ES2210235T3 - Sistemas de expresion de mamiferos para proteinas de hcv. - Google Patents
Sistemas de expresion de mamiferos para proteinas de hcv.Info
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Abstract
SISTEMAS DE EXPRESION DE MAMIFEROS PARA LA PRODUCCION DE PROTEINAS DE HCV. TALES SISTEMAS DE EXPRESION PROPORCIONAN GRANDES CANTIDADES DE PROTEINAS DE HCV Y PERMITEN EL DESARROLLO DE REACTIVOS DE DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICOS QUE CONTIENEN ANTIGENOS ESTRUCTURALES GLICOSILADOS Y PERMITEN TAMBIEN EL AISLAMIENTO DEL AGENTE ETIOLOGICO DE HCV.
Description
Sistemas de expresión de mamíferos para proteínas
de HCV.
Esta invención se refiere en general al virus de
la hepatitis C (HCV), y más en particular, se refiere a sistemas de
expresión de mamíferos capaces de generar proteínas y a usos de
estas proteínas.
Las descripciones de la enfermedad de la
hepatitis causando ictericia y color amarillento del ojo son
conocidas por el hombre desde la antigüedad. Ahora se sabe que la
hepatitis viral incluye un grupo de agentes virales con una
estructura de organización de proteínas virales y modo de
replicación característicos, causando la hepatitis con diferente
grado de gravedad de daño hepático a través de distintas rutas de
transmisión. La hepatitis viral aguda se diagnostica clínicamente
por síntomas bien definidos en el paciente que incluyen ictericia,
blandura hepática y un elevado nivel de transaminasas hepáticas
tales como la aspartato-aminotransferasa y la
alanina-aminotransferasa.
Actualmente, los ensayos serológicos se emplean
para distinguir más detalladamente entre la hepatitis A y la
hepatitis B. Hepatitis no A no B (NANBH) es un término usado por
primera vez en 1975 que describe casos de hepatitis
postransfusional no causados por el virus de la hepatitis A o por el
virus de la hepatitis B. Feinstone et al., New Engl. J.
Med. 292: 454-457 (1975). El diagnóstico de
NANBH principalmente se hizo por medio de la exclusión sobre la
base de los análisis serológicos para la presencia de hepatitis A o
hepatitis B. NANBH es responsable de aproximadamente el 90% de los
casos de hepatitis postransfusional. Hollinger et al., en N.
R. Rose et al., eds. Manual of Clinical Immunology,
American Society for Microbiology, Washington, D. C.,
558-572 (1986).
Los intentos para identificar el virus NANBH en
virtud de la similitud genómica con uno de los virus de la hepatitis
conocidos han fallado hasta ahora, sugiriendo que NANBH tiene una
organización genómica y estructura características. Fowler et
al., J. Med. Virol. 12:205-213
(1983), y Weiner et al., J. Med. Virol.
21:239-247 (1987). El progreso en el desarrollo de
ensayos para detectar anticuerpos específicos para NANBH se ha visto
entorpecido por dificultades encontradas en la identificación de
antígenos asociados con el virus. Wards et al., patente de
Estados Unidos N1 4,870,076; Wards et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 83:6608-6612 (1986); Ohori et
al., J. Med. Virol. 12:161-178 (1983);
Bradly et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
84:6277-6281 (1987); Akatsuka et al., J.
Med. Virol. 20:43-56 (1986).
En mayo de 1988, una colaboración de Chiron
Corporation con el Centro de Control de Enfermedades tuvo como
resultado la identificación de un supuesto agente NANB del virus de
la hepatitis C (HCV). M. Houghton et al. clonaron y
expresaron en E. coli un agente NANB obtenido a partir del
plasma infeccioso de un chimpancé. Cuo et al.,
Science 244:359-361 (1989); Choo et
al., Science 244:362-364 (1989). Se
identificaron las secuencias de ADNc a partir de HCV que codifican
para antígenos que inmunológicamente reaccionan con anticuerpos
presentes en la mayoría de los pacientes clínicamente diagnosticados
con NANBH. Basado en la información disponible y en la estructura
molecular de HCV, la estructura genética de los virus consiste en un
ARN lineal de una sola hebra (hebra positiva) de peso molecular de
aproximadamente 9,5 kb y posee un marco abierto de lectura
traduccional continuo. J. A. Cuthbert, Amer. J. Med. Sci.
299:346-355 (1990). Es un virus envuelto pequeño que
recuerda a los Flavivirus. Los investigadores han hecho intentos
para identificar el agente NANB por cambios estructurales en los
hepatocitos en individuos infectados. H. Gupta, Liver
8:111-115 (1988); D. W. Bradly J. Virol.
Methods 10:307-319 (1985). Se han detectado
cambios ultraestructurales similares en hepatocitos así como en
secuencias de ARN de HCV amplificadas por PCR en pacientes NANBH así
como en chimpancés experimentalmente infectados con plasma de HCV
infeccioso. T. Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
87:6441-6444 (1990).
Se encontró una considerable evidencia serológica
para implicar al HCV como agente etiológico de la NANBH
postransfusional. H. Alter et al., N. Eng. J. Med.
321:1494-1500 (1989); Estaben et al., The
Lancet Aug. 5:294-296 (1989); C. van Der Poel
et al., The Lancet Aug. 5:297-298
(1989); G. Sbolli, J. Med. Virol. 30:230-232
(1990); M. Makris et al., The Lancet
335:1117-1119 (1990). Aunque la detección de
anticuerpos contra HCV elimina del sistema de suministro de sangre
del 70 al 80% de la sangre infectada por NANBH, los anticuerpos
aparentemente se detectan fácilmente durante el estado crónico de
la infección, mientras que sólo el 60% de las muestras de la fase
aguda de NANBH son positivas para el anticuerpo contra HCV. H.
Alter et al., New Eng. J. Med.
321:1994-1500 (1989). El prolongado intervalo entre
la exposición a HCV y la detección de anticuerpo, y la falta de
información adecuada con respecto al perfil de respuesta inmune de
varias proteínas estructurales y no estructurales plantea preguntas
con respecto al estado infeccioso del paciente en las fases latente
y negativa para el anticuerpo durante la infección NANBH.
Desde el descubrimiento del supuesto agente
etiológico de HCV como se discute arriba, los investigadores han
intentado expresar las proteínas del supuesto HCV en sistemas de
expresión humanos y también aislar el virus. Hasta la fecha, no se
ha publicado ningún trabajo en el que se haya expresado HCV de
manera eficaz en sistemas de expresión de mamíferos, y no se ha
propagado el virus en sistemas de cultivos tisulares.
Por tanto, hay una necesidad de desarrollar
reactivos para ensayo y sistemas de ensayo para identificar la
infección aguda y la viremia que puede presentarse, actualmente no
detectable por medio de ensayos comercialmente disponibles. Se
necesitan estas herramientas para ayudar a distinguir entre la
infección aguda y persistente, en curso y/o crónica de aquellos de
probable resolución, y para definir el curso del pronóstico de la
infección NANBH, para
\hbox{desarrollar} estrategias
preventivas y/o terapéuticas. También los sistemas de expresión que
permiten la secreción de estos antígenos glicosilados ayudarían a
purificar y a producir reactivos diagnósticos y terapéuticos.
Esta invención proporciona nuevos sistemas de
expresión que son capaces de generar altos niveles de proteínas
expresadas de HCV. En particular, se expresan fragmentos
estructurales de HCV de longitud completa como una fusión con la
señal de secreción del precursor de la proteína amiloide (APP) o de
la hormona del crecimiento humana (HGH). Estos sistemas de expresión
únicos permiten la producción de altos niveles de proteínas de HCV,
contribuyendo al procesamiento apropiado; glicosilación y
plegamiento de la proteína(s) viral(es) en el sistema.
En particular, la presente invención proporciona los plásmidos
pHCV-162, pHCV-167,
pHCV-168, pHCV-169 y
pHCV-170. También se incluyen las proteínas de
fusión APP-HCV-E2 expresadas por los
vectores de expresión de mamíferos pHCV-162 y
pHCV-167. Además, se proporcionan las proteínas de
fusión HGH-HCV-E2 expresadas por los
vectores de expresión de mamíferos pHCV-168,
pHCV-169 y pHCV-170.
La presente invención también proporciona un
método para detectar un antígeno o anticuerpo de HCV en una muestra
de ensayo sospechosa de contener antígeno o anticuerpo de HCV, en
donde la mejora consiste en poner en contacto la muestra con un
antígeno glicosilado de HCV producido en un sistema de expresión de
mamíferos. También se proporciona un método para determinar un
antígeno o anticuerpo de HCV en una muestra de ensayo sospechosa de
contener un antígeno o anticuerpo de HCV, en donde la mejora
consiste en poner en contacto la muestra de ensayo con un anticuerpo
producido usando un antígeno glicosilado de HCV producido en un
sistema de expresión de mamíferos. El anticuerpo puede ser
monoclonal o policlonal.
La presente invención además proporciona un kit
de ensayo para detectar la presencia de antígeno de HCV o anticuerpo
de HCV en una muestra de ensayo sospechosa de contener dicho
antígeno o anticuerpo, que comprende un recipiente que contiene un
antígeno glicosilado de HCV producido en un sistema de expresión de
mamíferos. El kit de ensayo también incluye un anticuerpo producido
usando un antígeno glicosilado de HCV producido en un sistema de
expresión de mamíferos. Otro kit de ensayo proporcionado por la
presente invención comprende un recipiente que contiene un
anticuerpo producido usando un antígeno glicosilado de HCV producido
en un sistema de expresión de mamíferos. El anticuerpo proporcionado
para los kits de ensayo puede ser monoclonal o policlonal.
La figura 1 muestra una representación
esquemática de la estrategia empleada para generar y unir los clones
genómicos de HCV.
La figura 2 muestra una representación
esquemática de la localización y composición de aminoácidos de las
proteínas de fusión APP-HCV-E2
expresadas por los vectores de expresión de mamíferos
pHCV-162 y pHVC-167.
La figura 3 muestra una representación del vector
de expresión de mamíferos pRC/CMV.
La figura 4 muestra los resultados de RIPA
obtenidos para las proteínas de fusión
APP-HCV-E2 expresado por
pHCV-162 en células HEK-293 usando
sueros humanos positivos para anticuerpo contra HCV.
La figura 5 muestra los resultados de RIPA
obtenidos para las proteínas de fusión
APP-HCV-E2 expresado por
pHCV-162 en células HEK-293 usando
anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra péptidos
sintéticos.
La figura 6 muestra los resultados de RIPA
obtenidos para las proteínas de fusión
APP-HCV-E2 expresado por
pHCV-167 en células HEK-293 usando
sueros humanos positivos para anticuerpo contra HCV.
La figura 7 muestra la digestión con
endoglicosidasa-H de inmunoprecipitados de las
proteínas de fusión APP-HCV-E2
expresados por pHCV-162 y pHCV-167
en células HEK-293.
La figura 8 muestra los resultados de RIPA
obtenidos cuando sueros de americanos positivos para anticuerpo
contra HCV se analizaron contra las proteínas de fusión
APP-HCV-E2 expresadas por
pHCV-162 en células HEK-293.
La figura 9 muestra los resultados de RIPA
obtenidos cuando los sueros de donantes de sangre voluntarios
japoneses se analizaron contra las proteínas de fusión
APP-HCV-E2 expresadas por
pHCV-162 en células HEK-293.
La figura 10 muestra los resultados de RIPA
obtenidos cuando los sueros de donantes de sangre voluntarios
japoneses se analizaron contra las proteínas de fusión
APP-HCV-E2 expresadas por
pHCV-162 en células HEK-293.
La figura 11 muestra una representación
esquemática del vector de expresión de mamíferos
pCDNA-I.
La figura 12 muestra una representación
esquemática de la localización y composición de aminoácidos de la
proteína de fusión HGH-HCV-E1
expresada por el vector de expresión de mamíferos
pHVC-168.
\newpage
La figura 13 muestra una representación
esquemática de la localización o composición de las proteínas de
fusión HGH-HCV-E2 expresadas por los
vectores de expresión de mamíferos pHCV-169 y
pHCV-170.
La figura 14 muestra los resultados de RIPA
obtenidos cuando los sueros positivos para el anticuerpo HCV E2 se
analizaron contra la proteína de fusión
HGH-HCV-E1 expresada por
pHCV-168 en células HEK-293.
La figura 15 muestra los resultados de RIPA
obtenidos cuando los sueros positivos para el anticuerpo HCV E2 se
analizaron contra las proteínas de fusión
HGH-HCV-E2 expresadas por
pHCV-169 y pHCV-170 en células
HEK-293.
La presente invención proporciona clones
genómicos de longitud completa en diversos aspectos. Tales clones
genómicos de longitud completa pueden permitir el cultivo de los
virus HCV que sucesivamente es útil para varios propósitos. Los
cultivos eficaces del virus HCV pueden permitir el desarrollo de
inhibidores de la replicación viral, proteínas virales para
aplicaciones diagnósticas, proteínas virales para terapias y
especialmente antígenos virales estructurales, incluyendo, por
ejemplo, fragmentos supuestos de la envuelta de HCV, supuestos de
E1 de HCV y supuestos de E2 de HCV.
Las líneas celulares que pueden usarse para la
replicación viral son numerosas, e incluyen (pero no de forma
limitante), por ejemplo, hepatocitos primarios, hepatocitos
permanentes o semipermanentes, cultivos transfectados con virus
transformantes y con genes transformantes. Líneas celulares
especialmente útiles podría incluir, por ejemplo, cultivos de
hepatocitos permanentes expresan continuamente cualquiera de los
varios genes heterólogos de ARN polimerasa para amplificar
secuencias del ARN de HCV bajo el control de estas secuencias
específicos de ARN polimerasa.
Las fuentes de secuencias virales de HCV que
codifican para antígenos estructurales incluyen el supuesto núcleo,
los fragmentos supuestos E1 y E2. La expresión puede llevarse a cabo
en sistemas procariotas y eucariotas. La expresión de proteínas de
HCV en sistemas de expresión de mamíferos permite que se produzcan
proteínas glicosiladas tales como las proteínas E1 y E2. Estas
proteínas glicosiladas tienen utilidad diagnóstica en varios
aspectos, incluyendo, por ejemplo, los sistemas de ensayo para
aplicaciones de selección y pronóstico. La expresión en mamíferos
de proteínas virales HCV permite estudios de inhibidores incluyendo
la elucidación de los sitos o secuencias virales específicos de
unión y/o receptores virales en tipos celulares susceptibles, por
ejemplo, células de hígado y similares.
La obtención de clones de expresión específicos
como se describe en la presente invención en sistemas de expresión
de mamíferos proporciona antígenos para ensayos diagnósticos que
pueden determinar la etapa de la infección de HCV, tal como, por
ejemplo, infecciones agudas frente a infecciones en curso o
persistentes, y/o infecciones recientes frente a exposiciones
anteriores. Estos clones de expresión específicos también
proporcionan marcadores para la resolución de la enfermedad tales
como para distinguir la determinación de la enfermedad a partir de
hepatitis crónica causada por HCV. Se contempla que la
seroconversión temprana a antígenos estructurales glicosilados
posiblemente puede detectarse usando proteínas producidas en estos
sistemas de expresión de mamíferos. También se pueden producir
anticuerpos, monoclonales y policlonales, a partir de las proteínas
derivadas de estos sistemas de expresión de mamíferos que entonces
sucesivamente puede usarse para aplicaciones diagnósticas,
pronósticas y terapéuticas. También, los reactivos producidos a
partir de estos nuevos sistemas de expresión descritos en la
presente invención pueden ser útiles en la caracterización y/o
aislamiento de otros agentes infecciosos.
Las proteínas producidas por estos sistemas de
expresión de mamíferos, así como reactivos producidos a partir de
estas proteínas, puede ponerse en un recipiente apropiado y
empaquetarse como kits de prueba convenientes para llevar a cabo
ensayos. Otros aspectos de la presente invención incluyen un
polipéptido que comprende un epítopo de HCV unido a una fase sólida
y un anticuerpo contra un epítopo de HCV unido a una fase sólida.
También están incluidos métodos para producir un polipéptido que
contiene un epítopo de HCV que comprende incubar células
hospedadoras transformadas con un vector de expresión de mamífero
que contiene una secuencia que codifica para un polipéptido que
contiene un epítopo de HCV bajo condiciones que permiten la
expresión del polipéptido, y un polipéptido que contiene un epítopo
de HCV producido por este método.
La presente invención proporciona ensayos que
utilizan los polipéptidos recombinante o sintético proporcionados
por la invención, así como los anticuerpos descritos en la presente
invención en varios formatos, cualquier de los cuales puede emplear
un compuesto generador de señal en el ensayo. También se
proporcionan métodos de detección para los ensayos que no utilizan
compuestos generadores de señal. Todos los ensayos descritos
generalmente detectan el antígeno o el anticuerpo, o ambos, e
incluyen poner en contacto una muestra de ensayo con al menos un
reactivo proporcionado en la presente invención para formar al menos
un complejo antígeno/anticuerpo y detectar la presencia del
complejo. Estos ensayos se describen en detalle en la presente
invención.
También se incluyen en la presente invención
vacunas para el tratamiento de la infección con HCV que comprende un
péptido inmunogénico obtenido a partir de un sistema de expresión de
mamíferos que contiene un epítopo de HCV, o una preparación
inactivada de HCV, o una preparación atenuada de HCV. También se
incluye en la presente invención un método de producción de
anticuerpos contra HCV que comprende la administración a un
individuo de un polipéptido inmunogénico aislado que contiene un
epítopo de HCV en cantidad suficiente para producir una respuesta
inmune en el individuo inoculado.
También se proporciona en la presente invención
una célula crecida en cultivo tisular infectada con HCV.
El término "componente corporal que contiene
anticuerpo" (o muestra de ensayo) se refiere a un componente del
cuerpo de un individuo que es la fuente de los anticuerpos de
interés. Estos componentes son bien conocidos en la técnica. Estas
muestras incluyen muestras biológicas que se puede probar por los
métodos de la presente invención descritos aquí e incluyen fluidos
corporales humanos y animales tales como sangre completa, suero,
plasma, fluido cerebroespinal, orina, linfa y varias secreciones
externas de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinal,
lágrimas, saliva, leche, células blancas de la sangre, mielomas y
similares, fluidos biológicos tales como sobrenadantes de cultivos
celulares, muestras de tejido fijadas y muestras de células
fijadas.
Después de la preparación de las proteínas
recombinantes, como se describe en la presente invención, las
proteínas recombinantes puede usarse para desarrollar ensayos únicos
como se describe en la presente invención para detectar la presencia
de antígeno o anticuerpo contra HCV. Estas composiciones también
pueden usarse para desarrollar anticuerpos monoclonales y/o
policlonales con una proteína recombinante específica que une
específicamente el epítopo inmunológico de HCV deseado por el
especialista. También se contempla que al menos una proteína
recombinante de la invención puede usarse para desarrollar vacunas
siguiendo métodos conocidos en la técnica.
Se contempla que el reactivo empleado para el
ensayo puede proporcionarse en forma de un kit con uno o más
recipientes tales como viales o botellas, conteniendo cada
recipiente un reactivo separado tal como un anticuerpo monoclonal,
o un cocktail de anticuerpos monoclonales, o un polipéptido
(recombinante o sintético) empleado en el ensayo.
Las "fases sólidas" ("soportes
sólidos") son conocidas por los especialistas en la técnica e
incluyen las paredes de los pocillo de una placa de reacción, tubos
de ensayo, partículas de poliestireno, bolitas magnéticas, tiras de
nitrocelulosa, membranas, micropartículas, tales como partículas de
látex y otras. La "fase sólida" no es crítica y puede
seleccionarla un especialista en la técnica. De ese modo, las
partículas de látex, micropartículas, partículas magnéticas o no
magnéticas, membranas, tubos de plástico, paredes de pocillos de
microtitulación, astillas de vidrio o silicona, eritrocitos de
sangre de carnero también son ejemplos adecuados. Métodos adecuados
para la inmovilización de péptidos en fases sólida incluyen
interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. Una
"fase sólida", como se usa en la presente invención, se
refiere a cualquier material que es insoluble o puede hacerse
insoluble por una reacción posterior. La fase sólida puede elegirse
por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar el reactivo
capturado. Alternativamente, la fase sólida puede retener un
receptor adicional que tiene capacidad para atraer e inmovilizar al
reactivo capturado. El receptor adicional puede incluir una
sustancia cargada que está opuestamente cargada con respecto al
reactivo de captura en sí o a una sustancia cargada conjugada con el
reactivo capturado. Aún como otra alternativa, la molécula
receptora puede ser cualquier miembro de unión específica que se
inmoviliza en (se une a) la fase sólida y que tiene la capacidad
para inmovilizar el reactivo capturado a través de una reacción
específica de unión. La molécula receptora permite la unión
indirecta del reactivo capturado a un materia de fase sólida antes
de llevar a cabo el ensayo o durante la realización del ensayo. De
este modo, la fase sólida puede ser un plástico, un derivado del
plástico, un metal magnético o no, la superficie de vidrio o de
silicona de un tubo de ensayo, pocillo de microtitulación, láminas,
partículas, micropartículas, fragmentos, y otras configuraciones
conocidas por los especialistas en la técnica.
Se contempla y está dentro del ámbito de la
invención que la fase sólida también puede contener cualquier
material poroso con suficiente porosidad para permitir el acceso con
anticuerpos de detección y una afinidad de la superficie adecuada
para unir antígenos. Generalmente se prefieren estructuras
microporosas, pero también pueden usarse los materiales con
estructura de gel en estado hidratado. Tales soportes sólidos
eficaces incluyen: carbohidratos poliméricos naturales y sus
modificaciones sintéticas, derivados entrecruzados o sustituidos,
tales como agar, agarosa, ácido algínico entrecruzado, gomas
arábigas sustituidas y entrecruzadas, ésteres de celulosa,
especialmente con ácido nítrico y ácidos carboxílicos, ésteres de
celulosa mezclados, y éteres de celulosa; polímeros naturales que
contienen nitrógeno, tales como proteínas y derivados, incluyendo
gelatinas entrecruzadas o modificadas; polímero de hidrocarburos
naturales, tales como el látex y el caucho; polímeros sintéticos
que pueden prepararse con estructuras porosas adecuadas, tales como
polímeros de vinilo, incluyendo polietileno, polipropileno,
poliestireno, cloruro de polivinilo, acetato de polivinilo y sus
derivados parcialmente hidrolizados, poliacrilamidas,
polimetacrilatos, copolímeros y terpolímeros de los policondensados
anteriores, tales como poliésteres, poliamidas y otros polímeros,
tales como poliuretanos y poliepóxidos; materiales inorgánicos
porosos tales como sulfatos o carbonatos de metales alcalinotérreos
y magnesio, incluyendo sulfato de bario, sulfato cálcico, carbonato
cálcico, silicatos de álcali y metales alcalinotérreos, aluminio y
magnesio; y óxidos o hidratos de aluminio y silicona, tales como
arcillas, alúmina, talco, caolín, zeolita, gel de sílice o vidrio
(estos materiales puede usarse como filtros con los materiales
poliméricos anteriores); y mezclas o copolímeros de las clases
anteriores, tales como copolímeros de injerto obtenidos iniciando la
polimerización de polímeros sintéticos sobre un polímero natural
preexistente. Todos estos materiales pueden usarse en formas
adecuadas; tales como películas, hojas, o placas y puede recubrir o
unirse o laminar un apropiado vehículo inerte, tal como papel,
vidrio, películas de plástico o tejidos.
La estructura porosa de nitrocelulosa tiene una
absorción excelente y propiedades de adsorción para una amplia
variedad de reactivos incluyendo los anticuerpos monoclonales. El
nailon también posee características similares y también es
adecuado. Se contempla que tales soportes sólidos porosos descritos
anteriormente preferiblemente están en forma de hojas de grosor de
aproximadamente 0,01 a 0,5 mm, preferiblemente aproximadamente 0,1
mm. El tamaño de poro puede variar entre límites amplios, y
preferiblemente es de aproximadamente 0,025 a 15 micras,
especialmente de aproximadamente 0,15 a 15 micras. Las superficies
de tales soportes pueden activarse por procesos químicos que causan
la unión covalente del antígeno o el anticuerpo al soporte. La unión
irreversible del antígeno o el anticuerpo se obtiene, sin embargo,
en general por adsorción al material poroso por fuerzas hidrófobas
poco conocidas. También se describen soportes sólidos adecuados en
la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de serie
227,272.
El "reactivo indicador" comprende un
"compuesto generador de señal" (marcador) que es capaz de
generar una señal detectable mensurable por medios externos
conjugado (unido) a un miembro de unión específica de HCV.
"Miembro de unión específica" como se usa en la presente
invención significa un miembro de un par de unión específico. Esto
es, dos moléculas diferentes en donde una de las moléculas a través
de medios físicos o químicos específicamente se une a la segunda
molécula. Además de ser un anticuerpo miembro de un par de unión
específico para el HCV, el reactivo indicador también puede ser un
miembro de cualquier par de unión específico, incluyendo sistemas
hapteno-anti-hapteno tales como
biotina o anti-biotina, avidina o biotina, un
carbohidrato o una lectina, una secuencia de nucleótidos
complementaria, un efector o una molécula receptora, un cofactor
enzimático y un enzima, un inhibidor enzimático o un enzima, y
similar. Un miembro de unión específico inmunoreactivo puede ser un
anticuerpo, un antígeno o un complejo anticuerpo/antígeno que es
capaz de unirse a HCV tanto en un ensayo de tipo sándwich, para la
captura del reactivo como en un ensayo competitivo, o el miembro de
unión específico auxiliar como en un ensayo indirecto.
Los varios "compuestos de generación de
señal" (marcador) contemplados incluyen cromógenos, catalíticos
tales como enzimas, compuestos luminiscentes tales como fluoresceína
y rodamina, elementos radiactivos, y marcadores de visualización
directa. Ejemplos de los enzimas incluyen la fosfatasa alcalina,
peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa y
similares. La selección de un marcador no es crítica, pero será
capaz de producir una señal por sí mismo o junto con una o más
sustancias adicionales.
Los varios "compuestos de generación de
señal" (marcador) contemplados incluyen cromógenos, catalíticos
tales como enzimas, compuestos luminiscentes tales como fluoresceína
y rodamina, compuestos quimioluminiscentes tales como los compuestos
de acridina, fenantridinio y dioxetano, elementos radiactivos, y
marcados de visualización directa. Ejemplos de los enzimas incluyen
la fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante,
beta-galactosidasa y similares. La selección de un
marcador no es crítica, pero será capaz de producir una señal por
sí mismo o junto con una o más sustancias adicionales.
Otras realizaciones que utilizan otras varias
fases sólidas también se contemplan y están en el ámbito de esta
invención. Por ejemplo, procedimientos de captura iónica por
inmovilización de un complejo de reacción inmovilizable con un
polímero cargado negativamente, descrito en la solicitud de patente
de Estados Unidos en trámite junto con la presente con Nº de serie
150,278 correspondiente con la publicación de Patente Europea
0326100, y la solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de serie
375,029 (publicación EP Nº 0406473), que disfrutan de propiedad
común, puede emplearse de acuerdo con la presente invención para
efectuar una reacción inmunoquímica rápida de fase en solución. Un
complejo inmune inmovilizable se separa del resto de la mezcla de
reacción por interacciones iónicas entre el complejo
inmune/polianión cargado negativamente y la matriz porosa cargada
positivamente tratada previamente, y se detecta usando varios
sistemas generadores de señal previamente descritos, incluyendo
aquellos descritos en mediciones de señales quimioluminiscentes como
se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite
junto con la presente con Nº de serie 921,979 correspondiente con la
publicación EPO Nº 0 273,115, que disfruta de propiedad común y que
se incorpora en la presente invención como referencia.
También, los métodos de la presente invención
pueden adaptarse al uso en sistemas que utilizan tecnología de
micropartículas incluyendo sistemas automáticos y semiautomáticos en
donde la fase sólida comprende una micropartícula. Tales sistemas
incluyen los descritos en las solicitudes pendientes de patente de
Estados Unidos 425,651 y 425,643, que corresponden con las
solicitudes publicadas EPO Nº EP 0 425 633 y EP 0 424 634,
respectivamente.
El uso de microscopía de barrido por sonda (SPM)
para inmunoensayos también es una tecnología a la que los
anticuerpos monoclonales de la presente invención se adaptan
fácilmente. En la microscopía de barrido por sonda, en particular en
la microscopia de fuerza atómica, en la fase de captura, por
ejemplo, al menos uno de los anticuerpos monoclonales de la
invención, se adhiere a una fase sólida y se utiliza un microscopio
de barrido por sonda para detectar los complejos
antígeno/anticuerpo que puede estar presentes en la superficie de
la fase sólida. El uso de microscopía de efecto túnel de barrido
elimina la necesidad de marcadores que normalmente han de utilizarse
en muchos sistemas de inmunoensayo para detectar los complejos
antígeno/anticuerpo. Tal sistema se describe en la solicitud de
patente pendiente de Estados Unidos con Nº de serie 662,147, que
disfruta de propiedad común.
El uso de SPM para monitorizar las reacciones de
unión específica puede darse de muchas formas. En una realización,
un miembro de una pareja de unión específica (sustancia específica
analito que es el anticuerpo monoclonal de la invención) se une a
una superficie adecuada para el barrido. La unión de la sustancia
específica analito puede ser por adsorción a una pieza de prueba que
comprende una fase sólida de una superficie de plástico o metal,
siguiendo con métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
O puede utilizarse una unión covalente de una pareja de unión
específica (sustancia específica analito) a una pieza de prueba cuya
pieza de prueba comprende una fase sólida de plástico derivado,
metal, silicona o vidrio. Los métodos de unión covalente son
conocidos por los especialistas en la técnica e incluyen varias
formas de unir las parejas de unión específica de forma
irreversible a la pieza de muestra. Si la pieza de prueba es
silicona o vidrio, la superficie puede activarse antes de unir la
pareja de unión específica. Pueden usarse compuestos de silano
activado como el
trietoxi-aminopropil-silano
(disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis, MO),
trietoxi-vinil-silano (Aldrich
Chemical Co., Milwaukee, WI), y
(3-mercapto-propil)-trimetoxi
silano (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) para introducir grupos
reactivos tales como amino, vinilo y tiol, respectivamente. Tales
superficies activadas pueden usarse para unir directamente la pareja
de unión (en los casos de amino o tiol) o la superficie activada
puede además reaccionar con enlazadores tales como glutaraldehído,
bis-(succinimidil)-suberato, SPPD (succinimidil
3-[2-piridilditio] propionato), SMCC
(succinimidil-4-[N-maleimidometil]
ciclohexano-1-carboxilato), SIAB
(succinimidil [4-yodoacetil] aminobenzoato) y SMPB
(succinimidil 4-[1-maleimidofenil] butirato) para
separar la pareja de unión de la superficie. El grupo vinilo puede
oxidarse para proporcionar un medio de enlace covalente. También
puede usarse como anclaje para la polimerización de varios polímeros
tales como ácido poliacrílico, el cual puede proporcionar puntos
múltiples de unión para parejas de unión específicas. La superficie
amino puede reaccionar con dextranos oxidados de varios pesos
moleculares para proporcionar enlazadores hidrófilos de diferente
tamaño y capacidad. Ejemplo de dextranos oxidables incluyen
Dextrano T-40 (peso molecular de 40.000 daltons),
Dextrano T-110 (peso molecular de 110.000 daltons),
Dextrano T-500 (peso molecular de 500.000 daltons),
Dextrano T-2M (peso molecular de 2.000.000 daltons)
(todos ellos disponibles en Pharmacia, LUGAR), o Ficoll (peso
molecular de 70.000 daltons (disponible de Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO). También pueden usarse interacciones polielectrolíticas
para inmovilizar una pareja de unión específica en una superficie
de una pieza de muestra usando técnicas y métodos químicos
descritos en las solicitudes de patente pendientes de Estados
Unidos Nº de serie 150,278, clasificada el 29 de enero de 1988 y Nº
de serie 375,029, clasificada el 7 de julio de 1989, que disfrutan
de propiedad común. El método de unión preferido es por medios
covalentes. Tras la unión de un miembro de unión específico, la
superficie puede tratarse además con materiales tales como suero,
proteínas u otros agentes de bloqueo para minimizar la unión no
específica. La superficie también puede ser barrida en el sitio de
fabricación o antes del uso para verificar su adecuación para los
fines del ensayo. No se espera que el proceso de barrido altere la
propiedades específicas de unión de la pieza de prueba.
Pueden usarse otros varios formatos de ensayo,
incluyendo inmunoensayos tipo "sándwich" y ensayo de sonda
competitivo. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales producidos a
partir de las proteínas de la presente invención puede emplearse en
varios sistemas de ensayo para determinar la presencia, si la hay,
de proteínas de HCV en una muestra de ensayo. También pueden usarse
los fragmentos de estos anticuerpos monoclonales proporcionados. Por
ejemplo, en un primer formato de ensayo, un anticuerpo policlonal o
monoclonal anti-HCV o fragmento de éste, o una
combinación de estos anticuerpos, que están cubriendo una fase
sólida, se pone en contacto con una muestra de ensayo que puede
contener proteínas de HCV, para formar una mezcla. Esta mezcla se
incuba durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar
complejos antígeno/anticuerpo. Entonces, un reactivo indicador que
comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento de
éstos, que específicamente se une al fragmento de HCV, o una
combinación de estos anticuerpos, al que se ha unido un componente
que genera una señal, se pone en contacto con los complejos
antígeno/anticuerpo para formar una segunda mezcla. Entonces, esta
segunda mezcla se incuba durante un tiempo y bajo las condiciones
suficientes para formar complejos anticuerpo/antígeno/anticuerpo. La
presencia de antígeno de HCV presente en la muestra de ensayo y
capturado en la fase sólida, si lo hay, se determina por detección
de la señal mensurable generada por el compuesto que genera la
señal. La cantidad de antígeno de HCV presente en la muestra de
ensayo es proporcional a la señal generada.
Alternativamente, un anticuerpo policlonal o
monoclonal anti-HCV, un fragmento de éste o una
combinación de estos anticuerpos que se une a un soporte sólido, la
muestra de ensayo y un reactivo indicador que comprende un
anticuerpo monoclonal o policlonal, o fragmentos de éste, que
especialmente se unen al antígeno de HCV, o una combinación de estos
anticuerpos a los que se une un compuesto que genera la señal, se
ponen en contacto para formar una mezcla. Esta mezcla se incuba
durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar
complejos anticuerpo/antígeno/anticuerpo. La presencia, si la hay,
de proteínas de HCV presentes en la muestra de ensayo y capturada en
la fase sólida se determina por detección de la señal mensurable
generada por el compuesto que genera la señal. La cantidad de
proteínas de HCV presentes en la muestra de ensayo es proporcional a
la señal generada.
En otro formato de ensayo alternativo, uno o una
combinación de uno o más anticuerpos monoclonales de la invención
puede emplearse como sonda competitiva para la detección de
anticuerpos contra una proteína de HCV. Por ejemplo, las proteínas
de HCV, solas o en combinación, pueden cubrir una fase sólida. Una
muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos contra un
antígeno de HCV se incuba entonces con un reactivo indicador que
comprende un compuesto que genera una señal y al menos un anticuerpo
monoclonal de la invención durante un tiempo y bajo condiciones
suficiente para formar complejos antígeno/anticuerpo de la muestra
de ensayo y el reactivo indicador con la fase sólida o del reactivo
indicador con la fase sólida. La reducción en la unión del
anticuerpo monoclonal a la fase sólida puede medirse
cuantitativamente. Una reducción mensurable en la señal comparada
con la señal generada a partir de una muestra de ensayo de hepatitis
NANB negativa confirmada indica la presencia de anticuerpo
anti-HCV en la muestra de ensayo.
Aún en otro método de detección, cada uno de los
anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden emplearse
en la detección de antígenos HCV en cortes de tejido fijados, así
como en células fijadas, por análisis inmunohistoquímico.
Además, estos anticuerpos monoclonales pueden
unirse a matrices similares a Sepharose activada con CNBr y usarse
para la purificación por afinidad de proteínas específicas de HCV a
partir de cultivos celulares, o de tejidos biológicos tales como
sangre e hígado.
Los anticuerpos monoclonales de la invención
puede también usarse para la generación de anticuerpos quiméricos
para uso terapéutico u otras aplicaciones similares.
Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de
éstos puede proporcionarse individualmente para detectar antígenos
de HCV. Las combinaciones de los anticuerpos monoclonales (y
fragmentos de éstos) proporcionados en la presente invención también
puede usarse juntos como componentes de una mezcla o "cocktail"
de al menos un anticuerpo anti-HCV de la invención
con anticuerpos contra otras regiones de HCV, cada uno con
diferentes especificidades de unión. De ese modo, este cocktail
puede incluir los anticuerpos monoclonales de la invención que
están dirigidos contra las proteínas de HCV y otros anticuerpos
monoclonales contra otros determinantes antigénicos del genoma de
HCV.
El anticuerpo policlonal o fragmento de éste que
puede usarse en los formatos del ensayo debería unirse
específicamente a una región específica de HCV o a otras proteínas
de HCV usadas en el ensayo. El anticuerpo policlonal preferiblemente
usado es de origen mamífero; pueden usarse anticuerpos policlonales
de humano, cabra, conejo o carnero anti-HCV. Más
preferiblemente, el anticuerpo policlonal es un anticuerpo
policlonal de conejo anti-HCV. El anticuerpo
policlonal usado en los ensayos puede usarse sólo o como un cocktail
de anticuerpos policlonales. Puesto que los cocktails usados en los
formatos del ensayo están compuestos por anticuerpos monoclonales o
anticuerpos policlonales que tienen especificidad diferente por HCV,
serían útiles para diagnóstico, evaluación y pronóstico de infección
por HCV, así como para estudiar la diferenciación de proteínas y la
especificidad de HCV.
En otro formato de ensayo, puede detectarse la
presencia de anticuerpo y/o antígeno contra HCV en un ensayo
simultáneo como sigue. Una muestra de ensayo se pone simultáneamente
en contacto con un reactivo de captura de un primer analito, en
donde dicho reactivo de captura contiene un primer miembro de unión
específico para un primer analito unido a una fase sólida, y un
reactivo de captura para un segundo analito, en donde dicho
reactivo de captura contiene un primer miembro de unión para un
segundo analito unido a la segunda fase sólida, para formar de este
modo, una mezcla. Esta mezcla se incuba durante un tiempo y bajo
condiciones suficientes para formar complejos reactivo de
captura/primer analito y reactivo de captura/segundo analito.
Entonces, estos complejos así formados se ponen en contacto con un
reactivo indicador que contiene un miembro de un par de unión
específico para el primer analito marcado con un compuesto que
genera una señal y un reactivo indicador que contiene un miembro de
un par de unión específico para el segundo analito marcado con un
compuesto que genera una señal para formar una segunda mezcla. Esta
segunda mezcla se incuba durante un tiempo y bajo condiciones
suficientes para formar complejos reactivo de captura/primer
analito/reactivo indicador y complejos reactivo de captura/segundo
analito/reactivo indicador. La presencia de uno o más analitos se
determina detectando una señal generada en conexión con los
complejos formados sobre una o ambas fases sólidas con una
indicación de la presencia de uno o más analitos en la muestra de
ensayo. En este formato de ensayo, puede utilizarse proteínas
derivadas de los sistemas de expresión humanos, así como anticuerpos
monoclonales producidos a partir de proteínas derivadas de los
sistemas de expresión de mamíferos como se describe en la presente
invención. Tales sistemas de ensayo se describen con gran detalle en
la solicitud de patente pendiente de Estados Unidos Nº de serie
07/574,821 titulada Ensayo simultáneo para la detección de uno o más
analitos, clasificada el 29 de agosto de 1990, que disfruta de
propiedad común.
Aún en otros formatos de ensayo, pueden
utilizarse proteínas recombinantes para detectar la presencia de
anti-HCV en las muestras problema. Por ejemplo, una
muestra de ensayo se incuba con una fase sólida en la cual al menos
se ha unido una proteína recombinante. Éstas reaccionan durante un
tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos
antígeno/anticuerpo. Tras la incubación, se detecta el complejo
antígeno/anticuerpo. Se pueden usar reactivos indicadores para
facilitar la detección, dependiendo del sistema de ensayo escogido.
En otro formato de ensayo, una muestra de ensayo se pone en contacto
con una fase sólida a la que se ha unido una proteína recombinante
producida como se describe en la presente invención y también se
pone en contacto con un anticuerpo monoclonal o policlonal
específico para la proteína, que preferiblemente se ha marcado con
un reactivo indicador. Después de la incubación durante un tiempo y
bajo condiciones suficientes para que se formen complejos
anticuerpo/antígeno, la fase sólida se separa de la fase libre, y se
detecta el marcaje en la fase sólida o en la libre como una
indicación de la presencia de anticuerpo HCV. Se contemplan otros
formatos de ensayo utilizando las proteínas de la presente
invención. Estos incluyen poner en contacto una muestra de ensayo
con una fase sólida a la que se ha unido al menos una proteína
recombinante producida en el sistema de expresión de mamíferos,
incubar la fase sólida y la muestra de ensayo durante un tiempo y
bajo unas condiciones suficientes como para que se formen los
complejos antígeno/anticuerpo, y entonces poner en contacto la fase
sólida con un antígeno recombinante marcado. Ensayos tales como este
y otros se describen en la solicitud de patente pendiente de Estados
Unidos Nº de serie 07/787,710, que disfruta de propiedad común.
Mientras que la presente invención describe la
preferencia del uso de fases sólidas, se contempla que las
proteínas de la presente invención puedan utilizarse en sistemas de
ensayo en fase no sólida. Estos sistemas de ensayo son conocidos por
los especialistas en la técnica y se considera que están dentro del
alcance de la presente invención.
Ahora la presente invención será describa por
medio de ejemplo, que quieren ilustrar, pero no limitar, el espíritu
y el alcance de la invención.
El ARN aislado a partir del suero o plasma de un
chimpancé (designado como "CO") infectado experimentalmente con
HCV, o de un paciente humano seropositivo para HCV (designado como
"LG") se transcribieron a ADNc usando la transcriptasa inversa
empleando cebadores hexaméricos aleatorios o cebadores antisentido
específicos derivados de la secuencias prototipo de
HCV-1. La secuencia ha sido publicado por Choo et
al. (Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:2451-2455 [1991], y está disponible a través de
la base de datos GenBank, Nº de acceso M62321). Entonces, esta ADNc
se amplificó usando PCR y ADN polimerasa AmpliTaq® (disponible en el
kit Gene Amp® de Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conneticut 06859)
empleando un segundo cebador sentido colocado aproximadamente 1.000
a 2.000 nucleótidos secuencia arriba del cebador específico
antisentido o un par de cebadores sentido y antisentido flaqueando
un fragmento de 1.000 a 2.000 nucleótido de HCV. Después de 25 a 35
ciclos de amplificación siguiendo procedimientos estándar conocidos
en la técnica, una alícuota de esta mezcla de reacción se sometió a
PCR anidada (o "PCR-2"), en donde se emplea un
par de cebadores sentido y antisentido localizados en el interior
del par de cebadores de PCR original para una amplificación
adicional de segmentos del gen de HCV en cantidades suficientes para
análisis y subclonación, utilizando secuencias de reconocimiento de
endonucleasas presentes en la segunda pareja de cebadores de PCR. De
esta forma, se generaron siete fragmentos de ADN contiguo de HCV que
entonces podrían unirse usando la estrategia de generación de
clonación presentada y descrita en la figura 1. La localización de
los cebadores específicos usados de esta manera se presentan en la
tabla 1 y se numeran según la secuencia de HCV-1
publicada por Choo et al. (Base de datos de GenBank, Nº de
acceso M62321). Tras el montaje, la secuencia de ADN de cada uno de
los fragmentos individuales se determinó y se tradujo en las
secuencias genómicas de aminoácidos presentadas en las Secuencias
ID. Nº 1 y 2, respectivamente, para CO y LG, respectivamente. La
comparación del polipéptido genómico de CO con la de
HCV-1 demostró diferencias en 98 aminoácidos. La
comparación del polipéptido genómico de CO con la de LG, demostró
diferencias en 150 aminoácidos. La comparación del polipéptido
genómico de LG con la de HCV-1 demostró 134
diferencias de aminoácidos.
La proteína E2 del HCV a partir de CO
desarrollada como se describe en el ejemplo 1, se expresó como una
fusión con el precursor de la proteína amiloide (APP). APP ha sido
descrita por Kang et al. Nature
325:733-736 (1987). Brevemente, los aminoácidos 384
a 749 de HCV de CO aislado se usaron para sustituir la mayoría de la
secuencia codificadora del APP como se muestra en la figura 2. Un
fragmento HindIII-StyI de ADN que representa los 66
aminoácidos del extremo amino terminal en un fragmento
BglII-XbaI que presenta los 105 aminoácidos del
extremo carboxilo terminal de APP se ligaron a un fragmento de PCR
derivado de HCV a partir del CO que representa los aminoácidos 384 a
749 de HCV que contienen sitios de restricción de StyI y BglII en
sus extremos 5' y 3', respectivamente. Entonces, este casete génico
de fusión APP-HCV-E2 se clonó en un
vector de expresión de mamífero disponible comercialmente: pRC/CMV,
mostrado en la figura 3, (disponible en Invitrogen, San Diego, CA)
en los sitios únicos HindIII y XbaI. Tras la transformación en E.
coli DH5a se aisló un clon designado como
pHCV-162, que sitúa la expresión del casete génico
de fusión APP-HCV-E2 bajo el control
del potente promotor CMV. La secuencia de nucleótidos completa del
vector de expresión de mamíferos pHCV-162 se
presenta en la Secuencia ID. Nº 3. La traducción de los nucleótidos
922 hasta 2.535 tuvo como resultado la secuencia de aminoácidos
completa de la proteína de fusión
APP-HCV-E2 expresada por
pHCV-162 como se presenta en la Secuencia ID. Nº
4.
Se usó para todas las transformaciones y análisis
de expresión una línea celular primaria de riñón embriónico humano
(HEK) transformada con el adenovirus humano de tipo 5, designada
como HEK-293. Las células HEK-293 se
mantuvieron en medio mínimo esencial (MEM) que se complementó con
suero fetal bovino al 10% (FCS), penicilina y estreptomicina.
Se transfectaron aproximadamente 20 \mug de ADN
purificado a partir de pHCV-162 en células
HEK-293 usando el protocolo del fosfato cálcico
modificado según publicaron Chen et al., Molecular and
Cellular Biology 7(8):2745-2752 (1987).
La solución de fosfato cálcico-ADN se incubó sobre
las células HEK-293 durante aproximadamente 15 a 24
horas. La solución se eliminó, las células se lavaron dos veces con
medios MEM, y entonces las células se incubaron en medios MEM por
un período adicional de 24 a 48 horas. Para analizar la expresión de
proteína, las células transfectadas se marcaron metabólicamente con
100 \muCi/ml de metionina S-35 y cisteína durante
12 a 18 horas. Los medios de cultivo se eliminaron y se
almacenaron, y las células se lavaron en medios MEM y entonces se
lisaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía
Triton X-100® al 1% (disponible en Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO), dodecil sulfato sódico al 0,1% (SDS), y
deoxicolato al 0,5%, designado como PBS-TDS.
Entonces, este lisado celular se congeló a -70ºC durante 2 a 24
horas, se descongeló en hielo y luego se clarificó por
centrifugación a 50.000 x fuerza g durante una hora a 4ºC. Entonces,
se llevaron a cabo ensayos de radioinmunoprecipitación estándar
(RIPA) en aquellos lisados de células marcadas y/o medios de
cultivo. Brevemente, los lisados de células marcadas y/o los medios
de cultivo se incubaron con 2 a 5 \mul de sueros específicos a 4ºC
durante una hora. Luego se añadió Proteína
A-Sepharose y se incubaron las muestras durante una
hora más a 4ºC con agitación. Entonces, se centrifugaron las
muestras y los sedimentos se lavaron varias veces con tampón
PBS-TDS. Las proteínas recuperadas por
inmunoprecipitación se eluyeron calentando en un tampón de muestra
de electroforesis (Tris-HCl 50 mM, pH 6,8,
ditiotreitol [DTT] 100 mM, SDS al 2%, azul de bromofenol al 0,1% y
glicerol al 10%) durante cinco minutos a 95ºC. Entonces, las
proteínas eluidas se separaron en geles de poliacrilamida SDS que
posteriormente se trataron con un agente fluorográfico tal como
Enlightening® (disponible en NEN [DuPont], Boston, MA), se secaron
al vacío y se expusieron a una placa de rayos X a -70ºC con
pantallas intensificadoras. La figura 4 muestra un análisis RIPA
del lisado de células HEK transfectadas con pHCV-162
precipitado con suero humano normal (NHS), un anticuerpo monoclonal
dirigido contra las secuencias de APP que se sustituyeron en esta
construcción (MAB), y unos sueros humanos positivos para anticuerpo
contra HCV (Nº 25). También se muestra en la figura 4 los medios de
cultivo (sobrenadante) precipitados con los mismos sueros humanos
positivos para anticuerpo contra HCV (Nº 25). A partir de la figura
4, se puede distinguir que mientras que en los medios de cultivo de
las células HEK-293 transfectadas con
pHCV-162 sólo se detectan bajos niveles de una
proteína específica de HCV de aproximadamente 75K daltons, son
evidentes altos niveles de expresión de proteína intracelular de la
proteína de fusión APP-HCV-E2 de
aproximadamente 70K daltons.
Para una caracterización más detallada de esta
proteína de fusión APP-HCV-E2, se
usó un anticuerpo policlonal de conejo obtenido contra péptidos
sintéticos en un RIPA similar, los resultados de la cual se ilustran
en la figura 5. Como puede distinguirse a partir de esta figura, el
suero de conejo normal (NRS) no precipita la proteína de 70K
daltons mientras que los sueros obtenidos contra los aminoácidos
509 a 551 (6512) de HCV, los aminoácidos 380 a 436 (6521) de HCV y
los aminoácidos 45 a 62
(anti-N-terminal) de APP son
altamente específicos para la proteína de fusión
APP-HCV-E2 de 70K daltons.
Para aumentar la secreción de esta proteína de
fusión APP-HCV-E2, se generó otro
clon en el que se fusionó sólo los 66 aminoácidos del extremo
amino-terminal del APP, que contiene las supuestas
secuencias señal de secreción de las secuencias
HCV-E2. Además, se delecionó una secuencia
fuertemente hidrófoba en el extremo
carboxilo-terminal de la secuencia
HCV-E2 que se identificó como una potencial región
transmembrana. El clon resultante se designó como
pHCV-167 y se ilustra esquemáticamente en la figura
2. La secuencia de nucleótidos completa del vector de expresión de
mamíferos pHCV-167 se muestra en la Secuencia ID. Nº
5. La traducción de los nucleótidos 922 hasta el 2.025 tuvo como
resultado la secuencia completa de aminoácidos de la proteína de
fusión APP-HCV-E2, expresada por
pHCV-167 como se muestra en la Secuencia ID. Nº 6.
El ADN purificado de pHCV-167 se transfirió a
células HEK-293 y se analizó por RIPA y por geles
de poliacrilamida SDS como se describe previamente en la presente
invención. La figura 6 muestra los resultados en los que una muestra
de suero humano normal (NHS) falla en reconocer la proteína de
fusión APP-HCV-E2 presente en el
lisado celular o en el sobrenadante celular de las células
HEK-293 transfectadas con pHCV-167.
La muestras de control positivo de HCV (Nº 25), sin embargo,
precipita una proteína de fusión
APP-HCV-E2 de aproximadamente 65K
daltons presente en el lisado celular de las células
HEK-293 transfectadas con pHCV-167.
Además, se precipitaron de los medios de cultivo cantidades
sustanciales de proteína APP-HCV-E2
secretada de aproximadamente 70K daltons con suero Nº 25.
Se llevó a cabo una digestión con
endoglicosidasa-H (Endo-H) para
determinar la extensión y la composición de la glicosilación unida a
N en las proteínas de fusión
APP-HCV-E2 expresadas por
pHCV-167 y pHCV-162 en células
HEK-293. Brevemente, se precipitaron alícuotas
múltiples de lisados celulares marcados a partir de células
HEK-293 transfectadas con pHCV-162 y
pHCV-167 con suero humano Nº 50 que contenía
anticuerpo contra HCV E2 como se ha descrito previamente. Entonces,
los sedimentos de proteína A-Sepharose que contenían
los complejos proteína-anticuerpo inmunoprecipitados
se resuspendieron en tampón (acetato sódico 75 mM, SDS al 0,05%) que
contenía o no 0,05 unidades por ml de Endo-H
(Sigma). Las digestiones se llevaron a cabo a 37ºC durante 12 a 18
horas y todas las muestras se analizaron en geles de poliacrilamida
SDS como se ha descrito previamente. La figura 7 muestra los
resultados de la digestión con Endo-H. Los
marcadores de peso molecular (PM) marcados con
carbono-14 (obtenidos de Amersham, Arlington
Height, IL) son comunes en todos los geles y representa 200K, 92,5K,
69K, 46;, 30K y 14,3 K daltons, respectivamente. El suero humano
normal (NHS) no inmunoprecipita la proteína de fusión
APP-HCV-E2 expresada por
pHCV-162 o por pHCV-167, mientras
que el suero humano positivo para el anticuerpo HCV E2 (Nº 50)
fácilmente detecta la proteína de fusión
APP-HCV-E2 de 72K daltons en
pHCV-162 y la proteína de fusión
APP-HCV-E2 de 65K daltons en
pHCV-167. La incubación de estas proteínas
inmunoprecipitadas en ausencia de Endo-H (Nº 50
-Endo-H) no afecta significativamente a la cantidad
o movilidad de las proteínas expresadas por pHCV-162
o pHCV-167. La incubación en presencia de
Endo-H (Nº 50 + Endo-H) sin embargo,
reduce drásticamente la movilidad de las proteínas expresadas por
pHCV-162 y pHCV-167, produciendo una
distribución de tamaño heterogéneo. El peso molecular predicho para
el esqueleto polipeptídico no glicosilado de
pHCV-162 es de aproximadamente 59K daltons. El
tratamiento con Endo-H de pHCV-162
reduce la movilidad a un mínimo de aproximadamente 44K daltons, lo
que indica que la proteína de fusión
APP-HCV-E2 producida por
pHCV-162 se escinde proteolíticamente en el extremos
carboxilo-terminal. Un tamaño de aproximadamente 44K
daltons concuerda con la escisión de 720 aminoácidos en o cerca de
HCV. Igualmente, el tratamiento con Endo-H de
pHCV-167 reduce la movilidad a un mínimo de
aproximadamente 41K daltons, que favorablemente se compara con el
peso molecular predicho de aproximadamente 40K daltons de la
proteína de fusión intacta
APP-HCV-E2 expresada por
pHCV-167.
Se usaron el ensayo de radioinmunoprecipitación
(RIPA) y los análisis en gel de poliacrilamida SDS descritos
previamente para analizar en las numerosas muestras de suero la
presencia de anticuerpo dirigido contra epítopos de HCV E2. Las
células HEK-293 transfectadas con
pHCV-162 se marcaron metabólicamente y se prepararon
los lisados como se ha descrito previamente. Además del análisis
RIPA, en todas las muestras de suero se analizó la presencia de
anticuerpos dirigidos contra antígenos recombinantes específicos de
HCV que representan áreas distintas del genoma HCV usando el Abbott
Matrix® System (disponible en Abbott Laboratories, Abbott Park, IL
60064, patente de Estados Unidos Nº 5,075,077). En los datos de
Matrix mostrados en las tabla 2 a 7, C100 levadura representa la
región NS4 que contiene los aminoácidos 1.569 a 1.930 del HCV, C100
E. coli representa los aminoácidos 1676 a 1930 de HCV, NS3
representa los aminoácidos 1.192 a 1.457 de HCV, y NÚCLEO representa
los aminoácidos 1 a 150 de HCV.
La figura 8 muestra un resultado representativo
de RIPA obtenido usando un lisado celular de
pHCV-162 para seleccionar donantes de sangre
americanos y receptores de transfusiones positivos para anticuerpos
contra HCV. La tabla 2 resume el perfil de anticuerpo de estas
diversas muestras de sangre de americanos, con siete de las 17
muestras (41%) mostrando anticuerpos contra HCV E2. Se ha demostrado
la variabilidad genómica de la región E2 entre los diferentes HCV
aislados, particularmente en aislados distintos geográficamente que
puede llevar a diferencias en las respuestas anticorpales. Por
tanto, hemos analizado la presencia de anticuerpos específicos
contra la proteína de fusión
APP-HCV-E2 expresada por
pHCV-162 en veintiséis donantes voluntarios de
sangre japoneses y veinte pacientes hispanos en hemodiálisis que
previamente mostraron contener anticuerpos HCV. Las figuras 9 y 10
muestran los análisis por RIPA de los veintiséis donantes
voluntarios de sangre japonenses. El control positivo de sueros
humanos (Nº 50) y los estándares de peso molecular (PM) aparecen en
ambas figuras en las que se demuestra la inmunoprecipitación
específica de la proteína de fusión
APP-HCV-E2 de aproximadamente 72K
daltons en varias de las muestras de suero testadas. La tabla 3
muestra los resultados de RIPA de
APP-HCV-E2 y del Abbott Matrix®
resumiendo los perfiles de anticuerpo de cada una de las veintiséis
muestra de japoneses testadas. La tabla 4 muestran los datos
similares para los 20 pacientes hispanos en hemodiálisis testados.
La tabla 5 resume los resultados del RIPA obtenidos usando
pHCV-162 para detectar anticuerpo específico contra
E2 de HCV en estas muestras diversas. Dieciocho de los veintiséis
(69%) donantes voluntarios de sangre japoneses, catorce de los 20
(70%) pacientes hispanos en hemodiálisis y siete de los diecisiete
(41%) donantes de sangre o receptores de transfusión americanos
mostraron una respuesta específica contra la proteína de fusión E2
del HCV. La amplia reactividad demostrada por la proteína de fusión
APP-HCV-E2 expresada por
pHCV-162 sugiere el reconocimiento de epítopos
conservados en E2 del HCV.
Sangrados seriados a partir de cinco receptores
de transfusión seroconvertidos para anticuerpos HCV también se
analizaron usando la proteína de fusión
APP-HCV-E2 expresada por
pHCV-162. Este análisis se llevó a cabo para
determinar el intervalo de tiempo tras la exposición a HCV al cual
pueden detectarse los anticuerpos específicos contra E2. La tabla 6
muestra uno de tales pacientes (AN) que se reconvirtió a NS3 a los
154 días postransfusión (DPT). Los anticuerpos contra E2 del HCV
no se detectaron por RIPA hasta los 271 DPT. La tabla 7 muestra
otro de estos paciente (WA), que se reconvirtió para el núcleo en
algún momento antes de los 76 DPT y que era positivo para
anticuerpos contra E2 del HCV en la siguiente fecha disponible de
sangrado (103 DPT). La tabla 8 resume los resultados serológicos
obtenidos a partir de estos cinco receptores de transfusión
indicando que (a) cierto perfil general de anticuerpos en la
seroconversión (Estado AB); (b) los días postranfusión a los que un
ensayo de ELISA detectaría con más probabilidad anticuerpos contra
HCV (2.0 GEN); (c) las muestras en la que el anticuerpo contra E2
del HCV se detectó por RIPA (Estado E2 AB); y (d) el intervalo de
tiempo cubierto por las fechas de sangrado probadas (Muestras
testadas). Los resultados indican que el anticuerpo contra E2 del
HCV, como se detecta en el procedimiento de RIPA descrito aquí,
aparece tras la seroconversión para al menos uno de los otros
marcadores de HCV (NÚCLEO, NS3, C100, etc) y es continuo de forma
natural una vez que aparece. Además, la ausencia de anticuerpo para
el gen estructural de NÚCLEO aparece altamente correlacionada con
la ausencia de anticuerpo detectable contra E2, otro supuesto
antígeno estructural. Está en curso un trabajo más detallado para
correlacionar la presencia o ausencia de anticuerpos contra un gene
específico de HCV con la progresión de la enfermedad y/o el
intervalo de tiempo desde la exposición a los antígenos
virales.
Se generaron fragmentos de ADN del HCV que
representaban a E1 del HCV (aminoácidos 192 a 384 del HCV) y a E2
del HCV (aminoácidos 384 a 750 y 384 a 684 del HCV) a partir del CO
aislado, usando PCR como se describe en el ejemplo 2. Se usó un
sitio de restricción de EcoRI para unir un oligonucleótido
sintético que codificaba para la señal de secreción de la hormona
de crecimiento humana (HGH) (Blak et al., Oncogene, 3,
129-136, 1988) en el extremo 5' de esta secuencia
del HCV. Entonces, se clonó el fragmento resultante en el vector de
expresión de mamíferos pCDNA-I disponible
comercialmente, (disponible en Invitrogen, San Diego, California)
ilustrado en la figura 11. Tras la transformación en E.coli
MC1061/P3, los clones resultantes ponen la expresión de las
secuencias clonadas bajo el control específico del potente promotor
CMV. Tras los métodos resumidos anteriormente, se aisló un clon
capaz de expresar HCV-E1 (aminoácidos 192 a 384 del
HCV) empleando la seña de secreción de HGH en el extremo
amino-terminal. El clon se designó como
pHCV-168 y se ilustra esquemáticamente en la figura
12. De forma similar, se aislaron los clones capaces de expresar E2
del HCV (aminoácidos 384 a 750 ó 384 a 684 de HCV) empleando la
señal de secreción de HGH, designados como pHCV-169
y pHCV-170, respectivamente e ilustrados en la
figura 13. La secuencia completa de nucleótidos de los vectores de
expresión pHCV-168, pHCV-169 y
pHCV-170 se muestran en las Secuencias ID. Nº 7, 9
y 11, respectivamente. La traducción de los nucleótidos 2.227 hasta
2.913 tiene como resultado la secuencia completa de aminoácidos de
la proteína de fusión HGH-HCV-E1
expresada por pHCV-168 como se muestra en la
Secuencia ID. Nº 8. La traducción de los aminoácidos 2.227 hasta
3.429 tiene como resultado la secuencia completa de aminoácidos de
la proteína de fusión HGH-HCV-E2
expresada por pHCV-169 como se muestra en la
Secuencia ID. Nº 10. La traducción de los nucleótidos 2.227 a 3.228
tiene como resultado la secuencia completa de aminoácidos de la
proteína de fusión HGH-HCV-E2
expresada por pHCV-170 como se muestra en la
Secuencia ID. Nº 12. El ADN purificado a partir de
pHCV-168, pHCV-169 y
pHCV-170 se transfirió a las células
HEK-293 que entonces se marcaron metabólicamente, se
prepararon los lisados celulares y se llevaron a cabo análisis de
RIPA como se describe previamente en la presente invención. Siete
muestras de suero que previamente mostraron contener anticuerpos
contra la proteína de fusión
APP-HCV-E2 expresada por
pHCV-162 se analizaron contra los lisados celulares
marcado de pHCV-168, pHCV-169 y
pHCV-170. La figura 14 muestra el análisis de RIPA
de pHCV-168 y demostró que cinco sueros que
contienen anticuerpos contra E2 del HCV también contienen
anticuerpos contra E1 del HCV dirigidos contra una proteína de
fusión HGH-HCV-E1 de aproximadamente
33K daltons (Nº 25, Nº 50, Nº 121, Nº 503 y Nº 728), mientras que
otros dos sueros no contienen esos anticuerpos (Nº 476 y Nº 505).
La figura 15 muestra los resultados de RIPA obtenidos cuando se
analizaron los mismos sueros indicados anteriormente contra los
lisados celulares marcados de pHCV-169 o
pHCV-170. Los siete sueros positivos para
anticuerpos contra E1 del HCV detectan dos especies de proteína de
aproximadamente 70K y 75K daltons en células transformadas con
pHCV-168. Estas dos especies diferentes de la
proteína HGH-HCV-E2 podrían ser el
resultado de la escisión proteolítica incompleta de la secuencia de
E2 del HCV en el extremo carboxilo terminal (en o cerca del
aminoácido 720 de HCV) o a partir de diferencias en el
procesamiento de carbohidratos entre las dos especies. Los siete
sueros positivos para anticuerpos contra E2 del HCV detectaban una
única especie de proteína de aproximadamente 62K daltons para la
proteína de fusión HGH-HCV-E2
expresada en pHCV-170. La tabla 9 resume el perfil
serológico de seis de los siete sueros positivos para anticuerpos
contra E2 de HCV analizados contra la proteína de fusión
HGH-HCV-E1 expresada en pHCV. Está
en curso un trabajo más detallado para correlacionar la presencia o
ausencia de anticuerpos contra un gene específico de HCV con la
progresión de la enfermedad y/o el intervalo de tiempo desde la
exposición a los antígenos virales.
Los clones pHCV-167 y
pHCV-162 se han depositado en la American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland,
20852, el 17 de enero de 1992 bajo los términos del tratado de
Budapest, y se acordaron los siguientes números de designación de la
ATCC: para el clon pHCV-167 se acordó el número de
depósito de la ATCC 68893 y para el clon pHCV-162 se
acordó en número de depósito de la ATCC 68894. Los clones
pHCV-168, pHCV-169 y
pHCV-170 se han depositado en la American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852
el 26 de enero de 1993 bajo los términos del tratado de Budapest, y
se acordaron los siguientes números de designación de ATCC: para el
clon pHCV-168 se acordó el número de depósito de la
ATCC 69228, para el clon pHCV-169 se acordó el
número de depósito de la ATCC 69229 y para el clon
pHC-170 se acordó el número de depósito de la ATCC
69230. Los depósitos designados se mantendrán durante un período de
treinta (30) años a partir de la fecha de depósito, o durante cinco
(5) años tras la última solicitud del depósito, o por el periodo
impuesto por la patente de Estados Unidos, el que sea más largo.
Estos depósitos y otros materiales depositados mencionados en la
presente invención se proporcionan sólo por conveniencia, y no se
requiere practicar la invención a la vista de las descripciones de
la presente invención. Las secuencias del ADNc del HCV en todos los
materiales depositadas se incorporan en la presente invención como
referencia.
Otras variaciones de las aplicaciones del uso de
las proteínas y sistemas de expresión de mamíferos proporcionados en
la presente invención serán claras para los especialistas en la
técnica. Por consiguiente, se desea que la invención esté limitada
sólo de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: CASEY, JAMES M.
\hskip3.2cmBODE, SUZANNE L.
\hskip3.2cmZECK, BILLY J.
\hskip3.2cmYAMAGUCHI, JULIE
\hskip3.2cmFRAIL, DONALD E.
\hskip3.2cmDESAI, SURESH M.
\hskip3.2cmDEVARE, SUSHIL G.
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SISTEMAS DE EXPRESIÓN DE MAMÍFEROS PARA PROTEÍNAS DE HCV
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: ABBOTT LABORATORIES D377 / AP6D
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: ONE ABBOTT PARK ROAD
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ABBOTT PARK ROAD
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: IL
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 60064-3500
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatenIn Release No. 1.0, Versión No. 1.25
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: POREMBSKI, PRISCILLA E.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.207
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 5131.PC.01
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 708-937-6365
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 708-937-9556
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3011 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3011 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7298 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 922..2532
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 537 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7106 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 922..2022
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 367 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4810 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2227..2910
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 228 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5323 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2227..3423
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 399 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5125 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2227..3225
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 333 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
Claims (13)
1. El plásmido caracterizado por A.T.C.C.
Nº 68894.
2. El plásmido caracterizado por A.T.C.C.
Nº 68893.
3. El plásmido caracterizado por A.T.C.C.
Nº 69228.
4. El plásmido caracterizado por A.T.C.C.
Nº 69229.
5. El plásmido caracterizado por A.T.C.C.
Nº 69230.
6. La proteína de fusión
APP-HCV-E2 (precursor de la proteína
amiloide-virus de la hepatitis C-E2)
que puede expresarse por el plásmido caracterizado por
A.T.C.C. Nº 68894.
7. La proteína de fusión
APP-HCV-E2 que puede expresarse por
el plásmido caracterizado por A.T.C.C. Nº 68893.
8. La proteína de fusión
HGH-HCV-E2 (hormona del crecimiento
humano-virus de la hepatitis C-E2)
que puede expresarse por el plásmido caracterizado por
A.T.C.C. Nº 69228.
9. La proteína de fusión
HGH-HCV-E2 que puede expresarse por
el plásmido caracterizado por A.T.C.C. Nº 69229.
10. La proteína de fusión
HGH-HCV-E2 que puede expresarse por
el plásmido caracterizado por A.T.C.C. Nº 69230.
11. Un método para detectar un antígeno o
anticuerpo de HCV en una muestra de ensayo sospechosa de contener un
antígeno o anticuerpo de HCV que comprende poner en contacto la
muestra de ensayo con una proteína de fusión de una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 10.
12. Un kit de ensayo para detectar un antígeno o
anticuerpo de HCV en una muestra de ensayo sospechosa de contener un
antígeno o anticuerpo de HCV que comprende:
un recipiente que contiene una proteína de fusión
de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.
13. El kit de ensayo de la reivindicación 12 que
además comprende un anticuerpo que puede producirse usando una
proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a
10.
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