EA049367B1

EA049367B1 - MUTANT TRANSPOSE PiggyBac

Info

Publication number: EA049367B1
Application number: EA202191627
Authority: EA
Inventors: Неерадж Дж. Агравал; Кристин М. Дарис; Дженнитт Л. Стивенс; Хуонг Тхи Нгок Ле; Ноелия Бланко Талаван
Original assignee: Эмджен Инк.
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2025-03-18

Abstract

Транспозаза PiggyBac, сконструированная для увеличения стабильности в клетке. Сконструированные транспозазы piggyBac среди прочих путей применения применимы для стабильной трансформации клеток, разработки линий клеток, модификации генома и повышения титра рекомбинантных белков.PiggyBac transposase, engineered to enhance cellular stability. Engineered piggyBac transposases are used, among other things, for stable cell transformation, cell line development, genome modification, and increased titer of recombinant proteins.

Description

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/777325, поданной 10 декабря 2018 г., и предварительной заявке на патент США № 62/925516, поданной 24 октября 2019 г., которые настоящим включены посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей, как если бы они были полностью изложены в данном документе.This application claims priority to U.S. Provisional Patent Application No. 62/777,325, filed December 10, 2018, and U.S. Provisional Patent Application No. 62/925,516, filed October 24, 2019, which are hereby incorporated by reference in their entirety and for all purposes as if fully set forth herein.

Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates

Настоящее изобретение относится к транспозазам piggyBac, сконструированным для повышения стабильности в клетке, и, среди прочих путей применения, к применению сконструированных транспозаз piggyBac для стабильной трансфекции клеток, разработки линий клеток, модификации генома и повышения титра рекомбинантных белков.The present invention relates to piggyBac transposases engineered to enhance stability in a cell and, among other uses, to the use of engineered piggyBac transposases for stable transfection of cells, cell line development, genome modification, and increased titer of recombinant proteins.

Перечень последовательностейList of sequences

В качестве отдельной части настоящего изобретения настоящая заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме (имя файла: A-2320-WO-PCT_Sequence.txt, созданный 05.11.2019 г., размер 64 КБ), который включен посредством ссылки во всей своей полноте.As a separate part of the present invention, the present application contains a sequence listing in machine-readable form (file name: A-2320-WO-PCT_Sequence.txt, created 05.11.2019, size 64 KB), which is incorporated by reference in its entirety.

Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for the creation of an invention

Благодаря их широкой применимости биопрепараты применяют во всем мире в самых разных областях применения, как, например, в качестве средств терапии и средств диагностики. В настоящее время приблизительно 51% одобренных биопрепаратов получают с использованием клеток млекопитающих, при этом клетки яичника китайского хомячка (СНО) являются превалирующей клеточной фабрикой (Zhou and Kantardjeff, Mammalian cell cultures for biologics manufacturing, Springer, Heidelberg, New York, 2014). В результате этого биофармацевтическая промышленность претерпевает стремительную смену парадигмы. Скорость вывода продукта на рынок и рентабельность сейчас намного важнее, чем когда-либо прежде. Высокие затраты на исследования и разработки и длительные сроки разработки биофармацевтических лекарственных средств сделали обязательным устранение задержек и неэффективности при разработке лекарственных средств и, что более важно, при изготовлении. В то же время продуктовые линии становятся все сложнее и разнообразнее, поэтому биофармацевтическим компаниям теперь требуется инфраструктура, способная приспособиться к множеству методов с различными требованиями в диапазоне от индивидуализированных средств терапии, полученных из донорских клеток, до производства биологических лекарственных средств в количествах, находящих в диапазоне от граммов до сотен килограммов в год.Due to their broad applicability, biologics are used worldwide in a wide range of applications, such as therapeutics and diagnostics. Currently, approximately 51% of approved biologics are produced using mammalian cells, with Chinese hamster ovary (CHO) cells being the predominant cell factory (Zhou and Kantardjeff, Mammalian cell cultures for biologics manufacturing, Springer, Heidelberg, New York, 2014). As a result, the biopharmaceutical industry is undergoing a rapid paradigm shift. Speed to market and profitability are more important than ever before. High R&D costs and long lead times for biopharmaceutical drug development have made it imperative to eliminate delays and inefficiencies in drug development and, more importantly, manufacturing. At the same time, product lines are becoming increasingly complex and diverse, so biopharmaceutical companies now require infrastructure that can accommodate a variety of approaches with different requirements, ranging from individualized therapies derived from donor cells to the production of biological drugs in quantities ranging from grams to hundreds of kilograms per year.

Таким образом, существует потребность в увеличении продуцирования рекомбинантных белков от клеток-хозяев и в улучшении долгосрочной стабильности экспрессии. Одним из способов достижения данной цели является повышение титров белков, экспрессируемых системами экспрессии на основе клеток. В настоящем изобретении, описанном в данном документе, предусмотрены мутации, которые способствуют повышению стабильности транспозазы piggyBac, экспрессируемой в клетках-хозяевах. Было обнаружено, что транспозазы piggyBac, кодируемые последовательностями нуклеиновой кислоты, сконструированными с такими мутациями, приводят к увеличению титра рекомбинантных белков, экспрессируемых в клетках, содержащих сконструированную транспозазу piggyBac, по сравнению с титром рекомбинантных белков, экспрессируемых в клетках, содержащих транспозазу piggyBac дикого типа или не содержащих транспозазу piggyBac.There is thus a need to increase the production of recombinant proteins from host cells and to improve the long-term stability of expression. One way to achieve this goal is to increase the titers of proteins expressed by cell-based expression systems. The present invention described herein provides mutations that enhance the stability of piggyBac transposase expressed in host cells. It has been found that piggyBac transposases encoded by nucleic acid sequences engineered with such mutations result in an increased titer of recombinant proteins expressed in cells containing the engineered piggyBac transposase compared to the titer of recombinant proteins expressed in cells containing wild-type piggyBac transposase or lacking piggyBac transposase.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, содержащая аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 и/или аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере две из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В другом родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит замену изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, замену изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и замену серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления транспозазы piggyBac предусмотрено, что титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции сконструированной транспозазой piggyBac, которая описана в данном документе, повышен по сравнению с титром такого же представляющего интерес белка, экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac.In one aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase comprising an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533 and 573 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221 and 247 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533 and 573 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221 and 247 and/or an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least one of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least two of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In another related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine substitution at position 147 of SEQ ID NO: 2, an isoleucine to leucine substitution at position 247 of SEQ ID NO: 2, and a serine to threonine substitution at position 533 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment of the piggyBac transposase, it is provided that the titer of a recombinant protein of interest expressed by a cell transfected with the engineered piggyBac transposase described herein is increased compared to the titer of the same protein of interest expressed by a cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or one lacking the piggyBac transposase.

- 1 049367- 1 049367

В одном варианте осуществления представляющий интерес рекомбинантный белок представляет собой антигенсвязывающий белок.In one embodiment, the recombinant protein of interest is an antigen-binding protein.

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, сконструированная для увеличения стабильности в клетке-хозяине, где транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2.In one aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase engineered to increase stability in a host cell, wherein the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence by SEQ ID NO: 4. In another aspect of the present invention there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence by SEQ ID NO: 6. In another aspect of the present invention there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence by SEQ ID NO: 8. In another aspect of the present invention there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence by SEQ ID NO: 10. In another aspect of the present invention there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence by SEQ ID NO: 12. In another aspect of the present invention there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence by SEQ ID NO: 14. In another aspect of the present invention there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence by SEQ ID NO: 16.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:18.In another aspect, the present invention provides an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present The invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 18.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, при этом дополнительно содержит по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления вектор содержит одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих один или несколько представляющих интерес белков.In another aspect of the present invention, there is provided a vector comprising a nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein. In one embodiment, the vector comprises a nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein, further comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In one embodiment, the vector comprises one or more nucleic acid sequences encoding one or more proteins of interest.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена клетка, подвергнутая трансфекции вектором, описанным в данном документе. В одном варианте осуществления клетку подвергаютIn another aspect of the present invention, there is provided a cell transfected with a vector as described herein. In one embodiment, the cell is transfected with a vector as described herein.

- 2 049367 трансфекции транспозазой piggyBac, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или 18. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку-хозяина. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку CHO. В одном варианте осуществления клетка представляет собой иммунную клетку.- 2 049367 transfection with piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 18. In one embodiment, the cell is a host cell. In one embodiment, the cell is a CHO cell. In one embodiment, the cell is an immune cell.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена клетка, подвергнутая совместной трансфекции сконструированной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, и вектором, содержащим по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена клетка, подвергнутая совместной трансфекции вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, и вектором, содержащим по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена клетка, подвергнутая совместной трансфекции вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, а также, содержащим по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac.In another aspect, the present invention provides a cell co-transfected with an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein and a vector comprising at least one nucleic acid molecule encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon. In another embodiment, the present invention provides a cell co-transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein and a vector comprising at least one nucleic acid molecule encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon. In another embodiment, the present invention provides a cell co-transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein and further comprising at least one nucleic acid molecule encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена клетка, описанная в данном документе, где титр представляющего интерес белка, экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции сконструированной транспозазой piggyBac, увеличен по сравнению с титром такого же представляющего интерес белка экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac. В одном варианте осуществления предусмотрен представляющий интерес рекомбинантный белок, экспрессируемый клеткой. В родственном варианте осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая представляющий интерес рекомбинантный белок.In another aspect of the present invention, there is provided a cell as described herein, wherein the titer of a protein of interest expressed by a cell transfected with an engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the same protein of interest expressed by a cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or lacking the piggyBac transposase. In one embodiment, there is provided a recombinant protein of interest expressed by the cell. In a related embodiment, there is provided a pharmaceutical composition comprising the recombinant protein of interest.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ увеличения титра представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, предусматривающий конструирование молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, для увеличения стабильности в клетке-хозяине; совместную трансфекцию клетки-хозяина сконструированной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, и вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac; и культивирование клеток для осуществления экспрессии представляющего интерес рекомбинантного белка; где титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции сконструированной piggyBac, увеличивается по сравнению с титром представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac. В одном варианте осуществления клетку-хозяина подвергают трансфекции первым вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, и вторым вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления клетку-хозяина подвергают трансфекции одним вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac.In another aspect of the present invention, there is provided a method for increasing the titer of a recombinant protein of interest expressed by a host cell, comprising engineering a nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase to increase stability in the host cell; co-transfecting the host cell with the engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase and a vector comprising a nucleic acid sequence encoding the protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon; and culturing the cells to express the recombinant protein of interest; wherein the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with the engineered piggyBac is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or lacking the piggyBac transposase. In one embodiment, the host cell is transfected with a first vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase and a second vector comprising a nucleic acid sequence encoding the protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In one embodiment, the host cell is transfected with a single vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ увеличения продуцирования рекомбинантного белка в культуре клеток млекопитающих, экспрессирующих рекомбинантный белок, предусматривающий создание культуры клеток в биореакторе с использованием клетки-хозяина, которая была подвергнута совместной трансфекции молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке-хозяине, и вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac; и осуществление экспрессии представляющего интерес рекомбинантного белка; где титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции сконструированной piggyBac, увеличивается по сравнению с титром представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac. В одном варианте осуществления клетка-хозяин была подвергнута совместной трансфекции вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности вIn another aspect of the present invention, there is provided a method for increasing the production of a recombinant protein in a mammalian cell culture expressing the recombinant protein, comprising establishing a cell culture in a bioreactor using a host cell that has been co-transfected with a nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase engineered to be more stable in the host cell and a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a protein of interest flanked by at least inverted repeat elements of the piggyBac transposon; and expressing the recombinant protein of interest; wherein the titer of the recombinant protein of interest expressed by the host cell transfected with the engineered piggyBac is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by the host cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or one lacking the piggyBac transposase. In one embodiment, the host cell has been co-transfected with a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in

- 3 049367 клетке-хозяине, и вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления клетку-хозяина подвергают трансфекции одним вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac.- 3 049367 a host cell, and a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a protein of interest flanked by at least piggyBac transposon inverted repeat elements. In one embodiment, the host cell is transfected with a single vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' piggyBac transposon inverted repeat elements.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ получения выделенного, очищенного представляющего интерес рекомбинантного белка, предусматривающий создание культуры клеток в биореакторе с использованием клетки-хозяина, экспрессирующей представляющий интерес рекомбинантный белок, где линия клеток была подвергнута совместной трансфекции последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке-хозяине, и вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac; культивирование клеток для осуществления экспрессии представляющего интерес рекомбинантного белка; сбор представляющего интерес рекомбинантного белка, обработку представляющего интерес рекомбинантного белка посредством одной или нескольких типовых операций и получение выделенного, очищенного, представляющего интерес рекомбинантного белка. В одном варианте осуществления линию клеток подвергают совместной трансфекции вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке-хозяине, и вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления клетку-хозяина подвергают трансфекции одним вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна типовая операция представляет собой стадию хроматографического захвата, выбранную из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, мультимодальной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий и хроматографии на гидроксиапатите. В родственном варианте осуществления по меньшей мере одна типовая операция представляет собой стадию хроматографической доочистки, выбранную из ионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, мультимодальной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий и хроматографии на гидроксиапатите. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна типовая операция выбрана из инактивации вируса, удаления вируса путем фильтрации, глубинной фильтрации и UF/DF. В одном варианте осуществления титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции сконструированной транспозазой piggyBac, увеличен по сравнению с титром представляющего интерес рекомбинантного белка экспрессируемого клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac. В одном варианте осуществления предусмотрен выделенный, очищенный рекомбинантный белок. В родственном варианте осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая выделенный представляющий интерес белок.In another aspect of the present invention, there is provided a method for producing an isolated, purified recombinant protein of interest, comprising establishing a cell culture in a bioreactor using a host cell expressing a recombinant protein of interest, wherein the cell line has been co-transfected with a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in the host cell and a vector comprising a nucleic acid sequence encoding the protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon; culturing the cells to express the recombinant protein of interest; collecting the recombinant protein of interest, processing the recombinant protein of interest by one or more unit operations, and obtaining the isolated, purified recombinant protein of interest. In one embodiment, the cell line is co-transfected with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in a host cell and a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon. In one embodiment, the host cell is transfected with a single vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon. In one embodiment, the at least one unit operation is a chromatographic capture step selected from affinity chromatography, ion exchange chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, multimodal chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and hydroxyapatite chromatography. In a related embodiment, the at least one unit operation is a chromatographic polishing step selected from ion exchange chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, multimodal chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and hydroxyapatite chromatography. In one embodiment, the at least one unit operation is selected from virus inactivation, virus removal by filtration, depth filtration, and UF/DF. In one embodiment, the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with the engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or lacking the piggyBac transposase. In one embodiment, an isolated, purified recombinant protein is provided. In a related embodiment, a pharmaceutical composition comprising the isolated protein of interest is provided.

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен набор для трансфекции клетки, содержащий вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке-хозяине; и вектор, содержащий по меньшей мере 5'- и 3'-элементы инвертированных повторов транспозона piggyBac, в который встроена по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок.In one aspect of the present invention, there is provided a cell transfection kit comprising a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in a host cell; and a vector comprising at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon into which at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest has been inserted.

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ создания клеток, генетически модифицированных без участия вируса, предусматривающий: (a) создание вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке, и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac; (b) выделение нативных иммунных клеток от донора или субъекта; (b) трансфекцию клеток вектором и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке; и (c) размножение клеток путем культивирования клеток с образованием большей популяции клеток, генетически модифицированных без участия вируса. В одном варианте осуществления клетки подвергают трансфекции вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторовIn one aspect, the present invention provides a method for generating cells genetically modified without the involvement of a virus, comprising: (a) generating a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in a cell and at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon; (b) isolating naive immune cells from a donor or subject; (b) transfecting the cells with the vector and a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in a cell; and (c) expanding the cells by culturing the cells to form a larger population of cells genetically modified without the involvement of a virus. In one embodiment, the cells are transfected with a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements.

- 4 049367 транспозона piggyBac, и вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке. В одном варианте осуществления клетки подвергают трансфекции вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке.- 4 049367 piggyBac transposon, and a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in a cell. In one embodiment, the cells are transfected with a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon, and a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in a cell.

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта клеткой, генетически модифицированной без участия вируса, предусматривающий: (a) создание вектора, содержащего по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac; (b) выделение нативных иммунных клеток от субъекта или донора; (c) трансфекцию клеток вектором и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке; (d) размножение клеток путем культивирования клеток с образованием большей популяции генетически модифицированных клеток; (e) выделение трансформированных клеток из культуры клеток с получением популяции клеток, содержащей генетически модифицированные клетки; и (f) повторное введение субъекту клеток, генетически модифицированных без участия вируса. В одном варианте осуществления клетки подвергают трансфекции вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac, и вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке. В одном варианте осуществления клетки подвергают трансфекции вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке. В одном варианте осуществления нативная иммунная клетка представляет собой мононуклеарную клетку. В одном варианте осуществления нативная иммунная клетка представляет собой Т-клетку. В одном варианте осуществления по меньшей мере один представляющий интерес белок представляет собой антигенный рецептор, Т-клеточный рецептор или химерный антигенный рецептор. В одном варианте осуществления клетку также подвергают трансфекции молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей ген самоубийства, индуцируемый переключатель включения или ускорения или как первый, так и второй. В одном варианте осуществления предусмотрены клетки, популяции клеток или культуры клеток, генетически модифицированных без участия вируса. В одном варианте осуществления предусмотрен состав, содержащий генетически модифицированные клетки или популяции клеток. В другом варианте осуществления предусмотрен способ лечения или предупреждения заболевания или нарушения у нуждающегося в этом донора или субъекта, предусматривающий введение донору или субъекту эффективного количества генетически модифицированных клеток или популяций клеток.In one aspect, the present invention provides a method of treating a subject with a cell genetically modified without the involvement of a virus, comprising: (a) creating a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon; (b) isolating naive immune cells from the subject or a donor; (c) transfecting the cells with the vector and a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in the cell; (d) expanding the cells by culturing the cells to form a larger population of genetically modified cells; (e) isolating the transformed cells from the cell culture to obtain a population of cells comprising the genetically modified cells; and (f) reintroducing the cells genetically modified without the involvement of a virus to the subject. In one embodiment, the cells are transfected with a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon and a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in the cell. In one embodiment, the cells are transfected with a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon and a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in the cell. In one embodiment, the naive immune cell is a mononuclear cell. In one embodiment, the naive immune cell is a T cell. In one embodiment, at least one protein of interest is an antigen receptor, a T-cell receptor, or a chimeric antigen receptor. In one embodiment, the cell is also transfected with a nucleic acid molecule encoding a suicide gene, an inducible on or acceleration switch, or both. In one embodiment, cells, cell populations, or cell cultures are provided that are genetically modified without the involvement of a virus. In one embodiment, a composition comprising genetically modified cells or cell populations is provided. In another embodiment, a method of treating or preventing a disease or disorder in a donor or subject in need thereof is provided, comprising administering to the donor or subject an effective amount of genetically modified cells or cell populations.

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

Фиг. 1: Прогнозируемая вторичная структура. Полосками показаны прогнозируемые альфаспиральные области, стрелками показаны прогнозируемые бета-складчатые области.Fig. 1: Predicted secondary structure. Bars indicate predicted alpha-helical regions, arrows indicate predicted beta-sheet regions.

Фиг. 2: Увеличенный или сопоставимый титр моноклональных антител AB1 и AB2 у линий клеток, содержащих сконструированную транспозазу piggyBac, по сравнению с контролями, содержащими транспозазу piggyBac WT или не содержащими транспозазу piggyBac.Fig. 2: Increased or comparable titer of AB1 and AB2 monoclonal antibodies in cell lines containing engineered piggyBac transposase compared to controls containing WT piggyBac transposase or lacking piggyBac transposase.

Фиг. 3: Увеличенный титр у линии клеток, экспрессирующей слитый белок, для линии клеток со сконструированной транспозазой piggyBac по сравнению с контролями, содержащими транспозазу piggyBac WT или не содержащими транспозазу piggyBac.Fig. 3: Increased titer in a cell line expressing the fusion protein for a cell line with engineered piggyBac transposase compared to controls containing WT piggyBac transposase or lacking piggyBac transposase.

Фиг. 4: Сопоставимый титр молекулы биспецифического активатора, привлекающего T-клетки, у линий клеток, содержащих сконструированную транспозазу piggyBac, по сравнению с контролями, содержащими транспозазу piggyBac WT или не содержащими транспозазу piggyBac.Fig. 4: Comparable titer of the bispecific T cell attractant activator molecule in cell lines containing engineered piggyBac transposase compared to controls containing WT piggyBac transposase or lacking piggyBac transposase.

Фиг. 5: Для пулов, которые трансфицировали двойным ILT или тройным мутантом LLT транспозазы piggyBac, показано увеличение экспрессии по сравнению с пулами, содержащими транспозазу, которые не получали обработку с помощью MSX (0 мкМ MSX). В случае пулов, в которые не добавляли транспозазу (отсутствует), при добавлении MSX экспрессия не увеличивалась. Тестировали BiTE® HeteroFc, IgGscFV и mAb. MSX добавляли при трансфекции (25) или после восстановления исходного пула, подвергнутого трансфекции с помощью ДНК транспозазы (0-25).Fig. 5: Pools transfected with the double ILT or triple LLT mutant of piggyBac transposase show an increase in expression compared to pools containing transposase that did not receive MSX treatment (0 μM MSX). For pools to which transposase was not added (none), expression was not increased by the addition of MSX. BiTE® HeteroFc, IgGscFV and mAb were tested. MSX was added at transfection (25) or after reconstitution of the original pool transfected with transposase DNA (0-25).

Фиг. 6А и В: Уровни экспрессии в пулах в зависимости от трансфекции с помощью ДНК или мРНК двойного мутанта ILT транспозазы piggyBac при использовании способа электропорации или липидного способа.Fig. 6A and B: Expression levels in pools depending on transfection with piggyBac double mutant ILT transposase DNA or mRNA using the electroporation or lipid method.

6A) Способ трансфекции на основе электропорации для сравнения ДНК транспозазы с мРНК6A) Electroporation-based transfection method for comparing transposase DNA with mRNA

- 5 049367 транспозазы. Увеличение содержания мРНК транспозазы увеличивало экспрессию. 1) 0 мкг транспозазы, 20 мкг ДНК mAb; 2) ДНК двойного мутанта ILT: 20 мкг ДНК mAb, 5 мкг транспозазы, соотношение 4:1; 3) мРНК двойного мутанта ILT: 20 мкг ДНК mAb, 5 мкг транспозазы, соотношение 4:1; 4) мРНК двойного мутанта ILT: 20 мкг ДНК mAb, 10 мкг транспозазы, соотношение 2:1; 5) мРНК двойного мутанта ILT: 20 мкг ДНК mAb, 20 мкг транспозазы, соотношение 1:1; 11) мРНК двойного мутанта ILT: 14 мкг ДНК mAb, 100 мкг транспозазы, соотношение 7:1; 12) мРНК двойного мутанта ILT: 28 мкг ДНК mAb, 200 мкг транспозазы, соотношение 7:1.- 5 049367 transposase. Increasing the content of transposase mRNA increased expression. 1) 0 μg transposase, 20 μg mAb DNA; 2) ILT double mutant DNA: 20 μg mAb DNA, 5 μg transposase, ratio 4:1; 3) ILT double mutant mRNA: 20 μg mAb DNA, 5 μg transposase, ratio 4:1; 4) ILT double mutant mRNA: 20 μg mAb DNA, 10 μg transposase, ratio 2:1; 5) ILT double mutant mRNA: 20 μg mAb DNA, 20 μg transposase, ratio 1:1; 11) ILT double mutant mRNA: 14 μg mAb DNA, 100 μg transposase, ratio 7:1; 12) ILT double mutant mRNA: 28 μg mAb DNA, 200 μg transposase, ratio 7:1.

6B) Липидный способ трансфекции для сравнения ДНК транспозазы с мРНК транспозазы. Увеличение содержания мРНК транспозазы увеличивало экспрессию. ДНК двойного мутанта ILT транспозазы PiggyBac: 2 мкг ДНК mAb, 0,5 мкг транспозазы, соотношение 4:1; 2 мкг ДНК mAb, 2 мкг транспозазы, соотношение 1:1; 4 мкг ДНК mAb, 4 мкг транспозазы, соотношение 1:1; мРНК двойного мутанта ILT транспозазы PiggyBac: 2 мкг ДНК mAb, 0,5 мкг транспозазы, соотношение 4:1; 2 мкг ДНК mAb, 2 мкг транспозазы, соотношение 1:1; 4 мкг ДНК mAb, 4 мкг транспозазы, соотношение 1:1.6B) Lipid transfection method comparing transposase DNA with transposase mRNA. Increasing transposase mRNA increased expression. PiggyBac ILT transposase double mutant DNA: 2 μg mAb DNA, 0.5 μg transposase, 4:1 ratio; 2 μg mAb DNA, 2 μg transposase, 1:1 ratio; 4 μg mAb DNA, 4 μg transposase, 1:1 ratio; PiggyBac ILT transposase double mutant mRNA: 2 μg mAb DNA, 0.5 μg transposase, 4:1 ratio; 2 μg mAb DNA, 2 μg transposase, 1:1 ratio; 4 μg mAb DNA, 4 μg transposase, 1:1 ratio.

Фиг. 7: Уровни экспрессии у пулов, подвергнутых трансфекции с помощью электропорации. Трансфекция с помощью ДНК и обеих мРНК двойного мутанта транспозазы ILT. Пулы, подвергнутые трансфекции с помощью синтетической мРНК (PB син мРНК) и мРНК (PB мРНК), характеризовались аналогичными титрами с таковыми у пулов, подвергнутых трансфекции ДНК транспозазы (PB DNA), и более высокими титрами, чем у контрольных пулов без транспозазы. Стрелка, направленная вниз, указывает минимальное значение. Стрелка, направленная вверх, указывает максимальное значение. Белая полоса указывает медиану.Fig. 7: Expression levels in pools transfected by electroporation. Transfection with DNA and both mRNAs of the double mutant ILT transposase. Pools transfected with synthetic mRNA (PB syn mRNA) and mRNA (PB mRNA) had similar titers to pools transfected with transposase DNA (PB DNA) and higher titers than the control pools without transposase. Downward arrow indicates the minimum value. Upward arrow indicates the maximum value. White bar indicates the median.

Фиг. 8A и B: Интеграция на уровне генома и транскрипта у пулов линий клеток, трансфицированных с помощью ДНК и мРНК.Fig. 8A and B: Integration at the genomic and transcript levels in pools of cell lines transfected with DNA and mRNA.

8A) Все пулы линий клеток, трансфицированных ДНК двойного мутанта ILT транспозазы, имели интеграцию на уровне генома, тогда как линии, трансфицированные с помощью мРНК, не имели интеграцию на уровне генома. Полоска размером ~1,7 т. о. указывала на присутствие транспозазы в геноме линии клеток. Дорожка 1. Лесенка. Дорожки 2-4. ДНК двойного мутанта ILT транспозазы piggyBac. Дорожка 5. Отсутствие трансфекции. Дорожки 6-11. мРНК двойного мутанта ILT транспозазы piggyBac. Дорожка 12. Контроль с плазмидной ДНК.8A) All pools of cell lines transfected with ILT transposase double mutant DNA had genome-wide integration, whereas lines transfected with mRNA did not have genome-wide integration. The ~1.7 kb band indicated the presence of transposase in the cell line genome. Lane 1. Ladder. Lanes 2-4. PiggyBac ILT transposase double mutant DNA. Lane 5. No transfection. Lanes 6-11. PiggyBac ILT transposase double mutant mRNA. Lane 12. Plasmid DNA control.

8B) Фотография геля, полученного в ходе RT-PCR-анализа, для проверки транскрипции на уровне РНК. Все пулы линий клеток, трансфицированных ДНК двойного мутанта ILT транспозазы, характеризовались транскрипцией на уровне РНК, тогда как линии, трансфицированные с помощью мРНК, не характеризовались транскрипцией на уровне РНК. Полоска размером ~1,7 т. о. указывал на присутствие транскрипта транспозазы. Дорожка 1. Лесенка. Дорожки 2-3. мРНК двойного мутанта ILT транспозазы piggyBac. Дорожка 4. ДНК двойного мутанта ILT транспозазы piggyBac. Дорожка 5. Контроль с плазмидной ДНК.8B) Photograph of a gel obtained during RT-PCR analysis to verify transcription at the RNA level. All pools of cell lines transfected with ILT transposase double mutant DNA were characterized by RNA transcription, whereas lines transfected with mRNA were not characterized by RNA transcription. The ~1.7 kb band indicated the presence of the transposase transcript. Lane 1. Ladder. Lanes 2-3. ILT transposase piggyBac double mutant mRNA. Lane 4. ILT transposase piggyBac double mutant DNA. Lane 5. Plasmid DNA control.

Фиг. 9: Пул характеризовался малым числом копий и содержал клоны, в которых интеграция транспозазы отсутствовала.Fig. 9: The pool was characterized by a low copy number and contained clones in which transposase integration was absent.

Фиг. 10: TCR-T-клетки, полученные с использованием невирусной доставки генов и транспозазы piggyBac, проявляют устойчивую функцию in vitro. (A) Т-клетки успешно конструировали для экспрессии TCR с использованием двойного мутанта ILT. (B) Лизис клеток-мишеней и (C) пролиферация TCR-T-клеток со сконструированной piggyBac после совместной инкубации с антигенпрезентирующими клетками в течение 5 дней.Fig. 10: TCR T cells generated using nonviral gene delivery and piggyBac transposase exhibit robust function in vitro. (A) T cells were successfully engineered to express TCR using the ILT double mutant. (B) Lysis of target cells and (C) proliferation of piggyBac-engineered TCR T cells after co-incubation with antigen-presenting cells for 5 days.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

ДНК-транспозоны или мобильные элементы представляют собой генетические элементы, которые могут перемещаться из одного местоположения в другое в геноме хозяина. Мобильные элементы обычно делятся на два класса: класс 1 представлен ретротранспозонами, а класс 2 включает ДНК-транспозоны по типу вырезать и вставить.DNA transposons or mobile elements are genetic elements that can move from one location to another in the host genome. Mobile elements are generally divided into two classes: class 1 is represented by retrotransposons, and class 2 includes cut-and-paste DNA transposons.

Для ДНК-транспозонов класса 2 характерны два компонента: транспозон, содержащий ДНКсегмент, фланкированный двумя концевыми инвертированными повторами, и транспозаза, которая катализирует мобилизацию транспозона. Транспозаза функционирует путем связывания инвертированных повторов, вырезания ДНК-сегмента (вырезание), фланкированного концевыми инвертированными повторами, и реинтеграции сегмента в новое местоположение (вставка).Class 2 DNA transposons are characterized by two components: a transposon containing a DNA segment flanked by two terminal inverted repeats, and a transposase that catalyzes the mobilization of the transposon. The transposase functions by binding the inverted repeats, cutting out the DNA segment (excision) flanked by the terminal inverted repeats, and reintegrating the segment into a new location (insertion).

Транспозон piggyBac является транспозоном класса 2, и хотя он первоначально был выделен из Trichoplusia ni (металловидка серая), было показано, что он активно переносится в клетках млекопитающих с предпочтением доступным структурам хроматина (Li et al., Molecular and Cellular Biology 33(7): 1317-1330, 2013; Yoshida et al., Scientific Reports номер статьи 43613 (2017)). Благодаря своей способности вводить экзогенную ДНК в геном и способствовать стабильной экспрессии трансгена система на основе транспозона piggyBac является применимым инструментом для генетических манипуляций в клетках млекопитающих и была использована для облегчения стабильной трансфекции клеток млекопитающих для создания стабильных и высокопродуктивных поликлональных культур клеток млекопитающих, быстрого продуцирования рекомбинантного белка в гетерогенных популяцияхThe piggyBac transposon is a class 2 transposon and although originally isolated from Trichoplusia ni (gray metalloid), it has been shown to actively transfect in mammalian cells with a preference for accessible chromatin structures (Li et al., Molecular and Cellular Biology 33(7): 1317–1330, 2013; Yoshida et al., Scientific Reports article number 43613 (2017)). Due to its ability to introduce exogenous DNA into the genome and promote stable transgene expression, the piggyBac transposon-based system is a useful tool for genetic manipulation in mammalian cells and has been used to facilitate stable transfection of mammalian cells to generate stable and high-yield polyclonal mammalian cell cultures, rapid recombinant protein production in heterogeneous populations, and

- 6 049367 трансфицированных клеток и разработки клонов для разработки линий клеток, благодаря своему мотиву распознавания, который обычно ассоциирован с областями открытого хроматина и активно транскрибируемыми областями (опубликованная заявка на патент США №: US 2010/0311116; Ding et al., Cell 122(3):473-483, 2005; Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(4) 15008-13, 2006, Matasci et al., Biotechnology & Bioengineering 108(9): 2141-50, 2011; Matasci et al., BMC Proceedings 5(SUPPL.8) p. 34, 2011; Balasubramanian et al., J. Biotechnology 200:61-9, 2015; Balasubramanian et al., Biotechnology Progress 32(5):1308-1317, 2016; Balasubramanian et al., Biotechnology & Bioengineering 113(6):1234-43, 2016; Ahmadi et al., PLoS ONE 12(6):e0179902, 2017; Rajendra et al., Biotechnology Progress 33(2):534-540, 2017; и Rajendra et al., Biotechnology Progress 33(6): 1436-1448, 2017).- 6,049,367 transfected cells and clone development for cell line development, due to its recognition motif, which is typically associated with regions of open chromatin and actively transcribed regions (published US Patent Application No.: US 2010/0311116; Ding et al., Cell 122(3):473–483, 2005; Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(4) 15008–13, 2006, Matasci et al., Biotechnology & Bioengineering 108(9): 2141–50, 2011; Matasci et al., BMC Proceedings 5(SUPPL.8) p. 34, 2011; Balasubramanian et al., J. Biotechnology 200:61-9, 2015; Balasubramanian et al., Biotechnology Progress 32(5):1308-1317, 2016; Balasubramanian et al., Biotechnology & Bioengineering 113(6):1234-43, 2016; Ahmadi et al., PLoS ONE 12(6):e0179902, 2017; Rajendra et al., Biotechnology Progress 33(2):534–540, 2017; and Rajendra et al., Biotechnology Progress 33(6): 1436-1448, 2017).

Были предприняты попытки улучшить эффективность piggyBac на молярной основе посредством введения в транспозазу модификаций для увеличения частоты вырезания с использованием подхода дисплейной библиотеки и/или проведения сравнений последовательностей с гомологами от других видов и создания гиперактивных транспозаз (см., например, патент США № 8399643; патент США № 9670503; патент США № 9783790; патент США № 9546382 и Yusa et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(4):1531-36, 2011).Attempts have been made to improve the efficiency of piggyBac on a molar basis by introducing modifications into the transposase to increase the excision frequency using a display library approach and/or by performing sequence comparisons with homologs from other species and generating hyperactive transposases (see, e.g., U.S. Patent No. 8,399,643; U.S. Patent No. 9,670,503; U.S. Patent No. 9,783,790; U.S. Patent No. 9,546,382; and Yusa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(4):1531–36, 2011).

О структуре транспозазы piggyBac известно немного. Анализ аминокислотной последовательности транспозазы piggyBac показал, что это в основном альфа-спиральный белок. В попытке улучшить стабильность транспозазы piggyBac, введенной в клетку, в альфа-спиралях и прогнозируемых сайтах Nгликозилирования (т.е. мотиве NXS/t) выполняли мутации, и было обнаружено, что они увеличивают титр, как описано в данном документе. Сконструированные версии транспозаз piggyBac, включающие одиночные мутации или комбинации мутаций, вводили путем трансфекции в клетки вместе с последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок, фланкированной по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac, и оценивали в отношении экспрессии представляющего интерес белка по сравнению с аналогичными клетками, трансфицированными немутантной транспозазой piggyBac дикого типа из Trichoplusia ni (SEQ ID NO: 2), и клетками, не содержащими транспозазу piggyBac. Обнаружили, что транспозазы piggyBac, кодируемые последовательностями нуклеиновой кислоты, сконструированными для повышения стабильности, увеличивают титр рекомбинантных белков, экспрессируемых в клетках, содержащих сконструированную транспозазу piggyBac, по сравнению с титром рекомбинантных белков, экспрессируемых в клетках, содержащих транспозазу piggyBac дикого типа или не содержащих транспозазу piggyBac.Little is known about the structure of piggyBac transposase. Analysis of the amino acid sequence of piggyBac transposase has shown that it is a predominantly alpha-helical protein. In an attempt to improve the stability of piggyBac transposase once introduced into cells, mutations were made in the alpha helices and predicted N-glycosylation sites (i.e., the NXS/t motif) and were found to increase titer, as described herein. Engineered versions of piggyBac transposases, incorporating single mutations or combinations of mutations, were transfected into cells along with a protein-of-interest encoding sequence flanked by at least 5' and 3' piggyBac transposon inverted repeat elements and assessed for expression of the protein of interest compared to similar cells transfected with the wild-type, non-mutant piggyBac transposase from Trichoplusia ni (SEQ ID NO: 2) and cells lacking the piggyBac transposase. The piggyBac transposases encoded by nucleic acid sequences engineered to enhance stability were found to increase the titer of recombinant proteins expressed in cells containing the engineered piggyBac transposase compared to the titer of recombinant proteins expressed in cells containing the wild-type piggyBac transposase or lacking the piggyBac transposase.

Используемый в данном документе термин транспозон piggyBac или мобильный элемент piggyBac относится к полинуклеотидной последовательности, которая может быть вырезана из донорного полинуклеотида (например, вектора) и интегрирована в сайт-мишень, например, геномную или внехромосомную ДНК клетки. Например, мобильный элемент piggyBac из Trichoplusia ni имеет длину 2472 п. о. с короткими инвертированными повторами, включающими структуру асимметричного концевого повтора со спейсером из 3 п. о. между 5'-концевым повтором из 13 п. о. и 5'-внутренним повтором из 19 п. о. и спейсером длиной 31 п. о. между 3'-концевым повтором из 13 п. о. и 3'-внутренним повтором из 19 п. о. и единственной открытой рамкой считывания длиной 2,1 т. о., кодирующей функциональную транспозазу. (Li et al., Mol. Genet. Genomics (2001) 266: 190-198; Cary et al., Virology (1989) 172: 156-169).As used herein, the term piggyBac transposon or piggyBac mobile element refers to a polynucleotide sequence that can be excised from a donor polynucleotide (e.g., a vector) and integrated into a target site, such as genomic or extrachromosomal DNA of a cell. For example, the piggyBac mobile element from Trichoplusia ni is 2472 bp in length with short inverted repeats comprising an asymmetric terminal repeat structure with a 3 bp spacer between the 5'-terminal 13 bp repeat and the 5'-internal 19 bp repeat and a 31 bp spacer between the 3'-terminal 13 bp repeat and the 3'-internal 19 bp repeat. and a single 2.1-kb open reading frame encoding a functional transposase (Li et al., Mol. Genet. Genomics (2001) 266: 190–198; Cary et al., Virology (1989) 172: 156–169).

Используемые в данном документе 5'- и 3'-элементы инвертированных повторов транспозона piggyBac относятся к 5'- и 3'-сегментам, включающим сайт-мишень TTAA, спейсеры концевых повторов и внутренние повторы транспозона piggyBac, в случае T. ni, они включают сайты-мишени TTAA, 5'концевой повтор из 13 п. о. и 5'-внутренний повтор из 19 п. о. со спейсером из 3 п. о. между ними и 3'концевой повтор из 13 п. о. и 3'-внутренний повтор из 19 п. о. со спейсером из 31 п. о. между ними.As used herein, the 5' and 3' elements of the piggyBac transposon inverted repeats refer to the 5' and 3' segments comprising the TTAA target site, terminal repeat spacers, and internal repeats of the piggyBac transposon, in the case of T. ni, this includes the TTAA target sites, the 13 bp 5' terminal repeat, and the 19 bp 5' internal repeat with a 3 bp spacer between them, and the 13 bp 3' terminal repeat and the 19 bp 3' internal repeat with a 31 bp spacer between them.

Используемый в данном документе термин транспозаза piggyBac относится к полипептиду, который катализирует вырезание транспозона piggyBac из донорного полинуклеотида (например, вектора) и последующую интеграцию транспозона piggyBac в геномную или внехромосомную ДНК клетки-мишени. Транспозаза piggyBac использует механизм вырезания и вставки, при этом осуществляет вставку в сайт-мишень TTAA, который дуплицируется при вставке и точно вырезается после вставки, восстанавливая донорский сайт в его состояние до присутствия транспозона (Elick et al., Genetica 98: 3341, 1996. Fraser et al., Insect Mol. Biol. 5: 141-151, 1996. Wang and Fraser, Insect Mol. Biol. 1: 109-116, 1993). Транспозаза piggyBac может быть представлена в виде полипептида. В качестве альтернативы транспозаза piggyBac может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает кодирующую последовательностью, которая кодирует транспозазу piggyBac. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, если транспозаза piggyBac присутствует в виде сконструированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей сконструированную транспозазу piggyBac, сконструированная молекула нуклеиновой кислоты может присутствовать на том же векторе, который включает транспозон piggyBac, rn.e. в цис-конфигурации. В других вариантах осуществления настоящего изобретения сконструированная молекула нуклеиновой кислоты может присутствовать на втором векторе отдельно от транспозона, тю. в транс-конфигурации. Сконструированные транспозазыAs used herein, the term piggyBac transposase refers to a polypeptide that catalyzes the excision of a piggyBac transposon from a donor polynucleotide (e.g., a vector) and the subsequent integration of the piggyBac transposon into the genomic or extrachromosomal DNA of a target cell. The piggyBac transposase uses a cut-and-paste mechanism, inserting into the target site a TTAA that is duplicated upon insertion and accurately excised after insertion, restoring the donor site to its state prior to the presence of the transposon (Elick et al., Genetica 98: 3341, 1996; Fraser et al., Insect Mol. Biol. 5: 141-151, 1996; Wang and Fraser, Insect Mol. Biol. 1: 109-116, 1993). The piggyBac transposase may be provided as a polypeptide. Alternatively, the piggyBac transposase may be a nucleic acid molecule that includes a coding sequence that encodes the piggyBac transposase. In some embodiments, if the piggyBac transposase is present as an engineered nucleic acid molecule encoding an engineered piggyBac transposase, the engineered nucleic acid molecule may be present on the same vector that includes the piggyBac transposon, rn.e. in cis. In other embodiments, the engineered nucleic acid molecule may be present on a second vector separate from the transposon, ty. in trans. Engineered transposases

- 7 049367 piggyBac, описанные в данном документе, являются уникальными в том, что титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой, содержащей сконструированную транспозазу piggyBac, увеличен по сравнению с титром представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой, содержащей транспозазу piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac.- 7 049367 piggyBac described herein are unique in that the titer of the recombinant protein of interest expressed by a cell containing the engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by a cell containing wild-type piggyBac transposase or lacking piggyBac transposase.

Термины полипептид или белок используются по всему тексту взаимозаменяемо и относятся к молекуле, содержащей два или более аминокислотных остатков, соединенных друг с другом пептидными связями. Полипептиды и белки также включают макромолекулы, имеющие одну или несколько делеций, вставок и/или замен аминокислотных остатков в нативной последовательности, то есть полипептид или белок, продуцируемые встречающейся в природе и нерекомбинантной клеткой или продуцируемые генетически модифицированной или рекомбинантной клеткой, и они включают молекулы, имеющие одну или несколько делеций, вставок и/или замен аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности нативного белка. Полипептиды и белки также включают полимеры из аминокислот, в которых одна или несколько аминокислот являются химическими аналогами соответствующих встречающихся в природе аминокислот и полимеров. Полипептиды и белки также включают модификации, в том числе без ограничения гликозилирование, присоединение липида, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и АДФрибозилирование.The terms polypeptide or protein are used interchangeably throughout the text and refer to a molecule comprising two or more amino acid residues joined together by peptide bonds. Polypeptides and proteins also include macromolecules having one or more deletions, insertions, and/or substitutions of amino acid residues in the native sequence, i.e., a polypeptide or protein produced by a naturally occurring and nonrecombinant cell or produced by a genetically modified or recombinant cell, and they include molecules having one or more deletions, insertions, and/or substitutions of amino acid residues in the amino acid sequence of a native protein. Polypeptides and proteins also include polymers of amino acids in which one or more amino acids are chemical analogs of the corresponding naturally occurring amino acids and polymers. Polypeptides and proteins also include modifications including, but not limited to, glycosylation, lipid addition, sulfation, gamma-carboxylation of glutamic acid residues, hydroxylation, and ADP-ribosylation.

Предусмотрено, что транспозазы piggyBac, описанные в данном документе, включают полипептиды, имеющие одну или несколько вставок, делеций или замен аминокислотных остатков или любую их комбинацию, а также модификации, отличные от вставок, делеций или замен аминокислотных остатков, по сравнению с транспозазой piggyBac дикого типа из Trichoplusia ni (металловидка серая) (SEQ ID NO: 2). Используемая в данном документе аминокислотная замена в одном или нескольких из положений означает замены в 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 из указанных положений. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена в одном или нескольких из положений означает замены в 1, 2, 3, 4, 5 или 6 из указанных положений. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена в одном или нескольких из положений означает замены в 1, 2, 3, 4 или 5 из указанных положений. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена в одном или нескольких из положений означает замены в 1, 2, 3 или 4 из указанных положений. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена в одном или нескольких из положений означает замены в 1, 2 или 3 из указанных положений. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена в одном или нескольких из положений означает замены в 1 или 2 из указанных положений.The piggyBac transposases described herein are contemplated to include polypeptides having one or more insertions, deletions, or substitutions of amino acid residues, or any combination thereof, as well as modifications other than insertions, deletions, or substitutions of amino acid residues, as compared to the wild-type piggyBac transposase from Trichoplusia ni (gray metalweed) (SEQ ID NO: 2). As used herein, an amino acid substitution at one or more of the positions means substitutions at 1, 2, 3, 4, 5, 6, or 7 of the positions. In some embodiments, an amino acid substitution at one or more of the positions means substitutions at 1, 2, 3, 4, 5, or 6 of the positions. In some embodiments, an amino acid substitution at one or more of the positions means substitutions at 1, 2, 3, 4, or 5 of the positions. In some embodiments, an amino acid substitution at one or more of the positions means substitutions at 1, 2, 3, or 4 of the said positions. In some embodiments, an amino acid substitution at one or more of the positions means substitutions at 1, 2, or 3 of the said positions. In some embodiments, an amino acid substitution at one or more of the positions means substitutions at 1 or 2 of the said positions.

В настоящем изобретении предусмотрена транспозаза piggyBac, содержащая аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления транспозаза содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления транспозаза содержит аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления транспозаза содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 и/или аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза содержит по меньшей мере две из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO:2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO:2. В другом родственном варианте осуществления транспозаза содержит замену изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO:2, замену изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO:2 и замену серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO:2. В одном варианте осуществления титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции сконструированной транспозазой piggyBac, увеличен по сравнению с титром такого же представляющего интерес белка, экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac.The present invention provides a piggyBac transposase comprising an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the transposase comprises an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247, and/or an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533 and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the transposase comprises at least one of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the transposase comprises at least two of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In another related embodiment, the transposase comprises an isoleucine to leucine substitution at position 147 of SEQ ID NO:2, an isoleucine to leucine substitution at position 247 of SEQ ID NO:2, and a serine to threonine substitution at position 533 of SEQ ID NO:2. In one embodiment, the titer of a recombinant protein of interest expressed by a cell transfected with an engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the same protein of interest expressed by a cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or lacking a piggyBac transposase.

В настоящем изобретении предусмотрена транспозаза piggyBac, сконструированная для увеличения стабильности в клетке-хозяине, где транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16.The present invention provides a piggyBac transposase engineered to increase stability in a host cell, wherein the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid the sequence under SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16.

- 8 049367- 8 049367

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In another aspect, the present invention provides piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности транспозазы piggyBac дикого типа и мутантной транспозазыTable 1. Amino acid sequences of the wild-type and mutant piggyBac transposase

SEQ ID NO: SEQ ID NO: ID ID ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ SUBSEQUENCE 2 2 WT WT MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIW DL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIW DL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF 4 4 I147L I147L MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISELVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIW DL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISELVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIW DL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF

- 9 049367- 9 049367

6 6 I247L I247L MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKL WDL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKL WDL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF 8 8 S533T S533T MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIW DL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNITNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIW DL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNITNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF 10 10 LLT (I247L I147L S533T) LLT (I247L I147L S533T) MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISELVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKL WDL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISELVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKL WDL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD

- 10 049367- 10 049367

QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNITNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNITNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF 12 12 ILT (I247 I147L S533T) ILT (I247 I147L S533T) MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKL WDL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNITNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKL WDL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNITNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF 14 14 LIT (I247L I147 S533T) LIT (I247L I147 S533T) MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISELVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIW DL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNITNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISELVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIW DL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNITNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF 16 16 LLS (I247L I147L S533) LLS (I247L I147L S533) MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISELVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKL WDL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFID E VHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWS T SKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISELVKW TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDD LF DRSLSMVYVSVMSRDRFDFFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKL WDL FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMC D SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDN

- 11 049367- 11 049367

WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF WFT SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDG P LTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGV DTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQS RK KFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPNEVPGTSDDST EE PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF

Термины полинуклеотид, молекула нуклеиновой кислоты или сконструированная молекула нуклеиновой кислоты используются по всему тексту взаимозаменяемо, и они включают как однонитевые, так и двухнитевые нуклеиновые кислоты и включают геномную ДНК, РНК, мРНК, кДНК, или молекулы синтетического происхождения, или некоторые их комбинации, которые не ассоциированы с последовательностями, обычно встречающимися в природе. Термины выделенный полинуклеотид, выделенная молекула нуклеиновой кислоты или выделенная сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, в частности, относятся к последовательностям синтетического происхождения или последовательностям, которые обычно не встречаются в природе. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие указанные последовательности, в дополнение к указанным последовательностям могут включать кодирующие последовательности для не менее десяти или даже не менее двадцати других белков или их частей, или могут включать функционально связанные регуляторные последовательности, которые регулируют экспрессию кодирующей области упомянутых последовательностей нуклеиновой кислоты, и/или могут включать векторные последовательности. Нуклеотиды, входящие в состав молекул нуклеиновой кислоты, могут представлять собой рибонуклеотиды, или дезоксирибонуклеотиды, или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Модификации включают модификации оснований, такие как бромуридиновые и инозиновые производные, модификации рибозы, такие как 2',3'-дидезоксирибоза, и модификации межнуклеотидных связей, такие как фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, фосфороселеноатные, фосфородиселеноатные, фосфороанилотиоатные, фосфораниладатные и фосфороамиданые связи.The terms polynucleotide, nucleic acid molecule or engineered nucleic acid molecule are used interchangeably throughout the text and include both single-stranded and double-stranded nucleic acids and include genomic DNA, RNA, mRNA, cDNA, or molecules of synthetic origin, or some combination thereof, which are not associated with sequences commonly found in nature. The terms isolated polynucleotide, isolated nucleic acid molecule or isolated engineered nucleic acid molecule particularly refer to sequences of synthetic origin or sequences that are not commonly found in nature. Isolated nucleic acid molecules comprising said sequences, in addition to said sequences, may include coding sequences for at least ten or even at least twenty other proteins or portions thereof, or may include operably linked regulatory sequences that regulate the expression of the coding region of said nucleic acid sequences, and/or may include vector sequences. The nucleotides that make up nucleic acid molecules may be ribonucleotides or deoxyribonucleotides, or a modified form of either type of nucleotide. Modifications include base modifications such as bromuridine and inosine derivatives, ribose modifications such as 2',3'-dideoxyribose, and internucleotide linkage modifications such as phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoroselenoate, phosphorodiselenoate, phosphoroanilothiate, phosphoraniladate, and phosphoramidite linkages.

Используемый в данном документе термин выделенный означает, что вещество (i) не содержит по меньшей мере некоторых других белков или полинуклеотидов, с которыми оно обычно находилось бы, (ii) фактически не содержит других белков или полинуклеотидов из того же источника, например, полученных от того же вида, (iii) отделено от по меньшей мере приблизительно 50 процентов полипептидов, полинуклеотидов, липидов, углеводов или других материалов, с которым оно ассоциировано в природе, (iv) функционально связано (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом или полинуклеотидом, с которым оно не ассоциировано в природе, или (v) не встречается в природе.As used herein, the term "isolated" means that the substance (i) is free of at least some other proteins or polynucleotides with which it would normally be found, (ii) is substantially free of other proteins or polynucleotides from the same source, such as those obtained from the same species, (iii) is separated from at least about 50 percent of the polypeptides, polynucleotides, lipids, carbohydrates, or other materials with which it is associated in nature, (iv) is operably linked (through a covalent or non-covalent interaction) to a polypeptide or polynucleotide with which it is not associated in nature, or (v) is not found in nature.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В настоящем изобретении также предусмотрена транспозаза piggybac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17. В другом аспектеIn one embodiment, the present invention provides an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein. The present invention also provides a piggybac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present The invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17. In another aspect,

- 12 049367 настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18.- 12 049367 of the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence under SEQ ID NO: 18.

Таблица 2. Последовательности нуклеиновой кислоты транспозазы piggyBac дикого типа или мутантной транспозазыTable 2. Nucleic acid sequences of wild-type and mutant piggyBac transposase

SEQ ID NO: SEQ ID NO: ID ID ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ NUCLEIC ACID SEQUENCE 1 1 WT WT ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT

- 13 049367- 13 049367

GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAG CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAG CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC 3 3 I147L I147L ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGCTGGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGCTGGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG

- 14 049367- 14 049367

CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAG CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAG CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC 5 5 I247L I247L ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGCTGTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGCTGTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG

- 15 049367- 15 049367

TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAG CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAG CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC 7 7 S533T S533T ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA

- 16 049367- 16 049367

CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAC CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAC CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC 9 9 LLT (I247L I147L S533T) LLT (I247L I147L S533T) ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC

- 17 049367- 17 049367

CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGCTGGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGCTGTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAC CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGCTGGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGCTGTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAC CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC 11 11 ILT (I147 I247L S533T) ILT (I147 I247L S533T) ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC

- 18 049367- 18 049367

GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGCTGTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAC CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGCTGTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAC CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA

- 19 049367- 19 049367

GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC 13 13 LIT (I147L I247 S533T) LIT (I147L I247 S533T) ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGCTGGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGCTGGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT

- 20 049367- 20 049367

CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAC CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAC CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC 15 15 LLS (I147L I247L S533S) LLS (I147L I247L S533S) ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGCTGGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGCTGTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGC AG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGC GACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATC GACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGA CGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGA ATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTG GTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGT GCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCC CTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGCTGGTG AAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCG GCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCA TCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGA CCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGA CAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCA GACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGCTGTGG GACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCT GACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAA TGTA CATCCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATG TGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAG AGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAA CTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGG TTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCT GACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTG CTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGAC GGCC

- 21 049367- 21 049367

CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAG CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTA CCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACAC CCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGAT GGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCT TCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAG CCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCAT GAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAAC ATCAG CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAA GATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATC TGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC 17 17 ILT (I147I I247L S533T) РНК ILT (I147I I247L S533T) RNA AUGGGCUCUAGCCUGGACGACGAGCACAUCCUGAGCGCCCUGCUG CAG AGCGACGACGAACUGGUGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGAUCAG CGACCA CGUGUCCGAGGACGACGUGCAGUCCGACACCGAGGAAGCCUUCAU CGACG AGGUGCACGAAGUGCAGCCUACCAGCAGCGGCUCCGAGAUCCUGG ACGAG CAGAACGUGAUCGAGCAGCCUGGCAGCUCCCUGGCCAGCAACAGA AUCCU GACCCUGCCCCAGAGAACCAUCAGAGGCAAGAACAAGCACUGCUG GUCCA CCUCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGUGUCCGCCCUGAACAUCG UGCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAAUGUGCAGAAACAUCUACGACCCC CUGCU GUGCUUCAAGCUGUUCUUCACCGACGAGAUCAUCAGCGAGAUCG UGAAGU GGACCAACGCCGAGAUCAGCCUGAAGAGGCGGGAGAGCAUGACC GGCGCC ACCUUCAGAGACACCAACGAGGACGAGAUCUACGCCUUCUUCGGC AUCCU GGUGAUGACCGCCGUGAGAAAGGACAACCACAUGAGCACCGACG ACCUGU UCGACAGAUCCCUGAGCAUGGUGUACGUGUCCGUGAUGAGCAGA GACAGA UUCGACUUCCUGAUCAGAUGCCUGAGAAUGGACGACAAGAGCAU CAGACC CACCCUGCGGGAGAACGACGUGUUCACCCCCGUGCGGAAGCUGUG GGACC UGUUCAUCCACCAGUGCAUCCAGAACUACACCCCUGGCGCCCACC UGACC AUCGAUGAGCAGCUGCUGGGCUUCAGAGGCAGAUGCCCCUUCAG AAUGUA CAUCCCCAACAAGCCCAGCAAGUACGGCAUCAAGAUCCUGAUGAU GUGCG ACAGCGGCACCAAGUACAUGAUCAACGGCAUGCCCUACCUGGGCA GAGGC AUGGGCUCUAGCCUGGACGACGAGCACAUCCUGAGCGCCCUGCUG CAG AGCGACGACGAACUGGUGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGAUCAG CGACCA CGUGUCCGAGGACGACGUGCAGUCCGACACCGAGGAAGCCUUCAU CGACG AGGUGCACGAAGUGCAGCCUACCAGCAGCGGCUCCGAGAUCCUGG ACGAG CAGAACGUGAUCGAGCAGCCUGGCAGCUCCCUGGCCAGCAACAGA AUCCU GACCCUGCCCCAGAGAACCAUCAGAGGGCAAGAACAAGCACUGCUG GUCCA CCUCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGUGUCCGCCCUGAACAUCG UGCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAAUGUGCAGAAACAUCUACGACCCC C.U.G.C.U. GUGCUUCAAGCUGUUCUUCACCGACGAGAUCAUCAGCGAGAUCG UGAAGU GGACCAACGCCGAGAUCAGCCUGAAGAGGCGGGAGAGCAUGACC GGCGCC ACCUUCAGAGACACCAACGAGGACGAGAUCUACGCCUUCUUCGGC AUCCU GGUGAUGACCGCCGUGAGAAAGGACAACCACAUGAGCACCGACG ACCUGU UCGACAGAUCCCUGAGCAUGGUGUACGUGUCCGUGAUGAGCAGA GACAGA UUCGACUUCCUGAUCAGAUGCCUGAGAAUGGACGACAAGAGCAU CAGACC CACCCUGCGGGAGAACGACGUGUUCACCCCCGUGCGGAAGCUGUG GGACC UGUUCAUCCACCAGUGCAUCCAGAACUACACCCCUGGCGCCCACC UGACC AUCGAUGAGCAGCUGCUGGGCUUCAGAGGCAGAUGCCCCUUCAG AAUGUA CAUCCCCAACAAGCCCAGCAAGUACGGCAUCAAGAUCCUGAUGAU GUGCG ACAGCGGCACCAAGUACAUGAUCAACGGCAUGCCCUACCUGGGCA GAGGC

- 22 049367- 22 049367

ACCCAGACAAACGGCGUGCCCCUGGGCGAGUACUACGUGAAAGAA CUGAG CAAGCCUGUGCAUGGCAGCUGCAGGAACAUCACCUGCGACAACUG GUUCA CCAGCAUCCCCCUGGCCAAGAACCUGCUGCAGGAACCCUACAAGC UGACC AUCGUGGGCACCGUGCGGAGCAACAAGCGGGAGAUCCCAGAGGU GCUGAA GAACAGCAGAUCCAGACCUGUGGGAACAAGCAUGUUCUGCUUCG ACGGCC CCCUGACCCUGGUGUCCUACAAGCCCAAGCCCGCCAAGAUGGUGU ACCUG CUGUCCAGCUGCGACGAGGACGCCAGCAUCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGAUGGUGAUGUACUACAACCAGACCAAGGGCGGCGUGGACA CCCUGG ACCAGAUGUGCAGCGUGAUGACCUGCAGCAGAAAGACCAACAGA UGGCCC AUGGCCCUGCUGUACGGCAUGAUCAAUAUCGCCUGCAUCAACAGC UUCAU CAUCUACAGCCACAACGUGUCCAGCAAGGGCGAGAAGGUGCAGA GCCGGA AGAAAUUCAUGCGGAACCUGUACAUGAGCCUGACCUCCAGCUUCA UGAGA AAGAGACUGGAAGCCCCCACCCUGAAGAGAUACCUGCGGGACAAC AUCAC CAACAUCCUGCCCAACGAAGUGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGUGAUGAAGAAGAGGACCUACUGCACCUACUGUCCCAGCA AGAUC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCUGCAAGAAAUGCAAAAAAGUGAU CUGCCG GGAGCACAACAUCGACAUGUGCCAGAGCUGUUUCUAGC ACCCAGACAAACGGCGUGCCCCUGGGCGAGUACUACGUGAAAGAA CUGAG CAAGCCUGUGCAUGGCAGCUGCAGGAACAUCACCUGCGACAACUG GUUCA CCAGCAUCCCCUGGCCAAGAACCUGCUGCAGGAACCCUACAAGC UGACC AUCGUGGGCACCGUGCGGAGCAACAAGCGGGAGAUCCCAGAGGU GCUGAA GAACAGCAGAUCCAGACCUGUGGGAACAAGCAUGUUCUGCUUCG ACGGCC CCCUGACCCUGGUGUCCUACAAGCCCAAGCCCCGCCAAGAUGGUGU ACCUG CUGUCCAGCUGCGACGAGGACGCCAGCAUCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGAUGGUGAUGUACUACAACCAGACCAAGGGCGGCGUGGACA CCCUGG ACCAGAUGUGCAGCGUGAUGACCUGCAGCAGAAAGACCAACAGA UGGCCC AUGGCCCUGCUGUACGGCAUGAUCAAUAUCGCCUGCAUCAACAGC UUCAU CAUCUACAGCCACAACGUGUCCAGCAAGGGCGAGAAGGUGCAGA GCCGGA AGAAAUUCAUGCGGAACCUGUACAUGAGCCUGACCUCCAGCUUCA UGAGA AAGAGACUGGAAGCCCCCACCCUGAAGAGAUACCUGCGGGACAAC AUCAC CAACAUCCUGCCCAACGAAGUGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGUGAUGAAGAAGAGGACCUACUGCACCUACUGUCCCAGCA AGAUC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCUGCAAGAAAUGCAAAAAAGUGAU CUGCCG GGAGCACAACAUCGACAUGUGCCAGAGCUGUUUCUAGC 18 18 LLT (I147L I247L S533T) РНК LLT (I147L I247L S533T) RNA AUGGGCUCUAGCCUGGACGACGAGCACAUCCUGAGCGCCCUGCUG CAG AGCGACGACGAACUGGUGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGAUCAG CGACCA CGUGUCCGAGGACGACGUGCAGUCCGACACCGAGGAAGCCUUCAU CGACG AGGUGCACGAAGUGCAGCCUACCAGCAGCGGCUCCGAGAUCCUGG ACGAG CAGAACGUGAUCGAGCAGCCUGGCAGCUCCCUGGCCAGCAACAGA AUCCU GACCCUGCCCCAGAGAACCAUCAGAGGCAAGAACAAGCACUGCUG GUCCA CCUCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGUGUCCGCCCUGAACAUCG UGCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAAUGUGCAGAAACAUCUACGACCCC CUGCU GUGCUUCAAGCUGUUCUUCACCGACGAGAUCAUCAGCGAGCUGG UGAAGU GGACCAACGCCGAGAUCAGCCUGAAGAGGCGGGAGAGCAUGACC GGCGCC ACCUUCAGAGACACCAACGAGGACGAGAUCUACGCCUUCUUCGGC AUCCU GGUGAUGACCGCCGUGAGAAAGGACAACCACAUGAGCACCGACG ACCUGU UCGACAGAUCCCUGAGCAUGGUGUACGUGUCCGUGAUGAGCAGA GACAGA UUCGACUUCCUGAUCAGAUGCCUGAGAAUGGACGACAAGAGCAU CAGACC AUGGGCUCUAGCCUGGACGACGAGCACAUCCUGAGCGCCCUGCUG CAG AGCGACGACGAACUGGUGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGAUCAG CGACCA CGUGUCCGAGGACGACGUGCAGUCCGACACCGAGGAAGCCUUCAU CGACG AGGUGCACGAAGUGCAGCCUACCAGCAGCGGCUCCGAGAUCCUGG ACGAG CAGAACGUGAUCGAGCAGCCUGGCAGCUCCCUGGCCAGCAACAGA AUCCU GACCCUGCCCCAGAGAACCAUCAGAGGGCAAGAACAAGCACUGCUG GUCCA CCUCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGUGUCCGCCCUGAACAUCG UGCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAAUGUGCAGAAACAUCUACGACCCC C.U.G.C.U. GUGCUUCAAGCUGUUCUUCACCGACGAGAUCAUCAGCGAGCUGG UGAAGU GGACCAACGCCGAGAUCAGCCUGAAGAGGCGGGAGAGCAUGACC GGCGCC ACCUUCAGAGACACCAACGAGGACGAGAUCUACGCCUUCUUCGGC AUCCU GGUGAUGACCGCCGUGAGAAAGGACAACCACAUGAGCACCGACG ACCUGU UCGACAGAUCCCUGAGCAUGGUGUACGUGUCCGUGAUGAGCAGA GACAGA UUCGACUUCCUGAUCAGAUGCCUGAGAAUGGACGACAAGAGCAU CAGACC

- 23 049367- 23 049367

CACCCUGCGGGAGAACGACGUGUUCACCCCCGUGCGGAAGCUGUG GGACC UGUUCAUCCACCAGUGCAUCCAGAACUACACCCCUGGCGCCCACC UGACC AUCGAUGAGCAGCUGCUGGGCUUCAGAGGCAGAUGCCCCUUCAG AAUGUA CAUCCCCAACAAGCCCAGCAAGUACGGCAUCAAGAUCCUGAUGAU GUGCG ACAGCGGCACCAAGUACAUGAUCAACGGCAUGCCCUACCUGGGCA GAGGC ACCCAGACAAACGGCGUGCCCCUGGGCGAGUACUACGUGAAAGAA CUGAG CAAGCCUGUGCAUGGCAGCUGCAGGAACAUCACCUGCGACAACUG GUUCA CCAGCAUCCCCCUGGCCAAGAACCUGCUGCAGGAACCCUACAAGC UGACC AUCGUGGGCACCGUGCGGAGCAACAAGCGGGAGAUCCCAGAGGU GCUGAA GAACAGCAGAUCCAGACCUGUGGGAACAAGCAUGUUCUGCUUCG ACGGCC CCCUGACCCUGGUGUCCUACAAGCCCAAGCCCGCCAAGAUGGUGU ACCUG CUGUCCAGCUGCGACGAGGACGCCAGCAUCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGAUGGUGAUGUACUACAACCAGACCAAGGGCGGCGUGGACA CCCUGG ACCAGAUGUGCAGCGUGAUGACCUGCAGCAGAAAGACCAACAGA UGGCCC AUGGCCCUGCUGUACGGCAUGAUCAAUAUCGCCUGCAUCAACAGC UUCAU CAUCUACAGCCACAACGUGUCCAGCAAGGGCGAGAAGGUGCAGA GCCGGA AGAAAUUCAUGCGGAACCUGUACAUGAGCCUGACCUCCAGCUUCA UGAGA AAGAGACUGGAAGCCCCCACCCUGAAGAGAUACCUGCGGGACAAC AUCAC CAACAUCCUGCCCAACGAAGUGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGUGAUGAAGAAGAGGACCUACUGCACCUACUGUCCCAGCA AGAUC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCUGCAAGAAAUGCAAAAAAGUGAU CUGCCG GGAGCACAACAUCGACAUGUGCCAGAGCUGUUUCUAGC CACCCUGCGGGAGAACGACGUGUUCACCCCCGUGCGGAAGCUGUG GGACC UGUUCAUCCACCAGUGCAUCCAGAACUACACCCCUGGCGCCCACC UGACC AUCGAUGAGCAGCUGCUGGGCUUCAGAGGCAGAUGCCCCUUCAG AAUGUA CAUCCCCAACAAGCCCAGCAAGUACGGCAUCAAGAUCCUGAUGAU GUGCG ACAGCGGCACCAAGUACAUGAUCAACGGCAUGCCCUACCUGGGCA GAGGC ACCCAGACAAACGGCGUGCCCCUGGGCGAGUACUACGUGAAAGAA CUGAG CAAGCCUGUGCAUGGCAGCUGCAGGAACAUCACCUGCGACAACUG GUUCA CCAGCAUCCCCUGGCCAAGAACCUGCUGCAGGAACCCUACAAGC UGACC AUCGUGGGCACCGUGCGGAGCAACAAGCGGGAGAUCCCAGAGGU GCUGAA GAACAGCAGAUCCAGACCUGUGGGAACAAGCAUGUUCUGCUUCG ACGGCC CCCUGACCCUGGUGUCCUACAAGCCCAAGCCCCGCCAAGAUGGUGU ACCUG CUGUCCAGCUGCGACGAGGACGCCAGCAUCAACGAGAGCACCGGC AAGCC CCAGAUGGUGAUGUACUACAACCAGACCAAGGGCGGCGUGGACA CCCUGG ACCAGAUGUGCAGCGUGAUGACCUGCAGCAGAAAGACCAACAGA UGGCCC AUGGCCCUGCUGUACGGCAUGAUCAAUAUCGCCUGCAUCAACAGC UUCAU CAUCUACAGCCACAACGUGUCCAGCAAGGGCGAGAAGGUGCAGA GCCGGA AGAAAUUCAUGCGGAACCUGUACAUGAGCCUGACCUCCAGCUUCA UGAGA AAGAGACUGGAAGCCCCCACCCUGAAGAGAUACCUGCGGGACAAC AUCAC CAACAUCCUGCCCAACGAAGUGCCAGGAACAAGCGACGACAGCAC CGAGG AACCCGUGAUGAAGAAGAGGACCUACUGCACCUACUGUCCCAGCA AGAUC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCUGCAAGAAAUGCAAAAAAGUGAU CUGCCG GGAGCACAACAUCGACAUGUGCCAGAGCUGUUUCUAGC

Представляющие интерес полипептиды и белки могут представлять научный и коммерческий интерес, в том числе в качестве средств терапии на основе белков. Среди прочего, представляющие интерес белки включают секретируемые белки, несекретрируемые белки, внутриклеточные белки или мембраносвязанные белки. Представляющие интерес полипептиды и белки могут продуцироваться линиями рекомбинантных клеток животных с использованием методов культивирования клеток и могут обозначаться как рекомбинантные белки. Экспрессируемый белок(белки) может продуцироваться внутри клетки или секретироваться в культуральную среду, из которой он может извлекаться и/или собираться. Термин выделенный белок или выделенный рекомбинантный белок относится к представляющему интерес полипептиду или белку, который очищен от белков или полипептидов или других загрязняющих веществ, которые будут мешать его терапевтическому, диагностическому, профилактическому, исследовательскому или другому применению. Представляющие интерес белки включают белки, оказывающие терапевтическое воздействие путем связывания с мишенью, в частности с мишенью из перечисленных ниже, в том числе с мишенями, полученными из них, мишенями, родственными им, и их модификациями.Polypeptides and proteins of interest may be of scientific and commercial interest, including as protein-based therapeutics. Proteins of interest include, but are not limited to, secreted proteins, non-secreted proteins, intracellular proteins, or membrane-bound proteins. Polypeptides and proteins of interest may be produced by recombinant animal cell lines using cell culture techniques and may be referred to as recombinant proteins. The expressed protein(s) may be produced intracellularly or secreted into the culture medium, from which it may be recovered and/or collected. The term isolated protein or isolated recombinant protein refers to a polypeptide or protein of interest that is purified from proteins or polypeptides or other contaminants that would interfere with its therapeutic, diagnostic, prophylactic, research, or other use. Proteins of interest include proteins that exert a therapeutic effect by binding to a target, in particular to a target from the following, including targets derived therefrom, targets related thereto, and modifications thereof.

Представляющие интерес белки включают антигенсвязывающие белки. Антигенсвязывающий белок относится к белкам или полипептидам, содержащим антигенсвязывающую область или антигенсвязывающую часть, которая характеризуется аффинностью к другой молекуле (антигену), с которой она связывается. Антигенсвязывающие белки охватывают антитела, пептитела, фрагменты антител, производные антител, аналоги антител, слитые белки (в том числе одноцепочечныеProteins of interest include antigen-binding proteins. An antigen-binding protein refers to a protein or polypeptide that contains an antigen-binding region or antigen-binding portion that has an affinity for another molecule (antigen) to which it binds. Antigen-binding proteins include antibodies, peptibodies, antibody fragments, antibody derivatives, antibody analogs, fusion proteins (including single-chain

- 24 049367 вариабельные фрагменты (scFv) и двухцепочечные (двухвалентные) scFv, мутеины и Xmab). Также включены биспецифические активаторы, привлекающие T-клетки (BiTE®), биспецифические активаторы, привлекающие T-клетки, с добавочными элементами, такими как добавочные элементы, увеличивающие период полужизни, например, HLE BiTE, HeteroIg BITE и другие, химерные антигенные рецепторы (CAR, CAR T) и Т-клеточные рецепторы (TCR).- 24 049367 variable fragments (scFv) and double-chain (bivalent) scFv, muteins and Xmab). Also included are bispecific T cell engaging activators (BiTE®), bispecific T cell engaging activators with add-on elements such as half-life extending add-on elements such as HLE BiTE, HeteroIg BITE and others, chimeric antigen receptors (CAR, CAR T) and T cell receptors (TCR).

ScFv представляет собой одноцепочечный фрагмент антитела, содержащий вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела, связанные вместе. См. патенты США №№ 7741465 и 6319494, а также Eshhar et al., Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136. ScFv сохраняет способность исходного антитела специфически взаимодействовать с антигеном-мишенью.ScFv is a single-chain antibody fragment containing the variable regions of the heavy and light chains of the antibody linked together. See U.S. Patent Nos. 7,741,465 and 6,319,494 and Eshhar et al., Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136. ScFv retains the ability of the parent antibody to specifically interact with the target antigen.

Термин антитело включает обозначение как гликозилированных, так и негликозилированных иммуноглобулинов любого изотипа или подкласса или их антигенсвязывающей области, конкурирующей за специфическое связывание с интактным антителом. Если не указано иное, антитела включают человеческие, гуманизированные, химерные, мультиспецифические, моноклональные, поликлональные, гетеро-IgG, биспецифические и олигомерные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Антитела включают типы lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4. Также включены белки, имеющие антигенсвязывающий фрагмент или область, такую как Fab, Fab', F(ab')2, Fv, диатела, Fd, dAb, макситела, молекулы одноцепочечных антител, однодоменные VHH, фрагменты, являющиеся определяющей комплементарность областью (CDR), scFv, диатела, триатела, тетратела и полипептиды, содержащие по меньшей мере часть иммуноглобулина, которой достаточно для придания антиген-связывающую специфичность в отношении полипептида-мишени.The term antibody includes both glycosylated and nonglycosylated immunoglobulins of any isotype or subclass, or the antigen-binding region thereof that competes for specific binding with an intact antibody. Unless otherwise specified, antibodies include human, humanized, chimeric, multispecific, monoclonal, polyclonal, hetero-IgG, bispecific, and oligomeric antibodies, or antigen-binding fragments thereof. Antibodies include IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 types. Also included are proteins having an antigen-binding fragment or region such as Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diabodies, Fd, dAb, maxibodies, single-chain antibody molecules, single-domain VHH, fragments that are complementarity determining region (CDR), scFv, diabodies, triabodies, tetrabodies, and polypeptides containing at least a portion of an immunoglobulin sufficient to confer antigen-binding specificity for a target polypeptide.

Также включены человеческие, гуманизированные и другие антигенсвязывающие белки, такие как человеческие и гуманизированные антитела, которые не вызывают значительных вредных иммунных ответов при введении человеку.Also included are human, humanized, and other antigen-binding proteins, such as human and humanized antibodies, that do not induce significant adverse immune responses when administered to humans.

Также включены модифицированные белки, такие как белки, модифицированные химически с помощью нековалентной связи, ковалентной связи или как ковалентной, так и нековалентной связи. Также включены белки, дополнительно содержащие одну или несколько посттрансляционных модификаций, которые могут выполняться клеточными системами внесения модификаций, или модификаций, вносимых ex vivo с помощью ферментативных и/или химических способов или вносимых другими путями.Also included are modified proteins, such as proteins modified chemically by a non-covalent bond, a covalent bond, or both a covalent and non-covalent bond. Also included are proteins that additionally contain one or more post-translational modifications, which may be performed by cellular modification systems, or modifications introduced ex vivo by enzymatic and/or chemical means, or introduced by other routes.

Представляющие интерес белки также могут включать рекомбинантные слитые белки, содержащие, например, домен мультимеризации, такой как лейциновая застежка, суперспираль, Fc-часть иммуноглобулина и т.п. Также включены белки, содержащие все или часть аминокислотных последовательностей антигенов дифференцировки (называемых белками CD) или их лигандов, или белки, практически аналогичные одному из них.Proteins of interest may also include recombinant fusion proteins containing, for example, a multimerization domain such as a leucine zipper, a coiled coil, the Fc portion of an immunoglobulin, etc. Also included are proteins containing all or part of the amino acid sequences of differentiation antigens (called CD proteins) or their ligands, or proteins substantially similar to one of them.

В некоторых вариантах осуществления представляющие интерес белки могут включать колониестимулирующие факторы, такие как колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF). Такие средства на основе G-CSF включают без ограничения Neupogen® (филграстим) и Neulasta® (пэгфилграстим). Также включены средства, стимулирующие эритропоэз (ESA), такие как Epogen® (эпоэтин-альфа), Aranesp® (дарбэпоэтин-альфа), Dynepo® (эпоэтин-дельта), Mircera® (метоксиполиэтиленгликоль-эпоэтин-бета), Hematide®, MRK-2578, INS-22, Retacrit® (эпоэтин-дзета), Neorecormon® (эпоэтин-бета), Silapo® (эпоэтин-дзета), Binocrit® (эпоэтин-альфа), эпоэтин-альфа Hexal, Abseamed® (эпоэтин-альфа), Ratioepo® (эпоэтин-тета), Eporatio® (эпоэтин-тета), Biopoin® (эпоэтинтета), эпоэтин-альфа, эпоэтин-бета, эпоэтин-дзета, эпоэтин-тета и эпоэтин-дельта, эпоэтин-омега, эпоэтин-йота, тканевой активатор плазминогена, агонисты рецептора GLP-1, а также молекулы или их варианты или аналоги и биосимиляры любого из вышеперечисленного.In some embodiments, proteins of interest may include colony stimulating factors, such as granulocyte colony stimulating factor (G-CSF). Such G-CSF-based agents include, but are not limited to, Neupogen® (filgrastim) and Neulasta® (pegfilgrastim). Also included are erythropoiesis-stimulating agents (ESAs) such as Epogen® (epoetin alpha), Aranesp® (darbepoetin alpha), Dynepo® (epoetin delta), Mircera® (methoxypolyethyleneglycol epoetin beta), Hematide®, MRK-2578, INS-22, Retacrit® (epoetin zeta), Neorecormon® (epoetin beta), Silapo® (epoetin zeta), Binocrit® (epoetin alpha), Hexal epoetin alpha, Abseamed® (epoetin alpha), Ratioepo® (epoetin theta), Eporatio® (epoetin theta), Biopoin® (epoetin theta), epoetin alpha, epoetin beta, epoetin zeta, epoetin theta and epoetin delta, epoetin omega, epoetin iota, tissue plasminogen activator, GLP-1 receptor agonists, as well as molecules or variants thereof or analogs and biosimilars of any of the above.

В некоторых вариантах осуществления представляющие интерес белки могут включать белки, которые специфически связываются с одним или несколькими белками CD, белками семейства рецепторов HER, молекулами клеточной адгезии, факторами роста, факторами роста нервов, факторами роста фибробластов, трансформирующими факторами роста (TGF), инсулиноподобными факторами роста, остеоиндуктивными факторами, инсулином и родственным инсулину белками, белками коагуляции и связанными с коагуляцией белками, колониестимулирующими факторами (CSF), другими белками крови и сыворотки крови, антигенами групп крови; рецепторами, рецептор-ассоциированными белками, гормонами роста, рецепторами гормона роста, Т-клеточными рецепторами; нейротрофическими факторами, нейротрофинами, релаксинами, интерферонами, интерлейкинами, вирусными антигенами, липопротеинами, интегринами, ревматоидными факторами, иммунотоксинами, поверхностными мембранными белками, транспортными белками, хоминг-рецепторами, адрессинами, регуляторными белками и иммуноадгезинами.In some embodiments, proteins of interest may include proteins that specifically bind to one or more CD proteins, HER receptor family proteins, cell adhesion molecules, growth factors, nerve growth factors, fibroblast growth factors, transforming growth factors (TGF), insulin-like growth factors, osteoinductive factors, insulin and insulin-related proteins, coagulation proteins and coagulation-associated proteins, colony-stimulating factors (CSF), other blood and serum proteins, blood group antigens; receptors, receptor-associated proteins, growth hormones, growth hormone receptors, T-cell receptors; neurotrophic factors, neurotrophins, relaxins, interferons, interleukins, viral antigens, lipoproteins, integrins, rheumatoid factors, immunotoxins, surface membrane proteins, transport proteins, homing receptors, addressins, regulatory proteins and immunoadhesins.

В некоторых вариантах осуществления представляющие интерес белки связываются с одним или нескольким из следующего, по отдельности или в любой комбинации: CD белками, в том числе без ограничения CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD40, CD70, CD123, CD133, CD138, CD171 и CD174, белками семейства рецепторов HER, в том числе, например, HER2, HER3, HER4, и рецептором EGF, EGFRvIII, молекулами клеточной адгезии, например,In some embodiments, the proteins of interest bind to one or more of the following, individually or in any combination: CD proteins, including but not limited to CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD40, CD70, CD123, CD133, CD138, CD171, and CD174, HER receptor family proteins, including, for example, HER2, HER3, HER4, and the EGF receptor, EGFRvIII, cell adhesion molecules, for example,

- 25 049367- 25 049367

LFA-1, Mol, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM и интегрином альфа v/бета 3, факторами роста, в том числе без ограничения, например, фактором роста эндотелия сосудов (VEGF); VEGFR2, гормоном роста, тиреостимулирующим гормоном, фолликулостимулирующим гормоном, лютеинизирующим гормоном, рилизинг-фактором гормона роста, паратиреоидным гормоном, мюллеровым ингибирующим фактором, воспалительным белком макрофагов человека (MIP-1-альфа), эритропоэтином (EPO), фактором роста нервов, таким как NGF-бета, фактором роста тромбоцитов (PDGF), фактором роста фибробластов, в том числе, например, aFGF и bFGF, эпидермальным фактором роста (EGF), Cripto, трансформирующими факторами роста (TGF), в том числе, помимо прочего, TGF-α и TGF-β, в том числе TGF-β1, TGF-fL. TGF^3, TGF—e4 или TGF-fW инсулиноподобными факторами роста-I и -II (IGF-I и IGF-II), дез(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I) и остеоиндуцирующими факторами, инсулинами и родственными инсулину белками, в том числе без ограничения инсулином, A-цепью инсулина, B-цепью инсулина, проинсулином и инсулиноподобными белками, связывающими фактор роста; белками коагуляции и связанными с коагуляцией белками, такими как, среди прочего, фактор VIII, тканевой фактор, фактор фон Виллебранда, протеин C, альфа-1-антитрипсин, активаторами плазминогена, такими как урокиназа и тканевый активатор плазминогена (t-PA), бомбазином, тромбином, тромбопоэтином и рецептором тромбопоэтина, колониестимулирующими факторами (CSF), в том числе, среди прочего, следующими M-CSF, GM-CSF и G-CSF, другими белками крови и сыворотки крови, в том числе без ограничения альбумином, IgE и антигенами группы крови, рецепторами и ассоциированными с рецептором белками, в том числе, например, рецептором flk2/flt3, рецептором ожирения (OB), рецепторами гормона роста и Тклеточными рецепторами; нейротрофическими факторами, в том числе без ограничения нейротрофическим фактором костной ткани (BDNF) и нейротрофином-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6); A-цепью релаксина, В-цепью релаксина и прорелаксином, интерферонами, в том числе, например, интерферонами-альфа, -бета и -гамма, интерлейкинами (IL), например, IL-1-IL-10, IL-12, IL15, IL-17, IL-23, IL-12/IL-23, IL-2Ra, IL1-R1, рецептором IL-6, рецептором IL-4 и/или рецептором IL-13, IL-13RA2 или рецептором IL-17, IL-1RAP; вирусными антигенами, в том числе без ограничения антигеном оболочки вируса СПИДа, липопротеинами, кальцитонином, глюкагоном, предсердным натрийуретическим фактором, сурфактантом легких, альфа- и бета-факторами некроза опухоли, энкефалиназой, BCMA, каппа-цепью Ig, ROR-1, ERBB2, мезотелином, RANTES (регулируемый при активации, в норме экспрессируемый и секретируемый Т-клетками), мышиным гонадотропинассоциированным пептидом, ДНКазой, FR-альфа, ингибином и активином, интегрином, белком A или D, ревматоидными факторами, иммунотоксинами, морфогенетическим белком костной ткани (BMP), супероксиддисмутазой, поверхностными мембранными белками, фактором ускорения распада (DAF), оболочкой вируса СПИДа, транспортными белками, хоминг-рецепторами, MIC (MIC-a, MIC-B), ULBP 16, EPCAM, адрессинами, регуляторными белками, иммуноадгезинами, антигенсвязывающими белками, соматропином, CTGF, CTLA4, эотаксином-1, MUC1, CEA, c-MET, клаудином-18, GPC-3, EPHA2, FPA, LMP1, MG7, NY-ESO-1, PSCA, ганглиозидом GD2, ганглиозидом GM2, BAFF, OPGL (RANKL), миостатином, Dickkopf-1 (DKK-1), Ang2, NGF, рецептором IGF-1, фактором роста гепатоцитов (HGF), TRAIL-R2, c-Kit, B7RP-1, PSMA, NKG2D-1, белком 1 запрограммированной клеточной гибели и его лигандом, PD1 и PDL1, рецептором маннозы/hCGe, вирусом гепатита C, конъюгатом мезотелина dsFv[PE38, Legionella pneumophila (lly), IFN-гамма, белком 10, индуцируемым интерфероном-гамма (IP10), IFNAR, TALL-1, тимусным стромальным лимфопоэтином (TSLP), пропротеиновой конвертазой субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9), факторами стволовых клеток, Flt-3, пептидом, родственным гену кальцитонина (CGRP), OX40L, α4β7, белком, специфическим для тромбоцитов (гликопротеин тромбоцитов Iib/IIIb (PAC-1)), трансформирующим фактором роста-бета (TFGe), белком 3 Zona pellucida, связывающим сперматозоиды (ZP-3), TWEAK, альфа-рецептором фактора роста тромбоцитов (PDGFRa), склеростином и биологически активными фрагментами или вариантами любого из вышеперечисленного.LFA-1, Mol, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM and integrin alpha v/beta 3, growth factors including but not limited to vascular endothelial growth factor (VEGF); VEGFR2, growth hormone, thyroid stimulating hormone, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone, growth hormone releasing factor, parathyroid hormone, Müllerian inhibitory factor, human macrophage inflammatory protein (MIP-1-alpha), erythropoietin (EPO), nerve growth factor such as NGF-beta, platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor including, for example, aFGF and bFGF, epidermal growth factor (EGF), Cripto, transforming growth factors (TGF) including, but not limited to, TGF-α and TGF-β, including TGF-β1, TGF-fL. TGF^3, TGF-e4 or TGF-fW, insulin-like growth factors-I and -II (IGF-I and IGF-II), des(1-3)-IGF-I (brain IGF-I) and osteoinducing factors, insulins and insulin-related proteins, including but not limited to insulin, insulin A chain, insulin B chain, proinsulin and insulin-like growth factor binding proteins; coagulation proteins and coagulation-associated proteins such as, but not limited to, factor VIII, tissue factor, von Willebrand factor, protein C, alpha-1-antitrypsin, plasminogen activators such as urokinase and tissue plasminogen activator (t-PA), bombasin, thrombin, thrombopoietin and thrombopoietin receptor, colony stimulating factors (CSFs) including, but not limited to, M-CSF, GM-CSF and G-CSF, other blood and serum proteins including, but not limited to, albumin, IgE and blood group antigens, receptors and receptor-associated proteins including, for example, the flk2/flt3 receptor, the obesity (OB) receptor, growth hormone receptors and T cell receptors; neurotrophic factors, including but not limited to bone-derived neurotrophic factor (BDNF) and neurotrophin-3, -4, -5 or -6 (NT-3, NT-4, NT-5 or NT-6); relaxin A chain, relaxin B chain and prorelaxin, interferons, including, for example, interferons-alpha, -beta and -gamma, interleukins (IL), for example, IL-1-IL-10, IL-12, IL15, IL-17, IL-23, IL-12/IL-23, IL-2Ra, IL1-R1, IL-6 receptor, IL-4 receptor and/or IL-13 receptor, IL-13RA2 or IL-17 receptor, IL-1RAP; viral antigens including but not limited to AIDS envelope antigen, lipoproteins, calcitonin, glucagon, atrial natriuretic factor, pulmonary surfactant, tumor necrosis factor alpha and beta, enkephalinase, BCMA, Ig kappa chain, ROR-1, ERBB2, mesothelin, RANTES (regulated upon activation, normally expressed and secreted by T cells), mouse gonadotropin-associated peptide, DNase, FR-alpha, inhibin and activin, integrin, protein A or D, rheumatoid factors, immunotoxins, bone morphogenetic protein (BMP), superoxide dismutase, surface membrane proteins, degradative accelerating factor (DAF), AIDS envelope, transport proteins, homing receptors, MIC (MIC-a, MIC-B), ULBP 16, EPCAM, addressins, regulatory proteins, immunoadhesins, antigen-binding proteins, somatropin, CTGF, CTLA4, eotaxin-1, MUC1, CEA, c-MET, claudin-18, GPC-3, EPHA2, FPA, LMP1, MG7, NY-ESO-1, PSCA, ganglioside GD2, ganglioside GM2, BAFF, OPGL (RANKL), myostatin, Dickkopf-1 (DKK-1), Ang2, NGF, IGF-1 receptor, hepatocyte growth factor (HGF), TRAIL-R2, c-Kit, B7RP-1, PSMA, NKG2D-1, programmed cell death protein 1 and its ligand, PD1 and PDL1, mannose receptor/hCGe, hepatitis C virus, mesothelin conjugate dsFv[PE38, Legionella pneumophila (lly), IFN-gamma, interferon-gamma inducible protein 10 (IP10), IFNAR, TALL-1, thymic stromal lymphopoietin (TSLP), proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9), stem cell factors, Flt-3, calcitonin gene-related peptide (CGRP), OX40L, α4β7, platelet-specific protein (platelet glycoprotein Iib/IIIb (PAC-1)), transforming growth factor-beta (TFGe), zona pellucida sperm binding protein 3 (ZP-3), TWEAK, platelet-derived growth factor receptor alpha (PDGFRa), sclerostin, and biologically active fragments or variants of any of the above.

В другом варианте осуществления представляющие интерес белки включают абциксимаб, адалимумаб, адекатумумаб, афлиберцепт, алемтузумаб, алирокумаб, анакинру, атацицепт, базиликсимаб, белимумаб, бевацизумаб, биосозумаб, блинатумомаб, брентуксимаб ведотин, бродалумаб, кантузумаб мертанзин, канакинумаб, цетуксимаб, цертолизумаб пегол, конатумумаб, даклизумаб, деносумаб, экулизумаб, эдреколомаб, эфализумаб, эпратузумаб, этанерцепт, эволокумаб, галиксимаб, ганитумаб, гемтузумаб, голимумаб, ибритумомаб тиуксетан, инфликсимаб, ипилимумаб, лерделимумаб, люмиликсимаб, иксекизумаб, мапатумумаб, мотесаниб дифосфат, муромонаб-CD3, натализумаб, несиритид, нимотузумаб, ниволумаб, окрелизумаб, офатумумаб, омализумаб, опрелвекин, паливизумаб, панитумумаб, пембролизумаб, пертузумаб, пекселизумаб, ранибизумаб, рилотумумаб, ритуксимаб, ромиплостим, ромосозумаб, саргамостим, тоцилизумаб, тозитумомаб, трастузумаб, устекинумаб, ведолизумаб, визилизумаб, волоциксимаб, занолимумаб, залутумумаб и биосимиляры любого из вышеперечисленного.In another embodiment, the proteins of interest comprise abciximab, adalimumab, adecatumumab, aflibercept, alemtuzumab, alirocumab, anakinra, atacicept, basiliximab, belimumab, bevacizumab, biosozumab, blinatumomab, brentuximab vedotin, brodalumab, cantuzumab mertansine, canakinumab, cetuximab, certolizumab pegol, conatumumab, daclizumab, denosumab, eculizumab, edrecolomab, efalizumab, epratuzumab, etanercept, evolocumab, galiximab, ganitumab, gemtuzumab, golimumab, ibritumomab tiuxetan, infliximab, ipilimumab, lerdelimumab, lumiliximab, ixekizumab, mapatumumab, motesanib diphosphate, muromonab-CD3, natalizumab, nesiritide, nimotuzumab, nivolumab, ocrelizumab, ofatumumab, omalizumab, oprelvekin, palivizumab, panitumumab, pembrolizumab, pertuzumab, pexelizumab, ranibizumab, rilotumumab, rituximab, romiplostim, romosozumab, sargamostim, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab, ustekinumab, vedolizumab, visilizumab, volociximab, zanolimumab, zalutumumab, and biosimilars of any of the above.

Представляющие интерес белки в соответствии с настоящим изобретением включают все из вышеперечисленных и дополнительно включают антитела, содержащие 1, 2, 3, 4, 5 или 6 определяющих комплементарность областей (CDR) из любого из вышеупомянутых антител. Также включены варианты, содержащие область, которая на 70% или больше, в частности на 80% или больше, в частности на 90%Proteins of interest according to the present invention include all of the above and further include antibodies comprising 1, 2, 3, 4, 5 or 6 complementarity determining regions (CDRs) from any of the above antibodies. Also included are variants comprising a region that is 70% or more, in particular 80% or more, in particular 90%

- 26 049367 или больше, еще более конкретно на 95% или больше, в частности на 97% или больше, в частности на 98% или больше, еще более конкретно на 99% или больше идентична по аминокислотной последовательности эталонной аминокислотной последовательности представляющего интерес белка. Для этого идентичность может определяться с использованием разнообразного хорошо известного и легкодоступного программного обеспечения для анализа аминокислотных последовательностей. Предпочтительное программное обеспечение включает программное обеспечение, в котором реализованы алгоритмы Смита-Уотермана, которые считаются удовлетворительным решением проблемы поиска и выравнивания последовательностей. Могут также использоваться другие алгоритмы, в частности тогда, когда важным критерием является скорость. Обычно используемые программы для выравнивания и определения гомологичного соответствия ДНК, РНК и полипептидов, которые можно использовать в этой связи, включают FASTA, TFASTA, BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLASTN, PROSRCH, BLAZE и MPSRCH, причем последняя является реализацией алгоритма Смита-Уотермана для исполнения на массово-параллельных процессорах, изготавливаемых MasPar.- 26 049 367 or more, even more particularly 95% or more, in particular 97% or more, in particular 98% or more, even more particularly 99% or more identical in amino acid sequence to a reference amino acid sequence of the protein of interest. For this purpose, the identity can be determined using a variety of well-known and readily available software for amino acid sequence analysis. Preferred software includes software implementing the Smith-Waterman algorithms, which are considered to be a satisfactory solution to the problem of sequence search and alignment. Other algorithms may also be used, in particular when speed is an important criterion. Commonly used DNA, RNA, and polypeptide alignment and homology matching programs that can be used in this regard include FASTA, TFASTA, BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLASTN, PROSRCH, BLAZE, and MPSRCH, the latter being an implementation of the Smith-Waterman algorithm for execution on massively parallel processors manufactured by MasPar.

Представляющие интерес белки могут также включать рецепторы, полученные методами генной инженерии, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR или CAR-T) и Т-клеточные рецепторы (TCR), а также другие белки, содержащие антигенсвязывающую молекулу, которая взаимодействует с таким антигеном-мишенью. CAR можно сконструировать так, чтобы они связывались с антигеном (таким как антиген клеточной поверхности), путем встраивания антигенсвязывающей молекулы, которая взаимодействует с таким антигеном-мишенью. Как правило, CAR включают антигенсвязывающий домен (такой как scFv) вместе с одним или несколькими костимулирующими (сигнальными) доменами и одним или несколькими активирующими доменами.Proteins of interest may also include genetically engineered receptors such as chimeric antigen receptors (CARs or CAR-Ts) and T cell receptors (TCRs), as well as other proteins that contain an antigen-binding molecule that interacts with such a target antigen. CARs can be engineered to bind an antigen (such as a cell surface antigen) by inserting an antigen-binding molecule that interacts with such a target antigen. Typically, CARs include an antigen-binding domain (such as an scFv) together with one or more costimulatory (signaling) domains and one or more activation domains.

Предпочтительно, антигенсвязывающая молекула представляет собой фрагмент такого антитела и более предпочтительно один или несколько одноцепочечных фрагментов антитела (scFv). scFv являются предпочтительными для использования в химерных антигенных рецепторах, поскольку их можно конструировать так, чтобы они экспрессировались как часть единой цепи вместе с другими компонентами CAR. См. Krause et al., J. Exp. Med., 188(4): 619-626, 1998; Finney et al., Journal of Immunology, 161: 2791-2797, 1998.Preferably, the antigen-binding molecule is a fragment of such an antibody, and more preferably one or more single-chain antibody fragments (scFv). scFvs are preferred for use in chimeric antigen receptors because they can be engineered to be expressed as part of a single chain along with other CAR components. See Krause et al., J. Exp. Med., 188(4): 619-626, 1998; Finney et al., Journal of Immunology, 161: 2791-2797, 1998.

Химерные антигенные рецепторы включают один или несколько костимулирующих (сигнальных) доменов для повышения их активности. См. патенты США №№ 7741465 и 6319494, а также Krause et al. и Finney et al. (выше), Song et al., Blood 119:696-706 (2012); Kalos et al., Sci Transl. Med. 3:95 (2011); Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011) и Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016). Подходящие костимулирующие домены могут быть получены, помимо других источников, из CD28, CD28T, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3 (альфа, бета, дельта, эпсилон, гамма, дзета), CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD 33, CD37, CD40, CD 45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS функционально-ассоциированного антигена-1 лимфоцитов (LFA-1 (CD1 la/CD18), CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT (представитель 14 суперсемейства факторов некроза опухолей; TNFSF14), NKG2C, Ig-альфа (CD79a), DAP-10, рецептора Fc-гамма, молекулы MHC класса I, TNF, TNFr, интегрина, сигнальной молекулы активации лимфоцитов, BTLA, рецептора лиганда Toll, CD8-альфа, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4,CD8-бета, Ш^-бета, Ш^-гамма, Ш-7К-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl-ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDlla, LFA-1, ITGAM, CDl-lb, ITGAX, CDl-lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, 41-BB, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83-лиганда или их фрагментов или комбинаций. Костимулирующий домен может содержать одну или несколько внеклеточных частей, трансмембранную часть и внутриклеточную часть.Chimeric antigen receptors include one or more costimulatory (signaling) domains to enhance their activity. See U.S. Patent Nos. 7,741,465 and 6,319,494 and Krause et al. and Finney et al. (supra), Song et al., Blood 119:696–706 (2012); Kalos et al., Sci Transl. Med. 3:95 (2011); Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725–33 (2011); and Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59–83 (2016). Suitable costimulatory domains can be obtained from, among other sources, CD28, CD28T, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3 (alpha, beta, delta, epsilon, gamma, zeta), CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD 33, CD37, CD40, CD 45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS lymphocyte functional-associated antigen-1 (LFA-1 (CD1 la/CD18), CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT (tumor necrosis factor superfamily member 14; TNFSF14), NKG2C, Ig-alpha (CD79a), DAP-10, Fc-gamma receptor, MHC class I molecule, TNF, TNFr, integrin, lymphocyte activation signaling molecule, BTLA, Toll ligand receptor, CD8-alpha, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4,CD8-beta, IgB-beta, IgB-gamma, IgB-alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl-ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDlla, LFA-1, ITGAM, CDl-lb, ITGAX, CDl-lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, 41-BB, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 ligand, or fragments or combinations thereof. The costimulatory domain may comprise one or several extracellular parts, a transmembrane part and an intracellular part.

CAR также включают один или несколько активирующих доменов. CD3-дзета является элементом Т-клеточного рецептора на нативных Т-клетках, и было показано, что он является важным внутриклеточным активирующим элементом в CAR.CARs also include one or more activating domains. CD3-zeta is a T cell receptor element on naïve T cells and has been shown to be an important intracellular activating element in CARs.

CAR представляют собой трансмембранные белки, содержащие внеклеточный домен, как правило, содержащий антигенсвязывающий белок, который способен распознавать и связываться с представляющим интерес антигеном, а также включающий шарнирную область. Кроме того, есть трансмембранный домен и внутриклеточный (цитоплазматический) домен.CARs are transmembrane proteins that contain an extracellular domain, typically containing an antigen-binding protein that is capable of recognizing and binding to the antigen of interest, and also include a hinge region. In addition, there is a transmembrane domain and an intracellular (cytoplasmic) domain.

Внеклеточный домен имеет значение для передачи сигналов и для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. из любого белка, описанного в данном документе, или любой их комбинации. Внеклеточный домен может быть получен либо из синтетического, либо из природного источника, такого как белки описанные в данном документе. Внеклеточные домены часто содержат шарнирную часть. Она представляет собой часть внеклеточного домена, иногда называемую спейсерной областью. Шарниры могут быть получены из белков, описанных в данном документе, в частности костимулирующих белков, описанных выше, а также последовательностей иммуноглобулинов (Ig) или других подходящих молекул для достижения требуемого специфического расстояния от клетки-мишени.The extracellular domain is important for signaling and for the effective response of lymphocytes to an antigen. from any protein described herein, or any combination thereof. The extracellular domain may be obtained from either a synthetic or a natural source, such as the proteins described herein. Extracellular domains often contain a hinge portion. This is a portion of the extracellular domain sometimes referred to as a spacer region. Hinges may be obtained from proteins described herein, in particular the costimulatory proteins described above, as well as immunoglobulin (Ig) sequences or other suitable molecules to achieve the desired specific distance from the target cell.

- 27 049367- 27 049367

Трансмембранный домен может быть слит с внеклеточным доменом CAR. Аналогичным образом, он может быть слит со внутриклеточным доменом CAR. Трансмембранный домен может быть получен либо из синтетического, либо из природного источника, такого как белки, описанные в данном документе, в частности костимулирующие белки, описанные выше.The transmembrane domain may be fused to the extracellular domain of the CAR. Likewise, it may be fused to the intracellular domain of the CAR. The transmembrane domain may be derived from either a synthetic source or a natural source, such as the proteins described herein, in particular the costimulatory proteins described above.

Внутриклеточный (цитоплазматический) домен может быть слит с трансмембранным доменом и может обеспечивать активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки. Эффекторной функцией Т-клетки может быть, например, цитолитическая активность или хелперная активность, включая секрецию цитокинов. Внутриклеточные домены могут быть получены из белков, описанных в данном документе, в частности из CD3.The intracellular (cytoplasmic) domain may be fused to the transmembrane domain and may provide for activation of at least one of the normal effector functions of an immune cell. The effector function of a T cell may be, for example, cytolytic activity or helper activity, including secretion of cytokines. The intracellular domains may be derived from the proteins described herein, in particular from CD3.

Для получения полинуклеотидов, полипептидов, векторов, клеток-хозяев, иммунных клеток, композиций и т.п. в соответствии с настоящим изобретением можно использовать целый ряд известных методик.A variety of known techniques can be used to obtain polynucleotides, polypeptides, vectors, host cells, immune cells, compositions, etc. in accordance with the present invention.

Также в данном документе предусмотрены системы и конструкции экспрессии в форме плазмид, векторов экспрессии, кассет транскрипции или экспрессии, которые содержат по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, описанную выше, а также клетки-хозяева, содержащие такие системы или конструкции экспрессии. Используемый в данном документе вектор означает любую молекулу или любой элемент (например, нуклеиновую кислоту, плазмиду, бактериофаг, транспозон, космиду, хромосому, вирус, вирусный капсид, вирион, голую ДНК, образующую комплекс ДНК и т.п.), которые подходят для применения в переносе и/или транспортировке информации, кодирующей белок, в клеткухозяина и/или в специфическое местоположение и/или компартмент в клетке-хозяине. Векторы могут включать вирусные и невирусные векторы, неэписомные векторы млекопитающих. Векторы зачастую называют векторами экспрессии, например рекомбинантными векторами экспрессии и клонирующими векторами. Вектор может быть введен в клетку-хозяина для обеспечения репликации вектора самого по себе, и за счет этого обеспечения амплификации копий полинуклеотида, содержащегося в нем. Клонирующие векторы могут содержать компоненты последовательности, обычно включающие без ограничения точку начала репликации, промоторные последовательности, последовательности инициации транскрипции, энхансерные последовательности и селектируемые маркеры. При необходимости эти элементы могут быть выбраны специалистом средней квалификации в данной области.Also provided herein are expression systems and constructs in the form of plasmids, expression vectors, transcription or expression cassettes that contain at least one nucleic acid molecule as described above, as well as host cells containing such expression systems or constructs. As used herein, a vector means any molecule or element (e.g., a nucleic acid, plasmid, bacteriophage, transposon, cosmid, chromosome, virus, viral capsid, virion, naked DNA, complexed DNA, etc.) that are suitable for use in transferring and/or transporting protein-coding information into a host cell and/or to a specific location and/or compartment within a host cell. Vectors may include viral and non-viral vectors, non-episomal mammalian vectors. Vectors are often referred to as expression vectors, such as recombinant expression vectors and cloning vectors. The vector may be introduced into a host cell to allow the vector to replicate itself, thereby amplifying copies of the polynucleotide contained therein. Cloning vectors may contain sequence components that typically include, but are not limited to, an origin of replication, promoter sequences, transcription initiation sequences, enhancer sequences, and selectable markers. These elements may be selected by a person of ordinary skill in the art, if necessary.

Векторы применимы для трансформации клетки-хозяина и содержат последовательности нуклеиновой кислоты, которые направляют и/или регулируют (вместе с клеткой-хозяином) экспрессию одной или нескольких гетерологичных кодирующих областей, функционально связанных с ними. Конструкция экспрессии может включать без ограничения последовательности, которые приводят к транскрипции, трансляции или регулируют их и, в случае присутствия интронов, приводят к сплайсингу РНК кодирующей области, функционально связанной с ними. Функционально связанный означает, что компоненты, в отношении которых используется данный термин, находятся во взаимосвязи, которая позволяет им выполнять присущие им функции. Например, регуляторная последовательность, например промотор, в векторе, которая функционально связана с кодирующей последовательностью для белка, организована так, чтобы нормальная активность регуляторной последовательности приводила к транскрипции кодирующей последовательности для белка, что приводит к рекомбинантной экспрессии кодируемого белка.Vectors are useful for transforming a host cell and contain nucleic acid sequences that direct and/or regulate (in conjunction with the host cell) the expression of one or more heterologous coding regions operably linked thereto. The expression construct may include, but is not limited to, sequences that result in or regulate transcription, translation, and, where introns are present, result in RNA splicing of the coding region operably linked thereto. Operably linked means that the components to which the term is used are in a relationship that allows them to perform their intended functions. For example, a regulatory sequence, such as a promoter, in a vector that is operably linked to a coding sequence for a protein is arranged such that normal activity of the regulatory sequence results in transcription of the coding sequence for the protein, resulting in recombinant expression of the encoded protein.

Вектор можно выбрать таким образом, чтобы он был функциональным в конкретной используемой клетке-хозяине (т.е. вектор является совместимым с синтетическим аппаратом клетки-хозяина, что может обеспечивать осуществление амплификации и/или экспрессии гена). В некоторых вариантах осуществления применяют векторы, которые используются в структурных анализах комплементации фрагментов белка с применением белков-репортеров, таких как дигидрофолатредуктаза (см., например, патент США № 6270964). Подходящие векторы экспрессии известны в данной области техники, а также являются коммерчески доступными.The vector may be selected to be functional in the particular host cell used (i.e., the vector is compatible with the host cell's synthetic machinery, which can allow for amplification and/or expression of the gene). In some embodiments, vectors are used that are used in structural protein fragment complementation assays using reporter proteins such as dihydrofolate reductase (see, e.g., U.S. Patent No. 6,270,964). Suitable expression vectors are known in the art and are also commercially available.

Как правило, векторы, применяемые в любой из клеток-хозяев, будут содержать последовательности для поддержания плазмид, а также для клонирования и экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей. Как правило, такие последовательности будут включать одну или несколько из следующих нуклеотидных последовательностей: промотор, одну или несколько энхансерных последовательностей, точку начала репликации, последовательности регуляции транскрипции и трансляции, последовательность терминации транскрипции, полную последовательность интрона, содержащую донорный и акцепторный сайты сплайсинга, различные пре- или пропоследовательности для улучшения гликозилирования или выхода, природную или гетерологичную сигнальную последовательность (лидерную последовательность или сигнальный пептид) для секреции полипептида, сайт связывания рибосомы, последовательность полиаденилирования, последовательности внутреннего участка посадки рибосомы (IRES), элемент увеличивающей экспрессию последовательности (EASE), РНК трехсоставной лидерной последовательности (TPA) и гена VA из аденовируса 2, полилинкерную область для вставки полинуклеотида, кодирующего подлежащий экспрессии полипептид и элемент селектируемого маркера. Векторы могут быть собраны из начальногоTypically, vectors used in any of the host cells will contain sequences for maintaining plasmids, as well as for cloning and expression of exogenous nucleotide sequences. Typically, such sequences will include one or more of the following nucleotide sequences: a promoter, one or more enhancer sequences, an origin of replication, transcriptional and translational regulatory sequences, a transcription termination sequence, a complete intron sequence containing splice donor and acceptor sites, various pre- or pro-sequences to improve glycosylation or exit, a natural or heterologous signal sequence (leader sequence or signal peptide) for secretion of the polypeptide, a ribosome binding site, a polyadenylation sequence, internal ribosome entry site (IRES) sequences, an enhancing expression sequence element (EASE), the tripartite leader sequence (TPA) RNA and the VA gene from adenovirus 2, a polylinker region for insertion of a polynucleotide encoding the polypeptide to be expressed, and a selectable marker element. Vectors can be assembled from an initial

- 28 049367 вектора, такого как коммерчески доступный вектор, при этом дополнительные элементы можно получить отдельно и лигировать в вектор. Способы, применяемые для получения каждого из компонентов хорошо известны специалисту в данной области техники.- 28 049367 vector, such as a commercially available vector, wherein additional elements can be obtained separately and ligated into the vector. The methods used to obtain each of the components are well known to those skilled in the art.

Компоненты вектора могут быть гомологичными (т.е. происходить от того же вида и/или штамма, что и клетка-хозяин), гетерологичными (т.е. происходить от вида, отличного от вида или штамма клеткихозяина), гибридными (т.е. являются комбинацией фланкирующих последовательностей из более чем одного источника), синтетическими или природными. Последовательности компонентов, применимых в векторах, можно получить с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, как, например, последовательности, ранее идентифицированные посредством картирования и/или посредством рестрикционной эндонуклеазы. Кроме того, их можно получить с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или путем скрининга геномной библиотеки с помощью подходящих зондов.The vector components may be homologous (i.e., derived from the same species and/or strain as the host cell), heterologous (i.e., derived from a species different from the host cell species or strain), hybrid (i.e., a combination of flanking sequences from more than one source), synthetic, or natural. The sequences of the components useful in vectors may be obtained by methods well known in the art, such as sequences previously identified by mapping and/or by restriction endonuclease. They may also be obtained by polymerase chain reaction (PCR) and/or by screening a genomic library with suitable probes.

Сайт связывания рибосомы обычно необходим для инициации трансляции мРНК, и для него характерно наличие последовательности Шайна-Дальгарно (прокариоты) или последовательности Козак (эукариоты). Как правило, этот элемент расположен в направлении 3'-конца относительно промотора и в направлении 5'-конца относительно кодирующей последовательности полипептида, подлежащего экспрессии.The ribosome binding site is usually required for the initiation of mRNA translation and is characterized by the presence of a Shine-Dalgarno sequence (prokaryotes) or a Kozak sequence (eukaryotes). Typically, this element is located 3' to the promoter and 5' to the coding sequence of the polypeptide to be expressed.

Точка начала репликации содействует амплификации вектора в клетке-хозяине. Они могут входить в состав коммерчески доступных прокариотических векторов, а также их можно синтезировать химически на основе известной последовательности и лигировать в вектор. Для клонирования векторов в клетках млекопитающих могут быть применимы различные вирусные точки начала репликации (например, происходящие из SV40, вируса полиомы, аденовируса, вируса везикулярного стоматита (VSV) или папилломавирусов, таких как HPV или BPV).An origin of replication facilitates amplification of the vector in the host cell. They can be included in commercially available prokaryotic vectors, or they can be chemically synthesized based on a known sequence and ligated into the vector. Various viral origins of replication (e.g., those derived from SV40, polyoma virus, adenovirus, vesicular stomatitis virus (VSV), or papillomaviruses such as HPV or BPV) can be used for cloning vectors in mammalian cells.

Последовательности регуляции транскрипции и трансляции для векторов экспрессии в клеткаххозяевах, являющихся клетками млекопитающих, можно вырезать из вирусных геномов. Обычно применяемые промоторные и энхансерные последовательности получают из вируса полиомы, аденовируса 2, обезьяньего вируса 40 (SV40) и цитомегаловируса человека (CMV). Например, можно применять промотор/энхансер CMV человека немедленно-раннего гена 1. См., например, Patterson et al. (1994), Applied Microbiol. Biotechnol. 40:691-98. Последовательности ДНК, полученные из генома вируса SV40, например, точка начала репликации SV40, ранний и поздний промотор, энхансер, сайты сплайсинга и полиаденилирования, можно применять для обеспечения других генетических элементов, предназначенных для экспрессии последовательности структурного гена в клетке-хозяине, являющейся клеткой млекопитающего. Особенно применимы вирусные ранний и поздний промоторы, поскольку оба легко получить из вирусного генома в виде фрагмента, который также может содержать вирусную точку начала репликации (Fiers et al. (1978), Nature 273:113; Kaufman (1990), Meth. in Enzymol. 185:487-511). Также можно применять меньшие или большие фрагменты SV40 при условии, что включена последовательность длиной приблизительно 250 п. о., продолжающаяся от сайта Hind III в направлении сайта Bgl I, расположенного в точке начала репликации вируса SV40.Transcriptional and translational regulatory sequences for expression vectors in mammalian host cells can be excised from viral genomes. Commonly used promoter and enhancer sequences are derived from polyoma virus, adenovirus 2, simian virus 40 (SV40), and human cytomegalovirus (CMV). For example, the human CMV immediate early gene 1 promoter/enhancer can be used. See, e.g., Patterson et al. (1994) Applied Microbiol. Biotechnol. 40:691–98. DNA sequences obtained from the SV40 virus genome, such as the SV40 origin of replication, early and late promoter, enhancer, splice and polyadenylation sites, can be used to provide other genetic elements for expression of the structural gene sequence in a mammalian host cell. The viral early and late promoters are particularly useful because both are readily available from the viral genome as a fragment that may also contain the viral origin of replication (Fiers et al. (1978) Nature 273:113; Kaufman (1990) Meth. in Enzymol. 185:487-511). Smaller or larger fragments of SV40 can also be used, provided that approximately 250 bp of sequence extending from the Hind III site toward the Bgl I site located at the SV40 origin of replication is included.

Как правило, последовательность терминации транскрипции расположена в направлении 3'-конца относительно конца кодирующей области для полипептида, и она служит для терминации транскрипции. Обычно последовательность терминации транскрипции в прокариотических клетках представляет собой фрагмент c высоким содержанием G-C, за которым следует последовательность поли-Т. Хотя данную последовательность легко клонировать из библиотеки или даже приобрести в коммерческих источниках в качестве части вектора, ее также можно легко синтезировать с применением способов синтеза нуклеиновых кислот, известный специалистам в данной области техники.Typically, a transcription termination sequence is located 3' to the end of the coding region for the polypeptide, and serves to terminate transcription. Typically, the transcription termination sequence in prokaryotic cells is a G-C-rich fragment followed by a poly-T sequence. Although this sequence is easily cloned from a library or even purchased commercially as part of a vector, it can also be readily synthesized using nucleic acid synthesis techniques known to those skilled in the art.

Г ен селектируемого маркера кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина, выращиваемой в селективной среде для культивирования. Типичные гены маркеров отбора кодируют белки, которые: (a) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, тетрациклину или канамицину в случае прокариотических клеток-хозяев; (b) восполняют ауксотрофные недостаточности у клетки; или (c) обеспечивают необходимые питательные вещества, не доступные из комплексной или определенной среды. Специфические селектируемые маркеры представляют собой ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к тетрациклину. Для отбора как прокариотических, так и эукариотических клеток-хозяев можно также с успехом применять ген устойчивости к неомицину.A selectable marker gene encodes a protein required for the survival and growth of a host cell grown in a selective culture medium. Typical selectable marker genes encode proteins that: (a) confer resistance to antibiotics or other toxins, such as ampicillin, tetracycline, or kanamycin in the case of prokaryotic host cells; (b) complement auxotrophic deficiencies in the cell; or (c) provide essential nutrients not available from the complex or defined medium. Specific selectable markers include the kanamycin resistance gene, the ampicillin resistance gene, and the tetracycline resistance gene. The neomycin resistance gene can also be used successfully to select both prokaryotic and eukaryotic host cells.

Для амплификации гена, который будет экспрессироваться, можно применять другие селектируемые гены. Амплификация представляет собой процесс, при котором гены, которые требуются для продуцирования белка, крайне важного для роста или выживания клеток, многократно повторяются в тандеме в хромосомах последовательных поколений рекомбинантных клеток. Примеры подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающих включают систему глутаминсинтаза (GS)/метионинсульфоксимин (MSX), дигидрофолатредуктазу (DHFR) и гены тимидинкиназы, не содержащие промоторов. Трансформантов, являющихся клетками млекопитающих, помещают в условия давления отбора, в которых только лишь трансформанты являются единственными адаптированными для выживания вследствие присутствия в векторе селектируемого гена. Давление отбора создают за счетOther selectable genes can be used to amplify the gene to be expressed. Amplification is the process by which genes required to produce a protein essential for cell growth or survival are repeated many times in tandem on the chromosomes of successive generations of recombinant cells. Examples of suitable selectable markers for mammalian cells include the glutamine synthase (GS)/methionine sulfoximine (MSX) system, dihydrofolate reductase (DHFR), and promoterless thymidine kinase genes. Mammalian cell transformants are placed under selective pressure in which the transformants alone are adapted to survive due to the presence of the selectable gene in the vector. Selective pressure is created by

- 29 049367 культивирования трансформированных клеток в условиях, при которых концентрацию средства отбора в среде постепенно увеличивают, за счет чего обеспечивается амплификация как селектируемого гена, так и ДНК, которая кодирует представляющий интерес белок. В результате этого с амплифицированной ДНК синтезируются повышенные количества представляющего интерес полипептида.- 29 049367 culturing transformed cells under conditions in which the concentration of the selection agent in the medium is gradually increased, thereby ensuring the amplification of both the gene being selected and the DNA that codes for the protein of interest. As a result, increased amounts of the polypeptide of interest are synthesized from the amplified DNA.

В некоторых случаях, например, если в системе экспрессии на основе эукариотической клеткихозяина требуется гликозилирование, можно манипулировать с различными пре- или пропоследовательностями для улучшения гликозилирования или выхода. Например, можно изменять сайт расщепления пептидазой конкретного сигнального пептида или добавлять пропоследовательности, которые также могут воздействовать на гликозилирование. В положении -1 (относительно первой аминокислоты зрелого белка) конечного белкового продукта может находиться одна или несколько дополнительных аминокислот, образуемых в ходе экспрессии, которые могли быть не полностью удалены. Например, к аминоконцу конечного белкового продукта могут быть прикреплены один или два аминокислотных остатка, находящиеся в сайте расщепления пептидазой. В качестве альтернативы применение некоторых сайтов расщепления ферментами может приводить к получению слегка усеченной формы требуемого полипептида, если фермент осуществляет разрез в такой области в пределах зрелого полипептида.In some cases, such as when glycosylation is desired in a eukaryotic host cell expression system, various pre- or pro-sequences can be manipulated to improve glycosylation or yield. For example, the peptidase cleavage site of a particular signal peptide can be altered, or pro-sequences can be added that can also affect glycosylation. At position -1 (relative to the first amino acid of the mature protein) of the final protein product, there may be one or more additional amino acids formed during expression that may not have been completely removed. For example, one or two amino acid residues located at a peptidase cleavage site can be attached to the amino terminus of the final protein product. Alternatively, use of certain enzyme cleavage sites may result in a slightly truncated form of the desired polypeptide if the enzyme makes a cut at such a region within the mature polypeptide.

Как правило, экспрессия и клонирование будут предусматривать промотор, который распознается организмом-хозяином и функционально связан с молекулой, которая кодирует представляющий интерес белок. Промоторы представляют собой нетранскрибируемые последовательности, расположенные выше (т.е. в направлении 5'-конца) относительно стартового кодона структурного гена (обычно в пределах приблизительно 100-1000 п. о.), которые регулируют транскрипцию структурного гена. Традиционно промоторы подразделяют на два класса: индуцируемые промоторы и конститутивные промоторы. Индуцируемые промоторы запускают повышенные уровни транскрипции с ДНК, находящейся под их контролем, в ответ на некоторое изменение в условиях культивирования, как, например, присутствие или отсутствие питательного вещества или изменение температуры. С другой стороны, конститутивные промоторы приводят к постоянной транскрипции гена, с которым они функционально связаны, то есть осуществляют незначительный контроль над экспрессии гена или такой контроль отсутствует. Хорошо известно большое число промоторов, распознаваемых различными потенциальными клеткамихозяевами.Typically, expression and cloning will involve a promoter that is recognized by the host organism and operably linked to the molecule that encodes the protein of interest. Promoters are non-transcribed sequences located upstream (i.e., 5') of the start codon of a structural gene (usually within approximately 100-1000 bp) that regulate transcription of the structural gene. Traditionally, promoters are divided into two classes: inducible promoters and constitutive promoters. Inducible promoters drive increased levels of transcription from the DNA under their control in response to some change in culture conditions, such as the presence or absence of a nutrient or a change in temperature. Constitutive promoters, on the other hand, result in constant transcription of the gene to which they are operably linked, i.e., they exert little or no control over gene expression. A large number of promoters recognized by various potential host cells are well known.

Также из уровня техники хорошо известны промоторы, подходящие для применения с дрожжевыми клетками-хозяевами. Энхансеры для дрожжевых клеток предпочтительно применяют с промоторами для дрожжевых клеток. Подходящие промоторы для применения с клетками-хозяевами, являющимися клетками млекопитающих, хорошо известны, и они включают без ограничения промоторы, полученные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы кур, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирусы, вирус гепатита В и вирус обезьян 40 (SV40). Другие подходящие промоторы для клеток млекопитающих включают гетерологичные промоторы для клеток млекопитающих, например, промоторы генов белков теплового шока и промотор гена актина.Promoters suitable for use with yeast host cells are also well known in the art. Enhancers for yeast cells are preferably used with promoters for yeast cells. Suitable promoters for use with mammalian host cells are well known and include, but are not limited to, promoters derived from the genomes of viruses such as polyoma virus, fowlpox virus, adenovirus (such as adenovirus 2), bovine papillomavirus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retroviruses, hepatitis B virus, and simian virus 40 (SV40). Other suitable promoters for mammalian cells include heterologous promoters for mammalian cells, such as the promoters of heat shock protein genes and the actin gene promoter.

Дополнительные промоторы, которые могут представлять интерес, включают без ограничения: ранний промотор SV40 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); промотор CMV (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); промотор, содержащийся в 3'-концевом длинном повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); промотор гена тимидинкиназы вируса герпеса (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); промотор гена глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы (GAPDH); промоторные и регуляторные последовательности гена металлотионина (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42) и прокариотические промоторы, такие как промотор беталактамазы (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.75:3727-3731) или промотор tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). Также представляют интерес следующие области транскрипционного контроля животных, которые проявляют тканевую специфичность и были использованы в трансгенных животных: регуляторная область гена эластазы I, активная в ацинарных клетках поджелудочной железы (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); регуляторная область гена инсулина, активная в бета-клетках поджелудочной железы (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); регуляторная область гена иммуноглобулина, активная в лимфоидных клетках (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:14361444); регуляторная область вируса опухоли мышиной молочной железы, активная в клетках семенников, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); регуляторная область гена альбумина, активная в печени (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); регуляторная область гена альфа-фетопротеина, активная в печени (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); регуляторная область гена альфа-1-антитрипсина, активная в печени (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); регуляторная область гена бетаглобина, активная в миелоидных клетках (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); регуляторная область гена основного белка миелина, активная в олигодендроцитах в головномAdditional promoters that may be of interest include, but are not limited to: the SV40 early promoter (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); the CMV promoter (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); the promoter contained in the 3' long repeat of Rous sarcoma virus (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); the herpes virus thymidine kinase gene promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene promoter; promoter and regulatory sequences of the metallothionein gene (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42) and prokaryotic promoters such as the betalactamase promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) or the tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). Also of interest are the following regions of animal transcriptional control that exhibit tissue specificity and have been used in transgenic animals: the regulatory region of the elastase I gene, active in pancreatic acinar cells (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); the regulatory region of the insulin gene, active in pancreatic beta cells (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); the immunoglobulin regulatory region active in lymphoid cells (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); the murine mammary tumor virus regulatory region active in testicular, mammary, lymphoid, and mast cells (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); the albumin regulatory region active in the liver (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); the alpha-fetoprotein regulatory region active in the liver (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); the alpha-1-antitrypsin regulatory region active in the liver (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); the betaglobin regulatory region active in myeloid cells (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); the myelin basic protein regulatory region active in oligodendrocytes in the brain

- 30 049367 мозге (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); регуляторная область гена легкой цепи-2 миозина, активная в скелетных мышцах (Sani, 1985, Nature 314:283-286); и регуляторная область гена гонадотропного рилизинг-гормона, активная в гипоталамусе (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).- 30 049367 in the brain (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); the myosin light chain-2 gene regulatory region, active in skeletal muscle (Sani, 1985, Nature 314:283-286); and the gonadotropin-releasing hormone gene regulatory region, active in the hypothalamus (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

Энхансерную последовательность можно вставлять в вектор для повышения транскрипции ДНК у высших эукариот. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК длиной обычно приблизительно 10-300 п. о., которые воздействуют на промотор для повышения транскрипции. Энхансеры являются относительно независимыми от ориентации и положения, они были обнаружены в положениях в направлении как 5'-конца, так и 3'-конца относительно транскрипционной единицы. Известны некоторые энхансерные последовательности, полученные из генов млекопитающих (например, генов глобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и инсулина). Как правило, обычно применяют энхансер из вируса. Известные из уровня техники энхансер SV40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы и энхансеры аденовируса представляют собой иллюстративные энхансерные элементы для активации эукариотических промоторов. Хотя энхансер может находиться в векторе как в направлении 5'-, так и 3'-конца относительно кодирующей последовательности, как правило, он расположен в 5'-сайте относительно промотора.An enhancer sequence can be inserted into a vector to enhance transcription of DNA in higher eukaryotes. Enhancers are cis-acting DNA elements, typically approximately 10-300 bp in length, that act on a promoter to enhance transcription. Enhancers are relatively orientation and position independent and have been found at both 5' and 3' positions relative to the transcription unit. Several enhancer sequences are known to be derived from mammalian genes (e.g., globin, elastase, albumin, alpha-fetoprotein, and insulin genes). Typically, an enhancer from a virus is used. The SV40 enhancer, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma virus enhancer, and the adenovirus enhancers known in the art are exemplary enhancer elements for activating eukaryotic promoters. Although the enhancer can be located in the vector either 5' or 3' relative to the coding sequence, it is typically located in the 5' site relative to the promoter.

Последовательность, кодирующая соответствующую нативную или гетерологичную сигнальную последовательность (лидерную последовательность или сигнальный пептид), может быть встроена в вектор экспрессии для содействия внеклеточной секреции представляющего интерес белка. Выбор сигнального пептида или лидерной последовательности зависит от типа клеток-хозяев, в которых должен продуцироваться представляющий интерес белок, а гетерологичная сигнальная последовательность может замещать нативную сигнальную последовательность. Примеры сигнальных пептидов, которые являются функциональными в клетках-хозяевах, являющихся клетками млекопитающих, включают следующее: сигнальную последовательность интерлейкина-7, описанную в патенте США № 4965195; сигнальную последовательность рецептора интерлейкина-2, описанную в Cosman et al.,1984, Nature 312:768; сигнальный пептид рецептора интерлейкина-4, описанный в Европейском патенте № 0367566; сигнальный пептид рецептора интерлейкина-1 типа I, описанный в патенте США № 4968607; сигнальный пептид рецептора интерлейкина-1 типа II, описанный в Европейском патенте № 0460846.A sequence encoding an appropriate native or heterologous signal sequence (leader sequence or signal peptide) can be inserted into an expression vector to promote extracellular secretion of the protein of interest. The choice of signal peptide or leader sequence depends on the host cell type in which the protein of interest is to be produced, and the heterologous signal sequence can replace the native signal sequence. Examples of signal peptides that are functional in mammalian host cells include the following: the interleukin-7 signal sequence described in U.S. Patent No. 4,965,195; the interleukin-2 receptor signal sequence described in Cosman et al., 1984, Nature 312:768; the interleukin-4 receptor signal peptide described in European Patent No. 0,367,566; the interleukin-1 receptor type I signal peptide described in US Patent No. 4,968,607; the interleukin-1 receptor type II signal peptide described in European Patent No. 0,460,846.

Дополнительные регуляторные последовательности, для которых было показано, что они улучшают экспрессию гетерологичных генов с векторов экспрессии для клеток млекопитающих, включают такие элементы, как увеличивающей экспрессию элемент последовательности (EASE), полученный из клеток СНО (Morris et al., в Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997); патенты США №№ 6312951 В1, 6027915 и 6309841 В1) и РНК трехсоставной лидерной последовательности (TPL) и гена VA из аденовируса 2 (Gingeras et al. (1982), J. Biol. Chem. 257:13475-13491). Последовательности внутреннего участка посадки рибосомы (IRES) вирусного происхождения обеспечивают эффективную трансляцию дицистронных мРНК (Oh and Sarnow (1993), Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300; Ramesh et al. (1996), Nucleic Acids Research 24:2697-2700).Additional regulatory sequences that have been shown to improve expression of heterologous genes from mammalian cell expression vectors include elements such as the expression enhancing element sequence (EASE) derived from CHO cells (Morris et al., in Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997); U.S. Patent Nos. 6,312,951 B1, 6,027,915, and 6,309,841 B1) and the tripartite leader sequence (TPL) and VA gene RNA from adenovirus 2 (Gingeras et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:13475-13491). Viral-derived internal ribosome entry site (IRES) sequences mediate efficient translation of dicistronic mRNAs (Oh and Sarnow (1993), Current Opinion in Genetics and Development 3:295–300; Ramesh et al. (1996), Nucleic Acids Research 24:2697–2700).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления вектор дополнительно содержит транспозон piggyBac, содержащий сайт вставки для по меньшей мере одной экзогенной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один представляющий интерес белок. В одном варианте осуществления несколько представляющих интерес белков экспрессируются за счет экзогенной(-ых) молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления вектор включает бицистронные или мультицистронные конструкции, которые кодируют несколько представляющих интерес белков. В одном варианте осуществления транспозон содержит по меньшей мере 5'- и 3'-элементы инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO:18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 7. ВIn one embodiment, the present invention provides a vector comprising a nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein. In one embodiment, the vector further comprises a piggyBac transposon comprising an insertion site for at least one exogenous nucleic acid molecule sequence encoding at least one protein of interest. In one embodiment, multiple proteins of interest are expressed by the exogenous nucleic acid molecule(s). In one embodiment, the vector comprises bicistronic or multicistronic constructs that encode multiple proteins of interest. In one embodiment, the transposon comprises at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In one embodiment, an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein is provided. In one embodiment, a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. In another aspect, the present invention provides piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7. In

- 31 049367 другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18.- 31 049367 In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 18.

В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, содержащая аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO:2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 и/или аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере две из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO:2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO:2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO:2. В другом родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит замену изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO:2, замену изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO:2 и замену серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO:2. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:4. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.In one embodiment, a piggyBac transposase is provided that comprises an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 and/or a serine to threonine amino acid substitution at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least one of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least two of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO:2 and a serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO:2. In another related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine substitution at position 147 of SEQ ID NO:2, an isoleucine to leucine substitution at position 247 of SEQ ID NO:2, and a serine to threonine substitution at position 533 of SEQ ID NO:2. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8. In another aspect, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12. In another aspect, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO:4. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO:6. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO:8. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO:10. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO:12. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO:14. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO:16.

В одном варианте осуществления один вектор, содержащий транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, и транспозон, содержащий сайт вставки для по меньшей мере для одной экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один представляющий интерес белок, в можно трансфицировать в клетку. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, дополнительно содержащая по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления несколько представляющих интерес белков экспрессируются за счет экзогенной(ых) молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления вектор включает бицистронные или мультицистронные конструкции, которые кодируют несколько представляющих интерес белков.In one embodiment, a vector comprising a piggyBac transposase as described herein and a transposon comprising an insertion site for at least one exogenous nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest can be transfected into a cell. In one embodiment, the present invention provides a nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase as described herein, further comprising at least one nucleic acid molecule encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In one embodiment, multiple proteins of interest are expressed by the exogenous nucleic acid molecule(s). In one embodiment, the vector comprises bicistronic or multicistronic constructs that encode multiple proteins of interest.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен вектор, содержащий сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, и второй вектор, содержащий транспозон piggyBac, содержащий сайт вставки для одной или нескольких экзогенных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих по меньшей мере одинIn another embodiment of the present invention, there is provided a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein and a second vector comprising the piggyBac transposon comprising an insertion site for one or more exogenous nucleic acid molecules encoding at least one

- 32 049367 представляющий интерес белок, где два вектора можно совместно трансфицировать в клетку. В родственном варианте осуществления транспозон содержит по меньшей мере 5'- и 3'-элементы инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления несколько представляющих интерес белков экспрессируются за счет экзогенной(ых) молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления вектор включает бицистронные или мультицистронные конструкции, которые кодируют несколько представляющих интерес белков.- 32 049367 a protein of interest, wherein two vectors can be co-transfected into a cell. In a related embodiment, the transposon comprises at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In one embodiment, multiple proteins of interest are expressed by exogenous nucleic acid molecule(s). In one embodiment, the vector includes bicistronic or multicistronic constructs that encode multiple proteins of interest.

После сборки один или несколько векторов можно вводить в подходящую клетку для амплификации и/или экспрессии полипептида. Трансформацию вектора экспрессии в выбранную клетку можно осуществлять хорошо известными способами, включая трансфекцию, инфекцию, совместное осаждение с фосфатом кальция, электропорацию, нуклеофекцию, микроинъекцию, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, доставку, опосредованную катионными липидами, трансфекцию, опосредованную липосомами, бомбардировку микрочастицами, доставку гена, опосредованную рецептором, доставку, опосредованную полилизином, гистоном, хитозаном и пептидами. Выбранный способ отчасти будет зависеть от применяемого типа клетки-хозяина. Эти способы и другие подходящие способы хорошо известны специалисту в данной области техники и изложены в руководствах и других технических публикациях, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).Once assembled, one or more vectors can be introduced into a suitable cell for amplification and/or expression of the polypeptide. Transformation of the expression vector into the cell of choice can be accomplished by well-known methods, including transfection, infection, calcium phosphate co-precipitation, electroporation, nucleofection, microinjection, DEAE-dextran-mediated transfection, cationic lipid-mediated delivery, liposome-mediated transfection, microparticle bombardment, receptor-mediated gene delivery, polylysine, histone, chitosan, and peptide-mediated delivery. The method chosen will depend in part on the host cell type employed. These methods and other suitable methods are well known to those skilled in the art and are described in manuals and other technical publications, such as Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).

Используемый в данном документе термин трансформация относится к изменению генетических характеристик клетки, и при этом клетка была подвергнута трансформации, в случае если она была модифицирована, чтобы содержать новую ДНК или РНК. Например, клетка является трансформированной, когда она генетически модифицирована по сравнению с ее нативным состоянием путем введения нового генетического материала посредством трансфекции, трансдукции или других методик. После трансфекции или трансдукции трансформирующая ДНК может подвергаться рекомбинации с ДНК клетки путем физической интеграции в хромосому клетки, или может временно сохраняться в виде эписомального элемента без репликации, или может реплицироваться независимо в качестве плазмиды. Считается, что клетка была подвергнута стабильной трансформации, если трансформирующая ДНК реплицируется при делении клетки.As used herein, the term transformation refers to a change in the genetic characteristics of a cell, and a cell has been transformed if it has been modified to contain new DNA or RNA. For example, a cell is transformed when it is genetically modified from its native state by the introduction of new genetic material through transfection, transduction, or other techniques. Following transfection or transduction, the transforming DNA may recombine with the cell's DNA by physical integration into the cell's chromosome, or may be temporarily maintained as an episomal element without replication, or may replicate independently as a plasmid. A cell is said to have been stably transformed if the transforming DNA replicates upon cell division.

Используемый в данном документе термин трансфекция относится к поглощению клеткой чужеродной или экзогенной ДНК. Целый ряд методик трансфекции хорошо известен из уровня техники и раскрыт в данном документе. См, например, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, выше; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197.As used herein, the term transfection refers to the uptake of foreign or exogenous DNA into a cell. A variety of transfection techniques are well known in the art and are disclosed herein. See, e.g., Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197.

Используемый в данном документе термин трансдукция относится к способу, при котором чужеродную ДНК вводят в клетку с помощью вирусного вектора. См. Jones et al., (1998). Genetics: principles and analysis. Boston: Jones & Bartlett Publ.As used herein, the term transduction refers to the process by which foreign DNA is introduced into a cell using a viral vector. See Jones et al., (1998). Genetics: principles and analysis. Boston: Jones & Bartlett Publ.

Термины клетка или клетки включают любую прокариотическую или эукариотическую клетку. Клетки могут присутствовать либо ex vivo, либо in vitro, либо in vivo, быть либо отдельными, либо частью структуры более высокого уровня организации, такой как ткань или орган. К клеткам относятся клетки-хозяева, также называемые линиями клеток, которые получены методами генной инженерии для экспрессии полипептида, представляющего коммерческий или научный интерес. Клетки-хозяева, как правило, получают из линии, происходящей от первичной культуры, которую можно поддерживать в культуре в течение неограниченного времени. Г енетическое конструирование клетки-хозяина предусматривает трансфекцию, трансформацию или трансдукцию клеток рекомбинантной полинуклеотидной молекулой и/или иное изменение (например, путем гомологичной рекомбинации и активации гена или слияния рекомбинантной клетки с нерекомбинантной клеткой), направленно на то, чтобы клетка-хозяин экспрессировала необходимый рекомбинантный полипептид. Способы и векторы, предназначенные для генетического конструирования клеток и/или линий клеток, чтобы они экспрессировали представляющий интерес полипептид, хорошо известны специалистам в данной области техники; например, различные методики проиллюстрированы в Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1990, и ежеквартальные уточненные варианты); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture,1990, pp. 15-69.The terms cell or cells include any prokaryotic or eukaryotic cell. Cells may be present either ex vivo, in vitro, or in vivo, and may be either isolated or part of a higher-level structure such as a tissue or organ. Cells include host cells, also called cell lines, that have been genetically engineered to express a polypeptide of commercial or scientific interest. Host cells are typically derived from a line derived from a primary culture that can be maintained in culture indefinitely. Genetic engineering of a host cell involves transfecting, transforming, or transducing the cells with a recombinant polynucleotide molecule and/or otherwise altering (e.g., by homologous recombination and gene activation or by fusing a recombinant cell with a non-recombinant cell) to cause the host cell to express the desired recombinant polypeptide. Methods and vectors for genetically engineering cells and/or cell lines to express a polypeptide of interest are well known to those skilled in the art; for example, various techniques are illustrated in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1990, and quarterly revisions); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69.

Клеткой-хозяином может быть любая прокариотическая клетка (например, E. coli) или эукариотическая клетка (например, клетки дрожжей, насекомых или животных (например, клетки СНО)). Векторная ДНК может быть введена в прокариотические или эукариотические клетки с помощью традиционных методик трансформации или трансфекции. Прокариотические клетки-хозяева включают эубактерий, таких как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, представителей Enterobacteriaceae, таких как Escherichia, например E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например Salmonella typhimurium, Serratia, например Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacillus, например B. subtilis и B. licheniformis, Pseudomonas и Streptomyces. Среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев наиболее часто применяются Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи. Однако целый ряд других родов, видов и штаммов являютсяThe host cell may be any prokaryotic cell (e.g., E. coli) or eukaryotic cell (e.g., yeast, insect, or animal cells (e.g., CHO cells)). Vector DNA may be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells using conventional transformation or transfection techniques. Prokaryotic host cells include eubacteria, such as gram-negative or gram-positive organisms, such as members of the Enterobacteriaceae, such as Escherichia, such as E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, such as Salmonella typhimurium, Serratia, such as Serratia marcescans, and Shigella, and Bacillus, such as B. subtilis and B. licheniformis, Pseudomonas, and Streptomyces. Among the lower eukaryotic host microorganisms, Saccharomyces cerevisiae, or common baker's yeast, is the most commonly used. However, a number of other genera, species, and strains are

- 33 049367 общедоступными и применимыми в данном документе, такие как Pichia, например P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, Yarrowia; Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces, например Schwanniomyces occidentalis; и мицелиальные грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и клетки-хозяева рода Aspergillus, как, например, nidulans и niger.- 33 049367 publicly available and applicable herein, such as Pichia, such as P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, Yarrowia; Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces, such as Schwanniomyces occidentalis; and filamentous fungi, such as, for example, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium and host cells of the genus Aspergillus, such as, for example, nidulans and niger.

Линии клеток животных получают из клеток, предшественники которых были получены от многоклеточного животного. Одним типом линии клеток животных является линия клеток млекопитающих. Самые разнообразные линии клеток млекопитающих, подходящие для выращивания в культуре, доступны от Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США) и у коммерческих поставщиков. Примеры линий клеток, обычно применяемых в промышленности, включают линию клеток почек обезьяны CV1, трансформированную с помощью SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию эмбриональных клеток почек человека (293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре (Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59, 1977)); клетки почки детеныша хомячка (BHK, ATCC CCL 10); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы линии buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки гепатомы человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки линии TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68, 1982); клетки MRC 5 или клетки FS4; клетки миеломы млекопитающих и целый ряд других линий клеток, а также клетки яичников китайского хомячка (CHO). Клетки СНО широко применяются для продуцирования сложных рекомбинантных белков. Мутантные линии клеток, дефицитные по дигидрофолатредуктазе (DHFR) (Urlaub et al. (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 42164220), DXB11 и DG-44, являются предпочтительными линиями клеток-хозяев СНО, поскольку эффективная система экспрессии селектируемого и амплифицируемого гена DHFR обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка в этих клетках (Kaufman R. J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). Также включены линии клеток CHOK1SV, нокаутные по глутаминсинтазе (GS), которые позволяют использовать отбор на основе глутаминсинтетазы (GS) с использованием метионинсульфоксимина (MSX). Также включены клетки CHOK1 (ATCC CCL61). Кроме того, с такими клетками легко манипулировать в виде адгезивных или суспензионных культур, и они проявляют относительно хорошую генетическую стабильность. Клетки СНО и белки, рекомбинантно экспрессируемые в них, были всесторонне охарактеризованы и были одобрены регулирующими органами для применения в клиническом коммерческом производстве.Animal cell lines are derived from cells whose progenitors were derived from a multicellular animal. One type of animal cell line is a mammalian cell line. A wide variety of mammalian cell lines suitable for growth in culture are available from the American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) and from commercial suppliers. Examples of cell lines commonly used in industry include the monkey kidney cell line CV1 transformed with SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); the human embryonic kidney cell line (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture (Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59, 1977)); baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10); mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243–251, 1980); monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70); African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587); human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); dog kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human hepatoma cells (Hep G2, HB 8065); mouse mammary tumor cells (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI cells (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68, 1982); MRC 5 cells or FS4 cells; mammalian myeloma cells and a variety of other cell lines, as well as Chinese hamster ovary (CHO) cells. CHO cells are widely used for the production of complex recombinant proteins. The dihydrofolate reductase (DHFR)-deficient mutant cell lines (Urlaub et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 42164220), DXB11 and DG-44, are the preferred CHO host cell lines because the efficient expression system of the selectable and amplifiable DHFR gene provides high levels of recombinant protein expression in these cells (Kaufman R. J. (1990) Meth Enzymol 185:537-566). Also included are the CHOK1SV glutamine synthase (GS) knockout cell lines, which allow the use of GS-based selection using methionine sulfoximine (MSX). Also included are CHOK1 (ATCC CCL61) cells. In addition, these cells are easily manipulated as adherent or suspension cultures and exhibit relatively good genetic stability. CHO cells and the proteins recombinantly expressed in them have been extensively characterized and have been approved by regulatory agencies for use in clinical commercial production.

Клетки также могут включать мононуклеарные клетки, мононуклеарные клетки периферической крови, мононуклеарные костного мозга, мононуклеарные клетки, полученные из пуповинной крови, лимфоциты, моноциты, дендритные клетки, макрофаги, Т-клетки, наивные Т-клетки, Т-клетки памяти, CD28+ клетки, CD4+ клетки, CD8+ клетки, CD45RA+ клетки, CD45RO+ клетки, натуральные киллеры, гемопоэтические стволовые клетки, плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или их комбинации. В частности, клетки могут быть собраны у донора или субъекта с целью генетической модификации и повторного введения клеток донору или субъекту.The cells may also include mononuclear cells, peripheral blood mononuclear cells, bone marrow mononuclear cells, cord blood-derived mononuclear cells, lymphocytes, monocytes, dendritic cells, macrophages, T cells, naive T cells, memory T cells, CD28+ cells, CD4+ cells, CD8+ cells, CD45RA+ cells, CD45RO+ cells, natural killer cells, hematopoietic stem cells, pluripotent embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, or combinations thereof. In particular, the cells may be collected from a donor or subject for the purpose of genetically modifying and reintroducing the cells into the donor or subject.

В одном варианте осуществления предусмотрена клетка, трансфицированная транспозазой piggyBac, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена клетка, трансфицированная транспозазой piggyBac, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или 18. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена клетка, трансфицированная вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена клетка, подвергнутая трансфекции сконструированной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, и вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена клетка, подвергнутая совместной трансфекции вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, и вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена клетка, подвергнутая трансфекции вектором, содержащим сконструированной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В родственном варианте осуществления клетка представляет собой линию клеток. В родственном варианте осуществления клетка представляет собой клетку-хозяина. В родственном вариантеIn one embodiment, a cell is transfected with a piggyBac transposase encoded by a nucleic acid sequence as described herein. In one embodiment, the present invention provides a cell transfected with a piggyBac transposase encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 18. In one embodiment, the present invention provides a cell transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase as described herein. In one embodiment, the present invention provides a cell transfected with an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase as described herein and a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon. In another embodiment, the present invention provides a cell that has been co-transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein and a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In one embodiment, the present invention provides a cell that has been transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein and a nucleic acid molecule encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In a related embodiment, the cell is a cell line. In a related embodiment, the cell is a host cell. In a related embodiment

- 34 049367 осуществления клетка представляет собой клетку CHO. В родственном варианте осуществления клетка представляет собой иммунную клетку. В родственном варианте осуществления титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции сконструированной транспозазой piggyBac, увеличен по сравнению с титром представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac. В одном варианте осуществления предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO:18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18.- 34 049 367 embodiment, the cell is a CHO cell. In a related embodiment, the cell is an immune cell. In a related embodiment, the titer of the recombinant protein of interest expressed by a cell transfected with an engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by a cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or lacking a piggyBac transposase. In one embodiment, an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase as described herein is provided. In one embodiment, a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. In another aspect, the present invention provides piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 18.

В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, содержащая аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 и/или аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере две из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В другом родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит замену изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, замену изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и замену серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющаяIn one embodiment, a piggyBac transposase is provided comprising an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 and/or an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least one of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least two of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In another related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine substitution at position 147 of SEQ ID NO: 2, an isoleucine to leucine substitution at position 247 of SEQ ID NO: 2, and a serine to threonine substitution at position 533 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present The invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having

- 35 049367 аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.- 35 049367 amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено конструирование молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, для повышения стабильности в клетке и трансфекция клетки вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую сконструированную транспозазу piggyBac, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac, где титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции сконструированной транспозазой piggyBac, увеличен по сравнению с титром представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac. В одном варианте осуществления предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18.In one embodiment, the present invention provides for engineering a nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase to enhance stability in a cell and transfecting the cell with a vector comprising the engineered nucleic acid molecule encoding the engineered piggyBac transposase and a nucleic acid molecule encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon, wherein the titer of the recombinant protein of interest expressed by a cell transfected with the engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by a cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or lacking the piggyBac transposase. In one embodiment, an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein is provided. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 18.

В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, содержащая аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 и/или аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере две из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В другом родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит замену изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, замену изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и замену серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретенияIn one embodiment, a piggyBac transposase is provided comprising an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 and/or an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least one of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least two of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In another related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine substitution at position 147 of SEQ ID NO: 2, an isoleucine to leucine substitution at position 247 of SEQ ID NO: 2, and a serine to threonine substitution at position 533 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16 is provided. In another aspect of the present invention,

- 36 049367 предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:4. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.- 36 049367 provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено конструирование молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, для повышения стабильности в клетке и совместная трансфекция клетки вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую сконструированную транспозазу piggyBac, и вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac, где титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции сконструированной транспозазой piggyBac, увеличен по сравнению с титром представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac.In one embodiment, the present invention provides for engineering a nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase to enhance stability in a cell and co-transfecting a cell with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding an engineered piggyBac transposase and a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon, wherein the titer of the recombinant protein of interest expressed by a cell transfected with the engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by a cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or lacking a piggyBac transposase.

Также предусмотрена клетка-хозяин, подвергнутая трансфекции вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок, которая при культивировании в соответствующих условиях экспрессирует представляющий интерес белок. Экспрессированный белок впоследствии может быть собран из культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или непосредственно из клетки-хозяина, продуцирующей его (если он не секретируется). Выбор подходящей клетки-хозяина будет зависеть от различных факторов, таких как требуемые уровни экспрессии, модификации полипептидов, которые требуются или необходимы для активности (такие как гликозилирование или фосфорилирование), и простота фолдинга в биологически активную молекулу.Also provided is a host cell transfected with a vector comprising a nucleic acid encoding a protein of interest, which, when cultured under appropriate conditions, expresses the protein of interest. The expressed protein can then be collected from the culture medium (if the host cell secretes it into the medium) or directly from the host cell producing it (if it is not secreted). The choice of a suitable host cell will depend on various factors, such as the levels of expression desired, the modifications of the polypeptides that are required or essential for activity (such as glycosylation or phosphorylation), and the ease of folding into a biologically active molecule.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен представляющий интерес рекомбинантный белок, экспрессируемый клеткой, подвергнутой трансфекции вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена клетка, подвергнутая трансфекции вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, при этом вектор дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен представляющий интерес рекомбинантный белок, экспрессируемый клеткой, подвергнутой совместной трансфекции вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, и вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac.In one embodiment, the present invention provides a recombinant protein of interest expressed by a cell transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein. In one embodiment, the present invention provides a cell transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein, wherein the vector further comprises a nucleic acid sequence encoding the protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In one embodiment, the present invention provides a recombinant protein of interest expressed by a cell co-transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein and a vector comprising a nucleic acid molecule encoding the protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая представляющий интерес рекомбинантный белок, экспрессируемый клеткойхозяином, подвергнутой трансфекции вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена клетка-хозяин, подвергнутая трансфекции вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, при этом вектор дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая представляющий интерес рекомбинантный белок, экспрессируемый клеткойхозяином, подвергнутой совместной трансфекции вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, и вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок,In one embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein. In one embodiment, the present invention provides a host cell transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein, wherein the vector further comprises a nucleic acid sequence encoding the protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising a recombinant protein of interest expressed by a host cell co-transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein and a vector comprising a nucleic acid molecule encoding the protein of interest,

- 37 049367 фланкированную по меньшей мере 5'- и З'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac.- 37 049367 flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

Под культурой или культивированием подразумевают рост и размножение клеток за пределами многоклеточного организма или ткани. Подходящие условия культивирования для клеток млекопитающих известны из уровня техники. Среды для культивирования клеток и среды для культивирования тканей используются взаимозаменяемо для обозначения сред, пригодных для выращивания клетки-хозяина во время культивирования клеток in vitro. Как правило, среды для культивирования клеток содержат буфер, соли, источник энергии, аминокислоты, витамины и необходимые микроэлементы. Можно применять любую среду, способную поддерживать рост соответствующей клетки-хозяина в культуре. Среды для культивирования клеток, которые могут быть дополнительно дополнены другими компонентами для максимального увеличения роста клеток, жизнеспособности клеток и/или продуцирования рекомбинантного белка в конкретной культивируемой клетке-хозяине, коммерчески доступны и включают, среди прочего, среду RPMI-1640, среду RPMI-1641, модифицированную по Дульбекко среду Игла (DMEM), минимально обогащенную среду Игла, среду F12K, среду Хэма F12, модифицированную по Искову среду Дульбекко, среду МакКоя 5A, среду Лейбовица L-15, а также бессывороточные среды, такие как EX-CELL™ 300 Series, которые можно приобрести у Американской коллекции типовых культур или SAFC Biosciences, а также у других поставщиков. Среды для культивирования клеток могут представлять собой бессывороточные среды, безбелковые среды, среды, не содержащие факторов роста и/или пептона. Культуру клеток также можно обогатить путем добавления питательных веществ и их использовать их в концентрациях, превышающих обычные рекомендуемые.Culture or culturing refers to the growth and reproduction of cells outside of a multicellular organism or tissue. Suitable culture conditions for mammalian cells are known in the art. Cell culture media and tissue culture media are used interchangeably to refer to media suitable for growing a host cell during in vitro cell culture. Cell culture media typically contain a buffer, salts, an energy source, amino acids, vitamins, and essential trace elements. Any medium capable of supporting the growth of the appropriate host cell in culture can be used. Cell culture media, which may be further supplemented with other components to maximize cell growth, cell viability, and/or recombinant protein production in a particular host cell being cultured, are commercially available and include, but are not limited to, RPMI-1640 medium, RPMI-1641 medium, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Eagle's minimally enriched medium, F12K medium, Ham's F12 medium, Iscove's modified Dulbecco's medium, McCoy's 5A medium, Leibovitz's L-15 medium, and serum-free media such as EX-CELL™ 300 Series, which are available from the American Type Culture Collection or SAFC Biosciences, as well as other suppliers. Cell culture media may be serum-free media, protein-free media, media containing no growth factors and/or no peptone. Cell culture can also be enriched by adding nutrients and using them at concentrations higher than those normally recommended.

В течение жизненного цикла культуры можно применять различные составы сред, например, для облегчения перехода от одной стадии (например, стадии или фазы роста) к другой (например, стадии или фазы продуцирования) и/или для оптимизации условий во время культивирования клеток (например, концентрированная среда, подаваемая во время перфузионного культивирования). Состав ростовой среды можно использовать для содействия росту клеток и сведения к минимуму экспрессии белка. Состав среды для продуцирования можно использовать для содействия продуцированию представляющего интерес белка и поддержания клеток при минимальном росте новых клеток. Питательную среду, как правило среду, содержащую более концентрированные компоненты, такие как питательные вещества и аминокислоты, которые потребляются в ходе продуктивной фазы культуры клеток, можно использовать для дополнения и поддержания активной культуры, в частности культуры, эксплуатируемой в режиме подпитки, полуперфузионном или перфузионном режиме. Такая концентрированная питательная среда может содержать большинство компонентов среды для культивирования клеток в количестве, составляющем, например приблизительно 5^х, 6^х, 7^х, 8^х, 9^х, 10^х, 12^х, 14х, 16х, 20х, 30х, 50х, 100х, 200х, 400х, 600х, 800х или даже приблизительно 1000х от их обычного количества.During the life cycle of a culture, different media compositions can be used, for example, to facilitate the transition from one stage (e.g., a growth stage or phase) to another (e.g., a production stage or phase) and/or to optimize conditions during cell culture (e.g., a concentrated medium supplied during perfusion culture). A growth medium composition can be used to promote cell growth and minimize protein expression. A production medium composition can be used to promote the production of a protein of interest and maintain the cells while minimizing new cell growth. A growth medium, typically a medium containing more concentrated components such as nutrients and amino acids that are consumed during the production phase of a cell culture, can be used to supplement and maintain an active culture, in particular a culture operated in fed-batch, semi-perfusion, or perfusion mode. Such a concentrated nutrient medium may contain most of the components of the cell culture medium in an amount of, for example, about ^5x , ^6x , ^7x , ^8x , ^9x , ^10x , ^12x , 14x, 16x, 20x, 30x, 50x, 100x, 200x, 400x, 600x, 800x or even about 1000x their usual amount.

Ростовая фаза может происходить при более высокой температуре, чем продуктивная фаза. Например, ростовая фаза может происходить при первой температуре от приблизительно 35 до приблизительно 38°C, а продуктивная фаза может происходить при второй температуре от приблизительно 29 до приблизительно 37°C, необязательно от приблизительно 30 до приблизительно 36°C или от приблизительно 30 до приблизительно 34°C. Химические индукторы продуцирования белка, такие как, например, кофеин, бутират и гексаметилен-бисацетамид (HMBA), можно добавлять одновременно, до и/или после изменения температуры или вместо изменения температуры. Если индукторы добавляют после изменения температуры, их можно добавлять через промежуток времени от одного часа до пяти дней после изменения температуры, необязательно от одного до двух дней после изменения температуры.The growth phase may occur at a higher temperature than the production phase. For example, the growth phase may occur at a first temperature of about 35 to about 38°C, and the production phase may occur at a second temperature of about 29 to about 37°C, optionally about 30 to about 36°C or about 30 to about 34°C. Chemical inducers of protein production, such as, for example, caffeine, butyrate and hexamethylene bisacetamide (HMBA), can be added simultaneously, before and/or after the temperature change, or instead of the temperature change. If the inducers are added after the temperature change, they can be added after a period of time from one hour to five days after the temperature change, optionally from one to two days after the temperature change.

Клетки-хозяева можно культивировать в суспензии или в адгезивной форме, прикрепленными к твердому субстрату. Культуры клеток можно создавать в биореакторах с псевдоожиженным слоем, половолоконных биореакторах, роллерных флаконах, встряхиваемых колбах или биореакторах с перемешиванием, содержащих микроносители или без них.Host cells can be cultured in suspension or in adherent form, attached to a solid substrate. Cell cultures can be established in fluidized bed bioreactors, hollow fiber bioreactors, roller bottles, shake flasks, or stirred tank bioreactors, with or without microcarriers.

Культуры клеток можно эксплуатировать в периодическом режиме, в режиме подпитки, в непрерывном, полунепрерывном или перфузионном режиме. Клетки млекопитающих, такие как клетки СНО, можно культивировать в биореакторах d небольшом масштабе от менее 100 мл до менее 1000 мл, в более среднем масштабе с емкостью до более 2000 л и в более крупном масштабе, где емкость может превышать 20000 л. Средние и крупномасштабные культуры клеток, как, например, для клинического и/или коммерческого биопроизводства средств терапии на основе белка, можно поддерживать в течение недель и даже месяцев, пока клетки продуцируют требуемый(ые) белок(белки).Cell cultures can be operated in batch, fed-batch, continuous, semi-continuous, or perfusion modes. Mammalian cells, such as CHO cells, can be cultured in bioreactors at small scales of less than 100 ml to less than 1000 ml, at medium scales with capacities up to greater than 2000 L, and at larger scales where capacities can exceed 20,000 L. Medium and large scale cell cultures, such as for clinical and/or commercial biomanufacturing of protein-based therapeutics, can be maintained for weeks or even months while the cells produce the desired protein(s).

Затем полученный экспрессированный рекомбинантный белок можно собрать из среды для культивирования клеток. Способы сбора белка из суспензионных клеток известны из уровня техники и включают без ограничения кислотное осаждение, ускоренное осаждение, такое как флокуляция, разделение под действием силы тяжести, центрифугирование, разделение акустическими волнами, фильтрацию, в том числе мембранную фильтрацию с использованием ультрафильтров, микрофильтров, фильтров с тангенциальным потоком, альтернативных фильтров с тангенциальным потоком, глубинныхThe resulting expressed recombinant protein can then be collected from the cell culture medium. Methods for collecting protein from suspension cells are known in the art and include, but are not limited to, acid precipitation, accelerated sedimentation such as flocculation, gravity separation, centrifugation, acoustic wave separation, filtration, including membrane filtration using ultrafilters, microfilters, tangential flow filters, alternative tangential flow filters, depth

- 38 049367 фильтров и намывных фильтров. Рекомбинантные белки, экспрессируемые прокариотами, извлекают из телец включения в цитоплазме с помощью способов, предусматривающих процессы окислительновосстановительного фолдинга, известные в данной области техники.- 38 049367 filters and pre-wash filters. Recombinant proteins expressed by prokaryotes are recovered from inclusion bodies in the cytoplasm using methods that involve redox folding processes known in the art.

Собранный белок затем можно подвергнуть очистке или частичной очистке от любых примесей, таких как оставшаяся среда для культивирования клеток, клеточные экстракты, нежелательные компоненты, белки клетки-хозяина, неправильно экспрессированные белки и т.п., с применением одной или нескольких типовых операций. Термин типовая операция относится к функциональной стадии, которую выполняют как часть процесса очистки представляющего интерес рекомбинантного белка. Например, типовая операция может включать такие стадии, как без ограничения захват, очистка, доочистка, инактивация вируса, удаление вируса путем фильтрации, концентрирование и/или составление представляющего интерес рекомбинантного белка. Типовые операции могут быть спланированы для достижения одной цели или нескольких целей, таких как стадии захвата и дезактивации вирусов. Типовые операции также могут включать стадии удержания или хранения между стадиями обработки.The collected protein may then be purified or partially purified from any impurities such as residual cell culture medium, cell extracts, unwanted components, host cell proteins, misexpressed proteins, etc., using one or more unit operations. The term unit operation refers to a functional step that is performed as part of the process of purifying a recombinant protein of interest. For example, a unit operation may include steps such as, but not limited to, capture, purification, polishing, virus inactivation, virus filtration removal, concentration, and/or formulation of the recombinant protein of interest. Unit operations may be designed to achieve a single purpose or multiple purposes, such as virus capture and inactivation steps. Unit operations may also include retention or storage steps between processing steps.

Типовая операция захвата может включать хроматографический захват, при котором применяют смолы и/или мембраны, содержащие средства, которые будут связываться с представляющим интерес рекомбинантным белком, например аффинную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий (HIC), аффинную хроматографию на иммобилизованных ионах металла (IMAC) и т.п. Такие материалы известны в данной области техники и являются коммерчески доступными. Например, в аффинной хроматографии могут использоваться механизмы захвата на основе связывания с антителом или фрагментом антитела, такие как связывание с белком A, белком G, белком A/G, белком L. Представляющий интерес рекомбинантный белок можно пометить полигистидиновой меткой, а затем очистить из IMAC с применением, или эпитопом, таким как FLAG®, а затем очистить с применением специфического антитела, нацеленного на такой эпитоп.A typical capture operation may include chromatographic capture, which uses resins and/or membranes containing agents that will bind to the recombinant protein of interest, such as affinity chromatography, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography (HIC), immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC), and the like. Such materials are known in the art and are commercially available. For example, affinity chromatography may use capture mechanisms based on binding to an antibody or antibody fragment, such as binding to protein A, protein G, protein A/G, protein L. The recombinant protein of interest may be tagged with a polyhistidine tag and then purified from IMAC using, or an epitope such as FLAG® and then purified using a specific antibody targeting such an epitope.

Типовые операции, включающие инактивацию, уменьшение и/или устранение вирусных контаминантов, могут включать процессы, при которых проводят манипуляции со окружающей средой, и/или фильтрацию. Одним способом достижения инактивации вируса является инкубация при низком pH (например, pH <4) или других условиях раствора, таких как температура или химический состав, для достижения инактивации вируса. После инактивации вируса с помощью низкого pH может следовать типовая операция нейтрализации, при которой раствор с инактивированными вирусами повторно доводят до pH, более совместимого с требованиями следующих типовых операций. За ней также может следовать фильтрация, такая как глубинная фильтрация, для удаления любого образовавшегося помутнения или осадка. Удаление вируса путем фильтрации можно осуществить с помощью микро- или нанофильтров, таких как доступные от Asahi Kasei (Plavona®) и EDM Millipore (VPro®).Unit operations involving the inactivation, reduction, and/or elimination of viral contaminants may include processes that involve environmental manipulation and/or filtration. One way to achieve viral inactivation is by incubation at low pH (e.g., pH < 4) or other solution conditions such as temperature or chemical composition to achieve viral inactivation. Viral inactivation by low pH may be followed by a neutralization unit operation in which the solution with inactivated viruses is readjusted to a pH more compatible with the requirements of the following unit operations. This may also be followed by filtration, such as depth filtration, to remove any turbidity or sediment that has formed. Viral removal by filtration can be accomplished using micro- or nanofilters such as those available from Asahi Kasei (Plavona®) and EDM Millipore (VPro®).

В типовой операции доочистки можно применять различные способы хроматографии для очистки представляющего интерес белка и устранения загрязнений и примесей, таких как ДНК, белки клеткихозяина; удаления специфических для продукта примесей, вариантов продукта и агрегатов, адсорбции вирусов и т.п. В типовой операции хроматографической доочистки применяют смолы и/или мембраны, содержащие средства, которые можно применять либо в проточном режиме (когда представляющий интерес белок содержится в элюенте, а загрязнения и примеси связаны с хроматографической средой), либо в режиме связывания и элюирования, когда представляющий интерес белок связывается с хроматографической средой и элюируется после того, как загрязнители и примеси протекли через хроматографическую среду или были вымыты из нее. В качестве нескольких примеров такие хроматографические способы включают ионообменную хроматографию (IEX), такую как анионообменная хроматография (AEX) и катионообменная хроматография (CEX); хроматографию гидрофобных взаимодействий (HIC); смешанную модальную или мультимодальную хроматографию (MM), хроматографию на гидроксиапатите (HA); обращенно-фазовую хроматографию и гельфильтрацию.In a typical polishing operation, various chromatographic techniques may be used to purify the protein of interest and remove contaminants and impurities such as DNA, host cell proteins, remove product-specific impurities, product variants and aggregates, adsorb viruses, etc. A typical chromatographic polishing operation employs resins and/or membranes containing agents that can be used in either a flow-through mode (where the protein of interest is contained in the eluent and the contaminants and impurities are bound to the chromatographic medium) or a bind and elute mode where the protein of interest is bound to the chromatographic medium and eluted after the contaminants and impurities have flowed through or been washed out of the chromatographic medium. Some examples of such chromatographic techniques include ion exchange chromatography (IEX), such as anion exchange chromatography (AEX) and cation exchange chromatography (CEX); hydrophobic interaction chromatography (HIC); mixed modal or multimodal chromatography (MM), chromatography on hydroxyapatite (HA); reversed-phase chromatography and gel filtration.

Концентрирование продукта и замену буфера у представляющего интерес белка на требуемый буфер для составления, предназначенный для хранения лекарственного вещества в нерасфасованном виде, можно осуществлять с помощью ультрафильтрации и диафильтрации.Concentration of the product and buffer exchange of the protein of interest with the desired formulation buffer intended for storage of the bulk drug substance can be accomplished by ultrafiltration and diafiltration.

Важные характеристики и рабочие параметры можно измерять для принятия лучших взвешенных решений, касающихся работы каждой стадии во время производства. Эти важные характеристики и параметры можно отслеживать в режиме реального времени, в режиме практически реального времени и/или постфактум. Можно измерять такие ключевые важные параметры, как компоненты среды, которые потребляются (например, глюкоза), уровни накапливаемых побочных продуктов метаболизма (таких как лактат и аммиак), а также параметры, связанные с поддержанием и выживанием клеток, такие как содержание растворенного кислорода. Во время и после процесса можно отслеживать такие важные характеристики, как удельная продуктивность, плотность жизнеспособных клеток, pH, осмоляльность, внешний вид, цвет, агрегация, процент выхода и титр. Отслеживание и измерения можно проводить с помощью известных методик и коммерчески доступного оборудования.Important characteristics and operating parameters can be measured to make better informed decisions regarding the operation of each step during production. These important characteristics and parameters can be monitored in real-time, near real-time, and/or post-hoc. Key important parameters can be measured such as media components that are consumed (e.g., glucose), levels of accumulated metabolic by-products (e.g., lactate and ammonia), and parameters related to cell maintenance and survival such as dissolved oxygen. Important characteristics such as specific productivity, viable cell density, pH, osmolality, appearance, color, aggregation, percent recovery, and titer can be monitored during and after the process. Monitoring and measurement can be performed using known methodologies and commercially available equipment.

- 39 049367- 39 049367

Титры можно измерять с применением способов, известных из уровня техники. Например, титр можно измерять с помощью анализа на основе обращенно-фазовой HPLC с применением аффинной хроматографии, где белок А иммобилизован на носителе колонки. При нейтральном pH молекулы антитела связываются с белком А благодаря Fc-области, тогда как белки клетки-хозяина, компоненты кондиционированной среды и буфер элюируются из колонки в элюате. Захваченные антитела элюируют при кислом pH и детектируют по УФ-поглощению при 280 нм. Калибровочную кривую можно построить по результатам универсального стандарта антитела и соответствующих площадей пиков с использованием линейного регрессионного анализа. Затем рассчитывают концентрацию антитела в тестируемых образцах по калибровочной кривой и соотношению коэффициентов экстинкции универсального стандарта антитела и тестируемого антитела.Titers can be measured using methods known in the art. For example, the titer can be measured using a reversed-phase HPLC assay using affinity chromatography, where protein A is immobilized on a column carrier. At neutral pH, antibody molecules bind to protein A via the Fc region, while host cell proteins, conditioned medium components, and buffer elute from the column in the eluate. The captured antibodies are eluted at acidic pH and detected by UV absorbance at 280 nm. A calibration curve can be constructed from the results of the universal antibody standard and the corresponding peak areas using linear regression analysis. The concentration of the antibody in the test samples is then calculated from the calibration curve and the ratio of the extinction coefficients of the universal antibody standard and the test antibody.

К другим способам относятся без ограничения ELISA; HTRF (гомогенная флуоресценция с временным разрешением) (Cisbio US, Бедфорд, Массачусетс, США) и платформа Berkley Lights Beacon (Эмеривилл, Калифорния, США).Other methods include but are not limited to ELISA; HTRF (homogeneous time-resolved fluorescence) (Cisbio US, Bedford, MA, USA) and the Berkley Lights Beacon platform (Emeryville, CA, USA).

Также предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие представляющий интерес рекомбинантный белок, экспрессируемый клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac. Такие фармацевтические композиции включают представляющий интерес белок или клетки, экспрессирующие представляющий интерес белок, такие как иммунная клетка, экспрессирующая CAR и TCR, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями. Такие композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный забуференный солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатирующие средства, такие как EDTA или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия) и консерванты.Also provided are pharmaceutical compositions comprising a recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase. Such pharmaceutical compositions include a protein of interest or cells expressing a protein of interest, such as an immune cell expressing a CAR and a TCR, in combination with one or more pharmaceutically or physiologically acceptable carriers, diluents or excipients. Such compositions may contain buffers such as neutral buffered saline, phosphate buffered saline and the like; carbohydrates such as glucose, mannose, sucrose or dextrans, mannitol; proteins; polypeptides or amino acids such as glycine; antioxidants; chelating agents such as EDTA or glutathione; adjuvants (eg, aluminum hydroxide) and preservatives.

Фармацевтические композиции (растворы, суспензии и т.п.) могут включать одно или несколько из следующего: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический солевой раствор, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия, нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить растворителем или суспендирующей средой, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства, регулирующие тоничность, такие как хлорид натрия или декстроза. Препарат для парентерального введения можно заключать в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с несколькими дозами, выполненные из стекла или пластика.Pharmaceutical compositions (solutions, suspensions, etc.) may include one or more of the following: sterile diluents such as water for injection, saline solution, preferably physiological saline solution, Ringer's solution, isotonic sodium chloride solution, fixed oils such as synthetic mono- or diglycerides which can serve as a solvent or suspending medium, polyethylene glycols, glycerol, propylene glycol or other solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methylparaben; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; buffers such as acetates, citrates or phosphates, and tonicity adjusting agents such as sodium chloride or dextrose. The drug for parenteral administration can be contained in ampoules, disposable syringes or multi-dose vials made of glass or plastic.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ увеличения титра представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, предусматривающий конструирование молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, для увеличения стабильности в клетке-хозяине; совместную трансфекцию клетки-хозяина сконструированной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, и вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и З'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac; и культивирование клеток для осуществления экспрессии представляющего интерес рекомбинантного белка; при этом титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткойхозяином, подвергнутой трансфекции сконструированной piggyBac, увеличивается по сравнению с титром представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac. В родственном варианте осуществления клетку-хозяина подвергают трансфекции первым вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, и вторым вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и З'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В родственном варианте осуществления клетку-хозяина подвергают трансфекции одним вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и З'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретенияIn one embodiment, the present invention provides a method for increasing the titer of a recombinant protein of interest expressed by a host cell, comprising engineering a nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase to increase stability in the host cell; co-transfecting the host cell with the engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase and a vector comprising a nucleic acid sequence encoding the protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon; and culturing the cells to express the recombinant protein of interest; wherein the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with the engineered piggyBac is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or lacking the piggyBac transposase. In a related embodiment, the host cell is transfected with a first vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase and a second vector comprising a nucleic acid sequence encoding the protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In a related embodiment, a host cell is transfected with a single vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon. In one embodiment, an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase is provided, as described herein. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention

-40049367 предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18.-40049367 provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the sequence nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 18.

В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, содержащая аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO:2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 и/или аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере две из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В другом родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит замену изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, замену изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и замену серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.In one embodiment, a piggyBac transposase is provided comprising an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533, and 573 of SEQ ID NO:2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221 and 247 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine amino acid substitution at one or more of positions 429, 533 and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221 and 247 and/or an serine to threonine amino acid substitution at one or more of positions 429, 533 and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least one of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 in SEQ ID NO: 2, an isoleucine to leucine at position 247 in SEQ ID NO: 2, and a serine to threonine at position 533 in SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least two of the following amino acid substitutions: an isoleucine to leucine at position 147 in SEQ ID NO: 2, an isoleucine to leucine at position 247 in SEQ ID NO: 2, and a serine to threonine at position 533 in SEQ ID NO: 2. In another related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine substitution at position 147 in SEQ ID NO: 2, an isoleucine to leucine substitution at position 247 in SEQ ID NO: 2, and a serine to threonine substitution at position 533 in SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the transposase is provided piggyBac having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In another aspect, the present invention a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is provided. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 is provided. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 is provided. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is provided. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 is provided. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 is provided.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ увеличения продуцирования рекомбинантного белка в культуре клеток млекопитающих, экспрессирующих рекомбинантный белок, предусматривающий создание культуры клеток в биореакторе с использованием клетки-хозяина, которая была подвергнута совместной трансфекции молекулой нуклеиновой кислоты, сконструированной для увеличения стабильности в клетке-хозяине, и вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мереIn one embodiment of the present invention, there is provided a method for increasing the production of a recombinant protein in a mammalian cell culture expressing the recombinant protein, comprising establishing a cell culture in a bioreactor using a host cell that has been co-transfected with a nucleic acid molecule engineered to increase stability in the host cell and a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a protein of interest flanked by at least

- 41 049367 элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac; и осуществление экспрессии представляющего интерес рекомбинантного белка; где титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции сконструированной piggyBac, увеличивается по сравнению с титром представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac. В родственном варианте осуществления клетку-хозяина подвергают трансфекции первым вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, и вторым вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В родственном варианте осуществления клетку-хозяина подвергают трансфекции одним вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В одном варианте осуществления предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18.- 41 049 367 piggyBac transposon inverted repeat elements; and expressing a recombinant protein of interest; wherein the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with the engineered piggyBac is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or lacking the piggyBac transposase. In a related embodiment, the host cell is transfected with a first vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase and a second vector comprising a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' piggyBac transposon inverted repeat elements. In a related embodiment, the host cell is transfected with a single vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In one embodiment, an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase is provided, as described herein. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 18.

В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, содержащая аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 и/или аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере две из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO:2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В другом родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит замену изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, замену изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и замену серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозазаIn one embodiment, a piggyBac transposase is provided comprising an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 and/or an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least one of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least two of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In another related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine substitution at position 147 of SEQ ID NO: 2, an isoleucine to leucine substitution at position 247 of SEQ ID NO: 2, and a serine to threonine substitution at position 533 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8. In another aspect, the present invention provides a transposase

- 42 049367 piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.- 42 049 367 piggyBac having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения выделенного, очищенного представляющего интерес рекомбинантного белка, предусматривающий создание культуры клеток в биореакторе с использованием клетки-хозяина, экспрессирующей представляющий интерес рекомбинантный белок, где линия клеток была подвергнута совместной трансфекции последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке-хозяине, и вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac; культивирование клеток для осуществления экспрессии представляющего интерес рекомбинантного белка; сбор представляющего интерес рекомбинантного белка, обработку представляющего интерес рекомбинантного белка посредством одной или нескольких типовых операций и получение выделенного, очищенного, представляющего интерес рекомбинантного белка. В родственном варианте осуществления клетку-хозяина подвергают трансфекции первым вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, и вторым вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В родственном варианте осуществления клетку-хозяина подвергают трансфекции одним вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. В родственном варианте осуществления по меньшей мере одна типовая операция представляет собой стадию хроматографического захвата, выбранную из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, мультимодальной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий и хроматографии на гидроксиапатите. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна типовая операция представляет собой стадию хроматографической доочистки, выбранную из ионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, мультимодальной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий и хроматографии на гидроксиапатите. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна типовая операция выбрана из инактивации вируса, удаления вируса путем фильтрации, глубинной фильтрации и UF/DF. В родственном варианте осуществления титр представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции сконструированной транспозазой piggyBac, увеличен по сравнению с титром представляющего интерес рекомбинантного белка, экспрессируемого клеткой-хозяином, подвергнутой трансфекции транспозазой piggyBac дикого типа или не содержащей транспозазу piggyBac. В другом варианте осуществления предусмотрен выделенный, очищенный представляющий интерес рекомбинантный белок, полученный с помощью способа. В другом варианте осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая выделенный представляющий интерес белок. В одном варианте осуществления предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностьюIn one embodiment of the present invention, there is provided a method for producing an isolated, purified recombinant protein of interest, comprising establishing a cell culture in a bioreactor using a host cell expressing a recombinant protein of interest, wherein the cell line has been co-transfected with a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in the host cell and a vector comprising a nucleic acid sequence encoding the protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon; culturing the cells to express the recombinant protein of interest; collecting the recombinant protein of interest, processing the recombinant protein of interest by one or more unit operations, and obtaining the isolated, purified recombinant protein of interest. In a related embodiment, the host cell is transfected with a first vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase and a second vector comprising a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In a related embodiment, the host cell is transfected with a single vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. In a related embodiment, the at least one unit operation is a chromatographic capture step selected from affinity chromatography, ion exchange chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, multimodal chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and hydroxyapatite chromatography. In another embodiment, the at least one unit operation is a chromatographic polishing step selected from ion exchange chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, multimodal chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and hydroxyapatite chromatography. In another embodiment, the at least one unit operation is selected from virus inactivation, virus removal by filtration, depth filtration, and UF/DF. In a related embodiment, the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with the engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or lacking the piggyBac transposase. In another embodiment, an isolated, purified recombinant protein of interest produced by the method is provided. In another embodiment, a pharmaceutical composition comprising the isolated protein of interest is provided. In one embodiment, an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein is provided. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the sequence

- 43 049367 нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18.- 43 049 367 nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of under SEQ ID NO: 13. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence under SEQ ID NO: 15. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence under SEQ ID NO: 17. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence under SEQ ID NO: 18.

В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, содержащая аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 и/или аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере две из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В другом родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит замену изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, замену изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и замену серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.In one embodiment, a piggyBac transposase is provided comprising an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 and/or an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least one of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least two of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In another related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine substitution at position 147 of SEQ ID NO: 2, an isoleucine to leucine substitution at position 247 of SEQ ID NO: 2, and a serine to threonine substitution at position 533 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present The invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having amino acid sequence under SEQ ID NO: 16.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен набор для трансфекции клетки, содержащий вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке-хозяине, и вектор, содержащий по меньшей мере минимальные элементы инвертированных повторов транспозона piggyBac, в который встроена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая представляющий интерес белок. В одном варианте осуществления предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновойIn one embodiment, the present invention provides a cell transfection kit comprising a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in a host cell and a vector comprising at least minimal elements of the piggyBac transposon inverted repeats into which a nucleic acid sequence encoding a protein of interest has been inserted. In one embodiment, an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein is provided. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of

- 44 049367 кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18.- 44 049 367 acids of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the sequence nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17. In another aspect, the present invention provides a piggyBac, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 18.

В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, содержащая аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 и/или аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере две из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В другом родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит замену изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, замену изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO:2 и замену серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO:2. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.In one embodiment, a piggyBac transposase is provided comprising an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 and/or an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least one of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least two of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In another related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine substitution at position 147 in SEQ ID NO: 2, a substitution of isoleucine to leucine at position 247 in SEQ ID NO: 2, and a substitution of serine to threonine at position 533 in SEQ ID NO: 2. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8. In another aspect, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12. In another aspect, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

Транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, можно применять как часть системы транспозона piggyBac для переносов генов; получения линий клеток; применений, связанных с генной инженерией, таких как генетическая модификация клеток, создание геномных модификаций; применения в эмбриональном или соматическом мутагенезе; применения в опосредовании переноса генов; изучения характеристик генов; определения функции генов; скрининга онкогенов; геннойThe piggyBac transposase described herein can be used as part of the piggyBac transposon system for gene transfers; cell line generation; genetic engineering applications such as genetic modification of cells, creation of genomic modifications; applications in embryonic or somatic mutagenesis; applications in mediating gene transfer; gene characterization; determination of gene function; oncogene screening; gene

- 45 049367 терапии; создания плюрипотентных стволовых клеток и трансгенных животных, отличных от человека (см., например, US 2013/0209426; US 2010/0311116; Vanden Driessche et al., Blood 114 (8): 1461-1468, 2009; Yusa K, et al., Nat. Methods. 6(5):363-369, 2009; Wilson et al., Mol. Ther. 15(1):139-145, 2007; Landrette et al., PLoS ONE 6(10): 1-12, 2011; Nakanishi et al., Molecular Therapy 18(4): 707-714, 2010; Zhao et al., Transl Lung Cancer Res., 5(1):120-125, 2016; Wilson et al., Molecular Therapy 15(1): 139-145, 2007).- 45 049367 therapy; creation of pluripotent stem cells and transgenic non-human animals (see, e.g., US 2013/0209426; US 2010/0311116; Vanden Driessche et al., Blood 114 (8): 1461–1468, 2009; Yusa K, et al., Nat. Methods. 6 (5): 363–369, 2009; Wilson et al., Mol. Ther. 15 (1): 139–145, 2007; Landrette et al., PLoS ONE 6 (10): 1–12, 2011; Nakanishi et al., Molecular Therapy 18 (4): 707–714, 2010; Zhao et al., Transl Lung Cancer Res., 5(1):120-125, 2016; Wilson et al., Molecular Therapy 15(1): 139-145, 2007).

Транспозазы piggyBac, описанные в данном документе, можно применять при редактировании генома. Транспозазы piggyBac, описанные в данном документе, можно применять как часть системы транспозон/транспозаза piggyBac, преимущество которой заключается в том, что она обеспечивает эффективную невирусную доставку для интеграции в типы первичных клеток или стволовые клетки. Транспозазы piggyBac, описанные в данном документе, можно применять для осуществления невирусной доставки генов, кодирующих химерные антигенные рецепторы (CAR), альфа и бета-цепи Tклеточного рецептора (TCR), а также других генов, кодирующих белки, такие как цитокины, ингибиторы контрольных точек и другие белки, в сконструированные клетки. В одной генетической конструкции можно доставлять несколько генов. Преимуществом по сравнению с вирусной трансдукцией является то, что можно размещать большие генные грузы, и транспозаза увеличивает эффективность интеграции при невирусной трансфекции. Такую систему также можно применять в комбинации с другими технологиями невирусного редактирования генома, такими как нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), интегразы, таких как интеграза фага PhiC3, эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALES), рекомбиназы, специфические в отношении последовательности, и другие системы транспозон/транспозаза, такие как Sleeping Beauty, что обеспечивает возможность трансдукции множества клеток (US 2015/0031132; WO 2018/098671; Ivics et al., Cell 91(4): 501-510, 1997; Boch et al., Science 326(5959): 1509-1512, 2009; Christian et al., Genetics 186(2): 757-761, 2010; Wilber et al., Stem Cells Int; Vol: 2011: номер статьи 717069, 2011; Yusa et al., Nature 478, 20 October, 391-396, 2011; Silva et al., Curr Gene Ther 11(1): 11-27, 2011; Cong et al., Science 339(6121): 819-823, 2013; Mali et al., Science 339(6121): 823-826, 2013. Li et al., Molecular Therapy: Nucleic Acids Vol. 8 September, 64-76, 2017; и Ishida et al., www.nature/Scientific Reports 8, Article Number 310, 2018).The piggyBac transposases described herein can be used in genome editing. The piggyBac transposases described herein can be used as part of the piggyBac transposon/transposase system, which has the advantage of providing efficient non-viral delivery for integration into primary cell types or stem cells. The piggyBac transposases described herein can be used to perform non-viral delivery of genes encoding chimeric antigen receptors (CARs), T cell receptor (TCR) alpha and beta chains, as well as other genes encoding proteins such as cytokines, checkpoint inhibitors, and other proteins, into engineered cells. Multiple genes can be delivered in a single genetic construct. The advantage over viral transduction is that larger gene cargoes can be accommodated, and the transposase increases the efficiency of integration in non-viral transfection. Such a system can also be used in combination with other non-viral genome editing technologies such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9), integrases such as phage PhiC3 integrase, transcription activator-like effectors (TALESs), sequence-specific recombinases, and other transposon/transposase systems such as Sleeping Beauty, thereby enabling transduction of multiple cells (US 2015/0031132; WO 2018/098671; Ivics et al., Cell 91(4): 501–510, 1997; Boch et al., Science 326(5959): 1509–1512, 2009; Christian et al., Genetics 186(2): 757-761, 2010; Wilber et al., Stem Cells Int; Vol: 2011: article number 717069, 2011; Yusa et al., Nature 478, 20 October, 391-396, 2011; Silva et al., Curr Gene Ther 11(1): 11-27, 2011; Cong et al., Science 339(6121): 819-823, 2013; Mali et al., Science 339(6121): 823-826, 2013. Li et al., Molecular Therapy: Nucleic Acids Vol. 8 September, 64-76, 2017; and Ishida et al., www.nature/Scientific Reports 8, Article Number 310, 2018).

Транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, можно применять как части системы транспозона piggyBac для стабильной и невирусной трансфекции клеток конструкциями, кодирующими CAR, TCR и/или другие белки. Нативные Т-клетки можно: (i) извлечь из пациента (субъекта) или донора, (ii) модифицировать методами генной инженерии с применением системы транспозон/транспозаза piggyBac, содержащей транспозазы piggyBac, описанные в данном документе, для осуществления экспрессии одного или нескольких химерных антигенный рецепторов, T-клеточных рецепторов и/или других белков, которые связываются с по меньшей мере одним представляющим интерес антигеном, (iii) размножить путем культивирования клеток с образованием большей популяции сконструированных Тклеток и (iv) повторно ввести пациенту. После того, как сконструированные Т-клетки повторно вводят пациенту, они опосредуют иммунный ответ против клеток, экспрессирующих антиген. См., например, патенты США №№ 7741465 и 6319494; публикацию заявки на патент США № 2017/0355957; Nakazawa et al., J. Immunotherapy 32(8): 826-836; 2009; Nakazawa et al., Molecular Therapy 19(12): 2133-2143, 2011; Eshhar et al. Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136; Finney et al., Journal of Immunology, 161: 2791-2797, 1998; Krause et al., J. Exp. Med., 188(4): 619-626, 1998. Этот иммунный ответ включает секрецию IL-2 и других цитокинов Т-клетками, клональную экспансию Т-клеток, распознающих антиген, и опосредованное Т-клетками специфическое уничтожение клеток, положительных по мишени. См. Hombach et al., Journal of Immun. 167: 6123-6131 (2001).The piggyBac transposase described herein can be used as part of the piggyBac transposon system to stably and non-virally transfect cells with constructs encoding CARs, TCRs, and/or other proteins. Naive T cells can be: (i) recovered from a patient (subject) or donor, (ii) genetically engineered using the piggyBac transposon/transposase system containing the piggyBac transposases described herein to express one or more chimeric antigen receptors, T cell receptors, and/or other proteins that bind to at least one antigen of interest, (iii) expanded by cell culture to form a larger population of engineered T cells, and (iv) reintroduced into the patient. Once reintroduced into the patient, the engineered T cells mediate an immune response against cells expressing the antigen. See, e.g., U.S. Patent Nos. 7,741,465 and 6,319,494; U.S. Patent Application Publication No. 2017/0355957; Nakazawa et al., J. Immunotherapy 32(8): 826–836; 2009; Nakazawa et al., Molecular Therapy 19(12): 2133–2143, 2011; Eshhar et al. Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131–136; Finney et al., Journal of Immunology, 161: 2791–2797, 1998; Krause et al., J. Exp. Med., 188(4): 619–626, 1998. This immune response includes secretion of IL-2 and other cytokines by T cells, clonal expansion of T cells that recognize the antigen, and T cell-mediated specific killing of target-positive cells. See Hombach et al., Journal of Immun. 167: 6123–6131 (2001).

Иммунные клетки можно получить от субъекта. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки предусматривают Т-клетки. Т-клетки могут быть получены из целого ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из очага инфекции, асцит, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В определенных вариантах осуществления Т-клетки могут быть получены из дозы крови, собранной у субъекта, с применением огромного числа методик, известных специалисту в данной области, например, разделения с помощью FICOLLTM. Предпочтительно клетки могут быть получены из циркулирующей крови индивида с помощью афереза. Как правило, продукт аферезасодержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядерные лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В определенных вариантах осуществления клетки, собранные с помощью афереза, можно промывать для удаления фракции плазмы крови и помещать в соответствующий буфер или среду для последующей обработки. Клетки можно промывать с помощью PBS. Следует иметь в виду, что можно использовать стадию промывания, как, например, с использованием полуавтоматической проточной центрифуги, например, устройства для обработки клеток Cobe^TM 2991, Baxter CytoMateTM и т.п. После промывания клетки можно ресуспендировать в различных биосовместимых буферах или другом солевом растворе с буфером или без него. В некоторых вариантах осуществления из образца афереза могут быть удалены нежелательные компоненты.Immune cells can be obtained from a subject. In some embodiments, the immune cells include T cells. T cells can be obtained from a variety of sources, including peripheral blood mononuclear cells (PBMC), bone marrow, lymph node tissue, cord blood, thymus tissue, tissue from a site of infection, ascites, pleural effusion, spleen tissue, and tumors. In certain embodiments, T cells can be obtained from a unit of blood collected from a subject using a variety of techniques known to those skilled in the art, such as FICOLLTM separation. Preferably, the cells can be obtained from the circulating blood of an individual using apheresis. Typically, the apheresis product comprises lymphocytes, including T cells, monocytes, granulocytes, B cells, other nucleated leukocytes, red blood cells, and platelets. In certain embodiments, cells collected by apheresis can be washed to remove the plasma fraction and placed in an appropriate buffer or medium for subsequent processing. The cells can be washed with PBS. It should be noted that a washing step can be used, such as using a semi-automated flow centrifuge, such as a Cobe ^TM 2991 cell processor, Baxter CytoMate TM, etc. After washing, the cells can be resuspended in various biocompatible buffers or another saline solution with or without a buffer. In some embodiments, unwanted components can be removed from the apheresis sample.

- 46 049367- 46 049367

В некоторых вариантах осуществления Т-клетки выделяют из PBMC путем осуществления лизиса эритроцитов и истощения моноцитов, например, с помощью центрифугирования в градиенте PERC.OLL¹¹. Специфическую субпопуляцию Т-клеток, такую как CD28', CD4', CD8', CD45RA' и CD45RO+ Т-клетки, далее можно выделять с помощью методик положительной или отрицательной селекции, известных из уровня техники. Например, обогащение популяции Т-клеток с помощью отрицательной селекции может выполняться с помощью комбинации антител, направленных на поверхностные маркеры, уникальные для клеток, подвергающихся отрицательной селекции. Одним из способов для применения в данном документе является сортировка и/или отрицательная селекция клеток посредством магнитной иммуноадгезии или проточной цитометрии, в которой используется смесь моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на клетках, подвергающихся отрицательной селекции. Например, для обогащения клеток CD4+ путем отрицательной селекции смесь моноклональных антител, как правило, включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. Проточную цитометрию и сортировку клеток также можно применять для выделения представляющих интерес популяций клеток для применения в настоящем изобретении.In some embodiments, T cells are isolated from PBMCs by lysing red blood cells and depleting monocytes, such as by PERC.OLL gradient centrifugation ¹¹ . A specific subset of T cells, such as CD28', CD4', CD8', CD45RA' and CD45RO+ T cells, can then be isolated using positive or negative selection techniques known in the art. For example, enrichment of a T cell population by negative selection can be accomplished using a combination of antibodies directed to surface markers unique to cells undergoing negative selection. One method for use herein is cell sorting and/or negative selection using magnetic immunoadhesion or flow cytometry using a mixture of monoclonal antibodies directed to cell surface markers present on cells undergoing negative selection. For example, to enrich for CD4+ cells by negative selection, a mixture of monoclonal antibodies typically includes antibodies to CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, and CD8. Flow cytometry and cell sorting can also be used to isolate cell populations of interest for use in the present invention.

PBMC можно использовать непосредственно для генетической модификации генетическими конструкциями (такими как CAR или TCR) с применением способов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления после выделения PBMC далее можно выделять Т-лимфоциты, и как цитотоксические, так и хелперные Т-лимфоциты можно сортировать на субпопуляции наивных клеток, клеток памяти и эффекторных Т-клеток либо до, либо после генетической модификации и/или размножения.PBMCs can be used directly for genetic modification with genetic constructs (such as CAR or TCR) using the methods described herein. In certain embodiments, after PBMCs are isolated, T lymphocytes can be further isolated, and both cytotoxic and helper T lymphocytes can be sorted into naive, memory, and effector T cell subsets either before or after genetic modification and/or expansion.

В некоторых вариантах осуществления CD8+ клетки дополнительно сортируют на наивные, центральные клетки памяти и эффекторные клетки путем идентификации поверхностных клеточных антигенов, которые ассоциированы с каждым из этих типов CD8+ клеток. В некоторых вариантах осуществления экспрессия фенотипических маркеров центральных Т-клеток памяти включает CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и CD127 и является отрицательной по гранзиму В. В некоторых вариантах осуществления центральные Т-клетки памяти представляют собой CD45RO'. CD62L , CD8+ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления эффекторные Т-клетки являются отрицательными по CD62L, CCR7, CD28 и CD127 и положительными по гранзиму В и перфорину. В некоторых вариантах осуществления CD4+ Т-клетки дополнительно сортируют на субпопуляции. Например, CD4+ Тхелперные клетки можно отсортировать на наивные, центральные клетки памяти и эффекторные клетки путем идентификации клеточных популяций, которые имеют поверхностные клеточные антигены.In some embodiments, the CD8+ cells are further sorted into naive, central memory, and effector cells by identifying cell surface antigens that are associated with each of these CD8+ cell types. In some embodiments, expression of phenotypic markers of central memory T cells includes CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, and CD127 and is granzyme B negative. In some embodiments, the central memory T cells are CD45RO', CD62L, CD8+ T cells. In some embodiments, the effector T cells are negative for CD62L, CCR7, CD28, and CD127 and positive for granzyme B and perforin. In some embodiments, the CD4+ T cells are further sorted into subsets. For example, CD4+ T helper cells can be sorted into naive, central memory, and effector cells by identifying cell populations that share cell surface antigens.

Такие иммунные клетки, как Т-клетки, после выделения можно подвергнуть генетической модификации с помощью одного или нескольких векторов, содержащих одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или несколько CAR и транспозазы piggyBac, описанные в данном документе, как часть системы транспозон/транспозаза piggyBac. Иммунные клетки, генетически модифицированные без участия вируса, можно получить путем трансфекции клеток вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один CAR, TCR и/или другой представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и З'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. Генетически модифицированные иммунные клетки также можно получить путем совместной трансфекции иммунных клеток первым вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, описанную в данном документе, и вторым вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один CAR, TCR и/или другой представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac. Векторы можно вводить в клетку-хозяина с применением любых подходящих способов, известных в данной области техники, таких как электропорация или нуклеофекция. В дополнительном варианте осуществления смесь различных векторов экспрессии можно использовать для генетической модификации популяции иммунных эффекторных клеток, полученных от донора, где каждый вектор кодирует разный CAR, TCR или другой представляющий интерес белок. Полученные трансформированные иммунные эффекторные клетки образуют смешанную популяцию сконструированных клеток, при этом часть сконструированных клеток экспрессирует более одного разного CAR, TCR и/или другого представляющего интерес белка.Immune cells such as T cells, after isolation, can be genetically modified with one or more vectors comprising one or more nucleotide sequences encoding one or more CARs and the piggyBac transposases described herein as part of the piggyBac transposon/transposase system. Non-virally genetically modified immune cells can be produced by transfecting the cells with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein and at least one nucleic acid sequence encoding at least one CAR, TCR, and/or other protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. Genetically modified immune cells can also be produced by co-transfecting immune cells with a first vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein and a second vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one CAR, TCR, and/or other protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. The vectors can be introduced into the host cell using any suitable methods known in the art, such as electroporation or nucleofection. In a further embodiment, a mixture of different expression vectors can be used to genetically modify a population of immune effector cells obtained from a donor, wherein each vector encodes a different CAR, TCR, or other protein of interest. The resulting transformed immune effector cells form a mixed population of engineered cells, with a portion of the engineered cells expressing more than one different CAR, TCR, and/or other protein of interest.

Также включены гены самоубийства, которые обеспечивают возможность селективного устранения модифицированных клеток при введении пролекарства за счет кодирования ферментов, приводящих к образованию функционально активных токсичных продуктов, которые содействуют активации апоптоза или ингибируют пролиферацию клеток, сводя к минимуму побочные эффекты. Также может быть включен индуцируемый переключатель включения или ускорения. Подходящие методики включают применение индуцируемой каспазы-9 (опубликованная заявка на патент США 2011/0286980) или тимидинкиназы до, после или одновременно с трансфекцией клеток конструкцией CAR или TCR. Дополнительные способы введения генов самоубийства и/или переключателей включения включают TALENS, цинковые пальцы, RNAi, siRNA, shRNA, антисмысловую технологиюAlso included are suicide genes that allow selective elimination of modified cells upon administration of the prodrug by encoding enzymes that produce functionally active toxic products that promote activation of apoptosis or inhibit cell proliferation while minimizing side effects. An inducible on or off switch may also be included. Suitable techniques include the use of inducible caspase-9 (published US Patent Application 2011/0286980) or thymidine kinase before, after, or simultaneously with transfection of cells with the CAR or TCR construct. Additional methods for introducing suicide genes and/or on switches include TALENS, zinc fingers, RNAi, siRNA, shRNA, antisense technology

- 47 049367 и другие методики, известные из уровня техники.- 47 049367 and other techniques known from the prior art.

Перед генетической модификацией иммунные клетки можно активировать и размножить (или дифференцировать в случае предшественников) in vitro. Способы активации и размножения Т-клеток известны из уровня техники и описаны, например, в патенте США № 6905874; патенте США № 6867041; патенте США № 6797514 и PCT WO 2012/079000. Такие способы обычно включают приведение PBMC или выделенных Т-клеток в контакт со стимулирующим средством и костимулирующим средством, таким как антитела к CD3 и CD28, обычно прикрепленные к грануле или другой поверхности, в среде для культивирования с соответствующими цитокинами, такими как IL-2. Антитела к CD3 и CD28, прикрепленные к одной и той же грануле, выступают в роли суррогатных антигенпрезентирующих клеток (APC). Один пример представляет собой систему Dynabeads®, систему активации/стимуляции CD3/CD28 для физиологической активации Т-клеток человека.Prior to genetic modification, immune cells may be activated and expanded (or differentiated in the case of progenitors) in vitro. Methods for activating and expanding T cells are known in the art and are described, for example, in U.S. Patent No. 6,905,874; U.S. Patent No. 6,867,041; U.S. Patent No. 6,797,514; and PCT WO 2012/079000. Such methods typically involve contacting PBMCs or isolated T cells with a stimulatory agent and a costimulatory agent, such as anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, typically attached to a bead or other surface, in a culture medium with appropriate cytokines, such as IL-2. The anti-CD3 and anti-CD28 antibodies attached to the same bead act as surrogate antigen-presenting cells (APCs). One example is the Dynabeads® system, a CD3/CD28 activation/stimulation system for physiological activation of human T cells.

В других вариантах осуществления Т-клетки можно активировать и стимулировать для пролиферации с помощью питающих клеток и соответствующих антител и цитокинов с применением способов, описанных в патенте США № 6040177; патенте США № 5827642 и WO 2012129514, содержание которых настоящим включено посредством ссылки во всей своей полноте.In other embodiments, T cells can be activated and stimulated to proliferate using feeder cells and appropriate antibodies and cytokines using the methods described in U.S. Patent No. 6,040,177; U.S. Patent No. 5,827,642; and WO2012129514, the contents of which are hereby incorporated by reference in their entireties.

PBMC могут дополнительно включать другие цитотоксические лимфоциты, такие как NK-клетки, NKT-клетки или гемопоэтические стволовые клетки. Вектор экспрессии, несущий кодирующую последовательность для химерного рецептора, раскрытого в данном документе, может быть введен в популяцию Т-клеток, NK-клеток, NKT-клеток, моноцитов или гемопоэтических стволовых клеток от донора-человека.PBMCs may further include other cytotoxic lymphocytes, such as NK cells, NKT cells, or hematopoietic stem cells. An expression vector carrying a coding sequence for a chimeric receptor disclosed herein may be introduced into a population of T cells, NK cells, NKT cells, monocytes, or hematopoietic stem cells from a human donor.

Стандартные процедуры используют для криоконсервации клеток, экспрессирующих CAR или TCT, которая предназначена для хранения и/или подготовки для использования у субъекта-человека. Это подразумевает криоконсервацию иммунных клеток таким образом, чтобы клетки оставались жизнеспособными после оттаивания. Часть иммунных клеток, экспрессирующих CAR, можно подвергать криоконсервации посредством способов, известных из уровня техники, чтобы обеспечить постоянный источник таких клеток для будущего лечения пациентов, пораженных злокачественным новообразованием. При необходимости криоконсервированные трансформированные иммунные клетки можно размораживать, выращивать и размножать с получением большего количества таких клеток.Standard procedures are used to cryopreserve cells expressing CAR or TCT for storage and/or preparation for use in a human subject. This involves cryopreserving immune cells in a manner such that the cells remain viable after thawing. A portion of the CAR-expressing immune cells can be cryopreserved by methods known in the art to provide a continuous source of such cells for future treatment of patients affected by cancer. If necessary, the cryopreserved transformed immune cells can be thawed, grown, and expanded to produce more such cells.

Используемая в данном документе криоконсервация относится к консервации клеток путем охлаждения до отрицательных температур, таких как (как правило) 77 градусов Кельвина или -196°C. При отрицательных температурах зачастую используют криозащитные средства, чтобы предупредить повреждение консервируемых клеток из-за замораживания при низких температурах или нагревания до комнатной температуры. От повреждения клеток могут защитить криозащитные средства и оптимальные скорости охлаждения, и они известны из уровня техники. К криозащитным средствам относятся без ограничения диметилсульфоксид (DMSO) (Lovelock & Bishop, Nature (1959); 183: 1394-1395; AshwoodSmith, Nature (1961); 190: 1204-1205), глицерин, поливинилпирролидин (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci. (1960); 85: 576) и полиэтиленгликоль (Sloviter & Ravdin, Nature (1962); 196: 48).As used herein, cryopreservation refers to the preservation of cells by cooling to subzero temperatures, such as (typically) 77 degrees Kelvin or -196°C. At subzero temperatures, cryoprotectants are often used to prevent damage to the preserved cells due to freezing at low temperatures or warming to room temperature. Cryoprotectants and optimal cooling rates can protect against cell damage and are known in the art. Cryoprotectants include, but are not limited to, dimethyl sulfoxide (DMSO) (Lovelock & Bishop, Nature (1959); 183: 1394-1395; AshwoodSmith, Nature (1961); 190: 1204-1205), glycerol, polyvinylpyrrolidine (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci. (1960); 85: 576), and polyethyleneglycol (Sloviter & Ravdin, Nature (1962); 196: 48).

Затем клетки составляют для повторного введения субъекту. Клетки составляют, собирая их вначале из их культуральной среды, а затем промывая и концентрируя клетки в среде и контейнерной системе, подходящей для введения (фармацевтически приемлемый носитель), в эффективном для лечения количестве. Подходящей средой для инфузии может быть любой состав изотонической среды, как правило, физиологический солевой раствор, NormosolTM R (Abbott) или Plasma-Lyte^TM A (Baxter), но также можно использовать 5% раствор декстрозы в воде или лактат Рингера. Среда для инфузии может быть дополнена человеческим сывороточным альбумином.The cells are then formulated for reintroduction into the subject. The cells are formulated by first harvesting them from their culture medium and then washing and concentrating the cells in a medium and container system suitable for administration (a pharmaceutically acceptable carrier) in an amount effective for the treatment. A suitable infusion medium may be any isotonic medium formulation, typically physiological saline, NormosolTM R (Abbott) or Plasma- ^LyteTM A (Baxter), but 5% dextrose in water or lactated Ringer's may also be used. The infusion medium may be supplemented with human serum albumin.

Требуемое количество клеток для лечения в композиции обычно составляет по меньшей мере 2 клетки (например, по меньшей мере 1 клетку из субпопуляции центральных CD8+ Т-клеток памяти и по меньшей мере 1 клетку из субпопуляции CD4+ хелперных Т-клеток) или, чаще всего, более 10² клеток и не более 10⁶ клеток, не более 108 включительно или 10⁹ клеток, и может составлять более 10¹⁰ клеток. Число клеток будет зависеть от требуемого применения, для которого предназначена композиция, и типа клеток, включенных в нее. Клетки могут быть аутологичными, аллогенными или гетерологичными относительно пациента, проходящего терапию.The desired number of cells for treatment in the composition is usually at least 2 cells (e.g. at least 1 cell from the central CD8+ memory T cell subset and at least 1 cell from the CD4+ helper T cell subset) or, more often, more than ¹⁰² cells and no more than ¹⁰⁶ cells, no more than 108 inclusive or ¹⁰⁹ cells, and may be more than ¹⁰¹⁰ cells. The number of cells will depend on the desired use for which the composition is intended and the type of cells included therein. The cells may be autologous, allogeneic or heterologous relative to the patient undergoing therapy.

Популяции клеток, экспрессирующих CAR, TCR или другой представляющий интерес белок, можно вводить либо отдельно, либо в виде фармацевтической композиции в комбинации с разбавителями и/или другими компонентами, такими как IL-2 или другие цитокины или популяции клеток.Populations of cells expressing a CAR, TCR, or other protein of interest can be administered either alone or as a pharmaceutical composition in combination with diluents and/or other components such as IL-2 or other cytokines or cell populations.

Предусмотрены способы применения сконструированных клеток для лечения состояний, заболеваний или нарушений. Такие состояния, заболевания или нарушения включают виды рака, опухоли, солидные опухоли, гематологические нарушения, виды лейкоза, лимфомы, вирусные инфекции, воспалительные заболевания или нарушения и/или аутоиммунное заболевания или нарушения. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к формированию опосредованного Т-клетками иммунного ответа у субъекта, предусматривающему введение субъекту эффективного количества сконструированных иммунных клеток согласно настоящей заявке. ВMethods of using engineered cells to treat conditions, diseases, or disorders are provided. Such conditions, diseases, or disorders include cancers, tumors, solid tumors, hematological disorders, leukemias, lymphomas, viral infections, inflammatory diseases or disorders, and/or autoimmune diseases or disorders. In some embodiments, the present invention relates to generating a T cell-mediated immune response in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of engineered immune cells according to the present application. In

- 48 049367 некоторых вариантах осуществления опосредованный Т-клетками иммунный ответ направлен против клетки-мишени или клеток-мишеней. В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка содержит генетическую конструкцию, экспрессирующую один или несколько химерных антигенных рецепторов (CAR), T-клеточных рецепторов (TCR) и/или других представляющих интерес белков. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень представляет собой опухолевую клетку. В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или предупреждения злокачественного новообразования, при этом указанный способ предусматривает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества по меньшей мере одной выделенной антигенсвязывающей молекулы, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или предупреждения злокачественного новообразования, при этом указанный способ предусматривает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества по меньшей мере одной иммунной клетки, где иммунная клетка содержит генетическую конструкцию, кодирующую по меньшей мере один химерный антигенный рецептор, Тклеточный рецептор и/или выделенную антигенсвязывающую молекулу, описанные в данном документе. В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или предупреждения воспалительных и/или аутоиммунных нарушений. В настоящем изобретении также предусмотрено применение способов для поддержки процедур трансплантации, таких как клеточная терапия против несоответствующих молекул HLA на трансплантированной ткани/органе. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень представляет собой клетку островка Лангерганса.- 48 049 367 In some embodiments, the T cell-mediated immune response is directed against a target cell or target cells. In some embodiments, the engineered immune cell comprises a genetic construct expressing one or more chimeric antigen receptors (CARs), T cell receptors (TCRs), and/or other proteins of interest. In some embodiments, the target cell is a tumor cell. In some aspects, the present invention provides a method of treating or preventing a cancer, said method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of at least one isolated antigen-binding molecule described herein. In some embodiments, the present invention provides a method of treating or preventing a cancer, said method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of at least one immune cell, wherein the immune cell comprises a genetic construct encoding at least one chimeric antigen receptor, T cell receptor and/or isolated antigen binding molecule described herein. In some aspects, the present invention provides a method of treating or preventing inflammatory and/or autoimmune disorders. The present invention also provides the use of methods to support transplant procedures, such as cell therapy against mismatched HLA molecules on the transplanted tissue/organ. In some embodiments, the target cell is an islet cell.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ создания клеток, генетически модифицированных без участия вируса, предусматривающий: (a) создание вектора, содержащего по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'элементами инвертированных повторов транспозазы piggyBac; (b) выделение нативных иммунных клеток от донора или субъекта; (b) совместную трансфекцию клеток сконструированной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, и вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac; и (c) размножение клеток путем культивирования клеток с образованием большей популяции клеток, генетически модифицированных без участия вируса. В одном варианте осуществления клетки подвергают трансфекции вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac, и вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке. В одном варианте осуществления предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления клетки подвергают трансфекции вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, сконструированную для увеличения стабильности в клетке. В одном варианте осуществления предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO:18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозазаIn one embodiment, the present invention provides a method for generating cells genetically modified in a non-viral manner, comprising: (a) generating a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposase; (b) isolating naive immune cells from a donor or subject; (b) co-transfecting the cells with an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase and a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon; and (c) expanding the cells by culturing the cells to form a larger population of cells genetically modified in a non-viral manner. In one embodiment, the cells are transfected with a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon and a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in the cell. In one embodiment, an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase is provided. In one embodiment, the cells are transfected with a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon and a nucleic acid sequence encoding a piggyBac transposase engineered to increase stability in the cell. In one embodiment, an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase described herein is provided. In one embodiment, a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 18 is provided. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. In another aspect, the present invention provides piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11. In another aspect, the present invention provides a transposase

- 49 049367 piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18.- 49 049367 piggyBac, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 18.

В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, содержащая аминокислотную замену в одном или нескольких из положений 147, 176, 221, 247, 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит аминокислотную замену изолейцина на лейцин в одном или нескольких из положений 147, 176, 221 и 247 и/или аминокислотную замену серина на треонин в одном или нескольких из положений 429, 533 и 573 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит по меньшей мере две из следующих аминокислотных замен: изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В другом родственном варианте осуществления транспозаза piggyBac содержит замену изолейцина на лейцин в положении 147 в SEQ ID NO: 2, замену изолейцина на лейцин в положении 247 в SEQ ID NO: 2 и замену серина на треонин в положении 533 в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:4. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:6. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, имеющая аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.In one embodiment, a piggyBac transposase is provided comprising an amino acid substitution at one or more of positions 147, 176, 221, 247, 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises an amino acid substitution of isoleucine to leucine at one or more of positions 147, 176, 221, and 247 and/or an amino acid substitution of serine to threonine at one or more of positions 429, 533, and 573 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least one of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In a related embodiment, the piggyBac transposase comprises at least two of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 of SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 of SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 of SEQ ID NO: 2. In another related embodiment, the piggyBac transposase comprises an isoleucine to leucine substitution at position 147 of SEQ ID NO: 2, an isoleucine to leucine substitution at position 247 of SEQ ID NO: 2, and a serine to threonine substitution at position 533 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16. In another aspect, the present The invention provides a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 12. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта клеткой, генетически модифицированной без участия вируса, предусматривающий: (a) конструирование молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, для увеличения стабильности в клетке и вставку ее в вектор; (b) выделение нативных иммунных клеток из субъекта или донора; (c) совместную трансфекцию клеток сконструированной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу piggyBac, и вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона piggyBac; (d) размножение клеток путем культивирования клеток с образованием большей популяции генетически модифицированных клеток; (e) выделение трансформированных клеток из культуры с получением популяции клеток, содержащей генетически модифицированные клетки; и (f) повторное введение субъекту клеток, генетически модифицированных без участия вируса. В одном варианте осуществления предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. В другомIn one embodiment, the invention provides a method of treating a subject with a cell genetically modified without the involvement of a virus, comprising: (a) engineering a nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase to increase stability in the cell and inserting it into a vector; (b) isolating naive immune cells from the subject or a donor; (c) co-transfecting the cells with the engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase and a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon; (d) expanding the cells by culturing the cells to form a larger population of genetically modified cells; (e) isolating the transformed cells from the culture to obtain a population of cells comprising the genetically modified cells; and (f) reintroducing the cells genetically modified without the involvement of a virus to the subject. In one embodiment, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 18. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 15. In another aspect, the present invention provides a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. In another

- 50 049367 аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 3. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 7. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 15. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена транспозаза piggyBac, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18.- 50 049367 In one aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9. In another aspect of the present invention, there is provided a piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11. In another aspect of the present invention a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17. In another aspect of the present invention, a piggyBac transposase is provided, encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 18.

В родственном варианте осуществления нативная иммунная клетка представляет собой мононуклеарную клетку. В родственном варианте осуществления нативная иммунная клетка представляет собой Т-клетку. В другом варианте осуществления представляющий интерес белок представляет собой антигенный рецептор, T-клеточный рецептор или химерный антигенный рецептор. В другом варианте осуществления клетку также подвергают трансфекции молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей ген самоубийства, индуцируемый переключатель включения или ускорения или как первый, так и второй. В одном варианте осуществления предусмотрена сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая транспозазу piggyBac, описанную в данном документе.In a related embodiment, the native immune cell is a mononuclear cell. In a related embodiment, the native immune cell is a T cell. In another embodiment, the protein of interest is an antigen receptor, a T cell receptor, or a chimeric antigen receptor. In another embodiment, the cell is also transfected with a nucleic acid molecule encoding a suicide gene, an inducible on or fast switch, or both. In one embodiment, an engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase described herein is provided.

В одном варианте осуществления нативные иммунные клетки подвергают трансфекции вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac, иIn one embodiment, naive immune cells are transfected with a vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase, and

- 51 049367 вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'элементами инвертированных повторов транспозазы piggyBac.- 51 049367 a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposase.

В одном варианте осуществления нативные иммунные клетки подвергают трансфекции одним вектором, содержащим сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес белок, фланкированную по меньшей мере 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозазы piggyBac.In one embodiment, native immune cells are transfected with a single vector comprising an engineered nucleic acid molecule encoding a piggyBac transposase and at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposase.

В одном варианте осуществления вектор включает бицистронные или мультицистронные конструкции, которые кодируют несколько представляющих интерес белков.In one embodiment, the vector includes bicistronic or multicistronic constructs that encode multiple proteins of interest.

В настоящем изобретении также предусмотрены клетки, генетически модифицированные без участия вируса, популяции клеток или культуры клеток, полученные с помощью способов, описанных в данном документе. Также предусмотрен состав, содержащий генетически модифицированные клетки или популяции клеток, полученные с помощью способов, описанных в данном документе.The present invention also provides cells genetically modified without the participation of a virus, cell populations or cell cultures obtained by the methods described herein. Also provided is a composition containing genetically modified cells or cell populations obtained by the methods described herein.

Также предусмотрен способ лечения или предупреждения заболевания или нарушения у нуждающегося в этом донора или субъекта, предусматривающий введение донору или субъекту эффективного количества генетически модифицированных клеток или популяций клеток, полученных с помощью способов, описанных в данном документе. В другом варианте осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая выделенный, очищенный представляющий интерес белок, полученный с помощью способов, описанных в данном документе.Also provided is a method for treating or preventing a disease or disorder in a donor or subject in need thereof, comprising administering to the donor or subject an effective amount of genetically modified cells or cell populations obtained by the methods described herein. In another embodiment, provided is a pharmaceutical composition comprising an isolated, purified protein of interest obtained by the methods described herein.

Хотя терминология, используемая в данной заявке, является стандартной в пределах области техники, в данном документе предусмотрены определения некоторых терминов для обеспечения ясности и определенности смысла пунктов формулы изобретения. Единицы измерения, префиксы и символы могут быть обозначены в их форме, принятой в системе СИ. Упоминаемые в данном документе числовые диапазоны включают числа, определяющие границы диапазона, и включают и поддерживают каждое целое число в пределах заданного диапазона. Способы и методики, описанные в данном документе, в целом осуществляются в соответствии с традиционными способами, общеизвестными в данной области техники и описанными в различных общих и более специализированных литературных источниках, которые цитируются и обсуждаются на протяжении всей настоящей заявки, если не указано иное. См., например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), и Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Все документы или части документов, цитируемые в данной заявке, включая без ограничения патенты, заявки на патенты, статьи, книги и трактаты, настоящим явно включены посредством ссылки. Описываемое в аспекте или варианте осуществления настоящего изобретения можно объединять с другими аспектами и/или вариантами осуществления настоящего изобретения.Although the terminology used in this application is standard within the art, definitions of certain terms are provided herein to provide clarity and certainty in the meaning of the claims. Units of measurement, prefixes, and symbols may be denoted in their SI form. Numerical ranges referred to herein include the numbers defining the limits of the range and include and support each integer within the stated range. The methods and techniques described herein are generally performed in accordance with conventional methods well known in the art and described in various general and more specialized literature references that are cited and discussed throughout this application unless otherwise indicated. See, for example, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). All documents or portions of documents cited in this application, including but not limited to patents, patent applications, articles, books, and treatises, are hereby expressly incorporated by reference. What is described in an aspect or embodiment of the present invention may be combined with other aspects and/or embodiments of the present invention.

Настоящее изобретение не должно ограничиваться по объему конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе, которые подразумеваются в качестве отдельных иллюстраций индивидуальных аспектов настоящего изобретения, и функционально эквивалентные способы и компоненты находятся в пределах объема настоящего изобретения. Безусловно, специалистам в данной области техники из предшествующего описания и сопроводительных графических материалов станут очевидны различные модификации настоящего изобретения в дополнение к показанным и описанным в данном документе. Предусмотрено, что такие изменения попадают в объем приложенной формулы изобретения.The present invention should not be limited in scope by the specific embodiments described herein, which are intended as separate illustrations of individual aspects of the present invention, and functionally equivalent methods and components are within the scope of the present invention. Of course, various modifications of the present invention in addition to those shown and described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and the accompanying drawings. Such modifications are intended to fall within the scope of the appended claims.

ПримерыExamples

Пример 1. Идентификация и тестирование мутацийExample 1. Identification and testing of mutations

Структура транспозазы piggyBac и других родственных транспозаз пока неизвестна. Авторы настоящего изобретения прогнозировали мотивы вторичной структуры транспозазы piggyBac дикого типа из Trichoplusia ni (SEQ ID NO: 2) с применением in silico способа, называемого DSC (King, RD et al., Protein Sci. 5(11): 2298-2310, 1996). См. фиг. 1. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что транспозаза piggyBac представляет собой преимущественно альфа-спиральный белок. Авторы настоящего изобретения конструировали мутации, которые могли бы стабилизировать альфа-спирали, что могло улучшить общую стабильность транспозазы и что, в свою очередь, может оказывать положительное влияние на экспрессию транспозазы. В качестве остатков, которые потенциально можно подвергнуть мутации для улучшения стабильности альфа-спиралей в транспозазе piggyBac, авторы настоящего изобретения идентифицировали I147, I176, I221, I247.The structure of piggyBac transposase and other related transposases is not yet known. We predicted the secondary structure motifs of the wild-type piggyBac transposase from Trichoplusia ni (SEQ ID NO: 2) using an in silico method called DSC (King, RD et al., Protein Sci. 5(11): 2298-2310, 1996). See Fig. 1. We found that piggyBac transposase is a predominantly alpha-helical protein. We designed mutations that could stabilize the alpha-helices, which could improve the overall stability of the transposase, and which in turn could have a positive effect on the expression of the transposase. The present inventors identified I147, I176, I221, I247 as residues that could potentially be mutated to improve the stability of alpha helices in piggyBac transposase.

Авторы настоящего изобретения также идентифицировали предполагаемые сайты Nгликозилирования (т. е. мотив NXS/T) в последовательности транспозазы. Поскольку в целом мотив NXT подвергается более полному гликозилированию по сравнению с мотивом NXS, авторы настоящего изобретения выдвинули гипотезу, что мутация мотива NXS в мотив NXT могла бы улучшить общее гликозилирование на piggyBac, что, в свою очередь, могло бы улучшить стабильность транспозазы.The present inventors also identified putative N-glycosylation sites (i.e., the NXS/T motif) in the transposase sequence. Since the NXT motif is generally more completely glycosylated than the NXS motif, the present inventors hypothesized that mutation of the NXS motif to the NXT motif could improve overall glycosylation on piggyBac, which in turn could improve transposase stability.

- 52 049367- 52 049367

Запланировали мутации Ser в Thr в следующих сайтах N-гликозилирования: N427ES, N531IS и N571AS. Сайт N531IS присутствует на гидрофобном участке и, следовательно, после улучшения гликозилирования мог бы обеспечить наибольшее увеличение стабильности. В настоящее время неизвестно, является ли транспозаза piggyBac гликозилированной или то, требуется ли это для ее активации.Ser to Thr mutations were planned at the following N-glycosylation sites: N427ES, N531IS, and N571AS. The N531IS site is located in a hydrophobic region and would therefore provide the greatest stability gain after improved glycosylation. It is currently unknown whether piggyBac transposase is glycosylated or whether this is required for its activation.

Создали в общей сложности восемь плазмид, которые включали последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспозазу piggyBac дикого типа и семь транспозаз с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими одиночные, двойные или тройные мутации (см. таблицу 3). Плазмиды с клонированной транспозазой имели одни и те же кодоны ДНК, за исключением мутированных последовательностей. Плазмиды с транспозазой трансформировали в линию клеток и колонии собирали, их количество увеличивали в масштабе и проводили подтверждение их последовательности.A total of eight plasmids were constructed that contained the nucleic acid sequence encoding the wild-type piggyBac transposase and seven transposases with nucleic acid sequences encoding single, double, or triple mutations (see Table 3). The plasmids with the cloned transposase had the same DNA codons except for the mutated sequences. The transposase plasmids were transformed into a cell line and colonies were picked, scaled up, and sequence verified.

Таблица 3Table 3

SEQ ID NO SEQ ID NO Мутация Mutation ДНК DNA Белок Protein 1 1 2 2 Транспозаза piggyBac WT из Trichoplusia ni Transposase piggyBac WT from Trichoplusia ni 3 3 4 4 I147L: изолейцин на лейцин I147L: isoleucine to leucine 5 5 6 6 I247L: изолейцин на лейцин I247L: isoleucine to leucine 7 7 8 8 S533T: серин на треонин S533T: serine to threonine 9 9 10 10 LLT (I247L I147L S533T) LLT (I247L I147L S533T) 11 11 12 12 ILT (I247 I147L S533T) ILT (I247 I147L S533T) 13 13 14 14 LIT (I247L I147 S533T) LIT (I247L I147 S533T) 15 15 16 16 LLS (I247L I147L S533) LLS (I247L I147L S533)

Протестировали четыре представляющих интерес белка: два моноклональных антитела (AB1 и AB2), один слитый белок и один биспецифический активатор, привлекающий T-клетки. Каждый ген, кодирующий представляющий интерес белок, клонировали в отдельную плазмиду, содержащую по меньшей мере 5'- и 3'-элементы инвертированных повторов транспозона piggyBac. Количество этих четыре плазмид увеличивали в масштабе и проводили подтверждение их последовательности.Four proteins of interest were tested: two monoclonal antibodies (AB1 and AB2), one fusion protein, and one bispecific T-cell recruiter. Each gene encoding a protein of interest was cloned into a separate plasmid containing at least the 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon. The four plasmids were scaled up and sequence verified.

Кольцевые плазмиды с мутантной транспозазой подвергали совместной трансфекции вместе с одной из кольцевых плазмид, содержащих ген, кодирующий один из четырех белков, в клетки CHO, нокаутные по глутаминсинтазе, с помощью электропорации. Соотношение транспозазы к представляющему интерес белку в плазмиде составляло 1:4. Клетки оставляли для восстановления в среде, дополненной глутамином, на три дня при 36°C и 5% CO₂ перед заменой на селективную среду без глутамина. Клетки пересевали через каждые 3-4 дня в селективную среду при 36°C и 5% CO2 до тех пор, пока они не восстановили >90% своей жизнеспособности.Circular plasmids with the mutant transposase were co-transfected with one of the circular plasmids containing the gene encoding one of the four proteins into glutamine synthase knockout CHO cells by electroporation. The ratio of transposase to protein of interest in the plasmid was 1:4. Cells were allowed to recover in medium supplemented with glutamine for three days at 36°C and 5% _CO2 before being replaced with selective medium lacking glutamine. Cells were subcultured every 3-4 days in selective medium at 36°C and 5% CO2 until they recovered >90% of their viability.

Продуцирование проводили в режиме культивирования с подпиткой в планшетах с 24 глубокими лунками для оценки экспрессии экспрессируемого белка в стабильных линиях клеток. Культуры высевали из расчета 1^χ10⁶ клеток/мл в базальную среду для продуцирования без глутамина и подпитку дополнительными питательными веществами осуществляли в дни 3, 6 и 8. Культуры собирали в день 10 и анализировали супернатанты в отношении титра.Production was performed in fed-batch culture mode in 24-well deep-well plates to assess expression of the expressed protein in stable cell lines. Cultures were seeded at 1 ^x ¹⁰⁶ cells/mL in basal production medium without glutamine and supplemented with additional nutrients on days 3, 6, and 8. Cultures were harvested on day 10 and supernatants were analyzed for titer.

Титр измеряли с помощью аффинной UPLC-хроматографии, в ходе которой белок А иммобилизовали на носителе колонки при целевой загрузке 20 мкг. При нейтральном pH белок в тестируемом образце связывался с белком A благодаря Fc-области, тогда как белки клетки-хозяина, компоненты кондиционированной среды и буфер элюировались из колонки в элюате. Захваченный белок элюировали при кислом pH 1,9 с 1X DPBS и детектировали по УФ-поглощению при 280 нм. Калибровочную кривую строили по результатам универсального стандарта антитела и соответствующих площадей пиков с использованием линейного регрессионного анализа. Затем рассчитывали концентрацию белка в тестируемых образцах по калибровочной кривой и соотношению коэффициентов экстинкции универсального стандарта антитела и тестируемого образца.The titer was measured by UPLC affinity chromatography, in which protein A was immobilized on the column carrier at a target loading of 20 μg. At neutral pH, the protein in the test sample was bound to protein A via the Fc region, while host cell proteins, conditioned medium components, and buffer were eluted from the column in the eluate. The captured protein was eluted at an acidic pH of 1.9 with 1X DPBS and detected by UV absorbance at 280 nm. A calibration curve was constructed from the results of the universal antibody standard and the corresponding peak areas using linear regression analysis. The protein concentration of the test samples was then calculated from the calibration curve and the ratio of the extinction coefficients of the universal antibody standard and the test sample.

При применении мутантных транспозаз показан увеличенный или аналогичный титр тестируемых моноклональных антител и слитых белков по сравнению с транспозазой WT или контролями, в которых отсутствовала транспозаза. Биспецифические активаторы, привлекающие T-клетки, в целом характеризовались более низкими титрами, чем моноклональные антитела, и также обычно не экспрессировались на высоких уровнях при использовании в данной системе. В случае данной конкретной молекулы вероятным является то, что узкое место экспрессии ассоциировано не с сайтом транскрипции или интеграции гена, а скорее с узким местом в секреции белка. Другие биспецифические активаторы, привлекающие T -клетки, могут характеризоваться иными результаты, если у них нет таких же проблем с экспрессией, поэтому вполне вероятно, что использование другого остова биспецифических активаторов, привлекающих T-клетки, может привести к лучшим титрам.The use of mutant transposases showed increased or similar titers of the tested monoclonal antibodies and fusion proteins compared to WT transposase or controls lacking the transposase. The bispecific T cell attractor activators generally had lower titers than the monoclonal antibodies and were also generally not expressed at high levels when used in this system. In the case of this particular molecule, it is likely that the expression bottleneck is not at the transcription or gene integration site, but rather at a bottleneck in protein secretion. Other bispecific T cell attractor activators may show different results if they do not have the same expression problems, so it is possible that using a different bispecific T cell attractor activator backbone may result in better titers.

- 53 049367- 53 049367

Пример 2. Экспрессия двойных или тройных мутантов транспозазы в GS KO клетках-хозяевах с добавлением MSXExample 2. Expression of double or triple transposase mutants in GS KO host cells supplemented with MSX

CHO, нокаутные по глутаминсинтазе клетки (GSKO-клетки) подвергали трансфекции с использованием электропорации (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США) кольцевыми плазмидами, кодирующими 1) ДНК двойного мутанта ILT транспозазы piggyBac (ITR, SEQ ID NO: 11), 2) ДНК тройного мутанта LLT транспозазы piggyBac (LLT, SEQ ID NO: 9) и 3) не содержащими транспозазу piggyBac (отсутствует), при этом все они находились в комбинации с кольцевой плазмидой, содержащей представляющий интерес ген и 5'- и 3'-элементы инвертированных повторов транспозона piggyBac из Trichoplusia ni. Тестировали три представляющих интерес гена: гетеро-Fc биспецифического активатора, привлекающего T-клетки, IgG-scFv и моноклонального антитела (mAb).Glutamine synthase knockout CHO cells (GSKO cells) were transfected by electroporation (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) with circular plasmids encoding 1) piggyBac double mutant ILT transposase DNA (ITR, SEQ ID NO: 11), 2) piggyBac triple mutant LLT transposase DNA (LLT, SEQ ID NO: 9), and 3) piggyBac transposase-null (absent), all in combination with a circular plasmid containing the gene of interest and the 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon from Trichoplusia ni. Three genes of interest were tested: hetero-Fc bispecific T cell attractor activator, IgG-scFv, and a monoclonal antibody (mAb).

Метионинсульфоксимин (MSX) (EDM Millipore, Берлингтон, Массачусетс, США), 25 мкМ, добавляли через 3 дня после трансфекции (25), после восстановления жизнеспособности начального пула до >90% (0-25) или вовсе не добавляли (0). Добавление метионинсульфоксимина (MSX), ингибитора глутаминсинтазы, применяют для увеличения экспрессии представляющего гена в линии клеток GSKO CHO.Methionine sulfoximine (MSX) (EDM Millipore, Burlington, MA, USA), 25 μM, was added 3 days post-transfection (25), after recovery of the starting pool viability to >90% (0-25), or not added at all (0). Addition of methionine sulfoximine (MSX), a glutamine synthase inhibitor, was used to increase the expression of the presenting gene in the GSKO CHO cell line.

После восстановления клеток, обработанных MSX, их использовали для мелкомасштабного продуцирования в режиме культивирования с подпиткой в 24-луночных планшетах или вращающихся пробирках для оценки экспрессии экспрессируемого белка в стабильных линиях клеток. Культуры высевали из расчета 1*10⁶ клеток/мл в базальную среду для продуцирования без глутамина и подпитку дополнительными питательными веществами осуществляли в дни 3, 6 и 8. Культуры собирали в день 10 и анализировали супернатанты в отношении титра, как описано в примере 1.After recovery of MSX-treated cells, they were used for small-scale production in fed-batch culture mode in 24-well plates or spinner tubes to assess expression of the expressed protein in stable cell lines. Cultures were seeded at 1* ¹⁰⁶ cells/mL in basal production medium without glutamine and fed with additional nutrients on days 3, 6, and 8. Cultures were harvested on day 10 and supernatants were analyzed for titer as described in Example 1.

Для пулов, которые трансфицировали мутантной транспозазой (ILT или LLT), показано увеличение экспрессии по сравнению с пулами с транспозазой, которые не получали обработку с помощью MSX (0 мкМ MSX). В случае пулов, в которые не добавляли транспозазу (отсутствует), при добавлении MSX экспрессия не увеличивалась.Pools transfected with mutant transposase (ILT or LLT) showed an increase in expression compared to pools with transposase that did not receive MSX treatment (0 μM MSX). In the case of pools that did not receive transposase (none), expression was not increased by adding MSX.

Транспозон обеспечивает полунаправленный механизм трансфекции, который нацеливается на открытые участки хроматина, которые представляют собой области активной транскрипции в геноме. При интеграции транспозона в комбинации с транспозазой интегрируется полная последовательность вектора, расположенная между 5'- и З'-элементами инвертированных повторов транспозона. Трансфекция транспозона без транспозазы приводит к случайной интеграции в хромосому, и вследствие этого полная последовательность вектора, расположенная между 5'- и 3'-элементами инвертированных повторов транспозона, может не встроиться в активный сайт. Кроме того, без транспозазы не гарантирована полная интеграция, что может приводить к разрыву связи между представляющим интерес геном и маркером отбора (в данном случае глутаминсинтазой), и виду этого MSX не будет оказывать влияние на экспрессию представляющего интерес гена.The transposon provides a semi-targeted transfection mechanism that targets open chromatin regions, which are regions of active transcription in the genome. When a transposon is integrated in combination with a transposase, the entire vector sequence located between the 5' and 3' elements of the transposon inverted repeats is integrated. Transfection of a transposon without a transposase results in random integration into the chromosome, and as a result, the entire vector sequence located between the 5' and 3' elements of the transposon inverted repeats may not integrate into the active site. Furthermore, without a transposase, complete integration is not guaranteed, which may lead to a break in the link between the gene of interest and the selection marker (in this case, glutamine synthase), and as a result, MSX will have no effect on the expression of the gene of interest.

В контексте тестируемой векторной системы сконструированная транспозаза обладала дополнительным преимуществом, заключающимся в увеличении экспрессии как при добавлении MSX, так и без него по сравнению с контролем без транспозазы. (фиг. 5). Увеличение числа копий за счет piggyBac также могло способствовать улучшению отбора с помощью MSX.In the context of the vector system tested, the engineered transposase had the additional benefit of increasing expression with and without the addition of MSX compared to the no-transposase control (Fig. 5). The increase in copy number by piggyBac could also contribute to the improved selection by MSX.

Пример 3. Трансфекция с помощью ДНК или мРНК транспозаз piggyBacExample 3. Transfection with DNA or mRNA transposases piggyBac

Транспозаза, которую применяют для интеграции представляющего интерес гена, может быть на основе ДНК или мРНК. Одна проблема, связанная с применением транспозазы, транскрибируемой с ДНК, заключает в возможности интеграции гена транспозазы в геном, что могло бы приводить к активной транскрипции/трансляции транспозазы в подвергнутой трансфекции линии клеток. Возможно, это могло бы приводить к нестабильности генома вследствие транспозазной активности в потенциальных скрытых сайтах распознавания транспозазой. Альтернатива заключается в применении для трансфекции мРНК, поскольку она не интегрируется в геном.The transposase used to integrate the gene of interest can be DNA or mRNA based. One concern with using a transposase transcribed from DNA is the possibility of the transposase gene integrating into the genome, which could result in active transcription/translation of the transposase in the transfected cell line. This could potentially lead to genomic instability due to transposase activity at potential cryptic transposase recognition sites. An alternative is to use mRNA for transfection, since it does not integrate into the genome.

Для двойного мутанта, ILT, и тройного мутанта, LLT, транспозаз piggyBac получали немодифицированный мРНК-транскрипт с использованием оснований дикого типа, а также модифицированный синтетический мРНК-транскрипт с 25% замен на псевдо-U и 5-метил-Скэппированные основания.For the double mutant, ILT, and triple mutant, LLT, piggyBac transposases, an unmodified mRNA transcript using wild-type bases, as well as a modified synthetic mRNA transcript with 25% substitutions of pseudo-U and 5-methyl-Ccapped bases, were produced.

Для оценки транспозазы, транслируемой с мРНК, введенной в ходе трансфекции, проводили две серии экспериментов. В первом эксперименте тестировали мРНК-транскрипты двойного мутанта (ILT, SEQ ID NO: 17) и тройного мутанта (LLT, SEQ ID NO: 18) транспозазы piggyBac. Во втором эксперименте в дополнение к мРНК-транскрипту тестировали синтетический мРНК-транскрипт для двойного мутанта ILT с 25% замен на псевдо-U и 5-метил-С-кэппированные основания.To evaluate the transposase translated from the mRNA introduced during transfection, two sets of experiments were performed. In the first experiment, mRNA transcripts of a double mutant (ILT, SEQ ID NO: 17) and a triple mutant (LLT, SEQ ID NO: 18) of piggyBac transposase were tested. In the second experiment, in addition to the mRNA transcript, a synthetic mRNA transcript for the double mutant ILT with 25% substitutions for pseudo-U and 5-methyl-C-capped bases was tested.

мРНК-транскрипты и синтетические мРНК-транскрипты вместе с кольцевой плазмидой, содержащей 5'- и 3'-элементы инвертированных повторов транспозона piggyBac из Trichoplusia ni и ген, кодирующий моноклональное антитело, трансфицировали в линию GSKO клеток с применением либо электропорации, либо липидного способа трансфекции.mRNA transcripts and synthetic mRNA transcripts together with a circular plasmid containing the 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon from Trichoplusia ni and the gene encoding the monoclonal antibody were transfected into the GSKO cell line using either electroporation or lipid transfection.

В случае электропорации к 2*107 клеток, суспендированных в среде в кювете, добавляли равные количества линеаризованной векторной ДНК с генами транспозазы и транспозона. Смесь ДНК и клетокIn the case of electroporation, equal amounts of linearized vector DNA with transposase and transposon genes were added to 2*107 cells suspended in the medium in a cuvette. The mixture of DNA and cells

- 54 049367 подвергали электропорации с применением электропоратора Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories). Затем подвергнутые электропорации клетки вносили в теплую ростовую среду и инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение 3 дней, после чего клетки ресуспендировали в селективной среде для получения стабильных пулов. При липидной трансфекции использовали реагент липофектамин LTX (Gibco/ThermoFisher, Уолтем, Массачусетс, США). За день до трансфекции клетки высевали в количестве 1e6 клеток/мл в виде встряхиваемой суспензии. В день трансфекции клетки высевали в среду для трансфекции в 6-луночный планшет. Комплекс ДНК Mab/транспозаза/липофектамин LTX готовили и инкубировали. Затем комплекс добавляли к клеткам и инкубировали в течение 5-8 ч. После инкубации добавляли ростовую среду и клеткам давали возможность восстановиться в течение 2-3 дней. Для отделения клеток, в случае их прилипания, использовали трипсин и клетки центрифугировали и ресуспендировали в селективной среде для получения стабильных пулов.- 54 049367 were electroporated using a Bio-Rad Electroporator (Bio-Rad Laboratories). Electroporated cells were then added to warm growth medium and incubated at 37°C and 5% CO2 for 3 days, after which the cells were resuspended in selective medium to obtain stable pools. Lipid transfection reagent Lipofectamine LTX (Gibco/ThermoFisher, Waltham, MA, USA) was used. The day before transfection, cells were seeded at 1e6 cells/ml as a shake suspension. On the day of transfection, cells were seeded in transfection medium in a 6-well plate. DNA Mab/transposase/Lipofectamine LTX complex was prepared and incubated. The complex was then added to the cells and incubated for 5-8 hours. After incubation, growth medium was added and the cells were allowed to recover for 2-3 days. Trypsin was used to separate the cells if they adhered, and the cells were centrifuged and resuspended in selective medium to obtain stable pools.

Результаты трансфекции мРНК сравнивали с контрольными условиями, а именно линией GSKO клеток, подвергнутых трансфекции соответствующей ДНК, кодирующей транспозазу. Кольцевую плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую двойной мутант (ILT, SEQ ID NO:11) или тройной мутант (LLT, SEQ ID NO: 9), вместе с кольцевой плазмидой, содержащей 5'- и 3'-элементы инвертированных концевых повторов транспозона piggyBac из Trichoplusia ni, заключающих последовательность моноклонального антитела, трансфицировали при тех же условиях, что и мРНК.The results of mRNA transfection were compared with control conditions, namely a GSKO cell line transfected with the corresponding DNA encoding the transposase. A circular plasmid containing DNA encoding the double mutant (ILT, SEQ ID NO:11) or the triple mutant (LLT, SEQ ID NO:9), together with a circular plasmid containing the 5' and 3' elements of the inverted terminal repeats of the piggyBac transposon from Trichoplusia ni containing the monoclonal antibody sequence, were transfected under the same conditions as the mRNA.

Количества мРНК и ДНК транспозазы, представляющего интерес гена, соотношение ДНК или РНК представляющего интерес гена и транспозазы и число трансфицированных клеток меняли для тестирования оптимальных условий, табл. 4.The amounts of mRNA and DNA of the transposase of the gene of interest, the ratio of DNA or RNA of the gene of interest to transposase, and the number of transfected cells were varied to test the optimal conditions, Table 4.

Таблица 4. Условия электропорации и липофекцииTable 4. Electroporation and lipofection conditions

Транспозаза Transpozaza ДНК Mab (мкг) DNA Mab (mcg) ДНК или мРНК транспозазы (мкг) Transposase DNA or mRNA (µg) Соотношение Mab и транспозазы Ratio of Mab and transposase Эксперимент 1. Электропорация 2e7 клеток-хозяев Experiment 1. Electroporation of 2e7 host cells ДНК-контроль DNA control 20 20 5 5 4:1 4:1 Отсутствует Absent 20 20 0 0 мРНК mRNA 20 20 5 5 4:1 4:1 мРНК mRNA 20 20 10 10 2:1 2:1 мРНК mRNA 20 20 20 20 1:1 1:1 мРНК mRNA 14 14 100 100 1:7 1:7 мРНК mRNA 28 28 200 200 1:7 1:7 Эксперимент 2. Обработка липофектамином LXT 1,2e6 клеток-хозяев Experiment 2. Treatment of host cells with lipofectamine LXT 1,2e6 ДНК-контроль DNA control 2 2 0,5 0,5 4:1 4:1 ДНК-контроль DNA control 2 2 2 2 1:1 1:1 ДНК-контроль DNA control 4 4 4 4 1:1 1:1 мРНК mRNA 2 2 0,5 0,5 4:1 4:1 мРНК mRNA 2 2 2 2 1:1 1:1 мРНК mRNA 4 4 4 4 1:1 1:1 Эксперимент 3. Электропорация 2e7 клеток-хозяев Experiment 3. Electroporation of 2e7 host cells ДНК-контроль DNA control 30 30 15 15 2:1 2:1 мРНК mRNA 30 30 15 15 2:1 2:1 Синтетическая мРНК Synthetic mRNA 30 30 15 15 2:1 2:1

Трансфицированные клетки оставляли для восстановления в среде, дополненной глутамином, на три дня при 36°C и 5% CO2 перед заменой на селективную среду без глутамина. Их пересевали через каждые 3-4 дня в селективную среду при 36°C и 5% CO2 до тех пор, пока они не восстановили >90% своей жизнеспособности, и анализировали в отношении титра, как описано в примере 1.Transfected cells were allowed to recover in glutamine-supplemented medium for three days at 36°C and 5% CO2 before being replaced with selective medium lacking glutamine. They were subcultured every 3-4 days in selective medium at 36°C and 5% CO2 until they had recovered >90% of their viability and assayed for titer as described in Example 1.

В случае двойного мутанта ILT транспозазы piggyBac при трансфекциях с помощью мРНК достигались уровни экспрессии, сравнимые с трансфекциями с помощью ДНК при использовании либо электропорации, либо липидного способа трансфекции. На фиг. 6 показаны уровни экспрессии моноклонального антитела в клетках, подвергнутых трансфекции ДНК или мРНК двойным мутантом ILT транспозазы с использованием электропорации или липидного способа. На фиг. 6А показаны результаты трансфекции с использованием электропорации. В сравнении с ДНК-контролем экспрессия увеличивалась, поскольку увеличивалось количество мРНК. Тройной мутант LLT дал аналогичные результаты, данные не приведены. На фиг. 6B показаны результаты трансфекции с использованием липидного способа. Уровни экспрессии моноклонального антитела были лучшими или по меньшей мере сравнимыми с уровнями для ДНК-контроля.In the case of the piggyBac double mutant ILT transposase, mRNA transfections achieved expression levels comparable to DNA transfections using either the electroporation or lipid transfection methods. Figure 6 shows the expression levels of the monoclonal antibody in cells transfected with DNA or mRNA with the ILT transposase double mutant using either the electroporation or lipid method. Figure 6A shows the results of transfection using electroporation. Compared to the DNA control, expression increased as the amount of mRNA increased. The LLT triple mutant gave similar results, data not shown. Figure 6B shows the results of transfection using the lipid method. The expression levels of the monoclonal antibody were better than or at least comparable to those of the DNA control.

С использованием электропорации сравнивали результаты для синтетического варианта мРНК и мРНК. Оба варианта характеризовались более высокой экспрессией, чем контроль, который не был подвергнут трансфекции транспозазой (-).Using electroporation, the results for the synthetic mRNA variant and the mRNA were compared. Both variants were characterized by higher expression than the control, which was not subjected to transposase transfection (-).

- 55 049367- 55 049367

На фиг. 7 показаны уровни экспрессии моноклонального антитела применительно к экспрессии в пулах, трансфицированных с помощью ДНК двойного мутанта транспозазы ILT и обеих мРНК за счет электропорации. Пулы, подвергнутые трансфекции с помощью мРНК и синтетической мРНК, характеризовались аналогичными титрами с таковыми у пулов с транспозазой на основе ДНК, и более высокими титрами, чем у контрольных пулов без транспозазы.Figure 7 shows the expression levels of the monoclonal antibody relative to expression in pools transfected with the ILT double mutant transposase DNA and both mRNAs by electroporation. Pools transfected with the mRNA and the synthetic mRNA had similar titers to pools with the DNA-based transposase and higher titers than the control pools without transposase.

Анализ интеграции гена транспозазы на уровне геномной ДНКAnalysis of transposase gene integration at the genomic DNA level

Также анализировали интеграцию генов двойного мутанта ILT и тройного мутанта LLT транспозазы piggyBac на уровне геномной ДНК. Для проверки присутствия транспозазы использовали олигонуклеотидные праймеры к 5'- и 3'-концам нуклеотидной последовательности транспозазы, которые амплифицировали фрагмент длиной ~1,7 т. о. Геномную ДНК экстрагировали с использованием набора для выделения ДНК из клеток крови и культур клеток DNA Maxi (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США) из клеточных осадков, собранных от 1e7 клеток из восстановленных линий клеток, трансфицированных с помощью либо мРНК, либо ДНК. В качестве положительного контроля включали плазмидную ДНК. Геномную ДНК подвергали количественной оценке и проверяли ее качество (хорошим качеством считали >1,8) по соотношению поглощения 260/280 с использованием спектрофотометра NanoDrop (ThermoFisher, Уолтем, Массачусетс, США). ПЦР-амплификацию проводили с применением высокоточной полимеразы Q5 от компании New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США) на системе для ПЦР ProFlex (Life Technologies, Карлсбург, Калифорния, США). Для визуализации реакционную смесь прогоняли на агарозном геле.The integration of the piggyBac double mutant ILT and triple mutant LLT transposase genes was also analyzed at the genomic DNA level. To test for the presence of transposase, oligonucleotide primers to the 5' and 3' ends of the transposase nucleotide sequence were used, which amplified a fragment of ~1.7 kb. Genomic DNA was extracted using the DNA Maxi Blood and Cell Culture DNA Isolation Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) from cell pellets collected from 1e7 cells from reconstituted cell lines transfected with either mRNA or DNA. Plasmid DNA was included as a positive control. Genomic DNA was quantified and checked for quality (good quality was defined as >1.8) by the 260/280 absorbance ratio using a NanoDrop spectrophotometer (ThermoFisher, Waltham, MA, USA). PCR amplification was performed using high-fidelity Q5 polymerase from New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) on a ProFlex PCR system (Life Technologies, Carlsburg, CA, USA). The reaction mixture was run on an agarose gel for visualization.

Анализ интеграции гена транспозазы на уровне кДНКAnalysis of transposase gene integration at the cDNA level

Также анализировали интеграцию гена двойного мутанта ILT транспозазы piggyBac на уровне транскрипта. Описанные выше олигонуклеотидные праймеры снова использовали для амплификации фрагмента размером ~1,7 т. о. для проверки присутствия транскрипта транспозазы в клетке. мРНК экстрагировали с использованием мининабора RNeasy (Qiagen) из клеточных осадков, собранных от 1e7 клеток из восстановленных линий клеток, трансфицированных с помощью добавления либо мРНК, либо ДНК транспозазы. В качестве контроля включали плазмидную ДНК. мРНК подвергали количественной оценке и проверяли ее качество по соотношению поглощения 260/280 с использованием спектрофотометра NanoDrop. Транспозазу проверяли на уровне транскрипта с применением системы для одностадийной RT-PCR SuperScript III с высокоточной ДНК-полимеразой Taq Platinum (ThermoFisher), которая выполняет синтез кДНК и последующую амплификацию последовательности-мишени (т.е. транспозазы) на системе для ПЦР ProFlex (Life Technologies), согласно рекомендациям производителя. Для визуализации реакционную смесь прогоняли на агарозном геле.Integration of the piggyBac double mutant ILT transposase gene at the transcript level was also analyzed. The oligonucleotide primers described above were again used to amplify a ~1.7 kb fragment to test for the presence of the transposase transcript in the cell. mRNA was extracted using the RNeasy Mini Kit (Qiagen) from cell pellets collected from 1e7 cells from reconstituted cell lines transfected with either transposase mRNA or DNA. Plasmid DNA was included as a control. mRNA was quantified and quality checked by the 260/280 absorbance ratio using a NanoDrop spectrophotometer. Transposase was verified at the transcript level using the SuperScript III one-step RT-PCR system with Taq Platinum high-fidelity DNA polymerase (ThermoFisher), which performs cDNA synthesis and subsequent amplification of the target sequence (i.e., transposase) on the ProFlex PCR system (Life Technologies), according to the manufacturer's recommendations. For visualization, the reaction mixture was run on an agarose gel.

Пулы линий клеток, трансфицированных с помощью ДНК и мРНК, проверяли в отношении интеграции как на уровне генома, так и на уровне транскриптов, фиг. 8. Присутствие полоски размером ~1,7 т. о. указывало на присутствие транспозазы в геноме линии клеток, фиг. 8А. Все пулы линий клеток, трансфицированных ДНК двойного мутанта, ILT, транспозазы, имели интеграцию на уровне транскрипта, тогда как линии, трансфицированные с помощью мРНК, не имели интеграцию на уровне генома или транскрипта, фиг. 8B.Pools of cell lines transfected with DNA and mRNA were examined for integration at both the genomic and transcript levels, Fig. 8. The presence of a band of ~1.7 kb indicated the presence of transposase in the genome of the cell line, Fig. 8A. All pools of cell lines transfected with the double mutant, ILT, transposase DNA had integration at the transcript level, whereas lines transfected with mRNA had no integration at the genomic or transcript levels, Fig. 8B.

ddPCR-анализ числа копийddPCR copy number analysis

Для анализа числа копий геномную ДНК экстрагировали из 5*10⁶ клеток каждого клона и пула с использованием набора для клеток крови и тканей DNeasy (Qiagen). Цифровую капельную ПЦР проводили с использованием набора ddPCR Supermix для зондов (без dUTP) (Bio-Rad) в соответствии с рекомендациями производителя. Каждая реакционная смесь содержала 1 единицу HindIII, 10 нг ДНКшаблона, а также 900 нМ прямого и обратного праймеров и 250 нМ флуоресцентного зонда, разработанного для нацеливания на кодирующую последовательность-мишень для двойного мутанта ILT и эндогенный эталонный ген СНО, Gcg. Капли создавали с использованием системы AutoDG (BioRad), а ПЦР-амплификацию выполняли на системе для ПЦР ProFlex (Life Technologies) при следующих условиях термоциклирования: 10 мин при 95°C, с последующими 40 циклами при 94°C в течение 30 с и 60°C в течение 1 мин, затем 98°C в течение 10 мин. Капли считывали на системе для считывания капель QX200 (Bio-Rad), а анализ данных по числу копий выполняли с использованием программного обеспечения Quantasoft (Bio-Rad).For copy number analysis, genomic DNA was extracted from 5 x ¹⁰⁶ cells of each clone and pool using the DNeasy Blood and Tissue Cell Kit (Qiagen). Digital droplet PCR was performed using the ddPCR Supermix Probe Kit (dUTP-free) (Bio-Rad) according to the manufacturer's recommendations. Each reaction mixture contained 1 unit of HindIII, 10 ng of template DNA, as well as 900 nM forward and reverse primers and 250 nM of a fluorescent probe designed to target the ILT double mutant target coding sequence and the endogenous CHO reference gene, Gcg. Droplets were generated using the AutoDG System (BioRad) and PCR amplification was performed on a ProFlex PCR System (Life Technologies) using the following thermal cycling conditions: 10 min at 95°C, followed by 40 cycles of 94°C for 30 s and 60°C for 1 min, then 98°C for 10 min. Droplets were read on a QX200 Droplet Reader System (Bio-Rad) and copy number data analysis was performed using Quantasoft software (Bio-Rad).

Чтобы определить, все ли клоны в пределах пула имели интегрированную транспозазу, пулы, подвергнутые трансфекцией с помощью ДНК транспозазы, клонировали по одной клетке и проверяли на интеграцию на уровне геномной ДНК (gDNA). Пул и клоны также анализировали с помощью ddPCR в отношении числа копий транспозазы.To determine whether all clones within a pool had integrated transposase, pools transfected with transposase DNA were cloned single-cell and tested for integration at the genomic DNA (gDNA) level. The pool and clones were also analyzed by ddPCR for transposase copy number.

Пул характеризовался малым числом копий и содержал клоны, в которых интеграция транспозазы отсутствовала. Клоны без интеграции транспозазы идентифицировали путем скрининга клонов с использованием способа на основе ПЦР, описанного выше. Клоны с отсутствием интегрированной транспозазы присутствовали в популяции пула, фиг. 9.The pool was characterized by a low copy number and contained clones in which the transposase integration was absent. Clones lacking transposase integration were identified by screening clones using the PCR-based method described above. Clones lacking integrated transposase were present in the pool population, Fig. 9.

Пример 4. Получение TCR-T-клеток с применением транспозазы piggyBacExample 4. Generation of TCR-T cells using piggyBac transposase

Двойной мутант ILT транспозазы piggyBac успешно применяли для модификации первичных ТA double mutant of the ILT transposase piggyBac was successfully used to modify primary T

--

Claims

cells designed to express the T cell receptor (TCR), Fig. 10A. PiggyBac-derived TCR T cells exhibited robust target killing as well as antigen-specific proliferation (Figs. 10B and 10C).

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first isolated from leukapheresis products of healthy donors by Ficoll-Paque separation (GE Healthcare, Chicago, IL, USA), and then T cells were isolated from PBMCs using the EasySep Human T Cell Isolation Kit (Stemcell Technologies, Vancouver, Canada). T cells were then activated and 2 days after activation, T cells were co-electroporated with a plasmid containing the 5' and 3' inverted terminal repeat elements of the piggyBac transposon containing the genes encoding TCR-IRES-EGFP and mRNA encoding the double mutant ILT transposase (SEQ ID NO: 18) using the 4-D Nucleofection System (Lonza, Greenwood, SC, USA). The cytokine IL2 was added to the cells every 2-3 days.

Determination of TCR integration

At day 7 post-activation, T cells were assessed for TCR expression and cell phenotype by cell surface staining with a dextramer antibody (Immudex, Copenhagen, Denmark) recognizing the TCR and fluorophore-conjugated antibodies to CD3, CD4, and CD8 (Biolegend, San Diego, CA, USA). Samples were analyzed for expression by running on a BD LSRII flow cytometer.

Functional analyses

T cells were counted and collected for functional assays at days 9–14 post-activation.

Cell lysis and proliferation assay

T cells stained with 1E5 CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) were co-incubated with 5e4 target cells in 150 μl medium in a 96-well U-bottom plate for 5 days. Target cell lysis and T cell proliferation were assessed by dilution of CellTrace Violet, which was quantified by running samples on a BD LSRFortessa flow cytometer (Liberty Lake, WA, USA).

CLAUSE OF INVENTION

1. A piggyBac transposase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, comprising at least one of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 in SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 in SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 in SEQ ID NO: 2.

2. The piggyBac transposase of claim 1, comprising at least two of the following amino acid substitutions: isoleucine to leucine at position 147 in SEQ ID NO: 2, isoleucine to leucine at position 247 in SEQ ID NO: 2, and serine to threonine at position 533 in SEQ ID NO: 2.

3. The piggyBac transposase according to claim 1, comprising a substitution of isoleucine to leucine at position 247 in SEQ ID NO: 2 and a serine to threonine at position 533 in SEQ ID NO: 2.

4. The piggyBac transposase according to claim 1, comprising an isoleucine to leucine substitution at position 147 in SEQ ID NO: 2, an isoleucine to leucine substitution at position 247 in SEQ ID NO: 2, and a serine to threonine substitution at position 533 in SEQ ID NO: 2.

5. The piggyBac transposase of claim 1, wherein the titer of the recombinant protein of interest expressed by a cell transfected with the engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the same protein of interest expressed by a cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or one lacking the piggyBac transposase.

6. The piggyBac transposase of claim 5, wherein the recombinant protein of interest is an antigen-binding protein.

7. A piggyBac transposase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16.

8. The piggyBac transposase according to claim 7, having the amino acid sequence SEQ ID NO: 12.

9. The piggyBac transposase according to claim 7, having the amino acid sequence SEQ ID NO: 10.

10. An engineered nucleic acid molecule encoding the piggyBac transposase according to any one of claims 1, 7, 8 or 9.

11. The piggyBac transposase encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18.

12. A vector containing a constructed nucleic acid molecule according to claim 10.

13. A vector comprising the engineered nucleic acid molecule of claim 10, further comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

14. The vector of claim 13, wherein the vector comprises one or more nucleic acid sequences

- 57 049367 slots encoding one or more proteins of interest.

15. A cell transfected with a constructed nucleic acid molecule according to claim 10.

16. A cell transfected with the vector according to item 12.

17. The cell according to claim 15 or 16, wherein the cell is a host cell.

18. The cell according to claim 15 or 16, wherein the cell is a CHO cell.

19. The cell according to claim 15 or 16, wherein the cell is an immune cell.

20. A cell co-transfected with an engineered nucleic acid molecule according to claim 10 and a vector comprising at least one nucleic acid molecule encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

21. A cell co-transfected with the vector of claim 12 and a vector comprising at least one nucleic acid molecule encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

22. A cell co-transfected with a vector comprising the engineered nucleic acid molecule of claim 10 and comprising at least one nucleic acid molecule encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

23. The cell of any one of claims 15, 16, 20, 21 or 22, wherein the titer of the protein of interest expressed by a cell transfected with the engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the same protein of interest expressed by a cell transfected with wild-type piggyBac transposase or lacking the piggyBac transposase.

24. A method for increasing the titer of a recombinant protein of interest expressed by a host cell, comprising co-transfecting a host cell with an engineered nucleic acid molecule according to claim 10 and a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of a piggyBac transposon; and culturing the cells to express the recombinant protein of interest, wherein the titer of the recombinant protein of interest expressed by the host cell transfected with the engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with a wild-type piggyBac transposase or lacking the piggyBac transposase.

25. The method of claim 24, wherein the host cell is transfected with a first vector comprising the engineered nucleic acid molecule of claim 10 and a second vector comprising a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

26. The method of claim 24, wherein the host cell is transfected with a single vector comprising the engineered nucleic acid molecule of claim 10 and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

27. A method for increasing the production of a recombinant protein in a mammalian cell culture expressing a recombinant protein, comprising creating a cell culture in a bioreactor using a host cell that has been co-transfected with a nucleic acid molecule according to claim 10 and a vector containing a nucleic acid molecule encoding a protein of interest flanked by at least elements of the piggyBac transposon inverted repeats; and expressing the recombinant protein of interest;

wherein the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with the engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by a host cell transfected with wild-type piggyBac transposase or lacking piggyBac transposase.

28. The method of claim 25, wherein the host cell is transfected with a first vector comprising the engineered nucleic acid molecule of claim 10 and a second vector comprising a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

29. The method of claim 25, wherein the host cell is transfected with a single vector comprising the engineered nucleic acid molecule of claim 10 and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

- 58 049367

30. A method for producing an isolated, purified recombinant protein of interest, comprising creating a cell culture in a bioreactor using a host cell expressing the recombinant protein of interest, wherein the cell line has been co-transfected with the engineered nucleic acid sequence of claim 10 and a vector containing a nucleic acid sequence encoding the protein of interest flanked by at least 5' and 3' elements of inverted repeats of the piggyBac transposon;

culturing cells to express the recombinant protein of interest;

collecting a recombinant protein of interest, processing the recombinant protein of interest through one or more unit operations, and obtaining an isolated, purified recombinant protein of interest.

31. The method of claim 30, wherein the host cell is transfected with a first vector comprising the engineered nucleic acid molecule of claim 10 and a second vector comprising a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

32. The method of claim 30, wherein the host cell is transfected with a single vector comprising the engineered nucleic acid molecule of claim 10 and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon.

33. The method of claim 30, wherein the titer of the recombinant protein of interest expressed by the host cell transfected with the engineered piggyBac transposase is increased compared to the titer of the recombinant protein of interest expressed by the host cell transfected with wild-type piggyBac transposase or lacking the piggyBac transposase.

34. A method for obtaining cells genetically modified without the participation of a virus, which includes:

(a) creating a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon;

(b) isolating native immune cells from a donor or subject;

(c) transfecting cells with the vector and the engineered nucleic acid sequence of claim 10; and (d) propagating the cells by culturing the cells to form a larger population of cells genetically modified without the involvement of a virus.

35. The method of claim 34, wherein the cells are transfected with a vector comprising at least one nucleic acid sequence encoding at least one protein of interest flanked by at least 5' and 3' inverted repeat elements of the piggyBac transposon, and a vector comprising the engineered nucleic acid sequence of claim 10.

36. The method according to claim 34, wherein the cells are transfected with a vector containing