ES2221479T3 - Analisis genomico de varios locus mediante un procedimiento de ciclos de secuenciacion mejorado. - Google Patents
Analisis genomico de varios locus mediante un procedimiento de ciclos de secuenciacion mejorado.Info
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Abstract
Un procedimiento para secuenciar un ácido nucleico que comprende: a. proporcionar en una mezcla de reacción una primera y una segunda secuencia de ácidos nucleicos diana; b. proporcionar en la mezcla de reacción un primer y un segundo cebador de secuenciación marcado que pueden hibridar, respectivamente, con la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico diana, siendo el segundo cebador de secuenciación al menos tan largo como la longitud total del primer cebador de secuenciación más la longitud de la primera secuencia diana; c. proporcionar en la mezcla de reacción una ADN polimerasa, desoxirribonucleósidos, un desoxirribonucleótido terminador de cadena y condiciones que permitan que se produzca la duplicación de la primera y la segunda secuencia diana por la acción de la polimerasa mediante extensión a partir de los primeros y segundos cebadores de secuenciación, respectivamente, donde la incorporación periódica del nucleótido terminador de cadena por la polimerasa detiene la polimerización y se produce una mezcla de productos de la extensión de los cebadores de varias longitudes, en los que cada uno de los productos de la extensión de los cebadores de la mezcla que comienza con el segundo cebador de secuenciación es más largo que los productos de la extensión de los cebadores en la mezcla que comienzan con el primer cebador de secuenciación; y, d. detectar las longitudes de los productos de la extensión del cebador en la mezcla.
Description
Análisis genómico de varios locus mediante un
procedimiento de ciclos de secuenciación mejorado.
La invención pertenece al campo de los
procedimientos de análisis de ácidos nucleicos, incluidos los
procedimientos útiles para el análisis de secuencia y para la
diferenciación diagnóstica de tipos celulares, tales como
identificación de organismos patológicos.
Se conoce una variedad de procedimientos para
secuenciar ácidos nucleicos. La mayoría de los procedimientos en uso
en la actualidad para secuenciar ADN derivan del procedimiento
didesoxi de terminación de cadena de Sanger (Sanger, F. S. Nicklen y
A. R. Coulson (1977) "DNA sequencing with
chain-terminating inibitors" PNAS USA 74:
5463-5467). Estos procedimientos inician la
duplicación catalizada por la polimerasa a partir de un cebador
marcado complementario de una porción de la cadena que se va a
secuenciar. Típicamente se llevan a cabo cuatro reacciones de
polimerización, cada una con uno de los cuatro didesoxinucleótidos
(ddNTP) mezclados con los desoxinucleótidos normales. Los ddNTP no
pueden formar un enlace fosfodiéster con los nucleótidos siguientes,
de forma que en cada mezcla de reacción la polimerización en cadena
en ocasiones se interrumpe en un ddNTP, lo que produce una serie de
cadenas marcadas cuyas longitudes son indicativas de la localización
de una determinada base en la secuencia. Los fragmentos marcados
resultantes se pueden separar según su tamaño mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida. la posición de los
fragmentos en el gel puede determinarse mediante la detección del
marcador, por ejemplo, se pueden usar autorradiografías para
detectar fragmentos marcados radioactivamente. Recientemente se han
adaptado variaciones del método de secuenciación de Sanger para la
secuenciación automática a gran escala usando diversos marcadores
fluorescentes y electroforesis capilar en gel.
Antes de la secuenciación se puede usar la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las
secuencias. En las siguientes patentes de EE.UU. se describen
aspectos del procedimiento de PCR:
4.683.195, concedida el 28 de julio de 1987 a
Mullis y col. y la número 4.683.202, concedida el 28 de julio de
1987 a Mullis (véase también la patente de EE.UU. nº 4.965.188;
Saiki y col. (1988) Science 239: 487-491 y Mullis
K.B. y col. (eds), 1994, "The Polymerase Chain Reaction",
Springer Verlag, ISBN 081 7637508). La PCR usa cebadores que
hibridan con cadenas opuestas en cualquiera de los extremos de una
secuencia intermedia para amplificar la secuencia intermedia. Las
mezclas de la reacción en cadena de la polimerasa se calientan para
separar las cadenas complementarias entre ciclos de polimerización
activa. En las condiciones adecuadas, tales ciclos pueden dar como
resultado una amplificación de un millón de veces la secuencia
diana. Después, se puede secuenciar el ADN.
Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos
se pueden usar de forma útil para detectar una amplia variedad de
patógenos u otros organismos. De igual modo, la amplificación de
regiones variables de un genoma se puede usar para distinguir entre
un organismo y otro, un procedimiento que a veces se denomina huella
genética. Sin embargo, es posible obtener un resultado falso
positivo de las reacciones de amplificación cuando no se produce una
amplificación específica. Un abordaje para reducir este problema ha
sido el uso de varias reacciones de amplificación en una única
muestra, a veces conocida como amplificación múltiple, como se ha
descrito, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.582.989,
concedida el 10 de diciembre de 1996 a Caskey y col., la patente de
EE.UU. nº 5.552.283, concedida a Diamandis y col. el 3 de septiembre
de 1996 y la patente de EE.UU. nº 5.403.707, concedida el 4 de abril
de 1995 a Atwood y col. La patente de EE.UU. nº 5.582.989 enseña que
los procedimientos de PCR originales descritos en las patentes a las
que se ha hecho referencia anteriormente concedidas a Mullis y a
Mullis y col. no son adecuados para las reacciones de amplificación
múltiple simultáneas. La patente de EE.UU. nº 5.403.707 enseña que
en las reacciones de amplificación múltiple es útil usar cebadores
de longitud muy similar y, por tanto, de temperaturas de fusión
similares.
Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos
se pueden adaptar y combinar con la química de reacción de
secuenciación para proporcionar información de la secuencia. Tal
sistema puede denominarse "secuenciación por ciclos" y suele
implicar el uso de un par de cebadores, análogos a los cebadores de
la amplificación, que hibridan con cadenas opuestas en cualquier
extremo de la secuencia de interés. La química de la reacción de
amplificación normal se modifica incluyendo un nucleótido terminador
de cadena (tal como un ddNTP) en la mezcla de reacción, de forma que
algunos de los productos de la extensión del cebador terminarán en
los lugares de la secuencia de interés en los que esté el
nucleótido. Sin embargo, algunos de los productos de la extensión
del cebador alcanzarán el sitio de cebado opuesto, de forma que
pueden servir como molde para la extensión del cebador en el
siguiente ciclo de amplificación. En una adaptación de este
procedimiento, se puede realizar la secuenciación bidireccional
simultánea de ambas cadenas de un ADN bicatenario usando dos
cebadores específicos de cadena, cada uno de los cuales con un
marcador único. Existe una variedad de kits disponibles
comercialmente que proporcionan los reactivos adecuados e
instrucciones para llevar a cabo tales reacciones usando una
polimerasa termoestable: SequiTherm Long-Read Cycle
Sequencing Kit-LC (Cat. nº S36100LC), Epicentre
Technologies, Madison, Wisconsin, EE.UU.; SequiTherm Excel
Long-Read DNA Sequencing Kit-LC
(Cat. nº SE6100LC, Epicentre Technologies, Madison, Wisconsin,
EE.UU.; Thermo Sequenase fluorescent primer cycle sequencing kit
with 7-deaza-dGTP (Cat. nº RPN
2438), Amersham Life Science, Cleveland, Ohio, EE.UU. y Circumvent
Thermal Cycle Sequencing Kit (Cat nº 430-100), New
England Biolabs, Beverly, Mass., EE.UU.
La enfermedad de las mucosas (EM) es una de las
enfermedades víricas más frecuentes en el ganado, siendo la causa de
pérdidas económicas significativas. La EM se caracteriza por fiebre,
salivación, secreción nasal (rinitis), diarrea, anorexia,
deshidratación y aborto. La enfermedad esta causada por un virus ARN
conocido como el virus de la diarrea vírica bovina (BVDV). Se
conocen las secuencias de diversas variantes del genoma del BVDV
(Collett, M. S. y col, 1988, "Molecular Cloning and
Nucleotide Sequence of the Pestivirus Bovine: Diarrhoea Virus",
Virology 165: 19 1-199; Pellerin y col.,
1994, "Identification of a New Group of Bovine Viral Diarrhoea
Virus Strains Associated with Severe Outbreaks and High
Mortalities", Virology 203: 260-268).El BVDV
pertenece a una familia de Pestivirus que comparte muchas
similitudes con los virus causantes de la enfermedad del huésped y
el cólera porcino. El BVDV aparece en cepas no citopatogénicas (ncp)
y citopatogénicas (cp). La cepa ncp sobrevive en tejidos animales
sin producir ninguna alteración como infección latente. La cepa cp
causa alteraciones celulares y enfermedad.
Como virus ARN polimórfico, el BVDV es un ejemplo
de un amplio abanico de organismos para los que se requieren
protocolos diagnósticos fiables y para los que sería deseable poseer
técnicas para analizar de forma eficaz los polimorfismos que puedan
ser indicativos de patologías divergentes asociadas con diferentes
cepas del organismo. Las técnicas eficaces para determinar el linaje
evolutivo de un determinado patógeno, como se pone de manifiesto por
su secuencia de ácido nucleico completa o parcial, también pueden
ser útiles para proporcionar información sobre el organismo.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar procedimientos para analizar de forma simultánea varias
regiones de ácido nucleico en una sola reacción. Los procedimientos
se pueden adaptar, por ejemplo, para analizar las secuencias
obtenidas a partir de reacciones de amplificación múltiple. Tal
información puede ser útil para el diagnóstico fiable y diferencial
de organismos patológicos. Tal información también puede ser útil en
la diferenciación genómica de individuos mediante procedimientos
habitualmente denominados "huella genética".
En una forma de realización, la invención
proporciona un procedimiento para secuenciar un ácido nucleico en
una mezcla de reacción que comprende como dianas una primera y una
segunda secuencia de ácido nucleico. Las secuencias diana pueden
estar presentes en las mismas o en diferentes moléculas de ácido
nucleico. Se proporciona el primer y el segundo cebador marcados
para la secuenciación, que puedan hibridar, respectivamente, con la
primera y segunda secuencia de ácido nucleico diana. Siendo el
segundo cebador de secuenciación al menos tan largo como la longitud
total del primer cebador de secuenciación más la longitud de la
primera secuencia diana. La mezcla de reacción se proporciona con
una ADN polimerasa, desoxirribonucleótidos y un
desoxirribonucleótido terminador de cadena, en condiciones que
permitan la duplicación de la primera y la segunda secuencia diana
por la acción de la polimerasa mediante extensión a partir del
primer y el segundo cebador de la secuenciación, respectivamente.
Como en una reacción de secuenciación de Sanger típica, la
incorporación periódica del nucleótido terminador de la cadena por
la polimerasa termina la polimerización para producir una mezcla de
productos de la extensión del cebador de varias longitudes. De
acuerdo con la invención, cada uno de los productos de extensión del
cebador de la mezcla que comienza con el segundo cebador de
secuenciación será más largo que los productos de la extensión del
cebador en la mezcla que comienza con el primer cebador de
secuenciación. Una vez que las reacciones de secuenciación se han
completado, las longitudes de los productos de la extensión del
cebador en la mezcla se pueden detectar por medios conocidos, tales
como mediante electroforesis en gel.
El procedimiento de la invención se puede adaptar
para que funcione con otras secuencias de ácido nucleico como diana.
En tales formas de realización, se pueden proporcionar otros
cebadores de secuenciación marcados que puedan hibridar con las
secuencias diana adicionales. Los cebadores de secuenciación
adicionales son al menos tan largos como la secuencia más larga en
la mezcla de los productos de extensión del cebador.
Uno o más de los cebadores de secuenciación puede
ser un cebador de secuenciación "de cola" que comprende una
porción que no es homóloga a las secuencias de ácido nucleico diana.
Las porciones no homólogas del cebador de secuenciación de cola
pueden estar en posición 5' a las regiones del cebador de
secuenciación de cola que hibridan con las secuencias diana. En
formas de realización alternativas, la porción "de cola" de los
cebadores de secuenciación puede incluir moléculas de ADN no lineal,
tales como ADN ramificado o ácidos nucleicos dendríticos. Por otro
lado, las moléculas que no son de ADN pueden formar la "cola"
de los cebadores de secuenciación para proporcionar a los cebadores
un peso molecular adecuado para usar en los procedimientos de la
invención.
Los procedimientos de la invención pueden incluir
una etapa de amplificación de la primera y la segunda secuencia de
ácido nucleico diana, usando una reacción de amplificación. Se
pueden usar varias reacciones de amplificación, incluida una
reacción en cadena de la polimerasa. Por ejemplo, la reacción de
amplificación puede comprender proporcionar en la mezcla de reacción
una primera y una segunda región de ácido nucleico bicatenario para
amplificar, cada uno con cadenas complementarias con extremos 3'
opuestos que definen las regiones que se van a amplificar. Se puede
proporcionar un primer par de cebadores de amplificación, siendo un
miembro del primer par de cebadores de amplificación capaz de
hibridar con cada uno de los extremos 3' de las cadenas
complementarias de la primera región que se va a amplificar. La
primera región que se va a amplificar incluye, o es la misma, la
primera secuencia de ácido nucleico diana que se va a someter a la
reacción de secuenciación de la invención. Puede proporcionarse un
segundo par de cebadores de amplificación, siendo un miembro del
segundo par de cebadores de amplificación capaz de hibridar con cada
uno de los extremos 3' de las cadenas complementarias de la segunda
región que se va a amplificar. La segunda región que se va a
amplificar incluye, o es la mima, la segunda secuencia de ácido
nucleico diana que se va a secuenciar al menos parcialmente. La
mezcla de reacción se proporciona con una ADN polimerasa,
desoxirribonucleósidos trifosfatos y condiciones que permitan que se
produzca la duplicación por la ADN polimerasa de la primera y la
segunda región que se van a amplificar por extensión a partir del
primer y el segundo par de cebadores de amplificación,
respectivamente. Como en una típica reacción en cadena de la
polimerasa, las regiones de ácido nucleico se pueden amplificar
mediante ciclos de la mezcla de reacción entre una primera
temperatura a la que se funden las cadenas complementarias de las
regiones que se van a amplificar, y una segunda temperatura a la que
los cebadores de amplificación hibridan con los extremos 3' de las
cadenas complementarias de las regiones que se van a amplificar, y a
la que la polimerasa cataliza la duplicación de la primera y la
segunda región que se van a amplificar por extensión a partir del
primer y el segundo par de cebadores de amplificación,
respectivamente.
Las reacciones de secuenciación y amplificación
de la invención se pueden combinar en una ciclo de reacción de
secuenciación, en el que un miembro del primer y el segundo par de
cebadores de amplificación es, respectivamente, el mismo que el
primero y el segundo cebador de secuenciación marcado.
En una forma de realización alternativa, el
procedimiento de la invención además comprende una etapa de
extensión de una secuencia durante la amplificación (que se puede
llamar amplificación "progresiva" En tal forma de realización,
uno de los miembros del primer par de cebadores de amplificación
incluye secuencias que hibridan con el extremo 3' de una de las
cadenas complementarias de la primera región que se va a amplificar.
El cebador de amplificación "progresiva" también posee otras
secuencias que no pueden hibridar con el extremo 3' de esa cadena
complementaria. Estas secuencias adicionales se utilizan para
extender la secuencia durante la amplificación.
El procedimiento de extensión de una secuencia
durante la amplificación de acuerdo con la invención puede incluir
proporcionar una mezcla de reacción que comprende una región de
ácido nucleico bicatenario para amplificar. Teniendo la región que
se va a amplificar la primera y la segunda cadenas complementarias.
La región que se va a amplificar está definida por un extremo 3' en
cada una de la primera y la segunda cadena complementaria. Se
proporciona un primer cebador de amplificación con secuencias
complementarias al extremo 3' de la primera cadena complementaria y
con secuencias adicionales que no son complementarias al extremo 3'
de la primera cadena complementaria. Estas secuencias adicionales
del primer cebador de amplificación pueden ser 5' en relación con
las secuencias del primer cebador de amplificación que son
complementarias al diana. Se proporciona un segundo cebador de
amplificación con secuencias complementarias al extremo 3' de la
segunda cadena de la secuencia diana. La mezcla de reacción se
proporciona con una ADN polimerasa, desoxirribonucleósidos
trifosfatos y condiciones adecuadas para que la polimerasa catalice
la extensión de los cebadores de amplificación. La región que se va
a amplificar se amplifica y extiende mediante ciclos de la mezcla de
reacción entre una primera temperatura a la que se funden las
cadenas complementarias de la secuencia de ácido nucleico diana, y
una segunda temperatura a la que los cebadores de amplificación
hibridan con los extremos 3' de las cadenas complementarias y la
polimerasa cataliza la extensión a partir de los cebadores de
amplificación.
Se debe apreciar que los procedimientos de
extensión y amplificación de una secuencia se pueden adaptar para
que funcionen con series de cebadores, cada uno de ellos con
secuencias adicionales, por tanto, aumentando más el tamaño de la
región que se va a amplificar. Según el ejemplo anterior, la región
que se va a amplificar puede amplificarse y extenderse más al
proporcionar un tercer cebador de amplificación con secuencias
complementarias a las secuencias adicionales en el primer cebador de
amplificación. Además, el tercer cebador de amplificación comprende
secuencias "suplementarias" que no son complementarias al
primer cebador de amplificación o a la secuencia de ácido nucleico
que se va a amplificar. Estas secuencias suplementarias forman la
base para la extensión posterior de la región que se está
amplificando. Las secuencias suplementarias pueden estar en 5' a las
secuencias en el tercer cebador de amplificación que son
complementarias a las secuencias adicionales en el segundo cebador
de amplificación.
La figura 1 es una vista esquemática de un
protocolo de análisis genómico de varios locus, que muestra el
análisis de tres regiones genómicas: \alpha, \beta y \delta.
Cada una de las tres regiones se amplifica usando cebadores de PCR
apareados, la región \alpha se amplifica con los cebadores i e i',
la región \beta se amplifica con los cebadores ii e ii' y la
región \delta se amplifica con los cebadores iii e iii'. Una vez
que las regiones \alpha, \beta y \delta se han amplificado, se
pueden secuenciar. El cebador de secuenciación a se usa para
secuenciar el segmento A de la región \alpha, el cebador de
secuenciación b se usa para secuenciar el segmento B de la región
\beta, el cebador de secuenciación "de cola" d se usa para
secuenciar el segmento D de la región \delta. La longitud del
cebador de secuenciación b es mayor que la combinación de la
longitud del cebador de secuenciación a más el segmento A. La
longitud del cebador de secuenciación d es mayor que la combinación
de la longitud del cebador de secuenciación b más el segmento B.
También se muestra una ilustración esquemática de un gel de
secuenciación 10.
La figura 2 es un diagrama esquemático que
muestra la secuenciación bidireccional con cebadores e y e' y el uso
alternativo del terminador de secuenciación t. La T_{f} del
terminador es mayor que la T_{f} de los cebadores e y e'.
La figura 3 es un diagrama esquemático que
muestra la amplificación progresiva'' del segmento F para secuenciar
con el cebador de secuenciación f. El primer ciclo de amplificación
usa los cebadores de PCR v y v' para producir el polinucleótido F',
el segundo ciclo de amplificación usa los cebadores de secuenciación
vi y v' para producir el polinucleótido F'', el tercer ciclo de
amplificación usa los cebadores de PCR vii y v' para producir el
polinucleótido F'''.
La invención proporciona un procedimiento para
secuenciar un ácido nucleico, tal como un ADN o un ARN, con al menos
una primera y una segunda región para secuenciar. Las regiones que
se van a secuenciar se pueden encontrar en la misma molécula de
ácido nucleico (o genoma) o en diferentes moléculas en la misma
muestra.
Se seleccionan cebadores de secuenciación que
puedan hibridar en las condiciones adecuadas con las regiones que se
van a secuenciar, con las que hibridan en el extremo 3' de las
regiones para iniciar la polimerización. Los cebadores se
seleccionan de forma que cada uno produzca una serie de fragmentos
distinta en la reacción de secuenciación. Por ejemplo, el segundo de
dos cebadores se seleccionaría de forma que fuera al menos tan largo
como la longitud total del primer cebador de secuenciación más la
longitud de la primera región que se va a secuenciar. De este modo,
los productos de la reacción de secuenciación iniciada en el segundo
cebador siempre serán más largos que los productos de la reacción de
secuenciación iniciada en el primer cebador.
La reacción de secuenciación puede llevarse a
cabo usando procedimientos conocidos, mezclando los cebadores de
secuenciación con el ácido nucleico que se va a secuenciar en
presencia de polimerasa, nucleótidos y un nucleótido terminador de
cadena. Se usan condiciones que permitan que se inicie la
duplicación de las regiones de interés por la acción de la
polimerasa a partir de los cebadores de secuenciación.
La incorporación periódica del nucleótido
terminador de cadena detiene la polimerización para producir una
mezcla de secuencias de varias longitudes. La selección de cebadores
de una longitud adecuada impone que cada una de las secuencias de la
mezcla que comienzan con un cebador sean de longitud diferente a la
de las secuencias que comienzan con otro cebador. En ciertas formas
de realización se pueden seleccionar condiciones adecuadas para el
uso de cebadores de secuenciación que sean, preferentemente, de 10 a
600 pares de bases (pb) de longitud, o más preferiblemente de entre
16 y 500 pb. por ejemplo, cuando hay dos cebadores y el segundo
cebador es mayor que la longitud combinada del primer cebador y la
primera región secuenciada a partir del primer cebador, todas las
secuencias producidas a partir del segundo cebador serán más largas
que las secuencias en la mezcla que comienzan con el primer cebador.
Esta diferencia en las longitudes de los productos de la reacción de
secuenciación se ilustra en la figura 1 como el esquema del gel de
secuenciación 10. Por supuesto, de igual forma se pueden secuenciar
otras regiones a partir de cebadores que sean más largos que los
productos de la reacción de secuenciación a partir de cualquier otro
cebador.
La longitud de los productos de la reacción de
secuenciación puede limitarse escogiendo secuenciar un ácido
nucleico de longitud definida. Por ejemplo se pueden secuenciar
fragmentos de restricción (que pueden subclonarse usando técnicas
conocidas) o productos de amplificación de longitud definida, para
producir una mezcla de productos de reacción de secuenciación con
una longitud que varía entre, como mínimo, la longitud del cebador
de secuenciación y, como máximo, la longitud del fragmento de ácido
nucleico que se está secuenciando.
En variante, la longitud de los productos de la
reacción de secuenciación puede limitarse usando un terminador de
secuencia que comprenda un oligonucleótido que hibride con el
extremo 5' de la región que se va a secuenciar, en la que el
terminador de secuenciación tiene un extremo 3' desde el cual no se
puede iniciar la polimerización, como un ddNTP en el extremo 3'. La
figura 2 ilustra el uso alternativo de un terminador de la
secuenciación para definir la longitud de los productos de la
reacción de secuenciación que se extiende desde el cebador de
secuenciación e. Por ejemplo, un terminador t podría ser un
polinucleótido con un didesoxinucleótido en 3' o cualquier otro
nucleótido u otro resto a partir del cual no fuera posible la
extensión en 3' de la cadena.
En efecto, el uso de cebadores de secuenciación
de una longitud amplia de acuerdo con la presente invención aumenta
el peso molecular de los productos de la extensión del cebador
producidos por una reacción de secuenciación, de forma que los
productos de la reacción de secuenciación a partir de un cebador se
pueden distinguir de los productos de la reacción de secuenciación
de otro cebador. En formas de realización alternativas, el peso
molecular de los productos de la extensión del cebador de
secuenciación puede alterarse de forma similar, de forma que los
productos de la extensión del cebador se puedan distinguir, mediante
el uso de cebadores de secuenciación con otras modificaciones
químicas. entre las modificaciones alternativas se incluyen el uso
de tipos conocidos de moléculas de ADN no lineal, tales como ADN
ramificado o ácidos nucleicos dendríticos. Las tecnologías para ADN
ramificado se describen, por ejemplo, en las siguientes referencias:
Cao Y. y col., 1995, "Clinical evaluation of Branched DNA Signal
Amplification for Quantifying HTV Type 1 in human Plasma", AIDS
Research and Human Retroviruses 11 (3): 353-361:
Collins M. L. y col., 1995, ``Preparation and characterization of
RNA standards for use in quantitative branched ADN hybridization
assays'', Analytical Biochemistry 226 (1): 120-129;
Dewar R. y col., 1994, "Application of Branched DNA. signal
Amplification to Monitor Human Immunodeficiency Virus Type 1 Burden
in human Plasma"; Journal of Infectious diseases 170:
1172-1179. Los ácidos nucleicos dendríticos son
moléculas muy ramificadas que se pueden crear mediante hibridación
controlada y sobrecruzamiento de ácidos nucleicos monocatenarios,
como se describe en las siguientes referencias: Nilsen, T.W. y col.,
1997, "Dendritic nucleic acid structures" J. Theor. Biol.
187(2): 273-84. Un enfoque alternativo
consiste en modificar los cebadores con fosforoamidita para aumentar
de forma adecuada su peso molecular. Estas modificaciones químicas
alternativas de los cebadores de secuenciación se pueden adaptar
para cambiar los aparentes pesos moleculares de los productos de la
reacción de secuenciación de forma que todos los fragmentos que
comienzan con un cebador tengan pesos moleculares aparentes
diferentes que los productos de la reacción de secuenciación que
comienzan con otros cebadores.
Los cebadores de secuenciación se proporcionan en
consecuencia, de forma que el peso molecular aparente en la
electroforesis en gel de un "segundo cebador" sea al menos tan
grande como el peso molecular aparente de un "primer" cebador
de secuenciación extenso, es decir, el primer cebador de
secuenciación se extiende para que comprenda una primera secuencia
diana, donde el primer y el segundo cebador de secuenciación
hibridan, respectivamente, con la primera y la segunda secuencia
diana para facilitar el análisis de la secuencia de los dianas.
Los productos de la reacción de secuenciación se
pueden analizar de acuerdo con técnicas de secuenciación conocidas,
como mediante la separación de las secuencias en la mezcla según la
longitud y mediante la detección de las longitudes de las secuencias
de la mezcla. Una de dichas técnicas es la autorradiografía de las
secuencias producidas a partir de cebadores de secuenciación
marcados radioactivamente y separadas en geles de poliacrilamida.
Entre los procedimientos alternativos se incluyen la detección de
productos de reacción de secuenciación con marcaje fluorescente
separadas mediante electroforesis capilar en gel.
En un aspecto de la invención, en la reacción de
secuenciación sólo se usa un nucleótido terminador de cadena. En
esta forma de realización, sólo se obtiene información de la
secuencia para uno de los cuatro nucleótidos en la región de
interés. Una ventaja de este enfoque es que sólo requiere una única
reacción de secuenciación, cuyos resultados se pueden analizar en un
único procedimiento de detección, como en un solo carril en un gel
de secuenciación de poliacrilamida. Esta técnica puede ser
particularmente útil cuando se conoce la secuencia normal de la
región y se desea determinar si la región contenida en la muestra de
interés concuerda con esta secuencia conocida. Por ejemplo, puede
ser deseable confirmar que una reacción de amplificación ha
amplificado fielmente una secuencia diana para descartar la
posibilidad de una reacción de amplificación falsa positiva. La
información de secuencias parciales también puede ser útil para
distinguir subpoblaciones de un organismo de interés. Por ejemplo,
mediante secuenciación parcial se pueden distinguir diferentes
variantes de un patógeno, como, por ejemplo, un virus, o formas
alélicas de un gen asociado con una enfermedad o predisposición a la
enfermedad.
En una forma de realización alternativa, se puede
usar secuenciación bidireccional de las regiones de interés, como se
ilustra en la figura 2. en la figura 2 se muestran los cebadores
de secuenciación bidireccional e y e' flanqueando a la región E que
se va a secuenciar. En una variante de la invención, en la que las
reacciones de secuenciación bidireccional se llevan a cabo con
marcadores distinguibles, tales como cebadores marcados con
fluorescencia que absorben o emiten a diferentes longitudes de onda,
se puede usar un sólo carril en un gel de secuenciación para correr
los productos de la reacción de secuenciación de ñas dos reacciones
de secuenciación bidireccional. Estas técnicas se pueden aplicar de
acuerdo con la invención a muchas regiones de interés.
En otros aspecto de la invención, las regiones
que se van a secuenciar se pueden amplificar primero. por ejemplo,
se puede usar la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar
regiones para secuenciar. La región que se va a secuenciar puede
comprender todas o parte de las secuencias amplificadas. Si sólo se
va a secuenciar parte de la región amplificada, los cebadores de
secuenciación se insertan dentro de las regiones amplificadas. Si se
va a secuenciar toda la región amplificada, los cebadores de
secuenciación se pueden seleccionar a partir de cebadores de
amplificación, seleccionándose un cebador de secuenciación para cada
una de las regiones amplificadas. La figura 1 ilustra de forma
esquemática un protocolo de análisis de varios locus de acuerdo con
este aspecto de la invención y muestra el análisis de tres regiones
genómicas: \alpha, \beta y \delta. Cada una de las tres
regiones en esta forma de realización se amplifica usando cebadores
pareados de PCR: la región \alpha se amplifica con los cebadores i
e i', la región \beta se amplifica con los cebadores ii e ii' y la
región \delta se amplifica con los cebadores iii e iii'. Una vez
que las regiones \alpha, \beta y \delta se han amplificado se
pueden secuenciar. En la forma de realización ilustrada, el cebador
de secuenciación a se usa para secuenciar el segmento A de la
región \alpha, el cebador de secuenciación b se usa para
secuenciar el segmento B de la región \beta, el cebador de
secuenciación "de cola" d se usa para secuenciar el segmento D
de la región \delta. Como se muestra en la figura 1 de forma
esquemática mediante la fórmula "b> a + A", la longitud del
cebador de secuenciación b es mayor que la combinación de la
longitud del cebador de secuenciación a más el segmento A. De igual
forma, como se muestra en la figura 1 mediante la fórmula "d>b
+ B", la longitud del cebador de secuenciación d es mayor que la
combinación de la longitud del cebador de secuenciación b más el
segmento B. También se muestra una ilustración esquemática de un gel
de secuenciación 10, que muestra los fragmentos generados a partir
de la secuenciación de la región \alpha como las bandas entre a y
a + A, los fragmentos generados a partir de la secuenciación de la
región \beta se muestran como las bandas entre b y b + B, los
fragmentos generados a partir de la secuenciación de la región
\delta se muestran como las bandas entre d y d + D.
Por ejemplo, Innin y col. (eds) 1995 "PCR
Strategies", Academic Press, Inc., San Diego y Erlich (ed), 1992,
"PCR Technology", Oxford University Press, nueva York,
describen procedimientos para la realización de PCR.
Generalmente, la amplificación por PCR se produce
en una solución acuosa tamponada, preferiblemente a un pH de
7-9, más preferiblemente de aproximadamente 8. El o
los pares de cebadores se añaden en cantidades adecuadas (en una
adecuada proporción molar con la diana). A la mezcla de síntesis
también se añaden desoxirribonucleósidos trifosfatos dATP, dCTP,
dGTP y DTTP en cantidades adecuadas y la solución resultante se
calienta hasta alrededor de 85ºC-100ºC durante
aproximadamente 1 a 10 minutos, preferiblemente de 1 a 4 minutos.
Después de calentar, la solución se deja enfriar, generalmente hasta
aproximadamente 20ºC-40ºC, es decir una temperatura
adecuada para la hibridación del cebador. La polimerización se
inicia en la mezcla fría, típicamente mediante l adición de una
enzima como la ADN polimerasa. Entre las enzimas adecuadas para este
propósito se pueden incluir en ciertas formas de realización, por
ejemplo, la ADN polimerasa I de E. coli, el fragmento Klenow
e la ADN polimerasa I de E. coli, la ADN polimerasa T4 u
otras ADN polimerasas, la transcriptasa inversa u otras enzimas,
incluyendo enzimas termoestables que facilitarán una combinación de
los desoxirribonucleósidos trifosfatos del modo adecuado para formar
productos de extensión del cebador complementarios a cada cadena del
ácido nucleico molde. Generalmente, la síntesis se iniciará en el
extremo 3' del cebador y avanzará a los largo de la cadena molde
hasta que la síntesis termina. Las cadenas complementarias recién
sintetizadas forman los moldes usados en la etapa realizada con
éxito del procedimiento de amplificación. En la siguiente etapa, se
funden las cadenas complementarias, como se ha descrito antes, para
proporcionar moléculas monocatenarias a las que los cebadores se
hibridan para producir la extensión de la cadena. Las etapas de
separación y extensión de las cadenas se pueden repetir tantas veces
como sea necesario para producir la cantidad deseada de las
secuencias de ácido nucleico diana. por tanto, la cantidad de la
secuencia de ácido nucleico diana producida se acumulará de forma
exponencial.
Los expertos en la técnica de la invención pueden
establecer las condiciones adecuadas para la amplificación de
acuerdo con técnicas conocidas. Por ejemplo, en algunas formas de
realización, las condiciones adecuadas pueden comprender: dNTP 0,2
mM, MgCl_{2} 2,2 mM, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH
9,0, o,1% de Triton-X-100.
Para un determinado análisis se pueden
seleccionar cebadores de amplificación adecuados de acuerdo con la
invención usando criterios conocidos en la técnica, tales como los
criterios resumidos en la bibliografía acerca de la amplificación
general mencionada anteriormente. Para la amplificación por PCR,
generalmente los cebadores de designan de forma que la posición a la
que cada cebador hibrida a lo largo de la secuencia dúplex diana es
tal que un producto de extensión sintetizado a partir de un cebador,
cuando se separa del molde, sirve como molde para la extensión del
otro cebador. Típicamente, los cebadores de amplificación tienen una
longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos, más
típicamente de alrededor de 14 a alrededor de 24 nucleótidos de
longitud. Sin embargo, en las reacciones de "secuenciación por
ciclos" y en las reacciones de amplificación "progresiva" de
acuerdo con la presente invención, puede preferirse el uso de
cebadores más largos.
También se pueden usar procedimientos
alternativos para amplificar secuencias de acuerdo con varios
aspectos de la presente invención. Por ejemplo, expertos en la
técnica pueden adaptar procedimientos adecuados a partir de las
siguientes técnicas: amplificación por desplazamiento de cadena
(véase, por ejemplo, Persing y col. (eds) "Diagnostic Molecular
Microbiology: Principles and Applications", American Society for
Microbiology, Washington, D.C.); The ligase chain Reaction, Wu
(1989) Genomics 4:560, o Landegrin (1988) Science 241: 1077, o
Barringer (1990) Gene 89: 117); Transcription-based
Amplification (véase, por ejemplo, Kwoh Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 86: 1173 (1989)); Self-sustained Sequence
Replication (véase Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
87:1874); Q Beta Replicase Amplification; u otras técnicas mediadas
por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA, Cangene Corporation,
Mississauga, Ontario). Bibliografía alternativa que puede ser de
utilidad para que los expertos en la técnica realicen tales
procedimientos de acuerdo con la invención es la siguiente: Berger y
Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Methods in
Enzymology 152:307-316, Academic Press, Inc., San
Diego, California, EE.UU; Sambrook y col. (1989) ``Molecular Cloning
- A Laboratory Manual (2ª ed.) Vol 1-3, Cold Spring
Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Press, Nueva York.
El aislamiento de ácidos nucleicos a partir de
fuentes biológicas para análisis de acuerdo con la presente
invención puede llevarse a cabo a través de cualquiera de los medios
conocidos o equivalentes o mejoras de los mismos. Por ejemplo, se
describen procedimientos en Rothbart y col. (1989), "PCR
Techonology", Stockton Press, Nueva York y Han y col. (1987),
Biochemistry 26: 1617-1625. para este propósito
también se pueden usar de forma conveniente kits disponibles
comercialmente de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por
sus fabricantes, tales kits se pueden obtener de los siguientes
fabricantes: Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.; Stratagene,
La Jolla, California, EE.UU.
En formas de realización alternativas, como se
muestra en la figura 3, la invención utiliza un protocolo de
amplificación "progresiva" para aumentar la longitud de la
región que se someterá al análisis de la secuencia. Esta
amplificación "progresiva" puede ser útil para producir una
región sintetizada, que se muestra como s y s' en la figura 3, que
esté en uno (como se ilustra) o en los dos (no se ilustra) extremos
de la región genómica de interés, mostrada como F, F', F'' y F''' en
la figura 3, a través de interacciones de amplificación sucesivas,
mostradas como PCR 1, PCR 2 y PCR 3. La representación lineal de la
molécula que se va a amplificar se muestra, para simplificar las
cosas, como una línea en la figura 3, en la práctica el sustrato de
la amplificación sería, generalmente, una molécula bicatenaria, como
también lo sería en una reacción de PCR estándar. Como se muestra en
la figura 3, el primer ciclo de amplificación usa los cebadores de
amplificación v y v' para producir polinucleótidos que componen la
región F'. El segundo ciclo de amplificación (mostrado como PCR 2 en
la figura 3) usa los cebadores de secuenciación vi y v' para
producir polinucleótidos que componen la región F'' y región s
recién sintetizada, que corresponde a la región del cebador vi que
no es complementaria a la región F''. El tercer ciclo de
amplificación, PCR 3, usa los cebadores de PCR vii y v' para
producir polinucleótidos que comprenden la región F''' y la región
sintética s', que consiste en regiones complementarias a los
cebadores de amplificación vi y vii. La amplificación progresiva se
puede usar para crear regiones sintéticas en un extremo de la región
de interés, como se ilustra en la figura 3, o en ambos extremos con
la adaptación adecuada del procedimiento mostrado en la figura 3. El
uso de la amplificación progresiva para producir una o más regiones
sintéticas s para la hibridación a un cebador de secuenciación f
puede ser útil como alternativa al uso de los cebadores de
secuenciación "de cola", tales como d, o cuando la secuencia de
la región genómica en 5' o en 3' a la región de interés, como 3' a F
en la figura 3, no se conoce. La amplificación progresiva en ambos
extremos de una región facilita el uso de pares de cebadores de
amplificación aumentando de forma secuencial la T_{fs}.
En una forma de realización, puede llevarse a
cabo una amplificación progresiva de una porción del genoma de BVDV
(secuencias 6941 a 7255 del genoma de BVDV) usando los siguientes
conjuntos de cebadores de amplificación. En una forma de
realización, "la secuenciación por ciclos" (amplificación y
reacciones de secuenciación simultáneas, es decir, amplificación en
presencia de un ddNTP y un cebador marcado) podría llevarse a cabo
usando un miembro del Conjunto de Cebadores 3 como cebador de
secuenciación marcado:
Conjunto de cebadores
1
5'-GTA GGT AGA GTG AAA CCC
CG-3'
(complementario a las secuencias
6941-6961 del genoma de BVDV y análogo al cebador de
amplificación v de la figura 3)
5'-CGG GAC CTG GAC TTC ATA
GC-3'
(complementaria a las secuencias
7255-7245 del genoma de BVDV)
Conjunto de cebadores
2
5'-(dG)_{30}GTA GGT AGA GTG AAA CCC
GG-3'
(análogo al cebador de amplificación vi de la
figura 3)
5'-(dG)_{30} CGG GAC CTG GAC TTC ATA
GC-3'
Conjunto de cebadores
3
5'-(dA)_{30}(dG)_{30}('GTA
GGT AGA GTG AAA CCC GG-3'
(análogo al cebador de amplificación vii de la
figura 3)
5'-(dA)_{30}(dG)_{30}CGG
GAC CTG GAC TTC ATA GC-3'
En otro aspecto de la invención, los cebadores de
la amplificación progresiva se eligen de forma que el punto de
fusión del cebador usado en cada amplificación sucesiva sea mayor
que en la amplificación precedente. El par de cebadores con la
T_{f} menor puede añadirse en primer lugar, y después se pueden
añadir de forma secuencial los pares de cebadores con mayores
T_{f}. De este modo, cada reacción de extensión puede llevarse a
cabo a una temperatura lo bastante elevada como para impedir la
hibridación del cebador usado en la reacción de amplificación
precedente. Esto permite que se lleven a cabo sucesivas reacciones
progresivas sin una etapa intermedia de eliminación de los cebadores
de amplificación de las reacciones de amplificación previas y ayuda
a garantizar que la amplificación se produce en cada etapa sólo a
partir del cebador de amplificación que se ha añadido más
recientemente. por ejemplo, en la figura 3 el punto de fusión de los
cebadores sería del orden de v< vi< vii.
En otra forma de realización alternativa, cada
uno de los sucesivos cebadores de la amplificación progresiva se
pueden añadir a la reacción de amplificación al principio, con el
segundo y los siguientes cebadores encapsulados en materiales, tales
como ceras, con temperaturas de fusión crecientes. de este modo,
cuando se desee liberar el siguiente cebador, se puede elevar la
mezcla de la reacción hacia la siguiente temperatura mayor a la que
el cebador se liberará. Este procedimiento evita la necesidad de
añadir cebadores sucesivos a la mezcla de reacción durante la
amplificación.
En un aspecto de la invención, uno o más de los
cebadores de secuenciación pueden incluir regiones que no sean
homólogas a la región que se va a secuenciar a partir de ese
cebador. los cebadores de este tipo pueden conocerse como cebadores
de secuenciación "de cola". Las regiones no homólogas de un
cebador de cola se pueden localizar en el extremo 5' del cebador, de
forma que el extremo 3' del cebador hibride con la región de interés
para iniciar la polimerización, como se muestra en la figura 1 para
el cebador de secuenciación d. En formas de realización
alternativas, la porción no homóloga del cebador de cola puede
situarse entre el extremo 3' del cebador que es homólogo a la región
de interés y una región en 5' del cebador de cola que también es
homóloga a la región de interés. Cualquier disposición de secuencias
no homólogas en un cebador " de cola" puede ser aceptable (que,
por supuesto, puede tener segmentos complementarios que no forman
literalmente una "cola"), siempre que el cebador permanezca
capaz de iniciar la polimerización de la región de interés. la
presencia de secuencias no homólogas en el cebador de cola afectará
a la temperatura de fusión del cebador y, por tanto, influirá sobre
las condiciones a las que se lleva a cabo la reacción de
secuenciación, determinada de acuerdo con los parámetros de
hibridación del cebador de secuenciación conocidos en la
técnica.
El uso de procedimientos de secuenciación de la
presente invención puede combinarse de forma útil con técnicas de
amplificación de ácidos nucleicos para reducir la aparición de
resultados falsos positivos en las reacciones de amplificación. Por
ejemplo, la PCR (que puede estar precedida por transcripción inversa
de virus de ARN, es decir producción de copias ADNc usando una
molécula de ARN como molde y un oligonucleótido como cebador, que
puede abreviarse como PCR TI'' se puede usar para detectar la
presencia de un ácido nucleico diana en la muestra, tal como un
ácido nucleico viral.
Este enfoque presenta la bien reconocida ventaja
de ser capaz de detectar cantidades muy pequeñas del ácido nucleico
diana. Sin embargo, la reacción de amplificación puede generar
resultados falsos positivos cuando se amplifican de forma errónea
ácidos nucleicos que no son diana. La fiabilidad del ensayo de
amplificación puede aumentarse amplificando más la diana en un ácido
nucleico de interés, tales como dos regiones de un genoma viral, tal
procedimiento se conoce como PCR múltiplex. Sin embargo, todavía se
pueden producir resultados falsos positivos en el caso de la
amplificación inespecífica de más de una región. Los procedimientos
de secuenciación de la presente invención pueden usarse para
detectar la aparición de tales resultados falsos positivos
proporcionando una secuencia parcial o completa de las regiones
amplificadas. Los procedimientos de secuenciación de la presente
invención se adaptan en consecuencia para llevarse a cabo de forma
simultánea en al menos dos regiones homólogas mediante el uso de una
única reacción de secuenciación.
Los datos de la secuencia generados mediante los
procedimientos de la presente invención pueden ser útiles para
proporcionar información acerca del subtipo de un organismo. Por
ejemplo, la presencia de un ácido nucleico diana del organismo en
una muestra puede indicarse por una reacción de amplificación
positiva y la fiabilidad de esa detección puede verificarse mediante
secuenciación de acuerdo con la presente invención. La información
de la secuencia generada de este modo puede variar de un subtipo de
organismo diana a otro. Por ejemplo, los ácidos nucleicos virales a
menudo exhiben una variabilidad significativa de una cepa a otra, en
particular los virus de ARN como el VIH. Los cebadores de
amplificación pueden seleccionarse para detectar un amplio abanico
de tales cepas mediante la selección de cebadores homólogos a las
secuencias que generalmente están conservadas entre todas las cepas
del organismo. A continuación puede determinarse la variación entre
cepas mediante la valoración de los datos de la secuencia generada
de acuerdo con la invención.
Este ejemplo describe un aspecto de la presente
invención útil para la detección del virus de la diarrea vírica
bovina (BVDV). Los procedimientos de este ejemplo se pueden adaptar
para la detección y diferenciación de ácidos nucleicos de otros
organismos, tales como otros virus de ARN.
En este ejemplo se usa un sistema de dos
pigmentos para el análisis de la secuencia. En este sistema se usan
dos láser para detectar los productos marcados de la reacción de
secuenciación. Un láser excita a una longitud de onda de 700 nm y el
otro a 800 nm. Los cebadores de la reacción de secuenciación se
marcan con dos pigmentos fluorescentes diferentes cercanos al
espectro de infrarrojos (como los disponibles en
LI-COR, Inc. de Lincoln, Nebraska, EE.UU.), uno de
los cuales responde a la iluminación por el láser de 700 nm,
pigmento que se denomina IRD700, el otro pigmento responde al láser
de 800 nm y se denomina IRD800. Usando este sistema se pueden
distinguir dos fragmentos diferentes de ADN del mismo tamaño
molecular producidos por reacciones de secuenciación distintas, y
por tanto cada uno marcados con diferentes pigmentos, por su emisión
bajo la iluminación con láser a cada una de as longitudes de ondas.
Los fragmentos de ADN marcados con pigmentos pueden detectarse de
forma automática durante la electroforesis mediante microscopia de
fluorescencia de barrido. los dos conjuntos de cebadores usados en
este ejemplo son:
Conjunto de cebadores
1
[IRD 700 marcado) 5' GTA GGT AGA GTG AAA CCC
GG
(que hibrida con una primera cadena del genoma de
BVDV en las posiciones 6941-6961)
[IRD 800 marcado) 5' CGG GAC CTG GAC TTC ATA
GC
(que hibrida con la cadena complementaria del
genoma de BVDV en las posiciones 7255-7245)
El conjunto de cebadores 1 amplifica una región
de 314 pares de bases, es decir de la posición 6941 a la posición
7255.
Conjunto de cebadores
2
[IRD 700] 5 ' (dG)_{300} AGG CTA GCC ATG
CCC TTA GT
(que hibrida con el genoma de BVDV en las
posiciones 99-118)
[IRD 800] 5' (dG)_{300} TCT GCA GCA CCC
TAT CAG G
(que hibrida con la cadena complementaria del
genoma de BVDV en las posiciones 324-342)
El conjunto de cebadores 2 amplifica una región
de 243 pares de bases, es decir de la posición 99 a la posición 342,
y una secuencia sintética de 300 pb en cada extremo, para una
longitud total del fragmento completo de 843.
En este ejemplo el análisis genómico se lleva a
cabo de la siguiente forma:
Se extrajo el ARN total usando el reactivo
TRIZOL™ y los procedimientos para su uso recomendados por el
fabricante, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland, EE.UU.
Por otro lado, se puede preparar el ARN total mediante cualquier
procedimiento adecuado conocido por aquellos expertos en la técnica
(un kit alternativo es el Kit de aislamiento de ARN disponible en
Stratagene Corp. de La Jolla, CA, EE.UU.; véase también Chomczynski,
y col. (1987) Analytical Biochemistry 162,156. "Single Step Method
of RNA Isolation by Acid Guanidinium
Thiocyanate-Phenol-Chloroform
Extraction."). Un procedimiento de acuerdo con una forma de
realización es el siguiente:
a. A 750 \mul de reactivo Trizol se añadieron
250 \mul de la suspensión celular.
b. Se dejó a temperatura ambiente durante 5
minutos
c. Se añadieron 200 \mul de cloroformo y se
mezclaron bien durante 15 segundos.
d. La mezcla se centrifugó a 12800 rpm a +4ºC
durante 10 minutos.
e. Se transfirió la capa acuosa superior a un
nuevo tubo de Eppendorf de 1,5 ml.
f. Se añadieron y mezclaron 500 \mul de
isopropanol.
g. Se dejó a temperatura ambiente durante 5
minutos.
h. La mezcla se centrifugó a 12800 rpm a +4ºC
durante 10 minutos.
i. Se descartó el sobrenadante y se añadieron 200
\mul de alcohol al 85%.
j. La mezcla se centrifugó a 12800 rpm a +4ºC
durante 10 minutos.
k. Se descartó el sobrenadante y los tubos se
secaron al aire.
l. El ARN total se suspendió en 20 \mul de agua
tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).
El ADNc se puede preparar a partir de ARN aislado
de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Una
forma de realización es de la siguiente forma:
a. Las siguientes moléculas se mezclaron en un
tubo de centrifugación de 1,5 ml
- 1 \mug 2 \mul de ARN total;
- 2 \mul de cebador en 3' (10 pM/ml);
- 8 \mul de agua.
b. Se calentó la mezcla a 70ºC durante 10
minutos.
c. A la mezcla calentada se añadió lo
siguiente:
- 4 \mul de tampón 5x de la síntesis de la 1ª cadena
- 1 \mul de dNTP (10 mM), 2 \mul de MDTT 0,1
d. La mezcla se calentó a 42ºC durante 2
minutos.
e. A la mezcla anterior se añadió 1 \mul de
SUPERSCRIPT II (una transcriptasa inversa disponible en Life
Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland, EE.UU.).
f. Se incubó a 42ºC durante 50 minutos.
g. La reacción se detuvo calentando a 70ºC
durante 10 minutos.
La amplificación del ADNC se puede llevar a cabo
por cualquier procedimiento adecuado conocido para aquellos expertos
en la técnica. en la forma de realización de este ejemplo, el
procedimiento fue el siguiente:
Usando 2 \mul de la mezcla de transcripción
inversa se amplificaron dos regiones del ADNc en un termociclador
GeneAmp™ 2400 utilizando los pares de cebadores identificados en
este ejemplo, de acuerdo con los procedimientos especificados por el
fabricante, The Perkin Elmer Corporation:
a. La reacción se llevó a cabo en 25 \mul de la
mezcla de reacción de la siguiente forma:
- 16,0 \mul de H_{2}Od
- 2,0 \mul de molde
b. La mezcla se calentó hasta 95ºC durante 10
minutos
c. La mezcla de origen se preparó del siguiente
modo:
- Cebador 1 (10 pmol/\mul) 5 \mul
- Cebador 2 (10 pmol/\mul) 5 \mul
- dNTP (10 mM) 2,5 \mul
- Tampón 10X 2,5 \mul
- MgCl_{2} 25 mM 7,5 \mul
- Taq 5U/\mul 2,5 \mul
Se añadieron 7,0 \mul de la mezcla madre
d. La PCR se puede llevar a cabo en un
termociclador GeneAmp™ 2400 (The Perkin Elmer Corporation) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Opcionalmente, para separar los productos de
amplificación de los cebadores sin reaccionar se puede usar
filtración en gel. En este ejemplo el material amplificado se
purifica usando medios de filtración en gel Sephadex™
G-50 (disponible en Sigma Chemical, St. Louis, MO,
EE.UU.). Se pueden usar otros procedimientos conocidos en la técnica
para purificar los productos de amplificación, o esta etapa se puede
omitir.
Los segmentos amplificados se pueden someter a
ciclos de secuenciación usando los conjuntos de cebadores marcados
(fluorescentes) 1 y 2 para la secuenciación por ciclos
bidireccionales de múltiples locus. En cada conjunto de cebadores,
un cebador se marca con un pigmento fluorescente que absorbe a 700
nm y el otro cebador se marca con pigmentos fluorescentes que
absorben a 800 nm. En esta forma de realización, sólo se usa un
didesoxinucleótido (secuenciación de trayecto único). Como
alternativa se pueden preparar cuatro tubos, uno con cada uno de los
cuatro posibles didesoxinucleótidos, para obtener una secuencia
completa.
Los productos secuenciados por ciclos se separan
en un gel de poliacrilamida al 6% de 0,25 mm de espesor a 1500
voltios en un secuenciador automático (LI-COR Inc.,
Lincoln, NE, EE.UU.)
La secuencia de trayecto único se puede analizar
usando el software informático adecuado y compararse con un banco de
datos de subtipos de ADN de BVDV. Este análisis se puede usar para
identificar el subtipo de BVDV presente en la muestra.
Este ejemplo proporciona el análisis de cuatro
regiones del genoma de BVDV usando cebadores de pesos moleculares
diferentes y con marcadores fluorescentes distintos. En esta forma
de realización se puede usar un sistema de secuenciación con dos
pigmentos, como se ha descrito en el Ejemplo 1, para resolver
productos de la reacción de secuenciación que migran juntos
producidos a partir de los conjuntos de cebadores 1 y 2, y para
resolver productos de la reacción de secuenciación que migran juntos
producidos a partir de los conjuntos de cebadores 3 y 4, mientras
que los productos de la extensión a partir de 1 y 2 se resolverán
por peso molecular a partir de los productos de extensión de los
conjuntos de cebadores 3 y 4. En este ejemplo se usan los siguientes
cebadores:
Conjunto de cebadores
1
[IRD 700 marcado] 5' GTA GGT AGA GTG AAA CCC
GG
(que hibrida con una primera cadena del genoma de
BVDV en las posiciones 6941-6961)
[Sin marcar] 5' CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC
(que hibrida con la cadena complementaria del
genoma de BVDV en las posiciones 7255-7245)
El conjunto de cebadores 1 amplifica una región
de 314 pares de bases, es decir de la posición 6941 a la posición
7255.
Conjunto de cebadores
2
[IRD 800 marcado] 5'AGG CTA GCC ATG CCC TTA
GT
(que hibrida con el genoma de BVDV en las
posiciones 99-118)
(Sin marcar] 5' TCT GCA GCA CCC TAT CAG G
(que hibrida con la cadena complementaria del
genoma de BVDV en las posiciones 7255-7245)
El conjunto de cebadores 2 amplifica una región
de 243 pares de bases, es decir de la posición 99 a la posición
342.
Conjunto de cebadores de cola
3
[IRD 700 marcado] 5'(dG)_{300} GCA GAT
TTT GAA GAA AGA CA
(que hibrida con el genoma de BVDV en las
posiciones 4937-4960)
[Sin marcar] 5'(dG)_{300}TTG GTG TGT GTA
AGC CCA
(que hibrida con la cadena complementaria del
genoma de BVDV en las posiciones 5591-5609)
Conjunto de cebadores de cola
4
[IRD 800 marcado]
5'(dG)_{300}-ACG TGG ACG AGG GCA TGC CC
(que hibrida con el genoma de BVDV en las
posiciones 234-253)
[Sin marcar] 5'(dG)_{300}TGT GCC ATG TAC
AGC AGA GA
(que hibrida con la cadena complementaria del
genoma de BVDV en las posiciones 365-384)
El análisis genómico se puede llevar a cabo
usando procedimientos conocidos de acuerdo con los procedimientos
similares del ejemplo 1 o por procedimientos alternativos a esos
procedimientos.
Claims (17)
1. Un procedimiento para secuenciar un ácido
nucleico que comprende:
a. proporcionar en una mezcla de reacción una
primera y una segunda secuencia de ácidos nucleicos diana;
b. proporcionar en la mezcla de reacción un
primer y un segundo cebador de secuenciación marcado que pueden
hibridar, respectivamente, con la primera y la segunda secuencias de
ácido nucleico diana, siendo el segundo cebador de secuenciación al
menos tan largo como la longitud total del primer cebador de
secuenciación más la longitud de la primera secuencia diana;
c. proporcionar en la mezcla de reacción una ADN
polimerasa, desoxirribonucleósidos, un desoxirribonucleótido
terminador de cadena y condiciones que permitan que se produzca la
duplicación de la primera y la segunda secuencia diana por la acción
de la polimerasa mediante extensión a partir de los primeros y
segundos cebadores de secuenciación, respectivamente, donde la
incorporación periódica del nucleótido terminador de cadena por la
polimerasa detiene la polimerización y se produce una mezcla de
productos de la extensión de los cebadores de varias longitudes, en
los que cada uno de los productos de la extensión de los cebadores
de la mezcla que comienza con el segundo cebador de secuenciación es
más largo que los productos de la extensión de los cebadores en la
mezcla que comienzan con el primer cebador de secuenciación; y,
d. detectar las longitudes de los productos de la
extensión del cebador en la mezcla.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que
además comprende la etapa de amplificar la primera y la segunda
secuencia de ácido nucleico diana usando una reacción de
amplificación.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el
que la reacción de amplificación es una reacción en cadena de la
polimerasa.
4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el
que la reacción de amplificación comprende:
a. proporcionar en la mezcla de reacción una
primera y una segunda región de ácido nucleico bicatenario para
amplificar, comprendiendo cada una cadenas complementarias con
extremos 3' opuestos que definen la región que se va a
amplificar;
b. proporcionar en la mezcla de reacción un
primer par de cebadores de amplificación, en el que un miembro del
primer par de cebadores de amplificación puede hibridar con cada uno
de los extremos 3' de las cadenas complementarias de la primera
región que se va a amplificar, comprendiendo la primera región que
se va a amplificar la primera secuencia de ácido nucleico diana;
c. proporcionar en la mezcla de reacción un
segundo par de cebadores de amplificación, en el que un miembro del
segundo par de cebadores de amplificación puede hibridar con cada
uno de los extremos 3' de las cadenas complementarias de la segunda
región que se va a amplificar, comprendiendo la segunda región que
se va a amplificar la segunda secuencia de ácido nucleico diana;
d. proporcionar en la mezcla de reacción una ADN
polimerasa, desoxirribonucleósidos trifosfatos y condiciones que
permitan que se produzca la duplicación por parte de la ADN
polimerasa de la primera y la segunda región que se va a amplificar
mediante la extensión a partir del primer y segundo pares de
cebadores de amplificación, respectivamente;
e. amplificar las regiones de ácido nucleico
mediante ciclos de la mezcla de reacción entre una primera
temperatura a la que se funden las cadenas complementarias de las
regiones que se van a amplificar, y una segunda temperatura a la que
los cebadores de amplificación hibridan con los extremos 3' de las
cadenas complementarias de las regiones que se van a amplificar y a
la que la polimerasa cataliza la duplicación de la primera y la
segunda región que se van a amplificar mediante extensión a partir
del primer y el segundo par de cebadores de amplificación,
respectivamente.
5.El procedimiento de la reivindicación 4, que
además comprende una reacción de secuenciación por ciclos en la que
un miembro del primer y el segundo par de cebadores de amplificación
es, respectivamente, como los primeros y segundos cebadores de
secuenciación marcados.
6. El procedimiento de la reivindicación 4, que
además comprende la etapa de extender una secuencia durante la
amplificación, en la que un miembro del primer par de cebadores de
amplificación comprende secuencias que pueden hibridar, y secuencias
adicionales que no pueden hibridar, con el extremo 3' de una de las
cadenas complementarias de la primera región que se va a
amplificar.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, que
además comprende la etapa de separación de las secuencias en la
mezcla según su longitud, mediante electroforesis en gel.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la primera y la segunda secuencia de ácido nucleico diana se
encuentran presentes en diferentes moléculas de ácido nucleico.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la mezcla de reacción además se proporciona con:
a. una secuencia adicional de ácido nucleico
diana; y
b. un cebador adicional de secuenciación marcado
que puede hibridar con la secuencia diana adicional, siendo el
cebador adicional de secuenciación al menos tan largo como la
secuencia más larga en la mezcla de productos de la extensión del
cebador.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que al menos uno de los cebadores de secuenciación es un cebador
de secuenciación de cola que comprende una porción que no es
homóloga a las secuencias de ácido nucleico diana.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que las porciones no homólogas del cebador de secuenciación de
cola están en 5' a las regiones del cebador de secuenciación de cola
que pueden hibridar con las secuencias diana.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que en la mezcla de reacción se proporciona un terminador de la
secuenciación para limitar la longitud máxima de los productos de
extensión del cebador de una de dichas secuencias de ácido nucleico
diana.
13. Un procedimiento de extensión de una
secuencia durante la amplificación, que comprende:
a. proporcionar en una mezcla de reacción una
región de ácido nucleico bicatenaria para amplificar, con una
primera y una segunda cadenas complementarias, estando definida la
región que se va a amplificar por un extremo 3' en cada una de la
primera y la segunda cadena complementaria;
b. proporcionar en la mezcla de reacción un
primer cebador de amplificación con secuencias complementarias al
extremo 3' de la primera cadena complementaria y con secuencias
adicionales que no son complementarias al extremo 3' de la primera
cadena complementaria;
c. proporcionar en la mezcla de reacción un
segundo cebador de amplificación que tiene secuencias
complementarias al extremo 3' de la segunda cadena de la secuencia
diana;
d. proporcionar en la mezcla de reacción una ADN
polimerasa, desoxirribonucleósido trifosfatos y condiciones
adecuadas para que la polimerasa catalice la extensión de los
cebadores de amplificación;
e. amplificar y extender la región que se va a
amplificar mediante ciclos de la mezcla de reacción entre una
primera temperatura a la que se funden las cadenas complementarias
de la secuencia de ácido nucleico diana y una segunda temperatura a
la que los cebadores de amplificación hibridan con los extremos 3'
de las cadenas complementarias y la polimerasa cataliza la extensión
a partir de los cebadores de amplificación.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que la región que se va a amplificar además se amplifica y
extiende proporcionando un tercer cebador de amplificación con las
secuencias complementarias a las secuencias adicionales en el primer
cebador de amplificación, donde además el tercer cebador de
amplificación comprende secuencias suplementarias que no son
complementarias al primer cebador de amplificación o a la región que
se va a amplificar.
15. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que las secuencias adicionales del primer cebador de
amplificación están en 5' a las secuencias del primer cebador de
amplificación que son complementarias al diana.
16. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que las secuencias suplementarias del tercer cebador de
amplificación están en 5' a las secuencias del tercer cebador de
amplificación que son complementarias a las secuencias adicionales
en el segundo cebador de amplificación.
17. Un procedimiento de secuenciación de un ácido
nucleico que comprende:
a. proporcionar en una mezcla de reacción una
primera y una segunda secuencia de ácidos nucleicos diana;
b. proporcionar en la mezcla de reacción un
primer y un segundo cebador de secuenciación marcados que pueden
hibridar, respectivamente, con la primera y la segunda secuencias de
ácido nucleico diana, teniendo el segundo cebador de secuenciación
un peso molecular aparente en la electroforesis en gel al menos tan
grande como el peso molecular aparente del primer cebador de
secuenciación cuando el primer cebador de secuenciación se extiende
para comprender la primera secuencia diana;
c. proporcionar en la mezcla de reacción una ADN
polimerasa, desoxirribonucleósidos, un desoxirribonucleótido
terminador de cadena y condiciones que permitan que se produzca la
duplicación de la primera y la segunda secuencias diana por la
acción de la polimerasa mediante extensión a partir de los primeros
y segundos cebadores de secuenciación, respectivamente, donde la
incorporación periódica del nucleótido terminador de cadena por la
polimerasa detiene la polimerización y se produce una mezcla de
productos de la extensión de los cebadores de varias longitudes, en
los que cada uno de los productos de la extensión de los cebadores
de la mezcla que comienza con el segundo cebador de secuenciación
tiene un peso molecular aparente en la electroforesis en gel al
menos tan grande como el peso molecular aparente de los productos de
extensión del cebador en la mezcla que comienzan con el primer
cebador de secuenciación; y,
d. detectar los pesos moleculares aparentes de
los productos de la extensión del cebador en la mezcla.
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