ES2202581T3 - Uso de hialuronan (ha) para la movilizacion celular. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE EL USO DE FORMAS DEL ACIDO HIALURONICO QUE TIENEN UN PESO MOLECULAR INFERIOR A UNOS 750.000 DALTONS, SELECCIONADOS ENTRE EL GRUPO FORMADO POR EL ACIDO HIALURONICO Y LAS SALES FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES DEL MISMO, PARA LOS MISMOS FINES CONOCIDOS EN EL USO DEL GM - CSF O G - CSF RECOMBINANTE.

Description

Uso de hialuronán (HA) para la movilización celular.

Campo de la invención

La invención se refiere generalmente a métodos que utilizan formas exógenas de hialuronán (HA, ácido hialurónico) para movilizar células hematopoyéticas a la circulación, permitiendo diversos métodos de tratamiento de seres humanos, incluyendo mamíferos, incluyendo métodos para obtener el transplante de células hematopoyéticas, métodos para tratar la inmunosupresión, anemia, osteoporosis, métodos para tratar el cáncer, métodos para tratar la alergia y el asma, métodos para realizar transplante de órganos, métodos para realizar transplante de células hematopoyéticas, métodos para tratar el rechazo de órganos / tejidos, métodos para tratar la autoinmunidad y estados del tipo autoinmune y métodos para tratamientos de fertilización in vitro y fertilidad in vivo.

Antecedentes de la invención

El hialuronán es un glucosaminoglicano omnipresente en la matriz extracelular, que ha mostrado jugar un papel central en la embriogénesis, inflamación, cicatrización de heridas y metástasis de tumores.

(Toole, B.P. (1990) Hyaluronan and its bindingproteins, the hyaladherins. Curr. Opin. Cell. Biol. 2: 839-844.

Toole, B.P. (1982). Development role of hyaluronate. Conn Tiss. Res 10: 93-100).

La interacción entre HA y RHAMM, un receptor de la motilidad mediada por HA, se requiere para la conducta motil de una amplia variedad de células incluyendo esperma, fibroblastos, astrocitos, microglía y glóbulos blancos.

(Entwistle, J., Zhang, S., Yang, B., Wong, C., Li, Q., Hall, C.L., Jingbow, A., Mowat, M., Greenberg, A.H. y Turley, E.A., (1995) Characterization of the murine gene encoding the hyaluronan receptor RHAMM Gene 163: 233-238.

Hall, C.L., Yang, B., Yang, X., Zhang, S., Turley, M., Samuel, S., Lage, L.A., Wang, C., Curpen, G.D. y Savani, R.C., (1995). Overexpression of the Hyaluronan Receptor RHAMM is Transforming and Is Also Required for H-ras Transformation. Cell 82: 19-28.

Masellis-Smith, A., Belch, A.R., Mant, M.J., Turley, E.A. y Pilarski., L.M. (1996). Hyaluronan-dependent motility of B cells and leukemic plasma cells in blood, but not of bone marrow plasma cells, in multiple myeloma: Alternate use of receptor for hyaluronan-mediated motility (RHAMM) and CD44. Blood 87: 1891-1899.

Turley, E.A., Belch, A.R., Poppema., S. y Pilarski., L.M. (1993). Expression and function of a receptor for hyaluronan-mediated motility on normal and malignant B lymphocytes. Blood 81: 446-453.

Pilarski., L.M. Miszta, H. y Turley, E.A. (1993). Regulated expression of a receptor for hyaluronan-mediated motility on human thymocytes and T cells. J.Immunol. 150: 4292-4302.

Komouski, B.S., McCoshen, J., Kredentser, J. y Turley, E. (1994). The Regulation of Sperm Motility by a Novel Hyaluronan Receptor. Fertility and Sterility 61: 935-940.

Turley, E.A., Hossain, M.Z., Sorokan, T., Jordan, L.M. y Nagy, J.I. (1994) Astrocyte and microgial motility in vitro is functionally dependent on the hyaluronan receptor RHAMM. Glia 12: 68-80).

Las células que pueblan la sangre se derivan todas de células madre multipotenciales (o pluripotenciales) presentes en la médula ósea. Las células madre multipotenciales proliferan continuamente y se renuevan a sí mismas, pero también dan lugar a células progenitoras comunes. Una vez asignadas, las células progenitoras se diferencian en células precursoras inmaduras de los diversos linajes celulares sanguíneos que, tras etapas de diferenciación adicionales, dan lugar finalmente a células sanguíneas funcionales y maduras, tales como eritrocitos, monocitos, linfocitos y células polimorfonucleares. (Golub, E.S., Green, D.R. (1991) Immunology A Synthesis, 2:205; Kuby, J. (1997) Immunology, 3:50; Roitt, I., Brostoff, J., Male, D. Immunology, 4:2.1). Las células sanguíneas diferenciadas terminalmente pierden generalmente su capacidad de proliferar - de hecho, los eritrocitos y las plaquetas de mamíferos no contienen núcleos - y, por tanto, tienen tiempos de vida finitos. Los granulocitos pueden existir sólo durante cuestión de horas, mientras que los eritrocitos humanos permanecen en la circulación durante más de 100 días. Aunque algunos linfocitos tienen vidas medidas en años, la mayoría son efímeros (por ejemplo, 3 días - 3 semanas). Por tanto, para mantener números estacionarios de tipos particulares de células sanguíneas, debe existir una producción continua de éstos por la médula ósea. Este proceso se conoce como hemopoyesis (hematopoyesis) o el proceso hematopoyético. Aunque queda mucho por aprender, está claro que muchas etapas del proceso hematopoyético (hemopoyesis) están controladas por ciertas citocinas (por ejemplo, GM-CSF y G-CSF y eritropoyetina (EPO)), también conocidas como factores de crecimiento hematopoyético y por ciertos factores microambientales, incluyendo células estromales y componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, hialuronán).

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Clínicamente, el término "movilización" se refiere normalmente al proceso mediante el cual las células abandonan la médula ósea y entran en la sangre. Los expertos en la técnica no conocen el mecanismo por medio del cual se produce esto. Sin embargo, se cree que la movilización se puede ver como la estimulación de la conducta "desadhesiva" por las células hematopoyéticas.

Se cree que en circunstancias normales, las células hematopoyéticas están ancladas en su entorno mediante receptores conocidos como moléculas de adhesión. Estas moléculas de adhesión se unen a componentes de la matriz celular y extracelular dentro de tejidos para anclar la célula o, alternativamente, para permitir su conducta migratoria. Entre los receptores que se creen que son importantes están los que se unen a HA.

Se cree que la movilización implica dos acontecimientos:

1) una liberación de las interacciones de anclaje (desadhesión) y 2) la estimulación de la conducta migratoria. Para alcanzar la circulación desde el tejido linfático o la médula ósea, una célula debe "dejarse ir" de su interacción de anclaje, activar receptores de adhesión implicados en la migración (conducta motil) y, entonces, ejercer en realidad la locomoción a través del tejido, penetrar las paredes celulares endoteliales y entrar en el vaso sanguíneo (intravasar). Se sabe que el HA y los receptores para HA están implicados en la migración celular, motilidad y desadhesión.

La mayoría de las células hematopoyéticas están ancladas en la médula ósea u otros tejidos linfáticos. Se requiere un acontecimiento estimulante / inductor para movilizarlas a la circulación, puesto que este es un proceso activo, no pasivo. La presente práctica implica la administración de una variedad de citocinas, a menudo junto con agentes quimioterapéuticos, para movilizar las células hematopoyéticas a la sangre. El mecanismo para esto es desconocido. Sin embargo, la movilización de células madre, el reclutamiento de células madre hematopoyéticas dentro de la sangre, donde pueden recogerse fácilmente, se realiza clínicamente utilizando G-CSF y GM-CSF con o sin quimioterapia.

(Weaver, C.H., Hazelton, B., Birch, R., Palmer, P., Allen, C., Schwartzberg, L. y West, W. (1995). An analysis of engraftment kinetics as a function of the CD34 content of peripheral blood progenitor ceil collections in 692 patients after the administration of myeloablative chemotherapy. Blood 86: 3961-3969.

Boiron, J.M., Marit, G., Faberes, C., Cony-Makhoul, P., Foures, C., Ferrer, A.,M., Cristol, C., Sarrat, A., Girault, D. y Reiffers, J. (1993) Collection of peripheral blood stem cells in mutltiple myeloma following single high-dose cyclophosphamide with and without recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rh GM-CSF). Bone Marrow Transplantation 12: 49-55.

Schiller, G., Vescio, R., Freytes, C., Spitzer, G., Sahebi, F., Lee, M., Wu, C.H., Cao, J., Lee, J.C., Hong, C.H., Lichtenstein, A., Lill, M., Hall, J., Berenson, R. y Berenson, J. (1995) Transplantation of CD34+ peripheral blood progenitor cells after high-dose chemotherapy for patientes with advanced multiple myeloma. Blood 86: 390-397).

Las colecciones de células madre sanguíneas periféricas movilizadas (PBSC) que resultan del uso de G-CSF o GM-CSF se transplantan a, por ejemplo, un enfermo de cáncer. Éstas pueden ser o bien la población total de los glóbulos blancos movilizados o bien células madre purificadas. Las células madre son aquellas células que pueden reconstituir el sistema hematopoyético de un organismo, lo que requiere la autorenovación de las células madre así como la diferenciación a las células de los diversos linajes hematopoyéticos. El marcador CD34 es característico de las células madre. Otras células que se movilizan incluyen glóbulos blancos polimorfonucleares (células que median la inflamación y la depuración de patógenos), glóbulos blancos mononucleares (linfocitos y monocitos) y células progenitoras de glóbulos rojos (eritroblastos).

La movilización de las células madre CD34+ es una técnica clínica en rápida expansión para obtener material para el transplante hematopoyético alógeno o autólogo. La movilización de polimorfos es un complemento valioso de la quimioterapia intensa para mantener los mecanismos de defensa innatos. Actualmente, ambos métodos confían en la movilización mediante factores de crecimiento (G-CSF o GM-CSF), lo que es caro, produce dolor de huesos y tiene efectos secundarios desconocidos para donantes normales. Lleva hasta aproximadamente 4 semanas de tratamiento recoger suficiente material para un transplante. Tras el tratamiento con factor de crecimiento, las células CD34+ alcanzan un nivel máximo del 2-4% en sangre.

Las células maduras del sistema hematopoyético incluyen eritrocitos, células polimorfonucleares (PMN), linfocitos, monocitos, macrófagos, osteoblastos, osteoclastos, mastocitos y plaquetas. Todos ellos tienen una vida limitada y deben reemplazarse cuando mueren. Para conseguir un equilibrio entre la muerte y la renovación celular, la médula ósea no sólo debe proporcionar continuamente células progenitoras, sino también controlar la asignación de éstas a los diversos linajes de modo que se produzcan las proporciones correctas de células maduras. Los mecanismos de control básicos, especialmente de las etapas iniciales de la hematopoyesis, se entienden escasamente todavía. Parece haber cierta compartimentación de la médula y se han identificado "nidos" microscópicos de células precursoras particulares. Sin embargo, se ha demostrado que la supervivencia y proliferación de las células madre y progenitoras depende de la presencia de células accesorias que, in vitro, forman una capa "estromal" adherente. En ausencia de la capa estromal, las células madre y progenitoras mueren y así, parece que las células estromales ayudan en la proliferación y la diferenciación mediante interacciones intercelulares que incluyen la producción de factores de crecimiento en el medio extracelular. En cultivo, las células estromales han demostrado producir GM-CSF, M-CSF y un factor estimulante de colonias de megacariocitos (o moléculas funcionalmente equivalentes a éstas). Comúnmente se cree que tales factores de crecimiento (citocinas) están implicados en la hemopoyesis, pero permanece (n) sin aclarar su(s) papel (es) exacto (s) en la autorenovación de las células madre, la diferenciación de las células madre en células progenitoras comunes y la proliferación y diferenciación de las células progenitoras asignadas. Se han manifestado papeles más confirmados de estas citocinas en la estimulación del crecimiento y el desarrollo de precursores de "fase tardía" mediante el uso de sistemas de cultivo formadores de colonias in vitro presentados por Metcalf y sus colegas en los años 70. En estos sistemas experimentales, se suspenden células madre multipotenciales, progenitoras o precursores en ausencia de células estromales en medio de crecimiento de agar semisólido. Sin la adición de citocinas exógenas, las células mueren. Sin embargo, pueden estimularse a crecer, multiplicarse y diferenciarse para formar colonias de diversos linajes de células sanguíneas añadiendo al medio de crecimiento disoluciones de ciertos sobrenadantes obtenidos a partir de leucocitos activados o mediante la adición de las citocinas recombinantes purificadas disponibles ahora fácilmente, incluyendo GM-CSF. Además, la inyección de citocinas recombinantes a animales de experimentación y a pacientes en ensayos clínicos para evaluar el potencial terapéutico de los productos de citocina individuales, ha demostrado que IL-3, GM-CSF y G-CSF estimulan la producción de glóbulos blancos, tales como granulocitos y monocitos, apoyando, por tanto, a los papeles fisiológicos de tales citocinas. Además, también se ha vuelto evidente que estas citocinas no sólo ayudan en el crecimiento y la diferenciación de células sanguíneas inmaduras, sino que también, en muchos casos, son moléculas efectoras para la activación funcional de células maduras.

Se ha conseguido la clonación tanto de homólogos murinos como de humanos de IL-3, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-5 y EPO.

De las cuatro CSF "granulocito-macrófago", GM-CSF fue el primero en ser aislado y caracterizado. GM-CSF demostró inducir la proliferación de células hematopoyéticas derivadas de bazo o médula ósea murinas que contienen células progenitoras de granulocitos y macrófagos, dando lugar a colonias que contienen principalmente precursores de granulocitos y macrófagos. A este respecto, GM-CSF parece compartir propiedades biológicas con IL-3, caracterizado posteriormente. Sin embargo, estudios más recientes sugieren que GM-CSF actúa sobre las células multipotenciales de "fase tardía" en lugar de IL-3. También, GM-CSF parece ser menos activo que IL-3 estimulando la proliferación de precursores eritroides y megacariocíticos. Sin embargo, puede demostrarse que GM-CSF, como IL-3, tiene actividades en células maduras de los linajes de granulocitos y macrófagos.

GM-CSF (Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos-Macrófagos) actúa directa y selectivamente sobre las células progenitoras de granulocitos / macrófagos para estimular el crecimiento y la difernciación in vitro de células que pertenecen a estos linajes, por ejemplo, neutrófilos, eosinófilos, macrófagos. Se han demostrado estas actividades pleotrópicas para GM-CSF recombinante. Además de la regulación de la proliferación y diferenciación de las células progenitoras / precursoras del linaje mieloide, se ha demostrado también que GM-CSF activa las funciones de los tipos celulares mieloides maduros. Por ejemplo, se ha encontrado que GM-CSF induce actividad tumoricida a los macrófagos frente a la línea celular de melanoma maligno, A375. IFN\gamma también puede comportarse como un factor activador de macrófagos, pero al contrario que GM-CSF, requiere un estímulo secundario adicional, por ejemplo, LPS bacteriano, para provocar la actividad tumoricida. Además, GM-CSF activa los macrófagos para inhibir la replicación de Trypanosoma cruzi (un parásito unicelular que es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana) y aumenta los procesos oxidativos respiratorios. Además, se ha demostrado que se inhibe moderadamente la replicación de HIV-1 en la línea celular monocítica humana, U937, por GM-CSF y más eficazmente por la combinación de GM-CSF e IFN\gamma. Estos resultados sugieren que GM-CSF podría tener un papel fisiológico potencial en la activación de eosinófilos y macrófagos y así, posiblemente podría utilizarse profiláctica o terapéuticamente frente a una gama de agentes microbianos que se replican en macrófagos.

En neutrófilos y eosinófilos, GM-CSF estimula varias funciones. En particular, GM-CSF potencia la fagocitosis de bacterias y levaduras por los neutrófilos. También se ha demostrado que GM-CSF humano recombinante purificado potencia la actividad citotóxica de los neutrófilos y eosinófilos frente a células diana revestidas por anticuerpos. Estas observaciones y otras en las que las funciones antimicrobianas de neutrófilos y eosinófilos aumentan por GM-CSF, sugieren convincentemente un papel importante para este mediador en la defensa del huésped.

Cuando se inyecta repetidamente a ratones de forma intraperitoneal con GM-CSF murino recombinante, hay un aumento rápido y sostenido en el número y la actividad funcional de los macrófagos peritoneales, granulocitos (neutrófilos y eosinófilos), así como un aumento del número de monocitos circulantes (al GM-CSF normalmente le lleva aproximadamente dos semanas actuar). También se han observado aumentos marcados en el número de neutrófilos, eosinófilos y monocitos tras la inyección de GM-CSF humano recombinante a pacientes con SIDA y primates no humanos. Sin embargo, puede haber complicaciones asociadas con el tratamiento de GM-CSF. Metcalf y colegas han demostrado que los ratones transgénicos que contienen un gen GM-CSF murino expresado constitutivamente, tienen lesiones patológicas poco después del nacimiento en varios tejidos, incluyendo el cristalino, retina y músculo estriado, resultante de la infiltración activada por macrófagos. Por tanto, debe evitarse la activación del macrófago crónica en planes de tratamiento con GM-CSF. (Se conoce que los macrófagos activados producen varios mediadores inflamatorios, incluyendo citocinas tales como TNF\alpha e IL-1, que pueden inducir lesión tisular).

A diferencia de sus efectos estimulantes del crecimiento, GM-CSF puede actuar como un factor de diferenciación. Sus acciones sobre macrófagos y neutrófilos maduros, por ejemplo, podrían considerarse como consecuencias de su capacidad de inducir la diferenciación. Una manera de limitar la proliferación de células tumorales es desacoplar la autorenovación dirigida por el factor de crecimiento de la diferenciación inducida por el factor de crecimiento. En otras palabras, cuanto más "diferenciadas" se vuelven las células tumorales, menos capaces son de multiplicarse. A este respecto, GM-CSF ha demostrado inducir la diferenciación de la línea celular leucémica mieloide HL60 y suprimir su autorrenovación. Sin embargo, en otros varios estudios, GM-CSF estimuló la proliferación de las células HL60. Se puede monitorizar la diferenciación midiendo la expresión de varios antígenos asociados a la membrana plasmática, por ejemplo CD14 (marcador de monocitos / macrófagos) y CD57 (marcador de células NK). Se ha notificado que éstos son inducidos por GM-CSF en líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), lo que sugiere que el SCLC tiene un origen celular mieloide. Esto concordaría con una propuesta de que el SCLC se origina a partir de precursores de macrófagos que se infiltran en tejidos pulmonares lesionados, tal como sucede en fumadores empedernidos. La rápida disponibilidad de GM-CSF humano recombinante y la limitada distribución de los receptores para GM-CSF en las células de los linajes mieloide y, posiblemente eritroide, pueden ayudar así a definir el origen histológico de los tumores y sugiere modalidades terapéuticas alternativas para el tratamiento de cánceres tales como SCLC.

Por tanto, parece que aunque se ha hecho uso del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) como estimulante para la producción de células madre, células progenitoras, células precursoras, células accesorias y macrófagos, existe un número sustancial de desventajas en su uso, aquellas discutidas anteriormente y la aparición de dolor de huesos, fiebre, mialgia, eritema en pacientes a los que se les administró citocinas tales como GM-CSF y G-CSF, lo que hace que no sea deseable el uso de GM-CSF y G-CSF.

Por tanto, es un objeto de esta invención proporcionar el uso de otros compuestos que proporcionen efectos similares a los de GM-CSF y G-CSF pero con efectos secundarios menores.

Es un objeto adicional de esta invención proporcionar tales compuestos en dosis adecuadas para un uso eficaz y seguro.

Es todavía un objeto adicional de esta invención proporcionar tratamientos y regímenes de tratamiento mejorados.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar un uso novedoso del hialuronán (Hl para movilizar células tales como las células hematopoyéticas).

Otros y adicionales objetos de la invención serán comprendidos por aquellos expertos en la técnica a partir del siguiente sumario de la invención y la descripción detallada de las realizaciones de la misma.

Sumario de la invención

El uso de ácido hialurónico o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, que tengan un peso molecular inferior a 750.000 daltons, en la fabricación de una composición farmacéutica para potenciar la estimulación de la producción o liberación de células desde la médula ósea y otras localizaciones tisulares a la sangre, siendo las células células hematopoyéticas, en particular células de tipo dendrítico o progenitoras de mastocitos. La composición se utiliza para:

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preparar órganos o células concebidos para transplante; o

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para el tratamiento de un paciente que recibe un transplante de órgano o células, de estados autoinmunes o similares a los autoinmunes, de un paciente inmunosuprimido o inmunodeficiente, cáncer, SIDA, alergia, asma, osteoporosis o anemia.

Se prefiere que la composición farmacéutica se utilice para potenciar y/o activar / estimular células estromales, preferiblemente para facilitar la movilización.

Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para estimular y/o liberar células hematopoyéticas o células de tipo dendrítico desde la médula espinal y otros tejidos a la sangre.

Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para estimular la producción o la liberación de células hematopoyéticas o células de tipo dendrítico desde la médula espinal y otros tejidos a la sangre.

Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para movilizar células hematopoyéticas, preferiblemente células madre, o células de tipo dendrítico desde la médula espinal y otros tejidos de un ser humano a la sangre.

Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para generar células madre para trasplante.

Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para tratar la inmunosupresión producida por quimioterapia, la inmunosupresión producida por SIDA o cáncer.

Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para modular los síntomas de alergia o asma o para aumentar los niveles de glóbulos rojos en la sangre.

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Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para movilizar células hematopoyéticas antes y durante la recogida del tejido que se va a utilizar para el transplante de órgano.

Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para movilizar células hematopoyéticas y de tipo dendrítico a partir de un órgano ex vivo que ya se ha recogido del donante.

Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para tratar individuos huésped a punto de recibir un transplante de órgano, antes y durante el procedimiento de transplante.

Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para movilizar células hematopoyéticas y células de tipo dendrítico separadas o fuera de un injerto de órgano que muestra signos de rechazo inmunológico.

Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para optimizar los regímenes inmunosupresores utilizados en un paciente, para amortiguar o inhibir las respuestas inmunes.

Se prefiere además que la composición farmacéutica se utilice para maximizar la destrucción mediante quimioterapia de células hematopoyéticas y de tipo dendrítico en pacientes que se benefician de la misma.

Se prefiere además que la forma utilizada de ácido hialurónico sea hialuronato sódico.

Se prefiere además que la forma utilizada de ácido hialurónico tenga un peso molecular de aproximadamente 320.000 daltons.

Se prefiere además que la cantidad utilizada en la composición farmacéutica de ácido hialurónico o sales farmacéuticamente aceptables oscile desde 1,5 mg/kg hasta 3000 mg/70kg de peso corporal del paciente. Preferiblemente, la cantidad utilizada de ácido hialurónico oscila entre 1,5 mg/kg hasta 12 mg/kg de peso corporal del paciente.

Se prefiere además que la cantidad de ácido hialurónico sea de aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal del paciente. Alternativamente, una cantidad preferida de ácido hialurónico es de 3 mg/kg de peso corporal del paciente.

El término "células hematopoyéticas" pretende incluir todos los tipos de células hematopoyéticas durante toda su diferenciación desde la autorenovación de las células madre hematopoyéticas, a través de las células precursoras inmaduras de los diversos linajes sanguíneos hasta, e incluyendo, las células sanguíneas funcionales maduras, tal como sería entendido por las personas expertas en la técnica.

El término "células de tipo dendrítico" pretende incluir las células en la circulación, la médula ósea y otros tejidos, incluyendo aquellos tipos celulares implicados en la presentación de antígeno.

El término "células estromales" pretende incluir las células que componen el microambiente de las células hematopoyéticas, incluyendo células endoteliales, adipocitos, fibroblastos, células reticulares y células epiteliales, y todas las células similares funcionalmente.

Los términos "individuo" o "paciente" pretenden englobar todas las especies de mamíferos. Aunque los ejemplos de más adelante se refieren a seres humanos, una persona experta en la técnica sabría cómo esto es aplicable a otras especies de mamíferos.

El término "estimular" pretende ser equivalente al término "activar".

Se puede conseguir la movilización de células hematopoyéticas administrando formas de HA in vivo.

Se puede conseguir la generación de células hematopoyéticas (por ejemplo, células madre) para transplante administrando HA in vivo, y recogiendo las células que se van a transplantar de la sangre periférica.

La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse para el tratamiento de anemia adquirida (tal como pérdida de sangre, anemia por deficiencia de hierro, anemia que se adquiere tras una intervención quirúrgica, anemia relacionada con una infección, anemia relacionada con la insulina, anemias por hemoglobina baja durante el embarazo o de la producción de glóbulos rojos). Por tanto, esta invención proporciona el uso de formas de HA para el mismo uso que para el que se administra eritropoyetina.

El uso de ácido hialurónico y sales farmacéuticamente aceptables del mismo (por ejemplo, hialuronato sódico) se proporciona para el mismo que G-CSF y/o GM-CSF recombinante, incluyendo la producción / liberación de células madre, progenitoras y otras células hematopoyéticas.

En apoyo de las conclusiones respecto a lo que constituye la invención, se han realizado pruebas para las que se han expuesto los resultados como ejemplos del presente documento. Adicionalmente, se han vuelto a examinar ahora las pruebas realizadas anteriormente y las pruebas en marcha y se ha determinado que los resultados no evidentes, las conclusiones y, por tanto, la invención se confirman mediante estos materiales adicionales. Se conoce que los receptores para HA se expresan en casi todos los tipos de células hematopoyéticas. Las pruebas han demostrado que los receptores para HA que pueden unir HA se expresan mediante linfocitos T, linfocitos B y monocitos en individuos normales o en aquellos con una enfermedad inflamatoria (reestenosis o enfermedad del intestino inflamado); incluyendo los receptores implicados RHAMM y CD44. las células B malignas también expresan estos receptores y los utilizan para unir HA, así como en la conducta motil (Masellis, Smith et al, BLOOD 1996). Las pruebas han demostrado también que los timocitos humanos (células T inmaduras) tienen pocos receptores para HA, pero que la interacción con HA produce redistribución de los receptores para HA (principalmente, RHAMM) en la superficie celular, donde ahora pueden unir HA e interactuar con HA para promover la motilidad de los timocitos. Las pruebas han demostrado también que los timocitos tienen un conjunto de receptores para HA crípticos que pueden unir HA cuando se exponen experimentalmente y que pueden redistribuirse en la superficie para su uso funcional.

Por tanto, se ha determinado que el HA puede regular por incremento los receptores para HA, en particular RHAMM, y que estos receptores recién expresados median realmente la motilidad celular. Esto es un modelo in vitro de la movilización celular, en este caso que modela acontecimientos que hacen que los timocitos abandonen el órgano sólido, el timo, por la sangre, análogo a la conducta predicha del HA infundido in vivo, tal como se reivindica en esta invención, para hacer que células hematopoyéticas de muchos tipos abandonen la médula ósea u otro tejido y entren en la sangre. Por tanto, con estas pruebas que también apoyan la invención, que trata de acontecimientos in vivo, se cree que el HA infundido produce la redistribución de los receptores para HA sobre las células hematopoyéticas de muchos tipos (células madre y células en todas las fases de diferenciación dentro de los linajes hematopoyéticos), aumentando así su densidad superficial. Entonces, estos receptores interactúan con HA para producir la desadhesión y la iniciación de la conducta motil requerida para la migración hasta la sangre. (lo que se cree que se necesita para la movilización de células hematopoyéticas tal como se entiende en la terminología clínica). Aunque se cree que este acontecimiento tiene lugar tal como se describió, la invención se puede utilizar independientemente del mecanismo real de movilización.

Adicionalmente, las células madre CD34+ expresan los receptores para HA y pueden unir HA, proporcionando además ayuda in vitro para su movilización desde la médula ósea hasta la sangre mediante infusión de HA.

Las células T sanguíneas periféricas tienen receptores para HA crípticos, pueden unir débilmente HA y someterse a la conducta motil que está inhibida por anticuerpos contra el receptor para HA, RHAMM, aun cuando este receptor no se exprese en una densidad detectablede otro modo, sobre la superficie de las células T. El hecho de que RHAMM medie la motilidad indica que el HA ha regulado por incremento RHAMM críptico en las células T sanguíneas maduras, tal como se ha demostrado para las células T inmaduras. También se demuestra, como se cree, que el HA movilizará las células T desde los órganos linfáticos y tejidos distintos a la médula ósea (incluyendo el bazo, ganglios linfáticos, placas de Peyer, tejido linfático asociado al intestino y tejido linfático asociado a la piel).

Los osteoclastos, las células que disuelven el hueso y que participan en la destrucción patológica de masa ósea, expresan el receptor para HA, CD44, mientras que los osteoblastos y las células osteoprogenitoras, las células que producen masa ósea, sólo tienen una cantidad baja de CD44. Por tanto, se cree que esto indica que los osteoclastos y, por tanto la destrucción ósea, son afectados preferentemente por la infusión de HA en comparación con los osteoblastos y las células osteoprogenitoras. La osteoporosis y otros estados caracterizados por la reducción de la masa ósea y un aumento resultante de la fragilidad ósea serán modulados, por tanto, por la infusión de HA. Tal modulación tendrá un efecto preferentemente sobre las células responsables de la destrucción ósea, mientras que apenas tendrá efecto sobre aquellas responsables de la producción ósea, apoyando el uso de la infusión de HA en enfermedades óseas tales como la osteoporosis.

Además, los linfocitos malignos del linaje B (linfoma, mieloma múltiple, leucemia de células pilosas) expresan RHAMM y utilizan RHAMM para someterse a la conducta motil. En este caso, la motilidad es una conducta requerida para la diseminación de las células cancerígenas así como 0 para la migración de las células cancerígenas hasta y desde la médula ósea y otros órganos linfáticos. Por tanto, se cree que la forma de HA movilizará las células cancerígenas, facilitando así su selección como objetivo por el tratamiento.

En muchos cánceres, las células cancerígenas localizadas en hueso o las metástasis óseas son una complicación grave del cáncer. Aunque la quimioterapia sí que alcanza los espacios del hueso, parece inevitable que algunas regiones del hueso estén menos vascularizadas que otras y que algunas bolsas del cáncer escapen a los agentes quimioterapéuticos. Varios estudios indican que las células tumorales agrupadas en una masa de tumor son más resistentes a los fármacos que aquéllas en suspensiones celulares sencillas. La movilización del tumor a la sangre las liberará de cualquier agregado tumoral en la médula u otras localizaciones y se cree que las hará más sensibles a los fármacos.

El mieloma múltiple es un buen ejemplo de cáncer con un gran número de células malignas localizadas en hueso, mientras que el linfoma y el cáncer de mama incluyen metástasis óseas que dependen de la migración desde la masa tumoral principal, a través de la sangre, hasta la médula ósea. La médula ósea sólo se abastece por la sangre por lo que cualquier tráfico hasta o desde la médula ósea debe producirse por medio de la sangre. En el cáncer de mama, el mieloma múltiple y algunos linfomas, el receptor para HA, RHAMM, se expresa e identifica células cancerígenas circulantes. En el mieloma, las células cancerígenas localizadas en la médula ósea expresan RHAMM y CD44. Para estos cánceres que se originan como una masa sólida, que normalmente se extirpa de forma quirúrgica, se cree que la infusión de HA en el momento de la operación quirúrgica evitará la migración de las células cancerígenas desplazadas quirúrgicamente a través de la sangre, por ejemplo, al hueso o cualquier otra localización tisular, reduciendo así el riesgo de diseminación iatrogénica. Se cree que estas células cancerígenas son ahora más vulnerables a la quimioterapia. Se cree que para aquellos pacientes con células tumorales óseas, la infusión con HA producirá su movilización a la periferia donde serán atacadas más rápidamente, estarán expuestas a dosis potencialmente más elevadas de agentes terapéuticos y, donde serán ahora sensibles a los agentes que no pueden entrar fácilmente en la medula ósea.

Otro posible tratamiento de este tipo es el uso de combinaciones de hialuronán y liposomas y/o cualquier agente terapéutico adecuado que, por ejemplo, puede estar unido al hialuronán. El hialuronán se puede utilizar igualmente como un resto diana y de liberación para cualquier agente adecuado. Véase la solicitud de patente PCT WO 91/04058. El tratamiento también puede realizarse mediante la administración de agentes quimioterapéuticos u otros tipos de tratamiento.

Una forma de HA se puede infundir a un paciente para movilizar células cancerígenas desde la médula ósea o tejidos sólidos a la sangre, donde las células cancerígenas existen como suspensiones celulares sencillas y se hacen más sensibles a los fármacos y/o son más eficazmente atacadas por el agente quimioterapéutico y/o eliminadas mediante algún procedimiento físico tal como la leucoféresis.

Cantidades adecuadas de la forma de ácido hialurónico, que comprende ácido hialurónico y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo, pueden ser del orden de entre aproximadamente 1,5 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 12 mg/kg de peso corporal, por ejemplo aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal del paciente al que se administra la forma de ácido hialurónico (por ejemplo, mediante infusión intravenosa u otra manera adecuada) o una cantidad superior, tal como aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal del paciente y aproximadamente 12 mg/kg de peso corporal del paciente, al que se administra la forma de ácido hialurónico. Por tanto, cantidades de dosis adecuadas para una persona de 70 kg comprenden al menos aproximadamente 105 mg, por ejemplo, aproximadamente 420 mg de la forma de ácido hialurónico y, por ejemplo, 840 mg de la forma de ácido hialurónico.

Dependiendo de las células a movilizar, se pueden administrar diferentes regímenes de tratamiento de las dosis. Los siguientes regímenes de tratamiento se pueden revisar como sigue:

(a) una única dosis seleccionada del intervalo anterior puede, por ejemplo, movilizar selectivamente el tipo celular deseado;

(b) infusiones secuenciales de la misma cantidad de dosis de la forma de HA (por ejemplo, 6 mg/kg administrado semanalmente durante un mes);

(c) infusiones secuenciales con cantidades diferentes en cualquier orden. Cuando a los pacientes se les administra un régimen de tratamiento durante un periodo de tiempo por ejemplo, menores (inferiores) cantidades/kg de peso corporal del paciente durante un periodo de tiempo (por ejemplo, cada pocos días o una vez a la semana durante varias semanas), se pueden utilizar cantidades inferiores a 6 mg/kg para conseguir el mismo efecto. El paciente incluso se puede "preparar" para empezar el tratamiento administrándole dosis menores / inferiores que, por sí mismas, pueden no ser eficaces para el tipo celular (pero es eficaz para otros tipos celulares). Tales cantidades de preparación pueden, por ejemplo, ser de 1,5 mg/kg ó 3,0 mg/kg de peso corporal.

La forma de ácido hialurónico se puede administrar en cualquier vehículo adecuado tal como agua estéril o solución salina. El efecto estimulador comienza normalmente tan pronto como una hora tras la administración de una forma de ácido hialurónico y continúa durante al menos aproximadamente 72 horas y, en algunos casos, los efectos fueron todavía visibles después de 7 días.

Una forma de ácido hialurónico y/o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo (por ejemplo, la sal sódica) adecuada para su uso con la invención del solicitante es una cantidad que tiene las siguientes especificaciones / características:

Pruebas	Especificaciones	Resultados
pH	5,0 a 7,0 a 25^{o}C	6,0
Gravedad específica	0,990 a 1,010 a 25^{o}C	1,004
Viscosidad intrínseca	4,5 a 11,0 dL/g	7,07
Peso molecular	178.000 a 562.000	319.378
	daltons	daltons
Valoración e	9,0 a 11,0 mg/ml.	9,9 mg/ml
identificación de	Positivo	Positivo
hialuronato sódico

Otra cantidad tal puede comprender:

\newpage

Pruebas	Especificaciones
1. Descripción	Polvo blanco o crema inodora
2. Identificación(espectro IR)	Se ajusta a espectro estándar de referencia
3. pH (disolución al 1%)	5,0 a 7,0
4. Pérdida por desecación	No más del 10%
5. Residuo de ignición	15,0% a 19,0%
6. Contenido en proteínas	No más del 0,1%
7. Metales pesados	No más de 20 ppm
Arsénico	No mas de 2 ppm
Disolventes residuales
(a) Formaldehído	No más de 100 ppm
(b) Acetona	No más del 0,1%
(c) Etanol	No más del 2,0%
Valoración (base seca) de hialuronato sódico	97,0 al 102,0%
8. Viscosidad intrínseca	10,0 a 14,5 dL/g
9. Peso molecular	500.000 a 800.000 daltons
Recuentomicrobios aerobios totales (USP 23)	No más de 50 microorganismos/g
Escherichia coli (USP 23)	Ausente
Levaduras y mohos (USP 23)	No más de 50 microorganismos/g
Endotoxinas bacterianas	No más de 0,07 UE/mg
(LAL) (USP 23)

Otra cantidad tal está disponible de Hyal Pharmaceuticals Limited y viene en un vial de hialuronato sódico 20 mg/ml (300 mg/vial - Lote 2F3). La cantidad de hialuronato sódico es una disolución al 2% con un peso molecular medio de aproximadamente 225.000. La cantidad también contiene agua, en cantidad suficiente, que se destila tres veces y es estéril según la USP para formulaciones para inyectar. Los viales de ácido hialurónico y/o las sales del mismo pueden llevarse a un vial de vidrio de borosilicato de tipo 1 cerrado mediante un tapón de butilo que no reacciona con el contenido del vial.

La cantidad de ácido hialurónico y/o las sales del mismo (por ejemplo, la sal sódica) pueden comprender además las siguientes características:

una cantidad purificada, sustancialmente libre de pirógeno de ácido hialurónico obtenido a partir de una fuente natural, que tiene al menos una característica seleccionada del grupo (y preferiblemente todas las características) que consiste en lo siguiente:

i)

un peso molecular dentro del intervalo de 150.000-225.000;

ii)

menos de aproximadamente el 1,25% de mucopolisacáridos sulfatados en relación al peso total;

iii)

menos de aproximadamente el 6% de proteínas en relación al peso total;

iv)

menos de aproximadamente 150 ppm de hierro en relación al peso total;

v)

menos de aproximadamente 15 ppm de plomo en relación al peso total;

vi)

menos del 0,0025% de glucosamina;

vii)

menos del 0,025% de ácido glucurónico;

viii)

menos del 0,025% de N-acetilglucosamina;

ix)

menos del 0,0025% de aminoácidos;

x)

un coeficiente de extinción UV a 257 nm inferior a aproximadamente 0,275;

xi)

un coeficiente de extinción UV a 280 nm inferior a aproximadamente 0,25; y

xii)

un pH dentro del intervalo de 7,3-7,9. Preferiblemente, el ácido hialurónico se mezcla con agua estéril y la cantidad de ácido hialurónico tiene un peso molecular promedio medio dentro del intervalo de 150.000-225.000 daltons. Más preferiblemente, la cantidad de ácido hialurónico comprende al menos una característica seleccionada del grupo (y preferiblemente, todas las características) que consiste en las siguientes características:

i)

menos de aproximadamente el 1% de mucopolisacáridos sulfatados en relación con el peso total;

ii)

menos de aproximadamente el 0,4% de proteínas en relación con el peso total;

iii)

menos de aproximadamente 100 ppm de hierro en relación con el peso total;

iv)

menos de aproximadamente 10 ppm de plomo en relación con el peso total;

v)

menos del 0,00166% de glucosamina;

vi)

menos del 0,0166% de ácido glucurónico;

vii)

menos del 0,0166% de N-acetilglucosamina;

viii)

menos del 0,00166% de aminoácidos;

x)

un coeficiente de extinción UV a 257 nm inferior a aproximadamente 0,23;

xi)

un coeficiente de extinción UV a 280 nm inferior a 0,19; y

xii)

un pH dentro del intervalo de 7,5-7,7.

Los solicitantes pueden utilizar también hialuronato sódico producido y suministrado por LifeCore^{MR} Biomedical, Inc., que tiene las siguientes especificaciones:

Características	Especificación
Aspecto	Partículas blancas a color crema
Olor	Sin olor perceptible
Peso molecular	<750.000 Daltons
Barrido UV-Vis, 190-820 nm	Concuerda con el barrido de referencia
DO, 260 nm	<0,25 unidades DO
Sensibilidad de hialuronidasa	Respuesta positiva
Barrido IR	Concuerda con referencia
pH, disolución 10 mg/g	6,2 - 7,8
Agua	8% máximo
Proteínas	<0,3 mcg/mg NaHy
Acetato	<10,0 mcg/mg NaHy

Metales pesados, ppm máximas
As	Cd	Cr	Co	Cu	Fe	Pb	Hg	Ni
2,0	5,0	5,0	10,0	10,0	25,0	10,0	10,0	5,0

Biocarga microbiana	Ninguna observada
Endotoxina	<0,07 UE/mg NaHy
Pruebas Seguridad Biológica	Pasa prueba de toxicidad
	ocular en conejos

Otra cantidad de hialuronato sódico propuesto para ser utilizada se vende bajo el nombre de Hyaluronan HA-M5070 por Skymart Enterprises, Inc. que tiene las siguientes especificaciones:

\newpage

Resultados de las pruebas de las especificaciones

N° de lote	HG1004
pH	6,12
Sulfato de condroitina	no detectado
Proteínas	0,05%
Metales pesados	No más de 20 ppm
Arsénico	No más de 2 ppm
Pérdida por desecación	2,07%
Residuo de ignición	16,69%
Viscosidad intrínseca	12,75 dl/s (PM: 679.000)
Nitrógeno	3,14%
Valoración	104,1%
Recuentos microbiológicos	80/g
E. coli	Negativo
Mohos y levaduras	No más de 50/g

Se pueden elegir otras formas de ácido hialurónico y/o sus sales de otros proveedores y aquellas descritas en los documentos de la técnica anterior siempre que sean adecuados.

Las siguientes referencias enseñan sobre el ácido hialurónico, fuentes del mismo y procedimientos para la fabricación y recuperación del mismo que pueden ser adecuados.

La patente de los Estados Unidos 4.141.973 enseña sobre fracciones de ácido hialurónico (incluyendo sales sódicas) que tienen:

``(a)

un peso molecular promedio superior a aproximadamente 750.000, preferiblemente superior a aproximadamente 1.200.000 - esto es, una cifra de viscosidad limitante superior a aproximadamente 1400 cm^{3}/g y, preferiblemente superior a aproximadamente 2000 cm^{3}/g;

(b)

un contenido en proteínas inferior al 0,5% en peso;

(c)

una absorbencia de luz ultravioleta de una disolución al 1% de hialuronato sódico inferior a 3,0 a una longitud de onda de 257 nanómetros e inferior a 2,0 a una longitud de onda de 280 nanómetros;

(d)

una viscosidad cinemática de una disolución al 1% de hialuronato sódico en tampón fisiológico superior a aproximadamente 1000 centistokes, preferiblemente superior a 10.000 centistokes;

(e)

una rotación óptica molar de una disolución de hialuronato sódico al 0,1 - 0,2% en tampón fisiológico inferior a -11 x 10^{3} grados-cm-/mol (de disacárido) medida a 220 nanómetros;

(f)

sin infiltración celular significativa de las cámaras vítrea y anterior del ojo, sin enrojecimiento en el humor acuoso, sin turbidez o enrojecimiento en el vítreo y sin cambios patológicos en la córnea, cristalino, iris, retina y coroides del ojo de mono búho cuando un mililitro de una disolución al 1% de hialuronato sódico disuelto en tampón fisiológico se implanta en el vítreo, reemplazando aproximadamente la mitad del líquido vítreo existente, siendo dicho HA:

(g)

estéril y libre de pirógeno y

(h)

no antigénico''

El título de patente canadiense 1.205.031 (que se refiere a la patente de los Estados Unidos 4.141.973 como técnica anterior) se refiere a fracciones de ácido hialurónico que tienen pesos moleculares promedio de desde 50.000 hasta 100.000; 250.000 hasta 350.000; y 500.000 hasta 730.000 y trata de procedimientos para su fabricación.

Cuando se utiliza ácido hialurónico de peso molecular elevado (o sus sales), se debe tratar para permitir la administración y garantizar que no haya coagulación o bloqueo.

Como no existe toxicidad de la forma de ácido hialurónico, la forma de ácido hialurónico se puede administrar en dosis superiores a 12 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, superiores a 1000 mg/70 kg de una persona e incluso hasta cantidades de 3000 mg/70 kg de una persona, sin efectos tóxicos adversos.

La potenciación (estimulación) de la producción / liberación de células hematopoyéticas o de tipo dendrítico puede medirse mediante las propiedades fenotípicas, físicas o químicas, o cualquier otra característica utilizada por los expertos en la técnica para identificar un tipo celular dado.

Por tanto, administrando cantidades eficaces de las formas de ácido hialurónico, se pueden tratar pacientes con la forma de ácido hialurónico que sea segura y no tóxica y el paciente no sufrirá los efectos secundarios adversos del tratamiento con GM-CSF o G-CSF recombinante, aunque logra los efectos que se pueden obtener mediante la administración de GM-CSF o G-CSF recombinante. Se puede tratar al paciente administrándole un régimen de tratamiento que comprende una única dosis o una pluralidad de dosis de ácido hialurónico durante un periodo de tiempo (por ejemplo, varias semanas), o dosis que comprenden una cantidad o cantidades que es / son cantidad(es) inferior(es), seguido por cantidades que son cantidades superiores. Cantidades inferiores que las cantidades utilizadas sin preparación pueden ser eficaces en el paciente para estimular la producción / liberación de las células, la activación o la liberación, cuando el paciente se prepara. Por ejemplo, cantidades de dosis adecuadas pueden ser 6 mg/kg de peso corporal del paciente o 12 mg de la forma de ácido hialurónico/kg de peso corporal del paciente. Un régimen adecuado puede comprender además una cantidad adecuada (por ejemplo, 1,5 mg de la forma de ácido hialurónico/kg de peso corporal del paciente ó 3,0 mg/kg) para fines de "preparación", también seguido por la administración de otra cantidad eficaz (por ejemplo, aproximadamente 6 mg/kg, 10 mg/kg o más) tras un intervalo o intervalos predeterminados. Puede proporcionarse otro régimen adecuado de tratamiento sostenido tal como sigue:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Semana 1: \+ 1,5 mg/kg;\cr  Semana 2: \+ (7 días después) - 3,0
mg/kg;\cr  Semana 3: \+ (7 días después) - 6,0 mg/kg;\cr  Semana 4:
\+ (7 días después) - 12,0
mg/kg;\cr}

El tratamiento de las semanas 3 ó 4 se puede continuar en las semanas 5, 6, 7, etc. durante tanto tiempo como sea necesario. Cualquiera de los tratamientos se puede continuar durante tanto tiempo como sea necesario.

Por tanto, se describe un uso novedoso para el HA como un agente para movilizar células hematopoyéticas y dendríticas. Existe una variedad de aplicaciones para las que es necesario o deseable movilizar células hematopoyéticas y de tipo dendrítico incluyendo, pero sin limitarse a ello:

obtener material para transplante; la movilización, tras quimioterapia, de granulocitos y monocitos; la movilización de células T CD4+ desde órganos linfáticos sólidos a la sangre de pacientes con SIDA.

En una realización, se cree que se logra la movilización de células hematopoyéticas, incluyendo células polimorfonucleares, eritroblastos, células plasmáticas, monocitos de fase temprana, células T, células B y células madre, mediante la infusión intravenosa secuencial de dosis crecientes de HA (que tiene un peso molecular de 200.000 a 300.000 daltons, determinado según el patrón proteico aislado a partir de, por ejemplo, Streptomyces), durante un periodo de 4 semanas, tal como se explica en el presente documento.

Esta realización puede variarse y todavía proporcionar resultados equivalentes y la realización se puede optimizar adicionalmente para diversas aplicaciones, tal como se indica en el presente documento.

Se anticipa que también podría utilizarse la administración de HA como fragmentos más pequeños o más grandes. El HA se puede aislar en formas con PM promedio tales como las cantidades con promedio de PM de 200.000 a 300.000 utilizadas en el presente documento o incluso pesos moleculares más pequeños.

Existe la posibilidad de que fragmentos más pequeños de HA, inferiores de 200.000 a 300.000, pudieran ser más potentes en la movilización de células hematopoyéticas y de tipo dendrítico por los siguientes motivos. El HA se descompone rápidamente en la circulación y es rápidamente aclarado por las células endoteliales del hígado. Se cree que el HA utilizado, de PM de 200.000 a 300.000, se degrada rápidamente en fragmentos más pequeños que pueden tener una actividad biológica aumentada en la estimulación de la conducta migratoria, así como ser más eficaces en la mediación de la desadhesión (liberación del anclaje). Se cree que los fragmentos más pequeños de HA pueden entrar más fácilmente en la médula ósea que los fragmentos de PM elevados, que podrían no ser capaces de atravesar las zonas sinusales de la médula ósea, donde debe producirse el intercambio entre la sangre y los compartimentos de la médula ósea. Sin embargo, puesto que el HA se descompone in vivo, el uso de fragmentos más grandes podría ser igualmente eficaz. El tamaño óptimo del HA para infusión se puede determinar seleccionando el HA en diversos intervalos de PM (por ejemplo, PM de 25.000-50.000, 50.000- 100.000, etc).

Dosis de HA incluyen, pero sin limitarse a ello, el intervalo de aproximadamente 1,5 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg, por separado, y juntos en combinaciones secuenciales (es decir, infusiones múltiples de sólo una concentración, e infusiones múltiples cada una a concentraciones distintas).

Por ejemplo, puesto que 12 mg/kg proporcionó un efecto mayor (véase el presente documento), sería evidente para las personas expertas en la técnica probar dosis crecientes de HA para encontrar las dosis óptimas para cada uso. Esto se puede realizar simplemente administrando dosis crecientes de HA a los sujetos y analizando muestras de sangre tomadas, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento. Además, en lugar de aumentar secuencialmente la dosis semanalmente, se podría infundir el HA semanalmente (o a otros intervalos) en una concentración óptima que podría ser superior o inferior a 12 mg/kg, dependiendo de las células a movilizar. También se pueden examinar diferentes frecuencias y duraciones de administración de HA.

Son eficaces diferentes vías de administración además de la infusión intravenosa. Por ejemplo, un "depot" de HA colocado de forma subcutánea o intraperitoneal proporcionaría infusión continua durante un periodo de tiempo prolongado y sería un método conveniente y eficaz de suministrar HA. Si el HA se administra de forma subcutánea o intraperitoneal, por ejemplo, se podría lograr una infusión cutánea y monitorizar el sujeto con el tiempo. Alternativamente, el HA se podría administrar de forma oral. La invención incluye la administración de HA mediante tales medios y todos los demás, tal como sería entendido por las personas expertas en la técnica.

Diferentes protocolos de administración de HA, incluyendo variaciones del tamaño de HA, dosis, vía y duración de la administración de HA, movilizarán diferentes poblaciones de células hematopoyéticas y de tipo dendrítico.

Por ejemplo, un protocolo que moviliza óptimamente células madre CD34+ puede ser algo diferente de uno que es óptimo en la movilización de células T o células tumorales. Por tanto, el protocolo se puede optimizar para una aplicación particular deseada, administrando HA en diferentes condiciones y luego monitorizando la producción del subconjunto deseado de células hematopoyéticas en la sangre, tal como se indica en el presente documento. Debe monitorizarse el tiempo tras la infusión para la recuperación o inducción óptimas de poblaciones celulares específicas en la sangre, debido, tal como se observa en el ejemplo del presente documento, a la aparición de los diferentes tipos celulares producida secuencialmente durante un periodo de aproximadamente una semana tras la infusión. El modelo indicó la liberación temprana (4 horas) de células polimorfonucleares y eritroblastos (células progenitoras de glóbulos rojos de fase relativamente tardía, que son nucleadas), la liberación posterior de células madre, linfocitos pequeños y células plasmáticas (24-72 horas) y liberación todavía más posterior de células monocitoides (7 días).

En el presente documento, los sujetos fueron sujetos humanos. El HA también sería eficaz en primates u otros mamíferos para la movilización de células hematopoyéticas que se van a utilizar en un xenotransplante o para recoger células hematopoyéticas a partir de animales modificados genéticamente (por ejemplo, un cerdo modificado mediante ingeniería genética para expresar antígenos de histocompatibilidad principal humana en sus células hematopoyéticas).

El uso del HA como un agente para movilizar células hematopoyéticas se ilustra a continuación:

1.

La infusión de HA se puede utilizar para generar una fuente de células madre hematopoyéticas para transplante alógeno o autólogo. Tal transplante se utiliza frecuentemente para restaurar el sistema hematopoyético de pacientes con cáncer tras quimioterapia mieloablativa y radioterapia. Los donantes de células madre (o bien el paciente de cáncer antes de la quimioterapia o bien un donante alogénico) se pueden tratar con HA utilizando un protocolo generalmente eficaz, tal como el descrito en el presente documento, o un protocolo que se ha optimizado específicamente para producir el máximo número de células madre CD34+. Se pueden tratar colecciones de PBSC, congelar e infundir a pacientes utilizando protocolos médicos que son bien conocidos en la técnica (véase las referencias a continuación para ejemplos detallados de tales protocolos):

(Weaver, C.H., Hazelton, B., Birch, R., Palmer, P., Allen, C., Schwartzberg, L. y West, W. (1995). An analysis of engraftment kinetics as a function of the CD34 content of peripheral blood progenitor cell collections in 692 patients after the administration myeloablative chemotherapy. Blood 86: 3961-3969.

Boiron, J.M., Marit, C., Faberes, C., Cony- Makhoul, P., Foures, C., Ferrer, A.M., Cristol, C., Sarrat, A., Girault, D. y Reiffers, J. (1993) Collection of peripheral blood stem cells in mutltiple myeloma following single high-dose cyclophosphamide with and without recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rh GM-CSF). Bone Marrow Transplantation 12: 49-55.

Schiller, G., Vescio, R., Freytes, C., Spitzer, G., Sahebi, F., Lee, M., Wu, C.H., Cao, J., Lee, J.C., Hong, C.H., Lichtenstein, A., Lill, M., Hall, J., Berenson, R. y Berenson, J. (1995) Transplantation of CD34+ peripheral blood progenitor cells after high-dose chemotherapy for patients with advanced multiple myeloma. Blood 86: 390-397).

Las ventajas de utilizar HA como agente para movilizar células madre para trasplante sobre las citocinas utilizadas ahora en la técnica - GM-CSF y G-CSF - son numerosas. El HA tiene menos efectos secundarios que las citocinas y parece actuar más rápidamente, movilizando un espectro más diverso de células hematopoyéticas y más de ellas.

2.

La infusión de HA se puede utilizar como un método para la inmunoterapia complementaria después de quimioterapia, para movilizar polimorfos y monocitos para mecanismos de primera línea que se necesitan en la defensa frente a patógenos hasta la recuperación de la quimioterapia. Actualmente, se utilizan G-CSF y GM-CSF para este fin, y se administran de forma subcutánea o intravenosa hasta que se observa la recuperación de neutrófilos. Las ventajas de utilizar HA mencionadas en el párrafo 1 anterior se aplican aquí igualmente. Se puede sustituir el tratamiento de pacientes con HA, tal como se describe en el presente documento, por la infusión de citocinas en los protocolos clínicos ya existentes tales como los descritos en las referencias de a continuación:

(Weaver, C.H., Hazelton, B., Birch, R., Palmer, P., Allen, A., Schwartzberg, L. y West, W. (1995). An analysis of engraftment kinetics as a function of the CD34 content of peripheral blood progenitor cell collections in 692 patients after the administration of inveloablative chemotherapy. Blood 86: 3961-3969.

Boiron, J.M., Marit, G., Faberes, C., Cony-Makhoul, P., Foures, C., Ferrer, A.M., Cristol,G., Sarrat, A., Girault, D. y Reiffers, J. (1993) Collection of peripheral blood stem cells in mutltiple myeloma following single high-dose cyclophosphamide with and without recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rh GM-CSF). Bone Marrow Transplantation 12: 49-55.

Schiller, G., Vescio, R., Freytes, C., Spitzer, G., Sahebi, F., Lee, M., Wu, C.H., Cao, J., Lee, J.C., Hong, C.H., Lichtenstein, A., Lill, M., Hall, J., Berenson, R. y Berenson, J. (1995) Transplantation of CD34+ peripheral blood progenitor cells after high-dose chemotherapy for patientes with advanced multiple myeloma. Blood 86: 390-397).

3.

El tratamiento con HA también se puede utilizar como un complemento de la quimioterapia para el cáncer de la siguiente manera. En el mieloma múltiple, otros cánceres del sistema inmune y cáncer metastásico tal como cáncer de mama y cáncer de pulmón de células pequeñas, las células malignas están/se vuelven secuestradas o ancladas en la médula ósea y/u otros tejidos. Si estas células malignas pudieran movilizarse desde la médula ósea u otro tejido a la periferia, podrían ser más sensibles a los agentes quimioterapéuticos y destruidas más eficazmente. Una variedad de pruebas indica que las células cancerígenas no ancladas, en suspensión, tienendiferente sensibilidad a una variedad de agentes que la que tienen las células cancerígenas ancladas o las células cancerígenas dentro de un agregado. Se puede conseguir una concentración más elevada de fármaco en la sangre, en comparación con la médula ósea, y forzando las células migratorias metastásicas dentro de la sangre, se produciría su exposición a esta dosis más elevada. Se espera que el tratamiento con HA antes de la administración de los agentes quimioterapéuticos optimice la capacidad de la quimioterapia de seleccionar como objetivo las células malignas. A este respecto, la administración de HA se producirá antes del tratamiento con agentes quimioterapéuticos tales como la combinación de los agentes quimioterapéuticos con HA, tal como se enseña en el documento WO 91/04058. Tal administración previa se realizará en cantidades eficaces (tales como 6 mg/kg de peso corporal), preferiblemente al menos aproximadamente de 4-24 horas antes de la administración del agente quimioterapéutico. Se cree que la infusión de HA facilitará, por tanto, la destrucción de células cancerígenas mediada por el fármaco.

4.

El tratamiento con HA también se puede utilizar para movilizar componentes de la respuesta inmune adquirida / adaptativa, tales como las células T y las células B, tal como entenderán los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar HA en la inmunoterapia contra el SIDA, tal como sigue. Las pruebas sugieren que las razones CD4+/CD8+ son anómalas principalmente en la sangre de los pacientes con SIDA, pero que los tejidos linfáticos sólidos, tales como bazo y ganglio linfático, tienen cifras normales de células CD4+. Se espera que el tratamiento de los pacientes con HA movilice las células T CD4+ de los órganos linfáticos sólidos, que podría esperarse que medien la protección inmune de los pacientes con SIDA. Esto será útil para la linfadenopatía previa al SIDA totalmente declarado. A diferencia de la mayoría de los enfoques para tratar el SIDA, el tratamiento con HA es seguro y no tiene efectos secundarios perjudiciales conocidos. Los pacientes con cáncer muestran frecuentemente una inmunodeficiencia similar. Por tanto, se espera que la infusión de HA palie la inmunodeficiencia. Por tanto, estas enseñanzas parecen aplicables a otros estados que implican defectos adquiridos en la respuesta inmune adaptativa.

5.

Se conoce en la técnica que los proteoglicanos y los glucosaminoglicanos distinguen diferentes conjuntos de mastocitos. Se cree ahora que el tratamiento con HA moviliza células progenitoras de mastocitos desde la médula ósea y localizaciones periféricas (pulmón, piel, etc). Esto alteraría la biodistribución de los tipos de mastocitos en la sangre y tejido y, por tanto, modularía los síntomas de alergia y asma. Se espera que la infusión de HA movilice los mastocitos desde el tejido a la sangre y fuera de las localizaciones de reacción locales.

6.

El HA se podría utilizar también para movilizar osteoclastos con el fin de reducir su número dentro de la médula ósea, con el objetivo de reducir su efecto destructivo sobre la masa ósea en la osteoporosis y otras enfermedades óseas. Basándose en las propiedades de las células osteoprogenitoras, osteoblastos y osteoclastos, se espera que el HA reducirá selectivamente los osteoclastos de la médula ósea, dejando los osteoblastos in situ.

7.

La administración de HA produce la rápida aparición de eritroblastos en la sangre periférica (véase el presente documento). Por tanto, la infusión de HA será una herramienta útil en el tratamiento de anemias adquiridas. Estas anemias incluyen anemia por deficiencia de hierro, anemia que se produce tras una intervención quirúrgica, anemia relacionada con una infección, anemia relacionada con la insulina, anemias por hemoglobina baja durante el embarazo, anemia que resulta de la pérdida de sangre o de la mala producción o destrucción de glóbulos rojos. Como la eritropoyetina, el HA moviliza los glóbulos rojos a la circulación.

La infusión de una cantidad eficaz de HA puede movilizar cualquier tipo de célula sensible desde un tejido hasta otro, como un único agente o antes / durante otros procedimientos clínicos, tal como se enseña para células hematopoyéticas y otros tipos de células normales o malignas. Estas células incluyen células normales no hematopoyéticas y tienen el potencial, durante al menos una fase de diferenciación en su ciclo de vida, de someterse a movilización / migración in vivo , por ejemplo, la movilización de ovocitos desde el ovario hasta las trompas de Falopio. Clínicamente, este proceso se provoca para la colección de ovocitos que se va a utilizar para la fertilización in vitro. Se cree que el HA mejorará la liberación de ovocitos cuando se utiliza en combinación con otros procedimientos clínicos utilizados por los expertos en la técnica. Por tanto, la infusión de HA, con o sin otros tratamientos conocidos por los expertos en la técnica, pueden mejorar los tratamientos de fertilidad in vivo.

Se puede utilizar una composición farmacéutica que contiene HA para movilizar células hematopoyéticas antes y durante la recogida del tejido para el transplante de órgano. Se cree que el tejido recogido estará libre de linfocitos pasajeros y otras células hematopoyéticas y de tipo dendrítico, que han demostrado estimular el rechazo de órganos. Se puede utilizar la perfusión de HA para movilizar células hematopoyéticas y de tipo dendrítico fuera de un órgano ex vivo que ya se ha recogido del donante. Esto incluye, por ejemplo, la perfusión in vivo de tejidos de un donante de órganos legalmente muerto, in vivo antes de la recogida del órgano, por ejemplo, corazón, hígado / pulmón, riñón u otros tejidos requeridos para el transplante de órgano. Esto también incluye la infusión de HA antes y durante la perfusión ex vivo que se produce tras haberse recogido un órgano, que se va a utilizar para transplante, del donante de órganos antes de injertarlo en el huésped receptor.

Se cree que este método de infundir HA antes y durante los regímenes de perfusión in vivo y/o ex vivo mejorará sustancialmente la reducción de las células hematopoyéticas del donante en comparación con las disoluciones de perfusión sin HA tales como las utilizadas por los expertos en la técnica, mejorando así la supervivencia del injerto. Esto incluye el uso de una forma(s) de HA tal como se enseña en la invención, incluyendo formas de HA de bajo peso molecular (formas más pequeñas).

Se puede utilizar una composición farmacéutica que contiene HA para tratar individuos huésped a punto de recibir un transplante de órgano, antes y durante el procedimiento de transplante. Esto movilizará cualquier célula hematopoyética o de tipo dendrítico del huésped fuera de / separada de la localización de transplante del órgano. Esto retrasará la capacidad de las células hematopoyéticas o de tipo dendrítico del huésped para alojarse en el órgano transplantado y las forzará a permanecer en circulación, maximizando así los efectos del tratamiento posterior o simultáneo con agentes inmunosupresores.

El uso de una composición farmacéutica que contiene HA puede movilizar células hematopoyéticas y células de tipo dendrítico fuera de / separadas de un injerto de órgano que muestra signos de rechazo inmunológico, tal como entenderán los expertos en la técnica. La infusión de HA, con o sin los regímenes inmunosupresores utilizados por los expertos en la técnica, estimulará la migración / movilización fuera del injerto de órgano amenazado de las células infiltrantes hematopoyéticas del huésped, que atacan un injerto de órgano. Esta movilización, tal como se enseña en la invención, fuerza a las células hematopoyéticas y de tipo dendrítico que infiltran el injerto a la sangre, donde son inmunosuprimidas más eficazmente por los agentes utilizados por los expertos en la técnica.

Se puede utilizar una composición farmacéutica que contiene HA para optimizar los regímenes inmunosupresores utilizados por los expertos en la técnica para amortiguar o inhibir las respuestas inmunes, por ejemplo en el transplante de órgano o célula hematopoyética, en estados autoinmunes o similares a los autoinmunes y en asma / alergia, o en cualquier estado que implique reactividad inmune perjudicial. Se puede administrar una cantidad eficaz de HA a un paciente para optimizar los regímenes inmunosupresores utilizados en los pacientes para amortiguar o inhibir la respuesta inmune. Los niveles de agentes inmunosupresores en la sangre superan los que hay en otros tejidos. La movilización de las células hematopoyéticas autorreactivas o de rechazo, particularmente los linfocitos y las células de tipo dendrítico, desde el tejido en riesgo de autoinmunidad o rechazo a la sangre reducirá-parará el ataque inmunológico y facilitará la inmunosupresión de las células atacantes hematopoyéticas y de tipo dendrítico en la sangre aumentando su exposición a los agentes inmunosupresores.

Se puede utilizar una composición farmacéutica que contiene HA para maximizar la destrucción mediante quimioterapia de células hematopoyéticas y de tipo dendrítico, infundiendo HA antes y durante el tratamiento citorreductor administrado antes de un transplante autólogo o alógeno de célula hematopoyética a, por ejemplo, pacientes con cáncer, comprendiendo tal método la administración a un paciente de una cantidad eficaz de HA para maximizar la destrucción mediante quimioterapia de células hematopoyéticas y de tipo dendrítico en pacientes que se benefician de la misma. El HA infundido movilizará las células hematopoyéticas y de tipo dendrítico a la sangre, donde se vuelven más sensibles a los agentes citorreductores utilizados por los expertos en la técnica, incluyendo quimioterapia y/o regímenes de irradiación, basado en las pruebas de que las células sencillas son más vulnerables a estos agentes de lo que lo son las células en contacto con otras células y factores microambientales (es decir, en un microambiente anclado o como un agregado celular).

Ahora se ilustrarán realizaciones de la invención con referencia a las siguientes figuras, en las que:

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1-6 representan los resultados de la técnica de citometría de flujo, de análisis celular, que identifica células, en este caso, los glóbulos blancos (los glóbulos rojos se excluyeron específicamente de las células analizadas) según sus características de la superficie celular (utilizando anticuerpos conocidos para detectarlos) y sus tamaños, tomados de individuos sanos a los que se administró la forma de ácido hialurónico, hialuronato sódico, en el tiempo "0" y a partir de los que se extrajo sangre en los tiempos: 0 (figura 1); 1 hora tras la administración de hialuronato sódico (figura 2); 4 horas tras la administración (figura 3); 12 horas tras la administración (figura 4); 24 horas tras la administración de hialuronato sódico (figura 5); y 72 horas tras la administración (figura 6).[Las células sanguíneas utilizadas se habían purificado previamente utilizando centrifugación sobre Ficoll-Paque^{MR} (disponible comercialmente de Pharmacia)].

Descripción detallada de las figuras

Por tanto, la figura 1 (y las demás figuras 2-6) proporciona gráficos de características celulares, incluyendo granularidad (representado verticalmente) y dispersión frontal (altura FSC), respecto al tamaño de las células (representado horizontalmente). El gráfico muestra diferentes fracciones, marcadas de G_{1} a G_{4} (correspondientes a de R_{1} a R_{4}, siendo R el campo completo) de las cuales G_{4} es la que muestra los cambios en el número de células granulares más grandes, que se concluye que han salido / emigrado de la médula ósea. (R_{5} es el campo completo de células analizadas). Se concluye que la presencia de las células granulares grandes es indicativa de la movilización generalizada que incluye células madre (que son pequeñas y, por tanto, tienen una dispersión de luz baja y no se identificaron específicamente en este ensayo) y otras células hematopoyéticas.

Las células que caen dentro de la región identificada como G_{4} son aquellas que tienen propiedades de dispersión de luz elevada. La dispersión directa elevada indica un gran tamaño físico. La dispersión lateral elevada indica un aumento de la granularidad. En individuos normales, las células mononucleares sanguíneas periféricas incluyen muy pocas células en esta fracción de tamaño, en el intervalo de aproximadamente el 0-3%. La infusión de HA produce un gran aumento del número de células que aparecen en esta fracción de tamaño, lo que indica que migraron recientemente a la sangre. Normalmente, la mayoría de las células con dispersión de la luz elevada residen en la médula ósea. Como ejemplo, las células plasmáticas, las células que son secretores de anticuerpos de alta velocidad, están en esta fracción de tamaño y aparecen en la sangre sólo en estados patológicos tales como el mieloma múltiple. La expresión de CD19, un marcador de células B presente en algunas células plasmáticas, y la elevada dispersión, indican que el HA había movilizado las células plasmáticas de la médula ósea a la sangre de los voluntarios normales. La mayoría de las células plasmáticas normales se localizan en la médula ósea. Tras la infusión de HA, el número de células con dispersión elevada aumentó de manera espectacular durante el periodo de estudio de 72 horas.

Por tanto, es claro que el porcentaje de las células en G_{4} respecto a todas las células en el campo (R_{5}), que comprende G_{1} (que corresponde a R_{1}), G_{2} (que corresponde a R_{2}), G_{3} (que corresponde a R_{3}) y G_{4} (que corresponde a R_{4}) y las demás encontradas en R_{5} que no se han explicado anteriormente son con respecto a:

Figura 1 (tras 0 horas) \rightarrow 5% calculado como (G_{4})x 100% (R_{5})

Figura 2 (tras 1 hora) \rightarrow 9% calculado como (G_{4}) x 100% (R_{5})

Figura 3 (tras 4 horas) \rightarrow 26% calculado como (G_{4}) x 100% (R_{5})

Figura 4 (tras 12 horas) \rightarrow 30% calculado como (G_{4}) x 100% (R_{5})

Figura 5 (tras 24 horas) \rightarrow 9% calculado como (G_{4}) x 100% (R_{5})

Figura 6 (tras 72 horas) \rightarrow 6% calculado como (G_{4}) x 100% (R_{5})

(Cada una de las figuras 1-6 viene acompañada por datos de apoyo y representaciones gráficas de Recuentos frente a Altura FSC)

Los datos mostrados se basan en ejemplos en los que la cantidad de hialuronato sódico es igual o supera a 1,5 mg/kg de peso corporal del paciente (por ejemplo, 6 mg/kg y 12 mg/kg, que proporcionan resultados muy similares). Antes de administrar las cantidades de 6 mg/kg y 12 mg/kg, se administró a los pacientes 1,5 mg/kg y 3,0 mg/kg, tal como se ha tratado.

Las características del hialuronato sódico utilizado con los protocolos se exponen a continuación:

''A''
Pruebas	Especificaciones	Resultados
pH	5,0 a 7,0 a 25^{o}C	6,0
Gravedad específica	0,990 a 1,010 a 25°C	1,004
Viscosidad intrínseca	4,5 a 11,0 dL/g	7,07
Peso molecular	178.000 a 562.000	319.378
	daltons	daltons
Valoración e	9,0 a 11,0 mg/ml.	9,9 mg/ml
identificación de	Positivo	Positivo
hialuronato sódico

\newpage

Otra cantidad puede comprender:

Pruebas	Especificaciones
1. Descripción	Polvo blanco o crema inodoro
2. Identificación (espectro IR)	Se ajusta a espectro estándar de referencia
3. pH (disolución al 1%)	5,0 a 7,0
4. Pérdida por desecación	No más del 10%
5. Residuo de ignición	15,0% a 19,0%
6. Contenido en proteínas	No más del 0,1%
7. Metales pesados	No más de 20 ppm
8. Arsénico	No mas de 2 ppm
9. Disolventes residuales
a) Formaldehído	No más de 100 ppm
b) Acetona	No más del 0,1%
c) Etanol	No más del 2,0%
10. Valoración (base seca)	97,0 al 102,0%
de hialuronato sódico
11. Viscosidad intrínseca	10,0 a 14,5 dL/g
12. Peso molecular	500.000 a 800.000 daltons
13. Recuento microorganismos aerobios totales (USP 23)	No más de 50 microorganismos/g
14. Escherichia coli (USP 23)	Ausente
15. Levaduras y mohos (USP 23)	No más de 50 microorganismos/g
16. Endotoxinas bacterianas (LAL) (USP 23)	No más de 0,07 UE/mg

Se siguió el siguiente protocolo para la administración del hialuronato sódico identificado como "A" en las páginas anteriores y la extracción de sangre de los pacientes a los que se administró el hialuronato sódico.

A cuatro mujeres voluntarias, sanas y no fumadoras y a cuatro hombres voluntarios, sanos y no fumadores se les administró, a diferentes tiempos (al menos 7 días entre las dosis), las siguientes dosis:

(A)

1,5 mg/kg de peso corporal de infusión intravenosa de disolución estéril de ácido hialurónico al 1%.

(B)

3,0 mg/kg de peso corporal de infusión intravenosa de disolución estéril de ácido hialurónico al 1%.

(C)

6,0 mg/kg de peso corporal de infusión intravenosa de disolución estéril de ácido hialurónico al 1%.

(D)

12,0 mg/kg de peso corporal de infusión intravenosa de disolución estéril de ácido hialurónico al 1%.

(La disolución de ácido hialurónico era tal como se describió en el presente documento como "A" en las páginas anteriores de esta memoria descriptiva).

En cada caso, se infundió un volumen total de 250 ml. Por tanto, se diluyó la disolución de ácido hialurónico al 1%, según fue necesario, con un volumen apropiado de disolución de cloruro sódico al 0,9%. La infusión se realizó durante un periodo de 120 minutos.

Cada una de las dosis se administró de manera creciente (1,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 6,0 mg/kg y 12,0 mg/kg) a cada uno de los individuos con al menos 7 días entre las dosis. Se pidió a los individuos que realizaran actividad normal durante las primeras cuatro horas tras la administración del fármaco, evitando tanto el ejercicio vigoroso como el reposo absoluto.

Se extrajeron muestras de sangre de cada persona a intervalos de tiempo de 0, 1, 4, 12, 24 y 72 horas tras la administración de cada una de las dosis.

Se analizaron las células en las muestras extraídas mediante una técnica de análisis celular conocida, denominada citometría de flujo. Las figuras 1-6 ilustran los resultados de analizar los glóbulos blancos purificados de las muestras de sangre tomadas de los individuos tras 0, 1, 4, 12, 24 y 72 horas después de la administración de 12 mg/kg de peso corporal de hialuronato sódico mediante infusión venosa a los individuos, tras purificación. (Los glóbulos rojos se habían excluido del análisis de estas pruebas).

El área G muestra las células con dispersión de luz elevada, denominadas en el presente documento células grandes, de las muestras de sangre. Células que tienen estas propiedades incluyen células plasmáticas, células polimorfonucleares (tales como granulocitos, neutrófilos y similares) u osteoclastos. Normalmente, a tiempo t = 0 horas [en la infusión], sólo están presentes pequeñas cantidades de estas células en la sangre normal (menos del 3% del total de la población de glóbulos blancos [R_{5}]). Tras la administración de 12 mg de hialuronato sódico/kg de peso corporal, su presencia aumenta. [También fueron visibles aumentos cuando se infundieron cantidades inferiores de HA/kg, pero no se muestran].

Tras la infusión de 12 mg/kg a un individuo normal, se tomó una muestra de sangre, se purificó y se analizó con los siguientes resultados:

tiempo (t) horas	% de células que son células grandes
1	9,47
4	25,88
12	30,03
24	9,10
72	6,80

Estas células grandes, que se detectan en cifras relativamente elevadas en la sangre tras la infusión de HA, se concluye que son emigrantes desde la médula ósea. Debido a que sus propiedades de dispersión son idénticas a las de las células B de fase tardía y las células plasmáticas que surgen en estados cancerosos (por ejemplo, mieloma múltiple), también se concluye que incluyen células emigrantes desde la médula ósea, la principal localización de células plasmáticas en el organismo. La caracterización fenotípica de estas células grandes que surgen tras la infusión de HA indica que expresan una baja densidad del marcador CD19 de células B, lo que también concuerda con su identidad como células plasmáticas. Si se estimulan las células plasmáticas a la conducta migratoria mediante la infusión de HA, también se estimularán otros tipos celulares, en particular células madre, a la conducta migratoria. Por tanto, se concluye que estas células grandes similares a las plasmáticas son indicadores de la migración de células hematopoyéticas desde la médula ósea a la sangre. El HA regula por incremento los receptores para HA así como manda señales a la célula que activan la conducta motógena y, en última instancia, la migración fuera de la médula ósea a la sangre.

Por tanto, en lugar de utilizar GM-CSF recombinante con sus 20 efectos secundarios, el individuo puede recibir ahora una forma de ácido hialurónico (sin los mismos efectos secundarios). Debido a la falta de toxicidad, se pueden administrar a un paciente cantidades superiores a 12 mg/kg de peso corporal para obtener el efecto. Se ha encontrado que una cantidad de 6 mg de hialuronato sódico/kg de peso corporal administrada a un individuo tiene un efecto similar a la administración de 12 mg de hialuronato sódico/kg de peso corporal. Cantidades menores a 6 mg/kg de HA administrado consiguen efectos detectables sobre los tipos celulares de la sangre periférica. Durante este protocolo de infusión de 4 semanas, las dosis iniciales tuvieron efecto sobre las últimas dosis. Por ejemplo, las de 1 mg/kg y 3 mg/kg de peso del paciente "preparan" al paciente de modo que pueden ser adecuadas cantidades menores de la forma de ácido hialurónico, que son eficaces para estimular la producción / liberación de las células hematopoyéticas en dosis posteriores.

El ejemplo tratado a continuación se ha especificado también tal como sigue:

Según el ejemplo, se infundió de forma intravenosa HA (una disolución al 1% a partir de Streptomyces, de peso molecular 200.000-300.000, con menos del 0,1% de contaminantes proteicos [Hyal Pharmaceutical Corporatio, Mississauga, Ontario] descrito como "A" anteriormente en la solicitud, a cada uno de 6 voluntarios adultos normales, semanalmente durante 4 semanas. La dosis de HA administrada en cada una de las 4 semanas fue:

Semana 1: 1,5 mg de HA por kg de peso corporal,

Semana 2: 3 mg de HA por kg de peso corporal,

Semana 3: 6 mg de HA por kg de peso corporal,

Semana 4: 12 mg de HA por kg de peso corporal,

La dosis se infundió durante un periodo de aproximadamente 2 horas, cada semana.

Cada semana, se tomaron muestras de sangre a tiempo cero (inmediatamente antes de la infusión) y en los puntos de tiempo de 1 hora, 4 horas, 12 horas, 24 horas y 72 horas tras iniciarse la infusión. Se purificaron los glóbulos blancos utilizando técnicas estándar de laboratorio clínico y luego se analizaron para determinar sus propiedades físicas (tamaño y granularidad), utilizando métodos de citometría de flujo que están bien establecidos en la técnica. Se tiñeron las células con anticuerpos monoclonales (marcados con una ficoeritrina, que tiñe de naranja) que se aceptan en la técnica para detectar células B (CD19), células T (CD4 y CD8) y monocitos (CD14). Se detectó la capacidad de unir HA exponiendo las células a HA marcado con FITC (isotiocianato de fluoresceína, que tiñe de verde). Los tipos de glóbulos blancos se definieron mediante estas propiedades tal como se acepta ampliamente en la técnica de análisis clínicos.

Resultados

La infusión de HA produjo la aparición en la sangre de tipos y cifras de glóbulos blancos no observados en la sangre normal. Se observaron los siguientes cambios en las muestras de sangre tomadas tras la infusión de HA.

Aumento de las células polimorfonucleares

Un subconjunto de células grandes con dispersión lateral (SSC) elevada, que tenían las propiedades de las células polimorfonucleares sumamente granulares, aumentó desde aproximadamente el 4% hasta aproximadamente el 30% de las células sanguíneas periféricas totales. Este aumento se produjo más marcadamente en las semanas 3 y 4 (las dosis de 6 y 12 mg/kg) y durante el periodo de tiempo desde 4 hasta 12 horas tras la infusión.

Aparición de eritroblastos

En el punto de tiempo de 4 horas en la semana 4 (la dosis de 12 mg/kg), la muestra de sangre tenía muchos glóbulos rojos que se agregaban sobre la interfaz del gradiente de purificación Ficoll-Paque^{MR}. Esto no se produce en la sangre normal, pero es frecuente en la médula ósea y en algunas muestras de sangre tomadas tras quimioterapia para mieloma múltiple, y normalmente es debido a la presencia de eritroblastos que aumentaron de número tras la quimioterapia. Por tanto, se concluye que se movilizaron los eritoblastos mediante la infusión de HA.

Aparición de células plasmáticas

En el punto de tiempo de 72 horas, en la semana 4 (la dosis de 12 mg/kg), hubo grandes cifras de células granulares grandes, con una débil expresión de CD19 (un marcador de células B) y elevada unión a HA, las características de las células plasmáticas. Normalmente, las células plasmáticas no se encuentran en la sangre y la mayoría de las células plasmáticas en individuos normales se localizan en la médula ósea. Esto sugiere que el HA ha liberado las células plasmáticas de la médula ósea. Esto no parece suceder en las movilizaciones con citosina, lo que sugiere que el HA moviliza tipos celulares que no se movilizan normalmente.

Aparición de monocitos de fase temprana

En la semana 4, a tiempo cero, existen grandes cifras (del 20 al 40%) de células que tienen las propiedades de dispersión esperadas para los monocitos. Sin embargo, el uso de un marcador de monocitos no los detectó y, al contrario que los monocitos, no unieron HA. Puesto que solo están presentes a tiempo 0, y sólo la semana 4, son emigrantes tardíos a la sangre que resultan de la infusión previa de HA. Parecen ser monocitos de fase temprana.

Aumento de la proporción de células pequeñas

En los puntos de tiempo de 24-72 horas para las semanas 3 y 4 (las dosis de 6 y 12 mg/kg), la mayoría de las muestras tenían un aumento marcado de la proporción de células pequeñas. Éstas incluyen células T, células B y probablemente células madre hematopoyéticas.

Por tanto se ha concluido que las poblaciones inusuales en los glóbulos blancos purificados tras la infusión de HA son células que han migrado a la sangre como resultado de la exposición a HA. En un ejemplo, esto es debido a un efecto competitivo que media la liberación desde la matriz de la médula ósea, así como una activación de la migración celular por HA (que se sabe que tiene un papel principal en la motilidad celular). Los modelos indican la liberación / migración temprana (4 h) de polimorfos y eritroblastos (células progenitoras de glóbulos rojos de fase relativamente tardía, que son nucleadas), la liberación posterior de células madre, linfocitos pequeños y células plasmáticas (24-72 horas) y la liberación muy posterior de células monocitoides (7 días). Los cambios más espectaculares sucedieron en la semana 4 y tendieron a aumentar progresivamente durante el periodo de 4 semanas. Por tanto, muchas infusiones de HA movilizan más células y más tipos de células que sólo una infusión, y concentraciones más elevadas movilizan más células y tipos celulares que dosis inferiores. La movilización a las 4 horas y después se correlaciona con la presencia en circulación y en el organismo de fragmentos más pequeños de HA. El HA digerido puede ser un mejor agente movilizador que el HA grande. Tan sólo una exposición a la dosis menor de HA altera las poblaciones de glóbulos blancos purificados, indicativo de movilización. Sin embargo, ocurre de manera más reproducible a dosis más elevadas o después de más de una infusión. El examen minucioso de los datos tomados en las semanas 1 y 2 (tras la infusión de concentraciones de 1,5 ó 3 mg/kg de HA) indicó que se producía al menos la movilización de las células grandes. El examen de los datos de las personas normales sin tratar y de los datos a tiempo 0 para los 3 ciclos posteriores de tratamiento indicó que los efectos del HA fueron acumulativos, puesto que la proporción de células con dispersión elevada aumentó gradualmente durante el periodo de 4 semanas.

Puesto que pueden realizarse muchos cambios a las realizaciones sin separarse del alcance de la invención, se pretende que todo el material contenido en el presente documento se interprete como ilustrativo de la invención y no en un sentido limitante.

Claims (27)

1. Uso de ácido hialurónico o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, que tienen un peso molecular inferior a 750.000 daltons, en la fabricación de una composición farmacéutica para potenciar la estimulación de la producción o liberación celular desde la médula ósea y otras localizaciones tisulares a la sangre, siendo las células, células hematopoyéticas o células de tipo dendrítico, utilizándose dicha composición para:

-

preparar órganos o células concebidos para transplante; o

-

para el tratamiento un paciente que recibió un transplante de órgano o células, de estados autoinmunes o similares a los autoinmunes, de un paciente inmunosuprimido o inmunodeficiente, cáncer, SIDA, alergia, asma, osteoporosis o anemia.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para la estimulación y activación de células estromales.

3. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para potenciar la estimulación y activación de células estromales.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición es para la liberación de células cancerígenas desde la médula ósea y otros tejidos a la sangre.

5. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para estimular y liberar células hematopoyéticas o células de tipo dendrítico desde la médula ósea y otros tejidos a la sangre.

6. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para estimular la producción o liberación de células hematopoyéticas o células de tipo dendrítico desde la médula ósea y otros tejidos a la sangre.

7. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para movilizar células hematopoyéticas y de tipo dendrítico desde la médula ósea y otros tejidos de un ser humano a la sangre del ser humano.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que dichas células hematopoyéticas son células madre.

9. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para generar células madre para transplante.

10. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para tratar la inmunosupresión producida por la quimioterapia.

11. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para tratar la inmunosupresión producida por el SIDA.

12. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para tratar cáncer.

13. Uso según la reivindicación 1, en el que dichas células hematopoyéticas son células progenitoras de mastocitos.

14. Uso según la reivindicación 13, en el que dicha composición farmacéutica es para modular los síntomas de alergia o asma.

15. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para aumentar el nivel de glóbulos rojos en la sangre.

16. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para movilizar células hematopoyéticas antes y durante la recogida del tejido que se va a utilizar para los transplantes de órganos.

17. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para movilizar células hematopoyéticas y de tipo dendrítico fuera de un órgano ex vivo que ya se ha recogido del donante.

18. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para tratar individuos huésped a punto de recibir un transplante de órgano, antes y durante el procedimiento de transplante.

19. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para movilizar células hematopoyéticas y células de tipo dendrítico separadas o fuera de un injerto de órgano que muestra signos de rechazo inmunológico.

20. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para optimizar los regímenes inmunosupresores utilizados en un paciente para amortiguar o inhibir las respuestas inmunes.

21. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es para maximizar la destrucción mediante quimioterapia de células hematopoyéticas y de tipo dendrítico en pacientes que se benefician de la misma.

22. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que la forma de ácido hialurónico es hialuronato sódico.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que la forma de ácido hialurónico tiene un peso molecular de aproximadamente 320.000 daltons.

24. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que la cantidad utilizada de ácido hialurónico o sales farmacéuticamente aceptables en la composición farmacéutica oscila entre 1,5 mg/kg hasta 3000 mg/70 kg de peso corporal del paciente.

25. Uso según la reivindicación 24, en el que la cantidad de ácido hialurónico oscila entre 1,5 mg/kg hasta 12 mg/kg de peso corporal del paciente.

26. Uso según la reivindicación 25, en el que la cantidad de ácido hialurónico es de aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal del paciente.

27. Uso según la reivindicación 25, en el que la cantidad de ácido hialurónico es de aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal del paciente.