ES2216158T3 - Procedimiento para medir la infecciosidad viral. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para determinar el número de partículas virales infecciosas en una población de partículas virales, que comprende: i) infectar células en una población de células a una proporción de partículas totales respecto al número de células inferior a aproximadamente 100:1 hasta aproximadamente 0, 1:1 para generar células infectadas en el que las células se cultivan después de la infección durante un periodo de tiempo que resulta suficiente para la expresión de un polipéptido expresado por el virus pero insuficiente para que la propagación del virus infectante produzca una infección adicional de células; ii) hacer reaccionar un polipéptido expresado por el virus en las células infectadas con un anticuerpo marcado con un marcador fluorescente, presentando el anticuerpo especificidad para un polipéptido expresado por el virus; y iii) medir la inmunofluorescencia en el producto de la etapa ii) mediante citometría de flujo para determinar el número de células infectadas, determinando así el número de partículas virales infecciosas.

Description

Procedimiento para medir la infecciosidad viral.

Antecedentes de la invención

Un reto particular en la liberación de un gen mediante un vector viral para fines terapéuticos es la preparación y caracterización precisa de las formas clínicas de dosificación. La medición de partículas totales se puede realizar mediante técnicas tales como microscopia electrónica de preparaciones virales o la medición del ADN total mediante densidad óptica a 260 nm de una suspensión viral tratada con dodecil sulfato de sodio (SDS). Sin embargo, la infectividad de una preparación viral, es decir, resulta más arduo medir de forma precisa el número de partículas virales infecciosas en una preparación de virus.

Tradicionalmente, las partículas infecciosas se miden en cultivo mediante el ensayo de unidades formadoras de placas (pfu) que calcula el número de placas virales en función de la dilución. Una alternativa al ensayo pfu es la dosis infectiva en cultivo de tejidos (TCID_{50}), que estima la infectividad en función de la tinción intracelular para un antígeno por inmunofluorescencia directa. Los procedimientos presentan limitaciones, incluyendo un alto grado de variabilidad entre ensayos y están afectados por factores tales como el estadio de replicación viral, las características del vector, y las interacciones entre el virus y la célula.

Más recientemente, se han utilizado ensayos de citometría de flujo o FACS (separador de células activadas por fluorescencia) para medir el número de células infectadas en cultivos celulares infectados a una multiplicidad de infección relativamente elevada. Por ejemplo, Saalmüller y Mettenleiter (J. Virol. Methods 44: 99-108 (1993)) dan a conocer la identificación y cuantificación de células infectadas por mutantes recombinantes del virus de la seudorrabia mediante la reacción de la \beta-galactosidasa intracelular expresada durante la infección con virus recombinantes con un sustrato fluorogénico, seguido de la detección de células positivas en citometría de flujo. Morris et al. (Virology 197(1): 339-48 (1993)) estudiaron el procedimiento de infección productiva y no productiva por AcMNPV recombinante en células cultivadas mediante la inmunotinción de las células para detectar el producto del gen reportero CAT.

La presente invención trata la necesidad de un procedimiento más preciso para cuantificar las partículas virales infecciosas en un población.

Sumario de la invención

Los procedimientos de la presente invención están basados en el inesperado y sorprendente resultado de que el análisis por citometría de flujo de células infectadas a baja proporción de virus respecto a células proporciona una medición más precisa del título devirus infeccioso que los procedimientos tradicionales de titulación.

La invención es un procedimiento para determinar el número de partículas virales infecciosas en una población de partículas virales que comprende:

i) infectar células en una población de células a una proporción de partículas totales respecto a células inferior a aproximadamente 100:1 hasta aproximadamente 0,1:1 para generar células infectadas;

ii) hacer reaccionar un polipéptido expresado por el virus en las células infectadas con un anticuerpo marcado con un marcador fluorescente, presentando el anticuerpo especificidad para un polipéptido expresado por el virus; y

iii) medir la inmunofluorescencia en el producto de la etapa ii) mediante citometría de flujo para determinar el número de células infectadas, determinando así el número de partículas virales infecciosas.

Cuando el virus es un virus recombinante, el polipéptido viral puede estar codificado por un gen exógeno, tal como un gen reportero. En algunas formas de realización de la invención, el gen exógeno es un gen supresor de tumor tal como p53 o retinoblastoma (RB). El virus recombinante puede ser de replicación competente o defectuosa, deficiente o incompetente.

En algunas formas de realización de la invención, el virus es adenovirus. Así, cuando se cultivan las células infectadas después de la infección para permitir la expresión de un polipéptido viral, el polipéptido viral puede ser un polipéptido de adenovirus tal como hexon.

El polipétido viral se hace reaccionar con por lo menos un anticuerpo, aunque el anticuerpo puede ser una mezcla de anticuerpos. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal.

La proporción de partículas totales respecto a células es inferior a aproximadamente 100:1, típicamente inferior a 10:1, preferentemente inferior a 5:1, más preferentemente inferior a 1:1. En algunas formas de realización, la proporción puede ser tan baja como aproximadamente 0,1:1.

Descripción detallada

La presente invención proporciona procedimientos para cuantificar las partículas virales infecciosas en una población de partículas virales. El término "infecciosas" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la capacidad del virus para penetrar en las células y dirigir la síntesis de por lo menos un polipéptido codificado por el virus. No se requiere la capacidad de reproducir el ácido nucleico viral, pero ésta queda incluida por esta definición.

Típicamente, no todas las partículas virales de una preparación son infecciosas. Por ejemplo, las partículas pueden resultar dañadas en la preparación del virus, sin afectar así el número total de partículas pero haciendo decrecer el número de partículas capaces de infectar. Además, las cápsides vacías o la inestabilidad del virus extracelularmente también pueden contribuir al descenso de infectividad. La relación de partículas no infecciosas respecto a partículas infecciosas en preparaciones virales puede variar entre 1:1 hasta más de 100:1. Sin embargo, incluso los virus no infecciosos pueden causar cambios citológicos o daños a las células expuestas. Así, resulta ventajoso disponer de una medición precisa del número de partículas infecciosas en un población a fin de minimizar el número de partículas virales no infecciosas a las que las células se encuentran expuestas.

Prácticamente cualquier virus puede ser cuantificado o titulado mediante los procedimientos de la presente invención, incluyendo virus de ADN, virus de ARN, virus de replicación competente, virus de replicación incompetente, virus recombinates, virus que llevan transgenes, etc. Preferentemente, el virus puede infectar células en cultivo. Entre los ejemplos de virus a los que se puede aplicar este procedimiento se incluyen, pero no se limitan a, adenovirus, virus adeno-asociado, retrovirus, virus del herpes simplex, parvovirus, virus de Epstein Barr, virus de la rinotraqueitis, virus de la parainfluenza, virus de la diarrea bovina, virus Sindbis, baculovirus, virus de la seudorrabia, virus de la varicela-zoster, citomegalovirus, HIV, virus de la hepatitis A, B y C, y vaccinia.

En algunas formas de realización de la invención, la infectividad se mide mediante anticuerpos dirigidos contra un polipéptido expresado por el virus. El polipéptido puede ser un polipéptido viral estructural, un polipéptido regulador, un polipéptido tal como una polimerasa y otros. En algunas formas de realización de la invención el polipéptido es expresado preferentemente por un gen exógeno incorporado en el virus, tal como un gen reportero. Entre los ejemplos de genes reporteros se incluyen la \beta-galactosidasa y la cloramfenicol transacetilasa (CAT). En otras formas de realización de la invención, el gen reportero se detecta mediante anticuerpos dirigidos contra un producto de la acción del gen reportero, tal como la acción de un enzima sobre un sustrato. En otras formas de realización de la invención, el gen exógeno es un transgen con fines terapéuticos. Entre los ejemplos se incluyen, pero no se limitan a, genes supresores de tumores, incluyendo p53 o retinoblastoma (RB); interleucinas, incluyendo IL-2, IL-4 y IL-10; interferones, incluyendo alfa-, beta- y gamma-interferón; otras citocinas; timidina quinasa; factores de crecimiento, incluyendo GCSF y la hormona de crecimiento; Factor VIII; adenosina deaminasa, y otros. Típicamente, la síntesis de un polipéptido codificado por un trangen se medirá mediante un anticuerpo dirigido contra el polipéptido.

Los anticuerpos utilizados para la detección pueden ser policlonales, monoclonales, o pueden incluir mezclas de tales anticuerpos. Típicamente, la detección se realiza directamente mediante la utilización de un anticuerpo conjugado con fluoresceína dirigido contra el polipéptido viral. Sin embargo, también son posibles ensayos indirectos, en los cuales el anticuerpo dirigido contra el polipéptido viral se hace reaccionar después con un anticuerpo marcado con fluoresceína. Se puede utilizar cualquier marcador fluorescente compatible con la citometría de flujo.

Típicamente, para realizar el ensayo de la invención, el número total de partículas virales en una preparación viral se mide primero mediante cualquiera de las técnicas tradicionales. Por ejemplo, se puede preparar una alícuota de la preparación viral en un tampón que contenga dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1%, después de lo cual se mide la absorbancia óptica a 260 nm (Maizel et al. Virology 36: 115-125 (1968)). Las cuentas de partículas totales también se pueden obtener mediante la preparación de una muestra de la preparación viral para microscopia electrónica, y simplemente contando el número de partículas. Una técnica adicional para el contaje de partículas puede incluir la utilización de cromatografía de intercambio aniónico (Huyghe et al., Human Gene Therapy 6: 1403-1416 (1995)).

Posteriormente, las células se infectan con diluciones de las preparaciones virales a proporciones del número de partículas totales respecto al número de células no superiores a aproximadamente 100:1, típicamente inferior a aproximadamente 10:1, preferentemente inferior a aproximadamente 5:1, más preferentemente inferior a aproximadamente 1:1. En algunas formas de realización la proporción es tan baja como aproximadamente 0,1:1. Típicamente se realizará por lo menos una infección, aunque en algunas formas de realización se realizan por lo menos dos infecciones en paralelo a diferentes proporciones de partículas respecto a células. Típicamente se sabe que las células utilizadas son sensibles a la infección por el virus. No es necesario que las células mantengan la replicación del virus, pero la infección se realiza bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido viral a detectar.

El volumen total de una preparación viral utilizado para infectar células en cultivo está típicamente determinado por técnicos experimentados teniendo en cuenta factores tales como el número total de células a infectar, la concentración de partículas de la preparación viral, y el volumen del recipiente en el que se realiza la infección. Preferentemente, la concentración de partículas de virus utilizada para infectar células en la mezcla de infección es de por lo menos 10^{5} partículas por ml, más preferentemente de por lo menos 10^{6} partículas por ml, y aún más preferentemente de por lo menos 10^{7} partículas por ml. Típicamente, las preparaciones virales se preparan bajo condiciones favorables para la estabilidad del virus. Las condiciones para la infección y, opcionalmente, el cultivo después de la infección, dependerán del virus particular y del gen viral o reportero utilizado para la detección. El término "cultivo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier forma de cultivo celular en el que se proporcionan los requerimientos mínimos a las células para permitir la supervivencia continuada durante el periodo de interés. Así, por ejemplo, cultivo puede referirse a la preparación de una suspensión celular en un tampón apropiado, tal como tampón fosfato salino o un medio de crecimiento incompleto, durante un periodo de minutos u horas, o puede referirse a células que se adhieren a placas de cultivo durante minutos hasta días y hasta semanas en presencia de un medio de crecimiento completo apropiado. Típicamente, se proporciona un tiempo de cultivo suficiente para la expresión del polipéptido viral deseado, pero preferentemente no se proporciona el tiempo suficiente para la propagación del virus infectante que resultaría en la infección adicional de células. Así, es preferible que solo se produzca "una ronda" de infección en estas células. En algunas formas de realización, el periodo de tiempo permitido "en cultivo" estará comprendido entre menos de 1 hora y varias horas. En otras formas de realización, el periodo de tiempo estará comprendido entre 1 y 5 días.

Típicamente, las células se infectan bajo condiciones que favorecen la adsorción del virus a las células, aunque en algunas formas de realización se pueden utilizar condiciones menos óptimas. Típicamente, se deja que los virus se adsorban a las células durante 1-12 horas. En algunas formas de realización, las células se infectan en una suspensión concentrada con virus concentrado, para potenciar la tasa de infección o el número de células infectadas, seguidamente se diluyen hasta una concentración más favorable para el crecimiento celular o viral. En algunas formas de realización de la invención, puede ser deseable lavar los cultivos de células infectadas para eliminar el virus no adsorbido o los componentes del medio utilizado para la infección, o para exponer las células infectadas a un medio o condiciones de crecimiento más favorables para su supervivencia.

Después de dejar pasar el tiempo suficiente para permitir la expresión del polipéptido viral, las células se preparan típicamente en forma de suspensión de células individuales. Cuando las células se infectan en forma de células adherentes en cultivo de tejidos, típicamente los cultivos se tratan con un agente disociante tal como tripsina para desprender las células del sustrato. También se pueden utilizar medios mecánicos para desprender las células, tal como raspado. Seguidamente se recogen las células mediante centrifugación y se preparan en un tampón, tal como medio de crecimiento incompleto o completo, para la reacción con los reactivos de detección. Típicamente, las células se "fijan" para la inmunotinción mediante cualquiera de las varias técnicas estándar. Una revisión de las técnicas de fijación utilizadas comúnmente es proporcionada por Bauer y Jacobberger, Methods in Cell Biology 41: 351-376 (1994)), incorporado a la presente memoria como referencia en su totalidad para todos los fines. Cuando el polipéptido se detecta por su actividad, se pueden introducir reactivos fluorescentes en las células para permitir la detección de la actividad, tal como un sustrato para un enzima marcado con fluoresceína.

Seguidamente las poblaciones de células infectadas se someten al análisis mediante citometría de flujo estándar, tal como mediante los procedimientos descritos por Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3ª ed., John Wiley and Sons (1994). El término "FACS" se utiliza algunas veces para hacer referencia a la citometría de flujo, aunque el separador de células no es necesario para poner en práctica la presente invención. Típicamente, se adquiere un mínimo de 10.000 eventos en el análisis. Típicamente, las células muertas se excluyen del análisis bien por "forward/side scatter gating" o por marcaje con PI y establecimiento de ventanas electrónicas en la fracción PI negativa. Se encuentran disponibles una variedad de paquetes comerciales de software para ayudar en la preparación y análisis de los datos, tal como CellQuest^{TM}.

El siguiente ejemplo tiene el propósito de ilustrar pero no de limitar la invención en ningún sentido.

Ejemplo

En este ejemplo, el ACNRB, un adenovirus recombinante con replicación defectuosa, se tituló mediante TCID_{50} y mediante el procedimiento de baja proporción de número de partículas respecto al número de células (baja proporción) de la presente invención. El virus de ejemplo utilizado comprendía esencialmente la estructura del vector de adenovirus descrita por Wills et al. (Cancer Gene Therapy 2: 191-197 (1995)) con un ADNc completo de retinoblastoma insertado en el vector.

El número de partículas totales se obtuvo mediante el procedimiento de "SDS/OD_{260}" y procedimientos de cromatografía de intercambio aniónico descritos anteriormente. En ambos ensayos, la medición de la concentración de partículas totales fue de 1,0 x 10^{12}/ml.

Las partículas infecciosas se titularon mediante el ensayo TCID_{50} tal como describen Huyghe et al. (Human Gene Therapy 6: 1403-1416 (1995)). Brevemente, se plaquearon 293 células en una placa de microtitulación de 96 pocillos: 100 \mul de 5x10^{5} células/ml para cada pocillo en medio MEM completo (10% de suero bovino de ternero; 1% de glutamina) (GIBCO BRL). En una placa independiente, una alícuota de 250 \mul de la muestra de virus diluida 1:10^{6} se añadió a la primera columna y se diluyó seriadamente dos veces a través de la placa. Se utilizaron siete filas para muestras. Una fila se utilizó como control negativo. Se transfirió una alícuota de 100 \mul de cada pocillo a su posición idéntica en la placa sembrada de 293 y se dejó incubar a 37ºC en un incubador con aire humidificado/7% de CO_{2} durante 2 días. Seguidamente se decantó el medio por inversión y las células se fijaron con acetona al 50%/metanol al 50%. Después de lavar con PBS, las células fijadas se incubaron durante 45 minutos con el anticuerpo anti-Ad5 marcado con FITC (Chemicon Internacional #5016) preparado de acuerdo con las instrucciones del kit. Después de lavar con PBS, la placa se examinó bajo un microscopio de fluorescencia (excitación a 490 mm, emisión a 520 mm) y se evaluó la presencia de marcador. El título se determinó utilizando el programa de análisis Titerprint (Lynn, Biotechniques 12: 880-881 (1992)).

El ensayo de baja proporción se llevó a cabo de la siguiente manera. Se sembraron 1 X 10^{6} 293 células (células embrionarias de riñón humano, ATCC CRL 1573) por pocillo en placas de 4 6-pocillos. El volumen final por pocillo era de 1 ml. Después de aproximadamente 2 h, el medio (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DME glucosa elevada) que contenía 4500 mg/ml de D-glucosa, suplementado con 5% de suero bovino de ternero definido suplementado con hierro, L-glutamina 2 mM, y piruvato sódico 1 mM) en cada pocillo se aspiró y se reemplazó con 1,1 ml de medio (sin suero) que contenía el virus diluido. Se dejó que se produjera la adsorción durante 60 minutos, después de cuyo periodo a cada pocillo se le añadieron 2 ml adicionales de medio exento de virus. Después de aproximadamente 42 h, los cultivos de células infectadas se procesaron mediante análisis por citometría de flujo.

Las células se desprendieron del sustrato de plástico con una solución de tripsina-EDTA (GIBCO-BRL). Se recogieron las células desprendidas de cada pocillo y se centrifugaron a aproximadamente 200 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se eliminaron los sobrenadantes y las células se lavaron en tampón fosfato salino de Dulbecco (D-PBS) sin sales de calcio o magnesio. Seguidamente, las células peleteadas se resuspendieron en 2 ml de fijador de acetona:metanol (1:1) frío, y posteriormente se mantuvieron en hielo durante 15 minutos. A cada tubo se le añadieron 7 ml de D-PBS sin sales de calcio o magnesio, después de lo cual las células se resuspendieron en D-PBS con suero de ternero al 1% (v/v). Después de repetir estas dos etapas últimas, las células se resuspendieron en 50 \mul de D-PBS con suero de ternero al 1%. A cada tubo se le añadieron 70 \mul del anticuerpo anti-adenovirus conjugado con FITC (Chemicon #5016) en 2,0 ml de D-PBS. Las muestras se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 50 minutos. Seguidamente, las muestras se transfirieron a tubos de análisis para citometría de flujo, se diluyeron ligeramente con 0,5 ml de D-PBS, y se analizaron mediante citometría de flujo. Se utilizó un sistema de citometro de flujo Becton-Dickinson FACScan^{TM}, PN 34011570, 12-00189-01 con FACStation (ordenador MAC QUADRA 650, monitor e impresora) con el Software CellQuest^{TM}.

Los resultados se muestran en la tabla 1. Según el ensayo TCID_{50} tradicional, la proporción de número de partículas totales respecto a la unidad infecciosa fue de 63:1. Como resulta evidente en la tabla, a medida que decrecía la proporción de número de partículas totales respecto al número de células, la proporción calculada del número de partículas totales : unidades infecciosas también decrecía hasta valores tan bajos como 12:1, proporcionando así un valor para el título infeccioso que era aproximadamente 5 veces superior al del ensayo tradicional. Así, este ensayo de baja proporción proporciona una enumeración del número de partículas infecciosas en una preparación viral inesperadamente mejor (es decir, mucho más precisa) que los procedimientos tradicionales de titulación. Las consecuencias de tales mediciones precisas proporcionadas por la presente invención resultan especialmente importantes en el cálculo de las dosis eficaces de virus recombinantes para uso terapéutico.

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1

Claims (15)

1. Procedimiento para determinar el número de partículas virales infecciosas en una población de partículas virales, que comprende:

i) infectar células en una población de células a una proporción de partículas totales respecto al número de células inferior a aproximadamente 100:1 hasta aproximadamente 0,1:1 para generar células infectadas en el que las células se cultivan después de la infección durante un periodo de tiempo que resulta suficiente para la expresión de un polipéptido expresado por el virus pero insuficiente para que la propagación del virus infectante produzca una infección adicional de células;

ii) hacer reaccionar un polipéptido expresado por el virus en las células infectadas con un anticuerpo marcado con un marcador fluorescente, presentando el anticuerpo especificidad para un polipéptido expresado por el virus; y

iii) medir la inmunofluorescencia en el producto de la etapa ii) mediante citometría de flujo para determinar el número de células infectadas, determinando así el número de partículas virales infecciosas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el virus es adenovirus.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el polipéptido viral es hexon.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el virus es un virus recombinante.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el polipéptido viral está codificado por un gen exógeno.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el gen exógeno es un gen reportero.

7. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el gen exógeno es p53.

8. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el gen exógeno es retinoblastoma.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es una mezcla de anticuerpos.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es policlonal.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es monoclonal.

12. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el virus recombinante es de replicación defectuosa.

13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proporción es inferior a aproximadamente 10:1 hasta aproximadamente 0,1:1.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proporción es inferior a aproximadamente 5:1 hasta aproximadamente 0,1:1.

15. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proporción es de aproximadamente 0,1:1.