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EP1955053A1 - Verfahren und vorrichtung zur automatischen analyse von biologischen proben - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur automatischen analyse von biologischen proben

Info

Publication number
EP1955053A1
EP1955053A1 EP06817470A EP06817470A EP1955053A1 EP 1955053 A1 EP1955053 A1 EP 1955053A1 EP 06817470 A EP06817470 A EP 06817470A EP 06817470 A EP06817470 A EP 06817470A EP 1955053 A1 EP1955053 A1 EP 1955053A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
samples
interest
roi
regions
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06817470A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Schmidt
Christopher Wrighton
Kurt Zatloukal
Harald ZÖBL
Peter Hecht
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MEHES Gabor
3DHistech KFT
Original Assignee
MEHES Gabor
3DHistech KFT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MEHES Gabor, 3DHistech KFT filed Critical MEHES Gabor
Publication of EP1955053A1 publication Critical patent/EP1955053A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V20/00—Scenes; Scene-specific elements
    • G06V20/60—Type of objects
    • G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts
    • G06V20/693—Acquisition
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10056—Microscopic image
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10064—Fluorescence image
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30072—Microarray; Biochip, DNA array; Well plate

Definitions

  • the invention relates to a method for automatic analysis of biological samples, in particular tissue samples, wherein the sample is excited with light and taken as a data set of the sample, an image of the resulting fluorescence radiation of the sample and stored.
  • the invention relates to a device for the automatic analysis of biological samples, in particular tissue samples, with a device formed by at least one light source and a camera or a detector for scanning the samples to form data sets of the samples.
  • tissue samples For diagnostic and research purposes, it is common in medicine to collect different samples, such as tissue samples, and submit to various investigations. In the case of tissue samples which have been taken from human or animal organisms, it is customary to bed individual larger pieces of tissue in paraffin, which are processed for further analysis on glass slides into thin sections. Furthermore, paraffin blocks may contain several small pieces of tissue. From other paraffin blocks, cylindrical cores of tissue samples may be punched out of certain selected sites and inserted into corresponding large cylindrical holes of a paraffin block. Such tissue sample arrays (tissue microarrays, TMAs) are then usually cut using a microtome and the preparations, for example, examined histologically.
  • TMAs tissue microarrays
  • tissue sample arrays Due to the large number of sections and individual samples, the sections or tissue sample arrays described above are increasingly being supplied with automatic analyzes in order to obtain important information as quickly as possible, in particular for diagnostic or therapeutic purposes.
  • the investigations can be carried out with a microscope but also at the molecular level, the exact content and the composition of the starting material is of great importance.
  • TMAs tissue sample arrays
  • US 2003/0215936 A1 describes a method and an apparatus for the fastest possible and efficient examination of such tissue sample arrays.
  • tissue samples In addition to human, animal and plant tissues and combinations of different tissues come from different sources for the application of the present invention in question. Likewise, material extracted from tissue, such as e.g. Proteins and nucleic acids, which are applied dropwise to a glass slide, are examined with the present invention. Furthermore, body fluids such as blood, saliva or the like can be analyzed by living organisms. Finally, cultured cells or parts thereof but also organic or inorganic materials can be present as samples.
  • tissue samples such as e.g. Proteins and nucleic acids, which are applied dropwise to a glass slide, are examined with the present invention.
  • body fluids such as blood, saliva or the like can be analyzed by living organisms.
  • cultured cells or parts thereof but also organic or inorganic materials can be present as samples.
  • the samples used for the examination are usually Histologically colored in order to identify the areas of interest easier. For subsequent investigations, these samples are no longer available because of the coloring. For sequences of sections, for example histological tissue, sections of the samples are therefore only randomly stained. However, these random analyzes do not provide information about the actual regions of interest of the samples, which may vary from section to section. Although this information would be improved with an increase in the number of samples, there are fewer samples available for subsequent investigations. In addition, the usually manually performed controls are very time consuming and thus costly.
  • autofluorescence is the resulting radiation of elements excited by light of a certain wavelength
  • Most materials contain chemical structures that can be specifically excited by light and emit more or less fluorescence radiation.
  • Autofluorescence is an image of the composition of the material and can also be used to visualize biological or biochemical processes. In tissues, both cellular and extracellular components can emit fluorescence radiation. For example, nicotine midadenine dinucleotide (NAD) or flavin adenine dinucleotide (FAD), which are mainly located in the mitochondria, are considered the major emitters of fluorescent rays.
  • NAD nicotine midadenine dinucleotide
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • the quantity and composition of various substances result in specific autofluorescence patterns at a given excitation, thereby enabling the identification of the composition and functional differences of tissues by the detection of fluorescence radiation.
  • Autofluorescence is used for both in vivo and in vitro characterization of biological material.
  • the red blood pigment hemoglobin is located substantially throughout the human body. Hemoglobin is highly fluorescent, which results in a different autofluorescence pattern of the tissues due to the variability of the amount of hemoglobin.
  • the object of the present invention is therefore to provide an abovementioned method for the automatic analysis of biological samples, which can be carried out as quickly as possible and without destruction of the samples as far as possible and provides reliable results over the regions of interest of the sample or the informative character of the samples ,
  • the method should provide information about the regions of interest of the samples with the lowest possible cost in the shortest possible time.
  • the disadvantages of the prior art should be avoided or at least reduced.
  • Another object of the present invention is to provide an above-mentioned automatic apparatus O
  • the first object according to the invention is achieved in that the sample is scanned nondestructively, and that at least one parameter is selected from the stored data record of the sample and this or a value derived therefrom or a combination of parameters or values derived therefrom is compared with at least one threshold value, and the comparison value is used as a criterion for determining regions of interest of the sample and stored together with a unique identifier of the sample.
  • the method according to the invention thus provides to select certain parameters from a data set of the sample which was formed and stored by exploiting the fluorescence radiation by non-destructive scanning of the sample and to automatically determine the regions of interest of the sample which are stored together with a unique identifier of the sample.
  • the determination of the regions of interest need not be made in a single method step, but can also be determined iteratively in a control loop. This iterative determination is based on a learning process of information obtained by manual testing of biological samples or randomly selected pre-classified samples.
  • the selection of the at least one parameter can be carried out on the basis of empirical values depending on the sample.
  • there is a data record which proposes the regions of interest for each sample.
  • This data set is particularly important for the selection of subsequent investigations and, for example, supports the histologist in the selection of the corresponding samples.
  • a classification of a plurality of samples in a relatively quick time can also be automated and offered as a suggestion for further processing.
  • the procedure for the analysis of the biological samples may be carried out immediately prior to the examination of the samples, or at an earlier date, and the resulting data, together with further information and a unique identifier of the sample, for example, stored in a database, so that they are available for subsequent investigations.
  • these can also be stored in the so-called flat file format.
  • the information obtained can be stored on any storage medium.
  • a database structures and optimizes the process, especially with regard to classification and documentation.
  • important information for diagnostic, therapeutic purposes but also research purposes can be obtained.
  • the biological samples can be assigned to certain classes on the basis of a heuristic.
  • the present method utilizes autofluorescence for nondestructive microscopic characterization of samples, particularly tissue samples.
  • the pattern of the resulting fluorescence radiation of the sample allows an automatic analysis or decision as to which parts of the sample are relevant for certain examinations and which parts of the sample are irrelevant for certain examinations.
  • autofluorescence can be used to automatically distinguish the samples, for example, the tissue or tissue parts, from the surrounding material, for example paraffin, or to highlight certain tissue parts with functional differences from other tissue parts.
  • autofluorescence enables the automatic determination of constituents of the sample, in particular tissue components, without the sample being destroyed or further reactions occurring.
  • a combination of the nondestructive method of the invention with other methods in which the samples or portions thereof are degraded or even destroyed is also possible, thereby providing important additional information.
  • the fluorescence radiation is caused by excitation of the sample with laser light.
  • laser light In addition to laser light, however, mercury lamps or other light sources which can induce autofluorescence can also be used.
  • the image of the sulting fluorescence radiation of the sample are filtered.
  • the recorded data sets or images of the samples can be filtered according to various aspects.
  • mechanical filters which in front of the camera or.
  • ultraviolet lamps and three different filters for example with the following characteristics, are used.
  • CY3 indocarbocyanine
  • CY5 indodicarbocyanine
  • CY3 can be excited at 530 nm and emits light with a wavelength of 595 nm
  • CY5 is excited at 630 nm and emits fluorescence radiation at 680 nm.
  • Such light sources include, for example, lasers such as argon ions or helium / neon lasers, and light sources having a broad wavelength range can also be used instead of lasers
  • Light sources having a broad wavelength range can also be used instead of lasers
  • Mercury lamps or fiber optic devices are used as light sources.
  • these are preferably stored in a standardized format, for example in TIFF or JPG format. This allows Also, the application of existing image processing programs and does not require conversion of the data sets before the investigation.
  • the data record of the sample is transformed into at least one binary data record.
  • a binary data set consists of a matrix of logical zeros and logical ones, which can be analyzed accordingly. Such binary data sets are generated so that certain parameters are compared with one or more thresholds. If more than one parameter is used, several binary data records may be incurred, which can later be combined in the algorithm, for example by superposition and / or weighting.
  • each image can be represented by several binary images. For example, a color image with 8-bit resolution, ie 256 possible color gradations, can be represented unambiguously by superposing 256 binary images.
  • a fluorescence parameter in particular the fluorescence intensity
  • the data is compared with a predetermined threshold and then the comparison value used as a criterion for the determination of the regions of interest of the sample.
  • the respective threshold value can result from empirical values or can also be determined automatically by means of standardized static methods, for example so-called box-plot methods. This box-plot method uses the information of the accumulations of samples and quantile information and allows a simple determination of a threshold without the need for further knowledge, for example about the biological sample.
  • the values are preferably set in proportion to the intensity of the surrounding pixels and a distribution of the fluorescence intensity over the pixels of the image is generated.
  • a distribution of the fluorescence intensity over the pixels of the image is generated.
  • the variability in fluorescence intensity or the like can be used.
  • the fluorescence intensity depends strongly on the distribution of those molecules which radiation and can therefore be used for the following automatic analyzes:
  • Microinolecular Region Small molecules in the cell (e.g., NAD, FAD, tryptophan, or the like) emit submicroscopic fluorescence, the entirety of which results in a blurred intracellular appearance.
  • the fluorescence radiation is homogeneous when no interference from other sources of fluorescence occurs.
  • Macromolecular Area Molecular complexes (e.g., porphyrins, lipopigments, coagulated proteins, etc.) have a strong granular fluorescence pattern that can be observed in the microscope or digital image. This can occur with both intracellular and extracellular molecules resulting in variability in auto-fluorescence intensity.
  • Tissue condition Larger structures with specific molecular composition result in a characteristic orientation of autofluorescence, as is the case, for example, in collagen-rich connective tissues with longitudinally aligned parallel structures (fibers). This makes it possible to automatically determine the contours of certain structures within the sample and thus to infer areas of interest (ROI).
  • ROI areas of interest
  • the at least one threshold value can be derived from at least one parameter.
  • the threshold value can be determined by means of the median, if suitable parameters can be determined, so that their distribution behaves stably, ie in the example of the median a stable unimodal distribution is established in the parameters.
  • the threshold value can also be selected according to the type of sample. For example, together with the sample, information about the composition of the sample and associated thresholds determined from empirical values or other methods may be stored. For example, from a specific piece of information in a database, you can also - 1 U - närsentes, which for example was determined from a gradient method, a weight to be laid.
  • the threshold values can also be changed depending on the comparison values.
  • the inventive method can be improved iteratively or by a learning algorithm.
  • the threshold value can also be influenced by external parameters, which are determined for example by experts.
  • those regions of the samples whose comparison value is positive are identified as regions of interest. This is a simple way of distinguishing those who are interested from non-interested ones.
  • the geometric shape of the regions of interest of the sample is determined and stored for further processing and analysis.
  • the geometric shape may be defined, for example, by overlaying given geometrical bodies or by storing characteristics such as e.g. Center of gravity, maximum and minimum extent, Kleinausdehnungs- direction or the like., To be classified. Thus, they can be presented later and used for subsequent investigations.
  • the regions of the sample lying outside the regions of interest can be deleted or selectively displayed differently. This will prevent investigations on non-interesting parts of the sample.
  • the regions of the sample lying outside the regions of interest can also be cut out, with lasers in particular being used for cutting.
  • the size of the regions of interest of the sample can be determined.
  • the resulting size makes it easier to decide on subsequent investigations. the .
  • the ratio of the size of the regions of interest to the total surface of the sample can be formed and stored together with the unique identifier of the sample. This ratio provides information about the proportion of the sample of interest in the sample.
  • additional data sets from other sources can be used. From these data sets, at least one further parameter for determining the regions of interest can be selected.
  • a further data record can be, for example, a possibly colored microscopic image of the sample, which contains further interesting information.
  • samples are automatically processed sequentially or in parallel and the data obtained is stored over the regions of interest of the samples together with an identification of the samples.
  • data about the regions of interest of the samples can be collected and stored. These data are then available for a selection of samples for specific subsequent examinations.
  • the second object according to the invention is also achieved by an above-mentioned device for the automatic analysis of biological samples, in particular tissue samples, and a device for sampling the samples to form data sets of the samples, wherein the sampling device designed for non-destructive sampling comprises a computer unit for selecting at least one parameter from the data set and comparing this parameter or a derived value or a combination of parameters or derived therefrom Values are associated with at least one threshold, and that means for displaying an area of interest of the sample determined from the comparison value and a memory for storing this area together with a unique identifier of the sample.
  • the recording device is formed by at least one light source and a camera or a detector.
  • An apparatus for the automatic analysis of biological samples according to the present invention therefore usually consists of a computer unit which is connected to a scanning device formed from at least one light source and a camera or a detector and processes the information obtained accordingly.
  • the light source may be formed, for example, by a laser, a UV lamp, or combinations thereof.
  • a plurality of light sources may be provided in different wavelength ranges or else a light source which emits light in a very broad wavelength range.
  • the scanning device contains, for example, a microscope and / or a scanner.
  • a device for transforming the data set of the sample into at least one binary data record can be provided.
  • a filter device for filtering the data sets of the samples may be provided.
  • these may be filters which are arranged in hardware in front of the receiving device. but also filters, which, in terms of software, clean up the data obtained.
  • a microscope may be provided for receiving the samples to provide additional data sets.
  • a device for the automatic supply and removal of the samples can be provided.
  • a magazine for receiving a plurality of samples may be provided, from which the samples are automatically removed for analysis and returned.
  • a rapid automated analysis of the samples can be achieved.
  • Fig. 1 is a schematic block diagram for illustrating the method according to the invention
  • FIG. 2 is a flow chart illustrating the method for automatic analysis of biological samples
  • FIG. 3 shows the view of a tissue sample comprising several individual samples
  • Fig. 6 is a block diagram of an embodiment of the apparatus for automatic analysis of biological samples.
  • the biological sample 1 may, for example, be a section of an organ or the like which has been produced with the aid of a microtome and is to be examined histologically.
  • the sample 1 is usually applied to a glass carrier 2 and has a unique identifier ID, for example in the form of a barcode. Usually only a part of the total _
  • sample 1 rich of sample 1 interesting information.
  • a tissue section for example, the area that was taken from a specific organ, for example the liver, rather than the surrounding fatty or connective tissue, is usually of interest.
  • the regions of interest (ROI) of interest are determined manually by appropriate specialists, and staining methods can be used to assist, however, affecting sample 1 and becoming unavailable for some subsequent examinations
  • ROI regions of interest
  • the sample 1 In order not to destroy the sample 1 If this is not to be influenced, it is scanned nondestructively with corresponding devices 3 and at least one data record 4 of the sample 1 is created from this data record 4 Values with at least one em threshold value S compared and the comparison value used as a criterion for the determination of the regions of interest ROI of the sample 1.
  • the threshold value S By setting two threshold values S or a certain amount for a threshold value S, the threshold value S can also be used to specify an interval in which a parameter P must be present in order to satisfy a specific classification. As a result of the corresponding calculation, a proposal for the region of interest ROI or the regions of interest ROI of sample 1 is thus reproduced.
  • a data set 5 which contains the determined regions of interest ROI of the sample 1 together with the unique identifier ID of the sample 1.
  • This data set 5 together with the sample 1 forms an important unit, by means of which subsequent investigations on the sample 1 can be carried out more rapidly and more efficiently.
  • the inventive method of automatically analyzing biological samples 1 serves to more quickly identify those samples 1 which have no or too small an area of interest ROI. Thus, expensive investigations on unsuitable samples 1 can be omitted and time for the manual classification of samples 1 can be saved. the .
  • Such data sets 6 can be, for example, microscopic images of the sample 1, but also data which has been produced, for example, by specific dyeing methods or the like on the sample 1. Thus, important additional information is created which speeds up or improves the automatic analysis of the sample 1.
  • data sets 7 can also be used which were founded from the knowledge of experts. For example, certain hypotheses about different types of samples 1, as evidenced by previous studies, may be collected in such data sets 7. These data sets 7 can provide further parameters P "which can be used to calculate and determine the regions of interest ROI of the sample 1.
  • the determination of the regions of interest ROI of the sample 1 can also be carried out iteratively by changing the parameters of the data records 4, 6, 7 until an optimum result is obtained.
  • FIG. 2 shows a flow chart for further illustration of the method according to the invention for the automatic analysis of biological samples 1.
  • this is scanned non-destructively according to block 101.
  • the non-destructive scanning is carried out by optical methods by utilizing the autofluorescence radiation.
  • a data record is formed (block 102) which can still be filtered or transformed (block 103).
  • block 104 at least one parameter P is selected from the data record, and at least one threshold value S is defined in accordance with block 105.
  • the at least one parameter P or a value derived therefrom or a combination of parameters P or values derived therefrom is compared with the at least one threshold value S in order to determine from the comparison value the region of interest ROI or the regions of interest ROI of the sample 1 (Block 107).
  • the determined region of interest ROI is stored together with the identifier ID of the sample 1 (block 108) and possibly graphically displayed (block 109).
  • a query may be made in block 110 as to whether the result appears to be good based on certain criteria. If this is the case, the determined region of interest ROI of the sample 1 is determined in accordance with block 107.
  • the at least one threshold value S can be changed and adapted in accordance with block 111, and the at least one parameter P can be changed and adapted according to block 112 and the region of interest ROI of the sample 1 can be set again. This loop is repeated until the result corresponding to the query 110 is satisfactory and thus the region of interest ROI of the sample 1 is determined according to block 107.
  • Sample 9 in the form of a tissue sample array (TMAs).
  • Sample 1 is tissue sections of a particular target tissue, such as the liver.
  • the specimen 9 1 has no target tissue or reaction with a given staining of the tissue, and thus has no ROI of interest.
  • the individual sample 9 "approximately 50% of the total area is covered with target tissue or have a reaction.
  • the individual sample 9 ' 1 ' also has about 50% target tissue, which shows strong specific response.
  • the individual sample 9 1 ' 1 ' for the most part shows target tissue, which, however, only weakly shows a specific reaction.
  • the figure shows the variety of different samples that normally need to be analyzed in time-consuming manual work.
  • Fig. 5 shows some tissue samples 1 in which the manually determined regions of interest ROI have been defined and identified.
  • the ROIs of interest are cancerous tissues
  • the non-ROI regions of interest are ROI adipose tissue, connective tissue, or others.
  • FIG. 6 shows a block diagram of a possible device 10 for the automatic analysis of biological samples 1.
  • the device 10 has a device 11 for nondestructive scanning of the samples 1.
  • the scanning device 11 may be connected to a database 12 containing information about the samples 1.
  • the scanning device 11 is formed by at least one light source 13, preferably a laser and a device 14 for receiving an image of the sample 1.
  • a microscope 15 may be arranged to receive an image of the samples 1 to provide further data sets.
  • the scanning device 11 is connected to a computer unit 16, which corresponds to the data of the sampled samples 1. processed.
  • At least one parameter P is selected from the data sets of the samples 1 and this parameter P or a value derived therefrom or a combination of parameters P or values derived therefrom is compared with at least one threshold value S and the comparison value is used as criterion for the determination of interest Areas ROI of sample 1 used.
  • These regions of interest ROI are displayed on a display device 17, for example a screen, and stored in a memory 18 together with the identifier ID of the sample 1.
  • a device 19 for the automatic feeding and removal of the samples 1 may be provided, which are preferably connected to a magazine 20 for receiving a plurality of samples 1, which were taken from a corresponding bearing 21.

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  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatischen Analyse von biologischen Proben, insbesondere Gewebsproben, mit einer Einrichtung (11) zur Abtastung der Proben (1) zur Bildung von Datensätzen (4) der Proben (1). Zur Schaffung eines Verfahrens bzw. einer Vorrichtung (10), durch welche möglichst rasch und möglichst ohne Zerstörung der Proben (1) die interessierenden Bereiche (ROI) der Probe (1) festgelegt werden können, wird ohne Zerstörung der Probe (1) aus einem durch Ausnützung der Autofluoreszenz gebildeten Datensatz (4) der Probe (1) zumindest ein Parameter (P) ausgewählt und dieser oder ein davon abgeleiteter Wert oder eine Kombination von Parametern (P) oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert (S) verglichen, und der Vergleichswert als Kriterium für die Festlegung interessierender Bereiche (ROI) der Probe (1) verwendet und zusammen mit einer eindeutigen Kennung (ID) der Probe (1) gespeichert.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur automatischen Analyse von biologischen Proben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatischen Analyse von biologischen Proben, insbesondere Gewebsproben, wobei die Probe mit Licht angeregt wird und als Datensatz der Probe ein Bild der resultierenden Fluoreszenzstrahlung der Probe aufgenommen und gespeichert wird.
Weiters betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur automatischen Analyse von biologischen Proben, insbesondere Gewebsproben, mit einer durch zumindest eine Lichtquelle und eine Kamera bzw. einen Detektor gebildeten Einrichtung zur Abtastung der Proben zur Bildung von Datensätzen der Proben.
Für Diagnose- und Forschungszwecke ist es in der Medizin üblich, verschiedene Proben, beispielsweise Gewebsproben, zu sammeln und verschiedenen Untersuchungen zu unterwerfen. Im Falle von Gewebsproben, welche menschlichen oder tierischen Organismen entnommen wurden, ist es üblich, einzelne größere Gewebsstücke in Paraffin zu betten, welche für die weiteren Analysen auf Glasträger übertragen in dünne Schnittpräparate aufgearbeitet werden. Weiters können Paraffinblöcke mehrere kleine Gewebsstücke beinhalten. Von anderen Paraffinblöcken können von bestimmten ausgewählten Stellen zylindrische Kerne (so genannte cores) von Gewebsproben ausgestochen und in entsprechende große zylindrische Löcher eines Paraffinblockes eingebracht werden. Derartige Gewebsprobenarrays (tissue microarrays, TMAs) werden danach üblicherweise mit Hilfe eines Mikrotoms geschnitten und die Präparate beispielsweise histologisch untersucht.
Oben beschriebene Schnittpräparate oder Gewebsprobenarrays werden aufgrund der großen Anzahl von Schnitten und Einzelproben verstärkt automatischen Analysen zugeführt, um möglichst rasch wichtige Informationen, insbesondere für diagnostische oder therapeutische Zwecke, zu erhalten. Die Untersuchungen können mit einem Mikroskop aber auch auf molekularer Ebene durchgeführt werden, wobei der genaue Inhalt und die Zusammenstellung des Ausgangsmaterials von großer Bedeutung ist. Um den Vergleich zu erleichtern und die Materialauswahl auf das Relevante zu redu- — — zieren, werden die oben genannten Gewebsprobenarrays (TMAs) hergestellt. Beispielsweise beschreibt die US 2003/0215936 Al ein Verfahren und eine Vorrichtung für die möglichst rasche und effiziente Untersuchung von derartigen Gewebsprobenarrays.
Obgleich in der nachfolgenden Beschreibung hauptsächlich auf Gewebsproben eingegangen wird, ist die vorliegende Erfindung nicht auf derartige Proben beschränkt. Neben menschlichen, tierischen und pflanzlichen Geweben kommen auch Kombinationen verschiedenster Gewebe mit unterschiedlicher Herkunft zur Anwendung der vorliegenden Erfindung in Frage. Ebenso kann Material, welches von Gewebe extrahiert wurde, wie z.B. Proteine und Nukleinsäuren, die tropfenweise auf einen Glasträger aufgebracht werden, mit der vorliegenden Erfindung untersucht werden. Weiters können Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel oder dgl. von lebenden Organismen analysiert werden. Schließlich können auch gezüchtete Zellen oder Teile davon aber auch organische oder anorganische Materialien als Proben vorliegen.
Bei der Vielfalt der Proben ist es von besonderer Bedeutung, eine Aussage über die Relevanz der Einzelproben am Präparat treffen zu können. Dies ist einerseits für die Verlässlichkeit der Aussagen, welche nach Analyse der Probe getroffen werden, insbesondere für Diagnosen im medizinischen Bereich von großer Bedeutung. Andererseits stellen die Präparate einen enormen wirtschaftlichen Wert dar, der erhöht werden kann, wenn eine Aussage über die Relevanz der Einzelproben am Präparat getroffen werden kann.
Neben der Aussage über die Relevanz der Proben ist es auch wichtig, eine Aussage über jene Bereiche der Probe treffen zu können, welche für nachfolgende Untersuchungen interessant sind. Beispielsweise ist bei histologischen Proben nur jener Bereich der Probe wichtig, der beispielsweise ein bestimmtes Organ betrifft, während das umliegende Fettgewebe uninteressant ist. Bisher wurden derartige interessierende Bereiche bzw. Regions of Interest (ROI) in mühsamer manueller Art und Weise von entsprechenden Experten unter dem Mikroskop festgelegt.
Dabei werden die zur Untersuchung herangezogenen Proben übli- cherweise histologisch eingefärbt, um die interessierenden Bereiche leichter erkennen zu können. Für nachfolgende Untersuchungen stehen diese Proben aufgrund der Einfärbung nicht mehr zur Verfügung. Bei Sequenzen von Schnitten, beispielsweise his- tologischen Gewebes, werden daher nur stichprobenartig Schnitte der Proben eingefärbt. Diese stichprobenartigen Analysen liefern jedoch keine Informationen über die tatsächlichen interessierenden Bereiche der Proben, welche von Schnitt zu Schnitt variieren können. Diese Information würde zwar bei einer Erhöhung der Stichprobenanzahl verbessert, jedoch stehen dann umso weniger Proben für nachfolgende Untersuchungen zur Verfügung. Darüber hinaus sind die üblicherweise manuell durchgeführten Kontrollen sehr zeit- und somit kostenaufwändig.
Die Ausnützung der Autofluoreszenz, das ist die resultierende Strahlung von Elementen, welche mit Licht bestimmter Wellenlänge angeregt werden, ist eine geeignete Untersuchungsmethode, bei der die Probe nicht zerstört wird. Die meisten Materialien enthalten chemische Strukturen, welche mit Licht speziell angeregt werden können und mehr oder weniger Fluoreszenzstrahlung aussenden. Die Autofluoreszenz stellt ein Abbild der Zusammensetzung des Materials dar und kann auch zur Darstellung biologischer oder biochemischer Prozesse herangezogen werden. Bei Geweben können sowohl zelluläre als auch extrazelluläre Bestandteile Fluoreszenzstrahlung aussenden. Beispielsweise werden Nikotina- midadenin-dinukleotid (NAD) oder Flavinadenindinukleotid (FAD) , welche hauptsächlich in den Mitochondrien angeordnet sind, als hauptsächliche Aussender von Fluoreszenzstrahlen angesehen. Die Quantität und Zusammensetzung verschiedener Substanzen resultieren in spezifischen Autofluoreszenzmustern bei einer bestimmten Anregung, wodurch die Identifikation der Zusammensetzung und funktionellen Unterschiede von Geweben durch die Detektion der Fluoreszenzstrahlung ermöglicht wird. Autofluoreszenz wird sowohl für die in vivo- als auch in vitro-Charakterisierung von biologischem Material verwendet. Beispielsweise befindet sich aufgrund der Blutzirkulation der rote Blutfarbstoff Hämoglobin im Wesentlichen im ganzen menschlichen Körper. Hämoglobin ist stark fluoreszierend, wodurch aufgrund der Variabilität der Menge an Hämoglobin ein unterschiedliches Autofluoreszenzmuster der Gewebe resultiert. Zur Untersuchung der Blutzirkulation kann _ ^ _
dies durch spektroskopische Verfahren in vivo gemessen werden (Yoshinori Horie et al., „Role of nitric oxide in gut ischemia- reperfusion-induced hepatic microvascular dysfunction", American Physiological Society (1997) : G1007-G1013) . Auch in der Augenheilkunde wird die Autofluoreszenz zur Untersuchung der Retina eingesetzt (Anthony G. Robson et al., „Comparison of Fundus Au- tofluorescence with Photopic and Scotopic Fine-Matrix Mapping in Patients with Retinitis Pigmentosa and Normal Visual Acuity"; Investigative Ophtalmology & Visual Science 45(11) (2004): 4119- 4125) . Während zahlreiche Anwendungen der in vivo- oder in vi- tro-Spektroskopie von Autofluoreszenz existieren, konnte sich die Autofluoreszenz für die Untersuchung mikroskopischer Schnitte noch nicht etablieren. Im Gegenteil wurde die Fluoreszenzstrahlung von Geweben in der Fluoreszenzmikroskopie als nachteilig beschrieben (Werner Baschong et al., „Control of Autofluore- scence of Archival Formaldehyde-fixed, Paraffin-embedded Tissue in Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)"; The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 49 (12) (2001): 1565-1571). Die Verwendung der Autofluoreszenz-Spektroskopie zur Untersuchung mikroskopischer Strukturen wurde nur sehr selten beschrieben (Luigi Rigacci et al., „Multispectral Imaging Autofluorescence Microscopy for the Analysis of Lymph-Node Tissues", Photoche- mistry and Photobiology 71(6) (2000): 737-742); Erin M. GiIl et al., „Relationship Between Collagen Autofluorescence of the Human Cervix and Menopausal Status", Photochemistry and Photobiology 77(6) (2003): 653-658).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Schaffung eines oben genannten Verfahrens zur automatischen Analyse von biologischen Proben, welches möglichst rasch und möglichst ohne Zerstörung der Proben durchführbar ist und möglichst zuverlässige Ergebnisse über die interessierenden Bereiche der Probe bzw. den informativen Charakter der Proben liefert. Das Verfahren soll mit möglichst geringen Kosten in möglichst kurzer Zeit Informationen über die interessierenden Bereiche der Proben liefern. Die Nachteile des Standes der Technik sollen vermieden oder zumindest reduziert werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung einer oben genannten Vorrichtung zur automatischen O
Analyse von biologischen Proben, welche eine möglichst rasche und zuverlässige Analyse zulässt und darüber hinaus möglichst einfach und robust aufgebaut und möglichst kostengünstig herstellbar ist.
Die erste erfindungsgemäße Aufgabe wird dadurch gelöst, dass die Probe zerstörungsfrei abgetastet wird, und dass aus dem gespeicherten Datensatz der Probe zumindest ein Parameter ausgewählt und dieser oder ein davon abgeleiteter Wert oder eine Kombination von Parametern oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert verglichen wird, und der Vergleichswert als Kriterium für die Festlegung interessierender Bereiche der Probe verwendet und zusammen mit einer eindeutigen Kennung der Probe gespeichert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht somit vor, aus einem Datensatz der Probe, welcher unter Ausnützung der Fluoreszenzstrahlung durch zerstörungsfreie Abtastung der Probe gebildet und gespeichert wurde, bestimmte Parameter auszuwählen und daraus die interessierenden Bereiche der Probe automatisch festzustellen und zusammen mit einer eindeutigen Kennung der Probe abzuspeichern. Dabei muss die Bestimmung der interessierenden Bereiche nicht in einem einzigen Verfahrensschritt vorgenommen werden, sondern kann diese auch in einem Regelkreis iterativ ermittelt werden. Diese iterative Ermittlung basiert auf einem Lernverfahren aus Informationen, welche durch manuelle Prüfungen von biologischen Proben oder zufällig ausgewählten bereits vorklassifizierten Proben erhalten wurden. Die Auswahl des zumindest einen Parameters kann in Abhängigkeit der Probe aus Erfahrungswerten erfolgen. Als Resultat des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt ein Datensatz vor, der für jede Probe einen Vorschlag für die interessierenden Bereiche vornimmt. Dieser Datensatz ist für die Auswahl nachfolgender Untersuchungen besonders wichtig und unterstützt beispielsweise den Histologen bei der Auswahl der entsprechenden Proben. Dadurch kann eine Klassifizierung einer Vielzahl von Proben in relativ rascher Zeit auch automatisiert vorgenommen werden und als Vorschlag für die weitere Bearbeitung angeboten werden. Das Verfahren zur Analyse der biologischen Proben kann unmittelbar vor der vorgenommenen Untersuchung der Proben erfolgen oder auch zu einem früheren Zeitpunkt, und die resultierenden Daten gemeinsam mit weiteren Informationen und einer eindeutigen Kennung der Probe beispielsweise in einer Datenbank gespeichert werden, so dass sie für nachfolgende Untersuchungen zur Verfügung stehen. Alternativ zur Speicherung der Daten in einer Datenbank können diese auch im so genannten Flat- file-Format abgelegt werden. Grundsätzlich können die gewonnenen Informationen auf einem beliebigen Speichermedium abgelegt werden. Eine Datenbank strukturiert und optimiert jedoch den Pro- zess, vor allem hinsichtlich der Klassifizierung und Dokumentation. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können wichtige Informationen für diagnostische, therapeutische Zwecke aber auch Forschungszwecke gewonnen werden. Mittels der erhaltenen Informationen können die biologischen Proben aufgrund einer Heuristik bestimmten Klassen zugewiesen werden. Das vorliegende Verfahren nützt die Autofluoreszenz für die zerstörungsfreie mikroskopische Charakterisierung von Proben, insbesondere Gewebsproben, aus. Das Muster der resultierenden Fluoreszenzstrahlung der Probe ermöglicht eine automatische Analyse bzw. Entscheidung, welche Teile der Probe für bestimmte Untersuchungen relevant und welche Teile der Probe für bestimmte Untersuchungen irrelevant sind. Somit kann die Autofluoreszenz dazu verwendet werden, die Proben, beispielsweise das Gewebe oder Gewebsteile, vom umgebenden Material, beispielsweise Paraffin, automatisch zu unterscheiden oder bestimmte Gewebsteile mit funktionellen Unterschieden von anderen Gewebsteilen hervorzuheben. Somit ermöglicht die Autofluoreszenz die automatische Bestimmung von Bestandteilen der Probe, insbesondere Gewebsbestandteilen, ohne dass die Probe zerstört wird oder weitere Reaktionen eintreten. Eine Kombination des zerstörungsfreien erfindungsgemäßen Verfahrens mit anderen Methoden, bei welchen die Proben oder Teile davon beeinträchtigt oder sogar zerstört werden, ist natürlich auch möglich, um dadurch wichtige zusätzliche Informationen zu erhalten.
Vorzugsweise wird die Fluoreszenzstrahlung durch Anregung der Probe mit Laserlicht hervorgerufen. Neben Laserlicht können aber auch Quecksilberlampen oder andere Lichtquellen, welche Autofluoreszenz induzieren können, zur Anwendung kommen.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung kann das Bild der re- sultierenden Fluoreszenzstrahlung der Probe gefiltert werden. Die aufgenommenen Datensätze bzw. Bilder der Proben können nach verschiedenen Gesichtspunkten gefiltert werden. Dabei kommen sowohl mechanische Filter, welche vor die Kamera oder. dgl. zur Aufnahme der Bilder gesetzt werden, als auch elektronische Filter, welche von den Bilddaten durchlaufen werden, zur Anwendung, Im Falle eines Fluoreszensmikroskops werden beispielsweise Ul- traviolett-Lampen und drei verschiedene Filter beispielsweise mit folgenden Charakteristika eingesetzt.
Im Falle von Fluoreszenz-Scannern werden beispielsweise Laser bei zwei verschiedenen Wellenlängen zusammen mit hochspezifischen Fluoreszenzfarbstoffen, wie z.B. CY3 (Indocarbocyanin) oder CY5 (Indodicarbocyanin) verwendet. CY3 kann beispielsweise bei 530 nm angeregt werden und sendet Licht mit einer Wellenlänge von 595 nm aus. CY5 wird mit 630 nm angeregt und sendet eine Fluoreszenz-Strahlung mit 680 nm aus.
Bessere Ergebnisse können auch dadurch erzielt werden, dass die Probe mit kombiniertem Licht verschiedener Wellenlänge angeregt wird. Beim derartigen „Multispectral imaging" werden verschiedene Lichtquellen eingesetzt und dadurch mehr Informationen erhalten. Als Lichtquellen stehen beispielsweise Laser wie Argon- Ionen oder Helium/Neon-Laser zur Verfügung. Darüber hinaus können anstelle von Lasern auch Lichtquellen mit breitem Wellenlängenbereich herangezogen werden. Beispielsweise können Quecksilberlampen oder fiberoptische Geräte als Lichtquellen eingesetzt werden.
Um die nachfolgende Bearbeitung der Datensätze zu erleichtern, werden diese vorzugsweise in einem standardisierten Format, beispielsweise im TIFF- oder JPG-Format gespeichert. Dies ermög- licht auch die Anwendung vorhandener Bildverarbeitungsprogramme und erfordert keine Umwandlung der Datensätze vor der Untersuchung.
Vorteilhafterweise wird der Datensatz der Probe in zumindest einen binären Datensatz transformiert. Ein binärer Datensatz besteht aus einer Matrix von logischen Nullen und logischen Einsen, welche entsprechend analysiert werden können. Derartige binäre Datensätze werden so erzeugt, dass bestimmte Parameter mit einem Schwellwert oder mehreren Schwellwerten verglichen werden. Wenn mehr als ein Parameter benützt wird, können mehrere Binärdatensätze anfallen, welche zu einem späteren Zeitpunkt im Algorithmus beispielsweise durch Superposition und/oder Gewichtung kombiniert werden können. Prinzipiell kann jedes Bild durch mehrere Binärbilder dargestellt werden. Beispielsweise kann ein Farbbild mit 8 Bit Auflösung, also 256 möglichen Farbabstufungen, durch Superposition von 256 Binärbildern eindeutig dargestellt werden.
Als Parameter, der aus dem Datensatz ausgewählt wird und zur Analyse der interessierenden Bereiche der Proben herangezogen wird, kann ein Fluoreszenzparameter, insbesondere die Fluoreszenzintensität, verwendet werden. Die Daten werden mit einem vorgegebenen Schwellwert verglichen und danach der Vergleichswert als Kriterium für die Festlegung der interessierenden Bereiche der Probe verwendet. Der jeweilige Schwellwert kann aus Erfahrungswerten resultieren oder mittels standardisierter statischer Methoden, beispielsweise so genannten Box-Plot-Verfah- ren, auch automatisch bestimmt werden. Dieses Box-Plot-Verfahren benutzt die Information der Häufungen von Stichproben sowie Quantilinformationen und ermöglicht ein einfaches Bestimmen eines Schwellwerts ohne Voraussetzung weiterer Kenntnisse, beispielsweise über die biologische Probe. Bei Verwendung der Fluoreszenzintensität als Parameter werden die Werte vorzugsweise im Verhältnis mit der Intensität der umgebenden Pixel gesetzt und eine Verteilung der Fluoreszenzintensität über die Pixel des Bildes erzeugt. Als abgeleitete Werte eines Parameters können beispielsweise die Variabilität in der Fluoreszenzintensität oder dgl. herangezogen werden. Die Fluoreszenzintensität hängt stark von der Verteilung jener Moleküle, welche die Fluores- zenzstrahlung aussenden ab und kann daher für folgende automatische Analysen herangezogen werden:
1. Mikroinolekularer Bereich (Homogenität): Kleine Moleküle in der Zelle (z.B. NAD, FAD, Tryptophan oder dgl.) senden submikroskopische Fluoreszenz aus, deren Gesamtheit in einem unscharfen intrazellularen Erscheinungsbild resultiert. Die Fluoreszenzstrahlung ist homogen, wenn keine Störungen durch andere Fluoreszenz-Quellen auftreten.
2. Makromolekularer Bereich (Granularität) : Molekulare Komplexe, (z.B. Porphyrine, Lipopigmente, koagulierte Proteine, usw.) weisen ein starkes körniges Fluoreszenz-Muster auf, das im Mikroskop bzw. digitalen Abbild beobachtet werden kann. Dies kann sowohl bei intrazellularen als auch extrazellularen Molekülen auftreten, welche in einer Variabilität der AutoFluoreszenzin- tensität resultieren.
3. Gewebsbeschaffenheit (Orientierung): Größere Strukturen mit spezifischer molekularer Zusammensetzung resultieren in charakteristischer Orientierung der Autofluoreszenz, wie es beispielsweise bei kollagenreichen Bindegeweben mit longitudinal ausgerichteten parallelen Strukturen (Fasern) der Fall ist. Dadurch ist es möglich, die Umrisse bestimmter Strukturen innerhalb der Probe automatisch zu ermitteln und somit auf interessierende Bereiche (ROI) rückzuschließen.
Der zumindest eine Schwellwert kann aus zumindest einem Parameter abgeleitet werden. Beispielsweise kann der Schwellwert mittels des Medians festgelegt werden, wenn sich geeignete Parameter feststellen lassen, so dass sich deren Verteilung stabil verhält, beim Beispiel des Medians also eine stabile unimodale Verteilung bei den Parametern feststeht.
Der Schwellwert kann auch in Abhängigkeit der Art der Probe entsprechend gewählt werden. Beispielsweise können zusammen mit der Probe eine Information über die Zusammensetzung der Probe und zugehörige, aus Erfahrungswerten oder anderen Methoden bestimmte Schwellwerte hinterlegt sein. Beispielsweise kann aus einer bestimmten Information in einer Datenbank auch mittels eines Bi- — 1 U — närbildes, welches z.B. aus einem Gradientenverfahren bestimmt wurde, ein Gewicht gelegt werden.
Die Schwellwerte können auch in Abhängigkeit der Vergleichswerte verändert werden. So kann das erfindungsgemäße Verfahren iterativ bzw. durch einen Lernalgorithmus verbessert werden.
Der Schwellwert kann auch durch externe Parameter, welche beispielsweise durch Experten bestimmt werden, beeinflusst werden.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung ist vorgesehen, dass jene Bereiche der Proben, deren Vergleichswert positiv ist, als interessierende Bereiche gekennzeichnet werden. Dies stellt eine einfache Methode dar, die interessierenden von den nicht-inter- essierenden Bereichen zu unterscheiden.
Vorteilhafterweise wird die geometrische Form der interessierenden Bereiche der Probe ermittelt und für die weitere Bearbeitung und Analyse gespeichert. Die geometrische Form kann beispielsweise durch Überlagerungen mit vorgegebenen geometrischen Körpern oder durch Speicherung von Charakteristika, wie z.B. Schwerpunkt, maximale und minimale Ausdehnung, Hauptausdehnungs- richtung od. dgl., klassifiziert werden. Somit können sie später dargestellt und für nachfolgende Untersuchungen herangezogen werden.
Im Datensatz der Probe können die außerhalb der interessierenden Bereiche liegenden Bereiche der Probe gelöscht oder selektiv anders dargestellt werden. Dadurch wird verhindert, dass Untersuchungen an nicht-interessierenden Teilen der Probe vorgenommen werden.
Die außerhalb der interessierenden Bereiche liegenden Bereiche der Probe können auch ausgeschnitten werden, wobei zum Ausschneiden insbesondere Laser verwendet werden können.
Um eine Aussage über die Qualität der Probe treffen zu können, kann die Größe der interessierenden Bereiche der Probe bestimmt werden. Darüber hinaus kann aufgrund der resultierenden Größe die Entscheidung nachfolgender Untersuchungen erleichtert wer- den .
Dabei kann das Verhältnis der Größe der interessierenden Bereiche zur Gesamtfläche der Probe gebildet und zusammen mit der eindeutigen Kennung der Probe gespeichert werden. Dieses Verhältnis gibt Auskunft darüber, wie groß der Anteil der interessierenden Bereiche der Probe ist.
Schließlich kann im automatischen Verfahren vorgesehen sein, dass jene Proben, deren Verhältnis der Größe der interessierenden Bereiche zur Gesamtfläche der Probe einen vorgegebenen Grenzwert unterschreiten, als unverwertbar gekennzeichnet werden. Dadurch kann automatisch eine Ausscheidung von Proben, die einen zu geringen Anteil an interessierenden Bereichen aufweisen, vorgenommen werden.
Zur automatischen Analyse können weitere Datensätze, die von anderen Quellen stammen, herangezogen werden. Aus diesen Datensätzen kann zumindest ein weiterer Parameter zur Festlegung der interessierenden Bereiche ausgewählt werden. Ein derartiger weiterer Datensatz kann beispielsweise ein, allenfalls gefärbtes mikroskopisches Bild der Probe sein, welches weitere interessante Informationen enthält. Durch die Überlagerung des mikroskopischen Datensatzes mit dem Datensatz, welcher beispielsweise aus der Fluoreszenzstrahlung resultiert, kann die automatische Analyse der Probe weiter verbessert werden.
Um die Analyse möglichst rasch durchführen zu können, werden vorzugsweise mehrere Proben automatisch sequenziell oder parallel verarbeitet und die erhaltenen Daten über die interessierenden Bereiche der Proben zusammen mit einer Kennung der Proben gespeichert. Somit können bereits nach der Herstellung der Proben Daten über die interessierenden Bereiche der Proben gesammelt und gespeichert werden. Diese Daten stehen dann für eine Auswahl der Proben für bestimmte nachfolgende Untersuchungen zur Verfügung.
Gelöst wird die zweite erfindungsgemäße Aufgabe auch durch eine oben genannte Vorrichtung zur automatischen Analyse von biologischen Proben, insbesondere Gewebsproben, und einer Einrichtung zur Abtastung der Proben zur Bildung von Datensätzen der Proben, wobei die zur zerstörungsfreien Abtastung der Proben ausgebildete Abtasteinrichtung mit einer Rechnereinheit zur Auswahl zumindest eines Parameters aus dem Datensatz, und zum Vergleich dieses Parameters oder eines davon abgeleiteten Wertes oder einer Kombination von Parametern oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert verbunden ist, und dass eine Einrichtung zur Anzeige eines aus dem Vergleichswert festgelegten interessierenden Bereiches der Probe und ein Speicher zum Speichern dieses Bereiches zusammen mit einer eindeutigen Kennung der Probe. Vorgesehen ist. Die Aufnahmeeinrichtung wird durch zumindest eine Lichtquelle und eine Kamera bzw. einen Detektor gebildet. Im Falle der Autofluoreszenz wird ein Fluoreszenzscanner oder ein Fluoreszenzmikroskop verwendet, welche die Fluoreszenzstrahlung der Probe, welche mit einer entsprechenden Lichtquelle angeregt wurde, als Datensatz aufnimmt. Eine Vorrichtung zur automatischen Analyse von biologischen Proben gemäß der vorliegenden Erfindung besteht daher üblicherweise aus einer Rechnereinheit, welche mit einer aus zumindest einer Lichtquelle und einer Kamera bzw. einem Detektor gebildeten Abtasteinrichtung verbunden ist und die erhaltenen Informationen entsprechend verarbeitet.
Die Lichtquelle kann beispielsweise durch einen Laser, eine UV- Lampe oder Kombinationen davon gebildet sein.
Ebenso können mehrere Lichtquellen in verschiedenen Wellenlängenbereichen vorgesehen sein oder auch eine Lichtquelle, welche Licht in einem sehr breiten Wellenlängenbereich aussendet.
Die Abtasteinrichtung enthält beispielsweise ein Mikroskop und bzw. oder einen Scanner.
Weiters kann eine Einrichtung zur Transformation des Datensatzes der Probe in zumindest einen binären Datensatz vorgesehen sein.
Um die Relevanz der Daten zu erhöhen, kann eine Filtereinrichtung zum Filtern der Datensätze der Proben vorgesehen sein. Wie bereits oben erwähnt, kann es sich dabei um Filter handeln, welche vor die Aufnahmeeinrichtung Hardware-mäßig angeordnet wer- den, aber auch um Filter, welche Software-mäßig eine Bereinigung der erhaltenen Daten vornehmen.
Zusätzlich kann ein Mikroskop zur Aufnahme der Proben zur Schaffung zusätzlicher Datensätze vorgesehen sein.
Um eine möglichst rasche Analyse zuzulassen, kann eine Einrichtung zur automatischen Zu- und Abführung der Proben vorgesehen sein.
Ebenso kann ein Magazin zur Aufnahme einer Vielzahl von Proben vorgesehen sein, aus welchem die Proben zur Analyse automatisiert entnommen und wieder retourniert werden. Somit kann eine rasche automatisierte Analyse der Proben erzielt werden.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
Darin zeigen:
Fig. 1 ein schematisches Blockschaltbild zur Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 2 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung des Verfahrens zur automatischen Analyse von biologischen Proben;
Fig. 3 die Ansicht auf eine mehrere Einzelproben umfassende Gewebsprobe;
Fig. 4 beispielhaft verschiedene Gewebsproben mit unterschiedlichem Anteil der interessierenden Bereiche;
Fig. 5 die Draufsicht auf unterschiedliche Gewebsproben; und
Fig. 6 ein Blockschaltbild einer Ausführungsform der Vorrichtung zur automatischen Analyse von biologischen Proben.
Fig. 1 zeigt ein schematisches Blockschaltbild zur Veranschaulichung des Verfahrens zur automatischen Analyse von biologischen Proben 1. Die biologische Probe 1 kann beispielsweise ein Schnitt eines Organs oder dgl. sein, welcher mit Hilfe eines Mikrotoms hergestellt wurde und histologisch untersucht werden soll. Die Probe 1 ist meist auf einen Glasträger 2 aufgebracht und weist eine eindeutige Kennung ID beispielsweise in Form eines Barcodes auf. Meist beinhaltet nur ein Teil des Gesamtbe- _
reichs der Probe 1 interessante Information. Beispielsweise interessiert bei einem Gewebsschnitt meist jener Bereich, der einem bestimmten Organ, beispielsweise der Leber, entnommen wurde und nicht das umliegende Fett- oder Bindegewebe. Üblicherweise werden die interessierenden Bereiche, die so genannten „Regions of Interest" (ROI) , manuell von entsprechenden Spezialisten festgelegt. Dabei können Färbemethoden unterstützend angewandt werden, wodurch jedoch die Probe 1 beeinflusst wird und für manche nachfolgende Untersuchungen nicht mehr zur Verfügung steht. Zu diesem Zweck ist es ein Ziel, die Probe 1 automatisch zu analysieren, um die interessierenden Bereiche ROI automatisch festlegen zu können. Dadurch wird eine besonders wichtige Information für die nachfolgenden Untersuchungen an der Probe 1 zur Verfügung gestellt. Um die Probe 1 nicht zu zerstören bzw. nicht zu beeinflussen, wird diese mit entsprechenden Einrichtungen 3 zerstörungsfrei abgetastet und zumindest ein Datensatz 4 der Probe 1 geschaffen. Aus diesem Datensatz 4 wird nun zumindest ein Parameter P ausgewählt und dieser oder ein davon abgeleiteter Wert oder eine Kombination von Parametern P oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert S verglichen und der Vergleichswert als Kriterium für die Festlegung der interessierenden Bereiche ROI der Probe 1 verwendet. Durch die Festlegung zweier Schwellwerte S bzw. eines bestimmten Betrags für einen Schwellwert S kann durch den Schwellwert S auch ein Intervall festgelegt werden, in dem sich ein Parameter P aufhalten muss, um einer spezifischen Klassifizierung zu genügen. Als Resultat der entsprechenden Berechnung wird also ein Vorschlag für den interessierenden Bereich ROI bzw. die interessierenden Bereiche ROI der Probe 1 wiedergegeben. Danach wird ein Datensatz 5 gebildet, welcher die festgelegten interessierenden Bereiche ROI der Probe 1 zusammen mit der eindeutigen Kennung ID der Probe 1 enthält. Dieser Datensatz 5 bildet zusammen mit der Probe 1 eine wichtige Einheit, durch welche nachfolgende Untersuchungen an der Probe 1 rascher und effizienter durchgeführt werden können. Ebenso dient das erfindungsgemäße Verfahren zur automatischen Analyse von biologischen Proben 1 dazu, rascher jene Proben 1 zu identifizieren, welche keinen oder einen zu kleinen interessierenden Bereich ROI aufweisen. Somit können teure Untersuchungen an ungeeigneten Proben 1 unterbleiben und Zeit für die manuelle Klassifizierung der Proben 1 gespart wer- den .
Es können aus der Probe 1 auch weitere Datensätze 6 gebildet werden, aus welchen weitere Parameter P' ausgewählt werden können, die zur Festlegung der interessierenden Bereiche ROI herangezogen werden. Bei derartigen Datensätzen 6 kann es sich beispielsweise um mikroskopische Bilder der Probe 1 aber auch um Daten handeln, welche beispielsweise durch bestimmte Färbemethoden oder dgl. an der Probe 1 entstanden sind. Somit wird wichtige zusätzliche Information geschaffen, welche die automatische Analyse der Probe 1 beschleunigt bzw. verbessert.
Zusätzlich zu derartigen weiteren Datensätzen 6 können auch Datensätze 7 herangezogen werden, welche aus dem Wissen von Experten gegründet wurde. Beispielsweise können bestimmte, durch vorausgegangene Untersuchungen belegte, Hypothesen über verschiedene Arten von Proben 1 in solchen Datensätzen 7 gesammelt werden. Diese Datensätze 7 können weitere Parameter P'' liefern, die zur Berechnung und Festlegung der interessierenden Bereiche ROI der Probe 1 herangezogen werden können.
Wie in der Abbildung durch die strichlierten Linien veranschaulicht, kann die Festlegung der interessierenden Bereiche ROI der Probe 1 auch iterativ erfolgen, indem die Parameter der Datensätze 4, 6, 7 solange verändert werden, bis ein optimales Ergebnis vorliegt.
Schließlich kann, nach Erhalt des Ergebnisses des interessierenden Bereichs ROI der Probe 1, auch jener Bereich der Probe 1 entfernt werden, welcher außerhalb des interessierenden Bereichs ROI liegt. Es resultiert nunmehr ein Präparat 8, dessen Probe 1 ausschließlich aus dem automatisch festgelegten interessierenden Bereich ROI und der eindeutigen Kennung ID der Probe 1 besteht. Dadurch wird verhindert, dass an nicht interessierenden Bereichen der Probe 1 aufwändige und kostenintensive Untersuchungen vorgenommen werden.
Fig. 2 zeigt ein Flussdiagramm zur weiteren Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur automatischen Analyse von biologischen Proben 1. Ausgehend von der Probe 1 gemäß Block 100 wird diese entsprechend Block 101 zerstörungsfrei abgetastet. Die zerstörungsfreie Abtastung erfolgt dabei durch optische Verfahren unter Ausnützung der Autofluoreszenz-Strahlung. Nach dem Abtasten der Probe 1 wird ein Datensatz gebildet (Block 102), der noch gefiltert oder transformiert werden kann (Block 103) . Gemäß Block 104 wird aus dem Datensatz zumindest ein Parameter P ausgewählt, und entsprechend Block 105 zumindest ein Schwellwert S festgelegt. Gemäß Block 106 wird der zumindest eine Parameter P oder ein davon abgeleiteter Wert oder eine Kombination von Parametern P oder davon abgeleiteten Werten mit dem zumindest einen Schwellwert S verglichen, um aus dem Vergleichswert den interessierenden Bereich ROI bzw. die interessierenden Bereiche ROI der Probe 1 festzulegen (Block 107) . Der ermittelte interessierende Bereich ROI wird zusammen mit der Kennung ID der Probe 1 gespeichert (Block 108) und allenfalls grafisch dargestellt (Block 109) . Vor der Festlegung des interessierenden Bereichs ROI entsprechend Block 107 kann eine Abfrage gemäß Block 110 erfolgen, ob das Ergebnis anhand bestimmter Kriterien gut erscheint. Ist dies der Fall, wird der ermittelte interessierende Bereich ROI der Probe 1 entsprechend Block 107 festgelegt. Ist dies jedoch nicht der Fall, kann der zumindest eine Schwellwert S gemäß Block 111 verändert und angepasst werden sowie der zumindest eine Parameter P gemäß Block 112 verändert und angepasst werden und erneut der interessierende Bereich ROI der Probe 1 festgelegt werden. Diese Schleife wird so oft wiederholt, bis das Ergebnis entsprechend der Abfrage 110 zufriedenstellend ist und somit der interessierende Bereich ROI der Probe 1 gemäß Block 107 festgelegt wird.
Mit der Probe 100 können weitere Analysen entsprechend Block 113 durchgeführt werden und entsprechende Datensätze gebildet (Block 114) und allenfalls vorverarbeitet (Block 115) werden. Die so ermittelten Daten können zur Auswahl der Parameter gemäß Block 104 herangezogen werden. Ebenso können manuelle Einstellungen von Experten entsprechend Block 116 für die Auswahl der Parameter gemäß Block 104 sowie Daten aus Wissensdatenbanken (Block 117) verwendet werden und das Ergebnis der automatischen Analyse der biologischen Proben 1 verbessern.
Fig. 3 zeigt die Draufsicht auf ein Bild einer aus 25 Einzelpro- ben 9 bestehenden Probe 1 in Form eines Gewebsprobenarrays (TMAs) . Bei der Probe 1 handelt es sich um Gewebsschnitte eines bestimmten Zielgewebes, beispielsweise der Leber. Die Einzelprobe 91 weist beispielsweise kein Zielgewebe oder eine Reaktion bei einer bestimmten Färbung des Gewebes auf und hat daher keinen interessierenden Bereich ROI. Bei der Einzelprobe 9' ' sind etwa 50% der Gesamtfläche mit Zielgewebe bedeckt oder weisen eine Reaktion auf. Die Einzelprobe 9'1' weist ebenfalls etwa 50% Zielgewebe auf, welches starke spezifische Reaktion zeigt. Schließlich zeigt die Einzelprobe 91'1' zum Großteil Zielgewebe, welches jedoch nur schwach eine spezifische Reaktion zeigt. Die Abbildung zeigt die Vielfalt an unterschiedlichen Proben, welche normalerweise in zeitaufwändiger manueller Tätigkeit analysiert werden müssen.
Fig. 4 zeigt drei schematische Abbilder von Autofluoreszenzaufnahmen verschiedener Proben 1 mit unterschiedlichen Zusammensetzungen und somit unterschiedlicher Größe der interessierenden Bereiche ROI. Dabei handelt es sich um schematische Abbilder tatsächlicher Messergebnisse.
Schließlich zeigt Fig. 5 einige Gewebsproben 1, bei welchen die manuell ermittelten interessierenden Bereiche ROI festgelegt und gekennzeichnet wurden. Bei den interessierenden Bereichen ROI handelt es sich beispielsweise um Krebsgewebe, wogegen die irrelevanten Bereiche außerhalb der interessierenden Bereiche ROI Fettgewebe, Bindegewebe oder andere sind.
Schließlich zeigt Fig. 6 ein Blockschaltbild einer möglichen Vorrichtung 10 zur automatischen Analyse von biologischen Proben 1. Die Vorrichtung 10 weist eine Einrichtung 11 zur zerstörungsfreien Abtastung der Proben 1 auf. Die Äbtasteinrichtung 11 kann mit einer Datenbank 12 verbunden sein, welche Information über die Proben 1 enthält. Die Abtasteinrichtung 11 ist durch zumindest eine Lichtquelle 13, vorzugsweise einen Laser und eine Einrichtung 14 zur Aufnahme eines Bildes der Probe 1, gebildet. Für weitere Informationen kann ein Mikroskop 15 zur Aufnahme eines Bildes der Proben 1 zur Schaffung weiterer Datensätze angeordnet sein. Die Abtasteinrichtung 11 ist mit einer Rechnereinheit 16 verbunden, welche die Daten der abgetasteten Proben 1 entspre- chend verarbeitet. In der Rechnereinheit 16 wird zumindest ein Parameter P aus den Datensätzen der Proben 1 ausgewählt und dieser Parameter P oder ein davon abgeleiteter Wert oder eine Kombination von Parametern P oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert S verglichen und der Vergleichswert als Kriterium für die Festlegung interessierender Bereiche ROI der Probe 1 verwendet. Diese interessierenden Bereiche ROI werden auf einer Anzeigeeinrichtung 17, beispielsweise einem Bildschirm, dargestellt und in einem Speicher 18 zusammen mit der Kennung ID der Probe 1 gespeichert. Zur effizienteren Abwicklung des Verfahrens kann eine Einrichtung 19 zur automatischen Zu- und Abführung der Proben 1 vorgesehen sein, welche vorzugsweise mit einem Magazin 20 zur Aufnahme einer Vielzahl von Proben 1, die aus einem entsprechenden Lager 21 entnommen wurden, verbunden ist.

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur automatischen Analyse von biologischen Proben (1) , insbesondere Gewebsproben, wobei die Probe (1) mit Licht angeregt wird und als Datensatz (4) der Probe (1) ein Bild der resultierenden Fluoreszenzstrahlung der Probe (1) aufgenommen und gespeichert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) zerstörungsfrei abgetastet wird, und dass aus dem gespeicherten Datensatz (4) der Probe (1) zumindest ein Parameter (P) ausgewählt und dieser oder ein davon abgeleiteter Wert oder eine Kombination von Parametern (P) oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert (S) verglichen wird, und der Vergleichswert (V) als Kriterium für die Festlegung interessierender Bereiche (ROI) der Probe (1) verwendet und zusammen mit einer eindeutigen Kennung (ID) der Probe (1) gespeichert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) mit Laserlicht angeregt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bild der resultierenden Fluoreszenzstrahlung der Probe (1) gefiltert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) mit kombiniertem Licht verschiedener Wellenlängen angeregt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Datensatz (4) der Probe (1) in einem standardisierten Format, beispielsweise im TIFF- oder JPG-Format gespeichert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Datensatz (4) der Probe (1) in zumindest einen binären Datensatz transformiert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Parameter (P) ein Fluoreszenzparameter, insbesondere die Fluoreszenzintensität, verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Schwellwert (S) aus zumindest einem Parameter (P) abgeleitet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Schwellwert (S) in Abhängigkeit der Art der Probe (1) gewählt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Schwellwert (S) in Abhängigkeit der Vergleichswerte (V) verändert wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Schwellwert (S) durch externe Parameter (P1') beeinflusst wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass jene Bereiche der Proben (1), deren Vergleichswert positiv ist, als interessierende Bereiche (ROI) gekennzeichnet werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die geometrische Form der interessierenden Bereiche (ROI) ermittelt und für die weitere Bearbeitung und Analyse gespeichert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass im resultierenden Datensatz (5) der Probe (1) die außerhalb der interessierenden Bereiche (ROI) liegenden Bereiche der Probe (1) gelöscht oder selektiv anders dargestellt werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die außerhalb der interessierenden Bereiche (ROI) liegenden Bereiche der Probe (1) ausgeschnitten werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der interessierenden Bereiche (ROI) einer Probe (1) bestimmt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Größe der interessierenden Bereiche (ROI) zur Gesamtfläche der Probe (1) gebildet und zusammen mit der eindeutigen Kennung (ID) der Probe (1) gespeichert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass jene Proben (1) , deren Verhältnis der Größe der interessierenden Bereiche (ROI) zur Gesamtfläche der Probe (1) einen vorgegebenen Grenzwert unterschreiten, als unverwertbar gekennzeichnet werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Parameter (P'', P''') aufgrund zumindest eines weiteren Datensatzes (6, 7) der Probe (1) ausgewählt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Proben (1) automatisch sequentiell oder parallel verarbeitet und die erhaltenen Daten über die identifizierten interessierenden Bereiche (ROI) der Proben (1) gespeichert werden.
21. Vorrichtung (10) zur automatischen Analyse von biologischen Proben (1) , insbesondere Gewebsproben, mit einer durch zumindest eine Lichtquelle (13) und eine Kamera bzw. einen Detektor gebildeten Einrichtung (11) zur Abtastung der Proben (1) zur Bildung von Datensätzen (4) der Proben (1), dadurch gekennzeichnet, dass die zur zerstörungsfreien Abtastung der Proben (1) ausgebildete Abtasteinrichtung (11) mit einer Rechnereinheit (16) zur Auswahl zumindest eines Parameters (P) aus dem Datensatz (4) und zum Vergleich dieses Parameters (P) oder eines davon abgeleiteten Wertes oder einer Kombination von Parameter (P) oder davon abgeleiteten Werten mit zumindest einem Schwellwert (S) verbunden ist, und dass eine Einrichtung (17) zur Anzeige eines aus dem Vergleichswert festgelegten interessierenden Bereichs (ROI) der Probe (1), und ein Speicher (18) zum Speichern dieses Bereichs (ROI) zusammen mit einer eindeutigen Kennung (ID) der Probe (1) vorgesehen ist.
22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine Lichtquelle (13) durch einen Laser gebildet ist.
23. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine Lichtquelle (13) durch eine UV-Lampe gebildet ist.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Lichtquellen (13) in verschiedenen Wellenlängenbereichen vorgesehen sind.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtasteinrichtung (11) ein Mikroskop enthält.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtasteinrichtung (11) einen Scanner umenthält
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einrichtung zur Transformation des Datensatzes (4) der Probe (1) in zumindest einen binären Datensatz vorgesehen ist.
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass eine Filtereinrichtung zum Filtern der Datensätze (4) der Proben (1) vorgesehen ist.
29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroskop (15) zur Aufnahme der Proben (1) zur Schaffung zusätzlicher Datensätze (6) vorgesehen ist.
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einrichtung (19) zur automatischen Zu- und Abführung der Proben (1) vorgesehen ist.
31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass ein Magazin (20) zur Aufnahme einer Vielzahl von Proben (1) vorgesehen ist, aus welchem die Proben (1) zur Analyse automatisiert entnommen und wieder retourniert werden.
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