ES2214701T3 - Procedimiento para la inactivacion de agentes patogenos, especialmente de virus, en materiales biologicos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento de neutralización de agentes patógenos, en particular de virus, en un material biológico, por incubación con un agente químico. Este procedimiento se caracteriza porque la incubación se realiza en presencia de una sal eluotrópica que corresponde a una concentración de NaCL de al menos 200 mmol/l, preferentemente, 300 mmol/l. La invención se refiere también a una preparación que contiene un complejo de protrombina, purificada por cromatografía.

Description

Procedimiento para la inactivación de agentes patógenos, especialmente de virus, en materiales biológicos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la inactivación de agentes patógenos en materiales biológicos por medio de la incubación con substancias químicas.

Un material biológico proviene de organismos o bien líquidos corporales o microorganismos.

Puesto que los materiales biológicos pueden estar contaminados con agentes patógenos, como por ejemplo moléculas infecciosas o microorganismos y virus, o bien agentes pirógenos, se han desarrollado ya diferentes procedimientos para la inactivación o bien el desenriquecimiento de agentes patógenos o bien agentes pirógenos. Tales procedimientos comprenden tratamientos físicos y/o químicos, como por ejemplo diversos métodos de filtración (por ejemplo nano-, dia- o ultrafiltración), tratamiento térmico, tratamiento con un ácido o una base, tratamiento con detergentes y/o un disolvente orgánico así como tratamiento con luz ultravioleta o con rayos Láser. También se han propuesto en la técnica actual diferentes combinaciones de tales procedimientos para la inactivación o bien el desenriquecimiento de agentes patógenos.

De la EP 0 197 554 se conoce, por ejemplo, un procedimiento para la despirogenización e inactivación de virus en un producto biológico o farmacéutico que incluye un tratamiento con una substancia de inactivación de virus y despirogenización como, por ejemplo una substancia anfifílica y/o un disolvente, en una fase sólida en la que el producto existe de forma adsorbida. Después de este tratamiento se separa la substancia de inactivación de virus y de despirogenización de la fase sólida, se lava el producto adsorbido y finalmente se eluye de la fase sólida.

De la EP 0 131 740 se conoce el tratamiento de un compuesto con contenido de proteína en una solución con disolventes orgánicos como los di- o trialquil-fosfatos, en caso dado en presencia de un detergente (tratamiento por solventes/detergentes), mediante el cual se pueden obtener compuestos de proteínas libres de virus con contenido de lípidos.

De la AT-PS 402 151 se conoce un tratamiento térmico en el que se añade a un preparado en forma de solución acuosa antes del calentamiento un agente surfactivo en una concentración de, como mínimo, 1% sobre peso.

Otro procedimiento para la reducción o bien supresión de actividades no deseadas en productos biológicos o farmacéuticos es conocido de la EP 0 083 999. Este se basa en un contacto prolongado con una solución o suspensión de un anfifílico de efecto no desnaturalizante. Para eliminar el anfifílico se trata el producto despirogenizado con un intercambiador de iones.

Una desventaja de muchos de estos procedimientos conocidos en la técnica actual es la frecuente pérdida de actividades de las proteínas inestables que están contenidas en los compuestos a tratar, por ejemplo de las proteínas de la sangre. Especialmente, al realizar un paso de purificación cromatográfica se produce una inactivación de proteínas en un alcance relativamente importante. Una biodegradación de proteínas también puede conducir a una activación. Así se sabe, por ejemplo, que el factor VII en una purificación cromatográfica debido a procesos autocatalíticos se activa fácilmente en el factor VIIa no deseado debido a su inestabilidad. Otra desventaja consiste en el alto costo de tiempo y aparatos de muchos procedimientos, lo que reduce fuertemente su practicabilidad y, con frecuencia, hace que la aplicación a escala técnica industrial sea inadecuada.

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento cuidadoso para las proteínas, especialmente para las proteínas inestables de la sangre, para una inactivación efectiva de agentes patógenos en materiales biológicos, procedimiento que también puede traducirse a escala industrial y realizarse de forma económica. Especialmente, se pretende evitar en gran medida en el procedimiento para la inactivación de agentes patógenos, una biodegradación y una posible activación de proteínas sensibles.

El objetivo arriba mencionado se alcanza mediante un procedimiento para la inactivación de agentes patógenos, especialmente de virus, en un material biológico por la incubación con una substancia química, procedimiento en el que se realiza la incubación en presencia de una sal eluotrópica correspondiente a una concentración de NaCl de, como mínimo, 200 mmol/l, de preferencia, como mínimo, 300 mmol/l.

La inactivación de agentes patógenos en solución ofrece, frente al tratamiento de un adsorbente, algunas ventajas. Así, por ejemplo, la practicabilidad de un procedimiento de este tipo en un sistema homogéneo, monofásico es mayor y la validación del paso de inactivación es posible con mayor facilidad. También, la mejor accesibilidad de los agentes patógenos parece aumentar en una fase relativamente homogénea la eficacia del paso del procedimiento.

El material biológico contiene, de preferencia, una proteína humana y es, especialmente, un plasma o una fracción de plasma o proviene de un cultivo de células. De preferencia, el material biológico contiene un factor sanguíneo como el factor XII, XI, VIII, V, el factor Von Willebrand o fibrinógeno, especialmente una proteína dependiente de la vitamina K como el factor II, factor VII, factor IX, factor X, proteína C, proteína S o bien proteína Z.

Las proteínas pueden existir como factores individuales, de preferencia en forma purificada, o en una mezcla compleja. En un tipo de ejecución especialmente preferido, el material biológico contiene, como mínimo, un factor del complejo de protrombina y es, especialmente, una fracción con contenido del complejo de protrombina o un material con contenido del factor VII, por ejemplo, se parte, después de una crioprecipitación de plasma, del correspondiente sobrante (crio-sobrante).

El preparado según invención es, de preferencia, un preparado con una actividad FEIB (Factor Eight Inhibitor Bypassing-Activity - Actividad de Bypass del Inhibidor del Factor Ocho), es decir un preparado adecuado para el tratamiento de pacientes inhibidores del factor VIII.

El material que proviene de un cultivo de células es, de preferencia, un material que contiene factores sanguíneos realizados de manera recombinante, entre ellos factores de la coagulación intrínseca o extrínseca, de la fibrinolisis, de la trombolisis o de sus inhibidores, especialmente factores sanguíneos que dependen de la vitamina K.

Como células se consideran las células usuales para la expresión de proteínas recombinantes, de preferencia células de mamíferos, como, por ejemplo, células Vero, CHO o BHK. Las correspondientes proteínas pueden someterse directamente desde el extracto de células bruto al procedimiento según invención para la inactivación de agentes patógenos eventualmente existentes, sin embargo, también se puede tratar de una fracción de células previamente purificada.

La substancia química es, por ejemplo, un detergente (anfifílico, un agente surfactivo) que está incluido de preferencia en una cantidad mínima del 1%, de mayor preferencia del 5%, de máxima preferencia más del 10%; sin embargo, también se pueden utilizar según invención otras substancias químicas, especialmente aquellas conocidas, por ejemplo, por su efecto viricida, bactericida o despirogenizante, o bien mezclas de las más diferentes substancias químicas.

Sin embargo, la selección se ve limitada debido a que la actividad de la substancia biológica no se ha de ver esencialmente afectada. Para un procedimiento económico se elige un producto químico que conserva la actividad biológica del material en más del 50% referido a la actividad antes de la incubación, de preferencia como mínimo un 70%, y especialmente más del 85%. Conservación de la actividad biológica significa que las proteínas incluidas en el material biológico pueden realizar su función natural inherente o bien las diferentes funciones inherentes. Esta actividad biológica puede averiguarse e indicarse según el tipo de proteína, por ejemplo por medio de un ensayo cromógeno estándar o mediante la determinación del antígeno.

En caso dado se separa la substancia química después de la incubación.

Bajo detergente se entiende, en general, una substancia sintética, orgánica, tensioactiva.

De preferencia se utiliza en el procedimiento según invención un detergente no iónico. Los surfactivos no iónicos, como el poliéter, especialmente alquil-fenol-poliglicol-éter, son, entre otros, productos de la etoxilación de ácidos grasos, amidas de ácidos grasos, aminas grasas, alcoholes grasos, aminoóxidos, ésteres del ácido graso de polialcoholes y ésteres de azúcar.

Un surfactivo de este tipo tiene un efecto no desnaturalizante sobre las proteínas y se selecciona, de preferencia, del grupo del polisorbato y tritón. Como polisorbato se utiliza, por ejemplo, Tween®.

Si se utilizan detergentes como producto químico, se emplean éstos según un tipo de ejecución preferido sin la adición de otras substancias, especialmente sin la adición de substancias orgánicas tóxicas o de disolventes, como por ejemplo TNBP. De esta forma se minimiza el riesgo de contaminación.

El material biológico se incuba, según el procedimiento de la invención, con una substancia química. Incubación significa que el material biológico se pone en contacto con una solución, suspensión o emulsión de un producto químico para la inactivación de un agente patógeno o bien pirógeno eventualmente existente, durante un período lo suficientemente largo con una temperatura determinada. La puesta en contacto puede realizarse, por ejemplo, de forma simple dejando descansar la mezcla durante un tiempo definido.

La incubación se realiza según la presente invención en presencia de una sal eluotrópica. Bajo "sal eluotrópica" se entiende a continuación la sal en mezcla con productos químicos o la sal en una composición compleja, con la característica de separar y/o expulsar substancias adsorbidas de adsorbentes sólidos, impregnados en líquido o en forma de gel. De preferencia se trata en la sal eluotrópica de un producto de desorción, como el que se utiliza en procedimientos cromatográficos. La substancia adsorbida es generalmente lo suficientemente soluble en presencia de la sal eluotrópica, es decir se eligen de preferencia condiciones que no precipitan el material biológico.

El tipo y la concentración de la sal o bien de la composición se seleccionan, generalmente, según el adsorbente utilizado. El efecto de elución de una sal depende, por ejemplo, de la polaridad del disolvente, es decir aumenta, por lo tanto, por ejemplo en la secuencia etanol – acetona - metanol - agua. El adsorbente puede ser una fase sólida, especialmente una matriz adecuada para la cromatografía de intercambio de iones. En la composición que contiene la sal eluotrópica también se pueden incluir otros aditivos, como por ejemplo otras sales. De preferencia se trata en la composición de una composición acuosa con un índice pH en el rango entre 6,0 y 8,0, de preferencia alrededor de 7,0.

En un tipo de ejecución preferido se utiliza como sal eluotrópica el cloruro sódico, pero también se pueden utilizar otras sales alcalinas o de tierras alcalinas, entre ellas CaCl_{2}. Como sales eluotrópicas también se pueden emplear los así llamados caotrópicos, como por ejemplo urea, rodanuros o guanidina. La concentración de la sal es, como mínimo, de \geq 200 mmol/l, de preferencia de \geq 300 mmol/l. El límite superior de la concentración utilizada depende, especialmente, de la solubilidad de la correspondiente sal y se sitúa para NaCl, por ejemplo, alrededor de 2 mol/l. Las substancias caotrópicas, como por ejemplo la urea, pueden utilizarse, en caso dado, incluso hasta una concentración de 8 mol/l.

La incubación del material biológico con la substancia química se realiza durante un período suficiente para la inactivación de agentes patógenos eventualmente existentes, de preferencia un tiempo entre 10 minutos y 10 horas, de mayor preferencia entre 1 horas y 5 horas. El tiempo requerido para el procedimiento según invención puede predeterminarse en un ensayo previo por medio de virus de modelo como HIV, virus de Sindbus, FSME o de la hepatitis.

También la elección de la temperatura afecta el tiempo a emplear. En el procedimiento según invención se incuba, de preferencia, a temperatura ambiente, por ejemplo en un rango de temperaturas entre 15 y 45ºC, especialmente entre 20 y 30ºC. En el procedimiento según la invención se adsorbe y purifica el material biológico de preferencia en un soporte sólido y la incubación se realiza inmediatamente después de la elución del material purificado. La elución y la incubación se pueden realizar consecutivamente, sin embargo, también es posible su realización simultánea.

Según otro tipo de ejecución preferido, se realiza la incubación después de una purificación cromatográfica de un material biológico, habiéndose seguido procesando todavía más el eluato, por ejemplo mediante centrifugado, filtrado u otros métodos físicos.

El soporte sólido es, de preferencia, un material adecuado para la cromatografía, especialmente un material adecuado para la cromatografía de intercambio de iones, cromatografía hidrófoba o la cromatografía de afinidad. Por ejemplo se utilizan materiales como Sepharose®, Superdex, Sephadex®, Spherodex®, Toyopearl® o materiales inorgánicos como la hidroxil-apatita.

Como intercambiadores de iones se pueden utilizar materiales de intercambio de iones como, por ejemplo, DEAE-Sephacel®, DEAE-Sephadex®, DEAE-Sepharose® CL6B, DEAE-Sepharose® Fast Flow, QAE-Sephadex®, Q-
Sepharose® Fast Flow, Q-Sepharose® High Performance, DEAE-Tris-Acryl, DEAE-Spherodex®, Q-Hyper-D (comercializado por la firma Sepracor), DEAE-Toyopearl®, QAE-Toyopearl®, Fractogel® EMD-TMAE u otro material Fractogel.

Como ejemplo para los materiales hidrófobos de cromatografía se nombran, por ejemplo, Butyl-Sepharose® Octyl-Sepharose®, Phenyl-Sepharose®, Fractogel®TSK-Butyl, t-Butyl-HIC-Support o TSK-Gel Butyl Toyopearl®.

El material biológico puede adsorberse y purificarse en el soporte directamente desde una mezcla compleja, el paso de inactivación, sin embargo, puede estar precedido o ser seguido también por otros pasos para la purificación del material, dándose preferencia dentro del marco de la presente invención a otros pasos de purificación cromatográfica. Mediante el procedimiento de la invención se inactivan agentes patógenos. Bajo agentes patógenos se entienden también fracciones de, por ejemplo, virus, especialmente también el genoma aislado o sus fragmentos.

Los agentes patógenos pueden ser patógenos envueltos en lípidos, como por ejemplo el virus de hepatitis B o agentes patógenos no envueltos en lípidos como por ejemplo el virus de hepatitis A.

Los procedimientos de inactivación de virus se designan actualmente como efectivos si después de aplicar el procedimiento ya no se puede detectar la presencia de virus en una muestra de un material biológico, que se había mezclado con una gran cantidad de un virus de ensayo, por ejemplo virus HI o Virus Sindbis como virus de modelo para los virus de hepatitis, es decir el título de virus se redujo por debajo del límite de detección. La detección y la cuantificación de ácidos nucleicos puede realizarse, por ejemplo, mediante un método PCR, como el descrito en la AT-PS 401 062, o mediante la titulación directa.

Como medida para la inactivación se conoce el así llamado factor de reducción que se calcula después de una única adición del virus de ensayo a partir del logaritmo decimal del cociente del título inicial y final del virus. De las Directrices Europeas EC III/8115/89-EN de la Comisión de la Comunidad Europea se conoce, además, el así llamado factor global de reducción. Este se calcula a partir de la suma de los factores de reducción de medidas individuales y subsecuentes de la inactivación.

También se realiza de preferencia otro paso independiente para la inactivación o bien el desenriquecimiento de agentes patógenos. Para este fin se consideran todos los procedimientos conocidos de la técnica actual, para minimizar el riesgo de infección.

Especialmente se realiza, como otro paso para la inactivación o bien el desenriquecimiento una filtración y/o un tratamiento térmico.

Como filtración se utiliza, de preferencia, una nanofiltración. Un tratamiento térmico preferido se realiza en material biológico sólido, por ejemplo en un liofilisado con un contenido controlado de agua, por ejemplo un contenido de agua entre el 5 y el 8% y una temperatura entre los 50 y los 80ºC, como se ha descrito en la EP-0 159 311.

En un tipo de ejecución preferido se ha previsto un tratamiento en dos pasos con un detergente como producto químico. Aquí se utiliza en un primer paso un detergente en una cantidad de, como mínimo, un 1%, de preferencia como mínimo un 5%, de mayor preferencia como mínimo del 10%. En un segundo paso se emplea otro detergente en una cantidad de, como mínimo, un 10%, de preferencia como mínimo un 12%, de mayor preferencia como mínimo un 14%. El detergente utilizado puede ser el mismo para ambos pasos, sin embargo también se pueden emplear detergentes diferentes. En general, mediante la combinación de pasos para la inactivación de virus se puede reducir en gran medida o excluir el riesgo de una infección vírica después de administrar el correspondiente
preparado.

Según la presente invención también se proporciona un preparado purificado por cromatografía, preparado que contiene un factor sanguíneo activable de manera autodinámica con un porcentaje de un factor sanguíneo activado inferior al 50%, referido al contenido del factor sanguíneo activado y no activado, de preferencia inferior al 40%, de mayor preferencia inferior al 30%, y todavía más preferido inferior al 20%, más preferido inferior al 10%, de máxima preferencia inferior al 1%, y un contenido de detergente.

Especialmente se trata en el preparado de un preparado que contiene un complejo de protrombina con un factor de actividad VIIa inferior al 50% referido al contenido del factor VII activado y no activado, preferiblemente inferior al 10%, de mayor preferencia inferior al 1%.

El contenido de detergente del preparado según invención se sitúa aquí en una cantidad farmacéuticamente aceptable de, preferiblemente entre un 1% y el límite de detección del detergente.

Bajo un factor sanguíneo activable de forma autodinámica se entiende según la presente invención un factor sanguíneo que se puede activar de forma autocatalítica mediante el contacto superficial o por procesos como, por ejemplo, procesos cromatográficos. Especialmente, un factor sanguíneo de este tipo es un factor seleccionado del grupo del factor VII, factor XII, factor XI y pre-calicreína.

En otro tipo de ejecución preferido el preparado está libre de inhibidores de serinproteasa, como por ejemplo los inhibidores de trombina, o bien los cofactores como, por ejemplo, la heparina. En un tipo de ejecución especial, la libertad de tales substancias ya está dada durante un proceso cromatográfico.

La presente invención se refiere, por lo tanto, también a preparados correspondientes que se obtienen mediante el procedimiento según invención.

En el preparado según invención también se pueden incluir otros aditivos, por ejemplo substancias de efecto estabilizante como los aminoácidos.

Con ayuda de los siguientes ejemplos se pretende explicar todavía más en detalle la presente invención, sin quedar limitada a ellos.

Ejemplo 1 Tratamiento con detergentes de un complejo de protrombina activado FEIBA en presencia de TWEEN®-80

Se incubaron 15 mg de DEAE-Sephadex® A-50, Firma Pharmacia, durante 15 minutos a temperatura ambiente en 1 ml de una solución de 30 g/l de NaCl en agua para su hinchamiento. A continuación se separó el gel del sobrante de hinchamiento mediante centrifugado. Después siguieron cinco lavados del gel, cada uno con 1 ml de solución tampón (9 g/l de Na_{2}HPO_{4}. 2H_{2}O, 7 g/l de NaCl, pH 7,0) y otros dos lavados con una solución tampón (7 g/l de citrato de Na_{3}. 2H_{2}O, 7g/l de NaCl) también por resuspensión y centrifugado.

Se descongelaron 30 ml del plasma de citrato humano, recién congelado, a una temperatura de 0 a +4ºC y se separó el crioprecipitado producido por centrifugado a +2ºC. El "crio-sobrante" resultante se incubó con el DEAE-Sephadex® lavado, generándose FEIBA que se adsorbió junto con los factores del complejo de protrombina y la proteína inerte en el gel. A continuación se eliminó del gel de DEAE mediante lavado en una solución tampón (9 g/l de Na_{2}HPO_{4} -. 2H_{2}O, 7g/l de NaCl) la proteína inerte coadsorbida.

El complejo de gel-proteína húmedo con la solución tampón se suspendió ahora en 1,5 ml de una solución de 150 mg/ml de TWEEN®-80 y 30 mg/ml de NaCl durante 1 hora a 26ºC. Mediante el tratamiento con la solución de gran intensidad iónica, se desorbieron la proteína junto con los factores del complejo de protrombina y agentes patógenos eventualmente existentes. A continuación se diluyó la suspensión añadiendo 6,5 ml de agua y se readsorbío durante 1 hora a temperatura ambiente, readsorbiéndose de nuevo la fracción de proteína, mientras que componentes del agente patógeno inactivado quedaron junto con el detergente en la solución. El complejo de gel/proteína se lavó entonces cinco veces cada una con 1 ml de una solución de 7 g/l de NaCl en agua eliminando el detergente.

Para la elución se trató el gel con 0,7 ml de una solución de 30 g/l de NaCl en agua agitándolo. El eluato se dializó ahora contra agua destilada, se congeló y se liofilizó. Después de la reconstitución del liofilisado se determinó la actividad FEIB según la AT-B 350 726.

Como control sirvieron preparados de FEIBA realizados de la misma forma pero sin tratamiento con detergente.

El análisis del preparado obtenido mostró una actividad específica de 3,2 E FEIBA/mg de proteína con un contenido de proteína de 16,6 mg/ml después de la reconstitución del liofilisado y era comparable con la variante del procedimiento sin tratamiento con detergente, donde se obtuvo una actividad específica de 2,8 E/mg de proteína con una concentración de proteínas de 16,5 mg/ml.

Ejemplo 2 Tratamiento con detergente en la desorción de FEIBA con un tiempo de incubación prolongado

De forma análoga al ejemplo 1 se adsorbió la fracción del complejo de protrombina en DEAE-Sephadex®, se liberó de la proteína inerte mediante lavado, se desorbió a continuación con una solución de TWEEN®/NaCl. Sin embargo, la fracción de proteína se mantuvo en estado desorbido durante más de 2 o bien 3 horas manteniendo, por lo demás, las mismas condiciones. A continuación, se procesó según se describe en el ejemplo hasta obtener el producto final.

El análisis de estas fórmulas dio como resultado una actividad específica de 2,5 E FEIBA/mg de proteína con un contenido de proteína de 16,6 mg/ml con una incubación de 2 horas en presencia de TWEEN®-80 y una actividad específica de 2,3 E FEIBA/mg de proteína con un contenido de proteína de 17,4 mg/ml con una incubación de 3 horas con detergente.

Así fue posible demostrar que tampoco el tiempo de contacto prolongado con el detergente no tenía nada que ver con una inactivación esencial del principio activo o una reducción del rendimiento.

Ejemplo 3 Tratamiento con detergente de FEIBA con una readsorción en otro gel

FEIBA se preparó según se describe en el Ejemplo 1. Después del tratamiento y la desorción con detergente se introdujo la solución obtenida en un recipiente en el que se habían introducido previamente 15 mg de DEAE-Sephadex® A50, Firma Pharmacia, que se incubó previamente en una solución de 30 g/l de NaCl para el hinchamiento y a continuación se trató mediante cinco lavados cada uno con 1 ml de una solución tampón (9 g/l de Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O, 7g/l de NaCl, pH 7,0) y otros dos lavados en una solución tampón (7 g/l de citrato de Na_{3}.2H_{2}O, 7 g/l de NaCl) en cada caso mediante resuspensión y centrifugado. Después de una adsorción de una hora del complejo diluido de proteína para la separación del detergente se realizó el retratamiento según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. El producto final así obtenido tenía, comparándolo con un FEIBA preparado según la variante estándar, es decir sin tratamiento con un detergente, un rendimiento del 95% y tenía una actividad específica comparable.

Ejemplo 4 Tratamiento con detergente de un complejo de protrombina FEIBA activado en presencia de TWEEN®-80 a temperatura incrementada

Se incubaron 15 mg de DEAE-Sephadex® A-50, Firma Pharmacia, durante 15 minutos a temperatura ambiente en 1 ml de una solución de 30 g/l de NaCl en agua para su hinchamiento. Después se separó el gel del sobrante del hinchamiento mediante centrifugado. A continuación se realizaron cinco lavados del gel, cada uno con 1 ml de una solución tampón (9 g/l de Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O, 7 g/l de NaCl, pH 7,0) y otros dos lavados con una solución tampón (7 g/l de citrato de Na_{3}.2H_{2}O, 7g/l de NaCl) también mediante resuspensión y centrifugado.

Se descongelaron a 0 a +4ºC 30 ml de plasma de citrato humano recientemente congelado y se separó el crioprecipitado producido mediante centrifugado a +2ºC. El "crio-sobrante" resultante se incubó en el DEAE-Sephadex® lavado generándose FEIBA que se adsorbió en el gel junto con los factores del complejo de protrombina y la proteína inerte. A continuación se eliminó la proteína inerte coadsorbida del gel de DEAE mediante el lavado con una solución tampón (9 g/l de Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O, 7 g/l de NaCl).

El complejo de gel-proteína, húmedo de la solución tampón, se suspendió ahora en 1,5 ml de una solución de 1 mg/ml de TWEEN®-80 y 30 mg/ml de NaCl durante 1 hora a temperatura ambiente, desorbiéndose la fracción de proteína e impurezas adsorbidas no específicas. A continuación se separó el gel por filtración. Ahora se llevó la solución de proteínas mediante otra adición de TWEEN®-80 hasta alcanzar una concentración de detergente de 150 mg/ml y a continuación se incubó, bien durante 1 hora a 26ºC o bien durante 1 hora a 40ºC agitándola para la inactivación de agentes patógenos eventualmente existentes. A continuación se diluyó mediante la adición de 6,5 ml de agua y se readsorbió un Gel de DEAE-Sephadex® A-50 preparado y recientemente lavado. Después se eliminó el detergente mediante cinco lavados cada uno con 1 ml de una solución de 7 g/l de NaCl en agua y finalmente se siguió elaborando el preparado según se describe en el ejemplo 1.

El análisis de ambas variantes de tratamiento a 26ºC y a 40ºC mostró una actividad específica del preparado de FEIBA comparable con una variante estándar sin inactivación del virus. Los rendimientos eran en cada caso del 75% de la variante estándar.

Ejemplo 5 Tratamiento con detergente de un complejo de protrombina en presencia de TWEEN®-80 (actualmente según opinión del solicitante el mejor método para la ejecución de la invención)

Se descongelaron a 0 a +4ºC 30 ml de plasma de citrato humano recientemente congelado y se separó el crioprecipitado producido mediante centrifugado a +2ºC. El "crio-sobrante" resultante se mezcló con 2 IE Heparina/ml. A continuación se adsorbieron las proteínas del complejo de protrombina con DEAE-Sephadex® A-50, firma Pharmacia, en una concentración de 0,5 mg/ml. El complejo de gel-proteína se separó de la solución y se lavó en cada caso con una solución tampón 1 (4 g/l de citrato de Na_{3}.2H_{2}O, 7g/l de NaCl, 9 g/l de Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O, 500 IE heparina/l, pH 7,5) y a continuación con la solución tampón 2 (4 g/l de citrato de Na_{3}.2H_{2}O/l, 7g/l de NaCl, 500 IE heparina/l, pH 7,5).

El gel lavado se suspendió ahora, para la inactivación de agentes patógenos, con 1,5 ml de una solución que contenía 150 mg de TWEEN®-80/ml y 30 mg de NaCl/ml, durante 1 hora a 26ºC. Con este tratamiento se desorbió la fracción de proteína junto con agentes patógenos eventualmente existentes o fragmentos de agentes patógenos, y en el transcurso de la incubación con el detergente se inactivó el agente patógeno. A continuación se diluyó con 6 ml de agua según se describe en el ejemplo 1 y se readsorbió la fracción de proteína junto con el principio activo en la matriz de intercambio de iones durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se lavó cinco veces eliminando el detergente con 1 ml de una solución tampón (4 g/l de citrato de Na_{3}, 7g/l de NaCl, 500 IE heparina/l, pH 7,5) y se eluyó con una solución de 1 g/l de citrato de Na_{3}.2H_{2}O, 30 g/l de NaCl, 1000 IE heparina, pH 7,0. Al eluato se añadió 1 IE heparina/ml. La solución con contenido del complejo de protrombina se cambió contra un tampón que contenía 4 g/l de citrato de Na_{3}.2H_{2}O, 8 g/l de NaCl, pH 7,0 y se liofilizó. En el complejo de protrombina liofilizado reconstituido se ensayó el contenido de proteína y el contenido en factores de protrombina; los resultados están reflejados en la Tabla 1. Como control se preparó una fórmula sin tratamiento de TWEEN®. Los resultados del análisis también se pueden ver de la Tabla 1.

TABLA 1 Comparación de las actividades de los factores de protrombina después de realizar el procedimiento según invención y sin este procedimiento

	Composición
	Proteína	Protrombina	Factor VII	Factor IX	Factor X	Proteína C
	(mg/ml)	(E/ml)	(E/ml)	(E/ml)	(E/ml)	(E/ml)
Control	14,7	22,1	0,9	21,0	23,2	26,5
Preparado seg.	14,4	19,7	1,0	22,2	22,1	27,9
invención

Se mostró que por el tratamiento con detergente no tuvo lugar ningún cambio esencial de la composición del complejo de protrombina.

Ejemplo 6 Tratamiento de detergente del factor VII con TWEEN®-80 en comparación con la inactivación del virus del factor VII según un procedimiento convencional

De plasma de citrato humano se separó la fracción del complejo de protrombina que contenía los factores de coagulación protrombina, un pequeño porcentaje del factor VII, factor IX y factor X, según se describe en el ejemplo 5. La mayor parte del factor de coagulación VII que quedó en el sobrante después de la adsorción en DEAE-Sephadex® A50 se obtuvo ahora mediante la adsorción en hidróxido de aluminio. Para este fin se añadieron por cada litro de sobrante después de separar el complejo de protrombina 10 ml de una suspensión al 2% de hidrogel de aluminio y se agitó durante 30 minutos a 4ºC. A continuación se separó el complejo de hidróxido de aluminio / proteína mediante centrifugado a 5000 rpm durante 10 minutos a aproximadamente 4ºC en un rotor H6000A Sorvall RC3B, se rechazó el sobrante y el precipitado con 3,5% del volumen del sobrante del complejo de protrombina utilizado para la adsorción, se suspendió en una solución de 4 g de citrato de Na_{3}.2H_{2}O/l y 7 g de NaCl/l, pH 7,5 y se agitó durante 30 minutos.

Así se desorbió la proteína inerte del hidróxido de aluminio. El factor VII que quedó en el hidróxido de aluminio se peletizó por otro centrifugado según se describe más arriba. El sobrante se rechazó y el precipitado se utilizó para el siguiente procesamiento. Para la desorción de la fracción de proteína se agitó durante 30 minutos el complejo de hidróxido de aluminio - factor VII con 1% sobre volumen del sobrante del complejo de protrombina utilizado para la adsorción de un tampón de fosfato de 0,3 mol/l, pH 8,6 (53,4 g de Na_{2}HOP_{4}.2H_{2}O/l se ajustaron en un pH 8,6 con una solución de 41,1 g de NaH_{2}PO_{4}H_{2}O/l) que contenía 1% de TWEEN®-80. A continuación se añadió detergente para la inactivación de agentes patógenos para una concentración final del 15% de TWEEN®-80 y después se agitó durante una hora a 40ºC.

A continuación se enfrió la solución a aproximadamente 22ºC y se diluyó con 9 partes de agua destilada. Después se readsorbió la fracción del factor VII en 1 g/l de DEAE-Sephadex® A50 agitando durante una hora a aproximadamente 22ºC. A continuación se eliminó el detergente del complejo de gel-proteína en el filtro de vacío de sinterización mediante tres lavados, cada uno con 100 ml de una solución diluida de TWEEN® utilizados por litro con un tampón que contenía 4 g/l de citrato de Na_{3}.2H_{2}O/l y 7 g de NaCl/l, con un pH de 7,5, que contenía 500 IE heparina/l. La elución de la fracción del factor VII se realizó mediante agitación del complejo de proteína de intercambiador de iones y 100 ml/l de una solución diluida de TWEEN® de una solución que contenía 85 g de NaCl/l durante 30 minutos a 22ºC. En el eluato se determinaron cuantitativamente a continuación el contenido del factor VII con un ensayo cromógeno del factor VII (factor VII:C inmunochromo, IMMUNO AG, Viena, medido frente al estándar internacional del complejo de protrombina), el contenido de proteína según el método Von Bradford [Anal.Biochem. 72:248-254 (1976)] y el factor VIIa según el método de US 683.682 (medido frente al estándar internacional del Factor VIIa). Los resultados pueden verse en la Tabla 2.

Para fines de comparación se separó el factor VII mediante la adsorción en hidróxido de aluminio según se describe más arriba de otras proteínas del complejo de protrombina y se trató en estado adsorbido según la EP 0 197 554 con los agentes inactivantes del virus de la EP 0 131 740 con TWEEN®-80 y tri-(N-butil)-fosfato (TNBP). Para este fin se agitó el complejo de hidrogel de aluminio / proteína en una solución del 1% de TWEEN®-80 y 0,3 % de tri-(N-butil)-fosfato durante 18 horas a 4ºC con un volumen de 50 ml/l de sobrante del complejo de protrombina. A continuación se centrifugó, según se describe más arriba, con el fin de separar el complejo de hidróxido de aluminio / proteína y se eliminó el TWEEN®-80 y tri-(N-butil)-fosfato sobrante mediante lavado con 3 x 100 ml de una solución de 4 g/l de citrato de Na_{3}.2H_{2}O, 7 g/l de NaCl con un pH de 7,5 mediante la resuspensión. Después de cada lavado seguía una peletización del complejo de hidróxido de aluminio / proteína mediante centrifugado. La elución se realizó bajo las mismas condiciones que el preparado paralelo según el procedimiento de la invención. También el análisis del producto final se realizó de manera análoga. Los resultados pueden verse en la Tabla 2.

TABLA 2 Actividades del factor VIIa después de realizar el procedimiento según invención según la EP 0 197 554

	Composición
	Actividad F VII	Concentración	Actividad	Actividad del factor VIIa
	(E/ml)	de proteína	específica	(E/ml)	(VIIa/VII)
		(mg/ml)	(E/ml)
Preparado seg.	3,2	0,2	15,2	2,7	0,84
invención
Preparado seg.	3,8	0,5	7,6	11,9	3,13
EP 0197554 / EP
0131 740

Se mostró que mediante la aplicación de este procedimiento el contenido del factor VIIa era claramente superior si se compara con el procedimiento según invención, no pudiendo detectarse ninguna activación a pesar del tratamiento complejo del factor VII. Además, en el procedimiento según invención la actividad específica del producto obtenido era superior a la del preparado de la comparación.

Ejemplo 7 Determinación semicuantitativa del virus de la hepatitis G

En las fórmulas de inactivación de agentes patógenos de los ejemplos 1 a 6 se tomaron muestras en cada caso de los materiales de partida, del sobrante después de la crioprecipitación o del sobrante de adsorción después de separar los factores de coagulación II, IX y X, así como de los correspondientes preparados concentrados y purificados del factor de coagulación. 0,5 ml de estas muestras se diluyeron 1+1 con una solución tampón fisiológica de fosfato-sal común y se peletizaron los virus eventualmente existentes mediante ultracentrifugado. El RNA se extrajo de los pelets víricos mediante el método de RNAzol-Reactivo (Biotecx, Houston, Texas) y se disolvió en agua destilada esterilizada.

Se realizó con la pareja de cebadores NS5a 1 y NS5a 2 (Linnen, J. et al., Science 271: 505-508 (1996)) el RT-PCR en cuanto al virus de hepatitis G ácidos nucleicos (HGV). La secuencia de los cebadores utilizados (comercializados por Boehringer Mannheim, Alemania) era para NS5a 1: 5'CTCTTTCTGGTAGTAGCCGAGAGAT 3' y para NS5a 2: 5'CGAATGAGTCAGAGGACGGGGTAT 3'. El cebador se marcó con un colorante fluorescente y los amplicones fluorescentes resultantes de ello después de procedimientos de rutina de protocolos PCR usuales se analizaron en un Secuenciador ABI 377 de Applied Biosystems. Para poder excluir la presencia de inhibidores de RT-PCR en las muestras, se mecharon las muestras con RNA-Mimics del virus de hepatitis C y se analizaron en una C-PCR de hepatitis realizada según la EP 0 714 988. Se aceptaron exclusivamente como evaluable para la HGV-PCR los extractos que no mostraron inhibición en la HCV-PCR. La intensidad de la fluorescencia se tomó como medida para el contenido del virus de la hepatitis G. Se mostró que los materiales de partida utilizados para el fraccionamiento tenían antes de la inactivación del agente patógeno según el procedimiento de la invención fuertes señales positivas, es decir una alta concentración de productos amplificados del ácido nucleico del HGV, mientras que en los eluatos después de la readsorción y separación de los agentes inactivantes del virus ya no se podía detectar ningún HGV-RNA.

En los ensayos paralelos sin realización de un tratamiento de detergente, los eluatos eran positivos de HGV-PCR igual que los materiales de partida utilizados.

Claims (18)

1. Procedimiento para la inactivación de agentes patógenos, especialmente de virus, en materiales biológicos mediante la incubación con substancias químicas, caracterizado porque el material biológico se adsorbe en un soporte sólido y porque después se realiza la incubación con una substancia química en presencia de una sal eluotrópica según una concentración de NaCl mínima de 200 mM, de preferencia como mínimo 300 mM, para la separación y/o expulsión de las substancias adsorbidas del soporte, debido a lo cual la incubación tiene lugar al mismo tiempo que la elución o inmediatamente después de la elución del material biológico.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como substancia química se utiliza un detergente que se incluye de preferencia en una cantidad mínima del 1%, más preferido más del 5% y de mayor preferencia más del 10%.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque como sal eluotrópica se utiliza cloruro sódico.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la incubación se realiza durante un tiempo entre 10 minutos y 10 horas, de mayor preferencia entre 1 hora y 5 horas.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque como material biológico se utiliza plasma o una fracción de plasma o material de un cultivo de células.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se utiliza un material biológico que contiene un factor sanguíneo, especialmente una proteína dependiente de la vitamina K.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se utiliza un material biológico que es una fracción con contenido de un complejo de protrombina.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el material biológico se adsorbe en un soporte sólido, se purifica y porque la incubación se realiza después de la elución del material purificado.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la elución y la incubación se realizan de forma simultánea.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque como soporte sólido se utiliza un material cromatográfico, especialmente un material adecuado para la cromatografía de intercambio de iones o la cromatografía de afinidad.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se realizan otros pasos para la purificación del material, especialmente una purificación cromatográfica.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se realiza otro paso para la inactivación o bien el desenriquecimiento de agentes patógenos, especialmente una filtración o un tratamiento térmico.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque como substancia química se selecciona un detergente no iónico del grupo de Tween y Tritón.

14. Preparado purificado cromatográficamente, que contiene un factor sanguíneo activable de manera autodinámica, con un porcentaje inferior del 50% referido al contenido del factor sanguíneo activado y no activado, de preferencia menos del 40%, de mayor preferencia menos del 30%, todavía más preferido menos del 20%, más preferido menos del 10% y de máxima preferencia menos del 1%, y un contenido de detergente.

15. Preparado según la reivindicación 14, caracterizado porque el factor sanguíneo se ha seleccionado del grupo del factor VII, factor XII, factor XI y la pre-calicreína.

16. Preparado según una de las reivindicaciones 14 ó 15, caracterizado porque contiene un complejo de protrombina con una actividad del factor VIIa inferior al 50%, referido al contenido del factor VII activado y no activado, de preferencia inferior al 10%, de mayor preferencia inferior al 1%.

17. Preparado según una de las reivindicaciones 14 a 15, caracterizado porque está libre de inhibidores de la serinproteasa o bien de sus cofactores.

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18. Preparado según una de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque se obtiene mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13.