ES2197907T3

ES2197907T3 - Metodo para esterilizar productos.

Info

Publication number: ES2197907T3
Application number: ES94922207T
Authority: ES
Inventors: Randall S. Kent
Original assignee: Clearant Inc
Current assignee: Clearant Inc
Priority date: 1993-07-22
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 2004-01-16
Anticipated expiration: 2014-07-22
Also published as: CA2167528A1; ATE235262T1; FI960281A; US6346216B1; KR960703625A; EP0710124A1; US20030143107A1; PT710124E; AU687425B2; DE69432351D1; WO1995003071A1; FI960281A0; US6635222B2; CA2167528C; AU7343494A; EP0710124B1; DK0710124T3; US5362442A; NZ269786A; BR9407138A

Abstract

SE DESCRIBE UN METODO PARA ESTERILIZAR PRODUCTOS PARA ELIMINAR CONTAMINANTES BIOLOGICOS COMO VIRUS, BACTERIAS, LEVADURAS, MOHOS, MICOPLASMAS Y PARASITOS. EL METODO INCLUYE PROPORCIONAR EL PRODUCTO EN UNA FORMA QUE CONTENGA MENOS DEL 20 % DE SOLIDOS Y POSTERIORMENTE IRRADIAR EL PRODUCTO CON RADIACION GAMMA DURANTE UN LARGO PERIODO DE TIEMPO. GENERALMENTE EL PRODUCTO ES IRRADIADO DURANTE UN PERIODO NO MENOR DE 10 HORAS. EL LARGO TIEMPO DE IRRADIACION EN CONJUNCION CON EL BAJO NIVEL DE SOLIDOS EN EL PRODUCTO REDUCE SUSTANCIALMENTE EL DAÑO AL PRODUCTO. EL METODO ES UTIL EN MATERIALES SENSIBLES A LA ESTERILIZACION COMO LA SANGRE Y COMPONENTES DE LA SANGRE.

Description

Método para esterilizar productos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para esterilizar productos para retirar contaminantes biológicos tales como virus, bacterias, levaduras, mohos, micoplasmas y parásitos.

Antecedentes de la invención

Varios productos que se preparan para uso humano, veterinario o experimental pueden contener contaminantes indeseados y potencialmente peligrosos tales como virus, bacterias, levaduras, mohos, micoplasmas y parásitos. Por consiguiente, es de suma importancia que se determine si tales productos carecen de contaminantes antes del uso. Esto es especialmente importante cuando el producto se va a administrar directamente a un paciente, por ejemplo, en transfusiones de sangre, transplantes de órganos y otras formas de terapias humanas. Esto también es importante para diversos productos biotecnológicos que se cultivan en medios que contienen diversos tipos de plasma y que pueden ser propensos a micoplasmas o a otros contaminantes virales.

Previamente, la mayoría de los procedimientos han implicado métodos que seleccionan o ensayan productos con respecto a un contaminante particular en lugar de eliminar el contaminante del producto (1). Los productos que dan un resultado positivo en un ensayo para un contaminante simplemente no se usan. Los ejemplos de procedimientos de selección incluyen el ensayo de un virus particular en la sangre humana procedente de donantes de sangre. Sin embargo, tales procedimientos no siempre son fiables y no pueden detectar la presencia de virus en números muy bajos. En vista de las consecuencias asociadas con un resultado falso negativo, esto reduce el valor o la fiabilidad del ensayo. En ciertos casos, por ejemplo, en el caso del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), los resultados falsos negativos pueden ser amenazadores para la vida. Además, en algunos casos, puede llevar semanas, e incluso meses, determinar si el producto está contaminado o no.

Ciertos esfuerzos más recientes se han centrado en métodos para retirar o inactivar contaminantes presentes en los productos. Tales métodos incluyen tratamiento térmico, filtración, adición de inactivadores químicos e irradiación gamma (2). Está bien documentado que la irradiación gamma es eficaz en la destrucción de virus y bacterias (2, 3). De hecho, un autor concluye que la irradiación gamma es el método más eficaz en la reducción o eliminación de los niveles de virus (2). Sin embargo, cuando se aplica a productos sensibles a la radiación, tales como sangre o productos sanguíneos, la irradiación gamma también puede tener efectos perjudiciales sobre el propio producto. En particular, se ha demostrado que las dosis de alta radiación son perjudiciales para los glóbulos rojos, las plaquetas y los granulocitos (3).

Sumario de la invención

En vista de lo anterior, se necesita proporcionar un método para esterilizar productos que sea eficaz en la eliminación de contaminantes biológicos y que al mismo tiempo no tenga efectos adversos sobre el producto. Los ejemplos de contaminantes incluyen virus, bacterias, levaduras, mohos, micoplasmas y parásitos.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para esterilizar un producto que comprende irradiar el producto con radiación gamma a una velocidad de aproximadamente 0,5 kGy/h a aproximadamente 3,0 kGy/h durante un período de tiempo inferior a 10 horas.

Mediante el método de la presente invención, la radiación gamma se suministra durante un período de tiempo prolongado que reduce substancialmente el daño en el producto. Típicamente, la irradiación se realiza durante un período de tiempo de no menos de 10 horas, preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 horas, más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 horas. La velocidad de irradiación varía de aproximadamente 0,5 kGy/h a aproximadamente 3,0 kGy/hr, dependiendo del producto a esterilizar así como de la duración del tiempo de irradiación. La cantidad total de irradiación proporcionada típicamente está en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 32 kGy, ya que se ha demostrado que estos niveles son eficaces en la destrucción de contaminantes tales como virus.

El producto se irradia en una forma que contiene preferiblemente menos del 20% de sólidos. Por consiguiente, ciertos productos deben diluirse antes de la irradiación. El tratamiento de los productos en forma diluida también sirve para reducir la degradación del producto durante la irradiación. La elección del diluyente depende de la naturaleza del producto a irradiar. Por ejemplo, cuando se irradian glóbulos rojos, se debe elegir un diluyente fisiológicamente aceptable tal como citrato fosfato dextrosa.

El proceso de acuerdo con la presente invención puede realizarse a temperatura ambiente y no requiere la refrigeración, congelación o tratamiento químico del producto antes de que se lleve a cabo el proceso. Esto evita algunas de las etapas de tratamiento extra que están presentes en ciertos procesos de la técnica anterior.

El método de la presente invención es útil en el tratamiento de productos orgánicos que son sensibles a la irradiación. Tales productos pueden ser propensos a la degradación cuando se irradian por métodos convencionales. Sin embargo, no es de esperar que la irradiación de productos sensibles a la irradiación por el presente método sea perjudicial para los productos. El método típicamente se aplica a productos biológicos tales como sangre y componentes sanguíneos, aunque no se limita a los mismos.

En los casos en los que se van a irradiar células vivas (tales como células sanguíneas), puede añadirse un eliminador que se una a los radiales libres y a otros materiales que son tóxicos para las células. Un eliminador adecuado es etanol.

La eficacia del método de la presente invención es contraria a lo que han previsto otros especialistas en este área. En particular, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.620.908(1) se indica que si se aplicara irradiación gamma sobre un material proteico a temperatura ambiente, el material se destruiría casi completamente o se destruiría en tal grado que el material se volvería prácticamente ineficaz. A diferencia de esto, cuando se ha ensayado en sangre, el método de la presente invención no ha destruido la viabilidad de las células contenidas en la misma.

El documento EP 0 334679 A1 muestra la irradiación de productos de plasma sanguíneo o derivados de plasma a temperaturas de -20ºC a -60ºC usando dosificaciones de 1 o 2 a 20 o 40 KGy/hora, convencionalmente de 4 a 15 kGy/hora.

Descripción de las realizaciones preferidas

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar el método de la presente invención y no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1 Esterilización de Sangre

Se usó una bolsa de 200 ml de glóbulos rojos envasados de un día. Se añadió etanol a las células para conseguir una concentración final de etanol del 0,01%. Los glóbulos rojos se diluyeron por un factor de uno en diez usando una solución de Citrato Fosfato Dextrosa (CPD) modificada que tenía un pH de aproximadamente 6,4 a 6,7 y que tenía la siguiente composición en un volumen total de 500 ml:

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|ll|}\hline 
Ácido Cítrico Monohidrato  \+ 0,2 g \\  Citrato Sódico Dihidrato  \+
26,3 g \\  Fosfato Sódico Monobásico  \+ 2,2 g \\  Fosfato Sódico
Dibásico  \+ 1,0 g \\  Dextrosa  \+ 3,2 g
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Las células se irradiaron en un irradiador gamma de tamaño comercial que contenía una rejilla fuente de cobalto 60. La irradiación se realizó sin soporte en una caja desprotegida. Las células se irradiaron durante veinticuatro horas a una velocidad de aproximadamente 1 kGy/h. Después del período de irradiación, los glóbulos rojos se examinaron visualmente y se descubrió que eran viables, con un color rojo brillante. Una muestra de control, compuesta por glóbulos rojos envasados que no se diluyeron con la solución de CPD descrita anteriormente, no fueron viables después de la irradiación.

Cuatro días después del procedimiento de irradiación, las células diluidas se ensayaron con respecto a los niveles de diversos componentes sanguíneos y los resultados se muestran en la tabla 1. La muestra de control constaba de sangre de la misma bolsa que la muestra de ensayo, pero no experimentó irradiación. La tabla 1 demuestra que la dilución e irradiación de glóbulos rojos humanos no alteraba significativamente el recuento de glóbulos blancos. Los valores del recuento de plaquetas y del hematocrito fueron ligeramente inferiores que en el control, sin embargo, estos valores siguen estando dentro del intervalo observado en la sangre de un adulto normal. El nivel de hemoglobina fue superior al del control, lo que indica que algunos glóbulos rojos se lisaron durante el procedimiento. Esto también se demuestra por el recuento inferior de glóbulos rojos. Sin embargo, a diferencia de lo que se ha publicado previamente, una radiación de hasta 25 kGy no destruyó los componentes de la sangre por el presente procedimiento. Las células también se contaron y se descubrió que eran viables después de 25 kGy de irradiación gamma.

TABLA 1

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|}\hline 
Componente  \+ Sangre Irradiada  \+ Sangre de Control \\\hline 
Glóbulos Blancos  \+ 4 K/mm ^{3}   \+ 4,8 K/mm ^{3}  \\\hline 
Glóbulos Rojos  \+ 3 Mi/mm ^{3}   \+ 7,2 Mi/mm ^{3}  \\\hline 
Hemoglobina  \+ 42 g/dl  \+ 21 g/dl \\\hline  Hematocrito  \+ 46% 
\+ 64% \\\hline  Plaqueta  \+ 100 k/mm ^{3}   \+ 120 k/mm ^{3} 
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 2 Esterilización de Dextrosa

Se usan soluciones que contienen dextrosa (o glucosa) en el tratamiento de reducción de carbohidratos y de fluidos, en el tratamiento de hipoglucemias, como elemento para expandir el plasma, en diálisis renal y para neutralizar hepatotoxinas (4,5). La dextrosa también es la fuente preferida de carbohidratos en regímenes de nutrición parental (4,5). En todas las aplicaciones anteriores, la dextrosa debe esterilizarse antes del uso. La esterilización de productos que contienen dextrosa se realiza generalmente por esterilización térmica o esterilización en autoclave. Desafortunadamente, se ha informado que estos métodos degradan o caramelizan soluciones que contienen dextrosa ocasionando un cambio de color en la solución (5). También se ha informado que la irradiación gamma de la glucosa descompone soluciones que contienen glucosa (6). Por lo tanto, se necesita un método que pueda esterilizar productos que contienen dextrosa que no degrade el propio producto. En vista de los problemas de la técnica anterior, se trató una solución de dextrosa de acuerdo con el método de la presente invención como se indica a continuación.

Se irradió una solución de dextrosa al 5% durante 24 horas, a una velocidad de aproximadamente 1 kGy/h. Después de la irradiación, se ensayó el producto y se descubrió que no había ningún cambio en el espectro de luz visible en comparación con el control no irradiado. Por lo tanto, el presente método puede ser útil en la esterilización de productos que contienen dextrosa.

Después del experimento anterior, se irradiaron nuevas soluciones de dextrosa al 5 y al 50% a 25 kGy durante 36 horas a temperatura ambiente. Los resultados fueron similares a los descritos anteriormente. Además, se obtuvieron exploraciones UV/VIS y demostraron una ausencia completa del pico a 283,4 nm para los ``furfurales'' según la U.S.P. Por el contrario, las muestras de dextrosa esterilizadas usando un autoclave contienen el pico de furfural a 283,4.

Ejemplo 3 Esterilización de Albúmina de Suero Humano

Se irradió albúmina de suero humano normal como una solución de sal al 25% a una dosis total de 25 kGy durante 36 horas usando una célula Gamma 220. Durante la irradiación no se controló la temperatura, pero se estima que el recipiente que contenía la solución de albúmina estaba a aproximadamente 23ºC. En la tabla 2 se muestran los resultados del análisis de HPLC.

TABLA 2

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline 
Parámetro  \+ Control (%)  \+ Irradiado(%) \\\hline  Polímero  \+ 2 
\+ 3 \\\hline  Dímero  \+ 7  \+ 8 \\\hline  Monómero  \+ 90  \+ 86
\\\hline  Bajo Peso Molecular  \+ 1  \+ 3 \\\hline  pH  \+ 7,05  \+
6,97 \\\hline  NTU (debe ser  > 20)  \+ 11,4  \+ 11,4
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Como demuestran los resultados, la albúmina de suero humano normal puede irradiarse de forma segura a 25 kGy a temperatura ambiente sin que se vean afectadas adversamente las propiedades esenciales de la proteína. Esto no se ha demostrado anteriormente. Todos los demás intentos de irradiar la albúmina de suero requieren que se irradie en el estado congelado. Esto aumenta el coste y la dificultad de realizar la irradiación.

Ejemplo 4

Se extrajo sangre humana normal de un donante sano en un tubo heparinizado; se lavó tres veces con solución de CPD convencional, y después se diluyó a 1:20 con CPD que contenía un 0,01% v/v de etanol. Esta última solución de CPD con un 0,01% v/v de etanol se denomina SCPD. Después, se pusieron alícuotas de 2 ml en tubos de ensayo de plástico de 10 ml y se irradiaron a diferentes dosis hasta 26 kGy durante 36 horas a temperatura ambiente. No hubo hemolisis y las células parecían intactas aunque algo grandes y de forma ligeramente irregular. En la tabla 3 se presentan los resultados de tres experimentos distintos.

TABLA 3

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|c|c|c|}\hline
 Parámetro  \+ RBC ^{1}   \+ HGB ^{2}   \+ HCT ^{3}   \+ MCV ^{4}  
\+ MCH ^{5}   \+  MCHC ^{6}   \+ RDW ^{7}   \+ Indicadores \\\hline 
1*  \+ 1,08  \+ 41  \+ 0,097  \+ 89,5  \+ 38,3  \+ 427  \+ 17,7  \+
Casi Normal \\  Control  \+ 0,99  \+ 33  \+ 0,089  \+ 90,2  \+ 33,0 
\+ 366  \+ 15,3 \+ \\\dddcline{2}{9}  2*  \+  \+  \+  \+ 95,0  \+
32,3  \+ 339  \+ 12,0 \+ \\  \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline  12
kGy 1  \+ 1,22  \+ 45  \+ 0,166  \+ 135,8  \+ 36,5  \+ 269  \+ 27,3 
\+ 1+Anisocitosis \\   \+ 1,38  \+ 45  \+ 0,199  \+ 144,7  \+ 33,0 
\+ 228  \+ 24,9  \+ 3+Macrocitosis \\\hline  1  \+ 1,04  \+ 32  \+
0,169  \+ 163,0  \+ 31,3  \+ 192  \+ 18,8  \+ 1+Anisocitosis \\ 
16kGy  \+ 0,54  \+ 29  \+ 0,088  \+ 162,5  \+ 54,5  \+ 335  \+ 18,8 
\+ 3+Macrocitocis \\\dddcline{2}{9}  2  \+ 0,82  \+ 27  \+ 0,128  \+
156,5  \+ 32,8  \+ 209  \+ 19,8  \+ 2+Anisocitosis \\   \+ 0,81  \+
26  \+ 0,124  \+ 152,6  \+ 32,4  \+ 212  \+ 20,2  \+ 3+Macrocitocis
\\\hline  1  \+ 0,79  \+ 244  \+ 0,125  \+ 158,4  \+ 30,8  \+ 194 
\+ 19,4  \+ 1+Anisocitosis \\  20 kGy  \+ 1,26  \+ 28  \+ 0,203  \+
161,5  \+ 22,1  \+ 137  \+ 19,0  \+ 3+Macrocitocis \\\dddcline{2}{9}
 2  \+ 0,93  \+ 30  \+ 0,141  \+ 151,5  \+ 32,3  \+ 213  \+ 20,1  \+
2+Anisocitosis \\   \+ 0,92  \+ 30  \+ 0,143  \+ 155,5  \+ 32,1  \+
207  \+ 20,5  \+ 3+Macrocitocis \\\hline  26 kGy 1  \+ 1,15  \+ 34 
\+ 0,180  \+ 155,9  \+ 29,4  \+ 189  \+ 19,3  \+ 1+Anisocitosis \\  
\+ 1,15  \+ 34  \+ 0,176  \+ 153,0  \+ 29,9  \+ 195  \+ 23,4  \+
3+Macrocitocis \\\hline\multicolumn{9}{r}{* Experimiento 1 y
Experimento
2.}\\\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

1. Recuento de Glóbulos Rojos: Células x 10^{12}/litros.

2. Hemoglobina: gramos/litro.

3. Hematocrito.

4. Volumen corpuscular medio: Femtolitros.

5. Hemoglobina corpuscular media: picogramos.

6. Concentración de hemoglobina corpuscular media: gramos/litro.

No hubo hemolisis y las células parecían intactas aunque algo grandes y de forma ligeramente irregular. Las células se pusieron fácilmente en suspensión y se reconstituyeron en tampón nuevo.

Los tres siguientes experimentos (ejemplos 5, 6 y 7) se realizaron para determinar la eficacia del método cuando se trata sangre que contiene VIH. En cada ejemplo, las células se trataron de forma similar. El análisis se realizó en un segundo laboratorio independiente. El segundo laboratorio también se eligió porque podía manipular el virus del SIDA. En estos experimentos, las células se agitaron suavemente después de 12, 16 y 24 horas. Además, en el tercer experimento, (ejemplo 7), las células se pusieron en matraces T25 para proporcionar un área de superficie mayor y reducir la concentración debida a la sedimentación en el fondo de los tubos de centrífuga.

Ejemplo 5 Esterilización de Sangre que contiene VIH

El siguiente experimento se realizó con los siguientes objetivos específicos:

1.: Evaluar la toxicidad del proceso hacia los glóbulos rojos (RBC).

2.: Evaluar la actividad anti-retroviral del proceso.

Procedimiento

Inicialmente, se obtuvieron 2 ml de sangre anticoagulada a partir de un donante VIH-seronegativo. La sangre se centrifugó y se separó el plasma. El sedimento celular restante se resuspendió en 10 ml del tampón CPD y se centrifugó. Este proceso de lavado se repitió un total de tres veces. El sedimento final se resuspendió en 40 ml del tampón SCPD, y se distribuyó en tubos de plástico en alícuotas de 2 ml, reteniéndose 16 alícuotas separadas para una manipulación adicional. A 8 de estos tubos se les añadió una alícuota de HTLV-IIIB. Ésta es una cepa de laboratorio del virus VIH, y a cada uno de los tubos a infectar se le añadieron 100 dosis infecciosas de cultivo de tejidos (TCID). Para los 8 tubos restantes, se realizó una infección ``simulada'' añadiendo una pequeña cantidad de un tampón de laboratorio no infeccioso, solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se sometieron al proceso cuatro tubos infectados y cuatro tubos no infectados. Para la comparación, los 8 tubos restantes (cuatro infectados y cuatro no infectados) se manipularon de una forma idéntica, con la excepción de que no se sometieron al proceso.

Debe tenerse en cuenta que al comienzo del estudio, se obtuvo una alícuota separada de sangre del donante. Ésta se procesó en el laboratorio de hematología clínica y se realizó un hemograma completo. Estos resultados basales se compararon con el ensayo repetido en las alícuotas de estudio, que incluía la evaluación de cuatro muestras procesadas y cuatro muestras no procesadas, sin que ninguna de ellas estuviera infectada por VIH.

Se inoculó una alícuota de 0,5 ml de cada una de las muestras de estudio infectadas en células mononucleares (MC) que se habían obtenido 3 días antes. Estas células se habían suspendido en medio de cultivo RPMI, con un 10% de suero de ternero fetal y otros aditivos (penicilina, estreptomicina, glutamina, tampón HEPES) junto con 1 \mug/ml de PHA-P. Al mismo tiempo que esta inoculación, las células se resuspendieron en medio nuevo con rIL-2 (20 U/ml). Los cultivos se mantuvieron durante 7 días. Dos veces por semana, se recogió una porción del medio de cultivo para medir los niveles de antígeno p24 de VIH (kit comercial ELISA, Coulter Electronics, Hialeah, FL) para la medición del crecimiento viral.

Se usó una alícuota separada de las ocho muestras de estudio infectadas para los experimentos de titulación viral.

En resumen, se inocularon varias diluciones en serie de cuatro veces de los fluidos que contenían virus (que variaban de 1:16 a 1:65.536) por triplicado en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos. Se añadieron MC estimulados con PHA a cada pocillo (4 millones de células en 2 ml de medio de cultivo, con IL-2). Se recogió una alícuota del sobrenadante de cada uno de los pocillos de cultivo dos veces por semana para medir los niveles de antígeno p24 de VIH. Un pocillo se evaluó como ``positivo'' si el valor del antígeno p24 de VIH fue >30 pg/ml. La titulación viral se calculó de acuerdo con el método de Spearman-Karber (véase el manual de protocolo de virología ACTG) usando la siguiente ecuación:

M = xk + d[0,5-(1/n)r]

M: titulación (en log 4)

xk: dosis de la mayor dilución

d: espacio entre diluciones

n: número de pocillos por dilución

r: suma del número total de pocillos

Resultados

En la tabla 4 se muestran los parámetros de glóbulos rojos para la muestra basal así como para las muestras de estudio no procesadas y procesadas.

TABLA 4

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline
 Muestra/Número  \+ MCV  \+ MCH  \+ MCHC \\\hline  Basal  \+ 94,5 
\+ 32,0  \+ 339 \\\hline  No procesada-1  \+ 91,4 
\+ 34,4  \+ 376 \\\hline  No procesada-2  \+ 90,2 
\+ 37,9  \+ 420 \\\hline  No procesada-3  \+ 92,1 
\+ 40,0  \+ 433 \\\hline  No procesada-4  \+ 91,0 
\+ 40,2  \+ 442 \\\hline  Procesada-1  \+ 133,4  \+
37,8  \+ 284 \\\hline  Procesada-2  \+ 131,5  \+
45,0  \+ 342 \\\hline  Procesada-3  \+ 128,5  \+
38,9  \+ 303 \\\hline  Procesada-4  \+ 131,1  \+
39,4  \+ 301
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Las abreviaturas usadas en la tabla 4 se explican en la tabla 3.

Como se ha descrito anteriormente, se establecieron cultivos de VIH usando alícuotas de 0,5 ml de muestras de estudio no procesadas y procesadas. En la tabla 5 se muestran niveles de antígeno p24 (pg/ml) de las muestras de estudio del día 4 y del día 7 de cultivo.

TABLA 5

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline 
Muestra/Número  \+ p24-DÍA 4  \+
p24-DÍA 7 \\\hline  No procesada-1 
\+ 1360  \+ 464 \\\hline  No procesada-2  \+ 1180 
\+ 418 \\\hline  No procesada-3  \+ 1230  \+ 516
\\\hline  No procesada-4  \+ 1080  \+ 563 \\\hline 
Procesada-1  \+ 579  \+ 241 \\\hline 
Procesada-2  \+ 760  \+ 303 \\\hline 
Procesada-3  \+ 590  \+ 276 \\\hline 
Procesada-4  \+ 622  \+ 203
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Finalmente, se seleccionaron una muestra no procesada y una muestra procesada para la realización de la titulación viral directa sin cultivo. Los resultados se muestran en la tabla 6.

TABLA 6

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|}\hline 
Muestra/Número  \+ Titulación (log 10 ml) \\\hline  No
procesada-1  \+ 1,5 \\\hline 
Procesada-1  \+ 0,0
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Los glóbulos rojos se vieron afectados mínimamente por el proceso, aunque se observó alguna macrocitosis reproducible. Aunque tras el co-cultivo de muestras procesadas parecían existir algunos virus vivos residuales, esto no se confirmó por experimentos de titulación directos.

Ejemplo 6

El objetivo de este experimento fue evaluar la toxicidad del proceso hacia los glóbulos rojos de una forma exhaustiva.

Métodos

Para este experimento, se obtuvo 1 ml de sangre anticoagulada a partir del mismo donante VIH-seronegativo que en el primer experimento. La sangre se centrifugó y el plasma se retiró. El sedimento celular restante se resuspendió en 10 ml de tampón CPD y se centrifugó. Este proceso de lavado se repitió un total de tres veces. El sedimento final se resuspendió en 20 ml del tampón SCPD, y se distribuyó en tubos de plástico en alícuotas de 2 ml, reteniendo 10 alícuotas para una manipulación adicional. Se sometieron ocho tubos al proceso, mientras que los dos tubos finales se retuvieron como tubos de control no procesados. Después del procesamiento, los diez tubos se centrifugaron y el sedimento resultante se resuspendió en 100 \mul de tampón. Se realizó un hemograma completo sobre estas muestras de estudio reconcentradas.

Como en el primer experimento, se obtuvo una alícuota separada de sangre del donante cuando se tomó la muestra de estudio. Se realizó un hemograma completo sobre esta muestra basal. Como las muestras de estudio se reconcentraron a un 33-50% de su estado original, pudieron realizarse más comparaciones directas con la muestra basal que las que fueron posibles en nuestro experimento anterior.

Resultados

En la tabla 7 se muestran parámetros de glóbulos rojos para la muestra basal así como para las muestras de estudio no procesadas y procesadas. Las abreviaturas usadas en la tabla 7 se definen en la tabla 3.

TABLA 7

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|}\hline
 Muestra/Número  \+ RBC  \+ HGB  \+ MCV  \+ MCH  \+ MCHC \\\hline 
Basal  \+ 4,76  \+ 152  \+ 94,9  \+ 31,9  \+ 336 \\\hline  No
procesada-1  \+ 0,99  \+ 33  \+ 90,2  \+ 33,0  \+
366 \\\hline  No procesada-2  \+ 1,08  \+ 41  \+
89,5  \+ 38,3  \+ 427 \\\hline  Procesada-1  \+ 1,15
 \+ 34  \+ 153,0  \+ 29,9  \+ 195 \\\hline 
Procesada-2  \+ 1,15  \+ 34  \+ 155,9  \+ 29,4  \+
189 \\\hline  Procesada-3  \+ 1,26  \+ 28  \+ 161,5 
\+ 22,1  \+ 137 \\\hline  Procesada-4  \+ 0,79  \+
24  \+ 158,4  \+ 30,8  \+ 194 \\\hline  Procesada-5 
\+ 0,54  \+ 29  \+ 162,5  \+ 54,5  \+ 335 \\\hline 
Procesada-6  \+ 1,04  \+ 32  \+ 163,0  \+ 31,3  \+
192 \\\hline  Procesada-7  \+ 1,35  \+ 45  \+ 144,7 
\+ 33,0  \+ 228 \\\hline  Procesada-8  \+ 1,22  \+
45  \+ 135,8  \+ 36,5  \+ 269
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Hubo macrocitosis de las células que estaban presentes en todas las muestras procesadas. Se midieron niveles comparables de hemoglobina en las muestras no procesadas y procesadas. Los valores absolutos fueron apropiados para la dilución residual. Los glóbulos rojos se conservan.

Ejemplo 7

El objetivo de este ejemplo fue verificar y ampliar los resultados obtenidos en el ejemplo 6.

Métodos

Para este experimento, se obtuvieron 5 ml de sangre anticoagulada a partir del mismo donante VIH-seronegativo que en los dos primeros experimentos. La sangre se centrifugó y el plasma se retiró. El sedimento celular restante se resuspendió en 100 ml de tampón CPD y se centrifugó. Este proceso de lavado se repitió un total de tres veces. El sedimento final se resuspendió en 100 ml del tampón SCPD y se distribuyó en alícuotas de 25 ml, en matraces de cultivo de tejidos T25, reteniéndose las cuatro alícuotas para una manipulación adicional. Dos matraces se sometieron al proceso, mientras que los otros dos se retuvieron como matraces de control no procesados. Después del procesamiento, se observó el contenido de cada uno de los matraces y se realizó una determinación visual de la capacidad de las células de absorber el oxígeno (adoptando un color rojo brillante tras la exposición a aire ambiente). Después de esto, el contenido de los matraces se aspiró y se centrifugó, resuspendiendo el sedimento residual en un pequeño volumen de tampón. Se realizó un hemograma completo en estas muestras de estudio reconcentradas.

Como en los ejemplos 5 y 6, se obtuvo una alícuota separada de sangre a partir del donante cuando se obtuvo la muestra de estudio. Se realizó un hemograma completo en esta muestra basal. Como las muestras de estudio se reconcentraron a un 33-50% de su estado original, se pudieron realizar comparaciones directas de varios parámetros específicos con la muestra basal.

Resultados

Tras la inspección visual, no se pudieron apreciar diferencias entre las muestras de estudio procesadas y no procesadas. Específicamente, parecía haber una distribución uniforme de células bien suspendidas. Tras la exposición al aire ambiente, el contenido de todos matraces adoptó un color rojo algo más brillante. No se realizaron mediciones específicas cuantitativas de la oxigenación.

En la tabla 8 se muestran parámetros de glóbulos rojos para la muestra basal así como para las muestras de estudio no procesadas y procesadas. Las abreviaturas usadas en la tabla 8 se definen en la tabla 3.

TABLA 8

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|}\hline
 Muestra/Número  \+ RBC  \+ HGB  \+ MCV  \+ MCH  \+ MCHC \\\hline 
Basal  \+ 4,75  \+ 153  \+ 95,0  \+ 32,3  \+ 339 \\\hline  No
procesada-1  \+ 0,93  \+ 30  \+ 151,5  \+ 32,3  \+
213 \\\hline  No procesada-2  \+ 0,92  \+ 30  \+
155,5  \+ 32,1  \+ 207 \\\hline  Procesada-1  \+
0,82  \+ 27  \+ 156,5  \+ 32,8  \+ 209 \\\hline 
Procesada-2  \+ 0,81  \+ 26  \+ 152,6  \+ 32,4  \+
212
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Este experimento se diseñó para aproximarse con más exactitud a las condiciones de los glóbulos rojos que se van a transfundir a un paciente y, por consiguiente, se realizó a volúmenes superiores. En una base preliminar, no parece que el proceso afecte negativamente a la capacidad de los glóbulos rojos de transportar oxígeno, aunque esto debe medirse más formalmente. De manera interesante, en este experimento, no hubo ninguna diferencia en el tamaño celular entre las muestras procesadas y no procesadas, pudiendo compararse ambas en gran medida con el valor basal. Esto se repetiría. En todas las muestras de estudio se midieron niveles de hemoglobina comparables.

Aunque los ejemplos se refieren a realizaciones específicas del método de la presente invención, debe apreciarse que el método puede usarse para tratar una diversidad extremadamente amplia de productos que requieren esterilización. El hecho de que el método tenga una eficacia demostrada en la sangre, que es un material biológico frágil, hace que sea razonable predecir que el método puede usarse sobre muchos productos igualmente sensibles. Los ejemplos de otros productos que pueden tratarse incluyen compuestos farmacéuticos, proteínas, ácidos nucleicos, componentes sanguíneos, fluidos corporales (tales como el líquido cefalorraquídeo o la saliva), liposomas, productos que contienen glucosa, cultivos celulares, suero bovino fetal, médula ósea, órganos, alimentos y cosméticos tales como champús, lociones y cremas.

Referencias

1. Van Duzer, John P.; Method for Destroying Microbial Contamination in Protein Materials; Patente de Estados Unidos Nº 4.620.908; 4 de noviembre de 1986.

2. Keathly, J.D. Et. al.; Is There Life after Irradiation? Parte 2; BioPharm julio-agosto de 1993.

3. Leitman, Susan, F; Use of Blood Cell Irradiation in the Prevention of Post Transfusion Graft-vs-Host Disease; Transfusion Science 10:219-239, 1989.

4. The Merck Index, Decimoprimera Edición: Merck & Co. Inc. 1989.

5. Martindale Extra Pharmacopecia pág. 1.265.

6. Kawakishi et al; Radiation-Induced Degradation of D-glucose in Anaerobic Condition. Agric. Biol. Chem. Junio de 1977.

Claims

1. Un método para esterilizar un producto que comprende irradiar el producto con radiación gamma a una velocidad de 0,5 kGy/h a 3,0 kGy/h durante un período de tiempo no menor que 10 horas.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho producto a esterilizar se irradia en una forma que tiene un contenido de sólidos no menor que un 20% en peso.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la cantidad total de irradiación proporcionada está en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 32 kGy.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho producto se irradia durante un período de tiempo de 20 a 40 horas.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho producto se irradia durante un período de tiempo de 20 a 30 horas.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho producto es un producto orgánico.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho producto es un producto biológico.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho producto es sangre o un componente de la misma.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicho producto se diluye con una solución de citrato fosfato dextrosa.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho producto contiene dextrosa.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho producto es una proteína.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicho producto es un anticuerpo.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicho producto se irradia en presencia de un eliminador.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde dicho eliminador es un eliminador para tres radicales.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde dicho eliminador es etanol.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicho etanol está en una concentración final del 0,01% y dicha sangre o producto sanguíneo se diluye antes de la irradiación en un diluyente fisiológicamente aceptable para conseguir una dilución final de al menos 1:10.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicho diluyente fisiológico aceptable es una solución de citrato fosfato dextrosa modificada que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,7.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, donde dicha solución de citrato fosfato dextrosa contiene aproximadamente un 0,01% v/v de etanol.