ES2229158T3 - Procedimiento para el analisis de una muestra biologica. - Google Patents

Abstract

Procedimiento implementado por ordenador para el análisis de una muestra (104¿) biológica, para determinar una alteración en comparación con una muestra biológica sana, con los siguientes pasos: crear una primera imagen de la muestra biológica en una primera modalidad (DL) de toma de imagen; crear una segunda imagen de la muestra biológica en una segunda modalidad (PK) de toma de imagen, con lo que la primera modalidad de toma de imagen y la segunda modalidad de toma de imagen son diferentes y con lo que la primera modalidad de toma de imagen y la segunda modalidad de toma de imagen se seleccionan de un grupo de modalidades de toma de imagen que incluye una modalidad de toma de imagen de luz transmitida, una modalidad de toma de imagen de fluorescencia y una modalidad de toma de imagen de contraste de fases; clasificar (K1) la primera imagen mediante un primer parámetro previamente determinado; clasificar (K2) la segunda imagen mediante un segundo parámetro previamente determinado, con lo que la primera imagen se clasifica independientemente de la segunda imagen; y dependiendo de los resultados (E1, E2) de la clasificación, determinar (122) si la muestra (104¿) biológica presenta una alteración en comparación con una muestra biológica sana.

Description

Procedimiento para el análisis de una muestra biológica.

La presente invención se refiere a un procedimiento para el análisis de una muestra biológica y especialmente a un procedimiento para el análisis de una muestra de tejido, para detectar alteraciones tisulares benignas o malignas en el curso de la detección precoz y la prevención del cáncer.

Cada año mueren en el mundo aproximadamente 6,6 millones de personas de cáncer. En los países industrializados, esta enfermedad es la segunda causa más frecuente de muerte. A pesar de los grandes esfuerzos financieros y científicos hasta hoy no ha sido posible conseguir un avance decisivo del tratamiento con éxito de enfermedades tumorales. Desde el punto de vista actual, una reducción clara de las incidencias de cáncer y de la mortalidad por cáncer es posible únicamente por medio de soluciones innovadoras en los campos de detección precoz, pronóstico y prevención del cáncer.

Un medio eficaz para la detección precoz y la prevención del cáncer son las exploraciones preventivas regulares. Con la ayuda de la prevención del cáncer pueden detectarse células tumorales existentes, pero también alteraciones tisulares aún benignas, las denominadas displasias. En algunos casos, éstas se siguen desarrollando para formar tumores, sin embargo generalmente involucionan o se mantienen invariables. Con los procedimientos de diagnóstico utilizados actualmente no es posible una evaluación segura de la progresión.

Las exploraciones preventivas de cáncer se basan en gran parte en el análisis citológico e histológico de muestras de tejido bajo el microscopio. La interpretación de las imágenes microscópicas requiere la más alta competencia técnica y mucha rutina. Los procedimientos de procesamiento de imágenes digitales y reconocimiento de patrones ofrecen ventajas atrayentes para el uso en el caso de la clasificación de imágenes de hallazgos muy complejas y a veces también muy poco frecuentes, puesto que son neutrales e independientes de la situación subjetiva del observador. Sin embargo, hasta ahora no ha podido conseguirse la seguridad de clasificación necesaria con los procedimientos automáticos de análisis celular, basados en imágenes en escala de grises. Especialmente para las exploraciones preventivas del carcinoma de cérvix mediante un frotis ginecológico del cérvix (cuello uterino), así como para la valoración de muestras de secreciones bronquiales, se han desarrollado procedimientos automáticos que, sin embargo, sólo pueden detectar células tumorales presentes con una sensibilidad o especificidad muy limitadas.

Con la ayuda del procedimiento según Papanicolau (prueba PAP; procedimiento citológico de tinción para la identificación de células precancerosas y cancerosas (malignas) en frotis de cérvix) se ha conseguido reducir la incidencia (aparición) de tumores de cérvix en los países occidentales y en Japón en aproximadamente el 70%. Sin embargo, esta prueba presenta importantes deficiencias que consisten en que la tasa de hallazgos no claros se encuentra en del 5 al 10%, y la tasa de los resultados falsos negativos en del 5 al 50%.

Por tanto, en los últimos años se ha desarrollado una serie de nuevos procedimientos, que han sustituido la prueba PAP descrita anteriormente.

Un procedimiento emplea una técnica automática de preparación celular de capa delgada, con la que pueden identificarse células displásicas de manera claramente mejor en el caso de la presencia de únicamente muy pequeñas cantidades de material celular sospechoso. Este procedimiento fue admitido en 1996 por la FDA (Food and Drug Association) estadounidense como sustituto de las pruebas PAP tradicionales y, según los resultados de estudios clínicos, mejora la detección de displasias en un 65%.

Además se conoce un procedimiento de análisis de imágenes asistido por ordenador que hoy ya se utiliza principalmente en grandes laboratorios citológicos. Al contrario que la prueba PAP, en la cual la valoración microscópica de los frotis se realiza de forma manual, este procedimiento permite una valoración objetiva de frotis celulares. Estudios clínicos en los EE.UU. han obtenido como resultado que estos procedimientos automáticos llevan a una reducción de los resultados falsos negativos. La prueba recién descrita está admitida en los EE.UU. desde 1998 como diagnóstico de rutina para la prevención del cáncer de cérvix.

Los perfeccionamientos recién descritos de la prueba PAP son adecuados para solventar al menos parcialmente las desventajas de calidad de los procedimientos convencionales. Sin embargo, al igual que la propia prueba PAP, no pueden llevar a cabo una valoración fiable de la progresión de las displasias. Las exploraciones repetidas y complementarias para aclarar el diagnóstico y para controlar las displasias seguirán siendo necesarias igual que antes incluso en el caso del empleo de una preparación mejorada de las muestras y un análisis automático. Los procedimientos de análisis de imágenes convencionales utilizados para ello presentan dos ventajas importantes en el caso de la clasificación de imágenes de hallazgos muy complejas y muy poco frecuentes en comparación con el análisis celular manual, sin embargo, con estas tecnologías no puede alcanzarse la seguridad de clasificación necesaria. Los procedimientos sólo pueden detectar células tumorales y displasias presentes con una sensibilidad y especificidad muy limitadas (inferiores al 70%).

En 1996 se estableció una prueba de ADN para la detección de virus del papiloma humano para la prevención del cáncer de cérvix. Una serie de investigaciones ha mostrado que existe una relación estrecha entre la infección con virus del papiloma humano (VPH) y la aparición de lesiones y cáncer de cérvix. El VPH puede detectarse en aproximadamente el 99% de todos los carcinomas de cérvix invasivos y en más del 90% de los estados previos de alto grado. La tipificación del VPH está reconocida como el análisis diagnóstico complementario en el caso de mujeres con displasias leves y medias en los países industrializados occidentales. Sin embargo, el problema de la prueba del VPH para la prevención del cáncer de cérvix se encuentra en su alta tasa de resultados falsos positivos. Hasta el 80% de todas las mujeres presenta una infección por VPH a lo largo de su vida, pero sólo aproximadamente del 2 al 4% de todas las mujeres presentan realmente displasias y sólo aproximadamente del 1 al 2% de estas mujeres enferman de un carcinoma de cérvix.

Además, en el estado de la técnica se conoce un procedimiento para la detección de cáncer de vejiga, que se basa en la tecnología NMP (tecnología Nuclear Matrix Protein). Las NMP se encuentran en los núcleos de las células del tejido epitelial y en el caso de pacientes con cáncer de vejiga, presentan valores claramente aumentados que pueden detectarse en la orina por medio de anticuerpos específicos. Los resultados de estudios clínicos muestran que la tecnología NMP detecta displasias y tumores de cérvix con una sensibilidad claramente más alta que la prueba PAP convencional.

Otro procedimiento para la prevención del cáncer de cérvix es la identificación de marcadores proteicos específicos, que están sobreexpresados en el caso de células displásicas y en células tumorales. No se conocen resultados de estudios clínicos en relación con este procedimiento.

Al igual que los perfeccionamientos de la prueba PAP, también la tipificación del VPH y los marcadores proteicos pueden contribuir al mejoramiento de la calidad en la citología preventiva de cérvix. Sin embargo, ninguno de estos procedimientos diagnósticos in vitro puede realizar una afirmación objetiva de la progresión en cuanto al desarrollo de una célula en un tumor. Por medio de ello no pueden evitarse las exploraciones complementarias y repetidas, así como las operaciones que tienen lugar en el caso de lesiones persistentes o progresivas por motivos de seguridad.

En el documento EP 0 647 844 A se describe un procedimiento para citologías automáticas interactivas, en el que un sistema automático y un usuario establecen un diagnóstico de manera paralela, y en un paso final se compara el diagnóstico del sistema con el diagnóstico del usuario. Este procedimiento tiene la desventaja de que también aquí un usuario debe establecer un diagnóstico. En las patentes de los EE.UU. números 5.7557.954 y 5.978.497 se describen detalladamente procedimientos para la segmentación automática de imágenes que representan una muestra biológica, con lo que se clasifican objetos individuales basándose en características previamente determinadas.

En el documento DE 19747415 A1 se describe un procedimiento para simplificar un análisis de una muestra biológica por parte de un citólogo, determinando a partir de una muestra el material significativo desde el punto de vista diagnóstico y fijando un "camino" por la muestra de manera que el observador ya sólo tiene que observar las muestras relevantes.

En el documento US 5 162 990 A se describe un procedimiento para el análisis de una muestra biológica en el que se procesan por separado imágenes capturadas para diferentes modalidades de toma de imagen. Las imágenes procesadas se combinan para formar una imagen, que se continúa procesando y analizando.

Además de las publicaciones descritas anteriormente en relación con el análisis de células, en el estado de la técnica se conocen además sistemas de procesamiento de imágenes digitales, que se describen, por ejemplo, en los documentos DE 19834718 A1, DE 19612465 A1 y DE 19538004 A1. Estas patentes se refieren a sistemas generales de captación y de clasificación de imágenes que sin embargo no garantizan una seguridad de clasificación suficiente para el análisis de muestras biológicas en cuanto a posibles alteraciones benignas o malignas.

Partiendo del estado de la técnica descrito anteriormente, la presente invención se basa en la tarea de proporcionar un procedimiento automático, mejorado, para el análisis seguro de una muestra biológica, para detectar de manera segura y rápida alteraciones benignas o malignas en comparación con una muestra sana.

Esta tarea se soluciona por medio de un procedimiento según la reivindicación 1.

La presente invención proporciona un procedimiento implementado con ordenador para el análisis de una muestra biológica, para determinar una alteración en comparación con una muestra biológica sana, con los siguientes pasos:

crear una primera imagen de la muestra biológica en una primera modalidad de toma de imagen;

crear una segunda imagen de la muestra biológica en una segunda modalidad de toma de imagen;

clasificar la primera imagen mediante un primer parámetro previamente determinado;

clasificar la segunda imagen mediante un segundo parámetro previamente determinado, con lo que la primera imagen se clasifica independientemente de la segunda imagen; y

dependiendo de los resultados de la clasificación, determinar si la muestra biológica presenta una alteración en comparación con una muestra biológica sana.

En el ejemplo de realización preferido de la presente invención se proporciona un procedimiento inmunocitométrico que hace posible identificar claramente células tumorales y pronosticar la progresión de células displásicas a células tumorales.

En este sentido, la presente invención se basa en el concepto innovador, en el que por primera vez se combinan informaciones morfométricas (registradas por medición) de imágenes celulares con informaciones sobre el grado de daño oxidativo del ADN que está aumentado significativamente en células tumorales y células precancerosas que se están transformando en células tumorales. Las informaciones morfométricas de imágenes se obtienen mediante microscopia de luz transmitida. La determinación de la cantidad de daño del ADN en las células individuales tiene lugar en el microscopio de fluorescencia por medio de la medición de las señales de fluorescencia, emitidas por anticuerpos unidos específicamente a daños de ADN (8-oxoguanina) definidos.

La ventaja de la presente invención consiste en que, en comparación con los procedimientos existentes, se asocia un aumento significativo de informaciones de imágenes con nuevos procedimientos de valoración de imágenes basados en los conocimientos y que pueden entrenarse, y con ello se desarrolló una técnica de procedimiento no alcanzada hasta el momento en cuanto a la seguridad de clasificación y la sensibilidad de aplicación.

Según un ejemplo de realización preferido, el procedimiento según la invención encuentra su aplicabilidad en el análisis de frotis de cuello uterino (cérvix). Como un progreso en el análisis de esta muestra se lleva a cabo un proceso optimizado de preparación de estas muestras, durante el cual se eliminan el moco, se aislan las células sobre el soporte, se realizan una preparación y un tratamiento muy exactos y reproducibles con anticuerpos. A continuación, en este ejemplo de realización tiene lugar la obtención de imágenes microscópicas de luz transmitida, de contraste de colores, así como de fluorescencia, de alta calidad, que llevan a cabo una detección automática de displasias y su pronóstico o de células sospechosas de tumor en las tomas de imágenes microscópicas mediante un sistema de valoración de imágenes asistido por ordenador.

Una ventaja de este modo de proceder consiste en que las informaciones de las imágenes sobre el portaobjetos no sólo se registran y archivan digital y sistemáticamente, sino que se sustituye la competencia subjetiva de diagnóstico del personal médico especializado por el componente objetivo, asistido por ordenador.

La presente invención no está limitada al análisis de frotis de cérvix, sino que puede transferirse igualmente a la detección precoz de otros tipos de cáncer como, por ejemplo, el carcinoma de vejiga, de mama, de pulmón y tiroideo, así como a derrames malignos y similares.

A continuación se explican detalladamente ejemplos de realización preferidos de la presente invención mediante los dibujos adjuntos. Muestran:

la figura 1 una representación esquemática de un primer ejemplo de realización del procedimiento según la invención; y

las figuras 2A y B una representación detallada de los pasos individuales del ejemplo de realización descrito mediante la figura 1.

Antes de exponer a continuación ejemplos de realización más preferidos de la presente invención, a continuación se explican nuevamente los aspectos generales de la invención.

Una posibilidad para la detección de células tumorales consiste en registrar su daño oxidativo del ADN. Las células tumorales presentan siempre un daño oxidativo del ADN mayor que las células del tejido sano correspondiente. Esto se desprende de una serie de publicaciones sobre el contenido de daños de bases 8-oxoguanina mutagénicos y otras alteraciones oxidativas del ADN en tejidos tumorales y sanos del tracto gastrointestinal y de pulmón, próstata, cerebro, ovarios, mama, etc., tal como, por ejemplo, en Olinski et al. (1992) FEBS Lett. 309, 193-198; Jaruga et al. (1994) FEBS Lett. 341, 59-64; Musarrat et al. (1996) Eur. J. Cancer 32A, 1209-1214; Malins et al. (1996) Proc. Natl. Acad Sci. USA 93, 2557-2563; Matsui et al. (2000) Cancer Lett. 151, 87-95. Incluso en células de leucemia se encontraron niveles elevados de 8-oxoguanina (Senturker et al. (1997) FEBS Lett., 416, 286-290). La persistencia de estos daños lleva al desarrollo de patrones de mutación definidos en el ADN celular del tejido diana (por ejemplo, del tejido tumoral) que son típicos de los daños oxidativos del ADN, como se describe, por ejemplo, en Moriva (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1122-1126; Reid et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3904-3907; Du et al. (1994) Mol. Carcinog., 11, 170-175; Turker et al., (1999) Cancer Res., 59, 1837-1839.

Otras investigaciones no han mostrado valores de 8-oxoguanina elevados sólo en tumores, sino también en tejidos precancerosos (Musarrat et al. (1996) Eur. J. Cancer 32A, 1209-1214; Olinski et al. (1995) Free Radic. Boil. Med., 18, 807-813. Con ello se producen daños oxidativos del ADN ya en estados previos del cáncer, y posiblemente éstos son responsables de la aparición de células cancerígenas. Las investigaciones experimentales con animales han confirmado esta suposición. Realmente existe una relación causal entre la formación y la persistencia de los contenidos elevados de 8-oxoguanina y la aparición de tumores, como se describe, por ejemplo, en Driscoll
et al (1995) Exp. Lung Res., 21, 941-956; Nehls et al. (1998) Environ. Health Perspect., 105 Supl. 5, 1291-1296). Además de esta observación, las investigaciones han proporcionado las siguientes otras tres informaciones expuestas a continuación:

(a)

La aparición de daños oxidativos del ADN se produce mucho antes que la aparición de tumores.

(b)

El daño oxidativo del ADN debe permanecer (persistir) durante un largo periodo de tiempo hasta que aparece el cáncer. Para el desarrollo de tumores de cérvix a partir de estados previos premalignos (TIN III) se han determinado para la mujer en promedio 16 años (Forsmo et al (1997) Int J. Cancer, 71, 4-8).

(c)

El daño oxidativo debe tener lugar en el ADN de células que pueden dividirse. Sólo en estas células, los daños se transforman en mutaciones durante la replicación del ADN y se transmiten a las células hija.

Por tanto, el grado de daño oxidativo del ADN puede utilizarse para

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identificar una célula tumoral existente, o

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pronosticar si una displasia va a continuar desarrollándose en un tumor.

Además, para el procedimiento según la invención es necesaria una preparación de la muestra que, según un ejemplo de realización, utiliza un procedimiento inmunocitoquímico. Los procedimientos inmunocitoquímicos se han utilizado hasta el momento sólo de manera limitada en el diagnóstico, para lo cual existen los dos motivos siguientes. En comparación con los análisis inmunohistoquímicos en tejidos incluidos en parafina, la inmunocitoquímica es más difícil de realizar de manera estandarizada y la calidad de los preparados citológicos inmunoteñidos presenta fuertes variaciones. Además, la morfología de las células se afecta fuertemente después de los diferentes pasos de incubación para las tinciones inmunocitoquímicas. Según la presente invención se utiliza un procedimiento, en el que las tinciones inmunocitoquímicas están aseguradas en cuanto a la calidad y su reproducción está estandarizada, de manera que la morfología de las células tratadas se conserva mejor y la valoración de la imagen tiene lugar de manera fiable. Por medio de una preparación lo más temprana posible de las células o la fijación optimizada de los preparados celulares directamente después de la extracción, así como de una tinción modificada de Papanicolau o de Pappenheim en combinación con la inmunocitoquímica se hace posible la obtención de mejores resultados y más estandarizados. Por medio de ello se consigue una preparación de las muestras optimizada y una tinción de las células, por lo cual pueden realizarse tanto valoraciones convencionales mediante microscopia óptica, como también automáticas, de manera más fiable.

En la figura 1 se muestra una representación esquemática de un primer ejemplo de realización del procedimiento según la invención. Los pasos individuales de procedimiento se muestran en los bloques en la columna izquierda, y en paralelo a la columna izquierda se representan en la columna derecha los objetos o elementos correspondientes que actúan sobre los pasos individuales.

Fundamentalmente, el procedimiento según la invención se divide, según el ejemplo de realización representado, en un primer paso I parcial y en un segundo paso II parcial.

En el paso I parcial se explora o escanea en primer lugar la matriz 102 de muestras en el paso 100. La matriz 102 de muestras engloba múltiples muestras 104 individuales, con lo que debido al paso 100 se selecciona una muestra 104' biológica a partir de la matriz 102, como se aclara mediante la flecha 106. Una vez seleccionada una muestra 104' individual, en el paso 108 tiene lugar un análisis de imágenes individuales relacionado a la muestra 104', como se explica más en detalle a continuación.

Partiendo de los resultados del análisis de las imágenes individuales se determina si la muestra 104' biológica es sospechosa de tumor o no. Si se afirma la sospecha de tumor, entonces, según el ejemplo de realización representado en la figura 1, el procedimiento pasa al segundo paso II parcial, en el que, en el paso 110, se segmentan en primer lugar las imágenes individuales de manera que se producen imágenes parciales con células individuales, como se muestra a modo de ejemplo en la figura 1 con el 112, que muestra una imagen parcial con dos células 114 y 116 individuales. Como se representa mediante la flecha 118, se elige una célula, en el ejemplo mostrado, la célula 114, y en el paso 120 tiene lugar un análisis de esta célula 114 sospechosa. En función del resultado del análisis puede determinarse si en cuanto a la célula sospechosa de tumor se trata realmente de una célula tumoral ya existente o si aquí se trata de una displasia benigna o maligna.

Según el procedimiento según la invención, a partir de registros de datos de referencia previamente clasificados se determinan operadores matemáticos de características de manera iterativa para clasificar las imágenes registradas de las muestras biológicas. Una separación de las muestras con respectivamente un tipo de característica dominante hace posible la determinación de un conjunto de operadores correspondiente. Si los operadores ortogonales entre sí pueden asignarse claramente a los tipos de característica que interesan, entonces puede realizarse su diferenciación dentro de un registro de datos de imágenes.

En los planteamientos conocidos hasta el momento para la citología y citometría automáticas, los operadores utilizados para la extracción de características de estructura y forma se determinaron según el principio de prueba y error. Este modo de proceder tiene su límite a partir del momento en que deben detectarse patrones muy complejos y específicos dentro de contextos variables. En ello, el problema consiste en que el probar un gran número de operadores sobre una muestra al azar, de referencia, para determinar la relevancia en cuanto al objetivo de la detección, lleva a tiempos de cálculo de varios años debido al enorme tamaño del espacio de búsqueda. Puesto que en cuanto al análisis celular se trata de tareas de reconocimiento de patrones extremadamente complejos y también muy variables en su desarrollo, aquí se necesita un nuevo planteamiento, tal como se enseña según la presente invención. Con las condiciones límite de una capacidad de procesamiento disponible de manera limitada y de un tiempo de cálculo practicable, a partir de una biblioteca de operadores existente se seleccionan aquellos operadores que contribuyen a un resultado de clasificación óptimo.

Según el ejemplo de realización descrito mediante la figura 1, esta selección tiene lugar en el paso I parcial y en el paso II parcial.

En el paso I parcial se utiliza la selección de los operadores de manera global a nivel de una imagen 104', con lo que por una imagen 104' de este tipo puede entenderse una unidad que un citólogo ve como un conjunto, tal vez con diferentes aumentos, a través del ocular de su microscopio. A partir de una muestra citológica sana pueden guardarse entre 12 y 500 imágenes de este tipo, dependiendo del factor de aumento. En lo anterior, la selección automática de parámetros puede realizarse independientemente una de otra sobre imágenes individuales de diferentes modalidades, tales como de luz transmitida, contraste de fases y fluorescencia, así como también sobre diferentes tipos de células (de cérvix, vejiga, pulmón, etc.). En el caso de una muestra al azar, de imagen, previamente clasificada de manera suficientemente segura resulta un buen resultado de selección.

En el paso II parcial, en el caso de la presencia de células sospechosas, la segmentación del objeto y el análisis parcial siguen a nivel de la célula individual con la resolución máxima. Aquí se registran características dimensionales de la célula, de forma y de estructura, con lo que también aquí se utiliza el planteamiento de la selección de parámetros de textura. Además se determinan parámetros morfométricos.

Según la invención se enlazan la experiencia de muchos años de citólogos y técnicos en citología en la valoración y evaluación de hallazgos microscópicos histológicos, en la selección de los parámetros celulares y de la imagen celular que van a utilizarse para la clasificación de una célula, con un planteamiento más bien objetivo para la selección automática de parámetros. Puesto que una búsqueda completa, óptima, para la selección de parámetros ideales exigiría un tiempo de cálculo de varios años, el conocimiento existente de los expertos se integra sintáctica y semánticamente en la selección automática, enlazado con una función de ponderación.

Por medio de ello se consiguen las siguientes ventajas:

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La selección de parámetros se realiza mediante una amplia muestra al azar previamente clasificada, en varias fases de aprendizaje. Pueden entrenarse nuevamente las variaciones para la optimización y guardarse en archivos de configuración.

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Por medio de la preparación de varios registros de datos de configuración pueden analizarse con un sistema de clasificación, diferentes preparados citológicos (de cérvix, vejiga, pulmón,...) y adaptarse los algoritmos necesarios. Por medio de ello, este tipo de sistemas de clasificación no están ya limitados a un uso y permiten llevar a cabo una gran parte de las tareas de estudio citológico e histológico.

En la figura 2 se muestra una representación detallada del ejemplo de realización de la presente invención descrito mediante la figura 1. A partir de la matriz 102 de muestras con el gran número de muestras 104 individuales se selecciona una muestra 104' individual para el análisis.

En relación a esta muestra 104' individual se producen tres imágenes parciales, como se indica por medio de los bloques DL, PK y FL. La primera imagen parcial se produce mediante una primera modalidad de toma de imagen, concretamente la modalidad de toma de imagen microscópica de luz transmitida (DL). La segunda imagen parcial se obtiene mediante la modalidad de toma de imagen de contraste de fases (PK) y la tercera imagen parcial se obtiene mediante la modalidad de toma de imagen de fluorescencia (FL). Cada imagen DL, PK, FL parcial obtenida se clasifica independientemente una de otra mediante un conjunto de parámetros seleccionado, como se indica por medio de los bloques K_{1}, K_{2} y K_{3}. A partir de la clasificación de las imágenes parciales individuales se obtienen resultados de clasificación correspondientes para cada imagen parcial, como se indica por medio de los bloques E_{1}, E_{2} y E_{3}. En el paso 122 se determina, basándose en los resultados E_{1}, E_{2} y E_{3}, si existe una alteración de la muestra 104' en comparación con una muestra sana. Si esto se niega, entonces el procedimiento finaliza, según el ejemplo de realización representado, en el paso 124. Si se afirma una alteración de la muestra, por ejemplo, una sospecha de tumor, entonces el procedimiento continúa hacia el paso 126 en la figura 2B. En el paso 126 tiene lugar la segmentación de la muestra 104', ya descrita anteriormente, de manera que la muestra se divide en zonas individuales que esencialmente abarcan una célula o sólo células individuales, como se indica en la figura 2B esquemáticamente con 128, 130 y 132.

Para cada una de las secciones 128 a 132 o para cada imagen parcial con células individuales se producen las tres modalidades de toma de imagen ya descritas anteriormente, de luz transmitida, de contraste de fases y de fluorescencia (DL, PK, FL), como se representa por medio de los bloques correspondientes en la figura 2B. A continuación tiene lugar una clasificación de las imágenes parciales individuales, como se representa por medio de los bloques K en la figura 2B. Como se ha descrito anteriormente también aquí tiene lugar la clasificación de las imágenes parciales individuales para diferentes modalidades de toma de imagen independientemente una de otra para obtener resultados de clasificación correspondientes (véanse los bloques E).

Basándose en los resultados de la clasificación de las secciones o imágenes parciales individuales se obtienen los diagnósticos correspondientes de la célula o las células 134, 136, 138, que se utilizan en el paso 140 para el diagnóstico de la muestra biológica completa.

El ejemplo de realización detallado, descrito mediante la figura 2, abarca en primer lugar la clasificación previa a nivel de la imagen, como se muestra en la figura 2A. Para cada una de las muestras 104 que deben analizarse se producen tres imágenes individuales, que se obtienen mediante las modalidades de toma de imagen de luz transmitida (DL), de contraste de fases (PK) y de fluorescencia (FL). Estas tres imágenes se clasifican en primer lugar por separado a nivel de la imagen, es decir, cada una como conjunto. En lo anterior se utiliza un procedimiento de análisis de textura automático, ampliado y modificado, cuya ampliación consiste en que por medio de un procedimiento de textura está integrado un complemento que es necesario especialmente para preparados citológicos. Además se dispone de la integración del conocimiento existente de los expertos. Según la invención, una selección automática de los parámetros necesarios y suficientes para esta tarea de clasificación tiene lugar a partir de un fondo de aproximadamente 600 a 1000 parámetros de textura (parámetros de color, estadísticos, de textura, de forma). Los parámetros necesarios se determinan basándose en una muestra al azar representativa de imágenes por medio de una selección inteligente, con lo que, entre otros, la calidad, el valor de la información y el poder de diferenciación de los parámetros elegidos desempeñan un papel en la clasificación. Para cada modalidad de toma de imagen (DL, PK y FL) se determina independientemente en cada caso un conjunto de parámetros propio para la clasificación.

A continuación, en el paso 122 tiene lugar la correlación de los resultados de clasificación previa de varias modalidades de toma de imagen. Los resultados K_{1}, K_{2} y K_{3} de clasificación independientes de las tres modalidades de toma de imagen se correlacionan entre sí para tomar una decisión acerca de si la muestra 104' debe clasificarse como sana o como sospechosa de tumor. Por medio de una elección adecuada correspondiente de los límites de decisión también por medio de este tipo de clasificación previa se separan aproximadamente el 75% de las muestras con gran seguridad como no sospechosas de tumor. Todas las muestras clasificadas como sospechosas de tumor se someten en los pasos siguientes, que se muestran en la figura 2B, a otra etapa de clasificación a nivel de las células.

En la figura 2B se lleva a cabo primero la segmentación de la célula en el paso 126. Para analizar todas las muestras de imágenes sospechosas de tumor más exactamente y conducirlas a la clasificación de precisión, a partir de estas muestras de imágenes se segmentan en primer lugar células individuales. La segmentación de las células tiene lugar nuevamente por separado sobre todas las tres copias de imagen DL, PK y FL. El resultado de esta segmentación forma como unidad más pequeña secciones de imagen con, en el caso ideal, respectivamente una célula individual. Por medio de una preparación adecuada de las muestras en los pasos previos se asegura que sólo puedan verse pocos conglomerados de células, es decir, solapamientos de células.

A continuación, las células segmentadas se clasifican. En primer lugar, cada célula individual se clasifica por separado, con lo que se utiliza aquí también el procedimiento descrito anteriormente para la selección automática de parámetros, basada en los conocimientos. A nivel de la célula no sólo se utilizan parámetros de color y textura y parámetros estadísticos, sino que además también se observan parámetros de forma de la célula segmentada. También aquí se seleccionan mediante selección inteligente, a partir de un fondo de 600 a 1000 parámetros descriptivos de las células, aquellos con los cuales pueden diferenciarse entre sí con gran seguridad los tipos de células que aparecen en las diferentes modalidades de toma de imagen.

A continuación tiene lugar una fusión de los resultados de clasificación y una decisión. La clasificación a nivel de la célula se realiza en primer lugar para cada modalidad de imagen por separado, y a continuación deben tanto registrarse juntas las células segmentadas de las tres vistas, como también compensarse los resultados de clasificación, para llegar a un diagnóstico diferenciado.

En el caso del ejemplo de realización descrito anteriormente, las imágenes parciales pueden obtenerse en las diferentes modalidades de toma de imagen para las células segmentadas o bien basándose en las imágenes parciales producidas ya en el primer paso principal por medio de la simple segmentación de éstas o se lleva a cabo un segmentación correspondiente de la muestra y una nueva producción de imágenes en la segunda sección.

Además se hace referencia de que el procedimiento según la invención no está limitado al ejemplo de realización preferido. Más bien, el procedimiento según la invención hace posible un análisis de muestras biológicas para determinar si éstas presentan alteraciones en comparación con un tejido sano. Partiendo de esta clasificación de una muestra son posibles diferentes posibilidades de análisis posterior, siempre que éstas en realidad se deseen. Para algunas aplicaciones puede ser suficiente el determinar que han tenido lugar alteraciones de la muestra en comparación con tejido sano o muestras sanas.

Por otra parte, en el caso de otras aplicaciones, por ejemplo, procedimientos de análisis semi-automáticos, al citólogo se le pueden entregar para establecer un dictamen posterior sólo las muestras individuales, a partir de una muestra completa, que presentan una alteración sospechosa correspondiente, y el citólogo realizará entonces una valoración definitiva.

La tercera posibilidad consiste en la automatización completa como se ha descrito anteriormente mediante las figuras.

Claims (7)

1. Procedimiento implementado por ordenador para el análisis de una muestra (104') biológica, para determinar una alteración en comparación con una muestra biológica sana, con los siguientes pasos:

crear una primera imagen de la muestra biológica en una primera modalidad (DL) de toma de imagen;

crear una segunda imagen de la muestra biológica en una segunda modalidad (PK) de toma de imagen, con lo que la primera modalidad de toma de imagen y la segunda modalidad de toma de imagen son diferentes y con lo que la primera modalidad de toma de imagen y la segunda modalidad de toma de imagen se seleccionan de un grupo de modalidades de toma de imagen que incluye una modalidad de toma de imagen de luz transmitida, una modalidad de toma de imagen de fluorescencia y una modalidad de toma de imagen de contraste de fases;

clasificar (K_{1}) la primera imagen mediante un primer parámetro previamente determinado;

clasificar (K_{2}) la segunda imagen mediante un segundo parámetro previamente determinado, con lo que la primera imagen se clasifica independientemente de la segunda imagen; y

dependiendo de los resultados (E_{1}, E_{2}) de la clasificación, determinar (122) si la muestra (104') biológica presenta una alteración en comparación con una muestra biológica sana.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, con los siguientes pasos:

producir una tercera imagen de la muestra (104') biológica en una tercera modalidad (FL) de toma de imagen; y

clasificar (K_{3}) la tercera imagen mediante un tercer parámetro previamente determinado, con lo que la tercera imagen se clasifica independientemente de la primera imagen y de la segunda imagen.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, que en la determinación de una alteración de la muestra (104') biológica presenta los siguientes pasos, para determinar si la alteración de la muestra biológica es benigna o maligna:

determinar (126) al menos una sección (128, 130, 132) de la muestra (104') biológica, con lo que la sección esencialmente presenta un elemento o esencialmente elementos individuales;

producir una primera imagen (DL) parcial de la sección de la muestra biológica en una cuarta modalidad de toma de imagen;

producir una segunda imagen (PK) parcial de la sección de la muestra biológica en una quinta modalidad de toma de imagen;

clasificar (K) la primera imagen parcial mediante un cuarto parámetro previamente determinado;

clasificar (K) la segunda imagen parcial mediante un quinto parámetro previamente determinado, con lo que la primera imagen parcial se clasifica independientemente de la segunda imagen parcial; y

dependiendo de los resultados (E) de la clasificación, determinar si la alteración de la muestra biológica es benigna o maligna.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, con los siguientes pasos:

producir una tercera imagen (FL) parcial de la sección de la muestra biológica en una sexta modalidad de toma de imagen; y

clasificar la tercera imagen parcial mediante un sexto parámetro previamente determinado, con lo que la tercera imagen parcial se clasifica independientemente de la primera imagen parcial y de la segunda imagen parcial.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 3 ó 4, en el que la muestra biológica comprende múltiples células, con lo que la primera imagen parcial, la segunda imagen parcial y la tercera imagen parcial comprenden esencialmente una célula o esencialmente células individuales.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la primera modalidad de toma de imagen, la segunda modalidad de toma de imagen, la tercera modalidad de toma de imagen, la cuarta modalidad de toma de imagen, la quinta modalidad de toma de imagen y la sexta modalidad de toma de imagen se seleccionan de un grupo que comprende la luz transmitida, el contraste de fases y la fluorescencia, y en el que el primer parámetro previamente determinado, el segundo parámetro previamente determinado, el tercer parámetro previamente determinado, el cuarto parámetro previamente determinado, el quinto parámetro previamente determinado y el sexto parámetro previamente determinado se seleccionan de un grupo que comprende características de dimensión de la célula, de forma, de estructura, de color, de textura y características estadísticas, datos morfométricos y datos del daño oxidativo de las células.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la primera modalidad de toma de imagen y la cuarta modalidad de toma de imagen son la modalidad de toma de imagen de luz transmitida, la segunda modalidad de toma de imagen y la quinta modalidad de toma de imagen son la modalidad de toma de imagen de contraste de fases, y la tercera modalidad de toma de imagen y la sexta modalidad de toma de imagen son la modalidad de toma de imagen de fluorescencia, con lo que para cada modalidad de toma de imagen se determina independientemente en cada caso un conjunto de parámetros propios, del grupo de los parámetros previamente determinados para la clasificación.