ES2224245T5 - Purificacion del complejo factor viii mediante cromatografia de inmunoafinidad. - Google Patents
Purificacion del complejo factor viii mediante cromatografia de inmunoafinidad. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2224245T5 ES2224245T5 ES97922744T ES97922744T ES2224245T5 ES 2224245 T5 ES2224245 T5 ES 2224245T5 ES 97922744 T ES97922744 T ES 97922744T ES 97922744 T ES97922744 T ES 97922744T ES 2224245 T5 ES2224245 T5 ES 2224245T5
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- fvw
- complex
- factor viii
- chromatography
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
SE DESCRIBE UN COMPLEJO MUY PURO QUE SE COMPONE DE LOS COMPONENTES DEL FACTOR VIII Y DE VWF, CON UNA ACTIVIDAD ESPECIFICA DE AL MENOS 70, PREFERIBLEMENTE 100 A 300 E DEL FACTOR VIII:C/MG, UN PREPARADO FARMACEUTICO ESTABLE QUE CONTIENE ESTE COMPLEJO, ASI COMO UN PROCEDIMIENTO POR CROMATOGRAFIA DE INMUNOAFINIDAD PARA SU OBTENCION.
Description
Purificación del complejo factor VIII mediante
cromatografía de inmunoafinidad.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción de un complejo altamente purificado
formado por los componentes factor VIII (factor VIII: C o FVIII) y
factor von Willebrand (FvW), y de una preparación farmacéutica
estable que contiene el complejo altamente puro.
El factor von Willebrand es una glucoproteína
multimérica que está codificada por un gen en el cromosoma 12 y
circula en el plasma en concentraciones de 5 a 10 \mug/ml,
libremente y como complejo no covalente con el factor de coagulación
VIII, proteína que está codificada por un gen en el cromosoma 10 y
está ausente o falta en la hemofilia A.
Las dos funciones principales del FvW en la
hemostasis son:
- 1.
- La adhesión de los trombocitos al endotelio lesionado, para lo cual el FvW se liga al subendotelio herido y hace posible la formación de un puente entre esta superficie y las plaquetas, así como una agregación de estas últimas entre sí. La primera interacción entre los trombocitos y el subendotelio se realiza mediante la glucoproteína Ib de la membrana de los trombocitos y las fibras de colágeno del endotelio lesionado. El FvW se liga a estas dos proteínas y hace de mediador para la formación de una primera capa de trombocitos, interviniendo en la posterior reticulación de las plaquetas entre sí mediante el enlace al complejo glucoproteína IIb/IIIa. Los responsables de estas tareas en la hemostasis primaria son principalmente multímeros de gran tamaño (Eller; Lab. Med. (1994); 18: 168-176).
- 2.
- Debido a su sitio de unión para FVIII, el FvW influye también en la coagulación plasmática. El FVIII se halla en el plasma casi exclusivamente en forma de complejo no covalente con FvW, llevando aproximadamente una de cada diez moléculas de FvW una molécula de FVIII. Como portadores actúan sobre todo dímeros y multímeros de pequeño tamaño. Gracias a este complejo con FvW, el FVIII está protegido contra una inactivación proteolítica intensificada (por ejemplo por una proteína C activada).
Además, el complejo potencia el FVIII en lo que
se refiere a su actividad como cofactor en la coagulación intrínseca
(Eller; Lab. Med. (1994); 18: 168-176).
El FvW se forma en las células del endotelio
vascular, que constituyen la fuente principal de esta proteína
plasmática, mediante una liberación constitutiva o estimulada, pero
también se sintetiza, aunque en menor proporción, en los
megacariocitos (PNAS 92 (1995), 2428-2432).
El producto primario de la traducción se compone
de 2.813 aminoácidos. Una vez disociado el péptido señal (22
aminoácidos), se realiza la dimerización. El proceso posterior se
realiza en el aparato de Golgi, donde los dímeros se polimerizan
bajo disociación de los propéptidos (741 aminoácidos). El propéptido
desempeña un importante papel en la posterior ligadura de los
dímeros, catalizando la formación de enlaces disulfuro en el extremo
aminoterminal. De este modo se generan oligómeros de distintos
tamaños, que oscilan entre dímeros de 500.000 dalton y multímeros de
gran tamaño de hasta 20 millones de dalton. Adicionalmente a los
procesos proteolíticos, el FvW está sometido a otras modificaciones
postraduccionales, incluidas la glicosilación y la sulfatación
(Mancuso y col.: Hämostaseologie (1989); 9:
122-129).
Por tanto, la complejidad de la biosíntesis hace
que existan numerosas moléculas de FvW distintas con las más
diversas funciones y propiedades.
Como consecuencia, el factor von Willebrand
puede presentar actividades de enlace muy diferentes con respecto a
sus compañeros de enlace naturales. En particular, se ha comprobado
que la fuerza de enlace de diversas moléculas de FvW con la
glucoproteína Ib, con el colágeno, con la heparina, con el complejo
de glucoproteína IIb/IIIa, con el factor VIII y con el subendotelio
puede ser distinta.
Por tanto, esto implica que todas las
preparaciones de FvW consisten en una mezcla de las citadas diversas
proteínas de FvW o bien grupos de FvW y, consecuentemente, son
heterogéneas en lo que se refiere a sus propiedades, tales como la
fuerza de enlace esencial con respecto al factor VIII.
La presencia de diversas formas de FvW es
también el motivo de los complejos y distintos fenotipos en la
fisiopatología de la enfermedad de von Willebrand, que en ciertos
casos puede atribuirse a un déficit de producción del factor de von
Willebrand y en otros casos a un exceso de producción del mismo. Por
ejemplo, un exceso de producción de FvW conduce a una mayor
tendencia a las trombosis, mientras que un déficit en el suministro
de FvW tiene como consecuencia una mayor tendencia a las hemorragias
o mayor tiempo de coagulación, pero esto no puede aplicarse en
ningún caso de modo general, ya que también es decisiva la forma en
que se produce, en déficit o en exceso, el factor de von
Willebrand.
Para distinguir y caracterizar las propiedades
del FvW y el síndrome de FvW se emplean diversos métodos de
análisis.
Así pues, para el diagnóstico es imprescindible
determinar la actividad del cofactor ristocetina. Para ello se
estudia la agregación plaquetaria en presencia del antibiótico
ristocetina, que en los pacientes con síndrome de FvW se halla
reducida o es totalmente inexistente (Macfarlane y col.: Thrombosis
et Diathesis Haemorehagica 1775; 34:
306-308).
306-308).
Además, la actividad de formación de colágeno
del FvW puede aprovecharse para la diferenciación del síndrome de
FvW (Thomas y col.: Hämastaselogie (1994); 14:
133-139).
La constante de disociación de enlace entre el
FvW y el FVIII puede determinarse según el método de Vlot y col.
(Blood 83 (11) (1995); 3150-3157).
La estructura molecular del FvW se determina
mediante el análisis de la estructura multimérica por medio de
electroforesis SDS en geles de agarosa al 1,2% (Ruggeri y col.:
Blood (1981); 57: 1140-1143).
Para determinar la cantidad total de antígeno
FvW se utilizan los más diversos kits de ensayo ELISA disponibles en
el mercado.
La preparación de un complejo FVIII/FvW óptimo
debería tener como objetivo la obtención de un producto estable,
pero sobre todo libre de proteínas acompañantes no deseadas, ya que
toda carga de proteínas innecesaria implica un riesgo de efectos
secundarios no deseados.
Por tanto, toda concentración de FvW no
necesaria para la estabilización de FVIII constituye una carga para
el hemofílico.
Hasta la fecha, en el curso de los procesos de
producción de preparaciones de factor von Willebrand, especialmente
a partir de pools plasmáticos, no ha sido posible excluir totalmente
el riesgo de heterogeneidad de la composición debido a la presencia
de distintas formas del factor von Willebrand, ni ha sido posible,
en el estado actual de la técnica, obtener una preparación de FvW
con propiedades uniformes, por ejemplo en lo que se refiere a su
actividad de enlace con un determinado ligando.
Ya se sabía cómo depurar el complejo factor VIII
mediante diversos anticuerpos monoclonales anti-FvW,
tanto a partir de plasma como a partir de crioprecipitados (Thromb.
Haemostas. 57 (1987), 102-105). También se ha
ensayado la estabilidad del complejo FVIII/FvW en distintos tampones
con un pH 6,5, entre los cuales se incluyen aquellos que contienen
glicoles, aminoácidos, agentes caotrópicos, aminas, otras sales o
disolventes orgánicos y/o detergentes. La adición de lisina a
soluciones tampón junto con sustancias caotrópicas en altas
concentraciones, como por ejemplo urea 3M, proporcionaba una
protección del factor VIII: C/FvW:Ag contra los efectos de
desnaturalización. Las actividades de los factores VIII:C y FvW
R.cof. eran, tras una incubación con etilenglicol al 20% en volumen
+ KI 1M por ejemplo, de un 72% o un 48%, y, en caso de tratamiento
con urea 3M, de un 88% o un 77%.
La actividad específica del factor VIII:C en un
producto final, eluido con KI 1M + lisina 1M + imidazol 20 mM +
CaCl_{2} 5 mM, pH 6,5, era de 45 I.U./mg de proteína total, la del
FvW de 60 I.U./mg.
También se tiene información sobre la
purificación del complejo factor VIII/FvW por métodos
cromatográficos a partir de crioprecipitados tras su adsorción en
Al(OH)_{3} y sobre la realización de una
inactivación vírica utilizando anticuerpos monoclonales
anti-FvW (Biotechnol. Blood Prot. 227 (1993),
109-114). La elución del complejo adsorbido se
realizaba a un pH 6,5 bajo la adición del agente caotrópico KI (1M).
La relación factor VIII:C/FvW:Ag era 0,8 y la actividad específica
de factor VIII:C 38 i.u./mg.
Por último, por el documento
EP-0 295 645-A2 se sabe cómo
purificar el complejo factor VIII mediante cromatografía de afinidad
utilizando péptidos específicos, dirigidos contra FvW, de líquidos
biológicos heterogéneos. Para ello se eluyó el complejo utilizando
gradientes de pH o tampones con una gran fuerza iónica (véase el
ejemplo 5 del documento EP-0 295
645-A2).
En el documento EP 0 416 983 A1 se describe una
preparación con el complejo factor VIII/FvW obtenida mediante
cromatografía de intercambio aniónico. Según el documento WO
86/01718 A1 se obtuvo una preparación de complejo factor VIII/FvW
mediante cromatografía en un anticuerpo monoclonal.
En el documento JP 01/144991 A se describe la
purificación del factor VIII:C o de un complejo factor VIII:C/FvW
mediante la adsorción en un portador con un anticuerpo monoclonal,
para lo cual el factor VIII:C o el complejo factor VIII:C/FvW se
liga con una baja concentración de iones metálicos y se eluye con
una alta concentración de iones metálicos.
Todos estos complejos factor VIII/FvW del estado
actual de la técnica tienen en común el hecho de que, a pesar de una
alta concentración y depuración de los preparados, no han sido
capaces de proporcionar un preparado homogéneo en lo que se refiere
al FvW, en lo que respecta a su enlace en relación con el factor
VIII:C, y por lo tanto no existía ningún complejo factor VIII/FvW
nativo con una alta actividad específica.
\newpage
Por consiguiente, la presente invención se
plantea el problema de poner a disposición una preparación de factor
VIII/FvW que contenga un complejo factor VIII/FvW y que, en lo que
se refiere a las propiedades de enlace del FvW con respecto al
factor VIII, presente una estructura uniforme y gracias a ello sea
particularmente compatible o estable.
Según la invención, este problema se resuelve
mediante el procedimiento descrito en las reivindicaciones
1-10 para la producción de una preparación que
contiene un complejo altamente purificado, formado por los
componentes factor VIII y factor von Willebrand, con una actividad
específica de como mínimo 70, y preferentemente entre 100 y 300, U
de factor VIII:C/mg, que puede obtenerse purificando un material de
partida que contiene los factores VIII:C y FvW mediante
cromatografía de afinidad, eluyéndose de modo fraccionado el
complejo factor VIII:C y FvW, así como el factor VIII:C o el FvW no
en complejo. En este proceso, el factor VIII:C o el factor von
Willebrand en no complejo, o sea excedente, se separa mediante
cromatografía de inmunoafinidad, especialmente mediante elución
fraccionada, lo que permite obtener el factor en forma de complejo y
de no complejo en fracciones separadas.
Mediante la etapa de separación según la
invención del factor VIII:C o del factor von Willebrand no complejo,
se separan de forma selectiva especialmente moléculas de factor von
Willebrand con afinidad mermada con respecto al factor VIII y, por
primera vez, se obtiene un complejo factor VIII/FvW nativo y
homogéneo que contiene una fracción de FvW definida en lo que se
refiere a su afinidad con respecto al factor VIII.
Sorprendentemente, el complejo obtenido según la
invención es estable en cromatografía de inmunoafinidad en un medio
caotrópico. Ni siquiera en un medio con una conductividad de hasta
30 mS, preferentemente de hasta 40 mS, puede detectarse disociación
alguna del complejo. Así pues, el complejo estable factor VIII y FvW
puede eluirse y obtenerse de la columna anti-FvW
incluso con una fuerza iónica relativamente alta correspondiente a
una solución doble o triplemente isotónica.
En el complejo obtenido según la invención, el
FvW presenta preferentemente una actividad de enlace de colágeno en
un rango de 0,2 a 0,6, en relación con el antígeno de FvW (unidad de
plasma/unidad de plasma).
El complejo obtenido según la invención puede
obtenerse preferentemente mediante la purificación de un material de
partida que contenga los dos componentes, eluyéndose de forma
fraccionada el complejo y el factor VIII:C o FvW del portador de
inmunoafinidad.
Los eluyentes pueden contener también
concentraciones relativamente altas de agentes caotrópicos o sales
de acción caotrópica, ya que la cromatografía de inmumoafinidad se
realiza preferentemente en anticuerpos que conservan su afinidad o
avidez con relación al factor VIII o al FvW incluso en condiciones
estrictas y el complejo factor VIII/FvW obtenido permanece estable
también bajo dichas condiciones.
Por ejemplo, se eligen anticuerpos que liguen el
antígeno sin perjudicar las propiedades de enlace hasta una
concentración de NaSCN 1M o clorhidrato de guanidina 0,5M, o incluso
de sulfato amónico saturado al 100%. En cada caso un 50% del
antígeno se liga hasta una concentración de NaSCN 1,5M ó de
clorhidrato de guanidina 0,75M, de etilenglicol al 80% o de urea
0,75M. Los anticuerpos utilizados para la cromatografía de
inmunoafinidad son preferentemente anticuerpos fuertes que, en un
ensayo de enlace, se ligan al antígeno inmovilizado también en
disoluciones diluidas a un máximo de 30 ng/ml, preferentemente un
máximo de 15 ng/ml, lo que corresponde a una relación
anticuerpo/antígeno de 1:5 a 1:20.
Debido a las excelentes propiedades del complejo
obtenido según la invención en lo que se refiere a su homogeneidad,
especialmente en lo que respecta a las propiedades de enlace factor
VIII del FvW obtenido, dicho complejo es especialmente adecuado para
la obtención de preparaciones farmacéuticas para la administración
de factor VIII y/o FvW. Se ha comprobado que es posible obtener este
complejo en una concentración como mínimo 5.000 veces mayor,
preferentemente entre 7.100 y 21.400 veces mayor, que en el plasma.
Por lo tanto, una forma de realización especial de la presente
invención es la producción de una preparación farmacéutica estable
que contiene el complejo altamente purificado en una concentración
como mínimo 5.000 veces mayor, preferentemente entre 7.100 y 21.400
veces mayor, que en el plasma, en la que el complejo presenta una
gran fuerza de enlace de complejo y está esencialmente libre de FvW
o factor VIII:C no complejo. De este modo se garantiza que no se
perjudica al paciente debido a FvW excedente y a otras proteínas,
conservándose la actividad fisiológica del complejo factor VIII/FvW.
Así pues, el preparado obtenido según la invención se distingue por
su extraordinaria aceptación fisiológica.
La ausencia de FvW y/o factor VIII:C no complejo
significa que la preparación farmacéutica presenta menos de un 5%,
preferentemente menos de un 1%, de FvW o factor VIII:C libre, con
respecto al contenido total de proteína. Se prefieren especialmente
las preparaciones en las que no es posible detectar FvW:Ag o factor
VIII:C no complejo.
La detección de FvW o factor VIII no complejo se
realiza mediante recromatografía del complejo obtenido según la
invención en material de inmunoafinidad, para lo cual se carga dicho
material con una determinada cantidad de FvW o factor VIII libre, se
adsorbe de nuevo el complejo y se eluye en la forma arriba indicada.
El material obtenido tras la recromatografía contiene la misma
relación factor VIII:C y FvW:Ag que el material de partida y, por lo
tanto, no presenta pérdidas relativas. Otro ensayo para la detección
de factor VIII y FvW no ligado en complejo es el enlace del complejo
a anticuerpos de factor VIII:C o anticuerpos de FvW inmovilizados,
no pudiendo detectarse tras la adsorción ninguna proporción
esencial, es decir menos de un 5%, de FvW o factor VIII:C no
enlazado en el residuo.
La preparación farmacéutica obtenida según la
invención se distingue por una gran fiabilidad en lo que se refiere
a su espectro de acción, siendo el riesgo de descomposición o
activación de factor VIII debido a la pequeña proporción de factor
VIII:C libre o factor VIII:C fácilmente disociable considerablemente
menor con relación a las preparaciones de complejo de factor
VIII:C/FvW ya conocidas.
Se sobrentiende que la preparación farmacéutica
que contiene el complejo obtenido según la invención puede presentar
principios activos, sustancias tampón, sustancias auxiliares o
aditivos farmacéuticos adecuados, utilizados para preparados factor
VIII/FvW. Sin embargo, gracias a la excelente estabilidad del
complejo factor VIII/FvW, éste permite también elaborar un preparado
farmacéutico estable sin necesidad de utilizar adicionalmente los
estabilizantes usuales, tales como albúmina, azúcares, especialmente
trealosa o sacarosa.
El preparado farmacéutico obtenido según la
invención también es lo suficientemente estable en una solución con
pH neutro como para poder proporcionarse en forma de preparado
líquido o de preparado líquido congelado. Tras la reconstitución del
preparado liofilizado correspondiente se observa también una
composición del complejo prácticamente invariable.
El técnico en la materia puede determinar
también fácilmente la dosis a administrar o las concentraciones del
complejo en el preparado de acuerdo con los regímenes de
administración conocidos en el estado actual de la técnica para los
preparados de factor VIII/FvW.
El factor VIII y/o FvW puede estar contenido en
el preparado obtenido según la invención en forma de proteína nativa
o de un derivado, por ejemplo en forma de proteína mutada mediante
deleción, sustitución o inserción o en forma de derivado químico o
como fragmento, en tanto se mantenga la gran afinidad de enlace del
factor VIII con respecto al FvW en el complejo.
Un objeto de la presente invención es un
procedimiento para la purificación por cromatografía de
inmunoafinidad de un material de partida que contiene factor VIII:C
y FvW, caracterizado por las siguientes etapas:
- -
- puesta en contacto del material de partida con un material de cromatografía de inmunoafinidad,
- -
- elución del complejo factor VIII/FvW con un tampón de elución y
- -
- posterior elución de factor VIII:C o FvW en no complejo con otro tampón de elución que presenta una concentración o conductividad elevada con relación al tampón de elución anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante la elución fraccionada selectiva de los
factores en forma de no complejos del complejo se ha logrado obtener
por vez primera una preparación de factor von Willebrand, o un
complejo de factor VIII/FvW, uniforme en lo que se refiere a una
determinada fuerza de enlace.
Para la cromatografía de inmumoafinidad se
emplean preferentemente anticuerpos dirigidos contra el FvW. De este
modo es posible ajustar aun más el procedimiento de purificación,
cuyo objetivo esencial es el fraccionamiento de distintas moléculas
o unidades de FvW, a la distinta naturaleza de la molécula de von
Willebrand.
De acuerdo con una forma de realización especial
del procedimiento según la invención, se utilizan como anticuerpos
anticuerpos monoclonales. Éstos son preferibles a un antisuero
policlonal en lo que respecta a su homogeneidad.
Un tampón de elución preferente para el complejo
obtenido según la invención en la cromatografía de afinidad es aquel
que contiene un tiocianato y/o una sal de amonio, preferentemente en
una concentración no superior a 2M, y en la mayoría de los casos
preferentemente entre 0,05M y 1,5M. Este primer tampón de elución
contiene preferentemente etilenglicol, glicerina o un
polialquilenglicol.
El factor VIII:C o el FvW en no complejos se
eluyen preferentemente con un tampón que contiene un agente
caotrópico, especialmente tiocianato, y/o sal de amonio, y/o sales
alcalinas y/o etilenglicol, glicerina o un polialquilenglicol y se
obtienen también en forma de preparaciones homogéneas. El tampón
presenta una concentración o conductividad elevada en relación con
el primer tampón de elución, especialmente una concentración o
conductividad más de un 20% mayor, preferentemente más de un 50% a
un 100% mayor.
Con el procedimiento según la invención también
se obtiene una preparación de von Willebrand que presenta una
capacidad de enlace o de formación de complejo reducida con respecto
al factor VIII:C.
El complejo altamente purificado, pero también
las preparaciones de factor VIII:C o FvW no complejo, pueden, en
caso dado, purificarse en mayor medida mediante etapas
cromatográficas adicionales, preferentemente mediante cromatografía
de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel,
cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad, especialmente en
heparina inmovilizada, o cromatografía de iones metálicos quelantes,
y elaborarse de forma ya conocida y adecuada para obtener preparados
farmacéuticos o de diagnóstico.
Para la obtención de preparados farmacéuticos es
necesario, por regla general, prever un tratamiento para la
inactivación o desenriquecimiento de virus, preferentemente un
tratamiento térmico y/o un tratamiento físico o químico. En los
documentos EP-0 159 311, EP-0 519
901 y WO 94/13329 se describen procedimientos de tratamiento
adecuados. Dado que el complejo presenta una gran estabilidad, dicho
tratamiento de inactivación vírica se realiza preferentemente en el
complejo altamente purificado.
Según una forma de realización preferente del
procedimiento según la invención, el material de partida se
selecciona del grupo compuesto por plasma, fracciones plasmáticas,
por ejemplo crioprecipitados o precipitados alcohólicos, residuos de
cultivos celulares o preparados farmacéuticos.
La invención se explica más detalladamente en
base a los ejemplos siguientes, a los que sin embargo no está
limitada.
(Actualmente, según la opinión del
solicitante, el mejor modo de realizar la invención
reivindicada)
Se disuelven 500 gr de crioprecipitado en una
disolución tampón 1 + 4 a 30ºC. Después se clarifica la solución a
través de un filtro de 0,45 \mum (por ejemplo Millipore Durapore).
Una columna llena con 0,5 l de gel anti-FvW (firma
IMMUNOTECH, Francia) se prepara con aprox. 10 volúmenes de columna
(= VC) de equitampón y a continuación se aplica la solución de
crioprecipitado clarificada a 0,5 cm/min. Después se eliminan las
impurezas no deseadas mediante lavado con 5 a 10 VC de equitampón
(eventualmente con una concentración elevada de NaCl > 250 mM), a
una velocidad de flujo de 1 cm/min. Acto seguido se eluye el
complejo factor VIII/FvW con el tampón de elución 1 en una relación
aproximada 1:1. La elución con el tampón de elución 2 proporciona
FvW casi completamente libre de factor VIII. La segunda etapa de
elución sirve al mismo tiempo para limpiar la columna, con lo que es
posible equilibrarla de nuevo inmediatamente después.
\vskip1.000000\baselineskip
| Disolución tampón: | Tris 7,5 mM | |
| NaCl 60 mM | ||
| Lisina 100 mM | ||
| Acetato de Na 100 mM | pH 6,8 | |
| 25 U/ml de heparina |
\vskip1.000000\baselineskip
| Equitampón: | Tris 10 mM | |
| NaCl 100 mM | ||
| Lisina 100 mM | ||
| CaCl_{2} 3,25 mM | pH 6,8 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Tampón de elución 1: | Tris 10 mM | |
| Glicina 100 mM | ||
| NaCl 250 mM | ||
| AMS 300 mM | ||
| CaCl_{2} 3 mM | ||
| Etilenglicol al 40% | pH 6,5 |
| Tampón de elución 2: | Tris 10 mM | |
| Glicina 100 mM | ||
| NaCl 1,25 M | ||
| NaSCN 1,25 M | ||
| CaCl_{2} 3 mM | ||
| Etilenglicol al 40% | pH 7,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se descongela 1 l de plasma congelado a una
T>25ºC y después se diluye 1 + 2 con equitampón. La solución se
clarifica a través de un filtro de 0,45 \mum. Una columna llena
con 50 ml de gel anti-FvW (firma IMMUNOTECH) se
prepara con aprox. 5 VC de equitampón y a continuación se aplica la
solución de plasma clarificada con un flujo de 1 cm/min. Las
impurezas no deseadas se eliminan mediante lavado con 10 a 20 VC de
equitampón + NaCl 250 mM. La primera elución proporciona complejo
factor VIII/FvW; la segunda elución FvW libre de actividad de factor
VIII. Inmediatamente después puede equilibrarse la columna de
nuevo.
\vskip1.000000\baselineskip
| Equitampón: | 5 gr/l de citrato de Na | |
| 2 U/ml de heparina | pH 7,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Tampón de elución 1: | 5 gr/l de citrato de Na | |
| 30 gr/l de AMS | ||
| 20 gr/l de NaSCN | ||
| 75 gr/l de histidina | ||
| 5 gr/l de NaCl | ||
| 0,4 gr/l de CaCl_{2} | pH 7,0 |
| Tampón de elución 2: | 5 gr/l de citrato de Na | |
| 50 gr/l de AMS | ||
| 50 gr/l de NaSCN | ||
| 75 gr/l de histidina | ||
| 25 gr/l de NaCl | ||
| 0,4 gr/l de CaCl_{2} | pH 7,0 |
Claims (10)
1. Procedimiento para la purificación por
cromatografía de inmunoafinidad de un material de partida que
contiene factor VIII:C y factor von Willebrand (FvW),
caracterizado por las siguientes etapas:
- -
- puesta en contacto del material de partida con un material de cromatografía de inmunoafinidad,
- -
- elución del complejo factor VIII/FvW con un tampón de elución y
- -
- posterior elución de factor VIII:C o FvW no complejo con otro tampón de elución que presenta una concentración o conductividad elevada con relación al tampón de elución anterior.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque para la cromatografía de inmunoafinidad
se emplean anticuerpos dirigidos contra el FvW.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque como anticuerpos se emplean anticuerpos
monoclonales.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se emplean
anticuerpos de alta afinidad con respecto al FvW, que pueden ligar
el FvW también en un medio con tiocianato 1M.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el complejo
altamente purificado se eluye con un tampón que contiene un
tiocianato y/o una sal de amonio, preferentemente en una
concentración máxima de 2M, especialmente entre 0,05M - 1,5M.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el complejo
altamente purificado se eluye con un tampón que contiene
etilenglicol, glicerina o un polialquilenglicol.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se eluye y
obtiene factor VIII:C o FvW con un tampón que contiene un agente
caotrópico, especialmente tiocianato y/o sal de amonio, y/o sales
alcalinas y/o glicoles, como etilenglicol, glicerina o un
polialquilenglicol, presentando el tampón una concentración o
conductividad elevada con relación al tampón de la reivindicación 5
ó 6.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el complejo
altamente purificado se purifica mediante etapas cromatográficas
adicionales, preferentemente cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de filtración en gel, cromatografía hidrófoba,
cromatografía de afinidad o cromatografía de iones metálicos
quelantes.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se prevé una
etapa de tratamiento para la inactivación o el desenriquecimiento
viral, preferentemente un tratamiento térmico, que preferentemente
se realiza en el complejo altamente purificado.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque como material
de partida se utiliza un miembro del grupo compuesto por plasma,
una fracción plasmática, un residuo de cultivo celular y un
preparado farmacéutico.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0066796A AT403765B (de) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | Verfahren zur herstellung einer präparation enthaltend einen hochgereinigten komplex |
| AT667/96 | 1996-04-12 | ||
| AT66796 | 1996-04-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2224245T3 ES2224245T3 (es) | 2005-03-01 |
| ES2224245T5 true ES2224245T5 (es) | 2009-03-01 |
Family
ID=3496644
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97922744T Expired - Lifetime ES2224245T5 (es) | 1996-04-12 | 1997-04-09 | Purificacion del complejo factor viii mediante cromatografia de inmunoafinidad. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6307032B1 (es) |
| EP (1) | EP0906340B2 (es) |
| JP (2) | JP4375813B2 (es) |
| AT (1) | AT403765B (es) |
| DE (1) | DE59711732D1 (es) |
| ES (1) | ES2224245T5 (es) |
| WO (1) | WO1997039033A1 (es) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT406373B (de) * | 1997-02-27 | 2000-04-25 | Immuno Ag | Verfahren zur reinigung von faktor viii/vwf-komplex mittels kationenaustauscherchromatographie |
| AT406867B (de) * | 1997-02-27 | 2000-10-25 | Immuno Ag | Verfahren zur gewinnung von hochreinem vwf oder faktor viii/vwf-komplex |
| AT408443B (de) * | 1998-02-27 | 2001-11-26 | Immuno Ag | Verfahren zur gewinnung von gereinigtem faktor viii:c/vwf-komplex |
| US6605222B1 (en) * | 1998-05-20 | 2003-08-12 | Baxter Aktiengesellschaft | Method for producing a factor VIII/von Willebrand factor complex |
| EP2305314B1 (en) | 2001-10-10 | 2015-12-23 | ratiopharm GmbH | Remodelling and glycoconjugation of antibodies |
| SI2574677T1 (sl) | 2007-12-27 | 2017-11-30 | Baxalta GmbH | Procesi celične kulture |
| ES2600879T3 (es) | 2009-11-13 | 2017-02-13 | Grifols Therapeutics Inc. | Preparaciones que contienen el factor de Von Willebrand (FvW) y procedimientos, kits y utilizaciones relacionados con las mismas |
| SG191186A1 (en) | 2010-12-15 | 2013-07-31 | Baxter Int | Eluate collection using conductivity gradient |
| WO2013093760A2 (en) | 2011-12-19 | 2013-06-27 | Grifols, S.A. | Compositions, methods, and kits for preparing sialylated recombinant proteins |
| AU2012324020A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-18 | Grifols, S.A. | Method for purifying Factor VIII |
| WO2013083858A1 (en) | 2012-04-24 | 2013-06-13 | Novo Nordisk A/S | Compounds suitable for treatment of haemophilia |
| JP2014138614A (ja) * | 2014-04-09 | 2014-07-31 | Sk Chemicals Co Ltd | 第ｖｉｉｉ因子とその誘導体の製造及び精製方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2570276B1 (fr) | 1984-09-18 | 1987-09-04 | Immunotech Sa | Procede d'obtention du complexe fviii/vwf a usage therapeutique et produits en resultant |
| DE3707213A1 (de) | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung von faktor viii:c-mangelplasma und ein so erhaltenes mangelplasma |
| JPH01144991A (ja) * | 1987-12-02 | 1989-06-07 | Kagaku Oyobi Ketsusei Riyouhou Kenkyusho | 血液凝固第８因子の精製方法 |
| FR2651437A1 (fr) | 1989-09-05 | 1991-03-08 | Lille Transfusion Sanguine | Procede de preparation de concentre du complexe facteur viii-facteur von willebrand de la coagulation sanguine a partir de plasma total. |
| DE4435392B4 (de) * | 1994-10-04 | 2008-02-07 | Immuno Ag | Verfahren zur Trennung von vWF in hochmolekularen vWF und niedermolekularen vWF |
-
1996
- 1996-04-12 AT AT0066796A patent/AT403765B/de not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-04-09 ES ES97922744T patent/ES2224245T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-09 WO PCT/AT1997/000069 patent/WO1997039033A1/de active IP Right Grant
- 1997-04-09 DE DE59711732T patent/DE59711732D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-09 JP JP53657997A patent/JP4375813B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-09 EP EP97922744A patent/EP0906340B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-09 US US09/171,121 patent/US6307032B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-03-02 JP JP2009048163A patent/JP2009161547A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2224245T3 (es) | 2005-03-01 |
| JP2000508644A (ja) | 2000-07-11 |
| ATA66796A (de) | 1997-10-15 |
| DE59711732D1 (de) | 2004-07-29 |
| AT403765B (de) | 1998-05-25 |
| WO1997039033A1 (de) | 1997-10-23 |
| EP0906340A1 (de) | 1999-04-07 |
| JP4375813B2 (ja) | 2009-12-02 |
| US6307032B1 (en) | 2001-10-23 |
| EP0906340B2 (de) | 2008-09-03 |
| JP2009161547A (ja) | 2009-07-23 |
| EP0906340B1 (de) | 2004-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI106721B (fi) | Menetelmä ihmisen standardisoidun, korkean puhtauden omaavan von Willebrand -tekijän konsentraatin valmistamiseksi | |
| AU622133B2 (en) | Plasma and recombinant protein formulations in high ionic strength media | |
| CA2201714C (en) | Method for isolation of highly pure von willebrand factor | |
| ES2186870T5 (es) | Complejo de factor viii estable, procedimiento para su preparacion asi como preparaciones farmaceuticas del mismo. | |
| ES2364118T3 (es) | Purificación de factor viii usando una resina de modo mixto o multimodal. | |
| ES2221926T3 (es) | Fracciones del factor von willebrand de elevado y bajo pesos moleculares. | |
| ES2285754T3 (es) | Purificacion de factor von willebrand mediante cromatografia de intercambio cationico. | |
| ES2298096B1 (es) | Procedimiento para la obtencion de un concentrado de factor von willebrand o del complejo de factor viii/factor von willebrand y utilizacionde los mismos. | |
| JP2009161547A (ja) | 高度に精製された第ｖｉｉｉ因子コンプレックス | |
| ES2306471T5 (es) | Procedimiento para la purificación de un complejo factor VIII/factor von Willebrans(vWF) por cromatografía de intercambio catiónico | |
| US6579723B1 (en) | Method of recovering highly purified vWF or factor VIII/vWF-complex | |
| RU2015126551A (ru) | Способ очистки лечебных белков | |
| US5278289A (en) | Antihemophilic factor stabilization | |
| PL210616B1 (pl) | Sposób rozdzielania i oczyszczania fibrynogenu i plazminogenu | |
| ES2299653T3 (es) | Concentrado de un factor de von willebrand que contiene el factor viii, y procedimiento correspondiente. | |
| US20020019036A1 (en) | Von willebrand factor derivatives and methods of isolating proteins that bind to von willebrand factor | |
| Cooper et al. | The cold-insoluble globulin of plasma and its relationship to factor VIII | |
| CA2251558C (en) | Highly purified factor viii complex | |
| JP2001506987A (ja) | フォンビルブラント因子誘導体及びタンパク質の単離法 | |
| JP2020531516A (ja) | フォン・ウィルブランド因子のウイルスろ過の方法 | |
| WO2022218962A1 (en) | Liquid composition comprising factor viii or factor viii/von willebrand factor complex | |
| de Lille | Burnouf-Radosevich et a1. |