ES2227607T3 - Soporte solido para uso en cultivo celular, especialmente para el cultivo de celulas hepaticas, reactor biologico que contiene dicho soporte solido y su uso en un sistema de higado bioartificial. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION TRATA DE UN SOPORTE SOLIDO PARA SU UTILIZACION EN EL CULTIVO DE CELULAS IN VITRO, QUE INCLUYE UN MATERIAL MATRICIAL EN TRES DIMENSIONES Y FIBRAS HUECAS QUE SON PERMEABLES AL MENOS AL OXIGENO GASEOSO Y/O EL DIOXIDO DE CARBONO GASEOSO, UN REACTOR BIOLOGICO PARA EL CULTIVO Y/O MANTENIMIENTO DE CELULAS VIVAS QUE INCLUYE DICHO SOPORTE SOLIDO, ASI COMO UN PROCEDIMIENTO PARA CULTIVAR Y/O MANTENER CELULAS VIVAS, UTILIZANDO DICHO SOPORTE SOLIDO Y/O DICHO REACTOR BIOLOGICO. EL SOPORTE SOLIDO, EL REACTOR BIOLOGICO Y EL PROCEDIMIENTO RESULTAN ESPECIALMENTE ADECUADOS PARA CULTIVAR CELULAS HEPATICAS DERIVADAS DE HUMANO O ANIMAL, PARA SU USO EN UN HIGADO BIO - ARTIFICIAL O COMO HIGADO BIO ARTIFICIAL. LA INVENCION TRATA ADEMAS DE DICHO HIGADO BIO ARTIFICIAL, ASI COMO DE UN PROCEDIMIENTO PARA TRATAR TRASTORNOS HEPATICOS UTILIZANDO DICHO HIGADO BIO - ARTIFICIAL.

Description

Soporte sólido para uso en cultivo celular, especialmente para el cultivo de células hepáticas, reactor biológico que contiene dicho soporte sólido y su uso en un sistema de hígado bioartificial.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo del cultivo de células, especialmente de células tisulares adherentes como células hepáticas. Más en particular, la invención se refiere al campo de métodos y reactores biológicos para el cultivo y/o conservación de células, especialmente células hepáticas, y al uso de estos métodos en un sistema de hígado bioartificial (BAL).

Breve descripción de la técnica precedente

En general, es conocido que la mayoría de células tisulares requieren un soporte sólido sobre el que crecer y dividirse.

Aunque es posible el cultivo de células tisulares adherentes en vasos ordinarios, como botellas de vidrio o placas Petri, durante el cual las células se adhieren a la pared del vaso, normalmente se usan unos vasos o botellas de reacción especiales con un área de superficie grande para proporcionar una capacidad aumentada para la fijación celular. Una forma de mejorar dicho área de superficie es mediante el uso de un soporte sólido para la adherencia celular. Estos soportes sólidos son conocidos en la técnica; algunos ejemplos son perlas de vidrio, microportadores y fibras de celulosa.

Un problema especial en cuanto al cultivo de células adherentes - en comparación con el cultivo de células en suspensión o en capas confluentes - es el hecho de proporcionar las suficientes sustancias nutritivas y/o oxígeno a las células y/o proporcionar la eliminación suficiente de productos de desecho y/o de dióxido de carbono. Esto representa un problema especialmente con células con demandas rigurosas de oxigenación así como de eliminación de productos de desecho, como las células hepáticas.

La indisponibilidad de soportes sólidos y métodos adecuados para el cultivo in vitro de células hepáticas ha obstaculizado seriamente durante los últimos 40 años el desarrollo de los denominados sistemas de hígados bioartificiales (BAL), sistemas que podrían ser usados en pacientes con fallos hepáticos para el soporte y/o sustitución de la función natural del hígado. Puesto que un fallo hepático agudo tiene una prognosis muy pobre y es normalmente fatal para el paciente en un plazo de días o incluso horas [véase por ejemplo Devlin et al., Hepatology Vol. 21, No. 4. (1995), páginas 1018-1024 y Lake and Suzman, Hepatology, vol. 21, No. 3 (1995), páginas 879-882, que describe los problemas generales en la técnica del tratamiento de fallos hepáticos, dado que los hígados para transplante no están fácilmente disponibles, sería muy deseable un sistema BAL que podría soportar y/o reemplazar la función hepática, por ejemplo durante el periodo de tiempo en que el paciente espera un hígado disponible para el transplante y/o para prolongar el periodo hasta que el hígado del paciente se recupere lo suficientemente y/o se regenere por sí mismo y/o como resultado del tratamiento.

No obstante, debido al defecto anteriormente mencionado de métodos adecuados y/o materiales para cultivar y/o mantener células hepáticas in vitro, los sistemas de hígados bioartificiales de la técnica precedente han demostrado ser insuficientes hasta el momento, ya que no reemplazan completamente todas las funciones realizadas por el hígado del paciente in vivo, porque tienen una capacidad insuficiente, y/o porque el tiempo durante el cual son terapéuticamente eficaces es demasiado limitado para un uso práctico.

La historia de sistemas de hígados bioartificiales ha sido descrita en un número de artículos recientes, sobre todo Nyberg et al., the American Journal of Surgery, Vol. 166, Noviembre 1993, p.512-521, y Suzman and Kelly Scientific American, Mayo-Junio 1995, págs. 59-77.

Como se describe en estos artículos, los sistemas más recientes de soporte hepático estaban basados en la hemodiálisis, hemoperfusión con carbón vegetal, o hemodiálisis cruzada bien entre seres humanos o entre seres humanos y animales. También, se ha tratado la perfusión hepática extracorpórea.

Todos estos sistemas han demostrado ser insuficientes. Según ha sido declarado por Niberg et al.: ``en base al éxito limitado logrado por las técnicas anteriores de soporte hepático, el concepto comprendía que las funciones del hígado esenciales para la supervivencia serían mejor proporcionadas por preparaciones hepáticas mamíferas que permitieran una aplicación asistida o repetitiva. Estas preparaciones hepáticas, normalmente llamadas sistemas híbridos o bioartificiales, contienen componentes biológicos dentro de una estructura sintética. Estos componentes biológicos pueden incluir enzimas hepáticas aisladas, componentes celulares, láminas hepáticas o hepatocitos cultivados. Los hepatocitos pueden ser implantados en el paciente o introducidos extracorporalmente. Los sistemas de hepatocitos han demostrado ser la promesa más grande para un soporte del hígado bioartificial. Si se compara con componentes celulares y los sistemas de enzimas aisladas, los sistemas de hepatocitos deberían proveer un número superior de funciones hepáticas, puesto que utilizan células hepáticas metabólicamente activas e intactas (....). Una ventaja más importante del hígado bioartificial de hepatocitos en transplantes tradicionales de hepatocitos y técnicas de soporte anteriores, como la circulación cruzada y la perfusión hepática extracorporal, es que el hígado bioartificial puede ser construido a partir de materiales semipermeables que proporcionan una barrera entre los hepatocitos y el sistema inmunológico huésped. Como resultado la terapia del hígado bioartificial puede ser realizada sin inmunosupresión, y los hepatocitos de distintas especies (xenocitos) pueden ser usados dentro del hígado bioartificial.

Las desventajas de los sistemas de hígados bioartificiales incluyen (...) el problema de mantener la vitalidad y función normal de hepatocitos con la alta densidad de la célula necesaria para la aplicación clínica. Por ejemplo, cuando los hepatocitos se desarrollan en una superficie plástica con un medio de cultivo celular estándar, éstos pierden sus conexiones espaciales en aproximadamente 12 a 24 horas: también se aplanan y se vuelven un granulado: las funciones específicas del tejido se pierden en 3 a 5 días, seguido de la muerte del hepatocito en 1 a 2 semanas. Como resultado, las técnicas perfeccionadas del cultivo celular se han vuelto necesarias para la aplicación de sistemas de soporte del hígado bioartificiales''.

Varias aproximaciones diferentes al cultivo de hepatocitos y a las células relacionadas para el uso en o como sistemas BAL han sido descritas. No obstante, los sistemas de hepatocitos de las técnicas precedentes también tienen problemas con respecto a la capacidad y al tiempo de funcionamiento eficaz, véase Sussman y Kelly: ``Con respecto al suministro de la capacidad metabólica suficiente, no está claro exactamente cuánta necrosis hepática es fatal. Los experimentos en animales sugieren que al menos el 30% de la función original del hígado debe ser conservada para sobrevivir. El hígado de humano adulto contiene aproximadamente 1000 gm de hepatocitos, que son las células metabólicamente activas. Por ello, hemos propuesto que la asistencia eficaz del hígado requerirá el equivalente de 300 a 400 gm de células.

Dos fuentes de hepatocitos están disponibles: células recién aisladas (cultivos primarios) y células desarrolladas en cultivo continuo (células clonadas o inmortalizadas). Las células que han sido aisladas de un hígado normal humano o animal conservan muchas de sus funciones (....) la tecnología tiene limitaciones severas. Los hígados artificiales que usan células recién aisladas han proporcionado por el momento sólo una fracción de la capacidad metabólica necesaria. Los hepatocitos no se dividen después de ser aislados, de tal manera que se requiere una provisión estable de células nuevas. Esto junto con la naturaleza intensiva y costosa de la preparación celular, hace que sea casi imposible ampliar proporcionalmente la producción para conocer las necesidades actuales de una forma muy eficaz. Además, las células aisladas recientemente no parecen durar mucho tiempo durante el tratamiento. Un dispositivo para asistir al hígado que dura sólo de 6 a 7 horas, como algunos han demostrado, evidentemente no llega a permitir la regeneración del hígado. Finalmente, la producción de cualquier dispositivo de este tipo usando células animales implica varios problemas, especialmente en áreas de esterilidad y variabilidad lote-a-lote''.

Uchino et al, ASIAO Transactions 1988;23;972-977 describen un hígado bioartificial híbrido compuesto por monocapas de hepatocitos en multiplaca. Un total de 80 gramos de hepatocitos de perro adulto cultivados fueron cultivados en un reactor que comprendía una pila de 200 placas de vidrio borosilicado revestidas de colágeno. Estos hepatocitos fueron vitales y funcionaron bien durante 4 semanas en cultivo de perfusión. Este hígado bioartificial fue evaluado en perros antihepáticos. La supervivencia más larga obtenida fue de 65 horas.

No obstante, un inconveniente serio de este sistema, además de la complejidad de construcción y de utilización de un reactor de 200 placas de vidrio, consiste en que el cultivo de monocapas de hepatocitos en dichas placas excluye la formación ventajosa de agregados de hepatocitos. Es bien conocido en la técnica que los hepatocitos cultivados en o como agregados funcionan durante más tiempo y mejor que los hepatocitos cultivados en monocapas, mostrando una actividad más grande y mejor diferenciación.

Otro enfoque en el desarrollo de sistemas de hígados bioartificiales ha sido el uso de biorreactores de fibras huecas donde están presentes las células hepáticas en el espacio extrafibroso (extraluminal) mientras que un medio líquido es bombeado a través del lumen de la fibra (espacio intraluminal), normalmente por perfusión con sangre o plasma.

Rozga, Demetriou et al. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 43 (1994), dan una visión de conjunto de los sistemas de fibras huecas actuales. Este sistema consiste en un circuito de perfusión de plasma de flujo elevado que comprende una columna de carbón vegetal y un módulo poroso de fibras huecas con de 5 a 6 X 10^{9} hepatocitos porcinos con un microportador (microcarrier) anexo incorporado en el compartimiento extrafibroso. A causa del uso del soporte sólido (microportadores de dextrano revestidos con colágeno), el área de superficie disponible para la fijación de hepatocitos es aumentado.

No obstante, este diseño requiere un oxigenador de membrana separado para la oxigenación del plasma que sea incorporado en el circuito de perfusión para proporcionar el oxígeno suficiente a los hepatocitos en el módulo de fibras huecas. En consecuencia, dicha oxigenación así como la eliminación de dióxido de carbono dependen de factores limitantes como la solubilidad de oxígeno y dióxido de carbono en el plasma y el transporte del plasma oxigenado por todo el reactor. A causa de estas limitaciones dicho reactor de fibras huecas no puede fácilmente ser ampliado hasta una capacidad requerida para una aplicación terapéutica práctica.

Además, este reactor se usa con una columna de "conducto cerrado" con una densidad elevada de los macroportadores, que conduce a la formación de gránulos de microportadores y a problemas de transferencia de masa con respecto a las células en el centro de un gránulo de este tipo.

Otra desventaja de este sistema es que los hepatocitos primero tienen que ser inmovilizados en el microportador antes de que los hepatocitos puedan ser introducidos en el reactor de fibras huecas. Esto implica complicar también las fases de tratamiento pudiendo conducir a la pérdida de la vitalidad de la célula.

Sussman y Kelly, mencionados anteriormente, describen un sistema de hígado bioartificial basado en fibras huecas donde las células hepáticas están fijadas a capilares a través de los cuales toda la sangre del paciente es bombeada.

Según este sistema, las células del hígado son oxigenadas por la sangre del paciente, porque - como ha sido declarado por los autores- el plasma no proporciona la capacidad portadora del oxígeno de toda la sangre.

Además, la perfusión con toda la sangre puede llevar a que sus fibras y/o poros queden atascados dentro del biorreactor, este problema podría resolverse solamente mediante la sustitución total del módulo de fibras huecas, lo que requiere un nuevo aislamiento/inmovilización de los hepatocitos.

Otras desventajas de éste y otros sistemas de fibras huecas que usan toda la sangre como medio líquido son que "la membrana de las fibras huecas tiene que actuar primero como separadora del plasma antes de que el transporte significativo de sustancias nutritivas y metabolitos puedan producirse en la pared fibrosa", y que esto "requiere una anticoagulación sistémica con heparina para prevenir la coagulación en el módulo".

También, con el objetivo de superar problemas con el aislamiento de células, en este sistema BAL se usa una línea celular especial llamada C3A derivada de un tumor hepático de un niño. No obstante, con respecto a la actividad y función, el uso de este tumor derivado de líneas celulares es generalmente menos preferida en la técnica que el uso de hepatocitos primarios aislados, también desde un punto de vista de seguridad.

Además, la línea celular C3A usada por Suzman carece de algunas funciones trascendentales de hepatocitos primarios. También, las células C3A son menos diferenciadas, y en consecuencia menos activas que las células hepáticas primarias.

Un sistema de fibras huecas algo diferente está descrito por Nyberg et al, mencionado anteriormente: los hepatocitos son suspendidos en un gel de colágeno, que se inyecta en el lumen de las fibras huecas. Después de esto, el espacio extrafibroso del biorreactor es sometido a perfusión con el medio durante 24 horas, tras lo cual el gel se contrae en las fibras, creando de ese modo un tercer espacio que es sometido a perfusión con el medio.

La idea detrás de este diseño de tres compartimentos es que la sangre puede ser presionada a través del compartimento extrafibroso, mientras que las células atrapadas en el gel son nutridas y posiblemente estimuladas por los factores presentes en el medio que fluye a través de una vía adyacente al colágeno contraído.

No obstante, este sistema también requiere una preinmovilización complicada y prolongada de los hepatocitos.

Otro sistema BAL basado en capilares para la inmovilización de hepatocitos está descrita por Gerlach et al., Transplantation, Vol. 58, No. 9 (1994). Su biorreactor consiste en una estructura tridimensional para la perfusión de células descentralizadas con gradientes bajos de metabolitos y oxigenación descentralizada y eliminación de CO_{2}, lo que consiste en una red tejida de cuatro sistemas de membranas capilares específicas, cada una de las cuales sirve para objetivos diferentes, es decir I, flujo de plasma (fibras de poliamida); II, oxigenación y eliminación de dióxido de carbono (fibras de polipropileno hidrofóbico o fibras de silicio); Ill, escape de plasma (fibras de polisulfono); y IV, cocultivo endotelial sinusoidal (fibras de polipropileno hidrofílico). Estos capilares deben ser tejidos de tal manera que la mayoría de hepatocitos tengan cuatro tipos de membranas en su entorno.

Este reactor fue usado con 2.5 X 10^{9} hepatocitos porcinos con una vitalidad entre el 88 y 96%, que fueron cocultivados con células endoteliales sinusoidales autólogas presentes en el compartimento cocultivado del reactor.

En este tipo de biorreactor de fibras huecas las células hepáticas tienen que ser unidas directamente a las fibras huecas ya que ningún material matricial adicional para la fijación de las células está presente en el reactor. Con el objetivo de obtener una fijación suficiente de las células, las superficies de las fibras deben primero ser revestidas con un producto proteínico de membrana basal, como Matrigel^{R} u otros materiales a base de colágeno, lo que requiere una fase de pretratamiento separada y costosa. Aun así, puesto que las fibras huecas no están específicamente diseñadas y/o adecuadas para el uso como un soporte sólido en el cultivo de las células, la fijación y la velocidad de éstas permitida por y/o que se puede obtener con dichos reactores están limitadas y se requiere unas cargas de inóculo pesadas en el sembrado del reactor.

Además, la distancia media de las fibras dentro de dicha estructura fibrosa tridimensional es aproximadamente de 500 \mum, llevando a la formación de grandes agregados celulares de tamaño similar. Nuevamente, estos agregados de gran tamaño pueden llevar a problemas de transferencia de masa con respecto a las células en el centro de dicho agregado.

También, es bien conocido que las fibras huecas son difíciles de tratar, y por ello la producción de la red fibrosa tridimensional tan complicada descrita por Gerlach et al., que comprende cuatro sistemas capilares específicos separados, tiene una desventaja desde el punto de vista económico. También, este reactor es complicado de activar, y requiere unos sistemas de control múltiples separados de entrada/salida.

Un problema general de todos los biorreactores de fibras huecas de la técnica precedente mencionados anteriormente es que el medio líquido (sangre, plasma) a tratar está separado de los hepatocitos por la membrana de fibras huecas; en otras palabras, que no hay ningún contacto directo entre el medio líquido y los hepatocitos en el reactor. Las sustancias nutritivas y sustancias que deben ser extraídas del medio líquido y/o ser segregadas en el medio líquido, tienen que pasar a través de dicha barrera de membrana con el objetivo de alcanzar los hepatocitos y el medio líquido, respectivamente. El pasaje a través de la membrana puede conducir a fenómenos de transporte que pueden limitar la transferencia de masa alcanzable, y en consecuencia la eficacia del sistema BAL.

También, las membranas pueden ser obstruidas, especialmente cuando se usa la perfusión con sangre. En este caso el sistema BAL o partes de éste tienen que ser reemplazadas, lo que significa que la terapia debe ser interrumpida o incluso detenida.

Otro factor de limitación importante en el transporte de membrana es el corte del peso molecular de la membrana, véase Nyberg et al: ``Permeabilidad y total eliminación de la influencia del corte del peso molecular de la membrana, entrega de producto, y activación inmunológica. El rendimiento de las funciones de biotransformación y la eliminación de desechos nitrogenados son importantes funciones del hígado bioartificial, junto con la eliminación de productos de descomposición de glóbulos rojos como la bilirrubina. La producción de proteínas de coagulación y otras proteínas séricas por hepatocitos en el hígado bioartificial puede también ser provechosa para pacientes con fallos hepáticos. No obstante, estas proteínas son de tamaños similares a los anticuerpos, que podrían tener un efecto adverso cuando se dirigen contra hepatocitos no autólogos en el biorreactor. De forma alternativa, los pequeños productos peptídicos de los hepatocitos pueden salir del biorreactor y servir de estimulante antigénico en el paciente. Si estas moléculas externas dan como resultado la producción de citoquina nociva, la formación de un inmunocomplejo, o enfermedad del suero en pacientes con insuficiencia hepática sigue siendo determinada. Los efectos secundarios potenciales deben ser dirigidos experimentalmente con el objetivo de determinar el mejor corte de peso molecular para el uso en el hígado bioartificial.

El tratamiento clínico de la insuficiencia hepática requiere un cultivo de hepatocitos a gran escala y densidad elevada. En muchos biorreactores esto da lugar al aumento de la formación de gránulos de hepatocitos no fisiológicos. Los hepatocitos en el centro de estos grandes agregados muestran poca actividad metabólica y posible necrosis incluso debido a los gradientes elevados como resultado del transporte impedido de sustancias nutritivas y oxígeno y dióxido de carbono, toxinas y productos celulares de estas células. Esto se produce a diferencia del hígado in vivo donde cada hepatocito está en contacto cercano con la sangre. Además, en la mayoría de los sistemas, el intercambio de sustratos depende de la difusión que también limita la transferencia de masa en comparación con la situación in vivo donde los hepatocitos funcionan bajo condiciones de perfusión con gradientes bajos.

También, los biorreactores de la técnica precedente están limitados con respecto a la cantidad de medio líquido que puede ser retirada del lumen de fibras huecas, ya que el transporte de fusión en general será demasiado lento. En consecuencia, se requerirá una retirada activa de medio líquido del interior de las fibras huecas, aun así, el flujo total a través de la membrana de fibras huecas será muy lento y/o conducirá a la formación indeseada de gradientes, incluso con un alto flujo de medio líquido a través de las propias fibras huecas.

Otro problema general con los sistemas de hígado bioartificial de la técnica precedente es que éstos requieren el uso de preparaciones de células hepáticas con vitalidad elevada (> 80%) y fijación elevada. Como ya han declarado Sussman y Kelly anteriormente, la producción de estas células es un proceso muy costoso, complejo y que lleva mucho tiempo y requiere el aislamiento y el cultivo posterior de células hepáticas adecuadas con la vitalidad y cantidad suficientes lo que implica unos procedimientos complicados que no ofrecen de forma fiable los resultados requeridos, incluso cuando son realizados por expertos cualificados.

Además, los sistemas BAL conocidos que contienen hepatocitos no pueden ser almacenados antes del uso durante un periodo temporal prolongado porque la vitalidad y función de las células hepáticas en el reactor no pueden ser mantenidas a un nivel terapéuticamente aceptable.

También, la única técnica disponible para conservar células hepáticas aisladas durante un periodo temporal más largo, es decir crioconservación, no proporciona células que sean adecuadas para el uso con los sistemas BAL conocidos, véase Rozga et al, mencionado anteriormente: "la disponibilidad de células en demanda se ha convertido en una consideración muy importante en la preparación clínica donde se realiza el tratamiento de pacientes con FHF con urgencia, con poco tiempo de aviso y a todas horas. No obstante, [crioconservación] puede dar como resultado una pérdida significante de vitalidad celular [...] y fijación (hasta un 50%). [...] En consecuencia, en las preparaciones clínicas, preferimos el uso de hepatocitos recién aislados y bien fijados"

A causa de estos problemas, los sistemas BAL conocidos no pueden ser usados como unidades "de disponibilidad inmediata" que pueden ser guardadas y/o mantenidas en hospitales hasta que se requiera su uso, como es el caso de otros sistemas artificiales para el soporte de órganos como por ejemplo máquinas de diálisis o de corazón artificial o sistemas largos. También, la sustitución durante la terapia de un sistema BAL basado en células hepáticas primarias gastadas de la técnica precedente con función insuficiente con un sistema BAL reciente normalmente no es factible desde el punto de vista económico durante un periodo temporal prolongado.

Por ejemplo, Demetriou relata que después de 6 horas de uso, el 50% de las células hepáticas primarias dentro de su reactor murieron, mientras que en 24 horas todas las células murieron. Se han obtenido mejores resultados usando células inmortalizadas o la línea celular C3A relatada por Sussman et al., no obstante, el uso de esta línea celular derivada de hepatoblastos tiene otras desventajas como se ha mencionado anteriormente.

En vista de lo anterior, hay una necesidad continuada de sistemas de hígados bioartificiales que no tienen las desventajas anteriormente mencionadas de los sistemas de la técnica precedente.

La solicitud de patente británica 2,178,447 describe una matriz para el cultivo de las células in vitro que proporcionan una mayor área de superficie eficaz disponible para la fijación de las células proporcionada por una red de fibras o espuma de poros abiertos con un tamaño de poro adecuado de 10 \mum a 100 \mum. Este material matricial puede ser proporcionado en forma de hoja o tapiz o en forma de partículas o copos, esta última forma está comercializada por Bibby Sterilin bajo el nombre Fibra-Cel^{R}. Como hoja o tapiz, este material matricial tiene una apariencia similar al papel de filtro o papel de seda, o fieltro poroso fino.

Este material matricial tiene algunas ventajas especificas sobre microcápsulas, que son costosas y delicadas de producir y dan problemas con un crecimiento elevado de la densidad de la célula, porque frecuentemente las células del centro de la cápsula se mueren. También, estas microcápsulas pueden estallar prematuramente perdiendo su contenido y cada inoculación nueva requiere un nuevo procedimiento de encapsulación. En comparación con los microportadores el material matricial según GB-A-2,178,447 tiene la ventaja de que las células son inmovilizadas dentro de la estructura matricial. Con los microportadores, estas células son inmovilizadas en el exterior de las partículas portadoras, haciéndolas susceptibles a la fuerza de cizalla y a las colisiones de partículas, por ejemplo durante la preparación o llenado del reactor.

Además, en el material matricial según GB-A-2,178,447, las células pueden proliferar a lo largo de las fibras de la hoja en tres dimensiones (3D), mejor que en dos dimensiones como en botellas de cultivo de tejido convencionales, frascos o placas Petri o en microportadores o fibras huecas. Las células pueden unirse por sí mismas a más de una fibra y el desarrollo celular se produce en el volumen interno de la matriz fibrosa. Por estos motivos, este material matricial y similares son conocidos en la técnica como "matrices portadoras en 3D".

Otra ventaja de dicho material matricial en 3D es que no requiere cargas pesadas de inóculo de sistemas bidimensionales (20-30% de la cantidad final de células en saturación), pero puede ser inoculado en cantidades inferiores al 10%, e incluso hasta el 5%. La red tridimensional proporciona una "captura" más alta - y más rápida - de las células, permitiendo así también usar células con una fijación inferior a la adecuada.

El documento GB-A-2,178,447 además describe varias geometrías de un biorreactor potencial que utiliza el material matricial descrito en el mismo. Una de éstas comprende una hoja de dicho material matricial, enrollado en una espiral entre dos tubos aplanados, donde cada tubo aplanado alterno sirve a un conducto, uno para el medio nutritivo líquido, y el otro para gases como oxígeno, aire, CO_{2} y vapor de agua.

No obstante, el documento GB-A-2,178,447 no está dirigido a la construcción de sistemas de hígados bioartificiales, ni a los problemas específicos sobre el cultivo y/o conservación de hepatocitos en éstos. En particular, GB-A-2,1 78,447 no hace referencia al problema especial de suministrar el oxígeno suficiente a los hepatocitos altamente dependientes de oxígeno.

De hecho, el uso del reactor "enrollado en espiral" según GB-A-2,1 78,447 para cultivar y/o conservar hepatocitos en la práctica conducirá a una oxigenación insuficiente, puesto que el oxígeno es suministrado sólo mediante un conducto cubriendo toda la longitud del tapiz de la matriz. El uso de un único conducto de este tipo conduciría a la generación de un gradiente de oxígeno indeseado a lo largo de su longitud o incluso a una depleción de oxígeno local, especialmente cuando el reactor es ampliado mediante el aumento del número de enrollamientos matriciales.

También, la construcción de un biorreactor según GB-A-2,11 78,447 contempla un conducto separado para la introducción y/o eliminación del medio líquido, de modo que durante el uso como un BAL, las sustancias nutritivas, toxinas y otras sustancias que deben ser absorbidas o segregadas tendrían que pasar a través de la membrana que rodea a dicho conducto con el objetivo de alcanzar los hepatocitos, dando los problemas respectivos al transporte de la membrana y a la transferencia de masa como se ha descrito anteriormente.

Además, el uso de un conducto en espiral singular para el transporte de líquidos puede conducir a una alimentación no homogénea de medio líquido a todas las partes del biorreactor, por ejemplo por la generación de gradientes indeseados. Otros biorreactores descritos en la técnica precedente, por ejemplo DE A 4 218 917 y GB A 2 178 477 usan sólo un único conducto para la alimentación combinada del medio y de oxígeno.

Todos estos factores hacen un material matricial como tal y el biorreactor según GB-A-2,1 78,447 inapropiado para el uso en el cultivo de células hepáticas y/o para el uso como un BAL.

Objetos de la invención

Es en consecuencia un primer objeto de la invención el hecho de proporcionar un soporte sólido y biorreactor perfeccionados para el cultivo y/o conservación de células adherentes, células especialmente hepáticas, con propiedades de adherencia celular perfeccionadas e introducción y/o eliminación perfeccionadas de componentes gaseosos como oxígeno y dióxido de carbono, incluso cuando se usa en o como un biorreactor a gran escala.

Es otro objeto de la invención el hecho de proporcionar un soporte sólido perfeccionado y biorreactor que permita el contacto líquido directo entre las células y el medio líquido que se debe tratar mientras que al mismo tiempo se mantiene un flujo homogéneo de medio líquido por todo este soporte.

Es otro objeto de la invención el hecho de proporcionar un método para el cultivo de células hepáticas, con el que se puedan mantener vitales las células hepáticas en una cantidad y durante un periodo temporal que sean prácticos para el uso en un hígado bioartificial.

Otro objeto de la invención es el hecho de proporcionar un hígado bioartificial con características terapéuticas perfeccionadas que puedan utilizarse para reemplazar y/o complementar la función del hígado de un paciente.

Otro objeto adicional de la invención es el hecho de proporcionar un método para el tratamiento de la insuficiencia hepática, insuficiencia hepática especialmente aguda, usando un hígado bioartificial.

Otros objetos adicionales de la invención serán evidentes a partir de la descripción a continuación.

Breve descripción de la invención y de las figuras

Ahora se ha hallado que un soporte sólido perfeccionado para el cultivo de células puede ser obtenido suministrando un material matricial en 3D como se ha descrito anteriormente, y en particular el material matricial según GB-A-2,178,447, con fibras huecas para introducir y/o eliminar componentes gaseosos como oxígeno y/o dióxido de carbono, dicho soporte sólido siendo especialmente adecuado para el cultivo de células tisulares adherentes, como células hepáticas humanas o animales.

También se ha encontrado que un sistema de hígado bioartificial perfeccionado puede ser proporcionado usando el soporte sólido de la invención.

En términos generales, la invención en consecuencia se refiere a

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un soporte sólido, que comprende un material matricial en 3D y fibras huecas para el transporte de gases;

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un método para preparar dicho soporte sólido, que comprende la unión de fibras huecas a un material matricial en 3D;

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un reactor biológico, que comprende el soporte sólido de la invención;

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un método para el cultivo y/o conservación de células, células tisulares especialmente adherentes, y en particular células hepáticas, usando el soporte sólido y/o el biorreactor de la invención;

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un sistema de hígado bioartificial, que comprende el soporte sólido y/o el biorreactor de la invención;

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un método para la sustitución y/o soporte de funciones hepáticas en un paciente, y/o un método para el tratamiento de trastornos hepáticos, que comprende el uso del sistema de hígado bioartificial de la inven- ción.

Otros aspectos adicionales, formas de realización y ventajas de la invención serán evidentes mediante la descripción a continuación y las figuras, en las que

La Figura 1 muestra una vista frontal del soporte sólido preferido de la invención;

La Figura 2 muestra una vista en corte transversal del soporte sólido preferido de la invención en la configuración de tipo sándwich;

La Figuras 3 y 4 muestran dos geometrías posibles de los biorreactores de la invención;

Las Figuras 5 a 9 muestran cuatro configuraciones posibles del sistema de hígado bioartificial de la invención;

La Figura 10 muestra una forma de realización alternativa del soporte sólido de La invención, que comprende hojas de matrices separadas y hojas de fibras huecas.

La Figura 11 muestra de forma esquemática un aparato para inmovilizar células dentro del biorreactor de la invención.

La Figura 12 muestra de forma esquemática una construcción posible de un biorreactor de la invención.

La Figura 13 muestra una microfotografía microscópica ligera de un corte transversal de la matriz en 3D de un biorreactor de hepatocitos cultivado con 20.10^{6} células vitales/ml durante cinco días.

La Figura 14 muestra una micrografía de barrido electrónico de hepatocitos porcinos aislados cultivados durante cinco días en la matriz en 3D del dispositivo biorreactor con 20.10^{6} células vitales/ml.

Las Figuras 15A y 15B muestran MRI's sensibles de flujo transaccional de un diámetro interno (1.32 cm) pequeño (A) y un diámetro interno (2.2 cm) de un biorreacctor ampliado (B).

El soporte sólido

El soporte sólido de la invención en general comprende un material matricial en 3D y fibras huecas.

Una matriz en 3D está definida aquí como un material que proporciona uno tridimensional para el crecimiento de las células cultivadas en su interior. Estas matrices en 3D son conocidas por un experto en la técnica; algunos Ejemplos son:

1.

Gelfoam (Gelatina, tamaño: 20 mm*7mm, Upjohn Ltd., Tokyo Japón).

2.

PVF (resina formal de polivinilo reticulado y revestido de colágeno, tamaño. 2 mm de material de filtro industrial grueso que tiene una porosidad del 80%, Kanebo Kasei Co., Osaka, Japón).

3.

PVLA-RPU (poliuretano reticulado revestido de poli-N-para-vinilbencil-lactonamida, tamaño: 34 mm diámetro* 1 mm de grueso, Sanyo Chemical Industries, Ltd., Kyoto, Japón).

4.

PGA (ácido poliglicólico), Albany International Research Co., Mansfield, masa.

5.

Alcohol polivinílico (Polivinilalcohol), Unipoint Industries, High-point, NC.

6.

PGA/PLA (ácido poliglicólico/ácido poliláctico, proporción 90:10), Ethisorb.

7.

Espuma de Poliuretano 3D o matriz no-tejida.

8.

Espuma de caucho de silicona poroso (Ashby Scientific Ltd, Leicestershire, Reino Unido).

Preferiblemente, dicha matriz en 3D es un material que proporciona un sustrato con un área de superficie grande, cuya superficie eficaz es de 10 a aproximadamente 100 veces el área del mismo proyectada sobre una superficie plana, que comprende una red fisiológicamente aceptable de fibras que tienen una porosidad del 40 hasta aproximadamente el 95% y un tamaño de poro del orden de 10 \mum a 100 \mum, o una estructura de espuma de poro abierto con un tamaño de poro de aproximadamente 10 \mum a 100 \mum, la altura global de la matriz siendo del orden de 50 \mum hasta aproximadamente 2000 \mum, preferiblemente 100-1000 \mum, dicha matriz teniendo forma de una hoja o tapiz muy poroso, no-tejido.

Este material, así como su preparación, sus ventajas y sus formas de realización preferidas, están descritas en la solicitud de patente Británica 2 178 447, mencionada anteriormente.

La matriz preferiblemente tiene una estructura polimérica de poro abierto expandido con poros de aproximadamente 10 \mum a 100 \mum y una porosidad del 60 al 95%.

La matriz puede estar hecha de cualquier material adecuado mencionado en la solicitud de patente británica 2 178 447, pero preferiblemente está compuesta por un poliéster.

El material matricial puede también ser usado en cualquier forma como se describe en la solicitud de patente británica 2 178 447, pero preferiblemente se usa en forma de una estructura de tejido tridimensional no-tejido como una hoja o tapiz; estas hojas o tapices planos, altamente porosos, no tejidos y su preparación están también descritos en dicha referencia, y pueden ser obtenidas comercialmente por Bibby Sterilin Stone, Staffordshire. U.K.

Es también posible usar una combinación de diferentes hojas matriciales en 3D, por ejemplo una hoja de poliéster no tejida y una hoja de poliuretano no tejida, o una combinación de una estructura no tejida y una tejida. Es también posible usar una hoja en 3D con una densidad variable, es decir una estructura más abierta en el exterior y una estructura más compacta en el interior, que puede proporcionar una captura perfeccionada de células durante la carga del biorreactor.

Cuando se usa en la forma preferida de una hoja o tapiz, dicha hoja o tapiz preferiblemente tiene un espesor de 10 a 1000 \mum más preferiblemente 250 a 750 \mum, y normalmente alrededor de 400-500 \mum y comprende fibras redondas, planas no-redondas o huecas o una combinación de estas fibras del orden de 0.5 \mum a 20 \mum de diámetro o anchura, preferiblemente 10 \mum a 15 \mum y/o derniers preferidos de entre 0.05 y 5 dpf como se describe en dicha referencia.

Dichas fibras están preferiblemente dispuestas en la hoja o tapiz como una forma muy desordenada, de tipo aleatorio, intercruzada, los ejes de las fibras formando un conjunto abierto multidimensional.

Para el uso en el cultivo de células hepáticas y/o en el sistema BAL de la invención, el espesor de la hoja es preferiblemente aproximadamente igual a 0.2 - 0.8 mm, preferiblemente alrededor de 0.5 mm.

Aunque no es fundamental, la hoja generalmente tendrá una anchura de 10 cm a 100 cm, normalmente alrededor de 20 cm.

Las fibras huecas oxigenantes usadas en el soporte sólido deberían ser permeables al menos al oxígeno gaseoso y/o dióxido de carbono gaseoso, y como tales se pueden usar fibras porosas y no-porosas ("cerradas"), siendo preferidas las fibras porosas. En otros aspectos, el corte del peso molecular de las fibras no es particularmente limitado.

Las fibras pueden estar compuestas de cualquier material adecuado, preferiblemente un material hidrofóbico, como silicona, polietileno, polipropileno, polisulfono hidrofóbico, o cualquier otro material hidrofóbico adecuado a partir del cual se pueden hacer fibras huecas, o cualquier combinación de éstas.

Estas fibras y su preparación son conocidas en la técnica; los materiales comercialmente disponibles adecuados son Silastic de Dow Corning (fibras de silicona), Oxyphan y Plasmaphan de Akzo-Nobel (fibras de polipropileno hidrofóbico), fibras hidrofóbicas de polisulfono de Fresenius A.G., Bad Homburg, Alemania, o fibras de polipropileno revestidas en el interior y/o el exterior con caucho de silicio (Applied Membrane Technology, Minnetonka, Minnesota y Neomecs, St. Louis Park, Minnesota).

Las fibras huecas pueden ser tratadas con gas-plasma antes de la incorporación en el material matricial para mejorar sus propiedades hidrofóbicas.

El diámetro externo de las fibras es preferiblemente inferior a 10 mm, más preferiblemente 0.05-5 mm, más preferiblemente 0.1-1.0mm.

Las fibras son preferiblemente igualmente distribuidas por todo el material matricial. Más preferiblemente, están alineadas de forma paralela que vaya de un extremo del material matricial al otro extremo, de ese modo facilitando la construcción del soporte sólido, sin necesidad de formar una red compleja de fibras huecas entrelazadas.

El número de fibras huecas y la distancia entre las fibras individuales en el soporte sólido será tal que todas células que se adhieren al material matricial están suficientemente provistas de oxígeno y con la eliminación suficiente de dióxido de carbono.

Con el objetivo de conseguir esto, la distancia entre las fibras individuales, medidas desde el centro de una fibra hasta el centro de la siguiente, serán usualmente inferiores a 10 mm, más preferiblemente 0.1-5 mm, incluso más preferiblemente 1-3 mm y más preferiblemente alrededor de 2 mm, el número total de fibras estando relacionado con la longitud total de la hoja de la fibra. Preferiblemente, el soporte sólido comprende al menos tres, más preferiblemente al menos diez fibras huecas.

Normalmente, el reactor contendrá 50 a 50,000, preferiblemente 500 a 5000 fibras huecas.

Preferiblemente, las fibras huecas son fijadas y/o conectadas físicamente a dicho material matricial en 3D, aunque la invención no esté limitada a ello, y las formas de realización alternativas se describirán a continuación.

Las fibras pueden ser fijadas al material matricial mediante cualquier método adecuado que no impide que el transporte de oxígeno/dióxido de carbono a través de la pared de la fibra. Como tales las fibras pueden ser tejidas en el material matricial, encoladas en el material matricial, cosidas en el material matricial, conectadas al mismo por ultrasonidos.

Ejemplos de materiales matriciales adecuados en la práctica de la presente invención que comprenden fibras huecas fijadas a una hoja de poliéster no tejida, incluyen los tapices de fibras huecas comerciales que se pueden obtener a partir de AKZO-Nobel, (Wuppertal, Alemania) y de Microgon (Laguna Hils, CA, EEUU).

Para mejorar la unión y/o no dañar el material matricial, el material matricial puede primero ser laminado con una hoja de poliamida o de silicona adecuada o una malla de polipropileno gruesa como se describe en GB-A-2,178,447, tras lo cual las fibras son conectadas a dicha hoja o malla por los métodos descritos anteriormente.

Cuando el material matricial es en forma de hoja o tapiz, las fibras huecas pueden ser fijadas a ambos lados del material matricial, pero son fijadas preferiblemente sólo a un lado del tapiz de la matriz.

Según una forma de realización preferida, cuya geometría general está mostrada en la figura 1, el material matricial de la invención consiste en una matriz de poliéster 1 en 3D según GB-A-2 178 447, provista de fibras huecas porosas hidrofóbicas paralelas 2 con un diámetro de aproximadamente 0.7 mm, que están distanciadas a una distancia de aproximadamente 2 mm, tejidas en el material matricial o conectadas a uno de sus lados.

Un material de soporte sólido de este tipo proporciona facilidad de producción, y puede ventajosamente ser usado en la configuración "sándwich" mostrada en la figura 2, que comprende una pluralidad de hojas 1, donde cada hoja se encuentra a ambos lados rodeada por las fibras huecas 2, y viceversa, siendo 3 el espacio intraluminar (lumen de la fibra) y siendo 4 el espacio extraluminal.

En esta configuración de tipo sándwich, además de proporcionar una introducción y eliminación perfeccionada de gases, las fibras ventajosamente también actúan como un separador entre las hojas de fibras individuales, y sirven como un medio deflector y/o de canalización para proporcionar un flujo uniforme y una distribución del medio líquido a través del espacio extraluminal 4 por todo el soporte sólido.

Además, las fibras 2 proporcionan soporte físico a las hojas matriciales 3, lo cual es especialmente importante cuando el soporte sólido tiene que ser sometido a una gran cizalla, como un flujo líquido.

Cuando se usa la configuración de tipo sándwich, es posible que las fibras de capa individual a capa individual sean ligeramente angulares entre sí, o incluso perpendiculares.

Según otra forma de realización preferida mostrada en la figura 10, el soporte sólido comprende una hoja matricial en 3D separada 26 y una hoja separada que contiene fibras 27, por ejemplo obtenida para tejer fibras en una hoja o unir fibras individuales entre sí, y estas hojas y su preparación son muy conocidas en el campo de preparación de fibras huecas.

En una hoja de fibras separadas de este tipo, las fibras pueden ser paralelas en una dirección, o la hoja puede comprender dos, tres o más conjuntos de fibras paralelas donde los conjuntos de fibras paralelas son perpendiculares o angulares entre sí. Una hoja de este tipo puede por ejemplo ser obtenida tejiendo las fibras huecas de tal manera que se obtenga el número deseado de conjuntos de fibras huecas y también el ángulo deseado entre estos conjuntos.

En una hoja de este tipo que comprende conjuntos diferentes de fibras huecas, las fibras pueden también estar hechas de materiales adecuados diferentes como se ha mencionado anteriormente, dependiendo del uso final de dicho grupo de fibras. Pueden también tener diámetros diferentes, puesto que pueden ser entretejidas para formar la hoja de fibras huecas deseada.

La hoja que contiene las fibras puede ser laminada sobre una hoja del material matricial. Es también posible unir el material matricial, por ejemplo en forma de copos, a una hoja de fibras huecas de este tipo. Todas estas formas de realización son también preferiblemente usadas en una configuración de tipo sándwich como se muestra en la figura 10.

En todos los demás aspectos, esta forma de realización comprende los mismos aspectos preferidos y ventajas que se han mencionado anteriormente.

Finalmente, aunque el soporte sólido de la invención generalmente no requiera una fase de pretratamiento antes del uso, como los reactores de fibras huecas de la técnica precedente, está comprendido dentro del campo de la invención el hecho de tratar todo el soporte sólido, o sólo las fibras huecas o tapiz que contiene fibras huecas, con materiales matriciales extracelulares, como Matrigel, poli-N-para-vinilbencil-lactonamida o materiales a base de colágeno, conocidos en cierto modo per se, para así mejorar la adhesión celular. También, el soporte sólido puede estar provisto de una hoja de un material impermeable como poliamida, poli-fluoretileno o o silicona, por ejemplo laminándose en la hoja de la matriz o enrollándose o apilándose con el soporte sólido de la invención, así hasta que se formen pequeños compartimentos dentro del soporte sólido para mantener una distribución celular homogénea.

Otras formas de realización ventajosas serán evidentes para el experto en la técnica y están comprendidas dentro del campo de la invención.

Geometría y construcción del biorreactor

En general el biorreactor de la invención comprende un vaso adecuado, consistente en una pared que incluye un espacio, provisto del soporte sólido de la invención.

El soporte sólido es preferiblemente en forma de tapiz u hoja, más preferiblemente de la configuración "sándwich" mostrada en la figura 2. Existen dos vías preferidas para obtener dicha geometría del reactor.

Según la forma de realización mostrada en la figura 3, el soporte sólido 5 se encuentra en el reactor 6 en forma de tapiz u hoja enrollada en espiral del material matricial, siendo 7 la pared del vaso del reactor. Según esta forma de realización el reactor normalmente será un cilindro.

Según la forma de realización mostrada en la figura 4, el soporte sólido 8 está presente en el reactor 9 como capas apiladas, siendo 10 la pared del vaso del reactor. Según esta forma de realización, el reactor normalmente tendrá una forma de caja. También, las capas individuales de soporte sólido pueden ser apiladas con un ángulo, por ejemplo con unos ángulos rectos, dándole la configuración perpendicular de fibras huecas mencionada anteriormente.

El soporte sólido/biorreactor de la invención puede también comprender una hoja alternante de hojas de material matricial y hojas que contienen fibras huecas como se muestra en la figura 10, u hojas de fibras huecas con el material matricial presente entre las hojas, o unido a las hojas, o puede comprender un laminado de una hoja de material matricial y una hoja de fibras huecas, como se ha descrito anteriormente.

En todas estas geometrías del reactor, es posible que existan incorporados en el soporte/reactor dos, tres o más conjuntos separados (preferiblemente) de fibras huecas paralelas, donde cada grupo de fibras es angular o perpendicular a uno o más de los otros conjuntos de fibras presentes en el reactor.

Estos conjuntos diferentes de fibras pueden ser obtenidos por cualquiera de los métodos descritos anteriormente, por ejemplo apilando las capas individuales de material matricial con fibras huecas físicamente fijadas a éstas con un ángulo entre sí, usando placas de fibras huecas separadas que comprenden dos, tres o más conjuntos individuales de fibras con un(os) ángulo(s) entre sí como se ha descrito anteriormente, usando placas separadas de material matricial y material de fibras huecas y colocando las placas de fibras huecas con un(os) ángulo(s) entre sí, o cualquier combinación de esto, como el uso de una hoja de material matricial con fibras huecas físicamente fijadas a éstas apiladas con un ángulo con una hoja separada de fibras huecas.

Cuando existen diferentes conjuntos de fibras huecas, estos conjuntos pueden ser hechos de los mismos materiales distintos de fibras huecas adecuados y pueden tener diámetros diferentes etc., dependiendo del uso final de dicho grupo de fibras.

Otras geometrías del reactor adecuadas serán evidentes para el experto en la técnica, y estarán comprendidas dentro del campo de la invención. En todo caso la geometría será de tal manera que durante el uso todas las células en el biorreactor estén en la proximidad adecuada a las fibras de oxigenación, de modo que puedan ser proporcionadas adecuadamente con oxígeno.

También, para la mayoría de aplicaciones, y especialmente para el uso como o en un BAL, la geometría del reactor es preferiblemente de tal manera que la mayoría o preferiblemente todos los medios líquidos introducidos a través del vaso del reactor se pondrán en contacto con las células inmovilizadas en el soporte sólido.

Todas las geometrías del reactor mencionadas anteriormente que comprenden dos o más conjuntos de fibras huecas deberían no obstante ser distinguidas de la geometría del reactor descrita por Gerlach et al que comprende una red tridimensional de fibras huecas: En el reactor de Gerlach, no hay ningún material matricial en 3D separado para la adhesión celular, de modo que las células tienen que adherirse a las fibras huecas por sí mismas. Para que esto sea posible, las fibras huecas usadas en el reactor de Gerlach tienen que estar entretejidas para formar la red tridimensional requerida. También, en esta red, la distancia entre las fibras huecas entretejidas individuales debe ser tan pequeña como para permitir la adhesión tridimensional de las células hepáticas a estas fibras. Será evidente que esto provocará que la red en 3D de fibras huecas según Gerlach et al sea de muy difícil y costosa producción.

Según la presente invención, la adhesión celular es esencialmente proporcionada por el material matricial en 3D, y no por las fibras huecas, de modo que no se requiere una red de fibras huecas tridimensional para proporcionar la fijación celular en 3D. (Por ejemplo, en todas las geometrías del reactor anteriores, hay una red esencialmente bidimensional de fibras huecas con los conjuntos de fibras dispuestos en el mismo plano(s) - en el caso de conjuntos de fibras entretejidas -o en paralelo -en el caso de conjuntos de fibras apiladas- dentro del soporte sólido).

Será evidente que a causa de esto la distancia entre las fibras huecas individuales en el soporte sólido de la invención es menos fundamental y pueden ser más grande que en el reactor de Gerlach, puesto que se puede obtener una oxigenación suficiente de todas las células presentes dentro de la matriz.

También, el soporte sólido de la invención con conjuntos diferentes de fibras es más fácil de producir simplemente apilándose usando una hoja de fibras bidimensional que comprende dos o más conjuntos de fibras paralelas.

El reactor de la invención normalmente comprende una entrada/salida de gases operativamente conectada a las fibras huecas, de modo que el gas pueda ser introducido y extraído del lumen de las fibras huecas.

El reactor normalmente también comprende al menos una entrada y salida de líquidos, operativamente conectada al espacio extrafibroso, a través del cual un medio líquido pueda ser introducido o extraído de dicho espacio de extrafibroso o las células presentes en su interior. El reactor puede comprender entradas y salidas adicionales para ambos gases, líquidos y/o sólidos, según se requiera.

El reactor puede también comprender todos los elementos conocidos de reactores biológicos, como bombas de gas y/o líquido operativamente conectadas a las diferentes entradas o salidas; medios para medir y/o controlar la temperatura dentro del vaso del reactor; medios de acceso, como una escotilla, para acceder al interior del reactor; medios de inspección; sondas y medios para su inserción, como sondas para medir la vitalidad como también se describe a continuación, etc.

El reactor puede adicionalmente estar provisto de medios para el control automático de las diferentes funciones del reactor, como unos medios informáticos operativamente conectados a las bombas, medios de control de la temperatura etc.

El reactor puede también estar provisto de medios para agitar el reactor, como un motor eléctrico, por ejemplo para girar el reactor a lo largo de uno de sus ejes, o con medios para su agitación dentro del reactor, aunque esto normalmente no es preferido.

La pared del vaso de reactor puede ser hecha de cualquier material inerte adecuado, como vidrio, plástico como plexiglás, o metales, y policarbonato o polisulfono, estos últimos materiales son adecuados para la esterilización preferida por vapor. El interior del vaso del reactor puede estar provisto de un revestimiento especial compatible con las células a cultivar.

El tamaño del reactor no es limitado y normalmente dependen de la capacidad requerida. El volumen del reactor puede en consecuencia variar de 1 ml a 1000 litros.

Será evidente que para las geometrías del reactor anterior, el soporte sólido de la invención, en particular cuando se usa en forma de hoja o tapiz con las fibras huecas fijadas a ello, garantiza facilidad de construcción, en particular en comparación con el biorreactor que contiene la red capilar de Gerlach et al como se ha descrito arriba. El soporte sólido puede también ventajosamente servir para adaptar un reactor existente para su uso con el método de la invención.

Por ejemplo, la geometría del reactor de la figura 3 puede simplemente ser obtenida enrollando una hoja del soporte sólido de la invención y colocando dicha hoja de soporte enrollada en el vaso del reactor. Será evidente que la dimensión del soporte sólido será tal que una vez enrollado, se ampliará, teniendo preferiblemente una dimensión esencialmente correspondiente a la dimensión del vaso del reactor. Si fuera necesario el soporte sólido puede ser cortado en el tamaño deseado antes o después de haber sido enrollado. De la misma forma, la geometría del reactor de la figura 3 puede ser obtenida apilando una o más hojas del soporte sólido de un tamaño adecuado, o plegando una o más hojas en el vaso del reactor.

Como se ha mencionado arriba, es también posible enrollar una hoja separada del material matricial y una hoja que contenga fibras, o apilar capas separadas alternadas del material matricial y material que contenga fibras.

En todas estas configuraciones, las fibras huecas proporcionarán un soporte físico al soporte sólido enrollado o apilado, así como proporcionarán un flujo perfeccionado de líquido a través del espacio extrafibroso.

Será evidente que, en general, la cantidad de soporte sólido presente dentro el vaso del reactor, así como las dimensiones relativas, generalmente dependerán de y/o serán adaptadas al volumen y a las dimensiones del vaso del reactor.

El vaso del reactor puede también contener unos medios para soportar y/o mantener en su sitio el soporte sólido enrollado o apilado, como será evidente para un experto en la técnica.

Después de que el soporte sólido haya sido puesto en posición dentro del vaso del reactor, las fibras huecas así como el espacio extrafibroso pueden ser operativamente conectadas a las distintas entradas y salidas de gases y entradas y salidas de fluidos, respectivamente, que generalmente formarán parte del vaso del reactor, opcionalmente a través de o por medio de unos medios de distribución que garantizan una distribución uniforme del flujo de gases y/o del flujo de líquidos a través del reactor.

Según la forma de realización preferida de la invención, donde las fibras son unidireccionales, las fibras están conectadas de forma colectiva por una parte del material matricial a una alimentación de entrada de gases y por el lado opuesto conectadas de forma colectiva a una salida de gases. Sin embargo, es también posible tener un sistema que trabaje a contracorriente, por ejemplo donde la dirección del flujo de gases esté opuesta de fibra (capa) a fibra (capa), o en ángulos rectos con respecto a la configuración perpendicular mencionada anteriormente.

Será evidente a partir de lo expuesto anteriormente que el reactor según la presente invención es también muy sencillo de accionar con respecto al reactor de Gerlach et al que comprende una red tejida de cuatro sistemas discretos de membranas capilares, lo que requiere unos sistemas de entrada y salida múltiples. También en comparación con el reactor de Gerlach et al, el soporte sólido de la invención que comprende un material matricial en 3D garantiza a la vez una fijación celular perfeccionada y una capacidad celular perfeccionada por unidad de volumen.

Según la invención, el espacio de las fibras extracelulares puede ser conectado directamente a un sistema de entrada/salida de líquidos, que permita perfundir dicho espacio extrafibroso con el medio líquido, dando un contacto líquido directo entre las células presentes en el espacio extrafibroso y el medio líquido.

Aunque la invención en su forma de realización más sencilla comprenda sólo un conjunto de fibras huecas para la alimentación y/o la eliminación de componentes gaseosos, debe ser comprendido que pueden ser provistos sistemas separados adicionales de fibras huecas para la introducción y/o eliminación de gases específicos y/o medios líquidos. Estos sistemas adicionales pueden también ser usados para la introducción separada controlada de componentes gaseosos, líquidos y/o disueltos independientes de la alimentación principal líquida/gaseosa como se ha descrito arriba. Para este objetivo es también posible emplear fibras individuales, conjuntos de fibras o capas de fibras del soporte sólido, de tal modo que se mantenga la suficiente oxigenación.

Para estas aplicaciones, el soporte sólido/biorreactor de la invención generalmente comprenderá dos o más conjuntos diversos de fibras huecas paralelas o a un(os) ángulo(s) recíproco(s) como se ha descrito arriba, usando cada conjunto de fibras para un objetivo específico, usando al menos un conjunto para oxigenar suficientemente el reactor según la invención.

Es también posible según la invención que diversos conjuntos de fibras huecas sean empleados para el influjo y el aflujo. En esta forma de realización, la fibra generalmente se cerrará en una extremidad y en la otra extremidad será conectada respectivamente a una entrada o salida, dicha entrada y/o dicha salida opcionalmente estando provista de unos medios de bombeo.

El medio líquido/gaseoso es alimentado a través de la entrada al lumen fibroso de la fibra de entrada, pasa a través de la pared fibrosa en el espacio extrafibroso y luego es absorbido por la fibra de salida y eliminado.

Aunque pueden haber problemas en referencia al flujo alcanzable y/o al atasco de las fibras, la ventaja principal de esta forma de realización será que todo el medio provisto se pondrá necesariamente en contacto con las células en el espacio extrafibroso.

Otras formas de realización ventajosas serán evidentes para un experto en la técnica y están incluidas dentro de los límites de la invención.

Cultivo de células en el biorreactor

El biorreactor de la invención puede ser usado para cultivar y/o mantener todo tipo de células, y la invención también se refiere a aquellos usos y métodos de cultivo y/o conservación celular.

Preferiblemente las células son células adherentes derivadas de vegetales, humanos o animales, como células tisulares, aunque pueden también ser cultivadas de forma ventajosa las células fúngicas, así como todo tipo de organismos unicelulares como las bacterias.

La invención puede también ser empleada para el cultivo de células modificadas como líneas celulares, células fundidas, hibridomas, transforrmantes etc. Otros ejemplos de células adecuadas serán evidentes para un experto en la técnica.

El soporte sólido y el reactor de la invención pueden también ser usados para cultivar dos o más tipos de células diferentes al mismo tiempo.

En general la invención es particularmente apta para el cultivo de células que ponen requisitos estrictos acerca del soporte sólido disponible para la fijación celular, la alimentación y/o eliminación de componentes gaseosos, como oxigeno, o ambos. Las propiedades ventajosas del soporte sólido de la invención permiten cultivar y/o mantener adicionalmente las células con unas densidades celulares muy altas y con excelente fijación celular "tridimensional" y proliferación celular, como se ha mencionado arriba.

La capacidad celular total del reactor generalmente dependerá de factores como la dimensión del reactor, la cantidad de soporte sólido presente en éste y el tipo de células usadas.

En general, a causa de la gran superficie disponible para la fijación celular, la oxigenación perfeccionada y las altas densidades celulares alcanzables, el reactor generalmente mostrará una capacidad celular elevada por unidad de volumen. Además a causa de la oxigenación perfeccionada y del flujo homogéneo de líquido, el reactor puede ser ampliado hasta la capacidad requerida, por ejemplo aumentando el volumen y/o la cantidad de soporte sólido presente en el interior del reactor de una manera conocida per se - sin los problemas de adaptación generalmente asociados a los biorreactores de grandes dimensiones, como una oxigenación insuficiente y/o un flujo no homogéneo de
líquido.

El reactor de la invención está particularmente adecuado para el cultivo de células hepáticas humanas o células hepáticas animales, como células hepáticas caninas o porcinas, ambas como células primarias o como células inmortalizadas.

El reactor puede también servir para el cultivo y conservación de líneas celulares derivadas de células del hígado, transformantes de las células hepáticas; y células de hepatomas y hepatoblastos, así como líneas celulares derivadas de éstos, como la línea celular derivada del hepatoma C3A transformada descrita por Sussman et al.

El término células hepáticas y/o el término equivalente hepatocitos según se emplea en la presente solicitud comprenden por lo tanto todos estos tipos de células y líneas celulares diferentes.

Unos métodos para obtener dichas células, como el aislamiento, cultivo, transformación, etc., son bien conocidos y están por ejemplo descritos en la técnica anteriormente dicha.

Aunque para el uso en un BAL se utilicen preferiblemente células hepáticas con una vitalidad superior al 80%, por las razones mencionadas a continuación, el sistema BAL de la invención permite también emplear células hepáticas con una vitalidad no superior al 70%, o directamente del 40-50%.

Esto significa que la presente invención pone requisitos menos rígidos sobre la vitalidad celular con respecto a los sistemas BAL de la técnica anterior que requieren una vitalidad superior al 80%. Ésta es una ventaja práctica importante desde el punto de vista de los problemas normalmente asociados con el logro de una vitalidad celular elevada de este tipo, en particular con células hepáticas primarias, como se ha descrito arriba.

Además la invención permite usar células hepáticas que hayan sido almacenadas por crioconservación, y generalmente ofrece células hepáticas con una vitalidad inferior al 60-80%, de modo que no ya es necesario el aislamiento de células hepáticas frescas con la vitalidad suficiente para cada nuevo BAL. Esto tampoco era posible con los sistemas BAL de la técnica anterior.

Si se desea, el cultivo y conservación de las células hepáticas pueden ser realizados en presencia de suplementos agregados como factores del crecimiento, antibióticos y hormonas, así como factores de adhesión agregados y constituyentes de matrices extracelulares. Estos pueden ser agregados al propio flujo de perfusión antes de que éste entre en el reactor por medio de medios separados provistos en el reactor, como un conjunto separado de fibras huecas provisto para este objetivo específico.

También, la invención puede ser usada para el cocultivo de células hepáticas, por ejemplo con células hepáticas no parenquimatosas. Opcionalmente esto puede ser realizado en fibras huecas separadas presentes en el reactor.

Aunque estas técnicas sean conocidas en la técnica, ver por ejemplo las referencias anteriormente dichas, su uso no es siempre necesario y ciertamente no indispensable en virtud de las propiedades ventajosas del soporte sólido de la invención.

El biorreactor puede también ser empleado para cultivar las células de hibridomas - por ejemplo para la producción de anticuerpos monoclonales que generalmente muestran escasa fijación y/o adherencia a soportes sólidos.

Para cultivar las células, éstas son generalmente introducidas en el sistema del reactor bioartificial, tras lo cual se dejan fijar y/o adherirse al soporte sólido durante un periodo de tiempo adecuado. Durante esta fase de fijación, un gas con oxigeno o mezcla de gases a través de las fibras huecas, como oxigeno puro, aire, o una mezcla de gases que contenga oxigeno, preferiblemente el 50-99% de oxigeno, más preferiblemente el 90-99% de oxigeno, mezclado con otro gas inerte y/o fisiológicamente aceptable como nitrógeno o anhídrido carbónico es conducido a través de las fibras huecas oxigenantes y el gas gastado es eliminado por la salida de gases.

El transporte entre estos gases a las células tendrá lugar esencialmente mediante difusión, de manera que se garantice el suficiente intercambio de gases tanto por la gran área superficial disponible de las fibras huecas, como por la distancia reducida entre las células y la fibra oxigenante más próxima. Esta difusión-oxigenación evita las limitaciones asociadas a la oxigenación por el medio líquido, así como el empleo de un oxigenador separado, ya que el oxigenador está directamente incorporado en el propio reactor.

Además las sustancias nutritivas pueden ser introducidas en las células fijadas y los desechos pueden ser eliminados, generalmente mediante un flujo de líquido extraluminal. Así, se pueden emplear todas las sustancias nutritivas conocidas y adecuadas y las sustancias nutritivas que contengan soluciones y medios, o bien la solución puede ser adaptada en particular a las necesidades de las células a cultivar.

Dicho medio nutriente es preferiblemente introducido por un lado del material matricial y eliminado por el otro lado - por ejemplo mediante un flujo unidireccional - junto con los subproductos formados y los desechos.

Es también posible proporcionar fibras separadas para la alimentación controlada de algunas sustancias nutritivas específicas, aunque esto en general implicará una construcción y un funcionamiento más complicado del reactor, que por esta razón no es preferido.

Durante el cultivo, las células pueden ser mantenidas a una temperatura deseada, biológicamente o fisiológicamente aceptable, por ejemplo manteniendo el reactor en un termostato, o controlando la temperatura del flujo de líquido extraluminal y/o del flujo de gases dentro de las fibras, como será evidente para un experto en la técnica.

En el cultivo de las células, el reactor puede ser cargado con una pequeña cantidad de células, tras lo cual se permite a las células dividirse para poblar completamente el reactor. Según esta forma de realización, el soporte sólido de la invención requerirá unas cargas de inoculación menos elevadas con respecto a los soportes de la técnica anterior, con unas inoculaciones en una cantidad del 10% o inferior, o directamente del 5% de la capacidad celular total suficiente para poblar completamente el reactor mediante un crecimiento "tridimensional" provechoso.

Es también posible introducir más células en el reactor, para saturar completamente el material matricial con células adherentes, o incluso emplear una cantidad en exceso de células, tras lo cual las células superfluas son eliminadas.

Si se carga con una pequeña cantidad de inoculo, o con un gran exceso, el soporte matricial en 3D de la invención garantizará una "captura" aumentada de células, para así poder usar las células con fijación sub-óptima y/o reducir considerablemente el tiempo necesario para la fase de fijación. Esto último constituye una ventaja especial cuando el reactor debe ser usado como un BAL, ya que el tiempo necesario hasta que un BAL esté listo para el uso es fundamental en una preparación clínica.

Además a causa de los canales extraluminales formados dentro del soporte sólido de fibras huecas que actúan como medios de separación, medios de canalización o medios de deflección, después de la introducción en el biorreactor, por ejemplo mediante la inyección de una suspensión celular, las células serán distribuidas más rápidamente y más uniformemente por todo el soporte, reduciendo aún más el tiempo necesario para la fase de fijación y dando como resultado una distribución celular más homogénea.

En general, la fase de fijación durará de 30 minutos a 5 horas, dependiendo de las células específicas empleadas.

Según un aspecto especial de la invención, si la muestra de células que se debe introducir en el reactor contiene células vitales y no-vitales, diseño del reactor por sí sólo permite separar las células vitales de aquellas no- vitales, como será descrito a continuación con referencia al cultivo de células hepáticas.

Otra ventaja del biorreactor de la invención es que durante la fase de fijación se puede impedir la sedimentación de las células en forma de un gran gránulo en el fondo del biorreactor. También esto será ulteriormente descrito a continuación.

Después de la fase de fijación, y opcionalmente una fase de crecimiento celular y/o el logro de una condición estable, el reactor sembrado estará generalmente listo para el uso previsto. Durante este uso, las células generalmente serán mantenidas en/con la cantidad, vitalidad y actividad suficientes, es decir manteniendo unas condiciones biológicamente y/o fisiológicamente aceptables, mientras que el medio líquido a tratar será provisto a las células, generalmente a través del espacio extrafibroso. Para la mayoría de los usos y con la mayoría de las células, el biorreactor permitirá mantener la vitalidad y actividad a unos niveles superiores durante un periodo de tiempo más largo con respecto a los métodos de la técnica anterior.

Aunque la invención será ulteriormente descrita sucesivamente con referencia al cultivo de células hepáticas y al uso como hígado bioartificial, se espera que el biorreactor de la invención pueda también ventajosamente ser empleado para otros sistemas bioartificiales.

Como tales, el soporte sólido y/o el biorreactor de la invención pueden por ejemplo ser empleados en un páncreas bioartificial, un riñón bioartificial y/o una glándula paratiroidea bioartificial, médula ósea artificial, sistemas que actualmente se basan en reactores de fibras huecas como se ha descrito arriba. También el uso de la invención en estos sistemas se traducirá en las ventajas de la invención, como por ejemplo una fijación y capacidad celular perfeccionadas, contacto directo de las células con el medio líquido y/o una oxigenación perfeccionada, así como una duración del funcionamiento efectivo más larga.

El biorreactor de la invención puede también ser usado para la producción, bioconversión y/o eliminación de sustancias en o de un medio líquido o gaseoso, usando células aptas para las reacciones biológicas deseadas. Para estas y otras aplicaciones, la invención ventajosamente proporciona una gran área de superificie disponible para el intercambio gaseoso entre el lumen fibroso y el espacio extraluminal a través de la pared de las fibras huecas, así como un contacto directo de líquido entre las células dentro del espacio extracelular y del medio líquido, este último siendo de una importancia particular en la degradación, bioconversión o producción de sustancias biológicas de peso molecular elevado como los polipéptidos. Las sustancias producidas pueden luego ser aisladas del medio líquido derivado del biorreactor de una manera conocida per se.

Otros usos provechosos del biorreactor de la invención serán evidentes para un experto en la técnica.

Uso del soporte sólido y del biorreactor de la invención como hígado bioartificial.

Como se ha declarado anteriormente, las propiedades ventajosas del soporte sólido y del biorreactor de la invención los vuelven particularmente adecuados para el uso en o como un sistema de hígado bioartificial.

En un sistema de este tipo, las células hepáticas adecuadas son cultivadas y/o conservadas usando el soporte sólido y/o el biorreactor de la invención según se ha descrito arriba.

Por lo tanto, en general, el sistema de hígado bioartificial de la invención comprende un biorreactor de la invención y comprenderá como norma también células hepáticas como se ha definido arriba, que generalmente estarán presentes en el espacio extraluminal, más en particular serán fijadas al material matricial del soporte sólido.

Durante el uso, el biorreactor es operativamente conectado a la circulación sanguínea de un paciente mediante un circuito hidráulico, de tal manera que un medio líquido directamente o indirectamente derivado del paciente sea introducido en las células hepáticas en el espacio extraluminal, tras lo cual se permite que dichas células realicen la mayoría o todas las funciones normalmente realizadas por el hígado in vivo. Después del tratamiento por las células hepáticas, el medio líquido es devuelto al paciente.

El sistema BAL de la invención, por lo tanto, comprenderá además un circuito hidráulico para hacer circular el medio líquido, así como unos medios de bombeo conocidos per se para controlar el flujo líquido a través de dicho circuito. Como tal, el biorreactor de la invención puede ser incorporado en cada circuito conocido per se, por ejemplo según se ha descrito en la técnica anteriormente dicha, en la que el biorreactor de la invención sustituirá - por ejemplo -
al sistema BAL de fibras huecas.

El circuito puede también contener unos medios adicionales para el tratamiento del medio líquido, como una columna de carbón activo activada para la absorción de toxinas hidrofílicas y/o una columna de resina para la absorción de sustancias hidrófobas (o bilirrubina).

El circuito líquido puede también comprender filtros celulares para eliminar las células del flujo de líquido. Cuando se usa para mantener alejadas las células hepáticas muertas de la circulación de los pacientes, este filtro celular generalmente será colocado después del biorreactor.

El circuito líquido puede también comprender unos medios para añadir al medio líquido sustancias nutritivas y otras sustancias deseadas, aunque para esto el propio medio líquido derivado del paciente pueda ser suficiente para mantener vitales las células hepáticas en el reactor. Además los sistemas separados de fibras para agregar sustancias nutritivas pueden ser provistos en el reactor como se ha descrito arriba.

Durante el uso, el sistema BAL de la invención puede ser perfundido con toda la sangre - arterial o venosa - derivada de un paciente de una manera conocida per se. En este caso las células hepáticas en el reactor deben ser inmunológicamente compatibles con la sangre de los pacientes, de manera que generalmente se usarán células hepáticas humanas o células y líneas celulares derivadas. El empleo menos preferido de xenocitos podría requerir el uso de inmunosupresión.

Sin embargo, el BAL de la invención es preferiblemente perfundido con plasma derivado de un paciente. Según esta manera preferida de perfusión de plasma, el circuito generalmente comprende un separador de plasma o una unidad de plasmaféresis para separar el plasma de toda la sangre derivada del paciente. El uso de sistemas BAL basados en la plasmaféresis, así como de unidades de plasmaféresis adecuadas, son bien conocidos en el sector y están por ejemplo descritos en la técnica anterior más arriba.

En su modalidad de plasmaféresis, el circuito puede también comprender barreras inmunológicas para mantener separada de forma inmunológica la circulación sanguínea de pacientes de la circulación del plasma a través del reactor, permitiendo usar xenocitos como hepatocitos porcinos sin la necesidad de inmunosupresión. Generalmente el separador de plasma/unidad de plasmaféresis misma garantizará hasta cierto punto dicha separación inmunológica. El circuito puede de cualquier modo también contener (otros) medios separados, como membranas, columnas o módulos de fibras huecas con un corte del peso molecular adecuado, como se ha descrito arriba, colocados antes o después del reactor, y/o columnas específicas para la absorción de antígenos y/o anticuerpos etc. como es conocido por un experto en la técnica.

Como se ha mencionado anteriormente, no es preciso que una unidad de oxigenación separada sea incorporada en el circuito del medio líquido, incluso cuando se usa la perfusión de plasma.

Un cierto número de configuraciones posibles del BAL de la invención en la modalidad de plasmaféresis preferida se muestra en las figuras 5-9.

La Figura 5 muestra una configuración en la que la sangre arterial del paciente es alimentada a través de la línea 11, opcionalmente por medio de la bomba 12, a la unidad de plasmaféresis 13, donde el plasma es separado de toda la sangre que es devuelta al paciente a través de la línea 14.

El plasma es luego alimentado directamente a través de la línea 15, opcionalmente por medio de la bomba 16 al biorreactor 17 que contiene las células hepáticas, y de ahí es reenviado directamente a la sangre venosa en la línea 14 por medio de la línea 18.

Un gas que contiene oxigeno es alimentado a las fibras huecas por medio de la alimentación 19 y el gas enriquecido con dióxido de carbono es alejado a través de la línea 20.

La Figura 6 muestra una configuración de "circuito de flujo elevado" para hacer recircular el plasma en el reactor a través de la línea adicional 21 dotada de la bomba 22.

En la figura 7 el circuito está dotado de un filtro celular 23 para mantener alejadas de la circulación de los pacientes las células muertas expulsadas del reactor.

En la figura 8 el circuito está dotado de un cartucho de membrana de fibras huecas 24 para la separación inmunológica colocada en el circuito de flujo elevado después del reactor.

En las figuras 9a y 9b el circuito está dotado de una columna de pretratamiento inmunológico y/o columnas para la eliminación de toxinas hidrofílicas y/o hidrófobas, como se ha descrito arriba en la fase 25, incorporadas dentro (fig.9a) o fuera (fig.9b) del circuito de flujo elevado.

Será evidente para un experto en la técnica que todo el equipamiento diferente mencionado arriba y mostrado en las figuras puede ser combinado en un circuito.

Los distintos elementos del circuito BAL pueden ser provistos como sistema integrado en un alojamiento individual, o bien el BAL puede consistir en elementos separados conectados.

Aunque dependiendo de la geometría y de la capacidad, de la cantidad y actividad de las células presentes en el reactor, de la aplicación terapéutica deseada y de otros factores similares, el BAL de la invención puede ser usado para tratar de 1 a 300 ml por minuto de medio líquido derivado de un paciente.

Para conseguirlo, el medio líquido puede ser alimentado directamente al reactor 17 con un valor correspondiente, como se muestra en la figura 5.

De cualquier modo, preferiblemente el biorreactor de la invención es incorporado en un "circuito de flujo elevado", como es conocido per se a partir de la técnica anterior y mostrada en la Figura 6.

En un circuito de este tipo, formado por el reactor 17, la línea 21 y la bomba 22, y parte de las líneas 15 y 18, como se muestra en la figura 6, el flujo del medio líquido en el reactor 17 puede ser mantenido a un nivel superior que el flujo de líquido del paciente a través de las líneas 11 y 14, garantizando así la recirculación del medio líquido por el reactor 17. Generalmente esto será realizado por un control adecuado de las bombas 16, 22 y 18a, manteniéndolas en una proporción de flujo adecuada, en general respectivamente de 1:2:1 a 1:100:1.

El BAL de la invención puede también comprender dos o más biorreactores de la invención conectados en serie y/ o en paralelo; por ejemplo conteniendo el mismo tipo y/o diferentes tipos de células hepáticas o de otro origen.

El sistema de hígado bioartificial de la invención puede ser usado para soportar y/o sustituir las funciones hepáticas en pacientes con funcionalidad hepática comprometida y/o en casos en los que sea deseable y/o requerido un soporte hepático artificial. El sistema BAL puede por ejemplo ser empleado en pacientes que padecen de insuficiencia hepática fulminante (FHF), por ejemplo producida por infecciones por hepatitis viral o envenenamiento hepático agudo (por ejemplo con acetaminofeno, CCl_{4}, alcohol o fármacos), así como isquemia hepática transitoria y trauma hepático producido por una lesión. El hígado artificial puede también ser empleado para mejorar las condiciones del paciente antes del transplanto del hígado, para cubrir el periodo precedente al trasplante del hígado, para cubrir el periodo de rechazo tras un rechazo agudo de un hígado trasplantado, durante la fase antihepática mientras que se realiza un trasplante de hígado y/o durante la recuperación por un trasplante de hígado, o para dar tiempo al hígado del paciente para que se regenere.

Además el sistema BAL de la invención puede ser empleado en el tratamiento de patologías hepáticas crónicas para aumentar la calidad de la vida del paciente y/o para cubrir períodos de exacerbación.

El sistema BAL de la invención puede también ser empleado para cubrir los pacientes durante un periodo de crisis relativamente breve, permitiendo a que sus propios hígados se regeneren, ahorrándose el trauma y el coste del trasplante.

Como tal, el BAL de la invención preferiblemente será empleado de forma continua, aunque también esté previsto el uso intermitente.

Con el fin de obtener el biorreactor, las células hepáticas pueden ser introducidas en el biorreactor de manera conocida per se y/o como se describe arriba.

Según una forma de realización, sólo un pequeño número de células es sembrado en el reactor, después de que dejar a dichas células crecer y dividirse hasta que el biorreactor haya alcanzado su capacidad máxima y/o se alcance una condición estable, después de que el reactor pueda ser usado como un BAL.

En esta forma de realización el soporte y el biorreactor son así empleados para el cultivo de las células hepáticas, así como el propio sistema de hígado bioartificial. Será evidente que según este aspecto de la invención, el soporte sólido en 3D de la invención favorecerá la división y el crecimiento celular, en particular en comparación con los sistemas de fibras huecas de la técnica anterior, donde el crecimiento y la división celular generalmente estarán limitados o incluso impedidos.

Esta forma de realización generalmente no será adaptada para células hepáticas que sean incapaces de dividirse y crecer después de haber sido aisladas, como las células primarias hepáticas. De cualquier modo se espera que incluso con las células primarias del hígado, el soporte sólido de la invención permita que se produzca un cierto crecimiento y división, en particular en comparación con la técnica anterior. El cultivo de células primarias hepáticas que usan el soporte sólido y/o el biorreactor de la invención, opcionalmente con el uso de factores de crecimiento etc., está así explícitamente incluido dentro de los límites de la presente invención.

Según otra forma de realización, la cantidad de células corresponderá en gran medida y/o excederá la capacidad del biorreactor. En este caso las células son añadidas al reactor y se dejan adherir al soporte sólido, después de que las células en exceso no fijadas sean eliminadas, por ejemplo por lavado. Sucesivamente el biorreactor puede ser empleado como o en un BAL, opcionalmente después de haber alcanzado una condición estable.

Esta forma de realización generalmente tendrá la ventaja de que el sistema BAL estará listo para el uso después de un periodo de tiempo más breve en comparación con los sistemas de la técnica anterior, según la invención generalmente entre 0.5 y 6 horas, en la mayoría de los casos alrededor de 2 horas. Además esta forma de realización está particularmente adaptada para el uso con células primarias hepáticas.

En general el BAL será sembrado con 1.10^{5}-1.10^{8} células/ml, generalmente alrededor de 1-50.10^{6} células/ml (unidad de volumen), y hasta una capacidad total de 10^{8} a 10^{11} células, o alrededor de 1-1000 g de células, preferiblemente 100-500 g de células.

El reactor es generalmente sembrado inyectando una suspensión de células hepáticas en el reactor, obtenidas por ejemplo mediante cultivo de las células, poniendo en suspensión las células hepáticas en un medio líquido adecuado, o después del aislamiento, tras lo cual se permite que las células se distribuyan por todo el reactor y se adhieran al soporte sólido durante un periodo adecuado de tiempo, generalmente de 1 minuto a 5 horas o más, preferiblemente desde aproximadamente 30 minutos hasta 3 horas, y más preferiblemente alrededor de 2 horas. De modo comparativo, con el reactor de Gerlach et al, la fase de fijación puede durar hasta 8 horas o más.

Con el fin de facilitar aún más la distribución de la suspensión de las células, el reactor puede ser agitado después de que se haya inyectado la suspensión celular.

Según una forma de realización altamente preferida, después de la inyección de la suspensión de células el reactor es rotado, de forma intermitente pero preferiblemente de forma continua, alrededor de su eje longitudinal, es decir la dirección de las fibras huecas en el soporte sólido, durante el periodo de tiempo anteriormente dicho a la velocidad de 0.01-100 rpm, preferiblemente 0.1-10 rpm, más preferiblemente alrededor de 1 rpm. En la forma de realización preferida mostrada en la figura 11 el biorreactor mostrado en las figuras 3/4 es rotado alrededor de un eje central 29, fijándose el reactor al eje por medio de los medios de fijación 30, como una abrazadera de dimensiones adecuadas (no mostrada).

Este método de distribución de las células por todo el reactor impide la formación de un gránulo de células en el fondo del biorreactor, lo que podría provocar problemas en la transferencia de masa durante el uso, en particular con respecto a las células del centro del gránulo, que podría provocar la pérdida de actividad funcional y/o vitalidad. Mediante la rotación del reactor, e invirtiendo preferiblemente de forma periódica la dirección de rotación, la dirección de sedimentación cambia continuamente y se puede considerar que las células en suspensión siguen un recorrido casi circular en el reactor, de tal manera que las células se hallan reiteradamente en contacto con el material matricial, aumentando considerablemente las posibilidades de atrapamiento de las fibras de poliéster en dicho material matricial de tal manera que se obtenga una inmovilización homogénea con una proporción y velocidad de fijación
elevados.

Cuando la inmovilización de las células sea completa, la suspensión restante que contiene células no adheridas y/o en exceso es eliminada del reactor, tras lo cual el reactor puede opcionalmente ser enjuagado y/o con un medio líquido adecuado.

Además agitando y preferiblemente rotando el reactor, las células vivas pueden ser separadas, al menos en cierta medida, de células muertas presentes dentro la suspensión celular inyectada, en particular cuando se usa una suspensión cultivada de células primarias hepáticas. Las células vivas son atrapadas y/o se adhieren al soporte sólido, mientras que las células muertas no adherentes son eliminadas con la suspensión restante o lavando el reactor.

Además mediante la perfusión en el reactor de un medio líquido adecuado, las células muertas pueden ser expulsadas del reactor. Este "enjuague expulsivo" de células muertas puede también tener lugar durante el uso, o mientras que el reactor es conectado al circuito de perfusión. En este caso el hecho de incorporar un filtro celular 23 en el circuito hidráulico después del reactor, según se muestra en la figura 7, será muy provechoso.

Esta eliminación favorable de células muertas no puede lograrse con los biorreactores de fibras huecas de la técnica anterior, ya que en estos reactores las células hepáticas están presentes esencialmente en un "compartimento" encerrado entre las fibras huecas, sin medios para la perfusión con dicho espacio, o capturadas en el interior de un (hidro)gel.

Durante el uso, las células hepáticas en el reactor son mantenidas de una manera conocida per se. El BAL de la invención es preferiblemente mantenido a una temperatura fisiológicamente aceptable, preferiblemente alrededor de los 37°C. Además se pueden añadir al reactor sustancias nutritivas adicionales y otras sustancias adecuadas, cómo y si se requiere.

Las células hepáticas son oxigenadas alimentando con oxigeno o con gas enriquecido con oxigeno como "carbogen" (una mezcla 95:5 O_{2}/CO_{2}) o un gas que contiene oxigeno enriquecido con CO_{2}, como "gas de cultivo" (95% aire, 5% CO_{2}). Este gas puede ser alimentado con cualquier medio adecuado, como una botella de gas o una bomba de gas, o por conexión a una alimentación de gas externa. Como se ha afirmado anteriormente, este método de oxigenación directa a través de fibras huecas muy compactas significa que se evita la generación de oxigeno deletéreo y/o gradientes de anhídrido carbónico. Además durante la perfusión el medio líquido empleado puede tener una acción de "mezcla" adicional en la alimentación de gas, reduciendo ulteriormente dichos gradientes.

Antes de o durante el uso, el efecto funcional y la capacidad metabólica del biorreactor y de las células en éste contenidas pueden ser controladas de manera conocida per se con una cualquiera de las muchas pruebas disponibles para este objetivo, como la medición de la síntesis proteica, la ureogénesis, la retención de oxígeno (para la cual se puede emplear ventajosamente la medición directa en la salida del gas y en la entrada del gas), actividad citocromo P450, análisis metabólico del fármaco, técnicas de aclaramiento etc., ver por ejemplo Rozga et al citados más arriba. Además se puede usar un medidor de biomasa (Aber) que usa unas mediciones de conductibilidad basadas en diferencias en el potencial de membrana entre células muertas y células vivas. Un medidor de este tipo es conocido por un experto en la técnica.

El uso del hígado bioartificial de la invención naturalmente permitirá todas las ventajas asociadas al uso del soporte sólido y del biorreactor de la invención, así como un cierto número de ventajas adicionales tales como:

- fijación perfeccionada de las células hepáticas y capacidad celular perfeccionada por unidad de volumen debido a la presencia de un material matricial adecuado. El soporte sólido ofrece también un ambiente perfeccionado para la división celular y el crecimiento celular.

- Oxigenación perfeccionada de las células hepáticas debido a la presencia de las fibras de oxigenación, sin necesidad de un oxigenador separado y sin gradientes deletéreos.

- Contacto directo líquido entre las células hepáticas y la sangre o plasma a tratar, sin necesidad de que las toxinas y/o secreciones hepáticas atraviesen una membrana con los problemas de transferencia de masa asociados y de corte molecular.

- El reactor puede fácilmente ser "ampliado" hasta la capacidad requerida para el uso terapéutico.

- Fácil construcción que puede ser construida y activada fácilmente, y que en su forma más sencilla requiere sólo una entrada/salida de fluido y una entrada/salida de gas. Además no se requiere ningún pretratamiento costoso del soporte sólido.

- En comparación con los sistemas de la técnica anterior, el biorreactor de la invención pone unos requisitos menos rígidos sobre las preparaciones de células hepáticas (primarias) empleadas, en particular con respecto a la vitalidad y fijación.

- La velocidad y la proporción de fijación celular después del sembrado se reducen, de manera que el tiempo necesario hasta que el BAL esté listo para el uso se reduce y se requieren menos células hepáticas.

Por último una gran ventaja del uso del soporte sólido en 3D y del biorreactor de la invención como un BAL y/o en el cultivo y/o conservación de células hepáticas, así como el método de rotación anteriormente dicho para sembrar el reactor, consiste en que las células estén presentes y/o mantenidas en el reactor como pequeños agregados celulares, con al menos un diámetro no superior a 10 células, preferiblemente no superior a 6-8 células (100 \mum). Es muy conocido en la técnica que tales agregados de hepatocitos actúan y permanecen vitales durante un periodo de tiempo más largo, son más activos y mejor diferenciados de los hepatocitos desarrollados en monocapas o en portadores en 2D o fibras huecas. Además la morfología de las células cultivadas en estos pequeños agregados es parecida a la morfología de las células hepáticas en el hígado in vivo. Además, ya que estos agregados tienen unas dimensiones relativamente pequeñas (sólo 6-8 células de diámetro), no hay problemas con respecto a la transferencia de masa a las células al centro de los agregados, así como con las células hepáticas cultivadas en grandes agregados (> de 200 \mum), como los agregados de 500 \mum en el reactor de Gerlach et al., o inmovilizadas en microcápsulas.

La invención así permite el cultivo y/o a las células hepáticas en un reactor de gran capacidad con densidades celulares muy elevadas, como 20-40 x 10^{6} células/ml o más, se puede también afirmar que, en general y en comparación con los sistemas BAL de la técnica anterior, el soporte sólido de la invención garantiza un entorno que relaciona más de cerca las condiciones/entorno biológicos de las células en el hígado.

Naturalmente estas características significan también que el BAL de la invención tiene grandes ventajas desde un punto de vista terapéutico, en particular en comparación con los sistemas de la técnica anterior. El BAL será por lo general terapéuticamente eficaz durante un periodo de tiempo más largo, mostrará una eficacia perfeccionada y podrá ser fácilmente provisto de la capacidad suficiente para la sustitución hepática.

Otra ventaja práctica del BAL de la invención es que éste puede ser esterilizado en un autoclave (20 minutos a 120°C). Los sistemas de la técnica anterior requieren una esterilización a gas con gases tóxicos como óxido de etileno, que todavía está presente en y cedido por las fibras del reactor unas semanas después de la esterilización del reactor.

Por último el BAL de la invención por primera vez permite con éxito el uso de hepatocitos primarios crioconservados en un sistema de hígado bioartificial, dando la posibilidad de un aislamiento y conservación centralizados, tras lo cual las células pueden ser distribuidas a los hospitales donde pueden ser almacenadas hasta que sean necesarias. Junto con la fase reducida de fijación del BAL de la invención, esto significa que en una preparación clínica el BAL de la invención puede ser puesta a disposición del médico antes y con unos costes inferiores.

La invención será ahora ilustrada mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo I Prueba in vitro

El desarrollo de un sistema de soporte hepático para el tratamiento de pacientes con insuficiencia hepática fulminante y como un puente para el trasplante de hígado es un desafío significativo. Muchos intentos recientes estaban centrados en la desintoxicación de la sangre basándose en la suposición de que la insuficiencia hepática podría ser invertida si las toxinas asociadas fueran eliminadas de la circulación del paciente. Aunque la mejora del estatus neurológico en los pacientes haya sido reportada, ninguno de ellos ha conseguido la supervivencia a largo plazo. Se ha concluido así que un sistema de soporte hepático eficaz debería de ser capaz de realizar las múltiples funciones hepáticas sintéticas y metabólicas, incluidas la desintoxicación y excreción. La aproximación más lógica a este problema es la introducción de hepatocitos de funcionamiento activo. La forma de realización del estado de la técnica de esta teoría se presenta en el hígado bioartificial (BAL), un dispositivo extracorpóreo que comprende hepatocitos vitales bien nutridos y oxigenados, inmovilizados sobre un soporte mecánico y separados de la circulación sanguínea mediante membranas semipermeables.

Objetivos como la biocompatibilidad, el mantenimiento de la capacidad y practicidad funcionales, aspectos importantes en el desarrollo del BAL, han sido discutidos en la técnica anterior. De cualquier modo las actuales realizaciones del biorreactor no respetan las condiciones esenciales para una transferencia de masa óptima a y de los hepatocitos como se presentan en el hígado intacto. Con respecto a esto, el impacto de la construcción del biorreactor sobre la función de los hepatocitos ha sido subvalorada.

El objetivo de nuestro estudio era el desarrollar una configuración de un biorreactor que permitiera el cultivo de hepatocitos a alta densidad y simultáneamente garantizara que cada hepatocito operara en condiciones de perfusión como aquellas in vivo y en contacto directo con el medio, imitando así de forma más cercana la transferencia fisiológica de masa. Además, queríamos cultivar los hepatocitos como pequeños agregados, conocidos porque mantienen muchas de las características citoarquitectónicas halladas in vivo y muestran una actividad funcional mayor y prolongada en comparación con los hepatocitos cultivados como monocapas.

Otro objetivo era el desarrollar un biorreactor que pudiera ser adaptado hasta incorporar la masa celular suficiente para el soporte hepático terapéutico. Esto ha resultado en un nuevo diseño de un biorreactor que comprende una matriz de poliéster en 3D no tejida enrollada en espiral y un oxigenador integrado donde se reorganizan los hepatocitos y se inmovilizan como pequeños agregados.

A continuación, se presentan las características y los resultados in vitro del nuevo diseño del biorreactor de una forma de realización de la invención.

1. Materiales y métodos 1.a Aislamiento de los hepatocitos

Unos hígados porcinos fueron gentilmente proporcionados por el departamento de cardiología clínica y experimental de la AMC, Amsterdam, el departamento de dermatología de la AMC, Amsterdam, y por un matadero local. Los hepatocitos fueron aislados de los cerdos con una masa corporal de 20-25 kg usando una sencilla técnica de perfusión de colagenesis de dos fases como se ha descrito anteriormente (te Velde AA, Ladiges NCJJ, Flendrig LM, Chamuleau RAFM, J Hepatology 1995; 23: 184-192). La vitalidad de las células aisladas en base a la exclusión del tripan azul varió del 71 al 96% (n=8, media 89\pm7%). El rendimiento varió de 8.10^{6} a 30.10^{6} hepatocitos por g de peso de hígado húmedo para los diversos aislamientos.

1.b Biorreactor

El biorreactor está basado en un tejido en 3D de poliéster no-tejido diseñado particularmente para cultivar células dependientes del anclaje (Bibby Sterilin Ltd, Stone, Staffordshire, GB) y fibras huecas de polipropileno hidrófobas donadas por Dr. J. Vienken de AKZO-NOBEL (Plasmaphan, AKZO-NOBEL, Wuppertal, Alemania) para la oxigenación y la eliminación del anhídrido carbónico. El tejido en 3D (dimensiones: longitud 140 mm, anchura 90 mm, espesor 0.5 mm, diámetro de la fibra 13 \mum) proporciona una estructura de andamio para la inmovilización y el autoagregado de los hepatocitos. Su superficie de fijación es unas 15 veces su área saliente lo que permite el cultivo de hepatocitos con alta densidad. Las fibras huecas de oxigenación (diámetro externo 630 \mum, diámetro interno 300 \mum) están fijadas al portador en 3D de manera paralela a través del tejido, distanciadas con una distancia media de 2 mm. En general, esto se realiza plegando el material matricial tres o más veces, aplicando un cierto número de orificios en el material matricial plegado distanciados de 2 mm mediante una aguja, poniendo las fibras huecas de una longitud adecuada a través de los orificios así obtenidos, y luego extendiendo el material matricial plegado en dirección de las fibras, para así eliminar los pliegues y obtener un material matricial con las fibras huecas orientadas de manera unidireccional y paralela.

Este compuesto de poliéster-polipropileno es enrollado en espiral como un "brazo de gitano" con la ayuda de un núcleo acrílico (Fig. 3) y puesto en un alojamiento de diálisis en polisulfono (Minifilter, Amicon Srl, Irlanda, ID 1.4 cm, E.D 1.7 cm, longitud total 15.5 cm). Las fibras huecas de oxigenación son introducidas en resina de poliuretano (sistema PUR 725 A y 725 BF, Morton International, Bremen, Alemania) utilizando técnicas de encapsulación del dializador y acoplando tapones para la entrada y salida de gases.

El biorreactor resultante está mostrado en la figura 12, donde 31 es el alojamiento, 32 es la encapsulación de poliuretano, 33 es respectivamente la entrada y salida del espacio extrafibroso, 34 es el espacio extrafibroso y 35 son las fibras huecas.

El biorreactor es esterilizado por tratamiento en autoclave (20 min a 121°C). El sembrado de hepatocitos en el espacio extrafibroso (volumen 11 ml, adaptado para futuros experimentos in vivo sobre las ratas) se realiza inyectando la suspensión celular a través de los accesos de entrada y salida normalmente empleados para el flujo del material dializado. Los mismos accesos son empleados para la perfusión media después de la inmovilización celular.

1.c Cultivo de los hepatocitos

Los hepatocitos suspendidos en el medio Williams E frío (Gibco BRL Life Technologies, European Division) con suplemento de FCS inactivado por calor (10%, Boehringer Mannheim), glutamina (2 mM, BDH Laboratory Supplies Ltd.), insulina (20 mIE, Novo Nordisk, Dinamarca), dexametasona (1 \muM) y solución antibiótica/antimicótica (Gibco) con una concentración de 20.10^{6} células vitales/ml fueron inyectadas en dos biorreactores secos preenfriados (4°C) hasta obtener una cantidad final de 220.10^{6} células/unidad. Los biorreactores enfriados fueron integrados en dos circuitos separados de perfusión celular para obtener resultados por duplicado. Esta preparación fue puesta en una cabina (Stuart Scientific, modelo S160, GB) a temperatura regulada (37°C) donde los biorreactores fueron fijados a un dispositivo de rotación según la figura 11 y conectados al gas de cultivo (95% aire, 5% CO_{2}, flujo del gas: 30 ml/min, 37°C). Los reactores 28 fueron rotados horizontalmente a lo largo de su eje longitudinal 29 a 1 revolución/min durante un periodo de 120 minutos para garantizar una distribución uniforme de las células en todo el reactor y para acelerar la inmovilización mediante atrapamiento, fijación y auto-agregado de los hepatocitos vitales. A cada minuto la dirección de la rotación fue invertida automáticamente para evitar la obstruccción de los conductos de conexión. Después de este periodo de inmovilización se efectuó un lavado intermitente de los desechos del medio fresco de 15 horas (60 ml) para expulsar del reactor las células muertas y no fijadas, para proporcionar sustancias nutritivas y eliminar las toxinas de la región celular y para permitir que los hepatocitos se recuperaran del procedimiento de aislamiento. A continuación los dispositivos estaban listos para el uso.

1.d Pruebas de función de los hepatocitos Descripción general

El estudio incluía biorreactores con y sin hepatocitos, el segundo caso sirviendo como control. Ambos grupos recibieron un tratamiento y un seguimiento idénticos. Las pruebas de función de los hepatocitos fueron efectuadas en condiciones de recirculación, perfundiendo el medio Williams E (30 ml) suplementado a través del espacio extrafibroso del biorreactor con una proporción de flujo de 5 ml/min. Varios parámetros fueron constatados tras un periodo de 4 días, el último día reservado exclusivamente a la secreción de proteínas bajo condiciones libres de suero. Cada día durante los primeros tres días fue efectuada una batería de pruebas que incluían eliminación de galactosa, síntesis de urea, metabolismo de lidocaina y una sucesiva incubación de 14 horas con el medio Williams E suplementado para evaluar el metabolismo de los aminoácidos, proporción lactato/piruvato, pérdida enzimática, niveles de glucosa y pH. Cada prueba fue precedida de un lavado de desechos del medio fresco. Las muestras recogidas del circuito de anillo cerrado fueron congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a - 70°C antes del análisis.

Eliminación de galactosa

Se suministró D-Galactosa (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) en el circuito de anillo cerrado con una concentración de 1 mg/ml y se incubó durante 3 horas. Las muestras del medio fueron recogidas en diversos momentos cada día durante tres días. La concentración de galactosa fue medida a 340 nm (Cobas Bio, Roche, Suiza) utilizando equipos de pruebas enzimáticas (Boehringer Mannheim, Wiesbaden, Alemania, equipo No. 1242-73). A partir de esto se calculó la eliminación de galactosa.

Síntesis de urea de NH_{4}Cl

La capacidad de síntesis de la urea del sistema del biorreactor fue alcanzada incubando 10 mM de NH_{4}Cl durante 2 horas. Las muestras del medio fueron recogidas en momentos diversos cada día durante tres días. La urea fue determinada colorimétricamente a 525 nm (espectrofotómetro UV de Zeiss) con el equipo Sigma Chemical Co. No. 535 para el nitrógeno úreo.

Metabolismo de la lidocaina

Se suministró lidocaina-HCl (Sigma) en el circuito de anillo cerrado a una concentración de 500 \mug/ml y se incubó durante 1 hora. Las muestras del medio fueron recogidas en diversos momentos cada día durante tres días. Se analizó la lidocaína de las muestras y tres metabolitos de lidocaína, mono-etil-glicinexilidida (MEGX), 2,6-xilidina-HCl, glicina-xilidida (GX), con cromatografía liquida de alta resolución de fase inversa (HPLC). La lidocaina-HCl fue obtenida por Sigma Chemical Co. y la MEGX, la xilidina, GX y la etil-metil-glicinexilidida (EMGX) fueron cedidas por el Dr. R. Sandberg de Astra Pain Control (Södertälje, Suecia). La preparación de las muestras para el análisis de MEGX, xilidina y GX llevó a la adición de 75 \mul de solución estándar interna (EMGX 5 \mug/ml en agua dest) y 150 \mul agua dest. a una muestra de 150 \mul. El análisis de las concentraciones de lidocaína mucho más altas necesitaron una dilución de 20 veces la muestra en medio Williams E suplementado. El aislamiento de la lidocaína y de sus metabolitos se efectuó por extracción. Por eso, se agregaron 150 \mul de carbonato de sodio (0.1 M) y 600 \mul de cloroformo. Después de 1 min de vortexeado y 4 min de centrifugación a 8000 rpm, el supernadante acuoso fue eliminado y se agregaron 150 \mul de agua dest. y 350 \mul de HCl (0.1 M) a la fase orgánica. El procedimiento de vortexeado y centrifugación fue repetido y el supernadante eliminado. Un compartimiento de almacenamiento refrigerado de la muestra mantuvo los residuos a 4°C antes del análisis. La fase móvil (0.5 M de tampón de fosfato, pH 4.5) fue bombeado con una proporción de flujo de 1.7 ml/min (Perking Elmer 250) y pretratada con una columna Guard (Superspher 60 RP 8, longitud 10 cm, partículas 4 pm, Bischoff Chromatography, Alemania). Un muestreador automático (Gilson Sample Injector modelo 231, Francia) inyectó 50 \mul de partes alíquotas en una columna de HPLC (Superspher 60 RP 8, longitud 20 cm, i.d. 4.6 mm, partículas 4m, Bischoff Chromatography, Alemania) con temperatura regulada (55°C, Chrompac Column Thermostat, Países Bajos). La determinación fue de 198 nm (espectrofotómetro UV Schoeffel SF 770, Alemania) y las áreas máximas fueron calculadas por medio de un software de integración (Chrompac PCl, versión 5.12, países Bajos) que utiliza un ordenador Olivetti M250. Las muestras fueron cuantificadas comparando la proporción del área máxima del componente de interés con el estándar interno. Las curvas estándar fueron obtenidas para la lidocaína (5-80 \mug/ml), MEGX (0.5-16 \mul/ml), xilidina (5-80 \mug/ml) y GX (1-32 \mug/ml) y mostraron linearidad (r=0.996, n=6). El límite de determinación fue de 0.4 \mug/ml para GX, 0.3 \mug/ml para xilidina, 0.2 \mug/ml para MEGX, 0.4 \mug/ml para EMGX y 0.5 \mug/ml para lidocaína y los tiempos de retención fueron respectivamente 2.2 min, 2.4 min, 3.2 min, 4.1 min, y 5.8 min. El tiempo de estabilización de la columna se limitó a 20 minutos mediante el lavado con un tampón fosfato/acetonitrilo/ácido fosfórico (50mM, pH=1.7) y una solución de acetonitrilo (agua dest.: ACN = 1:1) para eliminar el valor máximo de
cloroformo.

Metabolismo de los aminoácidos

Se estudió la renovación metabólica de una amplia gama de aminoácidos. Las concentraciones de aminoácidos fueron determinadas mediante una derivatización completamente automatizada de la precolumna con o-ftaldialdehido (OPA), seguido de cromatografía liquida de alta resolución como se describe en Van Eijk HMH, Van der Heijden MAH, Van Berlo CLH, Soeters PB, Clin Chem 1988; 34: 2510-13.

Proporción lactato/piruvato. Los niveles de lactato/piruvato fueron determinados a 340 nm (Cobas Bio, Roche, Suiza) con equipos de pruebas enzimáticas (Boehringer Mannheim Wiesbaden, Alemania, equipo de lactato n. 149993 y equipo de piruvato n. 124982). A partir de esto se calculó la proporción lactato/piruvato.

Pérdida enzimática

Los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH), transaminasa glutámica oxaloacética (GOT) y transaminasa glutámica pirúvica (GPT) fueron medidos con analizadores clínicos habituales.

Glucosa

Los niveles de glucosa fueron medidos empleando tiras para la prueba de glucosa (hemoglucotest 1-44 R, Boehringer Mannheim, Wiesbaden, Alemania) y el dispositivo lector accesorio Reflolux-S.

pH

El pH fue medido realizando un muestreo 1 ml de medio con una jeringa de gas en sangre (Marz-1 75, Sherwood Medical, Irlanda) que fue determinado en un analizador de gas en sangre (Radiómetro: modelo ABL 300: Copenhague).

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Secreción proteica

Al cuarto día el sistema de cultivo de todo el biorreactor fue lavado con 250 ml de medio Williams E enriquecido sin FCS e incubado en el mismo medio. Las muestras del medio fueron recogidas después de 24 horas y dializadas ampliamente contra una solución de 50 mM de NH_{4}HCO_{3} y criodesecadas. Los residuos secos fueron reconstruidos en una cantidad del tampón de electroforesis (tampón Tris-barbital, pH=8.6, resistencia iónica 0.1) tal que el sobrenadante del cultivo había sido concentrado 20 veces.

Para visualizar las proteínas de suero segregadas por los hepatocitos porcinos efectuamos una inmunoelectroforesis cruzada usando un antisuero poliespecífico para las proteínas de suero porcino como se ha descrito anteriormente (28).

1.e Análisis microscópico

Unos sistemas de cultivo de cinco días fueron preparados para el análisis microscópico con el fin de determinar la orientación de los hepatocitos en el biorreactor.

Microscopia óptica

Los hepatocitos fueron fijados haciendo fluir en el biorreactor formalina (4%). Después de 24 horas el biorreactor fue abierto y doce muestras matriciales (1 cm^{2}) fueron tomadas desde diversas partes de tejido no-tejido. Las muestras fueron lavadas en agua, deshidratadas en etanoles graduados e introducidas en parafina. De aquí se cortaron unas lonchas de 8 \mum de espesor, que fueron desparafinadas con xilol y coloreadas con hematoxilina-eosina. Las preparaciones fueron observadas bajo microscopio óptico Olympus Vamox (tipo AHBT3, Tokio, Japón).

Microscopia de barrido electrónico

Los agregados de hepatocitos de cultivos de cinco días fueron fijados haciendo fluir en el biorreactor glutaraldehido al 4% en un tampón fosfato, pH 7.3 (Fluka Chem A.G., Buchs, Suiza). El biorreactor fue cortado en el medio y una parte fue deshidratada en etanoles graduados y definitivamente se desecó en hexametildisilazano (Sigma, München, Alemania). La superficie cortada fue revestida con oro en un dispositivo de revestimiento por pulverización y observada bajo un microscopio de barrido electrónico (ISI SS40, Japón).

1.f Análisis estadístico

Se usó una prueba t de Student no pareada, y P<0.05 fue considerado estadísticamente significativo. Los datos fueron presentados como media \pm SEM.

1.g Formación de imágenes por Resonancia Magnética (MRI)

La MRI es un método no invasivo para mostrar la distribución del flujo líquido por ejemplo en un tubo o, en el caso de la presente invención, en el biorreactor.

Se investigó la distribución del flujo en una sección transversal de un biorreactor pequeño (ID 1.32 cm, volumen 11 ml, 46 membranas de fibras huecas, núcleo acrílico de diámetro 0.4 cm) y ampliado (ID 2.2 cm, volumen 33 ml, 138 membranas de fibras huecas, núcleo acrílico de 0.4 cm de diámetro) de longitud similar. En primer lugar, los biorreactores fueron lavados con etanol y luego con agua para eliminar las burbujas de aire que pudieran bloquear el flujo del medio y/o pudieran alterar la homogeneidad del campo magnético traduciéndose en una intensidad de señal reducida. A continuación, un biorreactor fue colocado en una bobina de tipo jaula y colocado horizontalmente en un espectrómetro de 6.3 Tesla con orificios de 20 cm casero. Se emplearon dispositivos sin células ya que el espectrómetro no estaba equipado para soportar hepatocitos vitales. Se tomaron del centro del biorreactor MRI's sensibles al flujo transaxial usando una nueva técnica de formación de imágenes de perfusión en condiciones estables. En resumen, la señal del agua en una loncha de detección (ancho 2 mm, perpendicular a la dirección de flujo) es suprimida. Durante un momento de flujo de 100 ms, parte de la loncha es refrescada dando así un aumento de la intensidad de la señal. De esta forma, cuanto mayor es el flujo, más se refrescará la loncha de detección y más aumentará la intensidad de la señal. El flujo del fluido a velocidades superiores a 2 cm/s no resultarán en una señal aumentada, ya que la loncha de detección es luego completamente refrescada. Por lo tanto el flujo fue calibrado de manera que la velocidad máxima del fluido en la mayoría de los canales de flujo no excediera los 2 cm/s.

1.h Análisis alfa-GST Suero tóxico y vitalidad de los hepatocitos

El alfa-GST es liberado por los hepatocitos con una membrana celular dañada y es por lo tanto un marcador de la integridad de los hepatocitos. La enzima hepática alfa-GST fue de especies específicas determinadas (rata, cerdo, humano) con un equipo ELISA porporcionado por Biotrin, Irlanda.

Las ratas con isquemia hepática fueron tratadas con un BAL a base de hepatocitos porcinos. Las muestras de plasma fueron recogidas a tiempo para determinar los niveles de alfa-GST de rata y de cerdo (en una y misma muestra).

2. Resultados 2.a Cultivo de los hepatocitos

El estudio incluía 22 biorreactores, de los cuales 16 dispositivos (n=8 por duplicado) fueron empleados para cultivar hepatocitos y 6 dispositivos sin células (n=3 por duplicado) sirvieron como control. Los resultados de las pruebas de función de los hepatocitos en dos biorreactores con células del mismo procedimiento de aislamiento no fueron nunca diferentes al 10%, indicando inmovilización y cultivo celular reproducible. El sistema de cultivo permaneció estéril en todo el estudio y no se observó ninguna pérdida del medio en el lumen de las fibras huecas de oxigenación.

2.b Pruebas de función de los hepatocitos Eliminación de la galactosa

La capacidad de eliminación de la galactosa después de la incubación durante 180 min con una dosis estándar de galactosa permaneció constante durante un periodo de tres días.

Síntesis de la urea

Unos niveles elevados de amoníaco tienen una función en la encefalopatía hepática. La síntesis de la urea del amoníaco es por lo tanto una prueba importante de funcionalidad. La síntesis de la urea después de una incubación de 120 min. con 10 mM de NH_{4}Cl no varió en un periodo de tres días.

Metabolismo de la lidocaína

La actividad citocromo P450 de los hepatocitos fue analizada determinando la lidocaína y sus metabolitos.

La eliminación de lidocaína y la sucesiva producción de MEGX y xilidina después de una incubación de lidocaina de 60 min. no varió de forma significativa en un periodo de tres días. La xilidina fue el principal metabolito de la lidocaina en los primeros dos días. No se registró ninguna diferencia significativa en la producción de xilidina y MEGX en el tercer día. Considerando los experimentos individuales, el aclaramiento de la lidocaína se correlacionaba mejor con la formación de xilidina que de MEGX. Los hepatocitos porcinos no produjeron niveles individuales del metabolito GX durante la incubación con lidocaína durante una hora.

Metabolismo de los aminoácidos

La tabla 1 muestra las modificaciones en la concentración media de algunos aminoácidos relativos a la funcionalidad hepática. Una reducción de la concentración de glutamina fue asociada a una concentración aumentada de glutimato. El metabolismo hepático de los aminoácidos aromáticos (AAA) se reflejó en una reducción de las concentraciones de fenilalanina, tirosina y triptófano. La disminución en las concentraciones de arginina y la síntesis de ornitina indican actividad arginasa. Se observó una reducción en la concentración de alanina, un precursor de la gluconeogénesis hepática.

Además de la tabla 1, también otras concentraciones de aminoácidos disminuyeron de forma significativa como asparagina, glicina, histidina, valina, metionina, isoleucina, leucina y lisina. El metabolismo total de los aminoácidos permaneció estable durante un periodo de tres días.

Proporción lactato/piruvato

La proporción lactato/piruvato es un índice del estado funcional de la oxidación celular y del metabolismo aeróbico. La tabla 1 muestra una brusca disminución de la proporción lactato/piruvato, que se debió solamente a un descenso de la concentración del lactato. La proporción lactato/piruvato de 5 a 7 reflejó un estatus de oxigenación estable del sistema de cultivo durante un periodo de tres días.

Pérdida enzimática

Para constatar la vitalidad de los hepatocitos, se determinó el aspecto de la actividad enzimática, es decir LDH, GOT y GPT, en el caldo de cultivo. La emisión de LDH fue significativa sólo el primer día (tabla 1). La liberación de GOT fue significativa durante tres días con una tendencia descendente en la concentración media de GOT. Se liberaron unas cantidades bajas pero significativas de GPT en el primer y segundo día.

Glucosa

Los niveles de glucosa no variaron en el primer día de cultivo (tabla 1). Una reducción significativa en la concentración de glucosa fue observada en los días 2 y 3.

pH

El pH en el biorreactor estudiado fue mantenido constante (tabla 1) con la ayuda de un oxigenador integrado que garantiza presiones parciales estables (32.6\pm0.4 mmHg, n=8) de CO_{2} en el medio taponado con bicarbonato de sodio.

Secreción proteica

Los hepatocitos cultivados segregan proteínas en su medio de cultivo. Una inmunoelectroforesis bidimensional cruzada fue efectuada empleando un antisuero contra el suero porcino para visualizar las diversas cantidades y tipos de proteínas segregadas por los hepatocitos cultivados en el biorreactor después de una incubación de 24 horas con un medio Williams E suplementado sin FCS. Los resultados están mostrados en la Fig. 6. cada valor máximo representa una proteína diferente. El área bajo cada valor máximo es una indicación de la cantidad de proteína segregada. En el medio de cultivo de los biorreactores de control sin células no se detectaron proteínas de suero porcino (resultados no mostrados).

2.c Análisis microscópico

Los hepatocitos de la suspensión celular inyectada individual se reorganizaron en pequeños agregados de conformación irregular con un contacto célula-célula extendido (Fig. 14). Los agregados de este cultivo de cinco días fueron inmovilizados y atrapados dentro la estructura de fibra de poliéster. A pesar del cultivo con alta densidad, existe espacio suficiente entre los agregados para una perfusión sin impedimentos del medio hacia y desde los hepatocitos. Dado que la matriz en 3D está relativamente vacía tiene el potencial de cultivar hepatocitos también con densidades mayores a las actuales 20.10^{6} células vitales/ml. Dado que los agregados son tan pequeños (con un diámetro nunca superior a 5 células, normalmente 2-3 células), los hepatocitos funcionan en contacto directo con el medio. El flujo del medio a través de este compartimiento de inmovilización de hepatocitos se acerca a la situación in vivo donde cada hepatocito actúa bajo condiciones de perfusión y en contacto cercano con la sangre.

El análisis de las muestras matriciales en 3D tomadas cerca del acceso de entrada y salida y en el centro del tejido no-tejido reveló que los hepatocitos están distribuidos uniformemente en el dispositivo del biorreactor.

El recuento de células en doce preparaciones microscópicas de la matriz en 3D (dimensiones: longitud 10 mm, ancho 0.5 mm, espesor 8 \mum) de un biorreactor se tradujo en un número medio de 1379\pm135 (media\pmsd) hepatocitos/preparación. Se puede calcular que cada uno de los 220.10^{6} hepatocitos vitales sembrados se inmovilizarían dentro el tejido no-tejido, cada preparación debería contener unas 1400 células vitales. Por lo tanto en este experimento se inmovilizó como media el 98.5% de los hepatocitos.

La Fig. 15 presenta una micrografía de barrido electrónico de hepatocitos aislados después de cinco días en cultivo en la matriz en 3D del biorreactor. Según se ha observado por microscopia óptica, los hepatocitos de este cultivo de cinco días mantienen su configuración del agregado y permanecen inmovilizados en las fibras de poliéster. Se puede observar un contacto célula-célula extendido entre los hepatocitos esféricos.

2.d Resonancia magnética

Las Figuras 15A y 15B visualizan la distribución del flujo en una sección transversal de un biorreactor pequeño (A) y uno adaptado (B). La velocidad del fluido fue detectada sólo en la dirección axial y oscilaba desde cero (negro) hasta aproximadamente 2 cm/s (blanco). En comparación con la figura 1 pueden ser identificados diversos componentes del biorreactor como el tejido de poliéster no-tejido, las membranas de fibras huecas de oxigenación, los canales de flujo y el núcleo acrílico. La representación negra del tejido de poliéster no-tejido indica sólo que el flujo del medio dentro la matriz en 3D no estaba en la dirección axial. La perfusión del tejido en otras direcciones no fue analizada. La distribución homogénea de los puntos grises demuestra que todos los canales de flujo en ambos dispositivos fueron perfundidos. Los matices grises indican que la velocidad del fluido podría diferir del canal de flujo (variando de 0.5 a 2 cm/s, pero normalmente alrededor de 1.5 cm/s). Las flechas en la figura 2B muestran puntos de disminución de la intensidad de la señal como consecuencia de las burbujas de aire atrapadas. Las imágenes de spin eco (no mostradas) revelaron que la dimensión de las burbujas de aire era mucho más pequeña que la distorsión resultante. El espectrómetro sólo permitó una orientación horizontal del biorreactor. Normalmente el dispositivo está situado en vertical, lo cual facilita la eliminación de las burbujas de
aire.

Las Figuras 15A y 15B muestran un MRI sensible al flujo transaxial de un biorreactor pequeño (A, diámetro interno 1.32 cm) y de uno adaptado (B, diámetro interno 2.2 cm). La velocidad del fluido oscilaba de cero (negro) hasta aproximadamente 2cm/s (blanco). En comparación con la figura 1, pueden ser identificados diversos componentes del biorreactor, como el tejido de poliéster no-tejido, las membranas de fibras huecas de oxigenación, los canales de flujo y el núcleo acrílico. Las imágenes de ambos dispositivos muestran que todos los canales de flujo fueron perfundidos. Se pueden observar diferencias en la velocidad del fluido de los canales de flujo. Las flechas en la figura B indican puntos de intensidad de señal reducida como consecuencia de las burbujas de aire atrapadas.

2.e Determinación de alfa-GST

Como se esperaba, la concentración de alfa-GST de rata aumentó durante el tratamiento BAL. Sorprendentemente, la concentración de alfa-GST porcina permaneció constante, indicando que la vitalidad de los hepatocitos porcinos en el biorreactor de la invención no había sido efectuada por el plasma de rata tóxico.

3. Argumentación

En la técnica anterior los hepatocitos fueron cultivados en el espacio endoluminal y extrafibroso de unidades de fibras huecas. La popularidad de este concepto de cultivo celular puede ser fácilmente comprendida ya que es la manera más sencilla de realizar un BAL. Estos sistemas de cualquier modo no respetan las condiciones esenciales para una transferencia de masa óptima hacia y desde los hepatocitos presentes en el hígado intacto. Como consecuencia la actividad metabólica de los hepatocitos es deteriorada por las siguientes razones: el tratamiento clínico de la insuficiencia hepática requiere cultivos de hepatocitos a gran escala y con alta densidad. En muchos biorreactores esto provoca la formación de gránulos de hepatocitos no fisiológicos. Los hepatocitos en el centro de estos grandes agregados muestran escasa actividad metabólica y también posible necrosis a causa de altos gradientes debido a la transferencia de masa obstaculizada de sustancias nutritivas y oxigeno hacia estas células y de anhídrido carbónico, toxinas y productos celulares desde las mismas. Esto está en contraste con el hígado in vivo donde cada hepatocito está en contacto cercano con la sangre. Por otro lado, en la mayoría de los biorreactores el intercambio del sustrato depende de la difusión que limita ulteriormente la transferencia de masa en comparación con la situación in vivo, donde los hepatocitos actúan en condiciones de perfusión con unos gradientes bajos correspondientes. El biorreactor nuevo de la invención, cuando se usa como un BAL, se centra en dichos requisitos para la transferencia de masa fisiológica. Esto resultó en un sistema con las siguientes características:

1. Tejido de poliéster tridimensional no-tejido

El análisis al microscopio mostró que las fibras de poliéster del tejido no-tejido proporcionan una estructura para la inmovilización de los hepatocitos a alta densidad (20.10^{6} células/ml) y reorganización en pequeños agregados (con un diámetro no superior a 5 células, normalmente 2-3 células) con espacio entre los agregados. Esto permite a cada célula operar bajo condiciones de perfusión similares a aquellas in vivo y en contacto directo con el medio, imitando así de forma más cercana los gradientes fisiológicos. Las investigaciones sobre agregados de hepatocitos porcinos revelaron que tales estructuras mantienen muchas de las características cito-arquitectónicas halladas in vivo, sobreviven más tiempo y muestran actividad funcional igual y/o aumentada en comparación con el cultivo de monocapas. Se hallaron resultados similares para nuestro nuevo dispositivo de biorreactor que está basado en tales agregados de hepatocitos porcinos. La evaluación microscópica ha evidenciado un contacto extendido entre los hepatocitos esféricos como se observó in vivo. Las funciones específicas del hígado han sido mantenidas durante un periodo de tres días y la capacidad de síntesis de la urea fue duplicada con respecto al cultivo monocapa, según Lazar
et al.

2. Ningún material matricial extracelular

En un estudio precedente (te Velde AA, Ladiges NCJJ, Flendrig LM, Chamuleau RAFM, J Hepatology 1995; 23: 184-192) la actividad funcional de los hepatocitos porcinos fijados al plástico de cultivo tisular hidrofílico fue comparado con las células fijadas a diversos constituyentes de la matriz extracelular: colágeno I y IV, laminina, fibronectina, Engelbreth-HolmSwarm Natrix y en presencia de Matrigel. A excepción del Matrigel, ninguno de los materiales de los sustratos de matrices extracelulares aumentó la función de los hepatocitos porcinos en comparación con el plástico de cultivo tisular. El Matrigel tiene la desventaja de que es muy costoso y además unas cantidades relativamente grandes de proteínas murinas de origen tumoral rebasan el gel y pueden entrar en la circulación del paciente. Por ello decidimos inyectar la suspensión de hepatocitos directamente en el biorreactor seco y dejamos que los hepatocitos porcinos se inmovilizaran en las fibras de poliéster hidrofílicas. No se efectuó ningún enjuague previo con el medio, ni revestimiento con materiales de matrices extracelulares comunes como el Matrigel, colágeno u otros, consiguiendo de esta forma un dispositivo más seguro, más económico y más cómodo.

3. Inmovilización rápida de hepatocitos

Se dejó que los hepatocitos se inmovilizaran durante dos horas. Después del periodo de inmovilización las células muertas y no fijadas son expulsadas del biorreactor, mejorando como consecuencia la vitalidad global del sistema de cultivo. En teoría el sistema está luego listo para el uso. El análisis al microscopio óptico de un biorreactor de cinco días reveló que el 98.5% de los hepatocitos vitales fecundados estaban presentes en la matriz en 3D, indicando así una gran eficacia de inmovilización y un lavado celular limitado en el tiempo. Este último resultado fue confirmado por el análisis diario bajo microscopio óptico de muestras del medio del circuito de anillo cerrado, en el que se observaron rara vez células o fragmentos.

Una pequeña preparación podría representar una ventaja en la aplicación clínica, pero es preciso que ulteriores investigaciones demuestren el efecto que este tiempo de recuperación limitado tiene sobre la función de los hepatocitos. La inmovilización rápida puede explicada como sigue: después de la inyección de la suspensión de hepatocitos monocelulares, el biorreactor es rotado horizontalmente a lo largo de su eje longitudinal durante dos horas. Esto cambia continuamente la dirección de sedimentación de las células suspendidas, lo que permite a los hepatocitos moverse libremente en el espacio del biorreactor en búsqueda de fibras de poliéster a las que fijarse. La modalidad de rotación aumenta drásticamente las interacciones célula-fibra y célula-célula, acelerando así la fijación y el agregado de hepatocitos vitales. Además el estatus de una oxigenación óptima del sistema mejora además el valor de la inmovilización de los hepatocitos.

4. Bajos gradientes de sustrato y metabólicos

En un nivel celular, los bajos gradientes de sustrato y metabólicos en un cultivo de hepatocitos a alta densidad pueden ser realizados cultivando los hepatocitos como pequeños agregados dentro del tejido de poliéster no-tejido. Esto resulta en un cultivo de hepatocitos con el espacio suficiente entre los agregados para una perfusión sin impedimentos de todos los hepatocitos del medio con gradientes bajos. Observando todo el biorreactor, se pueden obtener gradientes bajos del medio reduciendo la distancia de perfusión entre el acceso de entrada y de salida o aumentando el caudal del medio. Gerlach et al mencionado arriba describe un complicado diseño del biorreactor que realizaba la primera opción cultivando los hepatocitos entre haces de fibras huecas tejidas independientemente, uno para el flujo del medio y otro para la salida del medio. Esto permite la perfusión descentralizada de las células entre estos capilares con un gradiente bajo. Una solución técnicamente mucho más sencilla es la última opción realizada mediante un aumento del caudal del medio a través del biorreactor. Esto era factible en nuestro sistema ya que los hepatocitos son cultivados dentro la matriz en 3D y de esta forma protegidos de la red de fibras de poliéster. El aumento progresivo de la capacidad del medio de 5 ml/min a 15 ml/min no ha mostrado ninguna marca de tensión de cizalla como una reducción de la actividad funcional de los hepatocitos o un aumento de la pérdida enzimática. El flujo y distribución uniformes del medio a todas las partes de la matriz 3D están garantizados por numerosos canales que son distribuidos uniformemente por todo el espacio del biorreactor. Además estos canales tienen en consideración también una alimentación homogénea de la suspensión de los hepatocitos inyectados en la matriz
tridimensional.

5. Oxigenación descentralizada y distribución uniforme de las fibras huecas de oxigenación

El oxigenador integrado elimina los gradientes de O_{2} y CO_{2} a lo largo de la dirección de perfusión del medio. Además la construcción de textura espiroidal (Fig. 3) crea una distribución homogénea de las fibras huecas de oxigenación por todo el biorreactor, garantizando así cada hepatocito de una fuente de oxigenación en los entornos directos. Esto resulta en una oxigenación óptima de los hepatocitos que fue confirmada por una brusca reducción de la proporción lactato/piruvato (32) y pH estable, indicando presiones parciales constantes de CO_{2} en el medio taponado con bicarbonato de sodio.

6. Biocompatibilidad

La biocompatibilidad ha sido dirigida construyendo el biorreactor en materiales aprobados por la FDA (Food and Drug Administration) que resisten a la alta tensión térmica del tratamiento en autoclave. Por lo que sabemos, éste es el primer biorreactor para el cultivo de hepatocitos que puede ser esterilizado por vapor. Esto es biológicamente mucho más seguro que la esterilización con óxido de etileno altamente tóxico usado normalmente, ya que los residuos de óxido de etileno rebasan de polímeros durante muchas semanas y pueden causar sensibilización y reacciones alérgicas en los pacientes.

7. Adaptación sencilla

El compartimiento de inmovilización de los hepatocitos está compuesto por muchas unidades repetitivas. Cada unidad es completamente capaz de soportar la función de los hepatocitos e incorpora una fibra hueca de oxigenación, un canal de perfusión del medio y material portador tridimensional. La adaptación hasta la masa hepática necesaria para la aplicación clínica implica simplemente un aumento del número de unidades y así un aumento del número de enrollamientos del compuesto fibra hueca/matriz tridimensional hasta obtener la capacidad de inmovilización requerida. El empleo de alojamientos de diálisis estándar y técnicas de encapsulación aseguran una producción sencilla de una amplia gama de tamaños del biorreactor.

Tal adaptación no influirá en la distribución del plasma en el biorreactor. Esto fue confirmado por los MRI sensibles al flujo, que mostraron la perfusión de todos los canales de flujo en un biorreactor pequeño y en uno adaptado. La velocidad del fluido podría diferir por canal de flujo, siendo un resultado del hecho de que los biorreactores han sido realizados a mano. Actualmente se considera que las técnicas de producción industrial resuelven este
problema.

Además con el análisis alfa-GST mencionado arriba, es ahora posible por primera vez hacer un seguimiento simultáneamente de las condiciones del hígado del paciente y los hepatocitos en el biorreactor. Ya que se piensa que los hígados porcinos son la fuente de hepatocitos del futuro, esta prueba podría ser una interesante posibilidad para hacer un seguimiento del daño hepatocelular durante el tratamiento BAL.

Un sistema de soporte de hígado bioartificial para el tratamiento de la insuficiencia hepática fulminante y como puente para el trasplante de hígado requiere una amplia cantidad de hepatocitos vitales y activamente en funcionamiento. Los hepatocitos porcinos están considerados la mejor elección, ya que los hepatocitos humanos están escasamente disponibles y las células transformadas pueden no presentar funciones cruciales típicas de los hepatocitos. Los hígados porcinos pueden ser obtenidos a partir de animales de laboratorio o del matadero y los hepatocitos porcinos pueden ser fácilmente aislados en grandes cantidades con una sencilla técnica de dos fases de perfusión de
colágeno.

Para la aplicación clínica de un hígado bioartificial no es aconsejable ningún hepatocito proveniente de un cultivo a largo plazo, ya que las funciones metabólicas de los hepatocitos primarios cultivados disminuyen con el tiempo. Por lo tanto se hizo un seguimiento del sistema de cultivo sólo para los primeros cuatro días después del aislamiento, cuando las funciones específicas del hígado son más altas. La diversidad de las funciones hepáticas no permite que una prueba individual pueda ser una indicación de la capacidad funcional del hepatocito. Por esta razón se efectuó una batería de pruebas para averiguar el rendimiento del sistema de cultivo. La eliminación de galactosa, síntesis de la urea y metabolismo de los aminoácidos permanecieron constantes durante un periodo de análisis de tres días, indicando la capacidad del sistema del biorreactor de mantener la función de los hepatocitos.

El aclaramiento de lidocaina es una indicación para la actividad citocromo P450 y se considera la función critica que debe ser provista por un BAL eficaz. El aclaramiento de lidocaina fue mantenido durante tres días, demostrando así actividad estable de P450 por parte de los hepatocitos cultivados en el biorreactor. En un experimento individual la actividad P450 fue mantenida durante 14 días con una tendencia a la reducción gradual en la segunda semana hasta el 70% de la actividad inicial. Para excluir que el aclaramiento de la lidocaina fuera provocado por evaporación, absorción o captación invariada de los hepatocitos, se analizaron las biotrasformaciones de la lidocaina detectando los metabolitos MEGX, xilidina y GX, sintetizados notoriamente en el hombre. Se observa que MEGX es el metabolito principal de la lidocaina en el hombre y en el cultivo de hepatocitos porcinos. Al contrarío, en este estudio no ha sido el MEGX sino la xilidina el metabolito principal de la lidocaina en los dos primeros días de cultivo. Además los hepatocitos porcinos no han producido niveles detectables del metabolito GX. En resumen, la síntesis de xilidina y MEGX han confirmado la actividad citocromo P450 como se demostró por el aclaramiento de la lidocaina. La biotransformación de la lidocaina en hepatocitos porcinos era diferente de aquella observada en
humanos.

La concentración de LDH, GOT y GPT, empleada como marcador de la integridad de la membrana celular, disminuyó rápidamente tras el periodo del análisis. Esta caída de los niveles enzimáticos indica probablemente la recuperación de los hepatocitos cultivados de los efectos dañinos de la técnica enzimática del aislamiento celular. Las concentraciones de GPT en nuestro sistema de cultivo fueron muy bajas en comparación con los niveles de LDH y GOT, que fueron observados también en la técnica anterior. Por lo tanto concluimos que el GPT es un indicador insuficiente de la integridad de la membrana de los hepatocitos porcinos y debería dejarse a un lado. El marcador más sensible en este estudio fue el GOT.

Otra importante función hepática es la secreción proteica, que fue estudiada en el biorreactor de hepatocitos el cuarto día de cultivo. El sistema de cultivo fue capaz de segregar varias proteínas según se visualizó por la inmunoelectroforesis cruzada, donde cada valor máximo representaba una proteína de suero diferente.

En conclusión, la invención proporciona una nueva configuración de un biorreactor que garantiza el mantenimiento de varias funciones específicas del hígado con un cultivo de hepatocitos con alta densidad. Esto, junto con la sencillez de funcionamiento, fabricación y adaptación, hace del sistema una posibilidad interesante para el soporte a corto plazo de pacientes con insuficiencia hepática.

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TABLA 1 Resultados de una incubación de 14 horas (cada día durante tres días) de 220.10^{6} hepatocitos cultivados en el biorreactor con medio Williams E suplementado con respecto a modificaciones de las concentraciones de aminoácidos, concentraciones de lactato y piruvato y proporción lactato/piruvato, pérdida enzimática, concentraciones de glucosa y pH

1

Claims (14)

1. Biorreactor que comprende una pared que rodea un espacio, dicho espacio comprendiendo:

(a)

un soporte sólido para el cultivo celular que consiste en una matriz tridimensional en forma de una hoja o tapiz altamente poroso, donde la matriz tridimensional comprende una red fisiológicamente aceptable de fibras o una estructura fisiológicamente aceptable de espuma de poros abiertos; y

(b)

conductos para proporcionar oxigeno gaseoso y eliminar anhídrido carbónico gaseoso; donde dichos conductos son fibras huecas hechas con un material hidrófobo y con un diámetro externo de 0.1 mm a 1.0 mm, donde dichas fibras huecas están distribuidas uniformemente a través de la matriz tridimensional y donde la distancia entre cada una de las fibras huecas está comprendida entre 0.1 mm y 5 mm.

2. Biorreactor según la reivindicación 1, donde las fibras huecas están dispuestas esencialmente en paralelo desde una extremidad de la matriz hasta la otra extremidad de la matriz.

3. Biorreactor según las reivindicaciones 1 o 2, donde el biorreactor incluye además al menos una entrada de gas y al menos una salida de gas operativamente conectadas a dichas fibras huecas.

4. Biorreactor según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde las fibras huecas están fijadas a la hoja o tapiz matricial tejiendo dichas fibras en la hoja o tapiz matricial, pegando dichas fibras a dicha hoja matricial, cosiendo dichas fibras a la hoja o tapiz matricial, uniendo dichas fibras a dicha hoja o tapiz matricial por medio de ultrasonidos.

5. Biorreactor según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el soporte sólido está presente en forma de al menos una hoja o tapiz enrollado o plegado, o al menos dos hojas o tapices apilados.

6. Sistema de órgano bioartificial que consiste en un biorreactor según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el biorreactor comprende células de origen humano o animal.

7. Sistema de órgano bioartificial según la reivindicación 6, donde las células están seleccionadas del grupo consistente en células hepáticas, células pancreáticas, células renales, células paratiroidales y células de la médula ósea.

8. Sistema de órgano bioartificial según las reivindicaciones 6 o 7, donde las células son células hepáticas seleccionadas del grupo consistente en hepatocitos primarios, células hepáticas inmortalizadas, transforrmantes de células hepáticas, células de hepatomas, hepatoblastos y líneas celulares derivadas.

9. Sistema de órgano bioartificial según la reivindicación 8, donde las células han sido sometidas a crioconservación.

10. Método para la conservación y/o el cultivo de células orgánicas que comprende la introducción de dichas células en el espacio de un biorreactor según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, de manera que dichas células se adhieran al soporte sólido, y se mantenga estas células en condiciones fisiológicamente aceptables, proporcionando al mismo tiempo oxigeno gaseoso o un gas que contiene oxigeno a través de las fibras huecas.

11. Método según la reivindicación 10 donde, después de que las células hayan sido introducidas en el espacio del biorreactor, las células son inmovilizadas en el soporte sólido situado en el biorreactor mediante rotación del reactor alrededor de un eje longitudinal interno o externo durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que las células se adhieran a dicho soporte sólido.

12. Método según la reivindicación 11, donde las células orgánicas son células hepáticas seleccionadas del grupo consistente en hepatocitos primarios, células hepáticas inmortalizadas, transformantes de células hepáticas, células de hepatomas, hepatoblastos y líneas celulares derivadas.

13. Método para la producción, bioconversión y/o eliminación in vitro de sustancias en o de un medio líquido o gaseoso, donde dicho método comprende el contacto del medio con células presentes en el espacio de un sistema de órgano bioartificial según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 6-9.

14. Método según la reivindicación 13, donde el medio líquido o gaseoso es sangre o plasma.