quirúrgico impregnado con células óseas ha resultado en gran parte infructuoso debido a la naturaleza no degradable del soporte celular. La patente U.S. Nº 4.609.551 da a conocer que los fibroblastos situados in vitro durante al menos tres días en una proteína ósea soluble son capaces de estimular una respuesta condrogénica in vitro y/o in vivo. Los fibroblastos activados son entonces trasladados in vivo mediante su combinación con una matriz biodegradable o bien mediante una inyección intra-articular o acoplamiento a homoinjertos y aparatos prostéticos. La desventaja de este método radica en que no puede desarrollarse la condrogénesis en cultivos a corto plazo y hay una dependencia excesiva en los fibroblastos situados en el lugar del implante para la síntesis del cartílago. El documento EP-A-739.631 presenta la producción de un material biológico que consiste en tejido cartilaginoso reconstituido mediante condrocitos en crecimiento sobre una lámina flexible de 1,5 mm de espesor de hueso natural desmineralizado. Esto, no obstante, será útil únicamente cuando el hueso no es autólogo, ya que cultivar hueso autólogo requiere un proceso de cirugía complicado y doloroso.

Los defectos de la superficie de la articulación pueden ser el resultado de diversas etiologías tales como procesos inflamatorios, neoplasias, sucesos post-traumáticos y degenerativos, etc. Sea cual fuere la causa, debido a su limitada capacidad de reparación, el cartílago cicatriza mal, implicando, en el mejor de los casos, la formación de alguna cicatriz tisular o de tejido fibrocartilaginoso. La reparación parcial de la superficie articular acaba produciendo osteoartritis y discapacidades funcionales graves. Basándose en la profundidad de la herida, se pueden definir dos tipos de defectos de la superficie articular: el osteocondral (o de espesor total) y el superficial (o de espesor parcial).

Los defectos de la superficie articular de tipo osteocondral (o de espesor total) incluyen daños en el cartílago articular, en el tejido óseo subcondral subyacente y en la capa calcificada de cartílago situada entre el cartílago articular y el hueso subcondral. Normalmente se presentan durante traumas graves de la articulación o durante las últimas etapas de enfermedades degenerativas de las articulaciones, por ejemplo en el caso de la osteoartritis. Dado que el tejido óseo subcondral está tanto inervado como vascularizado el daño a este tejido puede ser doloroso. Los defectos osteocondrales dependen del mecanismo extrínseco de reparación. La cicatrización extrínseca depende de elementos mesenquimales del hueso subcondral o tejidos relacionados con la articulación para participar en la formación de nuevo tejido conectivo, incluido el tejido esquelético. Este tejido de reparación puede experimentar cambios metaplásticos para formar fibrocartílago que, sin embargo, no presenta la misma composición bioquímica ni las mismas propiedades mecánicas que el cartílago articular normal o el hueso subcondral y degenera con el uso.

Las heridas superficiales o de grosor parcial del cartílago articular que no penetran en el hueso subcondral dependen del mecanismo intrínseco de reparación. En seguida después de la herida superficial, los condrocitos adyacentes a las superficies lesionadas presentan un breve arranque de actividad mitótica asociada con un incremento de la actividad metabólica y la síntesis de matriz. A pesar de estos intentos de reparación, no se aprecia un incremento en la cantidad de matriz de cartílago y el proceso de reparación raramente resulta efectivo en la curación de los defectos. A pesar de que algunas veces resultan inicialmente indoloros, los defectos de espesor parcial a menudo degeneran en una osteoartritis de la articulación implicada.

La reparación de los defectos del cartílago articular con suspensiones de condrocitos se ha venido realizando en una variedad de modelos animales y actualmente se emplea en humanos (Brittberg, M. et al., N. Eng. J. Med. 1994, 331:889-95). Condrocitos autólogos obtenidos a partir de una área no afectada de la articulación son extraídos, cultivados in vitro en presencia de suero autólogo y posteriormente inyectados bajo una capa periosteal suturada para cubrir el defecto del cartílago. Se ha podido comprobar que este procedimiento conlleva al menos una mejoría sintomática. Este prometedor método todavía presenta un amplio margen para la mejora, ya que se conoce que la expansión in vitro de los condrocitos acaba produciendo, después de un número limitado de divisiones celulares, la pérdida de su estabilidad fenotípica (definida como la capacidad de los condrocitos para formar cartílago hialino tanto in vitro como in vivo) haciendo que la suspensión celular a inyectar sea poco fiable.

Tres métodos alternativos han sido desarrollados en un intento de mejorar el índice de éxitos en el tratamiento de los cartílagos articulares de los mamíferos. En el primer método, matrices sintéticas transportadoras son impregnadas con condrocitos y después implantadas en el defecto del cartílago donde ellos producen y secretan componentes de la matriz extracelular para formar cartílago articular en el lugar del defecto. Una cierta variedad de matrices sintéticas transportadoras han sido empleadas hasta la fecha e incluyen geles de colágeno tridimensional (por ejemplo, la patente U.S. nº. 4.846.835), geles de fibrina-trombina reconstituida (por ejemplo, las patentes U.S. nºs. 4.642.120; 5.053.050 y 4.904.259), matrices de polímero sintético que contienen polianhídrido, poliortoéster, ácido poliglicólico y copolímeros de los mismos (Patente U.S. nº. 5.041.138), y polímeros basados en el ácido hialurónico. Una vez se ha obtenido una población de condrocitos multiplicada mediante mitosis, las células pueden ser implantadas tanto en el mismo individuo del cual se obtuvieron las células originales (implante autólogo) como en otro individuo (implante heterólogo). Además, el implante heterólogo permite el uso de condrocitos obtenidos a partir de individuos relacionados o no de la misma especie (alogénico), o a partir de una especie diferente (xenogénico). Alternativamente, los condrocitos pueden ser obtenidos a partir de una línea celular duradera consolidada que puede ser tanto alogénica como xenogénica.

El implante autólogo requiere que los condrocitos sean cultivados a partir de una área no afectada de la superficie articular del paciente y después multiplicados en un cultivo in vitro hasta un número o densidad suficiente para un implante efectivo. La cantidad de tiempo requerido para esta multiplicación suficiente, sin embargo, puede impedir el uso efectivo de un cultivo autólogo y que algunas reconstrucciones de cartílago han de efectuarse inmediatamente o muy poco tiempo después de que ha tenido lugar la lesión traumática. Otra limitación radica en el potencial mitótico de las células, ya que existe un límite en el número de veces que una célula puede multiplicarse y la cantidad final de células producidas para terapia puede ser limitada. Además, allí donde una afección articular debilitante grave causa una degradación general del tejido cartilaginoso en todo el cuerpo del paciente, por ejemplo en gente mayor, puede encontrarse muy poco cartílago no afectado disponible a partir del cual iniciar un cultivo de condrocitos. Por otra parte, la introducción de condrocitos heterólogos en un paciente puede estimular una respuesta inmune no deseada dirigida contra el material implantado, conduciéndonos a un rechazo potencial del tejido cartilaginoso recién formado e injertado. Además, el implante heterólogo implica el riesgo de transmisión al paciente de agente(s) infeccioso(s) presentes en el tejido o línea celular.

Además, cuando se emplean matrices sintéticas transportadoras, el neo-cartílago puede formarse alrededor de la periferia del implante impidiendo de ese modo la integración del implante en el defecto del cartílago. La observación de la formación y desarrollo del cartílago sintético resultante in situ es difícil de llevar a cabo y normalmente implica un examen artroscópico o de articulación abierta. Es más, los implantes que contienen componentes de polímeros sintéticos pueden ser inadecuados para reparar defectos en el cartílago de dimensiones considerables ya que la hidrólisis del polímero in situ inhibe la formación del cartílago y/o su integración en el defecto.

En el segundo método, el defecto se rellena con una matriz biocompatible y biodegradable que contiene factores de crecimiento quimiotácticos y mitogénicos para estimular la afluencia de células progenitoras de los condrocitos en la matriz in situ. Óptimamente, las matrices contienen poros de dimensiones suficientes como para permitir la afluencia celular y la proliferación de los progenitores de los condrocitos en el interior de la matriz. La matriz también puede contener factores de crecimiento para estimular la diferenciación de las células progenitoras de los condrocitos las cuales a su vez secretan los componentes de la matriz extracelular para formar cartílago en el lugar del defecto in situ (por ejemplo, las patentes U.S. nºs. 5.206.023 y 5.270.300 y EP-A-530.804). Este método, sin embargo, ocasiona problemas parecidos a los asociados con el primer método mencionado anteriormente. Además, hasta la fecha no se dispone de datos sobre si el cartílago articular contiene progenitores condrocíticos para defectos de espesor parcial.

En el tercer método, los condrocitos pueden ser cultivados y multiplicados in vitro para formar material sintético de tipo cartilaginoso que es implantado posteriormente en el defecto del cartílago. Éste presenta la ventaja sobre los métodos previos de que el desarrollo del material sintético cartilaginoso puede ser observado mediante la caracterización bioquímica y morfológica, previa al implante. El crecimiento de células condrogénicas puede conseguirse tanto de una manera dependiente de anclaje como de una manera independiente de anclaje. En esta última, las células condrogénicas pueden ser cultivadas como colonias en un gel de agarosa. Hasta el momento, solamente han sido preparadas pequeñas piezas de tejido cartilaginoso de forma indefinida empleando este método. Además, el cartílago resultante permanece incrustado en una matriz de gel haciendo que este método sea menos apropiado para el implante en mamíferos. Alternativamente, en otro método independiente de anclaje, los condrocitos pueden ser cultivados como colonias en un cultivo en suspensión. Sin embargo, las partículas resultantes que contienen material sintético de tipo cartilaginoso son habitualmente pequeñas y de forma indefinida y, por lo tanto, inapropiadas para el implante y reparación de un defecto del cartílago articular predeterminado. Esto produciría como resultado varias pequeñas piezas de cartílago, completamente separadas la una de la otra y, muy lejos de encontrarse integradas entre ellas y con el tejido cartilaginoso circundante.

En el método dependiente de anclaje, los cultivos primarios de condrocitos aislados del tejido primario se hacen crecer como monocapas unidas a la superficie de un matraz de cultivo celular (por ejemplo, la patente U.S. nº. 4.356.261). Las células primarias formadas directamente a partir del tejido del explante continúan siendo capaces de producir y secretar componentes extracelulares característicos del cartílago natural, especialmente colágeno tipo II y proteoglicanos sulfatados. Sin embargo, es bien conocido que durante los procesos in vitro de multiplicación de condrocitos en monocapa tiene lugar un proceso de desdiferenciación, y de ese modo pierden su capacidad para organizar cartílago hialino in vivo. Por lo tanto, hasta ahora no ha sido posible preparar parches grandes de cartílago articular a partir de pequeñas piezas de tejido obtenido en la biopsia empleando los procesos dependientes de anclaje de la patente U.S. nº. 4.356.261.

A fin de resolver los problemas anteriormente mencionados, la patente U.S. nº. 5.723.331 ofrece un método para preparar in vitro grandes cantidades de cartílago sintético a partir de muestras pequeñas del tejido obtenido mediante biopsia que, basándose en el descubrimiento que las células condrogénicas pueden ser extraídas a partir de una variedad de tejidos, por ejemplo cartílago pre-existente, el tejido pericondral o médula ósea, y multiplicadas in vitro previamente a la formación del cartílago, incluye células condrogénicas denudadas de una primera siembra (por ejemplo extraídas de un tejido disgregado enzimática o mecánicamente), multiplicadas ex vivo, en un receptáculo de forma predeterminada que tiene un contacto celular, una superficie adhesiva para las células, y luego cultivando las células condrogénicas multiplicadas en el recipiente durante el tiempo suficiente como para permitir que las células secreten una matriz extracelular y de este modo formar un parche de cartílago sintético tridimensional de células multi-estratificadas.

Otra desventaja de estos métodos consiste en que los condrocitos han de ser obtenidos a partir del paciente, normalmente mediante una biopsia, multiplicados en cultivo y luego implantados en una matriz. Esto resulta relativamente fácil en animales de laboratorio, pero presenta problemas logísticos mayores en humanos, donde la propia biopsia, necesaria para proporcionar las células para la reparación de un defecto, crea otro defecto. Además, si el defecto incluye una parte del hueso subyacente, éste no se ve corregido mediante el uso de condrocitos que ya se encuentran diferenciados y no van a formar nuevo hueso. Se requiere el hueso para sostener el nuevo cartílago.

El uso de células madre mesenquimales también ha sido propuesto para la reparación de diversos tejidos incluyendo el cartílago. Las células madre mesenquimales son una fuente alternativa potencial de células productoras de cartílago. Normalmente son reconocidas como células pluripotentes con la capacidad de dividirse varias veces para producir células descendientes que finalmente pueden originar tejidos conectivos, incluyendo cartílago, hueso, tendones, ligamentos, estroma medular. Por definición, no están limitadas a un número fijo de divisiones mitóticas.

Las células madre se definen como células indiferenciadas, que pueden dividirse sin límite para producir células que son células madre o células que se diferencian más para dar lugar a diferentes tipos de células progenitoras, incluyendo células madre mesenquimales. Dichas células madre mesenquimales son células pluripotenciales con la capacidad de diferenciarse en cualquiera de los tipos específicos de mesénquima o tejido conectivo, incluyendo los tejidos esqueléticos. Las células madre mesenquimales fueron extraídas de medula ósea u otras fuentes tales como periostio, placenta, cordón umbilical, piel y sangre (por ejemplo, en la patente U.S. nº. 5.811.094). Las células madre mesenquimales pluripotentes han sido también extraídas a partir de músculo (Paté et al., Proc. 49th Ann Sess. Forum Fundamental Surg. Problems Oct. 1993, 587-9), corazón (Dalton et al., J. Ceil Biol. 1993, 119 R202) y tejido granular (Lucas et al., J. Ceil. Biochem. 1993, 122 R212). La pluripotencialidad fue demostrada empleando un inductor no específico, la dexametasona, que provoca la diferenciación de las células madres en condrocitos (cartílago), osteoblastos (hueso), miotúbulos (músculo), adipocitos (tejido adiposo) y células de tejido conectivo.

Desgraciadamente, a pesar de que sería altamente deseable poseer células madre que pudieran ser obtenidas con facilidad a partir de un músculo o una biopsia de piel, cultivadas para producir un gran número, y luego empleadas como fuente de condrocitos, osteoblastos o miocitos, no existe un inductor específico conocido de las células madre mesenquimales que origine solamente cartílago. Estudios in vitro en los cuales se consigue la diferenciación dan lugar a una mezcla de tipos celulares. En las patentes U.S. nºs. 5.226.914 y 5.197.985 se sembraron las células en bloques de cerámica porosa, implantados subcutáneamente en ratones desnudos, dieron lugar principalmente a hueso. Sin embargo, la patente U.S. nº. 5.906.934 revela que bajo condiciones muy específicas las células madre mesenquimales en un transportador polimérico adecuado (tal como una malla de ácido poliglicólico) implantadas en un defecto de un cartílago o hueso van a diferenciarse para formar cartílago y/o hueso, como corresponda. También la patente U.S. nº. 5.919.702 revela que células progenitoras de condrocitos extraídas a partir de fuentes de cordón umbilical, por ejemplo gelatina de Wharton, y luego cultivadas, pueden dar lugar a condrocitos que pueden producir tejido cartilaginoso. También en otro intento de evitar los inconvenientes de las técnicas actuales de reparación de hueso y cartílago que causan hemorragias e implican el empleo de material no autólogo mecánicamente débil, la patente U.S. nº. 5.866.415 sugiere tratar los defectos en cartílago o hueso con un material biológico obtenido mediante la unión in vitro de células formadoras de cartílago o hueso a un periostio de tamaño suficiente como para contener el defecto.

Los documentos WO/96/41523 y WO/96/41620 describen el empleo del receptor de crecimiento fibroblástico FGFR3 como marcador para células mesenquimales progenitoras de esqueleto. Dichas células, sin embargo, expresan el FGFR3 que ha sido establecido por inventores actuales para indicar la diferenciación en células no pluripotentes del tipo precondroblasto en humanos. Por tanto, las células seleccionadas por estos métodos conocidos difieren de las células precursoras seleccionadas según la presente invención.

La Figura 1 presenta esquemáticamente la cascada jerárquica de células en el proceso de diferenciación, empezando a partir de células madre mesenquimales indiferenciadas hasta las células del esqueleto completamente diferenciadas. La patente U.S. nº. 5.811.094 describe métodos para identificar, aislar selectivamente y enriquecer mediante expansión en cultivo células madre mesenquimales. Dicha patente no proporciona métodos para aislar, purificar y expandir en cultivo células precursoras del esqueleto, métodos que son el propósito de la presente invención. Nuestros esfuerzos se centran en las células precursoras del esqueleto, tal como de aquí en adelante las vamos a definir, desentrañando la cascada molecular de acontecimientos subyacentes a las vías de diferenciación que nos llevan a las células especializadas de los tejidos esqueléticos, prestando atención específica a la generación de condrocitos estables. Se asume que los condrocitos estables forman cartílago estable in vivo y/o in vitro bajo las condiciones adecuadas. Con el cartílago estable se supone que cualquier signo de formación de hueso permanece ausente, incluso en largos períodos de tiempo.

El factor transformador del crecimiento beta ("TGF-\beta") hace referencia a una familia de proteínas diméricas relacionadas que regulan el crecimiento y diferenciación de diversos tipos celulares. Miembros de esta familia incluyen TGF-\beta 1, TGF-\beta 2, TGF-\beta 3, TGF-\beta 4, TGF-\beta 5, proteínas morfogénicas ("MP") tales como la MP-121 y la MP-52, inhibinas / activinas (tal como se presenta en EP-A-222.491), proteínas osteogénicas ("OP"), proteínas morfogenéticas de hueso (en lo sucesivo indicadas como "BMP"), factores de crecimiento / diferenciación("GDF") tales como GDF-5, GDF-6, GDF-9 y nodal. El TGF-\beta fue descrito primeramente por sus efectos en la proliferación celular. Tanto estimulaba el crecimiento independiente de anclaje de los fibroblastos de riñón de rata como inhibía el crecimiento de las células de riñón de mono. Se ha demostrado que los miembros de la familia del TGF-\beta tienen efectos biológicos muy diversos, por ejemplo, regulan la formación del hueso, inducen las células musculares a producir macromoléculas específicas de cartílago, inhiben el crecimiento de células progenitoras hematopoyéticas primigenias, células T, células B, queratinocitos de ratón, y diversas líneas celulares de cáncer humano. Los miembros de la familia del TGF-\beta aumentan la síntesis y secreción de colágeno y fibronectina, aceleran la curación de heridas por incisión, suprimen la síntesis de caseína en explantes de glándula mamaria de ratón, inhiben la síntesis de ADN en las células epiteliales de hígado de rata, estimulan la producción de proteoglicanos vinculados con el BFGF, modulan la fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico ("EFG") y la proliferación de células del carcinoma epidermoide y pueden provocar la apoptosis en células epiteliales uterinas, hepatocitos cultivados e hígado experimentando una regresión. Los TGF-\beta pueden proporcionar cardio-protección contra las heridas por reperfusión inhibiendo la adherencia de los neutrófilos al endotelio y protegen contra enfermedades de autoinmunidad experimental en ratones. En general, las proteínas de la familia TGF-\beta son factores de crecimiento multifuncionales y hormonalmente activos y también desempeñan actividades biológicas relacionadas tales como la atracción quimiotáctica celular, la estimulación de la diferenciación celular y de las capacidades de producción de tejidos. Las diferencias en su estructura y en su afinidad a receptores ocasionan variaciones considerables en su función biológica exacta.

En contraste con los informes precedentes sobre la capacidad del TGF-\beta para inducir la producción de macromoléculas específicas de cartílago en células musculares y condrocitos, se descubrió que el TGF-\beta actuaba de forma sinergística con el factor de crecimiento de los fibroblastos para inhibir la síntesis de colágeno tipo II en condrocitos esternales de pollo y en condrocitos de rata. De hecho, el TGF-\beta se ha revelado como el inhibidor prototípico de la proliferación de los tipos celulares más normales in vitro así como in vivo, presentando una remarcable diversidad de actividad biológica. El TGF-\beta 1 ha sido purificado a partir de plaquetas sanguíneas tanto humana como porcinas y actualmente se encuentra disponible TGF-\beta 1 recombinante.

Entre la subfamilia de las BMP, las estructuras de la BMP-1 hasta la BMP-13 han sido descritas previamente. Las actividades inductivas especiales de estas proteínas, junto con su presencia en el hueso, sugiere que son importantes reguladoras de los procesos de reparación ósea y pueden verse implicadas en el mantenimiento normal del tejido óseo. Recientemente se ha demostrado que la subfamilia de proteínas relacionada con la BMP-12, incluyendo la BMP-13 y la MP52 (ver por ejemplo WO93/16099 y la patente U.S. nº. 5.658.882) resulta útil en mezclas para la inducción de la formación y reparación de tejido del tipo tendón / ligamento. La patente U.S. nº. 5.902.785 revela que las proteínas relacionadas con la BMP-12 resultan especialmente efectivas en la inducción de tejido cartilaginoso y que la BMP-9 es útil para aumentar la síntesis de matriz de proteoglicano y, por lo tanto, para el mantenimiento del tejido cartilaginoso. También describe mezclas que incluyen una proteína relacionada con la BMP-12 e incluyendo adicionalmente una o más proteínas TGF-\beta de las que se ha comprobado su capacidad osteogénica, preferentemente las BMP-2, -4, -5, -6 y/o BMP-7, útiles para la regeneración de múltiples tipos de tejido (por ejemplo en la superficie de contacto o unión entre tejidos) y especialmente útiles para el tratamiento del cartílago articular en el que la superficie articular, cartílago, hueso subcondral y/o la superficie de contacto entre el cartílago y el hueso necesita ser reparada. La misma patente describe posteriormente mezclas que incluyen una proteína relacionada con la BMP-12 junto con una proteína útil para el mantenimiento de condrocitos o tejido cartilaginoso, tal como la BMP-9, siendo dichas mezclas especialmente útiles para la inducción y mantenimiento de tejido cartilaginoso en un lugar necesitado de la reparación del cartílago tal como un defecto cartilaginoso articular.

El documento WO96/14335 presenta, mediante el empleo ARNm preparado a partir de cartílago articular recién formado, el aislamiento de dos miembros de la familia BMP, designados como proteínas morfogenéticas derivadas del cartílago -1 y -2 (CDMP-1, CDMP-2). Más específicamente, el documento WO96/14335 presenta un extracto de cartílago purificado que estimula la formación de cartílago local cuando se combina con una matriz y se implanta en un mamífero, siendo producido dicho extracto mediante la obtención de tejido cartilaginoso, la homogeneización de dicho tejido cartilaginoso en presencia de agentes caotrópicos bajo condiciones que permitan la separación de las proteínas de los proteoglicanos, separación de dichas proteínas de dichos proteoglicanos, y finalmente la obtención de dichas proteínas. También presenta una molécula de ADN aislada que codifica una proteína con actividad condrogénica in vivo pero básicamente sin actividad osteogénica in vivo. El papel de la CDMP-1 como reguladora del crecimiento esquelético está hoy en día bien documentado. Storm et al. (1994) en Nature 368, 639-43 y Chang et al. (1994) en J.Biol.Chem. 269, 28227-34 establecieron independientemente que la CDMP-1 estaba mapada cerca del locus del braquipodismo en el cromosoma 2 en los ratones y podría verse envuelta en el fenotipo del braquipodismo. También las pautas de expresión de las CDMP sugieren que efectúan un papel importante para estos genes en la morfogénesis articular. El documento WO98/59035 también presenta un método para mantener un fenotipo cartilaginoso en condrocitos in vitro, incluyendo el cultivo de condrocitos en un medio libre de suero que contiene una CDMP y/o BMP. La Tabla 1 presenta un resumen de los miembros de la superfamilia BMP en mamíferos (ReddiAH, Nuture Biotechnol. 1998, 16: 247-52)

TABLA 1

100

Se ha demostrado que otras familias de factores de crecimiento estaban implicadas en la diferenciación y mantenimiento del cartílago, tales como los factores de crecimiento de los fibroblastos (FGFs), los cuales son una familia de factores de crecimiento polipeptídicos implicados en varias actividades. Se sabe que uno de sus receptores, el receptor FGF 3 (FGFR-3) (Keegan K. et al., 1991 Proc. Nat. Acad. Sci. 88; 1095-99) juega un papel crucial en la condrogénesis. Mutaciones puntuales en el gen fgfr3 a partir de las cuales se obtiene una proteína constitutivamente activa independiente del ligando (lo cual significa que la señalización del FGF está siempre activa, incluso en ausencia del ligando) causan anormalidades esqueléticas como acondroplasia y displasia tanatofórica.

Tal como se hacía referencia en las páginas 3 y 4 a pesar de que el transplante de condrocitos autólogos ("ACT") está convirtiéndose en una técnica ampliamente aceptada para reparar los defectos de la superficie articular ("JSD"), todavía presenta algunos inconvenientes. Más en detalle, este procedimiento implica la expansión in vitro - en presencia de suero autólogo - de condrocitos autólogos obtenidos a partir de una área no afectada de la articulación, seguido por el implante de la suspensión de condrocitos bajo una capa de periostio suturada para cerrar el defecto de la superficie articular. Resulta necesaria la expansión celular para obtener a partir de una pequeña biopsia de cartílago un número suficiente de células para reparar el defecto del cartílago. Sin embargo, resulta bien conocido, tal como se ha explicado anteriormente, que la expansión in vitro de los condrocitos ocasiona la desdiferenciación celular. Esto implica que la expansión de los condrocitos paga el precio de la pérdida de estabilidad fenotípica. No obstante, resulta imprescindible un control de calidad de los condrocitos multiplicados para ser usados en el ACT. Al final de la multiplicación celular, la población de condrocitos está compuesta por algunas células que mantienen su estabilidad fenotípica y otras que todavía pueden proliferar pero que no contribuirán más en la reparación del cartílago. A fin de obtener una suspensión celular coherente para el ACT, resulta deseable seleccionar condrocitos estables dentro de la población celular multiplicada. Los condrocitos son células esqueléticas con la capacidad de crecer en cultivos de agarosa independientes de anclaje. La capacidad de los condrocitos para crecer en condiciones independientes de anclaje es crítica para que estas células puedan sobrevivir y organizar tejido cartilaginoso una vez inyectadas como suspensión celular para la reparación de los JSD, pero probablemente no es ésta la única característica fenotípica requerida.

Por lo tanto, existe la necesidad en esta materia de identificar y seleccionar una fuente fácilmente accesible y expandible de células precursoras de esqueleto pluripotentes. También hay la necesidad en esta materia de resolver los diversos problemas encontrados en los métodos conocidos de reparación de cartílago. También hay la necesidad en esta materia de desarrollar técnicas de reparación de tejidos conectivos, incluyendo cartílago, por ejemplo, para problemas médicos tales como la artritis reumatoide y la osteoartritis, y una necesidad constatada desde hace mucho de un control de calidad sobre las poblaciones de condrocitos empleadas para dichos propósitos. Hay un número de sugerencias en la técnica anterior sobre que algunas células madre mesenquemáticas podrían originar específicamente cartílago o, en caso de que sea necesario, otros tejidos conectivos. Por ejemplo, la médula ósea contiene poblaciones de células madre mesenquimales pluripotentes que presentan la capacidad de diferenciarse en una amplia gama de tipos celulares de las líneas mesenquemática, hematopoyética y estromal. También se sabe que las células madre mesenquimales cultivadas in vitro pueden ser inducidas a diferenciarse en hueso o cartílago in vivo e in vitro, dependiendo del ambiente tisular o el medio de cultivo en el cual se ubican las células. Hasta la fecha, sin embargo, muy pocos marcadores celulares comunes o antígenos de diferenciación han sido identificados. Ejemplos de dichos marcadores incluyen antígenos Ly-6 para osteoblastos murinos (ver Horowitz et al. (1994) en Endocrinology, 135, 1032-43) y CD34 para tipos celulares hematopoyéticos humanos. Por otro lado, el periostio y la médula ósea son considerados como las fuentes más comunes de células precursoras con potencial osteogénico. Más específicamente, se ha demostrado que las células de la médula ósea, cuando son extraídas y expandidas mediante el método de cultivo de Friedenstein, originarán hueso, cartílago y tejido fibroso cuando sean implantadas. Sin embargo, Friedenstein en Calcif. Tiss. Int. (1995) 56 (S):S 17 admitió que obstáculos tales como la necesidad de cultivar por varios ciclos y desarrollar un método para transplantar dichas células, tienen que ser superados antes de que pueda confirmarse la utilidad clínica de este descubrimiento. Por lo tanto, hay una necesidad en la materia de identificar adecuadamente las células precursoras de esqueleto pluripotentes en una amplia gama de fuentes fácilmente accesibles y expandibles. Estas metas y otros propósitos se consiguen mediante los siguientes objetivos de la presente invención.

Sumario de la invención

Un primer objetivo de la presente invención es la identificación y caracterización de células precursoras de esqueleto en una amplia gama de fuentes fácilmente accesibles y expandibles. Los tejidos fácilmente accesibles incluyen, entre otros, el periostio, la médula ósea y la membrana sinovial. La solución a este problema según la presente invención consiste en utilizar un conjunto de marcadores moleculares. Estos marcadores moleculares pueden ser tanto marcadores positivos, indicando células precursoras que son pluripotentes como marcadores negativos indicando que las células se han diferenciado y ya no son pluripotentes. La ausencia de un marcador negativo puede ser empleada como marcador positivo. Un segundo objetivo de la presente invención es el empleo de dichas células precursoras de esqueleto y los marcadores moleculares para la reparación de una amplia gama de tejidos conectivos. Un tercer objetivo de la presente invención consiste en el empleo de dichas células precursoras de esqueleto como fuente de factores transformadores del crecimiento ("TGF") vinculadas a la estabilidad fenotípica de determinada población celular implicada en determinada vía de diferenciación, como por ejemplo, miembros de la familia TGF-\beta que están asociados positivamente con la estabilidad fenotípica de los condrocitos. Un cuarto objetivo de la presente invención consiste en el empleo de dichas células precursoras de esqueleto y dichos marcadores moleculares como células productoras de matriz en procedimientos de ingeniería de tejidos. Un quinto objetivo de la presente invención consiste en el co-implante de células precursoras de esqueleto y condrocitos expandidos para la reparación de cartílago in vivo.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática de la cascada jerárquica de células en las vías de diferenciación.

La Figura 2 es una fotografía mostrando que las células precursoras de esqueleto expresan la CDMP-1.

La Figura 3 muestra como el fenotipo de las células precursoras de esqueleto no depende del número de pases celulares o de la edad del donante. Las células derivadas del periostio en P5 y P15 de cuatro donantes de diferentes edades presentan un perfil molecular comparable tal como se ha calculado mediante una RT-PCR semi-cuantitativa.

La Figura 4 consiste en dos fotografías histológicas mostrando que las células precursoras de esqueleto pueden crecer de manera independiente de anclaje manteniendo su estabilidad fenotípica in vivo.

La Figura 5 es una fotografía mostrando que el implante recuperado de músculo de ratón está formado por células humanas.

La Figura 6 consiste en fotografías que demuestran que la diferenciación condrogénica se obtiene con independencia de la edad de los donantes.

La Figura 7 presenta fotografías histológicas de tejido cartilaginoso obtenido in vitro a partir de células humanas precursoras de esqueleto.

La Figura 8 A-F presenta análisis histoquímicos e inmunohistoquímicos de micromasas tanto sin tratar (A, B; H) como tratadas con TGF-\beta1.

La Figura 9 muestra la dinámica de la expresión génica mediante RT-PCR durante la condrogénesis en células precursoras de esqueleto marcadas.

Descripción detallada de la invención

Los términos empleados en toda esta presentación se definen tal como sigue:

Estabilidad de los condrocitos

La capacidad de una suspensión celular (tanto obtenida a partir de tejido cartilaginoso como a partir de cualquier otro tejido que contenga células con potencial condrogénico) para producir in vitro y/o mediante inyección en un mamífero (in vivo), tal como un ratón inmunodeficiente, en un rango de tiempo de 2 a 3 semanas, un implante de cartílago auténtico (hialino) sin signos de invasión vascular o formación de hueso endocondral.

Condrogénico

La capacidad de producir o estimular el crecimiento del cartílago, aplicada a los condrocitos y a células que se diferencian en condrocitos. El término también se aplica a determinados factores de crecimiento tales como TGF-\beta, que desencadena el crecimiento del cartílago.

Co-expresión

En el contexto de la presente invención entendemos por co-expresión que se expresa un factor cuando se expresa otro factor o marcador en el interior o la superficie de una célula. Por ejemplo, cuando una proteína morfogénica es empleada como un marcador y más concretamente la proteína morfogénica derivada del cartílago CDMP-1 o un homólogo de la misma se expresa(n), la co-expresión requiere que un marcador co-expresado simplemente esté presente o se exprese cuando el marcador morgofénico se expresa. Por lo tanto, el factor está vinculado con la misma vía de diferenciación post-natal específica como la proteína morfogénica con quien se co-expresa, tal como la CDMP-1. De forma preferente se regula por incremento o disminución junto con el marcador. Se regulará por disminución, por ejemplo, cuando las células precursoras experimenten una diferenciación hacia el fenotipo condrocítico. Dicho marcador de coexpresión más adelante se expresa preferiblemente a niveles detectables. Dicho factor co-expresado puede ser un marcador de superficie celular reconocible, detectable mediante anticuerpos policlonales o monoclonales y/o ligandos específicos. El factor co-expresado también puede incluir cualquier homólogo funcional o estructural de la CDMP-1.

Tejido conectivo

Tal como es utilizado aquí, un tejido cualquiera de toda una variedad de tejidos estructurales del cuerpo de un mamífero que incluye hueso, cartílago, ligamento, tendón, menisco, músculo, dermis, hiperdermis y cápsula articular.

Diferenciación

Un proceso biológico por el cual las células no especializadas primitivas mediante una serie de divisiones celulares dan lugar a una progenie que presenta una función o funciones cada vez más especializada(s).

Heterólogo

Se refiere a cualquier gen, promotor, polipéptido u otro tipo de molécula que no se encuentra presente de manera natural, no innata a una versión salvaje de una célula referenciada. Por ejemplo, un gen de la galactosidasa de E. coli\beta se considera "heterólogo" para una célula precursora del esqueleto humana.

Célula madre mesenquimal

Una célula primitiva que tiene la capacidad de autorregeneración y de diferenciación mediante una serie de líneas celulares para producir células descendientes con una amplia variedad fenotípica incluyendo tejidos conectivos, estroma de médula ósea, adipocitos, dermis y músculo.

Proteína marcadora

Un polipéptido que distingue una célula (o grupo de células) de otra célula (o grupo de células) en una población celular. Por ejemplo, un polipéptido que se expresa (tanto naturalmente como artificialmente, por ejemplo, incorporado mediante ingeniería genética) en la superficie de células precursoras del esqueleto pero no de otras células de una población celular actúa como proteína marcadora para las células precursoras del esqueleto. Habitualmente, la proteína marcadora es un antígeno celular de superficie, como por ejemplo un receptor de la hormona del crecimiento, de manera que pueden utilizarse anticuerpos que se enlazan con la proteína marcadora en métodos de selección celular, por ejemplo, para producir una población celular rica en células que expresan la proteína marcadora. Alternativamente, las proteínas intracelulares pueden ser empleadas como proteínas marcadoras. Por ejemplo, proteínas fluorescentes o luminiscentes, tales como proteína fluorescente verde, por ejemplo la ecuorina (proteína fluorescente verde de la Aequoria victoria) (Tanahashi et al. (1990), Gene 96:249-255) puede ser utilizada como proteína marcadora y puede facilitar la selección celular, por ejemplo, mediante FACS. También se pueden emplear enzimas, dado que la actividad enzimática puede ser detectada. Por ejemplo, la \beta-galactosidasa es muy apropiada para ser usada como proteína marcadora; este enzima puede ser detectado mediante la introducción en la célula de uno o más sustratos que liberan producto(s) fluorescente(s) por escisión por parte del enzima (disponible como producto de, por ejemplo, Molecular Probes). Otro enzima adecuado es la catecol 2,3 dioxigenasa, que viene codificada por xy/E de Pseudomonas putída (Domen et al. (1986), Anal. Biochem. 155: 379-384).

Vinculado operativamente

Conexión de una secuencia codificante y una o más secuencias reguladoras (por ejemplo, un promotor) de manera que se permite la expresión genética cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras transcripcionales) se enlazan con la(s) secuencia(s) reguladora(s).

Osteogénico

La capacidad de potenciar o generar la producción de hueso. El término puede ser aplicado a osteoblastos con la capacidad de potenciar el crecimiento del hueso, o células que ellas mismas poseen la capacidad de diferenciarse en osteoblastos. El término también puede aplicarse a factores de crecimiento con la capacidad de potenciar el crecimiento del hueso.

Estabilidad fenotípica

La capacidad, por parte de una célula cualquiera, de mantener la capacidad de organizar o reorganizar, in vivo o in vitro, la estructura de un tejido específico, tanto el tejido original de donde se han extraído las células como de un tejido diferente donde las células han sido forzadas a formarse bajo condiciones específicas.

Célula precursora

Una célula con la capacidad de diferenciarse para realizar una función específica.

Promotor

Una secuencia de nucleótidos suficiente para dirigir y/o regular la transcripción de una secuencia codificante. En la invención se incluyen aquellos promotores que son inducibles mediante señales o agentes externos; dichos elementos pueden ser localizados en las regiones no traducidas (UTR) 5' o 3' y en los intrones del gen nativo. Un "promotor CDMP-1" es cualquier secuencia localizada en cis que es suficiente para dirigir y/o regular la expresión de la CDMP-1 en células precursoras de esqueleto. Se sabe que en construcciones genéticas que contienen un promotor CDMP-1 (por ejemplo, aquellas construcciones que también contienen un gen indicador o un gen que codifica una proteína marcadora), variaciones menores (por ejemplo, delecciones, mutaciones puntuales y similares) pueden ser realizadas en la secuencia del promotor CDMP-1 sin que pierda la capacidad de ser activo en las células precursoras de esqueleto e inactiva en cualquier otra célula. Por lo tanto, los promotores CDMP-1 con dichas variaciones menores sin que se pierda la especificidad de célula precursora de esqueleto del promotor se encuentran englobados en el término "promotor CDMP-1". Además, múltiples copias del promotor CDMP-1, dispuestas conjuntamente, pueden ser utilizadas para dirigir la expresión del gen.

Relevante

En el presente contexto, relevante se refiere al hecho de que el producto del gen empleado para identificar células precursoras de esqueleto, ha de ser un producto vinculado a la vía esquelética post-natal tal como lo hace la CDMP-1.

Gen indicador

Cualquier gen cuya expresión puede ser monitorizada. Habitualmente los genes indicadores empleados incluyen, por ejemplo, genes que codifican la cloranfenicol acetiltransferasa, fosfatasa alcalina, luciferasa y proteína fluorescente verde.

Célula precursora de esqueleto

Una célula que ya no es indeferenciada, pero que todavía se encuentra orientada hacia cualquiera de las vías de diferenciación de los tejidos esqueléticos. La célula es todavía pluripotente y puede diferenciarse en cualquiera de los tejidos conectivos o en un subgrupo de los mismos.

Tejidos esqueléticos

Los tejidos esqueléticos incluyen los tejidos de los dientes, hueso, cartílago, menisco, ligamentos, discos intervertebrales y músculo.

Cartílago estable

El cartílago que no acaba convirtiéndose en hueso, es decir, cartílago que carece de cualquier signo de vascularización. El caso contrario al cartílago estable sería el cartílago transitorio que al final acaba convirtiéndose en tejido óseo. En el contexto de la presente invención, el cartílago será considerado como estable si, incluso después de por ejemplo siete semanas, no se presenta ningún signo de formación de hueso.

Célula madre

Célula precursora pluripotente con la capacidad de autorrenovación y de generar una variedad de tipos celulares diferenciados. Las auténticas células madre pueden dividirse indefinidamente. Entendemos por células madre embrionarias las células pluripotentes de cariotipo normal que derivan de la masa celular interna de un mamífero o blastocisto.

Descripción detallada

La presente invención puede ser descrita principalmente con referencia a las células precursoras del esqueleto pero la invención no se limita únicamente a ello. La presente invención se relaciona con el uso de marcadores embrionarios que reconocen que determinadas células precursoras han empezado una vía de diferenciación postnatal. Se cree que la presente invención no se encuentra limitada de ninguna manera a un tipo celular dado que se encuentran asociadas a organismos con células diferenciadas. Constituyen ejemplos de ello los animales, especialmente los mamíferos. La presente invención resulta especialmente útil respecto a las células precursoras de los mamíferos, en especial las células precursoras de esqueleto, y más en particular las células precursoras de esqueleto en humanos y caballos, pero no se encuentra limitada a los mismos. La presente invención emplea marcadores embrionarios celulares que se consideran disponibles en el interior o en la superficie de todas las células diferenciadas o células precursoras de dichas células diferenciadas en cualquier forma de vida diferenciada. Se considera que dichos marcadores embrionarios son una parte necesaria o bien se encuentran asociados con una parte necesaria de la embriogénesis a medida que el organismo en desarrollo, durante la diferenciación, también presenta la necesidad de reconocer células diferenciadas o parcialmente diferenciadas y esto ha de conseguirse bioquímicamente. Por consiguiente, la presente invención tiene amplias y diversas aplicaciones.

La presente invención se basa en descubrimientos sorprendentes que tienen importancia general en el desarrollo de todas las formas de vida diferenciadas, en particular en mamíferos tales como los humanos o los caballos.

Primero, las células precursoras de esqueleto humanas pluripotentes pueden ser identificadas de forma fiable mediante un conjunto de marcadores moleculares. Los marcadores pueden ser tanto positivos, indicando la presencia de células precursoras pluripotentes, como negativos, indicando que las células se han diferenciado y ya no son células precursoras. La ausencia de marcadores negativos puede ser considerada como un marcador positivo. Especialmente, la presente invención incluye células que carecen de un marcador negativo tal como el FGFR3 y presentan un marcador positivo. Segundo, dichas células precursoras de esqueleto, bajo condiciones regulares y adecuadas son capaces de producir y reparar diversos tejidos conectivos incluyendo el cartílago cuando son utilizadas tanto solas como en asociación con condrocitos. Y tercero, dichas células precursoras de esqueleto pueden ser inducidas a expresar genes vinculados a tejidos específicos.

Se tiene evidencia de que la expresión de la CDMP-1 faculta una determinada población celular expandida en un cultivo como células precursoras de esqueleto. Éste es un resultado inesperado, ya que la CDMP-1 siempre ha sido conocida por potenciar la diferenciación condrogénica y nunca vinculada al fenotipo de las células precursoras de esqueleto. Sea cual fuere la fuente, las células son expandidas en cultivo y evaluadas mediante análisis de RT-PCR para la expresión de la CDMP-1. Solamente las células que expresen la CDMP-1 pueden ser procesadas satisfactoriamente para ser dirigidas hacia una vía concreta de diferenciación de cualquier tejido conectivo esquelético, incluyendo el cartílago. De forma interesante, siempre que una célula precursora de esqueleto, definida por la expresión de la CDMP-1 en la RT-PCR, experimenta la diferenciación hacia un fenotipo condrocítico, entrando en una vía de diferenciación determinada, siempre se ve precedida por la regulación por disminución de la expresión de la CDMP-1.

Una primera forma de realización de la presente invención consiste en el uso de la proteína morfogenética derivada del cartílago CDMP-1 o un factor de crecimiento transformante que tenga al menos un 80% de homología con la CDMP-1 como marcador positivo de las células precursoras de esqueleto de cualquier parte del cuerpo de un mamífero o el empleo de un factor o marcador que es co-expresado o es co-detectable con la CDMP-1. Dicho de otra manera, independientemente de cual sea la fuente de células, la CDMP-1 o una homóloga de la misma o un marcador o factor co-expresado es selectivamente expresada por las células precursoras de esqueleto y regulada por disminución tan pronto como dichas células precursoras de esqueleto experimentan un paso de diferenciación hacia cualquier línea celular madura. Por ejemplo, cuando las células precursoras de esqueleto se diferencian en condrocitos, la expresión de marcadores de cartílago tales como el colágeno tipo II, el FGFR3, el colágeno tipo IX, o el colágeno tipo XI, este hecho se ve siempre precedido por la desaparición de la CDMP-1. Marcadores tales como el FGFR3, el colágeno tipo II, el colágeno tipo IX, el colágeno tipo XI, o marcadores o factores co-expresados o co-detectables con estos marcadores, son marcadores negativos. Productos genéticos relevantes co-expresados con la CDMP-1 o un gen relacionado con la CDMP-1 pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención para identificar positivamente células precursoras de esqueleto en una población de referencia. La ausencia de un marcador negativo puede utilizarse como marcador positivo según la presente invención. Este primer modo de realización se basa en la caracterización de las células precursoras de esqueleto humanas obtenidas a partir de donantes de diversas edades (comprendidas entre 9 y 95 años) después de un gran número de pases con marcadores moleculares. Utilizando un análisis mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa ("RT-PCR"), se observó que las células precursoras de esqueleto permanecen fenotípicamente estables durante los pases seriados, manteniendo su fenotipo y su potencial de diferenciación incluso después de haber sido congeladas en nitrógeno líquido durante 18 meses. La identificación de células positivas a la CDMP-1 puede efectuarse a nivel de ADN, ARN o proteína, directamente mediante el gen o los productos del gen de la CDMP-1 o indirectamente mediante homólogos funcionales del mismo o mediante factores o marcadores co-expresados con la CDMP-1.

Un segundo método de realización de la presente invención consiste en la utilización a fondo de reactivos, ligandos y/o anticuerpos que reconocen factores específicos co-expresados con las proteínas morfogénicas en cuestión, como marcadores de superficie celular. Dichos marcadores pueden ser empleados para ordenar un reservorio de células de mamífero heterogéneas, subpoblaciones de células precursoras de esqueleto para un procesamiento a fondo mediante el tratamiento adecuado, tal como diferenciación a fondo a través del linaje específico, por ejemplo, diferenciación en condrocitos y, preferiblemente, en condrocitos estables. La selección celular se basa en la utilización de proteínas marcadoras autólogas o heterólogas. La proteína marcadora heteróloga puede ser vírica, procariótica, eucariota o de origen sintético. La proteína marcadora puede ser un marcador que cuando se expresa produce un nivel de supervivencia preferente en aquellas células que expresan el marcador, siendo la resistencia antibiótica un ejemplo de ello. El marcador seleccionable también puede ser un marcador cuya expresión produce la muerte preferente de aquellas células que expresan el marcador. En este caso el marcador se expresa en otras células distintas de las células precursoras de esqueleto. Lo más habitual, no obstante, es que la proteína marcadora sea un polipéptido que se expresa en la superficie celular. Ejemplos de proteínas marcadoras adecuadas incluyen la CD8, la \beta-galactosidasa, la catecol 2,3 dioxigenasa, ecuorina (proteína fluorescente verde de la Aequorea victoria), y la hemaglutinina del virus de la gripe. Los genes que codifican esta y otras proteínas marcadoras son bien conocidas en la especialidad. Los métodos de selección celular convencionales (por ejemplo, selección celular activada por fluorescencia) (FACS)) pueden emplearse para aislar aquellas células en las cuales el marcador de superficie celular, co-detectable con la CDMP-1 o un homólogo de la misma, se expresa. Entonces se usa un anticuerpo etiquetado con fluorescencia para unirse específicamente al polipéptido de la superficie celular empleado como marcador heterólogo. Alternativamente, un anticuerpo no etiquetado puede ser usado para unirse al polipéptido de la superficie celular, y un segundo anticuerpo etiquetado puede ser utilizado para unirse específicamente al primer anticuerpo. Las células precursoras marcadas con fluorescencia pueden ser separadas de otras células de la muestra mediante FACS, por ejemplo. Otras técnicas, como es el uso de glóbulos magnéticos conjugados con la proteína que se enlazan selectivamente con células en concreto, también pueden ser usadas. Se encuentran comercialmente disponibles los equipos de reactivos apropiados. Generalmente, dichos equipos emplean un anticuerpo etiquetado (por ejemplo, un anticuerpo etiquetado con biotina) para unirse a la proteína marcadora de la superficie celular. Las células unidas con el anticuerpo entran en contacto con la proteína conjugada con el glóbulo magnético, donde la porción proteica de la proteína conjugada con el glóbulo se enlaza específicamente con el anticuerpo etiquetado. Por ejemplo, una estreptavidina conjugada con el glóbulo magnético puede ser utilizada para unirse a un anticuerpo etiquetado con biotina para dar lugar a un complejo que contiene la proteína conjugada con el glóbulo magnético, el anticuerpo etiquetado y la célula que expresa la proteína marcadora. Dichos complejos pueden ser separados de las otras células mediante la adhesión temporal del complejo a un imán y separando las células adheridas de las otras células (es decir, una población de células reducida formada, por ejemplo, por células precursoras de esqueleto). Los glóbulos magnéticos que se unen mediante enlace covalente a un anticuerpo secundario se encuentran disponibles comercialmente. Otros métodos de separación de células basados en anticuerpos, como el empleo de la cromatografía de afinidad o la retención de células que expresan las proteínas particulares de la superficie celular mediante placas de Petri revestidas con anticuerpos dirigidos contra las últimas, también son conocidos en la especialidad y pueden ser empleadas en la invención. Un práctico equipo de reactivos para la separación de células por afinidad, "CEPRATE LC" se encuentra comercialmente disponible y puede ser obtenido como producto de CellPro (CellPro, Inc. Bothell, WA 98921). Los métodos para aumentar los niveles de anticuerpos IgG o IgM son bien conocidos en la técnica y están por ejemplo descritos en Ausubel et al. (ed.), Short Protocols in Molecular Biology, 4ª edición, John Wiley & Sons, New York, concretamente en las unidades 11.3, 11.4 y 11.5, In Paul (ed.), Fundamental immunology, 4ª edición, Lippincott-Raven Publishers, New York, concretamente en el capítulo 4, página 101 ef; de St. Groth y Scheidegger (1980), J. Immunol Methods 35: 1-21; French et al. (1986), Immunol Today 7: 344-346; Langone y Vunakis (1986), Methods in Enzymology, vol. 121, Immunochemical Techniques, Part 1, Hybridoma technology and monoclonal antibodies. Orlando: Academic Press; Hämmerling et al. (1981); Monoclonal antibodies and T-cell hybridomas. Perspectives and technical advances. Amsterdam: Elsevier/North-Holland Biomedical Press; Yokoyama (1995) In Coligan et al (ed.), Current protocolo in immunology, Wiley & Sons, New York, 2.5.1-2.2.17; Kohler and Milstein (1975), Nature 256: 495-497. También es posible seleccionar células precursoras de esqueleto mediante genes indicadores bajo el control de un promotor que se expresa solamente en las células precursoras o, al contrario, en todas las células excepto las consideradas células precursoras. Dichas construcciones indicadoras pueden ser utilizadas para, por ejemplo, el estudio y verificación de si las células con una partícula promotora que es activa poseen las propiedades deseadas. Una construcción génica (construcción indicadora) puede, por consiguiente, ser introducida en la población celular de referencia. La construcción genética incluye entonces, por ejemplo, un promotor de CDMP-1 que está vinculado operativamente a un gen que codifica una proteína marcadora. La proteína marcadora es una proteína heteróloga para las células salvajes de la población de referencia y que preferiblemente no se expresa en la población de referencia salvaje y más en concreto en las células precursoras de esqueleto. Las células que expresan la proteína marcadora (es decir, células en las cuales el promotor de la CDMP-1 está activo) son entonces aisladas a fin de producir una población de células enriquecida con células condrogénicas precursoras de esqueleto. Por supuesto, quitando las células que expresan la CDMP-1 de la población celular, este método puede ser empleado para producir una población de células reducida en células condrogénicas precursoras de esqueleto. Los métodos para crear la construcción indicadora y para introducirla en la población de referencia son conocidos en la especialidad. Por ejemplo, las células obtenidas a partir del periostio, membrana sinovial o médula ósea, pueden ser transducidas mediante un plásmido en el cual la expresión de marcadores seleccionables dominantes convencionales tales como aquellas que proporcionan la resistencia a antibióticos, por ejemplo, fosfotransferasa de neomicina, de luminiscencia o fluorescencia o proteínas tales como la luciferasa o proteína fluorescente verde (por ejemplo, ecuorina), de otras enzimas detectables tal como la \beta-glucuronidasa, o de proteínas de la superficie celular tales como la CD8, se realiza bajo el control del promotor de la CDMP-1 humana. Un supuesto promotor de la CDMP-1 se ha dado a conocer en Sugiura T, et al., Biochem Biophys Res Comm 1999, 263:707-13. Además, clones de BAC aislados a partir del locus de la CDMP-1 (CDF-5) de ratón, fueron modificados mediante recombinación homóloga en bacterias. Las construcciones resultantes produjeron la expresión de genes indicadores exógenos en ratones en desarrollo de ratones transgénicos, Rountree R. et al, conferencia Internacional sobre Proteínas Morfogenéticas de Hueso, del 7 al 11 de junio del 2000. La cantidad de G418 que mataría las células no transformadas varia según las propiedades específicas de las células empleadas. En general, la concentración se encuentra entre 100 y 1.000 \mug/ml de G418 activa.

Los métodos adecuados de selección son bien conocidos en la especialidad. Dichos protocolos de selección o enriquecimiento evitarán la desagradable eventualidad de la aparición de otros tejidos contaminantes a partir del reservorio de células precursoras de esqueleto. Una vez enriquecidas, dichas células pueden ser conducidas a cualquier vía de diferenciación tal como la vía condrogénica, mediante el cultivo bajo condiciones adecuadas y coherentes con o sin factores de crecimiento / morfógenos para acabar con una población celular homogénea, tal como condrocitos fenotípicamente estables. En particular, la presente invención presenta como el periostio, la médula ósea y la membrana sinovial contienen células precursoras de esqueleto que expresan la CDMP-1 y que pueden ser dirigidas hacia la condrogénesis empleando las condiciones de cultivo adecuados. A diferencia de los anteriores estudios de Nakahara et al. (1991) J. Orthop. Res. 9:456-76, la presente invención muestra que con independencia de la edad del donante, las células humanas precursoras de esqueleto resultan fácilmente accesibles y expandibles y pueden ser inducidas de forma consistente a diferenciarse en condrocitos.

Un tercer modo de realización de la presente invención consiste en la utilización de las células precursoras de esqueleto para producir o reparar tejido conectivo en general, incluyendo tráquea, válvulas cardíacas, cuerdas vocales y similares, marcadas positivamente, por ejemplo marcadas con la CDMP-1. Este uso se basa en la capacidad de dichas células precursoras de esqueleto para mantener el potencial intrínseco de diferenciación en linajes múltiples, lo cual hace de ellas unos buenos candidatos para los protocolos de ingeniería de tejidos. El aislamiento, la expansión y la clasificación de poblaciones celulares empleando los marcadores específicos de la invención nos conducen al reservorio celular adecuado para dichos procedimientos de reparación. Más específicamente, empleando células precursoras de esqueleto marcadas positivamente, por ejemplo marcadas con la CDMP-1, se han desarrollado las condiciones de cultivo adecuadas que nos llevan a la inducción y formación de cartílago in vitro. En la presente invención, se ha planteado la formación de "cartílago estable" entre otros aspectos. El cartílago estable in vivo se obtiene, por ejemplo a partir de células jóvenes derivadas del periostio (PDCs). Con PDCs jóvenes queremos decir células que provienen de individuos menores de 20 años, en concreto menores de 16 y más en concreto menores de 10. Es importante darse cuenta de que el tratamiento de las células precursoras de esqueleto en cultivo en monocapa con diversos factores de crecimiento no acaba produciendo ninguna respuesta en términos de osteogénesis y/o condrogénesis, tal como se puede comprobar mediante análisis con la RT-PCR para marcadores de hueso y cartílago, mediante la tinción del azul alcián y la de von Kossa, y mediante la actividad de la fosfatasa alcalina. Para la inducción satisfactoria de cartílago, parece ser necesario cultivar células precursoras de esqueleto marcadas con la CDMP-1 a una densidad celular muy alta, por ejemplo a una densidad de al menos 10^{5} células/ml, y preferiblemente el llamado cultivo en micromasa a una densidad celular de aproximadamente 2 \cdot 10^{7} células/ml. Para la inducción satisfactoria del tejido conectivo, es aconsejable añadir (in vitro) o administrar (in vivo) un factor que estimula la diferenciación de las células precursoras de esqueleto en el tipo de tejido conectivo que ha de ser producido o reparado, por ejemplo un factor-\beta de crecimiento transformante tal como TGF-\beta 1, TGF-\beta 2 o TGF-\beta 3, preferiblemente en una relación de 10 ng/ml en un medio químicamente definido libre de suero, o juntamente con el cultivo expandido de células precursoras de esqueleto marcadas con la CDMP-1. Por ejemplo, las PDCs humanas que provienen de donantes jóvenes presentan actividad condrogénica espontánea, pero la inducción de una respuesta condrogénica en células de mayor edad fue posible mediante la combinación del cultivo en micromasa con, por ejemplo el tratamiento con TGF-\beta 1, con independencia del número de pases celulares o la edad de los donantes seleccionados.

Un cuarto modo de realización de la presente invención consiste en el empleo de células precursoras de esqueleto marcadas positivamente, por ejemplo marcadas con la CDMP-1, como fuente de factores de crecimiento, más específicamente los Factores - \beta de Crecimiento Transformante ("TGF-\beta") y Proteínas Morfogenéticas de Hueso ("BMP") de las que se conoce su importancia en la estimulación y mantenimiento del fenotipo del cartílago. Esto puede ayudar por ejemplo a la expansión de los condrocitos in vivo, evitando los condrocitos formados a partir de la desdiferenciación mediante pases seriados. Esto puede ser útil para el procedimiento de expansión in vitro de condrocitos humanos para transplantar empleando un medio derivado de las células autólogas precursoras de esqueleto.

Un quinto modo de realización consiste en el uso de células precursoras de esqueleto positivamente marcadas, por ejemplo, marcadas con la CDMP-1, como células productoras de matriz. De acuerdo con esta forma de realización, las células humanas precursoras de esqueleto tratadas con los factores de crecimiento adecuados (como en el tercer modo de realización descrito anteriormente) son capaces de producir matriz extracelular parecida al cartílago hialino. Dichas células tratadas pueden ser, por lo tanto, empleadas como suministro de matriz para el acomplamiento y crecimiento de condrocitos en la reparación de defectos de la superficie articular ("JSD"), y para procedimientos de ingeniería de tejidos del esqueleto cartilaginoso en general, por ejemplo, para el tratamiento de la estenosis subglótica, traqueomalacia, condromalacia patelar, osteoartritis y lesiones traumáticas, por ejemplo empleando polímeros bio-absorbibles (tales como el ácido poliláctico o el ácido poliglicólico) aplicados localmente para rellenar la lesión. En dicha utilización, dichas células tratadas proporcionan el soporte adecuado para el acoplamiento y crecimiento celular, eventualmente revestido o mezclado con factores de crecimiento. Dichas combinaciones de células, matrices de polímeros y factores de crecimiento también serán de utilidad en cirugía reconstructiva ortopédica. Una alternativa a este modo de realización es un método para mejorar el implante de un dispositivo prostético en tejido conectivo, incluyendo la implantación de un dispositivo prostético que tiene adheridas al mismo células precursoras de esqueleto bajo condiciones adecuadas para la diferenciación de las células en el tejido conectivo deseado.

Un sexto modo de realización de la presente invención es el co-implante de células precursoras del esqueleto marcadas positivamente, por ejemplo marcadas con la CDMP-1, y condrocitos para la reparación de los JSD y procedimientos de ingeniería de tejidos del esqueleto cartilaginosos en general. Este modo de realización se basa en la sorprendente observación de que la adición de células precursoras de esqueleto expandidas a una solución de condrocitos para la reparación de cartílago tiene un impacto espectacular en la capacidad de la formación de cartílago por parte de los condrocitos, tanto in vitro como in vivo. Dicho co-implante es capaz de reducir de manera considerable el número de condrocitos necesitados para la reparación satisfactoria de los JSD y también significa una notable mejora en la cantidad de cartílago producido. Estas observaciones nos permiten emplear condrocitos aislados frescos o condrocitos mínimamente expandidos en vez de las dañadas células condrocíticas expandidas in vitro, por lo tanto, salvando el problema relacionado con la pérdida de capacidad de formación de cartílago por parte de los condrocitos resultantes de la expansión in vitro. Tal como es bien conocido en la técnica, la expansión celular in vitro es de hecho un paso crítico en el transplante autólogo de condrocitos y puede dificultar la efectividad de las células inyectadas en la producción del cartílago.

Además de los numerosas utilizaciones previamente citadas, las células precursoras de esqueleto marcadas positivamente, por ejemplo marcadas con la CDMP-1, de la presente invención tienen la ventaja de que pueden ser almacenadas hasta al menos 18 meses en bancos de células bajo condiciones de almacenaje que incluyen una temperatura inferior a los -100ºC, por ejemplo en nitrógeno líquido, y en caso de necesidad, descongeladas, tratadas adecuadamente e implantadas en el mismo individuo allí donde se desea el nuevo tejido conectivo. Por ejemplo, los cultivos PDC de tripsina liberada fueron crioconservados en nitrógeno líquido en DMEM con FBS al 20% y dimetilsulfóxido al 10% (DMSO; Sigma). Esta capacidad de almacenaje de células resulta sorprendente, ya que otras células incluyendo los condrocitos pierden su fenotipo cuando son almacenadas bajo las mismas condiciones incluso durante cortos intervalos de tiempo.

Las células precursoras de esqueleto marcadas positivamente, por ejemplo marcadas con la CDMP-1, pueden ser empleadas para transplantes heterólogos en casos de compatibilidad con el HLA (Antígeno Leucocitario Humano) o para tejidos donde el riesgo de rechazo es mínimo y puede ser fácilmente evitado farmacéuticamente.

Las células marcadas positivamente según la presente invención también pueden carecer de un marcador negativo. Los métodos de selección celular descritos anteriormente pueden ser empleados para producir células precursoras sustancialmente puras.

Una mejor comprensión de la presente invención podrá obtenerse mediante los siguientes ejemplos ilustrativos.

Ejemplo 1 Aislamiento de las células precursoras de esqueleto del periostio, la membrana sinovial y la médula ósea

El periostio obtenido a partir de donantes humanos de diversas edades fue obtenido asépticamente de la tibia medial proximal, tanto en un periodo comprendido entre las 12 y las 24 horas después de la muerte o a partir de pacientes a los que se les ha realizado una intervención quirúrgica de sustitución de rodilla. El periostio fue lavado dos veces con la Solución Salina Equilibrada de Hank ("HBSS") disponible como producto de Life Technologies, complementado con una solución antibiótica y antimicótica (100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de amfotericina B, también disponibles como productos de Life Technologies), molidas muy finamente, y diferidas con colagenasa al 0,2% (Life Technologies) en un medio con un alto nivel de glucosa Dulbecco's Modified Eagle Medium ("DMEM") (Life Technologies) que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS) (disponible como producto de BioWhittaker) y antibióticos. Después de incubarlas toda la noche a 37ºC, las células del periostio fueron separadas mediante centrigufación, lavadas dos veces, resuspendidas en DMEM con alto contenido en glucosa complementado con FBS al 10% y antibióticos, sembradas en un frasco de cultivo T25 y se les permitió pegarse durante 4 días. Después de este período de tiempo, las células no adherentes fueron extraídas mediante un cambio de medio.

La membrana sinovial obtenida a partir de donantes humanos de diversas edades fue extraída a partir de articulaciones de rodilla durante las 24 horas posteriores a la muerte, y procesadas siguiendo el mismo protocolo descrito anteriormente para el periostio.

Muestras de médula ósea heparinizada obtenidas a partir de donantes humanos de edades diversas fueron disueltas con HBSS, dispuestas en capas en Lymphoprep (1,077 g/ml, disponible como producto de Nycomed, Oslo) y centrifugadas a 300g durante 20 minutos. Las células de la interfase del gradiente fueron seleccionadas, lavadas tres veces en HBSS y resuspendidas en un medio de cultivo.

Ejemplo 2 Expansión celular in vitro

Las células aisladas según el ejemplo 1 fueron cultivadas en monocapa en DMEM con alto contenido en glucosa conteniendo FBS al 10% y antibióticos a 37ºC en aire con un 95% de humedad y un 5% de CO_{2}, remplazándose el medio cada 3 días. Después de un período de entre 10 y 20 días de cultivo primario, cuando las células escasamente pegadas consiguieron confluir, fueron lavadas dos veces con solución salina de fosfato (PBS) libre de calcio y magnesio y cultivadas mediante tratamiento con EDTA-tripsina (tripsina al 0,25%, 1 mM de EDTA; Life Technologies), y recubiertas con una disolución de 1:4 para el primer subcultivo. Los pases celulares continuaron de la misma forma con una disolución de 1:4 cada 6-12 días y preferiblemente cada 7-8 días cuando las células alcanzaron la confluencia.

Ejemplo 3 CDMP-1 como marcador de las células precursoras de esqueleto

Las células extraídas del periostio tal como se describe en el ejemplo 1, la membrana sinovial y la médula ósea, y expandidas como se describe en el ejemplo 2, fueron caracterizadas en distintos pases mediante el análisis con la RT-PCR tal como se describe de aquí en adelante junto con otras células tales como los fibroblastos de la piel humana. Se encontró que la CDMP-1 solamente había sido expresada por poblaciones de células precursoras de esqueleto en todos los pases examinados hasta 18 y no por otras poblaciones celulares. En efecto, comprobamos que solamente las células expandidas en el cultivo marcado con la CDMP-1 bajo condiciones específicas pueden diferenciarse, por ejemplo, hacia la condrogénesis, mientras que las células CDMP-1 negativas, bajo las mismas condiciones, no son capaces de emprender ninguna vía de diferenciación esquelética. Además, la aparición de marcadores de cartílago va siempre precedida por la regulación por disminución de la expresión de la CDMP-1.

La Figura 2A muestra el análisis mediante la RT-PCR para la expresión de la CDMP-1 normalizada para la expresión de la \beta-actina en diferentes poblaciones celulares numeradas del 1 a 4:

\bullet Calle 1: células humanas precursoras de esqueleto derivadas del periostio;

\bullet Calle 2: células humanas precursoras de esqueleto derivadas de la membrana sinovial;

\bullet Calle 3: células humanas precursoras de esqueleto derivadas de la médula ósea;

\bullet Calle 4: fibroblastos de piel humana.

La Figura 2B muestra el análisis mediante la RT-PCR para la CDMP-1 y colágeno tipo II, normalizada para la expresión de la \beta-actina en fibroblastos de piel humana (calles 1 y 2) y células humanas precursoras de esqueleto derivadas del periostio (calles 3 y 4) en cultivo en micromasa, tanto sin tratar (calles 1 y 3) como tratadas durante 6 días con 10 ng/ml TGF-\beta1 (calles 2 y 4).

\bullet Calle 1: fibroblastos de piel humana sin tratar;

\bullet Calle 2: fibroblastos de piel humana tratados con 10 ng/ml TGF-\beta1;

\bullet Calle 3: células humanas precursoras de esqueleto sin tratar;

\bullet Calle 4: células humanas precursoras de esqueleto tratadas con 10 ng/ml TGF-\beta 1.

Extracción del ARN y análisis semi-cuantitativo mediante la RT-PCR

El ARN total fue extraído y tratado con ADNasa a partir de células humanas empleando el equipo de reactivos S.N.A.P.^{TM} (disponible como producto de Invitrogen). Un \mug de ARN total transcrito inversamente para producir ADNc con un oligo(dT)- cebador empleando Thermoscript (Life Technologies). La reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") se efectuó en un volumen de 10 \mul añadiendo 1 \mul de cada 60 \mul del ADNc como cadena molde, empleando Taq ADN polimerasa (disponible como producto de Eurogenetech). Cuando se conoció la secuencia del gen, se diseñaron cebadores en los distintos exones con el fin de distinguir el ADNc de la contaminación con ADN genómico. Antes del análisis con la PCR, los ADNc fueron ecualizados para la expresión del gen de mantenimiento de la \beta-actina. La PCR para la \beta-actina humana se efectuó parando la reacción en cada ciclo empezando a partir del 17º ciclo con el fin de asegurar que la amplificación por PCR se encontraba aún en la fase linear. Se sometieron los productos de la PCR a electroforesis en un gel de agarosa al 1% en un tampón de electroforesis TBE (Tris-borato/EDTA), teñido con bromuro de etidio, visualizado mediante transiluminación con rayos UV y analizado mediante densiometría empleando el software de Image Master (disponible como producto de Pharmacia-Biotech). Los ADNc fueron diluidos de acuerdo con la intensidad relativa de las bandas. Para descartar que la \beta-actina fuese regulada de manera diferente en las distintas muestras a comparar, el mismo análisis se realizó también para la expresión de otro gen de mantenimiento, la glucosa-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Después de la ecualización para la \beta-actina y la GAPDH, todas las muestras fueron analizadas simultáneamente para varios genes, incluyendo aquéllos implicados en la condrogénesis y el mantenimiento del cartílago. Para cada gen, se optimizó el ciclo a fin de que la amplificación se encontrara todavía en fase lineal cuando la PCR fuera parada para todas las muestras.

Ejemplo 4 Determinación de la estabilidad fenotípica de las células precursoras de esqueleto durante los pases seriados

En cada pase del procedimiento de expansión del ejemplo 2, las células precursoras de esqueleto procedentes de donantes de diversas edades fueron cultivadas para la extracción del ARN total y análisis mediante la RT-PCR para la expresión de 40 genes, tal como se ha descrito anteriormente. Su perfil molecular permanece estable durante los pases seriados hasta al menos 15 pases, indicando que éstas pueden ser ampliamente expandidas sin dificultar su propiedad de precursores de esqueleto.

La Figura 3 muestra cómo el fenotipo de las células precursoras de esqueleto no depende del número de pases o de la edad del donante. Las células derivadas del periostio en P5 y P15 de cuatro donantes de diferentes edades presentan un perfil molecular comparable tal como se analizó mediante la RT-PCR semi-cuantitativa. La figura muestra solamente un panel representativo de los genes examinados. En la última calle, el control negativo de agua Milli-Q. Las cadenas moldes están ecualizadas para la expresión de la \beta-actina.

Ejemplo 5 Crecimiento independiente de anclaje de células precursoras de esqueleto

El crecimiento independiente de anclaje de las células precursoras de esqueleto del ejemplo 2 fue analizado in vitro con un cultivo en agarosa e in vivo mediante la inyección intramuscular en ratones desnudos inmunodeficientes, tal como se explica más adelante. La inyección de células adultas precursoras de esqueleto en ratones desnudos produjo la formación de un tejido fibrocartilaginoso inmaduro y mal diferenciado de origen humano, tal como se demostró mediante hibridación in situ para la secuencia alu específica para humanos.

Cultivo en agarosa

El cultivo en agarosa se realizó mediante el método de Benya et al., Cell (1982) 30:215-24. Durante un breve período de tiempo, placas de Petri de 35 mm^{2} fueron revestidas con agarosa al 1% de T_{m} estéril de nivel alto (disponible como producto de Life Technologies) y colocada a nivel superficial a temperatura ambiente para que solidificase. Las células fueron liberadas mediante tripsinización, contadas mediante la prueba de exclusión del azul tripán y resupendidas con agarosa al 0,5% de T_{m} de nivel bajo (Life Technologies) en DMEM a una densidad de 2 x 10^{4} células/ml. 0,5 ml de esta suspensión celular fueron añadidos a cada una de las placas de Petri. Después de enfriar a 4ºC durante 15 minutos, se añadió DMEM conteniendo FBS al 10%, antibióticos y 50 \mug/ml de ácido ascórbico (Sigma), y las placas de Petri fueron colocadas a 37ºC en aire humidificado al 95% y un 5% de CO_{2}. El medio fue remplazado cada día.

Prueba in vivo

Las células precursoras de esqueleto en los distintos pases del ejemplo 2 fueron liberadas mediante tratamiento con tripsina, lavadas dos veces en PBS estéril y contadas mediante la prueba de exclusión del azul tripán. 5 x 10^{6} células viables fueron resuspendidas en un volumen de 50-100 \mul de PBS, e inyectadas por vía intramuscular en el muslo de ratones hembra inmunodeficiente de 4 a 5 semanas de edad. Los animales fueron sacrificados después de 3 semanas mediante dislocación cervical y los muslos diseccionados para recuperar el implante. Los implantes fueron pesados, y o bien congelados (snap-frozen) y almacenados en nitrógeno líquido, o bien fijados durante 4 horas en formaldehído fresco al 4%. Después de su fijación se procedió a la inclusión de las muestras en parafina, se cortaron con un grosor de 5 \mum y se tiñeron según los protocolos estándar (azul alcián a un pH 2,5, azul de toluidina, tricroma de Masson, safranina O) (Manual de Técnicas Histológicas). La Figura 4 muestra los implantes extraídos de ratones desnudos tres semanas después de la inyección intramuscular de 5 x 10^{6} células humanas adultas precursoras de esqueleto derivadas del periostio. El tricroma de Masson (4A) y la tinción suave con azul alcián a un pH de 2,5 (4B) presenta un tejido fibroso mal diferenciado que recordaban altamente al periostio. Esto indica que las células precursoras de esqueleto pueden crecer in vivo de manera independiente de anclaje, manteniendo su estabilidad fenotípica.

La hibridación in situ para secuencias alu específicas humanas se efectuó en los implantes extraídos para la identificación de células humanas tal como se explica a continuación.

Hibridación in situ para repeticiones alu específicas de humanos

La hibridación in situ se efectuó tal como se describe en Kuznetsov et al. (1987), J. Bone Min. Res. 12:1335-47). La Figura 4 muestra que el tejido fibroso obtenido de la prueba in vivo es de origen humano y no del ratón huésped.

Ejemplo 6 Formación de cartílago in vitro con células precursoras de esqueleto

La inducción y formación de cartílago in vitro, demostrado mediante tinción con azul alcián y análisis molecular para marcadores de cartílago mediante RT-PCR, se consiguió combinando cultivos en micromasa de las células precursoras de esqueleto del ejemplo 2 a una densidad celular muy alta y el tratamiento de dichas células con TGF-\beta 1, o TGF-\beta 2, o TGF-\beta 3 (R&D systems), disueltas en 4 mM de HC1 conteniendo 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA; Serva) y añadidas al medio de cultivo a una concentración final de 10 ng/ml. La diferenciación condrogénica de las células precursoras de esqueleto fue obtenida en todos los donantes, independientemente del número de pases celulares o de la edad del donante, ver Figuras 6A y B. La aplicación del TGF-\beta 1 a las células precursoras de esqueleto obtenidas de donantes de 24, 30, 62 y 78 años de edad generaron condrocitos que presentaban colágeno tipo II. Bajo las mismas condiciones la proteína recombinante morfogénica de hueso humano (BMP)-2, BMP-4 (Genetics Institute), BMP-7 o GDF-5 (CDMP-1; Creative Biomolecules) disuelta en acetonitrilo al 45%, ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% y añadida al medio de cultivo a concentraciones comprendidas entre los 100 y los 300 ng/ml, demostró ser mucho menos efectiva que las TGF-\beta.

Cultivos en micromasa

Las células precursoras de esqueleto expandidas obtenidas de donantes humanos de distintas edades a diferentes pases del ejemplo 2 fueron liberadas mediante tratamiento con tripsina, contadas mediante la prueba de exclusión del azul tripán, y resuspendidas en DMEM complementado con FBS al 10% y antibióticos a una densidad celular de 2 x 10^{7} células viables por ml. Los cultivos en micromasa fueron obtenidos pipeteando 20 \mul de gotas controladas de la suspensión celular en pocillos individuales de placas de 24 pocillos. Después de que se dejara que las células se unieran sin medio de cultivo durante 3 horas, se añadió el medio químicamente definido libre de suero sin factores de crecimiento. El día de la introducción en el cultivo en micromasa fue designado como día 0. Los factores de crecimiento humanos TGF-\beta 1, o TGF-\beta 2 o TGF-\beta 3 (disponibles como productos de R & D Systems) se disolvieron en 4 mM de HC1 conteniendo 1 mg/ml de albúmina de suero bovino ("BSA") y se añadieron al medio de cultivo a una concentración final de 10 ng/ml cada día empezando el día 1, cuando el medio de cultivo fue cambiado. Las mismas cantidades de 4 mM HCl conteniendo 1 mg/ml de BSA fueron añadidas a cultivos paralelos como controles. Los cultivos en micromasa fueron sembrados en diferentes períodos de tiempo para su análisis mediante RT-PCR y tinción con azul alcián, tal como se explica más adelante. Para poder ser comparados, los fibroblastos de piel humana fueron cultivados en idénticas condiciones.

Para los análisis histoquímicos e inmunohistoquímicos, se realizaron cultivos en micromasa tal como se describe más adelante.

Tinción con azul alcián in vitro

Las células fueron lavadas dos veces con PBS, fijadas en metanol durante una hora a -20ºC, lavadas con agua destilada y tratadas con azul alcián a pH 0,2 (azul alcián 8 GS al 0,5%, disponible como producto de Carl Roth, en 1 N HC1). El análisis cuantitativo se llevó a cabo extrayendo cultivos teñidos con azul alcián con 200 \mul de 6 M de guanidina-HC1 en agua Milli-Q durante 6 horas a temperatura ambiente. La densidad óptica de la tintura extraída fue medida a 630 nm empleando un Spectronic 2000 (Baush & Lomb). En paralelo, se emplearon fibroblastos de piel humana como control negativo y condrocitos articulares humanos como control positivo.

La Figura 7 muestra la tinción con azul alcián a pH 0,2 de las células humanas precursoras de esqueleto en cultivo en micromasa tanto sin tratar (7A) como tratadas durante 6 días con 10 ng/ml de TGF-\beta 1 (7B). Las muestras sin tratar no presentan coloración azul, mientras que las muestras tratadas han quedado fuertemente teñidas de azul.

Histología e inmunohistoquímica

Para los análisis histológicos e inmunohistoquímicos, se sembraron en micromasa 100 \mul de una suspensión de células precursoras de esqueleto en pocillos individuales en una placa de 12 pocillos. Las micromasas fueron tratadas con 10 ng/ml de TGF-\beta 1 o bien con la misma cantidad de solución transportadora de TGF-\beta 1 en el medio químicamente definido como libre de suero. Después de entre 15 y 20 días, las micromasas fueron extraídas de los pocillos, fijadas con formalina al 10%, incluida en parafina y cortada con un grosor de 5 pm. Para su evaluación histológica, las secciones fueron desparafinizadas y teñidas con azul de toluidina, safranina O o azul alcián a un pH de 2,5 siguiendo los protocolos estándar (Manual de Técnicas Histológicas). Al final se empleó rojo neutro para contracolorear los núcleos. Para el análisis inmunohistoquímico, las secciones fueron desparafinizadas y pre-digeridas con condroitinasa ABC (Sigma) a 50 mU/ml a temperatura ambiente durante una hora para facilitar el acceso de los anticuerpos. No se bloqueó ningún enlace de anticuerpo no específico incubando los cortes en BSA al 5% en PBS durante una hora. Entonces se incubaron las secciones durante una hora con anticuerpo monoclonal de ratón anti-colágeno tipo II humano (disponible como producto de Chemicon International), diluido 1:5 en BSA al 0,5% en PBS. La reactividad se detectó mediante microscopía de fluorescencia después de incubación durante una hora con un anticuerpo secundario Cy3 conjugado (IgG de cabra anti-ratón; Jackson ImmunoResearch Laboratories) que había sido diluido 1:500 en BSA al 0,5% en PBS. Los núcleos fueron contracoloreados con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol; ICN).

La Figura 8 muestra el análisis histoquímico e inmunohistoquímico de las micromasas tanto sin tratar (A, B, H) como tratadas con 10 ng/ml TGF-\beta 1 durante 15 días. Las células marcadas con la CDMP-1 en micromasa con TGF-\beta 1 experimentaron condrogénesis. La matriz cartilaginosa extracelular se tiñe con azul de toluidina (C) y azul alcián (D después de 7 días, F después de 15 días). La matriz cartilaginosa extracelular también presenta inmunotinción contra el colágeno tipo II (G, H después de 15 días).

Ejemplo 7 Mejora de la capacidad de los condrocitos para formar cartílago con células precursoras de esqueleto

Las interacciones de las células precursoras de esqueleto y los condrocitos articularos fueron examinadas tanto in vitro como in vivo. Para estos experimentos se emplearon las células humanas precursoras de esqueleto del ejemplo 2 y condrocitos articulares de cerdo, obtenidos tal como se indica más adelante, a fin de determinar la contribución relativa de los dos diferentes tipos celulares en el proceso de la formación del cartílago. Tal como fue explicado en el ejemplo 5, la contribución de las células humanas puede ser determinada realizando una hibridación in situ para genes alu específicos humanos. La adición de las células humanas precursoras de esqueleto del ejemplo 3 a los condrocitos articulares de cerdo produjo un impacto espectacular en el potencial de formación de cartílago de las células condrocíticas. En concreto, se observó un incremento en la cantidad de cartílago formado así como al mismo tiempo un descenso del umbral de la prueba in vivo (es decir, se requirió menos de un millón de células para la formación y organización del cartílago).

Obtención de condrocitos articulares de cerdo

El cartílago fue cortado en todo su espesor de las articulaciones metatarsal y metatarso-falangeal de un cerdo adulto y colocado en HBSS complementado con antibióticos. Después de dos lavados en HBSS conteniendo antibióticos durante 5 minutos a 37ºC, el cartílago fue molido finamente en una solución de colagenasa cruda al 0,2% en DMEM con alto nivel de glucosa conteniendo FBS al 10% y antibióticos. Después de incubarlas durante la noche a 37ºC, las células fueron lavadas dos veces en medio de cultivo (DMEM conteniendo FBS al 10% y antibióticos) y contados mediante la prueba de exclusión del azul tripán para regular el número de células viables.

Co-cultivo in vitro

Las células humanas precursoras de esqueleto pasadas en serie del ejemplo 2 y los condrocitos articulares frescos extraídos de cerdo fueron sembrados en cultivos en micromasa, empleando las condiciones descritas en el ejemplo 6, en el mismo pocillo de una placa con 12 pocillos sin añadir factores de crecimiento. Como controles, en un pocillo se pipetearon 2 micromasas de células humanas precursoras de esqueleto, y en otro pocillo 2 micromasas de condrocitos articulares de cerdo. En cada pocillo las 2 micromasas no se encontraban en contacto físico. Las micromasas fueron sembradas para el análisis histoquímico y los protocolos de tinción.

Co-implante in vivo

Las células humanas precursoras de esqueleto pasadas en serie del ejemplo 2 y los condrocitos articulares frescos extraídos de cerdo fueron inyectados vía intramuscular en ratones desnudos a diferentes ratios, tal como se indica en la tabla 2. Como controles, las células humanas precursoras de esqueleto y los condrocitos articulares de cerdo también fueron inyectados separadamente, empleando las mismas densidades celulares. Los animales fueron sacrificados después de 3 semanas mediante dislocación cervical. Los implantes fueron pesados y o bien congelados (snap-frozen) y almacenados en nitrógeno líquido, o bien fijados durante 4 horas en formaldehído fresco al 4%. Después de su fijación se procedió a la inclusión de las muestras en parafina, se cortaron con un grosor de 5 \mum y se tiñeron según los protocolos estándar (azul alcián a un pH 2,5, azul de toluidina, tricroma de Masson, safranina O) (Manual de técnicas histológicas). Se llevó a cabo la hibridación in situ para la secuencia alu específica de humanos para detectar y distinguir las células humanas precursoras de esqueleto de los condrocitos articulares de cerdo en el implante. Los resultados fueron los siguientes:

TABLA 2

200

Todos los números de células están expresados en millones.

La Figura 9 muestra la dinámica de la expresión genética determinada mediante RT-PCR durante la condrogénesis en las células precursoras de esqueleto marcadas con la CDMP-1.

: Calles 1 y 2: fibroblastos dérmicos humanos.

: Calle 3: células precursoras de esqueleto humano en monocapa.

: Calles 4-12: células humanas precursoras de esqueleto en micromasa. Puede observarse que la CDMP-1 está fuertemente regulada por disminución al entrar las células precursoras de esqueleto en condrogénesis y madurar hacia el fenotipo de condrocito. El fenotipo de condrocito maduro viene anunciado por la aparición del colágeno tipo II, el colágeno tipo X, el FGFR3 (factor de crecimiento 3 de los fibroblastos) y la BMP2. Un marcador positivo de acuerdo con la presente invención tal como el marcador de la CDMP-1 o un marcador o factor co-expresado o co-detectable con dicho marcador, y un marcador negativo tal como los marcadores condrocíticos del colágeno tipo II, colágeno tipo X, el FGFR3 y la BMP2 o un marcador co-expresado o co-detectable con cualquiera de ellos o con todos esos marcadores son mutuamente excluyentes. Las células precursoras de esqueleto de la presente invención pueden ser identificadas mediante un marcador positivo tal como la CDMP-1 (o un marcador o factor que es co-expresado o co-detectado con la CDMP-1) el cual no se expresa al mismo tiempo como un marcador negativo tal como el FGFR3 u otro factor o marcador co-expresado o co-detectable con el FGFR3.

A pesar de que la presente invención ha sido descrita refiriéndose a las células precursoras de esqueleto, el experto en la materia apreciará que la presente invención puede ser adaptada a cualquier forma de reparación tisular. El método a seguir consiste en identificar el marcador o marcadores embrionarios que identifican las células precursoras de las células del tejido específico a reparar, y entonces seleccionar células del organismo que presenten el marcador. Las células seleccionadas pueden ser expandidas ex vivo/in vitro y posteriormente reimplantadas para reparar el tejido.

Claims

1. Método para identificar positivamente células precursoras de esqueleto aisladas o expandidas, viables, capaces de realizar su función, y pluripotentes, que han entrado en una vía de diferenciación post-natal que conduce a los tejidos esquelético o conectivo y que comprende las etapas de

a): aislar las células de mamífero en un cultivo celular in vitro, y

b): detectar la presencia de la expresión del marcador embrionario positivo CDMP-1.

2. Método según la reivindicación 1, en el cual dicho tejido esquelético o conectivo es seleccionado a partir de hueso, cartílago, ligamento, tendón, menisco, cápsula articular, discos intervertebrales o dientes.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, el cual comprende la obtención de una población celular expandida a partir del cultivo celular obtenido en la etapa (a) y la detección de la presencia de la expresión de dicho marcador embrionario CDMP-1 en dicha población celular expandida.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende la detección de la ausencia de expresión de un marcador negativo.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el marcador positivo es un gen o una proteína o un ARNm expresado por un gen en las células precursoras o una parte del mismo, detectable en el nivel de ARNm, ADNc o proteína y/o detectable mediante la actividad de un promotor que dirige / regula la expresión de este gen, vinculado operativamente a un gen indicador heterólogo.

6. Método según la reivindicación 4 ó 5, en el cual el marcador negativo es expresado por el FGFR3 o un marcador o factor co-expresado o co-detectable con este marcador negativo.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual la etapa de la detección de la presencia del marcador positivo incluye la aplicación de un agente de enlace para el marcador positivo a una fuente celular aislada que incluya las células precursoras, identificando entonces positivamente la célula el marcador.

8. Método para seleccionar o enriquecer células precursoras de esqueleto aisladas o expandidas, viables, capaces de realizar su función, y pluripotentes, que han entrado en una vía de diferenciación postnatal que conduce a tejido esquelético o conectivo a partir de un reservorio de células de mamífero heterogéneas, cuyo método incluye el uso de reactivos, ligandos y/o anticuerpos que reconocen el ARNm o la proteína de la CDMP-1.

9. Método según la reivindicación 8, en el cual dicho tejido esquelético o conectivo se selecciona a partir de hueso, cartílago, ligamento, tendón, menisco, cápsula articular, discos intervertebrales o dientes.

10. Uso de reactivos, ligandos y/o anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen uno o más marcadores de superficie celular para seleccionar y enriquecer de células precursoras el cultivo celular in vitro, en el cual el marcador celular de superficie es la CDMP-1.

11. Cultivo de células precursoras de esqueleto aisladas o expandidas, viables, diferenciadas y pluripotentes, que han entrado en una vía de diferenciación postnatal que conduce a tejido esquelético o conectivo en el cual las células expresan un marcador embrionario positivo que es la CDMP-1.

12. Cultivo según la reivindicación 11, en el cual dicho tejido conectivo o esquelético se selecciona a partir de hueso, cartílago, ligamento, tendón, menisco, cápsula articular, discos intervertebrales o dientes.

13. Composición terapéutica que incluye el cultivo de la reivindicación 11 ó 12.

14. Composición terapéutica según la reivindicación 13, que además incluye condrocitos.

15. Composición terapéutica según la reivindicación 13 ó 14, que además incluye un factor que estimula la diferenciación de las células precursoras de esqueleto en el tipo de tejido conectivo o esquelético a producir o reparar y/o un polímero o transportador bio-absorbible.

16. Composición terapéutica según la reivindicación 15, en la cual dicho factor es un factor de crecimiento transformante o una proteína ósea morfogénica.

17. Composición terapéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la cual las células precursoras aisladas y expandidas, viables, diferenciadas, y pluripotentes, de dicho cultivo son pre-incubadas con un factor que estimula la diferenciación de las células precursoras de esqueleto en el tipo de tejido conectivo o esquelético a producir o reparar.

18. Composición terapéutica según la reivindicación 17, en la cual dicho factor es un factor de crecimiento transformante o una proteína ósea morfogénica.

19. Uso de un cultivo celular según la reivindicación 11 ó 12, como fuente in vitro de los factores \beta de crecimiento transformantes y proteínas óseas morfogénicas.

20. Implante que incluye el cultivo celular según la reivindicación 11 ó 12, siendo dicho implante adecuado para el implante de tejido conectivo.

21. Diagnóstico para identificar positivamente in vitro un marcador positivo de células precursoras de esqueleto aisladas o expandidas, viables, capaces de realizar su función, y pluripotentes, que han entrado en una vía de diferenciación postnatal que conduce a tejido esquelético o conectivo en el cual el marcador es la CDMP-1.

22. Diagnóstico según la reivindicación 21, en el cual dicho tejido esquelético o conectivo se selecciona a partir de hueso, cartílago, ligamento, tendón, menisco, cápsula articular, discos intervertebrales o dientes.

23. Diagnóstico según la reivindicación 21 ó 22, el cual además incluye la identificación de la ausencia de un marcador negativo.