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EP1485139A1 - Biomatrix sowie verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Biomatrix sowie verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number
EP1485139A1
EP1485139A1 EP03720209A EP03720209A EP1485139A1 EP 1485139 A1 EP1485139 A1 EP 1485139A1 EP 03720209 A EP03720209 A EP 03720209A EP 03720209 A EP03720209 A EP 03720209A EP 1485139 A1 EP1485139 A1 EP 1485139A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
biomatrix
collagen
matrix
solution
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP03720209A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Graeve
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ars Arthro AG
Original Assignee
Ars Arthro AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10241817A external-priority patent/DE10241817A1/de
Application filed by Ars Arthro AG filed Critical Ars Arthro AG
Publication of EP1485139A1 publication Critical patent/EP1485139A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3817—Cartilage-forming cells, e.g. pre-chondrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3852—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials

Definitions

  • the invention relates to a biomatrix and a method for its production.
  • DE 100 26 789 AI describes a cartilage replacement that allows good regeneration of a treated cartilage defect.
  • the application mentioned makes use of a 3D biomatrix that can be adapted in shape and size to the defect to be replaced ,
  • the state of the art also includes many other suggestions for implants in the area described.
  • the materials used here are either three-dimensional, but porous, for example in the case of a configuration as a sponge or fleece; or they are solid, but have no three-dimensional structure, for example in the case of an embodiment as a film.
  • special requirements must be placed on implants that are to replace parts of the mechanical body structure.
  • a defect to be repaired generally has at least a certain three-dimensionality, so that the implant should also be three-dimensional.
  • the implant due to its density or, in particular, its pressure stability, the implant must be able to take into account the mechanical loads when used in the body structure. In particular, the pressure stability of the previously known materials is not sufficient for use, for example, in the cartilage area.
  • the inventor has also set himself the task of developing a Biomatrix so that the Biomatrix as an implant can also cope with the high loads that occur in mechanical matters.
  • the inventor has set himself the task of developing a method with which such a biomatrix can be produced.
  • the task is solved to a surprisingly good degree by a biomatrix in which the matrix is compressed or solidified.
  • a collagen biomatrix as described in DE 100 26 789 AI can be three-dimensional per se.
  • the biological material becomes so strong that the dynamometric requirements in the mechanical body structure can be met.
  • the compressive strength of the compressed or solidified material in particular can meet very high demands. But tensile strength also increases compared to known biomatrices. ge with an increasing resistance to transverse contraction associated with the higher compressive strength.
  • the invention thus opens up far-reaching uses for implants, for example as cartilage replacement with high compressive strength, ligament replacement, selmen replacement, meniscus replacement, ligament disc replacement, nucleus replacement and / or annulus replacement.
  • implants for example as cartilage replacement with high compressive strength, ligament replacement, selmen replacement, meniscus replacement, ligament disc replacement, nucleus replacement and / or annulus replacement.
  • Such an implant can even be used as a bone replacement or as a replacement for bone-cartilage constructs.
  • the biomatrix compressed or solidified according to the invention can advantageously be characterized in that it has a density gradient.
  • the biomatrix can be homogeneously compressed, but the collagen structure can also be produced in gradient form.
  • the resulting implant can be adapted in a special way to the defect on the body trunk in accordance with the dynamometric requirements. It is also possible to economically manufacture implants with reinforced areas for special requirements.
  • the density gradient is stepped.
  • a biomatrix according to the invention is generally relatively easy to produce with a step-shaped density gradient.
  • the density gradient can also have a continuous transition.
  • a biomatrix designed in this way is relatively complex to manufacture, but can be adapted to the mechanical requirements at a defective location to an outstanding degree.
  • the biomatrix according to the invention can particularly preferably be distinguished in that the density gradient forms a body with a firmer outer shell and a softer core.
  • a softer core is also understood to mean a much softer core, including a core without its own hardness.
  • the core can be filled with a fluid or in particular a gas, so that a mechanical effect similar to that of an air cushion is achieved.
  • the properties of the implant are particularly well matched to the neighboring structures.
  • the soft core ensures sufficient flexibility of the Biomatrix when it is in use, while the solid outer shell protects particularly well against mechanical damage to the Biomatrix. In this way, the Biomatrix can still be sufficiently elastic with a long service life and great robustness.
  • biomatrix with a density gradient is also advantageous and inventive, regardless of an explicit compression or consolidation of the biomatrix.
  • the matrix according to the invention is combined with inert materials.
  • the inert materials can be of both biological and non-biological origin. Collagen fleeces are mentioned here as examples.
  • the biomatrix according to the invention has aligned fibers, in particular collagen fibers.
  • aligned fibers in particular collagen fibers.
  • the combination of compression and simultaneous application of changing pressure and tensile loads enables the collagen fibers to be aligned in the matrix.
  • this is also possible by applying physical AC voltages or by other physical methods.
  • Aligned fibers have a particularly advantageous effect on the physical properties of the biomatrix. If collagen fibers are used for this, both the physical and the biochemical properties experience a significant improvement.
  • an embodiment variant of the biomatrix according to the invention is particularly preferred in which the starting solution has 1 to 10 mg protein per ml gel solution and this starting solution is compressed to more than 50 times the original protein content, preferably more than 50 times.
  • the protein content can even up to Hundred times the original protein content. This creates a very pressure-stable matrix with high strength.
  • the task also solves a method for producing a biomatrix, in which the matrix is compressed or solidified.
  • the method according to the invention is preferably characterized in that the matrix is produced using a method for redifferentiating and / or multiplying dedifferentiated cartilage cells, in which undifferentiated cartilage cells are embedded in a three-dimensional, gel-like biomatrix containing at least 1.5 mg / l collagen in buffered serum-containing cell culture medium, to be cultured.
  • the main problem of degenerative or traumatic joint diseases is that the damaged articular cartilage shows only a slight ability to regenerate. A major task therefore consists in permanently inserting cartilage cells with the implant at the site of the defect enable the cartilage to regenerate. If the matrix is produced using the described method, the dedifferentiated cartilage cells in the biomatrix can redifferentiate and resume their cell-typical metabolic performance.
  • the biomatrix should contain a collagen structure newly composed of a preferably fresh collagen solution with a concentration of at least 1.5 mg collagen per ml biomatrix.
  • the term “culturing cells” is understood to mean maintaining the vital functions of cells in a suitable environment, preferably taking place in vitro, for example by supplying and removing metabolic educts and products, in particular also an increase of cells, Cartilage cells are understood to mean naturally occurring or genetically modified cartilage cells or their precursors, which can be of animal or human origin.
  • the process according to the invention is characterized in that the matrix is produced by a process comprising the isolation of collagen-containing tissue
  • the matrix according to the invention is produced without cells. This is particularly useful when there are no suitable cells available to produce the matrix.
  • the resulting implant is simpler and cheaper to manufacture, but also meets the requirements for mechanical strength.
  • the compression is effected by withdrawing liquid. If the matrix is one
  • the matrix can be pressurized physically, for example, or a negative pressure can be applied. Liquid can also be reliably extracted from the matrix using capillary forces or a combination of the described possibilities. In most cases, the easiest way to do this is to remove water. Such liquid withdrawal can be achieved particularly effectively by pressurizing or applying a negative pressure. Alternatively and cumulatively, it is advantageous if the compaction is brought about by chemical bonding. Chemical bonding represents a further possibility of removing water and / or other liquid from the biomatrix and thereby compressing or solidifying the biomatrix in order to achieve the desired properties.
  • the method according to the invention can also be used to produce a collagen thread with a diameter between 0.005 and 4 mm, preferably between 0.01 and 2 mm.
  • a collagen thread opens up many new possibilities for insertion into the human or animal body. In particular, it can even have a connection functionality.
  • the collagen solution pass through a nozzle.
  • the biomatrix is also compulsorily compressed.
  • the liquid collagen can be pressed through the nozzle with or without a buffer solution, which withdraws liquid from the collagen. This can be done by applying positive or negative pressure. After compaction, the collagen thread can be dried, whereby a proportion of approx. 10% residual moisture is readily permitted.
  • a collagen solution as described in DE 100 26 789 AI, with a protein concentration of 6 mg / ml gel solution serves as the starting material.
  • a buffer solution is used to buffer the acidic collagen solution,
  • the two liquids are combined in equal parts at 4 ° C and mixed together.
  • the mixed solution therefore has a collagen concentration of approximately 3 mg / ml.
  • This solution is now filled into a glass cylinder with a diameter of approx. 2 cm.
  • approx. 35 ml of collagen buffer solution mixture are filled into the cylinder, resulting in a filling height of approx. 10 cm.
  • the lower part of the glass cylinder is in a glass cover, which ensures a reliable seal.
  • the lower end of the glass cylinder is closed with a porous, liquid-permeable membrane.
  • the collagen buffer solution mixture is incubated in the cylinder for 20 minutes at 37 ° C., during which it gels completely.
  • a pressure stamp is then applied to the gelled matrix, which is inserted through the upper, open end of the glass cylinder and the matrix pressurized along the cylinder axis.
  • the pressure here is approximately 0.2 Pa and is maintained for 20 minutes.
  • the pressure compresses the matrix and squeezes liquid out of it. This happens first at the upper end of the matrix, to which the Daick is originally applied; a short time later there is also a liquid outlet at the lower opening which is closed by the liquid-permeable membrane.
  • the pressure stamp is carried along with the compressed matrix in order to maintain the applied pressure as unchanged as possible,
  • the protein content of collagen increases and the biomatrix solidifies according to the invention.
  • the pressure stamp is removed and the glass cylinder is removed from the base. The leaked liquid simply flows away, the compressed matrix remains.
  • the matrix still has a height of approx. 2 cm after compaction, the protein content has quintupled compared to that in the starting mixture and is approx. 15 mg / ml.
  • protein contents of collagen of, for example, 30 mg / ml gel and more can also be easily achieved,
  • the compressed matrix is then mechanically cleaned and opened, for example cut, according to the later application.
  • the graft is then ready for cultivation.
  • the wall of the standing cylinder can consist of non-porous material, for example glass, or of porous material, for example an ultrafiltration membrane.
  • the shape of a cylinder is not binding here, the compression or consolidation of the biomatrix can also take place in any other shape, for example also in the shape of a sphere or in the form of a strand.
  • the compressed matrix is shaped in accordance with the later application.
  • the compressed matrix can also be adapted to the later shape by mechanical methods such as cutting or punching and by physical methods, for example lasers.
  • the diameter and the thickness of the compressed matrix are variable.
  • the diameter can range from 1 mm to 200 mm, the thickness from 1 mm to 50 mm.
  • a collagen solution 1 as described above is again used as the starting material. This is pressed by a pump 2 via a line 3 a, 3 b through a nozzle 4 with a cylindrical section 5 and a conical section 6.
  • a auxiliary pump 7 can be used to Council container 8 and a buffer solution 9 are introduced into the line 3b and are passed through the nozzle 4 together with the collagen solution 1.
  • the collagen solution undergoes a strong compression, in which the liquid is extracted from it (in the figure illustrated by the arrows numbered 10 as an example).
  • a collagen thread 12 emerges, which essentially has the average of the outlet opening 11. The collagen thread 12 can then be dried

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Biomatrix sowie ein Verfahren zu deren Herstellung. Um einen biologisch wie mechanisch befriedigend wirkenden Ersatz beispielsweise für erkrankte Knorpel zur Verfügung zu stellen, wird eine Biomatrix vorgeschlagen, bei der die Matrix verdichtet oder verfestigt wird. Darüber hinaus wird ein entsprechendes Verfahren vorgeschlagen.

Description

Biomatrix sowie Verfahren zu deren Herstellung
Die Erfindung betrifft eine Biomatrix sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
In der Medizintechnik, insbesondere in der Chirurgie, stellt sich regelmäßig die Aufgabe, defekte Bestandteile am menschlichen oder tierischen Körper zu entfernen und durch künstlich hergestellte zu ersetzen. Die Medizintechnik ist hierbei Gegenstand intensiver Forschung. Es hat sich gezeigt, dass für die vielfältigen unterschiedlichen Aufgabenfelder viele spezielle Lösungen nötig sind.
So besclireibt im Feld der Reparatur von Gelenkerkrankungen die DE 100 26 789 AI einen Knorpelersatz, der eine gute Regeneration eines behandelten Knorpeldefekts erlaubt, Hierbei macht die genannte Anmeldung Gebrauch von einer 3D-Biomatrix, die dem zu ersetzenden Defekt in Foπn und Größe angepasst werden kann.
Im Stand der Technik finden sich darüber hinaus noch viele weitere Vorschläge zu Implantaten im beschriebenen Bereich. Die hier verwendeten Materialien sind entweder dreidimensional, aber porös, beispielsweise bei einer Ausgestaltung als Schwamm oder Vlies; oder sie sind massiv, haben aber keine dreidimensionale Struktur, beispielsweise bei einer Ausgestaltung als Folie. An Implantate, die Teile des mechanischen Körpergerüsts ersetzen sollen, müssen jedoch besondere Anforderungen gestellt werden. Zum einen weist ein zu reparierender Defekt im Allgemeinen zumindest eine gewisse Dreidi- mensionalität auf, sodass das Implantat ebenfalls dreidimensional geformt sein sollte. Zum anderen muss das Implantat aber durch seine Dichte bzw. insbesondere seine Druckstabilität den mechanischen Belastungen bei Einsatz im Körpergerüst Rechnung tragen können. Insbesondere die Druckstabilität der bisher bekannten Materialien ist für einen Einsatz zum Beispiel im Knorpelbereich nicht ausreichend.
Der Erfinder hat sich dalier die Aufgabe gestellt, eine Biomatrix so weiter- zuentwickeln, dass die Biomatrix als Implantat auch in mechanischen Belangen den hohen auftretenden Belastungen gerecht werden kann. Außerdem hat sich der Erfinder die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem eine solche Biomatrix hergestellt werden kann.
Die Aufgabe löst in überraschend gutem Maße eine Biomatrix, bei der die Matrix verdichtet oder verfestigt ist.
Eine Kollagenbiomatrix, wie sie in der DE 100 26 789 AI beschrieben wird, kann per se dreidimensional vorliegen. Durch Verdichten oder Verfestigen der Kollagenbiomatrix erreicht das biologische Material eine so hohe Fes- tigkeit, dass die dynamometrischen Erfordernisse im mechanischen Körper- gerüst erfüllt werden können. Insbesondere die Druckfestigkeit des verdichteten bzw. verfestigten Materials kann sehr hohen Ansprüchen genügen. Aber auch die Zugfestigkeit nimmt gegenüber bekannten Biomatrizes in Fol- ge eines mit der höheren Druckfestigkeit einhergehenden steigenden Widerstands gegen Querkontraktion stark zu.
Somit eröffnet die Erfindung weit reichende Einsatzmöglichkeiten für Implantate, beispielsweise als Knorpelersatz mit hoher Druckfestigkeit, Bänder- ersatz, Selmenersatz, Meniskusersatz, Bandsc eibenersatz, Nukleusersatz und/oder Anulusersatz. Sogar als Knochenersatz oder als Ersatz für Kno- chen-Knorpel-Konstrukte lässt sich ein solches Implantat einsetzen.
Die erfindungsgemäß verdichtete bzw. verfestigte Biomatrix kann vorteilhaft dadurch gekennzeichnet sein, dass sie einen Dichtegradienten aufweist, Die Biomatrix kann homogen verdichtet vorliegen, das Kollagengerüst kann aber auch in Gradientenform hergestellt sein. Hierdurch lässt sich das resultierende Implantat in besonderer Weise dem Defekt am Körperstamm gemäß den dynamometrischen Erfordernissen anpassen. Zudem ist es möglich, wirtschaftlich Implantate mit verstärkten Bereichen für besondere Erfordernisse herzustellen.
In einer bevorzugten Variante hierzu ist der Dichtegradient stufenförmig ausgebildet. Eine erfindungsgemäße Biomatrix ist regelmäßig relativ einfach mit einem stufenförmigen Dichtegradienten herzustellen.
Alternativ hierzu kann der Dichtegradient aber auch einen kontinuierlichen Übergang aufweisen. Eine dergestalt ausgeführte Biomatrix ist zwar relativ aufwendig in der Herstellung, kann aber den mechanischen Erfordernissen an einer defekten Stelle in hervorragendem Maße angepasst werden. Durch einen mit kontinuierlichem Übergang verlaufenden Dichtegradienten kann sich ein Implantat besonders homogen in das umgebende Körpergerüst einpassen, ohne dass - wie bei diskontinuierlichem Dichtegradient des Implantats und kontinuierlich veränderlichen Eigenschaften der benachbarten Strukturen - schädliche Spannungsspitzen entstehen.
Besonders bevorzugt kann sich die erfindungsgemäße Biomatrix dadurch auszeichnen, dass der Dichtegradient einen Körper mit festerer Außenhülle und weicherem Kern bildet. Unter einem weicheren Kern wird hierbei auch ein wesentlich weicherer Kern verstanden, einschließlich eines Kerns ohne eigene Härte. Beispielsweise kann der Kern durch ein Fluid oder insbesondere ein Gas gefüllt sein, sodass eine mechanische Wirkung ähnlich der eines Luftkissens erzielt wird. Hierdurch werden die Eigenschaften des Implantats besonders gut auf die benachbarten Strukturen abgestimmt. Der weiche Kern sorgt für eine ausreichende Flexibilität der Biomatrix im eingesetz- ten Zustand, wälirend die feste Außenliülle besonders gut gegen mechanische Beschädigung der Biomatrix schützt. So kann sich die Biomatrix bei einer langen Lebensdauer und bei einer großen Robustheit dennoch ausreichend elastisch verhalten.
Es versteht sich, dass eine Biomatrix mit einem Dichtegradienten auch un- abhängig von einer expliziten Verdichtung oder Verfestigung der Biomatrix vorteilhaft und erfinderisch ist.
Unabhängig hiervon ist es von Vorteil, wenn die erfindungsgemäße Matrix mit inerten Materialien kombiniert ist. Die inerten Materialien können hier- bei sowohl biologischen als auch nichtbiologischen Ursprungs sein. Beispielhaft seien hier Kollagenvliese genannt.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform weist die erfindungsgemäße Biomatrix ausgerichtete Fasern, insbesondere Kollagenfasem, auf. Durch die Kom- bination von Verdichtung und gleichzeitigem Anlegen von wechselnder Druck- und Zugbelastung können die Kollagenfasern in der Matrix ausgerichtet werden. Alternativ und kumulativ ist dies auch durch das Anlegen von physikalischen Wechselspannungen oder durch andere physikalische Methoden möglich. Durch ausgerichtete Fasern werden insbesondere die physikalischen Eigenschaften der Biomatrix vorteilhaft beeinflusst. Wenn hierfür Kollagenfasern verwendet werden, erfahren sowohl die physikalischen als auch die biochemischen Eigenschaften eine deutliche Verbesserung.
Es versteht sich, das ein Vorliegen von ausgerichteten Fasern, insbesondere Kollagenfasern, in der Biomatrix auch ohne explizite Verdichtung oder Verfestigung erreicht werden kann und auch hiervon unabhängig vorteilhaft und erfinderisch ist.
Schließlich ist eine Ausfuhrungsvariante der erfindungsgemäßen Biomatrix besonders bevorzugt, bei der die Ausgangslösung 1 bis 10 mg Protein pro ml Gellösung aufweist und diese Ausgangslösung auf über das Zelinfache, vorzugsweise über das Fünfzigfache, des ursprünglichen Proteingehalts verdichtet ist. Der Proteingehalt kann bei dem Verdichtungsvorgang sogar bis zum Hundertfachen des ursprünglichen Proteingehalts erhöht werden. Dadurch entsteht eine sehr druckstabile Matrix mit hoher Festigkeit.
Die gestellte Aufgabe löst außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer Biomatrix, bei dem die Matrix verdichtet oder verfestigt wird. Durch Ver- dichten oder Verfestigen erreicht die Biomatrix die oben genannten vorteilhaften Eigenschaften,
Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix mit einem Verfahren zur Redifferenzierung und/oder Vermehrung von dedifferenzierten Knorpelzellen hergestellt wird, bei dem de- differenzierte Knorpelzellen eingebettet in einer dreidimensionalen, gelartigen Biomatrix, enthaltend mindestens 1,5 mg/1 Kollagen in gepuffertem se- rumhaltigen Zellkulturmedium, kultiviert werden, Das Hauptproblem degenerativer oder traumatischer Gelenkerkrankungen besteht darin, dass der geschädigte Gelenkknorpel nur eine geringe Fähigkeit zur Regeneration zeigt, Eine große Aufgabe besteht insofern darin, mit dem Implantat an der Stelle des Defekts nachhaltig Knorpelzellen einzubringen, die die Regeneration des Knorpels ermöglichen. Wenn die Matrix mit dem beschriebenen Verfahren hergestellt wird, können die dedifferenzierten Knorpelzellen in der Biomatrix redifferenzieren und ihre zelltypischen Stoffwechselleistungen wieder aufnehmen. Hierfür sollte die Biomatrix ein aus einer, vorzugsweise frischen, Kollagenlösung neu konstituiertes Kollagengerüst mit einer Konzentration von mindestens 1,5 mg Kollagen pro ml Biomatrix enthalten. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff Kultivieren von Zellen ein, vorzugsweise in vitro stattfindendes, Aufrechterhalten der Lebensfunktionen von Zellen in einer geeigneten Umgebung, zum Beispiel unter Zu- und Abfuhr von Stoffwechseledukten und -produkten ver- standen, insbesondere auch eine Vermehrung der Zellen, Unter Knorpelzel- len werden natürlicherweise vorkommende oder gentechnisch veränderte Knorpelzellen oder ihre Vorläufer verstanden, die tierischer oder menschlicher Herkunft sein können.
In einer besonders bevorzugten Variante ist das erfindungsgemäße Verfali- ren dadurch gekennzeiclmet, dass die Matrix nach einem Verfahren hergestellt wird, umfassend das Isolieren von kollagenhaltigem Gewebe, das
Überfuhren des kollagenhaltigen Gewebes in saure Lösung, das Inkubieren des in die saure Lösung überführten Kollagengewebes bei 2 bis 10 °C, insbesondere 4 °C, das Abzentrifugieren nicht gelöster Kollagenanteile, das Mischen der erhaltenen Kollagenlösung bei 2 bis 10 °C, vorzugsweise 4 °C, mit einer Lösung, enthaltend Zellkulturmedium, Serum und Puffer, und das Gelieren der gemischten Lösung durch Erhöhung der Temperatur. Dieses Verfahren ist sehr effektiv und kann auch bei einer geringen Ausgangmenge an Knorpelgewebe genügend Zellmaterial für die Herstellung von Knorpel- transplantaten zur Verfügung stellen. Zudem wird eine homogene Verteilung der Zellen in der Biomatrix auf einfache und zuverlässige Weise erreicht. Die Festigkeit des resultierenden Materials ist hierbei durch das Ausgangsvolumen der Kollagenlösung einstellbar. Je nach Anwendungsfall kann es vorteilhaft sein, wenn bei dem erfindungs- gemäßen Verfahren die Matrix mit Zellen hergestellt ist. Das verdichtete bzw. verfestigte Material kann mit oder ohne Zellen hergestellt werden. Die Herstellung mit Zellen unterstützt die Biokompatibilität des resultierenden Implantats in der beschriebenen Weise.
In einer Alternative hierzu ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Matrix ohne Zellen hergestellt. Dies bietet sich insbesondere dann an, wenn keine geeigneten Zellen zur Herstellung der Matrix zur Verfügung stehen. Zudem ist das resultierende Implantat einfacher und kostengünstiger in der Herstellung, erfüllt aber ebenso die Anforderungen an die mechanische Belastbarkeit.
Es bietet sich vorteilhaft an, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Verdichtung durch Flüssigkeitsentzug bewirkt wird. Wenn die Matrix einen
Überschuss an Flüssigkeit aufweist, ist der Entzug eben dieser überschüssi- gen Flüssigkeit die einfachste Mögliclikeit, die Matrix zu verdichten bzw. zu verfestigen. Es bieten sich hier vielfältige Möglichkeiten der praktischen Durchführung. Auf physikalischem Weg kann die Matrix beispielsweise mit Druck beaufschlagt werden oder ein Unterdruck angelegt werden. Auch über Kapillarkräfte oder durch eine Kombination der beschriebenen Mög- liclikeiten lässt sich der Matrix zuverlässig Flüssigkeit entziehen. In den meisten Fällen wird es hierbei das einfachste Mittel sein, Wasser zu entziehen. Besonders effektiv lässt sich ein solcher Flüssigkeitsentzug durch Druckbeaufschlagung oder Anlegen eines Unterdrucks erreichen. Alternativ und kumulativ ist es von Vorteil, wenn die Verdichtung durch chemische Bindung bewirkt wird. Chemische Bindung stellt eine weitere Mögliclikeit dar, der Biomatrix Wasser und/oder andere Flüssigkeit zu entziehen und die Biomatrix damit zu verdichten bzw. zu verfestigen, um die gewünschten Eigenschaften zu erreichen.
Außerdem kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch ein Kollagenfaden mit einem Durchmesser zwischen 0,005 und 4 mm, vorzugsweise zwischen 0,01 und 2 mm, hergestellt werden. Ein solcher Kollagenfaden eröffnet viele neue Möglichkeiten beim Einsetzen in den menschlichen oder tieri- sehen Körper. Insbesondere kann er sogar eine Verbindungsftinktion haben.
Zur Herstellung eines solchen Fadens wird vorgeschlagen, dass die Kollagenlösung eine Düse durchläuft. Einhergehend mit der Querschnittsverengung in der Düse wird auch die Biomatrix zwangsweise verdichtet. Hierzu kann das flüssige Kollagen mit oder ohne Pufferlösung durch die Düse ge- presst werden, welche dem Kollagen Flüssigkeit entzieht. Dies kann durch Anlegen eines Überdrucks oder eines Unterdrucks geschehen. Nach der Verdichtung kann der Kollagenfaden getrocknet werden, wobei ein Anteil von ca. 10 % Restfeuchte ohne Weiteres zulässig ist.
Erfindungsgemäße Verfahren werden nachstehend anhand zweier Beispiele erläutert. Es sei hierbei jedoch betont, dass sich die vorliegende Patentanmeldung nicht nur - wie im Beispiel - auf Knorpelzellen bezieht, sondern auch auf Knochenzellen, Stammzellen, Fibroblasten, Endothelzellen, Muskelzellen, Epithelzellen, Drüsenzellen, Sinneszellen und Kombinationen aus den genannten Zellen. Die Erfindung lässt sich ohne Weiteres auch auf diese Zellarten anwenden,
Beispiel 1
Als Ausgangsmaterial dient eine Kollagenlösung, wie sie in der DE 100 26 789 AI beschrieben ist, mit einer Proteinkonzentration von 6 mg/ml Gellösung. Gleichzeitig wird eine Pufferlösung für das Abpuffern der sauren Kollagenlösung verwendet,
Die beiden Flüssigkeiten werden bei 4 °C zu gleichen Teilen zusammengefügt und miteinander vermischt. In der gemischten Lösung herrscht somit eine Kollagenkonzentration von ca. 3 mg/ml vor. Diese Lösung wird nun in einen Glaszylinder mit einem Durchmesser von ca. 2 cm gefüllt. Vorliegend werden ca, 35 ml Kollagen-Pufferlösungsgemisch in den Zylinder gefüllt, es ergibt sich eine Füllhöhe von ca. 10 cm.
Der Glaszylinder steht dabei mit seiner unteren Öffnung in einem Glasso- ekel, welcher eine zuverlässige Abdichtung gewährleistet. Zudem ist der Glaszylinder an seinem unteren Ende mit einer porösen, flüssigkeitsdurchlässigen Membran verschlossen.
Das Kollagen-Pufferlösungsgemisch wird im Zylinder befindlich für 20 Minuten bei 37 °C inkubiert, wobei es vollständig geliert. Auf die gelierte Mat- rix wird anschließend ein Druckstempel aufgebracht, welcher durch das obere, offene Ende des Glaszylinders in diesen eingeführt wird und die Matrix längs der Zylinderachse mit Druck beaufschlagt. Der Druck beträgt dabei vorliegend ca. 0,2 Pa und wird für 20 Minuten aufrechterhalten.
Durch den Druck wird die Matrix komprimiert und Flüssigkeit aus ihr herausgedrückt. Dies geschieht zunächst am oberen Ende der Matrix, an wel- chem auch der Daick ursprünglich aufgebracht wird; kurze Zeit später erfolgt auch am unteren, durch die flüssigkeitsdurchlässige Membran verschlossene Öffnung ein Flüssigkeitsaustritt. Der Druckstempel wird mit der komprimierten Matrix mitgeführt, um den aufgebrachten Druck möglichst unveraiindert aufrechtzuerhalten ,
Mit Verdichtung der Matrix, also mit abnehmender Höhe der Matrixsäule, wird der Proteingehalt an Kollagen größer, und die Biomatrix verfestigt sich erfindungsgemäß. Nach der Druckbeaufschlagung wird der Druckstempel entfernt und der Glaszylinder vom Sockel abgenommen. Die ausgetretene Flüssigkeit fließt einfach ab, die verdichtete Matrix bleibt zurück. In vorliegendem Versuch hat die Matrix nach der Verdichtung noch eine Höhe von ca. 2 cm, der Proteingehalt hat sich somit gegenüber demjenigen im Ausgangsgemisch verfünffacht und beträgt ca. 15 mg/ml. Bei weiterer Komprimierung können auch ohne Weiteres Proteingehalte an Kollagen von beispielsweise 30 mg/ml Gel und mehr erreicht werden,
Die verdichtete Matrix wird abscliließend mechanisch gereinigt und entsprechend der späteren Anwendung gefoπnt, beispielsweise geschnitten. Das Transplantat ist dann fertig für die Kultivierung. Die Wandung des Standzylinders kann dabei aus nicht porösem Material, beispielsweise Glas, oder aus porösem Material, beispielsweise einer Ultra- filtrationsmembran, bestehen. Die Form eines Zylinders ist hierbei nicht bindend, die Verdichtung bzw. Verfestigung der Biomatrix kann auch in jegli- eher anderen formgebenden Gestalt erfolgen, beispielsweise auch in Kugelgestalt oder strangförmig. Die Formgebung der verdichteten Matrix erfolgt hierbei entsprechend der späteren Applikation.
Die verdichtete Matrix kann aber auch durch mechanische Verfahren wie beispielsweise Schneiden oder Stanzen sowie durch physikalische Metho- den, beispielsweise Laser, der späteren Form angepasst werden. Der Durchmesser und die Dicke der verdichteten Matrix sind hierbei variabel. Der Durchmesser kann von 1 mm bis 200 mm reichen, die Dicke von 1 mm bis 50 mm.
Beispiel 2
Zur Verdeutlichung dieses Beispiels für ein erfindungsgemäßes Verfaliren wird Bezug auf die Zeichnung genommen. Hierin zeigt
die einzige Figur schematisch einen Versuchsaufbau zur Herstellung von Kollagenfasern.
Ais Ausgangsmaterial dient abermals eine wie vorstehend beschriebene Kol- lagenlösimg 1. Diese wird von einer Pumpe 2 über eine Leitung 3 a, 3b durch eine Düse 4 mit einem zylindrischen Abschnitt 5 und einem konischen Abschnitt 6 gepresst. Optional kann über eine Zusatzpumpe 7 aus einem Vor- ratsbehälter 8 auch eine Pufferlösung 9 in die Leitimg 3b eingeführt werden imd gemeinsam mit der Kollagenlösung 1 durch die Düse 4 geführt werden.
Infolge der Querschnittsverengung im konischen Abschnitt 6 der Düse 4 erfährt die Kollagenlösung eine starke Verdichtung, im Ralimen derer Flüssigkeit entzogen wird (in der Figur durch die exemplarisch mit 10 bezifferten Pfeile verdeutlicht). An einer Austrittsöffhung 11 der Düse 4 tritt ein Kollagenfaden 12 aus, welcher im Wesentlichen den Durchschnitt der Austrittsöffhung 11 hat. Der Kollagenfaden 12 kann anschließend getrocknet werden,

Claims

Patentansprüche:
1. Biomatrix, dadurch gekennzeichnet, dass sie verdichtet oder verfestigt ist.
2. Biomatrix nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Dichtegradienten aufweist
3. Biomatrix nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Dichtegradient stufenförmig ausgebildet ist.
4. Biomatrix nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Dic - tegradient einen kontinuierlichen Übergang aufweist,
5, Biomatrix nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Dichtegradient einen Körper mit festerer Außenhülle und weicherem Kern bildet.
6. Biomatrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix mit inerten Materialien kombiniert ist.
7. Biomatrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgerichtete Fasern, insbesondere Kollagenfasern, aufweist.
8, Biomatrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgangslösung 1 bis 10 mg Protein pro ml Gellösung aufweist und diese Ausgangslösung auf über das Zelnfa- ehe, vorzugsweise über das Fünfzigfache, des ursprünglichen Proteingehaltes verdichtet ist.
9. Verfaliren zur Herstellung einer Biomatrix, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix verdichtet oder verfestigt wird.
10. Verfaliren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix mit einem Verfahren zur Redifferenzierung und/oder Vermehrung von dedifferenzierten Knorpelzellen hergestellt wird, bei dem dedifferenzierte Knorpelzellen eingebettet in einer dreidimensionalen, gelartigen Biomatrix, enthaltend mindestens 1,5 mg pro Liter Kollagen in gepuffertem serumhaltigen Zellkulturmedium, kultiviert werden.
11, Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix nach einem Verfaliren hergestellt wird, umfassend das Isolieren von kollagenhaltigem Gewebe, das Überführen des kollagenhal- tigen Gewebes in saure Lösung, das Inkubieren des in die saure Lö- sung überfül rten Kollagengewebes bei 2 bis 10°C, insbesondere 4°C, das Abzentrifugieren nicht gelöster Kollagenanteile, das Mischen der erhaltenen Kollagenlösung bei 2 bis 10°C, vorzugsweise 4°C, mit einer Lösung, enthaltend Zellkulturmedium, Serum und Puffer, und das Gelieren der gemischten Lösung durch Erhöhung der Temperatur.
12. Verfaliren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix mit Zellen hergestellt ist.
13. Verfaliren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix ohne Zellen hergestellt ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdichtung durch Flüssigkeitsentzug bewirkt wird.
15. Verfaliren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der
Flüssigkeitsentzug durch Druckaufschlag initiiert wird.
16. Verfaliren nach Anspmch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der
Flüssigkeitsentzug durch Anlegen eines Unterdmcks durchgeführt wird.
17. Verfaliren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdichtung durch chemische Bindung bewirkt wird.
18. Verfaliren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch gekenn- zeichnet, dass ein Kollagenfaden mit einem Durchmesser zwischen
0,005 und 4 mm, vorzugsweise zwischen 0,01 und 2 mm, hergestellt wird.
19. Verfaliren nach Anspmch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Kol- lagenlösung zur Formung des Kollagenfadens eine Düse durchläuft.
20. Verfaliren nach Anspmch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Kollagenfaden nach der Verdichtung getrocknet wird
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