ES2217763T3

ES2217763T3 - Metodo para el aislamiento de adn plasmidico ccc.

Info

Publication number: ES2217763T3
Application number: ES99926364T
Authority: ES
Inventors: Torsten Schmidt; Karl Friehs; Erwin Flaschel; Martin Schleef
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 1998-05-25
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2019-05-21
Also published as: US6664078B1; WO1999061633A3; EP1144656B1; EP1144656A2; AU753138B2; CA2329246A1; DE69916892T2; DE69916892D1; AU4365899A; DK1144656T3; JP2002516113A; PT1144656E; ATE265539T1; WO1999061633A2

Abstract

Un método para la producción de biomasa para el aislamiento de ADN plasmídico ccc que comprende: (a) cultivar un transformante bacteriano en un bioreactor que contiene un medio de carga exento de antibióticos que comprende (aa) una fuente de carbono; (ab) una mezcla de sales inorgánicas; (ac) una fuente de nitrógeno; en condiciones de cultivo por cargas; (b) alimentar en condiciones de realimentación a dicho cultivo de (a) al final de la fase de carga, después de aumentar el oxígeno disuelto por encima de un valor de referencia umbral, una porción de un medio de alimentación que comprende: (ba) una fuente de carbono; y (bb) una sal de magnesio; y (c) permitir al transformante bacteriano metabolizar dicho medio de alimentación.

Description

Método para el aislamiento de ADN plasmídico ccc.

La presente invención se refiere a la producción de biomasa para el aislamiento de ADN plasmídico ccc que comprende cultivar un transformante bacteriano en un bioreactor que contiene un medio de carga exento de antibióticos en condiciones por cargas y, al final de la fase de carga, alimentar en condiciones de realimentación una porción de un medio de alimentación después del aumento del OD por encima de un valor de referencia umbral. Dicho medio de alimentación comprende además una fuente de carbono y de nitrógeno y una sal de magnesio, preferiblemente a concentraciones por encima de 20 mM. Preferiblemente, el transformante bacteriano se recoge después del final del cultivo y se congela o liofiliza. Se prefiere también aislar, opcionalmente de forma directa, el ADN plasmídico ccc después de recoger las bacterias.

Se citan diversos documentos a lo largo del texto de esta memoria. Cada uno de los documentos citados en la presente memoria (incluyendo cualquier especificación, instrucción, etc. del fabricante) se incorpora a la presente memoria como referencia; sin embargo, no se admite que ningún documento citado sea realmente técnica anterior de la presente invención.

Con la aparición y la progresión de la tecnología del ADN recombinante en una variedad de campos tales como la producción de productos alimentarios y la terapia médica, ha aumentado constantemente el deseo de grandes cantidades de ADN altamente puro. Los métodos tradicionales de purificación de ADN genómico o plasmídico (véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", CSH Press, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor, Nueva York) requieren habitualmente una metodología sofisticada si el ADN ha de estar exento de ARN y de otros compuestos orgánicos contaminantes. En particular, los métodos para obtener ADN plasmídico ccc en forma pura padecen normalmente la desventaja de que tienen que separarse del producto deseado otras topologías de plásmido también producidas. Por ejemplo, Lahijani et al., Human Gene Therapy 7 (1996), 1971-1980, han reseñado que pueden obtenerse altos rendimientos de plásmidos derivados de pBR322 pretendidos para terapia génica humana cuando se emplean plásmidos que comprenden una mutación puntual sensible a la temperatura que afecta a la regulación negativa de la replicación del origen de replicación ColE1. Utilizando este proceso, se reseñó un rendimiento de 2,2 g de ADN plasmídico a partir de una fermentación por cargas alimentada de 10 l. Sin embargo, los transformantes bacterianos se hicieron crecer en presencia del antibiótico canamicina, que los haría inadecuados para registro y uso posterior en seres humanos. Otros enfoques han intentado evitar el uso de antibióticos; véase, por ejemplo, Chen et al., J. Industrial Microbiology and Biotechnology 18 (1997), 43-48. En este artículo, se da a conocer una fermentación por cargas alimentada automatizada con controles de realimentación basados en el oxígeno disuelto y el pH para la producción de ADN plasmídico superenrrollado. Se sugiere que este ADN es útil para vacunas de ADN. Sin embargo, los resultados reseñados, por ejemplo en la Figura 4, no apoyan la idoneidad sugerida del ADN plasmídico con fines de vacunación. Esto es debido al hecho de que además del ADN plasmídico ccc, se produce una variedad de otras formas plasmídicas en estas condiciones. Además, este método conduce a altas contaminaciones con ADN genómico y, comparativamente, pueden obtenerse sólo cantidades pequeñas de plásmido.

En consecuencia, el ADN plasmídico ccc producido mediante los métodos de la técnica anterior es inadecuado para una variedad de fines tales como fines médicos debido a la heterogeneidad del producto obtenido y/o debido al empleo de antibióticos en el proceso de producción. El problema técnico subyacente de la presente invención era por lo tanto proporcionar un método que supere estas dificultades de la técnica anterior y permita la producción de ADN ccc sin la producción concomitante de otras formas plasmídicas y que sea, además, adecuado con fines médicos. La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por tanto, la presente invención se refiere a un método para la producción de biomasa para el aislamiento de ADN plasmídico ccc que comprende

(a): cultivar un transformante bacteriano en un bioreactor que contiene un medio de carga exento de antibióticos que comprende:

: (aa) una fuente de carbono;

: (ab) una mezcla de sales inorgánicas;

: (ac) una fuente de nitrógeno;

: en condiciones de cultivo por cargas;

(b): alimentar en condiciones de realimentación a dicho cultivo de (a) al final de la fase de carga, después de aumentar el OD por encima de un valor de referencia umbral, una porción de un medio de alimentación que comprende:

: (ba) una fuente de carbono; y

: (bb) una sal de magnesio; y

(c): permitir al transformante bacteriano metabolizar dicho medio de alimentación.

El término "biomasa", como se utiliza en el contexto de la presente invención, se refiere a cualquier material biológico que es o surge de células u organismos que son capaces de reproducción.

La expresión "ADN plasmídico ccc" designa una isoforma de plásmido que es un plásmido circular que está típica pero no necesariamente superenrollado negativamente respecto a una molécula relajada. Esto da como resultado una conformación más compacta de la molécula, que se describe como un círculo cerrado covalentemente superenrollado del ADN plasmídico. En células de E. coli, dos enzimas regulan el superenrrollamiento del ADN. La girasa introduce vueltas negativas de superhélice en la molécula, mientras que la topoisomerasa I relaja el ADN introduciendo rupturas monocatenarias. Según el método de la invención, lo más preferido es producir el ADN plasmídico ccc en forma monomérica. Es más, el método de la invención proporciona este tipo particularmente deseado de plásmido habitualmente en una cantidad de más de un 90% de la producción de plásmido total. Es también útil, aunque menos preferido, la producción de ADN plasmídico ccc dimérico.

La expresión "medio de carga" designa el medio utilizado en cultivo por cargas, concretamente en el cultivo discontinuo de transformantes bacterianos u otros microorganismos. Este cultivo discontinuo se caracteriza por una sola inoculación en medio reciente (medio de carga) al inicio del cultivo hasta que se agotan los nutrientes y sustratos.

La expresión "condiciones de realimentación" se refiere al suplemento de concentrado de medio durante el cultivo por cargas alimentado dependiendo de parámetros de cultivo como por ejemplo OD, pH, etc., que están correlacionados con el crecimiento del microorganismo.

La expresión "valor de referencia umbral" en el contexto de la presente invención se pretende que signifique un valor definido para un parámetro que se monitoriza durante el cultivo por cargas alimentado. En caso de sobrepasar o no alcanzar ese valor, una señal de monitorización inicia la respuesta en la regulación del cultivo. El experto en la técnica está en disposición de determinar dichos valores definidos basándose en su conocimiento ordinario y en las enseñanzas de esta invención; véase por ejemplo el

\hbox{ejemplo 1.}

El término "OD" (concentración de oxígeno disuelto) designa en la presente memoria la cantidad de oxígeno en un líquido en porcentaje de la concentración de saturación.

En las condiciones por cargas alimentadas anteriormente definidas, la concentración de oxígeno disuelto (OD) aumenta durante el cultivo de transformantes bacterianos después del consumo de nutrientes tales como los contenidos en el medio de alimentación. Por lo tanto, la invención se refiere en una realización preferida a un método en el que la alimentación de un cultivo transformante bacteriano comprende repetidos ciclos de alimentación después de cada aumento del OD por encima de un valor de referencia umbral. Es bien sabido por el experto en la técnica que la alimentación puede controlarse y/o medirse mediante otros parámetros de control, como pH del medio, velocidad de crecimiento específico de transformantes bacterianos, coeficientes de respiración u otros. Sin embargo, todos estos parámetros están interrelacionados y son indicativos del OD. Por lo tanto, independientemente de cuál parámetro se utilice realmente como sistema de lectura, permite una conclusión directa (o indirecta) sobre el valor del OD. En consecuencia, la medida de cualquiera de dichos parámetros está cubierta por la invención siempre que permita una conclusión con respecto al aumento del OD por encima de un valor de referencia umbral. La expresión "permitir al transformante bacteriano metabolizar dicho medio de alimentación" se refiere a la metabolización parcial o completa de dicho medio de alimentación y preferiblemente la metabolización esencialmente completa de dicho medio de alimentación.

Según la presente invención, se ha encontrado que el método aquí dado a conocer conduce a la producción de altas concentraciones de plásmido y a plásmidos con una homogeneidad de ADN típicamente de más de 90% de monómeros ccc. El resultado es realmente sorprendente, puesto que los monómeros ccc de la alta homogeneidad indicada se obtienen en ausencia de presión de selección por antibióticos. El experto en la técnica puede emplear el método aquí descrito para la producción de ADN ccc en un amplio intervalo de tipos o tamaños de plásmidos. El método de la invención permite además el aislamiento de una mayor cantidad del plásmido deseado a partir de cultivos bacterianos de lo que era posible con métodos de la técnica anterior. Esto conduce también a una significativa reducción de costes de los procesos de fermentación, puesto que pueden emplearse fermentadores más pequeños en comparación con los procesos de la técnica anterior si se ha de generar la misma cantidad de plásmido.

Una ventaja significativa adicional del método de la presente invención para la producción de biomasa para el aislamiento de ADN plasmídico ccc se refiere al hecho de que los medios están desprovistos de antibióticos. El ADN ccc obtenido está por tanto definitivamente exento de antibióticos y puede emplearse, sin elaborados esquemas de purificación adicionales que consumen tiempo y dinero, en terapia médica cuando las contaminaciones antibióticas han de evitarse.

En el método de la presente invención, lo más preferido es emplear medios de carga o alimentación desprovistos de extracto de levadura u otras fuentes de aminoácidos complejos derivadas de fuentes naturales. Esto es debido a que el cultivo en dichos medios totalmente sintéticos no tiene el peligro de contaminación relacionada con la fuente y tiene la ventaja de una mayor reproducibilidad. Otra opción preferida sería utilizar medios semisintéticos que comprenden, por ejemplo, extractos de levadura, extractos de plantas, suplementos de peptona y otros. Estos medios sintéticos o semisintéticos pueden emplearse en una o más etapas del cultivo de los transformantes. Esto incluye también la etapa de precultivo indicada a continuación. Se idea también en la presente invención cultivar en/alimentar diferentes tipos de medio en diferentes etapas de cultivo. Los diferentes medios pueden alimentarse también cuando se emplean ciclos de alimentación repetidos como se discute a continuación en la presente memoria. Lo más preferido es que estos medios sean esterilizables en autoclave. Las sales de magnesio deberían esterilizarse en autoclave separadamente.

Como se ha indicado anteriormente, en una realización preferida del método de la invención la etapa (b) comprende ciclos de alimentación repetidos después de cada aumento del OD por encima del valor de referencia umbral. Esta realización de la invención es particularmente ventajosa, puesto que permite la producción de altos rendimientos de biomasa que permiten el aislamiento de altas cantidades de ADN plasmídico ccc.

El transformante bacteriano utilizado en el método de la invención puede ser una bacteria gram-negativa o una bacteria gram-positiva. Son ejemplos de bacterias gram-positivas bacterias del género Bacillus, por ejemplo Bacillus subtilis. En una realización preferida, el transformante bacteriano es una célula de E. coli.

Aunque el experto en la técnica es capaz de desarrollar o preparar una fuente de carbono adecuada, se utiliza preferiblemente glicerol como fuente de carbono en el método de la presente invención.

Puede emplearse una variedad de fuentes de nitrógeno bien conocidas y establecidas en el método de la invención. En una realización preferida adicional de la presente invención, la fuente de nitrógeno empleada es NH_{3}.

En una realización preferida adicional del método de la invención, la fuente de carbono en el medio de carga está en una concentración (final inicial) \leq 100 g/l.

En otra realización preferida adicional del método de la invención, la fuente de carbono en el medio de carga está en una concentración (final inicial) \leq 1000 g/l.

En aún otra realización preferida del método de la invención, la fuente de nitrógeno está en una concentración (final inicial) \leq 30%.

En una realización preferida adicional del método de la invención, la mezcla de sales inorgánicas comprende Na_{2}HPO_{4} \leq 6 g/l, KH_{2}PO_{4} \leq 3 g/l, NaCl \leq 0,5 g/l y ácido cítrico\cdotH_{2}O \leq 1,5g/l. Esto designa la concentración final inicial en el medio, concretamente la concentración final que está presente en el medio al inicio de la fermentación.

Lo más preferiblemente, dicha mezcla de sales inorgánicas comprende también una sal de magnesio, preferiblemente MgSO_{4}, por ejemplo acomplejada con agua. En este caso, se prefiere una concentración inicial menor de o de aproximadamente 0,3 g/l. Se desea también esterilizar por autoclave separadamente la sal de magnesio.

En otra realización preferida del método de la invención, en la etapa (b), la concentración de sal de magnesio está en el intervalo de 5-100 mM. Esto designa de nuevo la concentración final inicial en el medio.

En una realización particularmente preferida del método de la invención, en la etapa (b), la concentración de sal de magnesio es de 80 mM. Según la invención, se ha encontrado sorprendentemente que en particular concentraciones bastante altas de sal de magnesio tales como 80 mM, preferiblemente de MgSO_{4}, proporcionan excelentes resultados con respecto a la homogeneidad de los monómeros de plásmido ccc.

Las sales de magnesio que pueden utilizarse según la presente invención comprenden MgCl_{2}, Mg(NO_{3})_{2}, MgSO_{4} u otras. En una realización preferida del método de la invención, la sal de magnesio es MgSO_{4}.

En otra realización preferida de la invención, se añade una solución de elementos traza en las etapas (a) y/o (b). La adición de elementos traza puede potenciar adicionalmente el rendimiento de plásmido.

En otra realización del método de la invención, la solución de elementos traza comprende cada uno de los siguientes compuestos:

FeCl_{3}\cdot6 H_{2}O en una concentración final preferiblemente \leq 54,0 mg/l

ZnSO_{4}\cdot7 H_{2}O en una concentración final preferiblemente \leq 13,8 mg/l

MnSO_{4}\cdotH_{2}O en una concentración final preferiblemente \leq 18,5 mg/l

CoSO_{4}\cdot7 H_{2}O en una concentración final preferiblemente \leq 5,6 mg/l

CuCl_{2} en una concentración final preferiblemente \leq 1,7 mg/l

H_{3}BO_{3} en una concentración final preferiblemente \leq 10 mg/l

Na_{2}MoO_{4}\cdot2 H_{2}O en una concentración final preferiblemente \leq 25 mg/l; y

ácido cítrico en una concentración final preferiblemente \leq 50 mg/l.

El medio de crecimiento bacteriano o procariótico puede suplementarse ventajosamente con una fuente de aminoácidos. Por lo tanto, en una realización preferida adicional del método de la invención, el medio de carga comprende una fuente de aminoácidos.

En otra realización preferida del método de la invención, el medio de alimentación comprende una fuente de aminoácidos. Las fuentes de aminoácidos son bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden comprender extractos de levadura, extractos de planta, suplementos de peptona y otros (véase Sambrook et al., loc. cit.)

En una realización adicional del método de la invención, el cultivo del transformante bacteriano se lleva a cabo a un intervalo de temperatura de 30ºC a 42ºC.

En una realización particularmente preferida del método de la invención, el intervalo de temperatura es de aproximadamente 35ºC a 38ºC.

Para compensar los requisitos auxotróficos de los transformantes bacterianos, se prefiere que en el método de la invención el medio de carga comprenda un suplemento específico de la cepa hospedadora bacteriana. Se ha descrito una variedad de suplementos específicos para diferentes cepas hospedadoras bacterianas y son bien conocidos en la técnica, por ejemplo tiamina para transformantes bacterianos que portan una deficiencia de tiamina.

En una realización preferida adicional del método de la invención, las células hospedadoras se recogen después de la etapa (c) de dichos cultivos. La recogida de los transformantes bacterianos es uno de los métodos convencionales en técnicas de fermentación y biología molecular. La recogida de los transformantes puede comprender filtración, centrifugación o métodos similares que son bien conocidos en la técnica.

En aún otra realización preferida del método de la invención, las células hospedadoras se someten, después de la etapa (c), a una etapa de lavado antes o después de la recogida. Estas etapas de lavado pueden llevarse a cabo en una solución que no afecte a la integridad de las células pero que elimine los compuestos de cultivo de la célula.

En otra realización preferida del método de la invención, una etapa adicional comprende la congelación o liofilización de los transformantes después de la etapa (c) o después de las etapas identificadas anteriormente en la presente memoria en cualquiera de las realizaciones preferidas adicionales. La realización es particularmente útil si no se desea un aislamiento inmediato del plásmido ccc. Las células congeladas o liofilizadas pueden transportarse o almacenarse convenientemente hasta su uso posterior.

En aún otra realización preferida del método de la invención, una etapa adicional comprende el aislamiento de ADN plasmídico ccc.

Existen múltiples modos de aislar ADN ccc que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen métodos de centrifugación en gradiente de CsCl y purificación por cromatografía (véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", CSH Press, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Como se afirmó anteriormente en la presente memoria, puede obtenerse ADN plasmídico aislado que consiste en más de 90% de monómeros ccc. El experto en la técnica, cuando emplea las enseñanzas de la presente invención, es capaz de obtener ADN ccc en grandes cantidades que satisface los criterios de calidad del ADN plasmídico para terapia génica y los enfoques de vacunación con ácido nucleico (véase Schorr et al., DNA Vaccines 772 (1995), 271-273) sin etapas de purificación exhaustiva posteriores para eliminar, por ejemplo, antibióticos. Por tanto, es posible emplear el ADN ccc de la invención obtenido para vacunaciones con ácidos nucleicos como se describe en la técnica anterior, por ejemplo en Davis et al., Vaccine 12 (1994), 1503-1509; o para estrategias de terapia génica como las que se dan a conocer en Cao et al., Human Gene Therapy 6 (1995), 1497-1501.

Además, en otra realización preferida, la invención se refiere a un método que comprende además la etapa de (a') precultivar el transformante bacteriano en un medio exento de antibióticos.

En una realización particularmente preferida del método de la invención, el transformante bacteriano está en fase de crecimiento exponencial después del final de dicho precultivo. La fase de crecimiento exponencial puede evaluarse mediante tecnología convencional, por ejemplo determinando la densidad óptica del caldo de cultivo.

Las figuras muestran

Figura 1: Curso temporal de oxígeno disuelto, velocidad de agitación y medio de alimentación monitorizados en un bioreactor durante un cultivo por cargas alimentado controlado mediante realimentación de OD. Se muestra el cultivo del plásmido pUK21CMV\beta en DH5\alpha de E. coli en un bioreactor de 30 l. Por encima de un valor de referencia umbral del 30%, se controló el OD aumentando la velocidad de agitación. Por debajo de un valor de referencia umbral del 45%, se controló el OD alimentando una solución nutriente al bioreactor.

Figura 2: Peso de célula seca (PCS) y concentración de plásmido durante el cultivo por cargas alimentado de pUK21CMB\beta en DH5\alpha de E. coli en medio de glicerol-extracto de levadura semidefinido. El transformante bacteriano se cultivó en un bioreactor de 30 l.

Figura 3: Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de ADN plasmídico (cada uno aproximadamente a 250 ng) a diferentes tiempos de cultivo (10-40 h) de un cultivo de 30 litros. Se aisló el ADN plasmídico a partir de volúmenes de cultivo definidos utilizando kits Miniprep QIAGEN.

Figura 4: Peso de célula seca y concentración de plásmido durante un cultivo por cargas alimentado de DH5\alpha de E. coli que contiene pUK21CMV\beta utilizando un medio sintético de glicerol. La fermentación se llevó a cabo en un bioreactor de 5 l.

Figura 5: Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de ADN plasmídico (cada uno aproximadamente a 250 ng) a diferentes tiempos de cultivo (10-44 h) de un cultivo de 7 litros. Se aisló el ADN plasmídico a partir de volúmenes de cultivo definidos utilizando kits Miniprep QIAGEN.

Figura 6: Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de muestras de ADN plasmídico pUT 649 (200 ng/4 diferentes aislamientos) a 41 h de tiempo de cultivo, cuando se recogieron las células. Se aisló ADN plasmídico independientemente utilizando kits Midiprep QIAGEN (Tip-100).

Figura 7: Biomasa final de diversas condiciones de cultivo en medio de extracto de levadura (EL). Los cultivos se realizaron como se describe en el ejemplo 1 o se describe por Chen et al., J. Industrial and Biotechnology 18 (1997), 43-48 o Lahijani et al., Human Gene Therapy 7 (1996), 1971-1980.

Figura 8: Concentración final de plásmido de diversos cultivos en medio de extracto de levadura (EL). El cultivo se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1 y se comparó con cultivos como los descritos por Chen et al., J. Industrial Microbiology and Biotechnology 18 (1997), 43-48 o Lahijani et al., Human Gene Therapy 7 (1996), 1971-1980.

Figura 9: Rendimiento de plásmido por biomasa de diversos cultivos en medio de extracto de levadura (EL) en la recogida de células. El cultivo se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1 y se comparó con cultivos como los descritos por Chen et al., J. Industrial Microbiology and Biotechnology 18 (1997), 43-48 o Lahijani et al., Human Gene Therapy 7 (1996), 1971-1980.

Figura 10: Mapa de restricción del plásmido pUK21CMV\beta

Figura 11: Secuencia de ADN del plásmido pUK21CMV\beta (SEC ID Nº 2)

Figura 12: Mapa de restricción del plásmido pUT 649.

Figura 13: Secuencia de ADN del plásmido pUT 649 (SEC ID Nº 1)

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1 Producción de alta calidad y en alta cantidad de un plásmido ccc de 7,5 kpb en medio de glicerol/leva- dura

Se ha llevado a cabo el método para la producción de biomasa para el aislamiento de ADN plasmídico ccc mediante un cultivo por cargas alimentado controlado mediante realimentación de DH5\alpha de E. coli que contiene el plásmido pUK21CMV\beta (7612 pb) (Figuras 10, 11) en un bioreactor de 30 l (LAB 30 L, MBR, Suiza) con un volumen de trabajo de 23 l.

El medio de carga semidefinido (15 l) consistía en glicerol 10 g/l, extracto de levadura 5,0 g/l, Na_{2}HPO_{4} 6,0 g/l, KH_{2}HPO_{4} 3,0 g/l, NaCl 0,5 g/l, ácido cítrico 1,5 g/l, MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O 0,3 g/l, clorhidrato de tiamina 5 mg/l y solución de elementos traza 10 ml/l. El clorhidrato de tiamina y la solución madre de elementos traza (FeCl_{3}\cdotH_{2}O 5,40 g/l, ZnSO_{4}\cdot7 H_{2}O 1,38 g/l, MnSO_{4}\cdotH_{2}O 1,85 g/l, CoSO_{4}\cdot7 H_{2}O 0,56 g/l, CuCl_{2} 0,17 g/l, H_{3}BO_{3} 1,0 g/l, Na_{2}MoO_{4}\cdot2 H_{2}O 2,5 g/l y ácido cítrico 5,0 g/l) se esterilizaron separadamente. Antes de la esterilización del bioreactor (25 min a 121ºC), se ajustó el pH del medio a 6,7 utilizando NaOH.

El cultivo se llevó a cabo a 37ºC y 50 kPa. Se mantuvo la aireación a 30 l/min y el pH se controló con H_{3}PO_{4} al 10% y/o NH_{4}OH al 25%. Se utilizó como reactivo antiespumante Pluronic® PE-8100 (BASF). La velocidad de agitación mínima fue de 100 rpm.

Se utilizó una solución madre congelada en glicerol de DH5\alpha de E. coli que incluía pUK21CMV\beta para inocular 200 ml de medio de siembra Luria-Bertani (LB) en un matraz agitado de 1000 ml. Se incubó el cultivo a 37ºC durante 8 h en un agitador orbital a 180 rpm. Después de alcanzar una densidad celular de DO_{600} 0,3-0,5, se transfirió una alícuota de 50 ml de este precultivo al bioreactor.

Durante el cultivo, se mantuvo automáticamente el oxígeno disuelto (OD) al 30% de saturación del aire aumentando la velocidad de agitación en un 1% de la velocidad de agitación previa cuando la concentración de oxígeno disuelto bajaba de un valor de referencia umbral del 30%. A concentraciones de OD por encima del 30%, la velocidad de agitación permaneció constante. Cuando el OD alcanzaba un valor de referencia umbral del 45% de saturación del aire, se activaba automáticamente una bomba de nutriente para alimentar una solución concentrada de glicerol 600 g/l, extracto de levadura 90 g/l y MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O 20 g/l al cultivo. El caudal máximo de la bomba de nutriente fue de 50 ml/min. Se interrumpía la alimentación cuando el OD bajaba del 45%. Cada dos horas, se determinó el crecimiento celular midiendo la densidad óptica a 600 nm y el peso de célula seca. Se determinó la concentración de plásmido después de aislar ADN plasmídico a partir de un volumen de cultivo sedimentado definido utilizando kits Miniprep QIAGEN (Tip-20) según las instrucciones del fabricante. Después de la digestión con endonucleasa de restricción EcoRI, se realizó la cuantificación de estas muestras de ADN mediante electroforesis en gel capilar como se describe por Schmidt et al., J. Biotechnol. 49 (1996), 219-229. Para analizar la distribución de forma del plásmido y como control de calidad, se realizó la electroforesis de todas las muestras no digeridas en geles de agarosa al 0,8%.

La Figura 1 describe los niveles de OD, velocidad de agitación y valores de solución de alimentación monitorizados en el bioreactor durante un cultivo por carga alimentado controlado mediante realimentación. Después de 14 h, cuando se agotaron los nutrientes, la concentración de OD aumentó drásticamente y empezó el bucle de alimentación. Durante esta fase por cargas alimentada, la concentración de OD osciló entre el valor de referencia umbral para alimentación (45%) y el valor de referencia umbral para aumentar la velocidad de agitación (30%).

La Figura 2 ilustra la formación de biomasa (peso de célula seca) y ADN plasmídico durante el cultivo. El crecimiento celular ocurrió hasta las 36 h de tiempo de cultivo. Se alcanzó una biomasa final de 48 g/l de peso de célula seca (DO_{600}= 140). La concentración de plásmido producida en este reactor fue de aproximadamente 200 mg/l, que corresponde a 4,6 g de ADN plasmídico. La masa de plásmido por peso celular fue de aproximadamente 4,2 mg/g. Aunque no se utilizaron antibióticos para selección, la concentración de plásmido aumentó durante todo el cultivo.

La electroforesis en gel de agarosa mostró un producto plasmídico de alta calidad durante todo el cultivo (Figura 3). El ADN plasmídico aislado consistía en más un 90% de moléculas ccc y satisfacía los criterios de calidad del ADN plasmídico para terapia génica y enfoques de vacunación con ácido nucleico (Schorr et al., DNA Vaccines 772 (1995), 271-273).

Ejemplo 2 Producción de alta calidad de ADN plasmídico ccc en medio sintético de glicerol

Se realizó un cultivo por cargas alimentado controlado mediante realimentación de OD de DH5\alpha de E. coli que contenía pUK21CMV\beta (7612 pb; SEC ID Nº 2) en un bioreactor de 7 l (LAB 7 L, MBR, Suiza) con 5,5 l de volumen de trabajo. Se emplearon medios sintéticos de glicerol en esta fermentación.

El medio de carga definido (3,5 l) consistió en glicerol 20 g/l, Na_{2}HPO_{4} 6,0 g/l, KH_{2}HPO_{4} 3,0 g/l, NaCl 0,5 g/l, ácido cítrico 1,5 g/l, MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O 0,3 g/l y solución de elementos traza 10 ml/l que contenía FeCl_{3}\cdot6 H_{2}O 5,40 g/l, ZnSO_{4}\cdot7 H_{2}O 1,38 g/l, MnSO_{4}\cdotH_{2}O 1,85 g/l, CoSO_{4}\cdot7 H_{2}O 0,56 g/l, CuCl_{2} 0,17 g/l, H_{3}BO_{3} 1,0 g/l, Na_{2}MoO_{4}\cdot2 H_{2}O 2,5 g/l y ácido cítrico 5,0 g/l. Se esterilizó separadamente el clorhidrato de tiamina 5 mg/l mediante filtración y se transfirió al bioreactor. Antes de la esterilización del bioreactor (25 min a 121ºC), se ajustó el pH del medio a 6,7. Se llevó a cabo el cultivo a 37ºC y 50 kPa. Se mantuvo la aireación a 10 l/min y el pH se controló con H_{3}PO_{4} al 10% y NH_{4}OH al 25%. El reactivo antiespumante fue Pluronic® PE-8100 (BASF). La velocidad mínima de agitación fue de 150 rpm. Se utilizó una solución madre congelada en glicerol de DH5\alpha de E. coli que contenía pUK21CMV\beta para inocular 55 ml de medio de siembra LB en un matraz agitado de 300 ml. El cultivo se incubó a 37ºC durante 8 h en un agitador orbital a 180 rpm. Después de alcanzar una densidad celular de DO_{600} 0,3-0,5, se transfirieron 50 ml de este precultivo al bioreactor.

Durante el cultivo, se mantuvo automáticamente el oxígeno disuelto (OD) al 30% de saturación del aire aumentando la velocidad de agitación en un 1% de la velocidad de agitación previa cuando la concentración de oxígeno disuelto bajaba de un valor de referencia umbral del 30%. A concentraciones de OD por encima del 30%, la velocidad de agitación permaneció constante. Cuando el OD alcanzaba un valor de referencia umbral del 45% de saturación del aire, se activaba automáticamente una bomba de nutriente para alimentar una solución concentrada de glicerol 1000 g/l y MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O 20 g/l al cultivo. El caudal máximo de la bomba de nutriente fue de 30 ml/min. Se interrumpía la alimentación cuando el OD bajaba del 45%.

Cada dos horas, se determinó el crecimiento celular midiendo la densidad óptica a 600 nm y el peso de célula seca. Se determinó la concentración de plásmido después de aislar ADN plasmídico a partir de un volumen de cultivo sedimentado definido utilizando kits Miniprep QIAGEN (Tip-20) según las instrucciones del fabricante. Después de la digestión con endonucleasa de restricción EcoRI, se realizó la cuantificación de estas muestras de ADN mediante electroforesis en gel capilar como se describe por Schmidt et al., 1996 (Schmidt et al., J. Biotechnol. 49 (1996), 219-229). Para analizar la distribución de forma del plásmido y como control de calidad, se realizó la electroforesis de todas las muestras no digeridas en geles de agarosa al 0,8%.

La Figura 4 describe la formación de biomasa y ADN plasmídico durante el cultivo. El crecimiento celular ocurrió hasta las 40 h de tiempo de cultivo. Se alcanzó una biomasa final de 48 g/l de peso de célula seca (DO_{600}= 145) utilizando un medio sintético. La concentración de plásmido producida fue de aproximadamente 100 mg/l, que corresponde a 550 mg de ADN plasmídico. La masa de plásmido obtenido por peso de célula fue de aproximadamente 2,1 mg/g.

Como se verificó por electroforesis en gel de agarosa, el producto plasmídico se obtuvo en una alta cantidad durante todo el tiempo de cultivo (Figura 5). El ADN plasmídico aislado se obtuvo en forma de momómeros ccc, los dímeros ccc que existían en forma de concatémeros se encontraron en pequeñas cantidades. Las muestras de ADN satisfacían los criterios de calidad del ADN plasmídico para terapia génica y los enfoques de vacunación con ácido nucleico.

Ejemplo 3 Producción de alta calidad de un plásmido para enfoques de terapia génica mediante fermentación salina de alta densidad

Se realizó un cultivo por cargas alimentado realimentado por OD de DH5\alpha de E. coli que contenía pUT 649 (Figuras 12, 13) (4618 pb; SEC ID Nº 1) (el vector pUT 649 se ha descrito en el catálogo Eurogentec 1994 (Eurogentec, Lieja, Bélgica) con el número de catálogo VE-1134-a) utilizando el mismo medio de glicerol-extracto de levadura (medio de carga de 7,5 l) descrito en el ejemplo 1. Se aplicaron condiciones de cultivo similares a las descritas en el ejemplo 1 y la fermentación se realizó en un bioreactor con 10 l de volumen de trabajo (BiOE de BRAUN). La aireación fue de 15 l/min. En la fase de carga, la velocidad de agitación se fijó a 800 rpm. En la fase por cargas alimentada, se aumentó esta velocidad a 100 rpm cuando el OD bajó por debajo del valor de referencia umbral del 30%. Se bombeó el medio de alimentación al bioreactor (caudal 10 ml/min) cuando el OD alcanzó el valor de referencia umbral del 45%.

En un matraz agitado de 1 l, se inocularon 100 ml de medio de carga con 500 \mul de solución madre de glicerol de DH5\alpha de E. coli que contenía pUT649. La incubación se llevó a cabo durante 5 h a 37ºC en un agitador orbital. Se transfirió un inóculo de 1,5 ml de este precultivo al bioreactor.

Después de 41 h de tiempo de cultivo, cuando los transformantes bacterianos alcanzaron la fase estacionaria, la biomasa final proporcionó 60 g/l de peso de célula seca y 230 mg/l de plásmido. Pudo aislarse más de un 90% de ADN plasmídico monómero ccc (Fig. 6).

Ejemplo 4 Comparación entre diferentes condiciones de cultivo por cargas y por cargas alimentado

Se compararon un cultivo por cargas en medio Luria-Bertani (LB) (Sambrook et al., loc. cit.) en un bioreactor de 7 l y un cultivo por cargas alimentado como se describe en el ejemplo 1 y cultivos por cargas alimentados como se dan a conocer en el estado de la técnica. Mientras que Chen et al. (J. Industrial Microbiology and Biotechnology 18 (1997), 43-48) utilizaron un medio de dextrosa-extracto de levadura en la fase de carga y alimentaron un medio de alimentación de glucosa-extracto de levadura, Lahijani et al. (Human Gene Therapy 7 (1996), 1971-1980) realizaron cultivos por cargas y por cargas alimentados en medio de glucosa-extracto de levadura que contenía antibióticos empleando una mutación puntual controlable por la temperatura en el transformante bacteriano.

La Figura 7 muestra la biomasa final cuando las células alcanzaron la fase de crecimiento estacionario. El rendimiento de biomasa en los cultivos por cargas en medio LB o los descritos por Lahijani et al. fue bajo. La alimentación de soluciones nutrientes, como las descritas por Chen et al. o las descritas en la presente invención, condujo a mayores rendimientos de biomasa.

Como se muestra en la Figura 8, en comparación con los cultivos por cargas en medio LB, las concentraciones de plásmido aumentaron por un factor de 35-40 en las fermentaciones por cargas alimentadas utilizando medio de glucosa-extracto de levadura, como se describe por Lahijani et al., o utilizando medio de glicerol-extracto de levadura, como se describe en la presente invención. Sin embargo, los cultivos realimentados como se llevaron a cabo por Chen et al. condujeron a menores concentraciones de plásmido.

Lahijani et al. utilizaron el antibiótico canamicina durante el cultivo y obtuvieron una concentración de plásmido similar a la obtenida con el método de la presente invención utilizando medio de glicerol-extracto de levadura exento de antibióticos. No pudo llevarse a cabo una comparación de biomasa puesto que Lahijani et al. no dan a conocer ninguna figura referente a la biomasa obtenida.

Como se describe en la Figura 9, el cultivo por cargas alimentado con medio de glicerol-extracto de levadura condujo a mayores rendimientos de plásmido por biomasa en comparación con las condiciones por cargas en medio LB. Podían obtenerse mayores rendimientos de plásmido por biomasa mediante el cultivo por cargas en medio de glucosa-extracto de levadura, pero el rendimiento total de plásmido era bajo.

La homogeneidad y pureza del ADN plasmídico aislado fueron mejores en las condiciones de cultivo realizadas según la presente invención (Fig. 3, 5, 6). Lahijani et al. reseñaron que el ADN aislado contenía grandes cantidades de ARN y dímeros concatenados, mientras que Chen et al. obtuvieron grandes cantidades de ADN genómico contaminante. Por tanto, la eliminación de dicho ADN no ccc, ARN o ADN genómico contaminante requiere etapas de procesamiento adicionales, consume tiempo y además reduce los rendimientos del ADN aislado mediante tecnologías de la técnica anterior.

En resumen, el análisis de datos permite la conclusión inequívoca de que el método de la invención es superior al de la técnica anterior con respecto a la pureza del producto deseado, opcional o preferiblemente en combinación con la cantidad de producto final deseado obtenido. El método de la invención es aplicable a otros plásmidos y proporciona rendimientos similares o los mismos resultados ventajosos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Qiagen GmbH

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Max-Volmer-Strasse 4

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Hilden

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PAÍS: DE

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 40724

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo método para el aislamiento de ADN plasmídico ccc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: compatible con PC-IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release n° 1.0, versión n° 1.25 (OEP)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4618 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC N° ID 1:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7612 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC N° ID 2:

26

27

28

29

30

Claims

1. Un método para la producción de biomasa para el aislamiento de ADN plasmídico ccc que comprende:

: (aa) una fuente de carbono;

: (ab) una mezcla de sales inorgánicas;

: (ac) una fuente de nitrógeno;

: en condiciones de cultivo por cargas;

(b): alimentar en condiciones de realimentación a dicho cultivo de (a) al final de la fase de carga, después de aumentar el oxígeno disuelto por encima de un valor de referencia umbral, una porción de un medio de alimentación que comprende:

: (ba) una fuente de carbono; y

: (bb) una sal de magnesio; y

2. El método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende repetidos ciclos de alimentación después de cada aumento del oxígeno disuelto por encima de un valor de referencia umbral.

3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el transformante bacteriano es una célula de E. coli.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se utiliza glicerol como fuente de carbono.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se utiliza NH_{3} como fuente de nitrógeno.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la fuente de carbono en el medio de carga está en una concentración \leq 100 g/l.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la fuente de carbono en el medio de alimentación está en una concentración \leq 1000 g/l.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la fuente de nitrógeno está en una concentración \leq 30%.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la mezcla de sales inorgánicas comprende Na_{2}HPO_{4} \leq 6 g/l, KH_{2}PO_{4} \leq 3 g/l, NaCl \leq 0,5 g/l y ácido cítrico\cdotH_{2}O \leq 1,5 g/l.

10. El método según la reivindicación 9, en el que dicha mezcla de sales inorgánicas comprende también una sal de magnesio.

11. El método según la reivindicación 10, en el que dicha sal de magnesio es MgSO_{4} en una concentración de 0,3 g/l.

12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que, en la etapa (b), la concentración de sal de magnesio está en un intervalo de 5 a 100 mM.

13. El método según la reivindicación 12, en el que, en la etapa (b), la concentración de sal de magnesio es de 80 mM.

14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la sal de magnesio es MgSO_{4}.

15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que se añade una solución de elementos traza en la etapa (a) y/o (b).

16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la solución de elementos traza comprende: FeCl_{3}\cdot6 H_{2}O, ZnSO_{4}\cdot7 H_{2}O, MnSO_{4}\cdotH_{2}O, CoSO_{4}\cdot7 H_{2}O, CuCl_{2}, H_{3}BO_{3}, Na_{2}MoO_{4}\cdot2 H_{2}O y ácido cítrico.

17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el medio de carga comprende una fuente de aminoácidos.

18. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el medio de alimentación comprende una fuente de aminoácidos.

19. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el cultivo del transformante bacteriano se lleva a cabo en un intervalo de temperatura de 30ºC a 42ºC.

20. El método según las reivindicaciones 1 a 19, en el que el intervalo de temperatura es de aproximadamente 35ºC a 38ºC.

21. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el medio de carga comprende un suplemento específico de la cepa hospedadora bacteriana.

22. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células hospedadoras, después de la etapa (c), se recogen de dichos cultivos.

23. El método según la reivindicación 22, en el que las células hospedadoras se someten, después de la etapa (c), a una etapa de lavado antes o después de la recogida.

24. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que una etapa adicional, después de la etapa (c), comprende la congelación o liofilización de las células hospedadoras.

25. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que una etapa adicional, después de la etapa (c) o después de las etapas especificadas en las reivindicaciones 22 a 24, comprende el aislamiento de ADN plasmídico ccc.

26. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende además la etapa de (a') precultivar el transformante bacteriano en un medio exento de antibióticos.

27. El método según la reivindicación 26, en el que el transformante bacteriano está en una fase de crecimiento exponencial después del final de dicho precultivo.

28. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que el medio de carga, el medio de alimentación y/o el medio utilizado para precultivar es un medio sintético o semisintético.