EA048264B1 - Способы и композиции для вставки кодирующих антитела последовательностей в локус "безопасная гавань" - Google Patents

Abstract

Предложены способы и композиции для интеграции кодирующих последовательностей для антигенсвязывающих белков, таких как нейтрализующие антитела широкого спектра действия, в локус "безопасная гавань", такой как локус альбумина у животного in vivo.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка заявляет приоритет согласно заявке США № 62/828518, поданной 3 апреля 2019 г., и заявке США № 62/887885, поданной 16 августа 2019 г., каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей.

Ссылка на перечень последовательностей, представленный в текстовом файле посредством EFS WEB

Перечень последовательностей, записанный в файле 544998SEQLIST.txt, имеет объем 186 килобайт, был создан 2 апреля 2020 г. и включен в данный документ посредством ссылки.

Уровень техники

Нейтрализующие антитела играют важную роль в антибактериальном и противовирусном иммунитете и играют важную роль в предотвращении или модуляции бактериальных или вирусных заболеваний. Антитела, вырабатываемые иммунной системой при инфицировании или активной вакцинации, имеют тенденцию сосредотачиваться на легкодоступных петлях на бактериальной или вирусной поверхности, которые часто имеют большую последовательность и конформационную изменчивость. Однако бактериальная или вирусная популяция могут быстро уклоняться от этих антител, а антитела атакуют части белка, которые не являются необходимыми для функционирования. Хотя нейтрализующие антитела широкого спектра действия могут преодолеть эти проблемы, эти антитела, как правило, появляются слишком поздно, чтобы обеспечить эффективную защиту от болезни, а лечение такими антителами обеспечивает лишь кратковременную защиту.

Сущность изобретения

Представлены животные, имеющие кодирующие последовательности для антигенсвязывающих белков, интегрированные в локус безопасная гавань, и способы интеграции кодирующих последовательностей для антигенсвязывающих белков в локус безопасная гавань у животных in vivo. Точно так же клетки, геномы или гены, содержащие кодирующие последовательности для антигенсвязывающих белков, интегрированные в локус безопасна гавань, и способы интеграции кодирующих последовательностей для антигенсвязывающих белков в локус безопасная гавань в клетке, геноме или гене in vitro или in vivo. В одном аспекте представлены способы вставки последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в локус безопасная гавань у животного in vivo. Некоторые такие способы включают введение животному нуклеазного агента, нацеленного на целевой сайт в локусе безопасная гавань, и экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом нуклеазный агент расщепляет целевой сайт, а последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставляется в локус безопасная гавань для получения модифицированного локуса безопасная гавань. Некоторые такие способы включают введение животному: (а) нуклеазного агента, который нацелен на сайт-мишень в локусе безопасная гавань, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент; и (b) экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом нуклеазный агент расщепляет целевой сайт, а последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставляется в локус безопасная гавань для получения модифицированного локуса безопасная гавань. Аналогичным образом представлены способы вставки последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в локус безопасная гавань в клетке in vitro или in vivo. Некоторые такие способы включают введение в клетку нуклеазного агента, нацеленного на целевой сайт в локусе безопасная гавань, и экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом нуклеазный агент расщепляет целевой сайт, а последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставляется в локус безопасная гавань для получения модифицированного локуса безопасная гавань. Некоторые такие способы включают введение в клетку: (а) нуклеазного агента, который нацелен на сайт-мишень в локусе безопасная гавань, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент; и (b) экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом нуклеазный агент расщепляет целевой сайт, а последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставляется в локус безопасная гавань для получения модифицированного локуса безопасная гавань. В другом аспекте представлены нуклеазный агент и экзогенная донорная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, для применения при вставке последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в локус безопасная гавань у субъекта (например, животного или клетки in vivo), при этом нуклеазный агент нацелен на сайт-мишень и расщепляет его в локусе безопасная гавань и при этом экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вставляют в локус безопасная гавань. В другом аспекте представлены нуклеазный агент или одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенная донорная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, для применения при вставке последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в локус безопасная гавань у субъекта (например, животного или клетки in vivo), при этом нуклеазный агент нацелен на сайт-мишень и расщепляет его в локусе безопасная гавань и при этом экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вставляют в локус безопасная гавань. Некоторые такие способы могут включать введение животному или в клетку нуклеазного агента,

- 1 048264 нацеленного на целевой сайт в локусе безопасная гавань, и экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом нуклеазный агент расщепляет целевой сайт, а последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставляется в локус безопасная гавань для получения модифицированного локуса безопасная гавань. Некоторые такие способы могут включать введение животному или в клетку: (а) нуклеазного агента, который нацелен на сайт-мишень в локусе безопасная гавань, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент; и (b) экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом нуклеазный агент расщепляет сайт-мишень, а последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставляется в локус безопасная гавань для получения модифицированного локуса безопасная гавань. В другом аспекте представлены нуклеазный агент и экзогенная донорная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, для применения при лечении или проведении профилактики (предотвращения) заболевания у субъекта (например, животного), при этом нуклеазный агент нацелен на сайт-мишень и расщепляет его в локусе безопасная гавань у субъекта, при этом экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вставляют в локус безопасная гавань, и при этом антигенсвязывающий белок экспрессируется у субъекта и нацелен на антиген, ассоциированный с заболеванием. В другом аспекте представлен нуклеазный агент или одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенная донорная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, для применения при лечении или проведении профилактики (предотвращения) заболевания у субъекта (например, животного), при этом нуклеазный агент нацелен на сайт-мишень и расщепляет его в локусе безопасная гавань у субъекта, при этом экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вставляют в локус безопасная гавань, и при этом антигенсвязывающий белок экспрессируется у субъекта и нацелен на антиген, ассоциированный с заболеванием. Некоторые такие способы могут включать введение животному нуклеазного агента, нацеленного на сайт-мишень в локусе безопасная гавань, и экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом антигенсвязывающий белок нацелен на антиген, ассоциированный с заболеванием, причем нуклеазный агент расщепляет сайт-мишень, а последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в локус безопасная гавань для получения модифицированного локуса безопасная гавань, в результате чего антигенсвязывающий белок экспрессируется в животном и связывает антиген, ассоциированный с заболеванием. Некоторые такие способы могут включать введение животному: (а) нуклеазного агента, нацеленного на сайт-мишень в локусе безопасная гавань, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент; и (b) экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующей антигенсвязывающий белок, при этом антигенсвязывающий белок нацелен на антиген, ассоциированный с заболеванием, причем нуклеазный агент расщепляет сайт-мишень, а последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в локус безопасная гавань для получения модифицированного локуса безопасная гавань, в результате чего антигенсвязывающий белок экспрессируется у животного и связывает антиген, ассоциированный с заболеванием.

В некоторых таких способах антигенсвязывающий белок нацелен на антиген, ассоциированный с заболеванием. В некоторых таких способах антигенсвязывающий белок у животного оказывает профилактическое или терапевтическое действие в отношении заболевания у животного. В еще одном аспекте предоставлены способы лечения или проведения профилактики заболевания у животного, имеющего заболевание или подверженного риску заболевания. Некоторые такие способы могут включать введение животному нуклеазного агента, нацеленного на сайт-мишень в локусе безопасная гавань, и экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом антигенсвязывающий белок нацелен на антиген, ассоциированный с заболеванием, причем нуклеазный агент расщепляет сайт-мишень, а последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в локус безопасная гавань для получения модифицированного локуса безопасная гавань, в результате чего антигенсвязывающий белок экспрессируется в животном и связывает антиген, ассоциированный с заболеванием. Некоторые такие способы могут включать введение животному: (а) нуклеазного агента, нацеленного на сайт-мишень в локусе безопасная гавань, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент; и (b) экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующей антигенсвязывающий белок, при этом антигенсвязывающий белок нацелен на антиген, ассоциированный с заболеванием, причем нуклеазный агент расщепляет сайт-мишень, а последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в локус безопасная гавань для получения модифицированного локуса безопасная гавань, в результате чего антигенсвязывающий белок экспрессируется у животного и связывает антиген, ассоциированный с заболеванием.

В некоторых таких способах вставленная последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, функционально связана с эндогенным промотором в локусе безопасная гавань. В некоторых таких способах модифицированный локус безопасная гавань кодирует химерный белок, содержащий эндогенный сигнал секреции и антигенсвязывающий белок.

- 2 048264

В некоторых таких способах локус безопасная гавань представляет собой локус альбумина. Необязательно, последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в первый интрон локуса альбумина.

В некоторых таких способах последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в локус безопасная гавань в одной или более клетках печени животного.

В некоторых таких способах нуклеазный агент представляет собой нуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN), нуклеаза на основе эффектора, подобного активатору транскрипции, (TALEN), или белок (Cas), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами, (CRISPR), и направляющую РНК (англ.: gRNA - рус.: нРНК). Необязательно, нуклеазный агент представляет собой белок Cas и нРНК, где белок Cas представляет собой белок Cas9, и где нРНК включает: (a) CRISPR-РНК (сгРНК), которая нацелена на сайт-мишень, при этом сайт-мишень сразу фланкируется последовательностью мотива, прилегающего к протоспейсеру, (PAM); и (b) трансактивирующую CRISPR РНК (tracrРНК). Необязательно, по меньшей мере одна нРНК содержит 2'-O-метильные аналоги и 3'-фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в первых трех 5'- и 3'-концевых остатках РНК.

В некоторых таких способах последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют посредством негомологичного соединения концов. В некоторых таких способах экзогенная донорная нуклеиновая кислота не содержит гомологичные плечи. В некоторых таких способах последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют посредством направляемую гомологией репарацию. В некоторых таких способах экзогенная донорная нуклеиновая кислота является одноцепочечной. В некоторых таких способах экзогенная донорная нуклеиновая кислота является двухцепочечной.

В некоторых таких способах последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, в экзогенной донорной нуклеиновой кислоте фланкирована с каждой стороны сайтом-мишенью для нуклеазного агента, при этом нуклеазный агент расщепляет сайты-мишени, фланкирующие последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок. Необязательно, сайт-мишень в локусе безопасная гавань больше не присутствует, если последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в локус безопасная гавань в правильной ориентации, но он преобразуется, если последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в локус безопасная гавань в противоположной ориентации. Необязательно, экзогенную донорную нуклеиновую кислоту доставляют при помощи опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) доставки, а расщепление сайтов-мишеней, фланкирующих последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, удаляет инвертированные концевые повторы AAV.

В некоторых таких способах антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, полиспецифическое антитело, scFV, бис-scFV, диатело, триатело, тетратело, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)₂, антигенсвязывающий белок с двумя вариабельными доменами, антигенсвязывающий белок с одним вариабельным доменом, привлекающий T-клетки биспецифический активатор или антитело Дэвиса. В некоторых таких способах антигенсвязывающий белок не является одноцепочечным антигенсвязывающим белком. Необязательно, антигенсвязывающий белок содержит тяжелую цепь и отдельную легкую цепь, необязательно, где последовательность, кодирующую тяжелую цепь, содержит сегменты V_H, D_H, и J_H, а последовательность, кодирующую легкую цепь, содержит генные сегменты V_L и J_L. В некоторых таких способах последовательность, кодирующая тяжелую цепь, находится выше последовательности, кодирующей легкую цепь, в последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок. Необязательно, последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше последовательности, кодирующей легкую цепь. В некоторых таких способах последовательность, кодирующая легкую цепь, находится выше последовательности, кодирующей тяжелую цепь, в последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок. Необязательно, последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше последовательности, кодирующей тяжелую цепь. В некоторых таких способах экзогенная сигнальная последовательность секреции представляет собой сигнальную последовательность секреции ROR1.

В некоторых таких способах последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, кодирует тяжелую цепь и легкую цепь, связанные пептидом 2A или участком внутренней посадки рибосомы (IRES). Необязательно тяжелая цепь и легкая цепь связаны пептидом 2А. Необязательно, пептид 2A представляет собой пептид T2A.

В некоторых таких способах ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой ассоциированный с раком антиген. В некоторых таких способах ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой ассоциированный с инфекционным заболеванием антиген, такой как бактериальный антиген. Необязательно, бактериальный антиген представляет собой антиген PcrV Pseudomonas aeruginosa. В некоторых таких способах ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой вирусный антиген. Необязательно, вирусный антиген представляет собой антиген гриппа или антиген вируса Зика.

В некоторых таких способах вирусный антиген представляет собой антиген гемагглютинин гриппа. Необязательно, антигенсвязывающий белок содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и

- 3 048264 тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, где: (I) легкая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 18, и тяжелая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 20, необязательно при этом три CDR легкой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 76-78, соответственно, и три CDR тяжелой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 79-81, соответственно; или (II) модифицированный локус безопасная гавань содержит кодирующую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 120; или (III) легкая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 126, и тяжелая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 128, необязательно при этом три CDR легкой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 129-131, соответственно, и три CDR тяжелой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 132-134, соответственно; или (IV) модифицированный локус безопасная гавань содержит кодирующую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 146.

В некоторых таких способах вирусный антиген представляет собой антиген оболочки вируса Зика (Env). Необязательно, антигенсвязывающий белок содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, где: (I) легкая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3, и тяжелая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5, необязательно при этом три CDR легкой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 64-66, соответственно, и три CDR тяжелой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 67-69, соответственно; или (II) модифицированный локус безопасная гавань содержит кодирующую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 115. Необязательно, антигенсвязывающий белок содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, где: (I) легкая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13, и тяжелая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 15, необязательно при этом три CDR легкой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 70-72, соответственно, и три CDR тяжелой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 73-75, соответственно; или (II) модифицированный локус безопасная гавань содержит кодирующую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, указанной в любой из SEQ ID NO: 116-119.

В некоторых таких способах ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой бактериальный антиген.

В некоторых таких способах антигенсвязывающий белок представляет собой нейтрализующий антигенсвязывающий белок или нейтрализующее антитело. Необязательно, антигенсвязывающий белок представляет собой нейтрализующий антигенсвязывающий белок широкого спектра действия или нейтрализующее антитело широкого спектра действия.

В некоторых таких способах нуклеазный агент и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят в отдельных средствах доставки. В некоторых таких способах нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят в отдельных средствах доставки. В некоторых таких способах нуклеазный агент и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят вместе в одном и том же средстве доставки. В некоторых таких способах нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят вместе в одном и том же средстве доставки. В некоторых таких способах нуклеазный агент и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят одновременно. В некоторых таких способах нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят одновременно. В некоторых таких способах нуклеазный агент и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят последовательно. В некоторых таких способах нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят последовательно. В

- 4 048264 некоторых таких способах нуклеазный агент и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят в виде однократных доз. В некоторых таких способах нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят в виде однократных доз. В некоторых таких способах нуклеазный агент и/или экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят в виде многократных доз. В некоторых таких способах нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и/или экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят в виде многократных доз. В некоторых таких способах нуклеазный агент и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту доставляют посредством внутривенной инъекции. В некоторых таких способах нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту доставляют посредством внутривенной инъекции.

В некоторых таких способах нуклеазный агент и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят посредством опосредованной липидными наночастицами доставки, или посредством опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) доставки. Необязательно, и нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят посредством опосредованной AAV доставки. Необязательно, нуклеазный агент и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят при помощи множества разных векторов AAV (например, при помощи двух разных векторов AAV). Необязательно, AAV представляет собой AAV8 или AAV2/8. В некоторых таких способах нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят посредством опосредованной липидными наночастицами доставки или посредством опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) доставки. Необязательно, нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят посредством опосредованной AAV доставки. Необязательно, нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят при помощи множества разных векторов AAV (например, при помощи двух разных векторов AAV). Необязательно, AAV представляет собой AAV8 или AAV2/8. В некоторых таких способах нуклеазный агент вводят посредством опосредованной липидными наночастицами доставки. Необязательно липидная наночастица содержит Dlin-MC3-DMA (MC3), холестерин, DSPC и PEG-DMG в молярном соотношении 50: 38,5: 10: 1,5. В некоторых таких способах нуклеазный агент в липидной наночастице представляет собой белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами, (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК). Необязательно Cas9 находится в форме мРНК, а нРНК находится в форме РНК. В некоторых таких способах нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, вводят посредством опосредованной липидными наночастицами доставки. Необязательно липидная наночастица содержит Dlin-MC3-DMA (MC3), холестерин, DSPC и PEG-DMG в молярном соотношении 50: 38,5: 10: 1,5. В некоторых таких способах нуклеазный агент представляет собой белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами, (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК). Необязательно, Cas9 в липидной наночастице находится в форме мРНК, а нРНК в липидной наночастице находится в форме РНК.

В некоторых таких способах экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят посредством опосредованной AAV доставки. Необязательно, AAV представляет собой одноцепочечный AAV (ssAAV). Необязательно, AAV представляет собой самокомплементарный AAV (scAAV). Необязательно, AAV представляет собой AAV8 или AAV2/8.

В некоторых таких способах нуклеазный агент, содержащий мРНК, кодирующую белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами, (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК), вводят посредством опосредованной липидными наночастицами доставки, а экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят посредством опосредованной AAV8 или опосредованной AAV2/8 доставки. В некоторых таких способах нуклеазный агент содержит ДНК, кодирующую белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами, (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК), при этом ДНК, кодирующую Cas9, вводят посредством опосредованной AAV8 доставки в первом AAV8, или опосредованной AAV2/8 доставки в первом AAV2/8, а ДНК, кодирующую нРНК, и экзогенные донорные нуклеиновые кислоты вводят посредством AAV8-опосредованной доставки во втором AAV8, или опосредованной AAV2/8 доставки во втором AAV2/8. В некоторых таких способах нуклеазный агент содержит белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами, (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК), причем способ включает введение нРНК и мРНК, кодирующей Cas9, посредством опосредованной липидными наночастицами доставки, а экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят посредством опосредованной AAV8 или опосредованной AAV2/8 доставки. В некоторых таких способах нуклеазный агент содержит белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами, (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК), при этом способ включает введение ДНК, кодирующей Cas9, посредством опосредованной AAV8 доставки в первом AAV8 или посредством опосредованной AAV2/8 доставка в первом AAV2/8, а введение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты и ДНК, кодирующей нРНК, осуществляют посредством опосредо- 5 048264 ванной AAV8 доставки во втором AAV8 или посредством опосредованной AAV2/8 доставки во втором

AAV2/8.

В некоторых таких способах экспрессия антигенсвязывающего белка у животного приводит к уровням в плазме, равным по меньшей мере около 2,5, по меньшей мере около 5, по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 200 мкг/мл, по меньшей мере около 300 мкг/мл, по меньшей мере около 400 мкг/мл или по меньшей мере около 500 мкг/мл через около 2 недели, около 4 недели или около 8 недель после введения нуклеазного агента и экзогенной донорной последовательности. В некоторых таких способах экспрессия антигенсвязывающего белка у животного приводит к уровням в плазме, равным по меньшей мере около 2,5 мкг/мл, по меньшей мере около 5 мкг/мл, по меньшей мере около 10 мкг/мл, по меньшей мере около 100 мкг/мл, по меньшей мере около 200 мкг/мл, по меньшей мере около 300 мкг/мл, по меньшей мере около 400 мкг/мл, по меньшей мере около 500 мкг/мл, по меньшей мере около 600 мкг/мл, по меньшей мере около 700 мкг/мл, по меньшей мере около 800 мкг/мл, по меньшей мере около 900 мкг/мл или по меньшей мере около 1000 мкг/мл через около 2 недель, около 4 недель, около 8 недель, около 12 недель или около 16 недель после введения нуклеазного агента или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенной донорной последовательности.

В некоторых таких способах животное представляет собой отличное от человека животное. Необязательно, животное представляет собой отличное от человека млекопитающее. Необязательно, отличное от человека млекопитающее представляет собой крысу или мышь. В некоторых таких способах животное представляет собой человека.

В некоторых таких способах нуклеазный агент представляет собой белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами, (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК), при этом нуклеазный агент, и экзогенную донорную последовательность доставляют посредством опосредованной липидными наночастицами доставки, опосредованной аденоассоциированным вирусом 8 (AAV8) доставки или опосредованной AAV2/8 доставки, при этом последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в первый интрон эндогенного локуса альбумина посредством негомологичного соединения концов в одной или более клетках печени у животного, при этом вставленная последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, функционально связана с эндогенным промотором альбумина, модифицированный локус альбумина кодирует химерный белок, содержащий эндогенный сигнал секреции альбумина и антигенсвязывающий белок, при этом антигенсвязывающий белок нацелен на вирусный антиген или бактериальный антиген, антигенсвязывающий белок представляет собой нейтрализующее антитело широкого спектра действия, а кодирующие антигенсвязывающий белок последовательности кодируют тяжелую цепь и отдельную легкую цепь, связанные пептидом 2А. Необязательно, последовательность, кодирующая тяжелую цепь, находится выше последовательности, кодирующей легкую цепь, в кодирующей антигенсвязывающий белок последовательности, при этом последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше кодирующей последовательности легкой цепи, и при этом экзогенная сигнальная последовательность секреции представляет собой сигнальную последовательность секреции ROR1.

В некоторых таких способах нуклеазный агент представляет собой белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами, (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК), при этом нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную последовательность доставляют посредством опосредованной липидными наночастицами доставки, опосредованной аденоассоциированным вирусом 8 (AAV8) доставки или опосредованной AAV2/8 доставки, последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в первый интрон эндогенного локуса альбумина посредством негомологичного соединения концов в одной или более клетках печени у животного, при этом вставленная последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, функционально связана с эндогенным промотором альбумина, модифицированный локус альбумина кодирует химерный белок, содержащий эндогенный сигнал секреции альбумина и антигенсвязывающий белок, при этом антигенсвязывающий белок нацелен на вирусный антиген или бактериальный антиген, антигенсвязывающий белок представляет собой нейтрализующее антитело широкого спектра действия, а кодирующие антигенсвязывающий белок последовательности кодируют тяжелую цепь и отдельную легкую цепь, связанные пептидом 2А. Необязательно, последовательность, кодирующая тяжелую цепь, находится выше последовательности, кодирующей легкую цепь, в кодирующей антигенсвязывающий белок последовательности, при этом последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше кодирующей последовательности легкой цепи, и при этом экзогенная сигнальная последовательность секреции представляет собой сигнальную последовательность секреции ROR1.

В другом аспекте представлены животные, полученные любым из вышеуказанных способов. В другом аспекте представлены клетки, модифицированные геномы или модифицированные гены безопасной гавани, полученные любым из вышеуказанных способов. В другом аспекте представлены животные, клетки или геномы, содержащие экзогенную последовательность, кодирующую антигенсвязывающий

- 6 048264 белок, интегрированную в локус безопасная гавань.

У некоторых таких животных, клеток или геномов вставленная последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, функционально связана с эндогенным промотором в локусе безопасная гавань. У некоторых таких животных, клеток или геномов модифицированный локус безопасная гавань кодирует химерный белок, содержащий эндогенный сигнал секреции и антигенсвязывающий белок.

У некоторых таких животных, клеток или геномов локус безопасная гавань представляет собой локус альбумина. Необязательно, последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в первый интрон локуса альбумина.

У некоторых таких животных, клеток или геномов последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставлена в локус безопасная гавань в одной или более клетках печени животного.

В некоторых таких животных, клетках или геномах, антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, полиспецифическое антитело, scFV, бис-scFV, диатело, триатело, тетратело, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)₂, антигенсвязывающий белок с двумя вариабельными доменами, антигенсвязывающий белок с одним вариабельным доменом, привлекающий Tклетки биспецифический активатор или антитело Дэвиса. Необязательно, антигенсвязывающий белок не является одноцепочечным антигенсвязывающим белком. Необязательно, антигенсвязывающий белок содержит тяжелую цепь и отдельную легкую цепь, необязательно, где последовательность, кодирующую тяжелую цепь, содержит сегменты VH, D_H, и J_H, а последовательность, кодирующую легкую цепь, содержит генные сегменты V_L и J_L. У некоторых таких животных, клеток или геномов последовательность, кодирующая тяжелую цепь, расположена выше последовательности, кодирующей легкую цепь, в последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок. Необязательно, последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше последовательности, кодирующей легкую цепь. У некоторых таких животных, клеток или геномов последовательность, кодирующая легкую цепь, расположена выше последовательности, кодирующей тяжелую цепь, в последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок. Необязательно, последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше последовательности, кодирующей тяжелую цепь. У некоторых таких животных, клеток или геномов экзогенная сигнальная последовательность секреции представляет собой сигнальную последовательность секреции ROR1.

У некоторых таких животных, клеток или геномов последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, кодирует тяжелую цепь и легкую цепь, связанные пептидом 2А или участком внутренней посадки рибосомы (IRES). Необязательно тяжелая цепь и легкая цепь связаны пептидом 2А. Необязательно, пептид 2A представляет собой пептид T2A.

У некоторых таких животных, клеток или геномов антигенсвязывающий белок нацелен на ассоциированный с заболеванием антиген. У некоторых таких животных, клеток или геномов экспрессия антигенсвязывающего белка у животного оказывает профилактическое или терапевтическое действие в отношении заболевания у животного. У некоторых таких животных, клеток или геномов ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой ассоциированный с раком антиген. У некоторых таких животных, клеток или геномов ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой антиген, ассоциированный с инфекционным заболеванием. Необязательно, ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой вирусный антиген. Необязательно, вирусный антиген представляет собой антиген гриппа или антиген вируса Зика.

У некоторых таких животных, клеток или геномов вирусный антиген представляет собой антиген гемагглютинин гриппа. Необязательно, антигенсвязывающий белок содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, где: (I) легкая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 18, и тяжелая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 20, необязательно при этом три CDR легкой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 76-78, соответственно, и три CDR тяжелой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 79-81, соответственно; или (II) модифицированный локус безопасная гавань содержит кодирующую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 120; или (III) легкая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 126, и тяжелая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 128, необязательно при этом три CDR легкой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 129-131, соответственно, и три CDR тяжелой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентич- 7 048264 ных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 132-134, соответственно; или (IV) модифицированный локус безопасная гавань содержит кодирующую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 146.

У некоторых таких животных, клеток или геномов вирусный антиген представляет собой антиген оболочки вируса Зика (Env). Необязательно, антигенсвязывающий белок содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, где: (I) легкая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3, и тяжелая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5, необязательно при этом три CDR легкой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 64-66, соответственно, и три CDR тяжелой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 67-69, соответственно; или (II) модифицированный локус безопасная гавань содержит кодирующую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 115. У некоторых таких животных, клетках или геномах антигенсвязывающий белок содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, где: (I) легкая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13, и тяжелая цепь содержит, состоит по существу или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 15, необязательно при этом три CDR легкой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 70-72, соответственно, и три CDR тяжелой цепи содержат, состоят по существу или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 73-75, соответственно; или (II) модифицированный локус безопасная гавань содержит кодирующую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, указанной в любой из SEQ ID NO: 116-119.

У некоторых таких животных, клеток или геномов ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой бактериальный антиген. Необязательно, бактериальный антиген представляет собой антиген PcrV Pseudomonas aeruginosa.

У некоторых таких животных, клеток или геномов антигенсвязывающий белок представляет собой нейтрализующий антигенсвязывающий белок или нейтрализующее антитело. Необязательно, антигенсвязывающий белок представляет собой нейтрализующий антигенсвязывающий белок широкого спектра действия или нейтрализующее антитело широкого спектра действия.

У некоторых таких животных, клеток или геномов экспрессия антигенсвязывающего белка у животного приводит к уровням в плазме, равным по меньшей мере около 2,5 мкг/мл, по меньшей мере около 5 мкг/мл, по меньшей мере около 10 мкг/мл, по меньшей мере около 100 мкг/мл, по меньшей мере около 200 мкг/мл, по меньшей мере около 300 мкг/мл, по меньшей мере около 400 мкг/мл или по меньшей мере около 500 мкг/мл через около 2 недели, около 4 недели или около 8 недель после введения нуклеазного агента и экзогенной донорной последовательности. У некоторых таких животных, клеток, или геномов экспрессия антигенсвязывающего белка у животного приводит к уровням в плазме, равным по меньшей мере около 2,5 мкг/мл, по меньшей мере около 5 мкг/мл, по меньшей мере около 10 мкг/мл, по меньшей мере около 100 мкг/мл, по меньшей мере около 200 мкг/мл, по меньшей мере около 300 мкг/мл, по меньшей мере около 400 мкг/мл, по меньшей мере около 500 мкг/мл, по меньшей мере около 600 мкг/мл, по меньшей мере около 700 мкг/мл, по меньшей мере около 800 мкг/мл, по меньшей мере около 900 мкг/мл или по меньшей мере около 1000 мкг/мл через около 2 недель, около 4 недель, около 8 недель, около 12 недель или около 16 недель после введения нуклеазного агента или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенной донорной последовательности. У некоторых таких животных, клеток или геномов экспрессия антигенсвязывающего белка у животного приводит к уровням в плазме, равным по меньшей мере около 2,5 мкг/мл, по меньшей мере около 5 мкг/мл, по меньшей мере около 10 мкг/мл, по меньшей мере около 100 мкг/мл, по меньшей мере около 200 мкг/мл, по меньшей мере около 300 мкг/мл, по меньшей мере около 400 мкг/мл или по меньшей мере около 500 мкг/мл через около 2 недели, около 4 недели или около 8 недель после введения нуклеазного агента или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенной донорной последовательности. У некоторых таких животных, клеток или геномов экспрессия антигенсвязывающего белка у животного приводит к уровням в плазме, равным по меньшей мере около 2,5 мкг/мл, по меньшей мере около 5 мкг/мл, по меньшей мере около 10 мкг/мл, по меньшей мере около 100 мкг/мл, по меньшей мере около 200 мкг/мл, по меньшей мере около 300 мкг/мл, по меньшей мере около 400 мкг/мл, по меньшей мере около 500 мкг/мл, по меньшей мере около 600 мкг/мл, по меньшей мере около 700 мкг/мл, по меньшей мере около 800 мкг/мл, по меньшей мере около 900 мкг/мл или по меньшей мере около 1000 мкг/мл через около 2 недель, около 4 недель, около 8 недель, около 12 недель или около 16 недель после введения нуклеазного агента или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нук- 8 048264 леазный агент, и экзогенной донорной последовательности.

У некоторых таких животных, клеток или геномов животное представляет собой отличное от человека животное. Необязательно, животное представляет собой отличное от человека млекопитающее. Необязательно, отличное от человека млекопитающее представляет собой крысу или мышь. В некоторых таких животных, клетках или геномах животное представляет собой человека.

У некоторых таких животных, клеток или геномов последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в первый интрон эндогенный локус альбумина в одной или более клетках печени у животного, при этом вставленная последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, функционально связана с эндогенным промотором альбумина, модифицированный локус альбумина кодирует химерный белок, содержащий эндогенный сигнал секреции альбумина и антигенсвязывающий белок, при этом антигенсвязывающий белок нацелен на вирусный антиген или бактериальный антиген, антигенсвязывающий белок представляет собой нейтрализующее антитело широкого спектра действия, а кодирующие антигенсвязывающий белок последовательности кодируют тяжелую цепь и отдельную легкую цепь, связанные пептидом 2А. Необязательно, последовательность, кодирующая тяжелую цепь, находится выше последовательности, кодирующей легкую цепь, в кодирующей антигенсвязывающий белок последовательности, при этом последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше кодирующей последовательности легкой цепи, и при этом экзогенная сигнальная последовательность секреции представляет собой сигнальную последовательность секреции ROR1.

В другом аспекте предоставлены экзогенные донорные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, для вставки в локус безопасная гавань. В другом аспекте представлен ген безопасная гавань, содержащий кодирующую последовательность для антигенсвязывающего белка, интегрированную в ген безопасная гавань. В другом аспекте представлен способ создания модифицированного гена безопасная гавань, включающий приведение в контакт гена безопасная гавань с нуклеазным агентом, нацеленным на сайт-мишень в гене безопасная гавань, и экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом нуклеазный агент расщепляет сайт-мишень, а последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в ген безопасная гавань для получения модифицированного гена безопасная гавань. В другом аспекте представлен способ создания модифицированного гена безопасная гавань, включающий приведение в контакт гена безопасная гавань с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в ген безопасная гавань для получения модифицированного гена безопасная гавань.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 (не в масштабе) показана общая схема вставки генов антител в первый интрон эндогенного локуса альбумина. SD относится к сайту донора сплайсинга, SA относится к сайту акцептора сплайсинга от первого интрона гена альбумина мыши, LC относится к легкой цепи антитела (например, антитела к вирусу Зика, REGN4504), HC относится к тяжелой цепи антитела (например, антитела к вирусу Зика, REGN4504), mAlbss относится к сигнальному пептиду секреции альбумина, кодируемому экзоном 1 эндогенного гена альбумина, ss относится к сигнальному пептиду Ror1 мыши; sWPRE относится к посттранскрипционному регуляторному элементу вируса гепатита сурка, поли(А) относится к последовательности поли(А) SV40, а 2A относится к саморасщепляющемуся пептиду 2A из тешовируса-1 свиньи (P2A).

На фиг. 2 показан дизайн эксперимента для тестирования вставки антитела к вирусу Зика в первый интрон локуса альбумина мыши после доставки мРНК Cas9 и нацеленной на альбумин нРНК (либо направляющей РНК 1, версии 1 (N-Cap), либо версии 2). в печень мыши при помощи липидных наночастиц (ЛНЧ) и доставку донорной последовательности антитела к вирусу Зика AAV2/8 AlbSA 4504 (легкая цепь и тяжелая цепь, связанные саморасщепляющимся пептидом P2A).

На фиг. 3 показана экспрессия антитела REGN4504 к вирусу Зика (интегрированный AAV), измеренная при помощи ИФА в образцах плазмы мышей через 7 дней (1-я неделя), 14 дней (2-я неделя) и 28 дней (4-я неделя) после совместной инъекции ЛНЧ, состоящей из мРНК Cas9 и нацеленной на альбумин нРНК (либо направляющей РНК 1 версии 1 (N-Cap) или версии 2) и донорной последовательности антитела к вирусу Зика AAV2/8 AlbSA 4504. По оси ординат показана концентрация hIgG.

На фиг. 4 показаны результаты анализа нейтрализации вируса Зика в образцах плазмы, взятых через четыре недели после инъекции ЛНЧ Cas9-нРНК и донорной последовательности антитела к вирусу Зика AAV2/8 AlbSA 4504. Также показаны результаты для антитела положительного контроля (антитело REGN4504 к вирусу Зика).

На фиг. 5 показан вестерн-блоттинг антител, продуцируемых интегрированным AAV. № 15 представляет собой одну из мышей, которой инъецировали ЛНЧ с мРНК Cas9 и направляющей РНК 1 версии 1. № 17 представляет собой одну из мышей, которой инъецировали ЛНЧ с мРНК Cas9 и направляющей РНК 1 версии 2.

На фиг. 6 показана схема нацеленной независимо от гомологии опосредованной вставкой однона- 9 048264 правленной нацеленной вставки AAV-REGN4446 в интрон 1 локуса альбумина мыши. нРНК1 hU6 представляет собой кассету экспрессии направляющей РНК 1 версии 1, которая управляется промотором U6 человека. SA относится к акцептору сплайсинга от первого интрона гена альбумина мыши, HC относится к тяжелой цепи антитела к вирусу Зика REGN4446, фурин относится к сайту расщепления фурина, 2A относится к саморасщепляющемуся пептиду 2A (тестировали 2A из вируса, вызывающего энтеровирусный везикулярный стоматит, 18 (F2A), свиного тешовируса-1 (P2A) и вируса Thosea asigna (T2A)), Ss относится к сигнальной последовательности (в этом примере тестировали сигнальную последовательность альбумина мыши и сигнальную последовательность Ror1 мыши), LC относится к легкой цепи антитела к вирусу Зика REGN4446, WPRE относится к посттранскрипционному регуляторному элементу вируса гепатита сурка, а поли(А) относится к последовательности поли(А) бычьего гормона роста. AAV вводили мышам, готовым к Cas9.

На фиг. 7 показан дизайн эксперимента для тестирования вставки антитела к вирусу Зика (REGN4446) в первый интрон локуса мышиного альбумина после доставки нацеленной на альбумин нРНК (нРНК 1 версии 1) и донорных последовательностей антител к вирусу Зика (REGN4446) в готовую к Cas9 мышь посредством AAV2/8, как показано на фиг. 6. Вирусы вводили готовым к Cas9 мышам внутривенно. Сыворотку собирали на 10-й, 28-й и 56-й день для определения титра антител, связывания и функциональных анализов. Мышей выводили из эксперимента на 70-й день для определения частоты вставки и уровня мРНК.

На фиг. 8 показана экспрессия антитела 4446 к вирусу Зика (интегрированный AAV) в образцах плазмы готовых к Cas9 мышей на 10-й, 28-й и 56-й день после инъекции AAV, кодирующих нацеленную на альбумин нРНК (нРНК 1 версии 1), и различные донорные последовательности антител к вирусу Зика (REGN4446). Показаны результаты для эписомального AAV (CMV и CASI) и интегрированного AAV (F2A/Albss, P2A/Albss, T2A/Albss и T2A/RORss).

На фиг. 9 показан вестерн-блоттинг антител, экспрессируемых из эписомального AAV (CMV LC T2A RORss HC; CASI HC T2A RORss LC) или интегрированного AAV (нРНК1 версии 1 HC T2A RORss LC).

На фиг. 10 показана связывающая способность (связывание с белком оболочки вируса Зика) антител, экспрессируемых из эписомального AAV (CMV LC T2A RORss HC; CASI HC T2A RORss LC) или интегрированного AAV (нРНК1 версии 1 HC F2A Albss LC; нРНК1 HC P2A Albss LC; нРНК1 HC T2A Albss LC; нРНК1 HC T2A RORss LC; и нРНК1 HC T2A LC). Также показаны результаты с антителом положительного контроля (антитело к вирусу Зика REGN4446).

На фиг. 11 показаны результаты анализа нейтрализации (инфекция, вызванная вирусом Зика) антител, экспрессируемых из эписомального AAV (CMV LC T2A RORss HC; CASI HC T2A RORss LC) или интегрированного AAV (нРНК1 версии 1 HC F2A Albss LC; нРНК1 HC P2A Albss LC; нРНК1 HC T2A Albss LC; нРНК1 HC T2A RORss LC и нРНК1 HC T2A LC). Также показаны результаты с антителом положительного контроля (антитело к вирусу Зика REGN4446).

На фиг. 12A показана частота инделей в печени готовых к Cas9 мышей после инъекции эписомального AAV (CMV LC T2A RORss HC; CASI HC T2A RORss LC) или интегрированного AAV (F2A/Albss; P2A/Albss; T2A/Albss; и T2A/RORss).

На фиг. 12B показаны уровни мРНК антитела (mAlb-REGN4446), экспрессируемого из эписомального AAV (CMV LC T2A RORss HC; CASI HC T2A RORss LC) или интегрированного AAV (F2A/Albss; P2A/Albss; T2A/Albss; и T2A/RORss) в печени готовых к Cas9 мышей по данным кПЦР TAQMAN.

На фиг. 13 показана структура генома AAV, несущих кассеты экспрессии Cas9 и нРНК.

На фиг. 14 показаны уровни белка-мишени 1 в сыворотке крови до и после инъекции (через 35 дней после инъекции) вирусов AAV2/8, несущих tRNAGln нРНК (нацеленный на ген-мишень 1) и Cas9, управляемые четырьмя разными промоторами.

На фиг. 15 показаны уровни антител у мышей, которым инъецировали два AAV, один из которых несет Cas9, а другой несет нРНК и матрицу вставки. На фигуре показана экспрессия антитела 4446 к вирусу Зика (интегрированный AAV) в образцах сыворотки мышей C57BL/6 на 11 день и 28 день после инъекции двух AAV, одного из которых кодирует нацеленную на альбумин нРНК (нРНК1 версии 1) и донорные последовательности (T2A/RORss) антитела к вирусу Зика (REGN4446) и одну, несущую последовательность Cas9, управляемую промотором серпина AP. Показаны результаты для эписомального AAV (CASI HC T2A RORss LC) и интегрированного AAV на двух разных уровнях вирусных геномов на мышь (Двойной-Низкая и Двойной-Высокая). В группе, получавшей только направляющую РНК, не было доставлено AAV, несущего последовательность Cas9, поэтому интеграции не произошло.

На фиг. 16 показаны результаты анализа нейтрализации (инфекция, вызванная вирусом Зика) антител, экспрессируемых из эписомального AAV или интегрированного AAV (эксперименты с двойным AAV).

На фиг. 17 показан дизайн эксперимента для тестирования введения антитела к HA (гемагглютинин вируса гриппа) в первый интрон локуса мышиного альбумина после доставки мРНК Cas9 и нацеленной на альбумин нРНК (нРНК 1 версии 1) в печень мыши при помощи липидных наночастиц (ЛНЧ) и доставки донорной последовательности антител к НА AAV2/8 AlbSA 3263 (легкая цепь и тяжелая цепь, свя

- 10 048264 занные саморасщепляющимся пептидом P2A).

На фиг. 18 показаны уровни циркулирующих антител в сыворотке мыши у мышей, которым инъецировали два AAV, один из которых несет Cas9, а другой несет нРНК и матрицу вставки, на 11, 28, 42, 56 и 118 дни после инъекции. Показано сравнение эписомальной экспрессии и Cas9-опосредованной интеграции. Результаты экспериментов на мышах C57BL/6 показаны на левой панели, а результаты экспериментов на мышах BALB/c показаны на правой панели.

На фиг. 19 показана связывающая способность (связывание с белком оболочки вируса Зика) антитела, экспрессируемого из эписомального AAV или интегрированного AAV (эксперименты с двойным AAV). Закрашенные кружки и ромбы представляют эксперименты на мышах C57BL/6, а белые кружки и ромбы представляют эксперименты на мышах BALB/c. Также показаны результаты для антитела положительного контроля (антитело к вирусу Зика REGN4446), введенного в сыворотку наивной мыши.

На фиг. 20 показан дизайн эксперимента для тестирования введения антитела к вирусу Зика в первый интрон локуса мышиного альбумина, включая анализы титра, связывания, качества антител и нейтрализации. Он также демонстрирует структуру генома двух AAV, совместно доставленных в этом эксперименте.

На фиг. 21 показаны результаты анализа нейтрализации (инфекция, вызванная вирусом Зика) антител, экспрессируемых из эписомального AAV или интегрированного AAV (эксперименты с двойным AAV) у мышей C57BL/6 и мышей BALB/c. Также показаны результаты для антитела положительного контроля (антитело к вирусу Зика REGN4446), введенного в сыворотку наивной мыши.

На фиг. 22 показан дизайн эксперимента заражения вирусом Зика in vivo для антитела, экспрессируемого из эписомального AAV или интегрированного AAV (эксперименты с двойным AAV).

На фиг. 23 показаны уровни hIgG в сыворотке за один день до заражения вирусом Зика у мышей, получавших следующее: (1) PBS (солевой раствор); (2) AAV2/8 для эписомальной экспрессии контрольного антитела c нецелевым связыванием (CAG HC T2A RORss LC) (мкАт не к вирусу Зика); а (3) Низкая доза (1.0E+11 ГВ/мышь) или (4) Высокая доза (5.0E+11 ГВ/мышь) AAV2/8 для эписомальной экспрессии антитела к вирусу Зика REGN4446 (CASI HC_T2A_RORss_LC) (Эписомальный - Низкая доза и Эписомальный - Высокая доза, соответственно); (5) Низкая доза (5E+11 ГВ/мышь/вектор) или (6) Высокая доза (1E+12 ГВ/мышь/вектор) двух AAV, один из которых несет нРНК1 и кассету экспрессии мкАт REGN4446 (HC_T2A_RORss_LC), а второй несет кассету Cas9, управляемую промотором серпина AP, (Вставленный - Низкая и Вставленный - Высокая, соответственно); или (7) 200 мкг СНО-очищенных мкАТ к вирусу Зика REGN4446 (СНО-очищенное).

На фиг. 24A показаны результаты эксперимента с заражением вирусом Зика (процент выживаемости) с теми же группами, что и на фиг. 23, но также включая неинфицированный контроль.

На фиг. 24B показаны те же данные, что и на фиг. 24A, но с группировкой по титрам. Значения в таблице в верхней части фигуры представляют собой уровни моноклональных антител, измеренные за день до заражения вирусом Зика, в мкг/мл, а кодировка - это тип AAV, который доставил матрицу мкАт (либо одиночный AAV для эписомальной экспрессии или двойной AAV для Cas9-опосредованной интеграции и низкая или высокая доза для любого).

На фиг. 25 показаны уровни hIgG в сыворотке мышей, получавших: (1) PBS (солевой раствор); (2) антитело к вирусу Зика REGN4446 (CASI HC_T2A_RORss_LC) (Эписомальный - 5 день - антитело к вирусу Зика); (3) антитело к PcrV H1H29339P (CAG HC_T2A_RORss_LC) (Эписомальный - 5 день - антитело к PcrV); (4) антитело к HA H1H11829N2 (CAG LC_T2A_RORss_HC) (Эписомальный - 5 день - антитело к HA); (5) антитело к PcrV H1H29339P (HC_T2A_RORss_LC) (Вставленный - 12 день - антитело к PcrV); или (6) антитело к HA H1H11829N (LC_T2A_RORss_HC) (Вставленный -12 день - антитело к HA). Эксперименты с эписомальным AAV проводили на мышах C57BL/6, а эксперименты со вставками выполняли на готовых к Cas9 мышах.

На фиг. 26 показана связывающая способность (связывание с белком PcrV) антител к PcrV, экспрессируемых из эписомального AAV (CAG HC_T2A_RORss_LC) или интегрированного AAV (HC_T2A_RORss_LC). Также показаны результаты с очищенным антителом положительного контроля (антитело к PcrV H1H29339P). Эписомальные антитела к вирусу Зика использовали в качестве отрицательного контроля.

На фиг. 27 показаны результаты анализа цитотоксичности. Эффекты цитотоксичности штамма P. aeruginosa 6077, опосредованные PcrV, нейтрализуются антителами к PcrV, экспрессируемыми из эписомального AAV (CAG HC_T2A_RORss_LC) или интегрированного AAV (HC_T2A_RORss_LC). Для сравнения показаны результаты с СНО-очищенным антителом к PcrV, разведенным либо в PBS, либо в сыворотке наивной мыши. Антитело к вирусу Зика, экспрессируемое из эписомального AAV (CASI HC_T2A_RORss_LC), использовали в качестве отрицательного контроля.

На фиг. 28 показана связывающая способность (связывание с белком HA) антител, экспрессируемых из эписомального AAV (CAG LC_T2A_RORss_HC) или интегрированного AAV (LC_T2A_RORss_HC). Также показаны результаты с очищенным антителом положительного контроля (антитело к НА H1H11829N2). Эписомальные антитела к вирусу Зика использовали в качестве отрицательного контроля.

- 11 048264

На фиг. 29 показаны результаты анализа нейтрализации. Штамм гриппа H1N1 A/PR/8/1934 нейтрализуется антителами к HA, экспрессируемыми из эписомального AAV (CAG LC_T2A_RORss_HC) или интегрированного AAV (LC_T2A_RORss_HC). Также показаны результаты с очищенным антителом положительного контроля (антитело к НА H1H11829N2). Очищенное антитело к Feld1 и только сыворотку использовали в качестве отрицательного контроля.

На фиг. 30 показан дизайн эксперимента с заражением Pseudomonas in vivo для антитела, экспрессируемого из эписомального AAV или интегрированного AAV (эксперименты с двойным AAV).

На фиг. 31 показаны титры hIgG мышей C57BL/6 и BALB/c, которым инъецировали AAV девять дней назад (это за 7 дней до заражения Pseudomonas) у мышей, получавших: (1) PBS; (2) AAV2/8 для эписомальной экспрессии антитела изотипического контроля к HA H1H11829N2 (CAG LC_T2A_RORss_HC) (антитело к HA); a (3) Низкая доза (1,0E+10 ГВ/мышь) или (4) Высокая доза (1,0E+11 ГВ/мышь) AAV2/8 для эписомальной экспрессии антитела к PcrV H1H29339P (CAG HC_T2A_RORss_LC) (Эписомальный - Низкая и Эписомальный - Высокая, соответственно), (5) Низкая доза (1E+11 ГВ/мышь/вектор) или (6) Высокая доза (1E+12 ГВ/мышь/вектор) двух AAV, один из которых несет нРНК1 и кассету экспрессии мкАт к PcrV H1H29339P (HC_T2A_RORss_LC), а второй несет кассету Cas9, управляемую промотором серпина AP, (Вставленный- Низкая и Вставленный - Высокая, соответственно), или (7) Низкая доза (0,2 мг/кг) или (8) Высокая доза (1,0 мг/кг) СНО-очищенных мкАт к PcrV H1H29339P (0,2 мг/кг СНО и 1,0 мг/кг СНО, соответственно).

На фиг. 32A показаны результаты эксперимента с заражением Pseudomonas (процент выживаемости) на мышах C57BL/6 с Эписомальный - Низкая (CAG Низкая), Эписомальный - Высокая (CAG Высокая), Вставленный - Низкая (KI Низкая) и Вставленный - Высокая (KI Высокая) на фиг. 31, а также включает неинфицированный контроль, незащищенный контроль только для бактерий и незащищенный изотипический контроль.

На фиг. 32B показаны результаты эксперимента с заражением Pseudomonas (процент выживаемости) на мышах BALB/c с Эписомальный - Низкая (CAG Низкая), Эписомальный - Высокая (CAG Высокая), Вставленный- Низкая (KI Низкая) и Вставленный - Высокая (KI Высокая) на фиг. 31, а также включает неинфицированный контроль, незащищенный контроль только для бактерий и незащищенный изотипический контроль.

Определения

Термины белок, полипептид и пептид, используемые в контексте данного документа взаимозаменяемо, включают полимерные формы аминокислот любой длины, включая кодируемые и некодируемые аминокислоты, и химически или биохимически модифицированные либо дериватизированные аминокислоты. Данные термины также включают в себя модифицированные полимеры, такие как полипептиды, имеющие модифицированные пептидные каркасы. Термин домен относится к любой части белка или полипептида, имеющей конкретную функцию или структуру.

Термины нуклеиновая кислота и полинуклеотид, используемые в контексте данного документа взаимозаменяемо, включают полимерные формы нуклеотидов любой длины, включая рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или их аналоги либо их модифицированные версии. Они включают одно-, двухи многоцепочечные ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК и полимеры, содержащие пуриновые основания, пиримидиновые основания или другие встречающиеся в природе, химически модифицированные, биохимически модифицированные, не встречающиеся в природе или дериватизированные нуклеотидные основания.

Термин интегрированная в геном относится к нуклеиновой кислоте, которая была введена в клетку таким образом, что нуклеотидная последовательность интегрировалась в геном клетки. Для стабильного включения нуклеиновой кислоты в геном клетки можно использовать любой протокол.

Термин вектор экспрессии, или конструкция экспрессии, или кассета экспрессии относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, содержащей желаемую кодирующую последовательность, функционально связанную с соответствующими последовательностями нуклеиновой кислоты, необходимыми для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретной клеткехозяине или организме. Последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии в прокариотах, как правило, включают промотор, оператор (необязательно) и сайт связывания рибосомы, а также другие последовательности. Общеизвестно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы терминации и полиаденилирования, хотя некоторые элементы могут быть удалены, а другие добавлены без ущерба для необходимой экспрессии.

Термин направленный вектор относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, которая может быть введена путем гомологичной рекомбинации, лигирования, опосредованного негомологичным соединением концов, или любым другим способом рекомбинации в целевое положение в геноме клетки.

Термин вирусный вектор относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, которая включает по меньшей мере один элемент вирусного происхождения и включает элементы, достаточные или допускающие упаковку в частицу вирусного вектора. Вектор и/или частицу можно использовать для переноса ДНК, РНК или других нуклеиновых кислот в клетки in vitro, ex vivo или in vivo. Известны многочисленные формы вирусных векторов.

- 12 048264

Термин выделенный по отношению к клетке, ткани (например, образцам печени), белкам, и нуклеиновым кислотам включает клетки, ткани (например, образцы печени), белки, и нуклеиновые кислоты, которые относительно очищены по сравнению с другими бактериальными, вирусными, клеточными, или другими компонентами, которые обычно могут присутствовать in situ, вплоть до практически чистого препарата клеток, тканей (например, образцов печени), белков и нуклеиновых кислот кислот. Термин выделенный также включает: клетки, ткани (например, образцы печени), белки, и нуклеиновые кислоты, не имеющие аналогов в природе, были химически синтезированы и, таким образом, в значительной степени не загрязнены другими клетками, тканями (например, образцами печени), белками, и нуклеиновыми кислотами, или были отделены или очищены от большинства других компонентов (например, клеточных компонентов) с которыми они естественным образом связаны (например, другими клеточными белками, полинуклеотидами, или клеточными компонентами).

Термин дикий тип включает объекты, имеющие структуру и/или активность, которые наблюдаются в нормальном (в отличие от мутантного, болезненного, измененного и т.д.) состоянии или контексте. Гены и полипептиды дикого типа часто существуют в нескольких различных формах (например, аллелях).

Термин эндогенная последовательность относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая встречается в природе внутри клетки или животного. Например, эндогенная последовательность альбумина животного относится к последовательности нативного альбумина, которая естественным образом встречается в локусе альбумина у животного.

Экзогенные молекулы или последовательности включают молекулы или последовательности, которые, как правило, не присутствуют в клетке в такой форме. Нормальное присутствие включает наличие в зависимости от конкретной стадии развития и условий окружающей среды клетки. Экзогенная молекула или последовательность, например, может включать мутированную версию соответствующей эндогенной последовательности внутри клетки, такую как гуманизированная версия эндогенной последовательности, или может включать последовательность, соответствующую эндогенной последовательности внутри клетки, но в другой форме (т.е. не в хромосоме). Напротив, эндогенные молекулы или последовательности включают молекулы или последовательности, которые, как правило, присутствуют в этой форме в конкретной клетке на конкретной стадии развития в определенных условиях окружающей среды.

Термин гетерологичный при использовании в контексте нуклеиновой кислоты или белка указывает на то, что нуклеиновая кислота или белок содержит, по меньшей мере, два сегмента, которые в природе не встречаются вместе в одной и той же молекуле. Например, термин гетерологичный, когда он используется в отношении сегментов нуклеиновой кислоты или сегментов белка, указывает на то, что нуклеиновая кислота или белок содержит две или более подпоследовательностей, которые не находятся в подобной зависимости друг с другом (например, не соединены вместе) в природе. В качестве одного примера, гетерологичная область вектора нуклеиновой кислоты представляет собой сегмент нуклеиновой кислоты внутри молекулы или сегмент, присоединенный к другой молекуле нуклеиновой кислоты, который не обнаруживается в ассоциации с другой молекулой в природе. Например, гетерологичная область вектора нуклеиновой кислоты может содержать кодирующую последовательность, фланкированную последовательностями, не обнаруженными в ассоциации с кодирующей последовательностью в природе. Аналогичным образом, гетерологичная область белка представляет собой сегмент аминокислот внутри молекулы или присоединенный к другой молекуле пептида, который не обнаруживается в ассоциации с другой молекулой пептида в природе (например, слитый белок или белок с меткой). Точно так же нуклеиновая кислота или белок могут содержать гетерологичную метку или гетерологичную последовательность секреции или локализации.

Для оптимизации кодонов используется преимущество вырожденности кодонов, что демонстрируется множеством комбинаций кодонов из трех пар оснований, которые определяют аминокислоту, и, как правило, включает процесс модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в конкретных клетках-хозяевах путем замены, по меньшей мере, одного кодона нативной последовательности на кодон, который чаще или наиболее часто используется в генах клетки-хозяина, при сохранении нативной аминокислотной последовательности. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas9, может быть модифицирована для замены кодонов, имеющих более высокую частоту использования в данной прокариотической или эукариотической клетке, включая бактериальную клетку, дрожжевую клетку, человеческую клетку, клетку, которая не является человеческой, клетку млекопитающего, клетку грызуна, клетку мыши, клетку крысы, клетку хомяка или любую другую клетку-хозяин, по сравнению с встречающейся в природе последовательностью нуклеиновой кислоты. Таблицы использования кодонов легко доступны, например, в Базе Данных Использования Кодонов (Codon Usage Database). Эти таблицы можно адаптировать разными способами. См. Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292, включенную в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Также доступны компьютерные алгоритмы для оптимизации кодонов конкретной последовательности для экспрессии в конкретном хозяине (см., например, Gene Forge).

Термин локус относится к конкретному расположению гена (или значимой последовательности),

- 13 048264 последовательности ДНК, последовательности, кодирующей полипептид, или положению на хромосоме генома организма. Например, локус альбумина может относиться к конкретному расположению гена альбумина, последовательности ДНК альбумин, кодирующей альбумин последовательности, или положению альбумина на хромосоме генома организма, которое было идентифицировано относительно того, где находится такая последовательность. Локус альбумина может содержать регуляторный элемент гена альбумина, включая, например, энхансер, промотор, 5'- и/или 3'-нетранслируемую область (UTR) или их комбинацию.

Термин ген относится к последовательностям ДНК в хромосоме, которые могут содержать, если они присутствуют в природе, по меньшей мере, одну кодирующую и по меньшей мере одну некодирующую область. Последовательность ДНК в хромосоме, которая кодирует продукт (например, но не ограничиваясь этим, продукт РНК и/или продукт полипептида) может содержать кодирующую область, прерванную некодирующими интронами, и последовательность, расположенную рядом с кодирующей областью как на 5'-, так и на 3'-концах, так что ген соответствует полноразмерной мРНК (включая 5'- и 3'нетранслируемые последовательности). Кроме того, в гене могут присутствовать другие некодирующие последовательности, включая регуляторные последовательности (например, но не ограничиваясь этим, промоторы, энхансеры и сайты связывания факторов транскрипции), сигналы полиаденилирования, участки внутренней посадки рибосомы, сайленсеры, изолирующие последовательности и области прикрепления к матриксу. Эти последовательности могут быть близки к кодирующей области гена (например, но не ограничиваясь этим, в пределах 10 т.п.н.) или находиться в отдаленных участках, и они влияют на уровень или скорость транскрипции и трансляции гена.

Термин аллель относится к вариантной форме гена. Некоторые гены имеют множество различных форм, которые расположены в одном и том же положении или генетическом локусе на хромосоме. Диплоидный организм имеет два аллеля в каждом генетическом локусе. Каждая пара аллелей представляет собой генотип определенного генетического локуса. Генотипы описываются как гомозиготные, если есть два идентичных аллеля в определенном локусе, и как гетерозиготные, если эти два аллеля различаются.

Промотор представляет собой регуляторную область ДНК, обычно содержащую ТАТА-бокс, способный управлять РНК-полимеразой II, чтобы инициировать синтез РНК в соответствующем сайте инициации транскрипции для конкретной полинуклеотидной последовательности. Промотор может дополнительно содержать другие области, которые влияют на скорость инициации транскрипции. Описанные в данном документе промоторные последовательности модулируют транскрипцию функционально связанного полинуклеотида. Промотор может быть активным в одном или более типах клеток, описанных в данном документе (например, эукариотической клетке, клетке млекопитающего, отличного от человека, человеческой клетке, клетке грызунов, плюрипотентной клетке, эмбрионе на одноклеточной стадии, дифференцированной клетке или их комбинации). Промотор может представлять собой, например, конститутивно активный промотор, условный промотор, индуцибельный промотор, временно ограниченный промотор (например, промотор, регулируемым развитием) или пространственно ограниченный промотор (например, специфический к клетке или тканеспецифический промотор). Примеры промоторов можно найти, например, в WO 2013/176772, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

Конститутивный промотор представляет собой промотор, который активен во всех тканях или отдельных тканях на всех стадиях развития. Примеры конститутивных промоторов включают промоторы гена немедленного раннего ответа цитомегаловируса человека (hCMV), гена немедленного раннего ответа цитомегаловируса мыши (mCMV), фактора элонгации 1-альфа человека (hEF1a), фактора элонгации 1-альфа мыши (mEF1a), фосфоглицератокиназы мыши (PGK), гибридный промотор куриного бетаактина (CAG или CBh), ранний промотор SV40 и промотор бета-2 тубулина.

Примеры индуцибельных промоторов включают, например, химически регулируемые промоторы и физически регулируемые промоторы. Химически регулируемые промоторы включают, например, спирторегулируемые промоторы (например, промотор гена алкогольдегидрогеназы (alcA)), тетрациклинрегулируемые промоторы (например, чувствительный к тетрациклину промотор, последовательность оператора тетрациклина (tetO), промотор tet-On или промотор tet-Off), регулируемые стероидами промоторы (например, промотор глюкокортикоидного рецептора крысы, промотор рецептора эстрогена или промотор рецептора экдизона), или регулируемые металлами промоторы (например, промотор металлопротеина). Физически регулируемые промоторы включают, например, терморегулируемые промоторы (например, промотор теплового шока) и светорегулируемые промоторы (например, индуцируемый светом промотор или репрессируемый светом промотор).

Тканеспецифические промоторы могут представлять собой, например, нейрон-специфические промоторы, специфичные для глии промоторы, специфические для мышечных клеток промоторы, специфические для сердечных клеток промоторы, специфические для клеток почек промоторы, специфические для костных клеток промоторы, специфические для эндотелиальных клеток промоторы, или специфичные для иммунных клеток промоторы (например, промотор В-клеток или промотор Т-клеток).

Промоторы, регулируемые в процессе развития, включают, например, промоторы, активные только

- 14 048264 на эмбриональной стадии развития или только во взрослой клетке.

Термин функциональная связь или функционально связанный включает контактное расположение двух или более компонентов (например, промотора и другого элемента последовательности), таким образом, что оба компонента функционируют нормально и допускают возможность того, что, по меньшей мере, один из компонентов может опосредовать функцию, которая воздействует на, по меньшей мере, один из других компонентов. Например, промотор может быть функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор контролирует уровень транскрипции кодирующей последовательности в ответ на присутствие или отсутствие одного или более факторов регуляции транскрипции. Функциональная связь может включать в себя случаи, когда такие последовательности расположены смежно друг с другом или действуют в транс-положении (например, регуляторная последовательность может действовать на расстоянии, чтобы контролировать транскрипцию кодирующей последовательности).

Комплементарность нуклеиновых кислот означает, что нуклеотидная последовательность в одной цепи нуклеиновой кислоты из-за ориентации ее групп азотистых оснований образует водородные связи с другой последовательностью на противоположной цепи нуклеиновой кислоты. Комплементарные основания в ДНК обычно представляют собой A с T и C с G. В РНК они обычно представляют собой C с G и U с A. Комплементарность может быть совершенной или значительной/достаточной. Совершенная комплементарность между двумя нуклеиновыми кислотами означает, что две нуклеиновые кислоты могут образовывать дуплекс, в котором каждое основание в дуплексе связано с комплементарным основанием путем спаривания по Уотсону-Крику. Значительная или достаточная комплементарность означает, что последовательность в одной цепи не полностью и/или не совершенно комплементарна последовательности в противоположной цепи, но что между основаниями на двух цепях происходит достаточное связывание для образования стабильного гибридного комплекса в наборе условий гибридизации (например, концентрации соли и температуры). Такие условия можно предсказать с помощью последовательностей и стандартных математических расчетов для прогнозирования Tm (температуры плавления) гибридизованных цепей или путем эмпирического определения Tm с использованием обычных способов. Tm включает температуру, при которой популяция гибридизационных комплексов, образованных между двумя цепями нуклеиновой кислоты, денатурируется на 50% (т.е. популяция двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты становится наполовину диссоциированной на одноцепочечные). При температуре ниже Tm преимущественно происходит образование гибридизационного комплекса, тогда как при температуре выше Tm преимущественно происходит плавление или разделение цепей в гибридизационном комплексе. Tm можно оценить для нуклеиновой кислоты, имеющей известное содержание G+C в водном 1 M растворе NaCl, используя, например, Tm=81,5+0,41(% G+C), хотя другие известные вычисления Tm учитывают структурные характеристики нуклеиновой кислоты.

Для гибридизации требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты содержали комплементарные последовательности, хотя возможны несовпадения между основаниями. Условия, подходящие для гибридизации двух нуклеиновых кислот, зависят от длины нуклеиновых кислот и степени комплементарности, переменных, которые хорошо известны. Чем выше степень комплементарности между двумя нуклеотидными последовательностями, тем больше будет значение температуры плавления (Tm) для гибридов нуклеиновых кислот, имеющих эти последовательности. Для гибридизации нуклеиновых кислот с короткими участками комплементарности (например, комплементарность 35 или менее, 30 или менее, 25 или менее, 22 или менее, 20 или менее или 18 или менее нуклеотидов) положение несовпадений становится важным (см. Sambrook et al., цитировано выше, 11.7-11.8). Как правило, длина гибридизируемой нуклеиновой кислоты составляет, по меньшей мере, около 10 нуклеотидов. Иллюстративные минимальные длины гибридизируемой нуклеиновой кислоты включают, по меньшей мере около 15 нуклеотидов, по меньшей мере около 20 нуклеотидов, по меньшей мере около 22 нуклеотида, по меньшей мере около 25 нуклеотидов и по меньшей мере около 30 нуклеотидов. Кроме того, температуру и концентрацию соли в промывочном растворе можно регулировать по мере необходимости в соответствии с такими факторами, как длина области комплементарности и степень комплементарности.

Последовательность полинуклеотида не обязательно должна быть на 100% комплементарной последовательности его нуклеиновой кислоты-мишени для специфической гибридизации. Более того, полинуклеотид может гибридизоваться с одним или более сегментами, так что промежуточные или соседние сегменты не участвуют в событии гибридизации (например, петлевая структура или шпилечная структура). Полинуклеотид (например, нРНК) может иметь по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99% или 100% комплементарности последовательности с областью-мишенью в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, на которую они нацелены. Например, нРНК, в которой 18 из 20 нуклеотидов комплементарны области-мишени и поэтому специфически гибридизуются, будет иметь 90% комплементарности. В этом примере оставшиеся некомплементарные нуклеотиды могут быть сгруппированы или могут перемежаться с комплементарными нуклеотидами и не обязательно должны быть смежными друг с другом или с комплементарными нуклеотидами.

Процент комплементарности между конкретными участками последовательностей нуклеиновых

- 15 048264 кислот внутри нуклеиновых кислот может быть определен обычным способом с использованием программ BLAST (основные инструменты поиска локального сопоставления) и программ PowerBLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Zhang and Madden (1997) Genome Res. 7:649-656, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей) или с использованием программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Мэдисон, штат Висконсин), используя настройки по умолчанию, в которых используется алгоритм Смита - Ватермана (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).

В способах и композициях, предложенных в данном документе, используется множество различных компонентов. Некоторые компоненты в описании могут иметь активные варианты и фрагменты. Такие компоненты включают, например, белки Cas, CRISPR-РНК, tracrРНК и направляющие РНК. Биологическая активность каждого из этих компонентов описана в данном документе в другом месте. Термин функциональный относится к врожденной способности белка или нуклеиновой кислоты (или их фрагмента или варианта) проявлять биологическую активность или функцию. Такие биологические активности или функции могут включать, например, способность белка Cas связываться с направляющей РНК и с последовательностью ДНК-мишени. Биологические функции функциональных фрагментов или вариантов могут быть такими же или могут фактически быть изменены (например, в отношении их специфичности, селективности или эффективности) по сравнению с исходной молекулой, но с сохранением основной биологической функции молекулы.

Термин вариант относится к нуклеотидной последовательности, отличающейся от последовательности, наиболее распространенной в популяции (например, на один нуклеотид), или к последовательности белка, отличной от последовательности, наиболее распространенной в популяции (например, на одну аминокислоту).

Термин фрагмент применительно к белку означает белок, который короче или содержит меньше аминокислот, чем полноразмерный белок. Термин фрагмент применительно к нуклеиновой кислоте означает нуклеиновую кислоту, которая короче или имеет меньше нуклеотидов, чем полноразмерная нуклеиновая кислота. Фрагмент может представлять собой, например, когда речь идет о фрагменте белка, N-терминальный фрагмент (т.е. образован путем удаления части C-терминального конца белка), Cтерминальный фрагмент (т.е. образован путем удаления части N-терминального конца белка) или внутренний фрагмент (т.е. образован путем удаления части каждого из N-концевых и C-терминальных концов белка). Фрагментом может представлять собой, например, когда речь идет о фрагменте нуклеиновой кислоты, 5'-фрагмент (т.е. образован путем удаления части 3'-конца нуклеиновой кислоты), 3'-фрагмент (т.е. образован путем удаления части 5'-конца нуклеиновой кислоты) или внутренний фрагмент (т.е. образован путем удаления части каждого из 5'- и 3'-концов нуклеиновой кислоты).

Идентичность последовательностей, или идентичность, в контексте двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании последовательностей для максимального соответствия в указанном окне сравнения. Когда процент идентичности последовательностей используется в отношении белков, то положения остатков, которые не идентичны, часто отличаются по консервативным аминокислотным заменам, в которых аминокислотные остатки заменены на другие аминокислотные остатки с аналогичными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность) и, следовательно, не меняют функциональных свойств данной молекулы. Когда последовательности отличаются по консервативным аминокислотным заменам, процент идентичности последовательностей может быть увеличен для корректировки относительно консервативного характера замены. Указывают, что последовательности, отличающиеся по таким консервативным заменам, имеют сходство последовательностей, или сходство. Средства для выполнения данной оценки хорошо известны. Как правило, это включает в себя оценку консервативной замены как частичного, а не полного несоответствия, что тем самым увеличивает процент идентичности последовательностей. Таким образом, например, если идентичной аминокислоте присваивается оценка, равная 1, а неконсервативной замене присваивается оценка, равная нулю, то консервативной замене присваивается оценка, равная от нуля до 1. Оценка консервативных замен рассчитывается, например, так, как реализовано в программе PC/GENE (Intelligenetics, Маунтин-Вью, штат Калифорния, США).

Процент идентичности последовательностей включает значение, определенное путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей (наибольшее количество полностью совпадающих остатков) в окне сравнения, при этом часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пробелы, гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания данных двух последовательностей. Данный процент рассчитывается путем определения числа положений, в которых одно и то же основание нуклеиновой кислоты или один и тот же аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, чтобы получить количество совпадающих положений, с последующим делением числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножением полученного результата на 100, чтобы получить процент идентичности последовательностей. Если не указано иное (например, более короткая последовательность включает в себя связанную гетерологичную

- 16 048264 последовательность), окно сравнения представляет собой полную протяженность более короткой из двух сравниваемых последовательностей.

Если не указано иное, значения идентичности/сходства последовательностей включают значение, полученное с использованием программного обеспечения GAP версии 10 с использованием следующих параметров: % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с использованием штрафа в 50 за открытие гэпа и штрафа в 3 за удлинение гэпа, а также матрицы замен nwsgapdna.cmp; % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с использованием штрафа в 8 за открытие гэпа и штрафа в 2 за удлинение гэпа, а также матрицы замен BLOSUM62; или с помощью любой эквивалентной программы. Эквивалентная программа включает в себя любую программу для сравнения последовательностей, которая для любых двух рассматриваемых последовательностей генерирует выравнивание, имеющее идентичные совпадения нуклеотидных или аминокислотных остатков и идентичный процент идентичности последовательностей по сравнению с соответствующим выравниванием, созданным в программе GAP версии 10.

Термин консервативная аминокислотная замена относится к замене аминокислоты, которая обычно присутствует в данной последовательности, на другую аминокислоту аналогичного размера, заряда или полярности. Примеры консервативных замен включают в себя замену неполярного (гидрофобного) остатка, такого как изолейцин, валин или лейцин, на другой неполярный остаток. Аналогичным образом, примеры консервативных замен включают в себя замену одного полярного (гидрофильного) остатка на другой, например, замену аргинина на лизин и наоборот, замену глутамина на аспарагин и наоборот или замену глицина на серин и наоборот. Кроме того, замена основного остатка, такого как лизин, аргинин или гистидин, на другой остаток, или замена одного кислотного остатка, такого как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, на другой кислотный остаток являются дополнительными примерами консервативных замен. Примеры неконсервативных замен включают в себя замену неполярного (гидрофобного) аминокислотного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин, аланин или метионин, на полярный (гидрофильный) остаток, такой как цистеин, глутамин, глутаминовая кислота или лизин, и/или замену полярного остатка на неполярный остаток. Типовая классификация аминокислот обобщенно представлена в табл. 1 ниже.

Таблица 1 Классификация аминокислот

Аланин	Ala	A	Неполярная	Нейтральная	1,8
Аргинин	Arg	R	Полярная	Положительно заряженная	-4,5
Аспарагин	Asn	N	Полярная	Нейтральная	-3,5
Аспарагиновая кислота	Asp	D	Полярная	Отрицательная	-3,5
Цистеин	Cys	C	Неполярная	Нейтральная	2.5
Глутаминовая кислота	Glu	E	Полярная	Отрицательная	-3,5
Глутамин	Gin	Q	Полярная	Нейтральная	-3,5
Глицин	Gly	G	Неполярная	Нейтральная	-0,4
Г истидин	His	H	Полярная	Положительно заряженная	-3,2
Изолейцин	lie	I	Неполярная	Нейтральная	4,5
Лейцин	Leu	L	Неполярная	Нейтральная	3,8
Лизин	Lys	К	Полярная	Положительно заряженная	-3.9
Метионин	Met	M	Неполярная	Нейтральная	1.9
Фенилаланин	Phe	F	Неполярная	Нейтральная	2,8
Пролин	Pro	P	Неполярная	Нейтральная	-1.6
Серин	Ser	S	Полярная	Нейтральная	-0 8
Треонин	Thr	T	Полярная	Нейтральная	-0,7
Триптофан	Trp	w	Неполярная	Нейтральная	-0,9
Тирозин	Tyr	Y	Полярная	Нейтральная	-1,3
Валин	Vai	V	Неполярная	Нейтральная	4.2

Термин гомологичная последовательность (например, последовательность нуклеиновой кислоты) включает последовательность, которая либо идентична, либо по существу сходна с известной эталонной последовательностью таким образом, что она, например, на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей

- 17 048264 мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или на 100% идентична известной эталонной последовательности. Гомологичные последовательности могут включать, например, ортологическую последовательность и паралогичные последовательности. Гомологичные гены, например, как правило, происходят от общей предковой последовательности ДНК либо в результате видообразования (ортологичные гены), либо в результате генетической дупликации (паралогичные гены). Ортологические гены включают гены разных видов, которые произошли от общего предкового гена путем видообразования. Ортологи, как правило, сохраняют ту же самую функцию в ходе эволюции. Паралогичные гены включают гены, связанные посредством дупликации в геноме. Паралоги могут развить новые функции в ходе эволюции.

Термин in vitro включает искусственную среду и процессы или реакции, которые происходят в искусственной среде (например, в пробирке или выделенной клетке, или линии клеток). Термин in vivo включает естественную среду (например, клетку, или организм или тело) и процессы или реакции, которые происходят в естественной среде. Термин ex vivo включает клетки, которые были удалены из организма человека, а также процессы или реакции, происходящие в таких клетках.

Термин репортерный ген относится к нуклеиновой кислоте, имеющей последовательность, кодирующую продукт гена (обычно фермент), который можно легко и количественно проанализировать, когда конструкция, содержащая последовательность репортерного гена, функционально связанную с эндогенным или гетерологичным промоторным и/или энхансерным элементом, вносится в клетки, содержащие (или которые можно сделать так, чтобы они содержали) факторы, необходимые для активации промоторных и/или энхансерных элементов. Примеры репортерных генов включают, но не ограничиваются ими, гены, кодирующие бета-галактозидазу (lacZ), гены бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы (cat), гены люциферазы светлячков, гены, кодирующие бета-глюкуронидазу (GUS), и гены, кодирующие флуоресцентные белки. Репортерный белок относится к белку, кодируемому репортерным геном.

Термин флуоресцентный репортерный белок, используемый в данном документе, означает репортерный белок, который определяется на основе флуоресценции, где флуоресценция может исходить либо непосредственно от репортерного белка, либо от активности репортерного белка на флуорогенном субстрате, либо от белка с аффинностью в отношении связывания с соединением с флуоресцентной меткой. Примеры флуоресцентных белков включают зеленые флуоресцентные белки (например, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, мономерная версия Azami Green, CopGFP, AceGFP и ZsGreenl), желтые флуоресцентные белки (например, YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP и ZsYellowl), синие флуоресцентные белки (например, FP, eBFP, eBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire и T-sapphire), голубые флуоресцентные белки (например, CFP, eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl и Midoriishi-Cyan), красные флуоресцентные белки (например, RFP, mKate, mKate2, mPlum, мономер DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, мономер DsRed, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry и Jred), оранжевые флуоресцентные белки (например, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, мономерная версия Kusabira-Orange, mTangerine и tdTomato) и любой другой подходящий флуоресцентный белок, присутствие которого в клетках можно определить с помощью методов проточной цитометрии.

Репарация в ответ на двухцепочечные разрывы (DSB) происходит главным образом через два консервативных пути репарации ДНК: гомологичную рекомбинацию (HR) и негомологичное соединение концов (NHEJ). См. Kasparek & Humphrey (2011) Semin. Cell Dev. Biol. 22(8):886-897, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Точно так же репарация нуклеиновой кислоты-мишени, опосредованная экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, может включать любой процесс обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами.

Термин рекомбинация включает любой процесс обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами и может происходить по любому механизму. Рекомбинация может происходить посредством направляемой гомологией репарации (HDR) или гомологичной рекомбинации (HR). HDR или HR включает форму репарации нуклеиновой кислоты, которая может требовать гомологии нуклеотидной последовательности, использует донорную молекулу в качестве матрицы для репарации молекулы мишени (т.е. той, которая подверглась двуцепочечному разрыву) и приводит к передаче генетической информации от донора к мишени. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, такой перенос может включать коррекцию несоответствия гетеродуплексной ДНК, которая образуется между поврежденной мишенью и донором, и/или зависимую от синтеза гибридизацию цепи, при которой донор используется для повторного синтеза генетической информации, которая станет частью мишени, и/или связанные процессы. В некоторых случаях донорный полинуклеотид, часть донорного полинуклеотида, копия донорного полинуклеотида или часть копии донорного полинуклеотида интегрируется в ДНКмишень. См. Wang et al. (2013) Cell 153:910-918; Mandalos et al. (2012) PLoS ONE 7:e45768:1-9; и Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

Негомологичное соединение концов (NHEJ) включает репарацию двухцепочечных разрывов в нуклеиновой кислоте путем прямого лигирования разорванных концов друг с другом или с экзогенной последовательностью без необходимости в гомологичной матрице. Лигирование несмежных последова

- 18 048264 тельностей с помощью NHEJ часто может приводить к делециям, вставкам или транслокациям вблизи места двухцепочечного разрыва. Например, NHEJ может также привести к направленной интеграции экзогенной донорной нуклеиновой кислоты посредством прямого лигирования разорванных концов с концами экзогенной донорной нуклеиновой кислоты (т.е. захват на основе NHEJ). Такая направленная интеграция, опосредованная NHEJ, может быть предпочтительной для введения экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, когда пути направляемой гомологией репарации (HDR) не могут легко применяться (например, в неделящихся клетках, первичных клетках и клетках, которые плохо выполняют гомологичную репарацию ДНК). Кроме того, в отличие от направляемой гомологией репарации, знания о больших областях идентичности последовательностей, фланкирующих сайт расщепления, не требуются, что может быть полезно при попытке направленной вставки в организмы, геномы которых имеют ограниченные знания о геномной последовательности. Интеграция может происходить посредством лигирования тупых концов между экзогенной донорной нуклеиновой кислотой и расщепленной геномной последовательностью или посредством лигирования липких концов (т.е. имеющих 5'- или 3'-выступы) с использованием экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, фланкированной выступами, которые совместимы с теми, которые генерируются нуклеазным агентом в расщепленной геномной последовательности. См., например, US 2011/020722, WO 2014/033644, WO 2014/089290 и Maresca et al. (2013) Genome Res . 23 (3): 539-546, каждый из которых полностью включен в данный документ посредством ссылки для всех целей. Если лигированы тупые концы, может потребоваться удаление мишени и/или донора для создания областей микрогомологии, необходимых для соединения фрагментов, что может создать нежелательные изменения в последовательности-мишени.

Композиции или способы, содержащие или включающие один или более перечисленных элементов, могут включать в себя другие элементы, не перечисленные специально. Например, композиция, которая содержит или включает белок, может содержать белок отдельно или в комбинации с другими элементами. Переходная фраза состоящий по существу из означает, что объем формулы изобретения следует интерпретировать как включающий в себя указанные в формуле изобретения элементы, а также те, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики заявленного изобретения. Таким образом, термин состоящий по существу из при использовании в формуле данного изобретения не предназначен для интерпретации как эквивалент слову включающий.

Необязательно или по усмотрению означает, что описанное далее событие или обстоятельство может или не может произойти, и что описание включает случаи, в которых событие или обстоятельство происходит, и случаи, при которых событие или обстоятельство, когда оно не происходит.

Обозначение диапазона значений включает все целые числа в пределах данного диапазона или все целые числа, определяющие данный диапазон, а также все поддиапазоны, определяемые целыми числами в пределах данного диапазона.

Если иное не очевидно из контекста, термин около охватывает значения ± 5 указанного значения.

Термин и/или относится и охватывает любые и все возможные комбинации одного или более связанных перечисленных элементов, а также отсутствие комбинаций при интерпретации в альтернативе (или).

Термин или относится к любому одному члену конкретного списка, а также включает любую комбинацию элементов этого списка.

Формы единственного числа включают в себя соответствующие им формы множественного числа, если из контекста явным образом не следует иное. Например, термин белок или по меньшей мере один белок может включать множество белков, включая их смеси.

Статистически значимое означает p <0,05.

Подробное описание сущности изобретения

I. Обзор

Нейтрализующие антитела играют важную роль в антибактериальном и противовирусном иммунитете и играют важную роль в предотвращении или модуляции бактериальных или вирусных заболеваний. Такие антитела защищают клетку от антигена или инфекционного тела, нейтрализуя любой биологический эффект, который они оказывают.

Активная вакцинация, как правило, считается лучшим способом борьбы с вирусными заболеваниями, и ее также можно использовать для борьбы с бактериальными заболеваниями. Активный иммунитет относится к процессу воздействия на организм антигена для создания адаптивного иммунного ответа. На проявление реакции уходит дни/недели, но может длиться годами. Пассивный иммунитет относится к процессу обеспечения заранее образованных специфических антител из экзогенного источника для защиты от инфекции. Однако, поскольку собственная иммунная система человека не стимулировалась, иммунологическая память не генерировалась. Следовательно, пассивная иммунизация дает немедленную, но непродолжительную защиту. Защита длится от нескольких дней до нескольких месяцев, а не лет. Пассивная иммунизация может иметь некоторые преимущества перед вакцинацией. В частности, пассивная иммунизация стала привлекательным подходом из-за появления новых и устойчивых к лекарственным средствам микроорганизмов, заболеваний, которые не реагируют на терапию лекарственным

- 19 048264 средствами, и людей с ослабленной иммунной системой, которые не могут реагировать на обычные вакцины.

Антитела, вырабатываемые иммунной системой при инфицировании или активной вакцинации, имеют тенденцию сосредотачиваться на легкодоступных петлях на бактериальной или вирусной поверхности, которые часто имеют большую последовательность и конформационную изменчивость. Это проблема по двум причинам: популяция бактерий или вирусов могут быстро уклоняться от этих антител, а антитела атакуют части белка, которые не являются необходимыми для функционирования. Например, препятствием на пути к разработке эффективной вакцины против некоторых вирусов, таких как ВИЧ, является необычайная способность таких вирусов мутировать и развиваться во множество квазивидов. Нейтрализующие антитела широкого спектра действия, называемые широкого спектра действия, потому что они атакуют многие штаммы или квазивиды бактерий или вирусов, и нейтрализующие, потому что они атакуют ключевые функциональные участки бактерий или вирусов и блокируют инфекцию, могут преодолеть эти проблемы. Однако, эти антитела, как правило, появляются слишком поздно, чтобы обеспечить эффективную защиту от болезни, а лечение такими антителами обеспечивает лишь кратковременную защиту.

В данном документе представлены способы и композиции для интеграции кодирующих последовательностей для антигенсвязывающих белков, таких как нейтрализующие антитела широкого спектра действия, в локус безопасная гавань, такой как локус альбумина у животного in vivo. Последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, может содержать последовательность, кодирующую тяжелой цепи, и последовательность, кодирующую отдельную легкую цепь, интегрированные в один и тот же локус безопасная гавань, чтобы получить антигенсвязывающий белок, который не является одноцепочечным антигенсвязывающим белком. Аналогичным образом, в данном документе представлены способы и композиции для интеграции кодирующих последовательностей для антигенсвязывающих белков, таких как нейтрализующие антитела широкого спектра действия, в любой геномный локус у животного in vivo. Последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, может содержать последовательность, кодирующую тяжелой цепи, и последовательность, кодирующую отдельную легкую цепь, интегрированные в один и тот же геномный локус, чтобы получить антигенсвязывающий белок, который не является одноцепочечным антигенсвязывающим белком. Такие способы приводят к высоким уровням экспрессии антител, которые достигают терапевтического окна для многих заболеваний, включая инфекционные заболевания, и сравнимы с уровнями экспрессии, достигаемыми с помощью эписомальных векторов, которые обычно сохраняются в нескольких копиях на клетку. Интеграция кодирующей последовательности, как в описанных в данном документе способах, имеет преимущество перед неинтегрирующими эписомальными векторами, поскольку удержание трансгена может быть проблематичным с нереплицирующимися эписомальными векторами из-за того, что концентрация нереплицирующихся эписом постепенно и быстро уменьшается из-за деления клеток. В делящихся клетках концентрация ДНК AAV уменьшается из-за деления клеток, что требует введения большего количества вируса для продолжения терапевтического ответа. Эти последующие воздействия могут привести к быстрой нейтрализации вируса и, следовательно, к снижению ответа организма хозяина. Однако эти проблемы не возникают при использовании описанных в данном документе способов интеграции. Уровни экспрессии антител, достигаемые описанными в данном документе способами, могут защитить животных от заражения инфекционными агентами, такими как вирусы и бактерии, или вылечить инфекцию такими инфекционными агентами. Однако способы и композиции не ограничиваются терапевтическими антителами, нацеленными на вирусные или бактериальные антигены, и включают также другие терапевтические антитела.

II. Способы вставки последовательностей, кодирующих антигенсвязывающий белок, в локусы безопасная гавань

В данном документе представлены способы вставки последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в локус безопасная гавань в клетке или животном in vivo. Также предложены способы вставки последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в локус безопасная гавань в клетке in vitro или ex vivo. Аналогичным образом, в данном документе представлены способы вставки последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в геномный локус в клетке или животном in vivo. Также представлены способы вставки последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в геномный локус в клетке in vitro или ex vivo. Также представлены нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, или одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) и экзогенная донорная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, для применения при вставке последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в геномный локус или локус безопасная гавань у субъекта (например, животного или клетки in vivo), причем нуклеазный агент нацелен на сайт-мишень и расщепляет его в геномном локусе или локусе безопасная гавань, и при этом экзогенная донорная нуклеиновая кислота вставлена в геномный локус или локус безопасная гавань. Также представлена экзогенная донорная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, для применения при вставке последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в геномный локус или локус безопасная гавань у субъекта (например, животного или клетки in vivo), причем экзоген- 20 048264 ная донорная нуклеиновая кислота вставлена в геномный локус или локус безопасная гавань. Также представлены нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) и экзогенная донорная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, для применения при лечении или проведении профилактики (предотвращении) заболевания у субъекта (например, животного), при котором нуклеазный агент нацелен на сайт-мишень и расщепляет его в геномном локусе или локусе безопасная гавань субъекта, причем экзогенная донорная нуклеиновая кислота вставлена в геномный локус или локус безопасная гавань, и при этом антигенсвязывающий белок экспрессируется у субъекта и нацелен на антиген, ассоциированный с заболеванием. Также предоставляется экзогенная донорная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, для применения при лечении или проведении профилактики (предотвращения) заболевания у субъекта (например, животного), причем экзогенная донорная нуклеиновая кислота вставлена в геномный локус или локус безопасная гавань, при этом антигенсвязывающий белок экспрессируется у субъекта и нацелен на антиген, ассоциированный с заболеванием. Такие способы могут включать, например, введение животному или в клетку нуклеазного агента, нацеленного на сайт-мишень в геномном локусе или локус безопасная гавань (или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент), и экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующей антигенсвязывающий белок. Нуклеазный агент может расщеплять целевой сайт, а последовательность, кодирующую антигенсвязывающую белок, вставляют в геномный локус или локус безопасная гавань для получения модифицированного геномного локуса или локуса безопасная гавань. Альтернативно, такие способы могут включать введение животному или в клетку экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок. Последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в геномный локус или локус безопасная гавань (например, посредством гомологичной рекомбинации или любого другого механизма рекомбинации или вставки) для получения модифицированного геномного локуса или локуса безопасная гавань. Также представлены способы вставки последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в геномный локус или ген безопасная гавань или для вставки кодирующей последовательности антигенсвязывающего белка в геномный локус или локус безопасная гавань в геноме. Такие способы могут включать, например, приведение в контакт геномного гена или гена безопасная гавань, или геномного локуса, или локуса безопасная гавань с нуклеазным агентом, нацеленным на сайт-мишень в геномном гене/локусе или гене/локусе безопасная гавань (или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) и экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом нуклеазный агент расщепляет сайт-мишень, а последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в геномный ген/локус или ген/локус безопасная гавань для получения модифицированного геномного гена/локуса или гена/локуса безопасная гавань. Альтернативно, такие способы могут включать приведение в контакт геномного гена/локуса или гена/локуса безопасная гавань с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в геномный ген/локус или ген/локус безопасная гавань для получения модифицированного геномного гена/локуса или ген/локус безопасная гавань. Необязательно можно использовать два или более нуклеазных агента, нацеленных на разные сайты-мишени в геномном гене/локусе или гене/локусе безопасная гавань. Модифицированный геномный ген/локус или ген/локус безопасная гавань может быть гетерозиготным или гомозиготным по последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок.

Необязательно, такие способы могут дополнительно включать оценку экспрессии и/или активности антигенсвязывающего белка у животного. Примеры таких способов описаны в другом месте в данном документе, как и примеры антигенсвязывающих белков (и кодирующих последовательностей), типов нуклеазных агентов, типов экзогенных донорных нуклеиновых кислот, типов геномных локусов или локусов безопасная гавань, а также типов животных, которые могут использоваться в таких способах. В некоторых способах экспрессия антигенсвязывающего белка в образцах сыворотки или плазмы животного составляет по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 1000, по меньшей мере около 1500, по меньшей мере около 2000, по меньшей мере около 2500, по меньшей мере около 3000, по меньшей мере около 3500, по меньшей мере около 4000, по меньшей мере около 4500, по меньшей мере около 5000, по меньшей мере около 5500, по меньшей мере около 6000, по меньшей мере около 6500, по меньшей мере около 7000, по меньшей мере около 7500, по меньшей мере около 8000, по меньшей мере около 8500, по меньшей мере около 9000, по меньшей мере около 9500, по меньшей мере около 10000, по меньшей мере около 20000, по меньшей мере около 30000, по меньшей мере около 40000, по меньшей мере около 50000, по меньшей мере около 60000, по меньшей мере около 70000, по меньшей мере около 80000, по меньшей мере около 90000, по меньшей мере около 100000, по меньшей мере около 110000, по меньшей мере около 120000, по меньшей мере около 130000, по меньшей мере около 140000, по меньшей мере около 150000, по меньшей мере около 200000, по меньшей мере около 250000, по меньшей мере около

- 21 048264

300000, по меньшей мере около 350000, по меньшей мере около 400000, по меньшей мере около 500000, по меньшей мере около 600000, по меньшей мере около 700000, по меньшей мере около 800000, по меньшей мере около 900000 или по меньшей мере около 1000000 нг/мл (т.е. по меньшей мере около 0,5, по меньшей мере около 1, по меньшей мере около 1,5, по меньшей мере около 2, по меньшей мере около 2,5, по меньшей мере около 3, по меньшей мере около 3,5, по меньшей мере около 4, по меньшей мере около 4,5, по меньшей мере около 5, по меньшей мере около 5,5, по меньшей мере около 6, по меньшей мере около 6,5, по меньшей мере около 7, по меньшей мере около 7,5, по меньшей мере около 8, по меньшей мере около 8,5, по меньшей мере около 9, по меньшей мере около 9,5, по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 110, по меньшей мере около 120, по меньшей мере около 130, по меньшей мере около 140, по меньшей мере около 150, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 250, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 350, по меньшей мере около 400, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 900, или по меньшей мере около 1000 мкг/мл) через около 1 неделю, около 2 недели, около 3 недели, около 4 недели, около 5 недель, около 6 недель, около 7 недель, около 8 недель, около 9 недель, около 10 недель, около 1 месяц, около 2 месяца, около 3 месяца, около 4 месяца, около 5 месяцев или около 6 месяцев после инъекции нуклеазного агента (или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) и экзогенной донорной последовательности. Например, экспрессия может составлять по меньшей мере около 2500, по меньшей мере около 5000, по меньшей мере около 10000, по меньшей мере около 100000, по меньшей мере около 400000, по меньшей мере около 500000, по меньшей мере около 600000, по меньшей мере около 700000, по меньшей мере около 800000, по меньшей мере около 900000, или по меньшей мере около 1000000 нг/мл (то есть, по меньшей мере около 2,5, по меньшей мере около 5, по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 400, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 900, по меньшей мере около 1000, по меньшей мере около 1100, по меньшей мере около 1200, по меньшей мере около 1300, по меньшей мере около 1400 или меньшей мере около 1500 мкг/мл) через около 2 недели, около 4 недели, около 8 недель, около 9 недель, около 10 недель, около 11 недель, около 12 недель, около 13 недель, около 14 недель, около 15 недель, около 16 недель, около 17 недель, около 18 недель, около 19 недель, около 20 недель, около 1 месяц, около 2 месяца, около 3 месяца, около 4 месяца, около 5 месяцев или около 6 месяцев после инъекции. В некоторых способах, в которых антигенсвязывающий белок или антитело нацелены на бактериальный или вирусный антиген, процент инфективности снижается до менее около 95%, менее около 90%, менее около 85%, менее около 80%, менее около 75%, менее около 70%, менее около 65%, менее около 55%, менее около 50%, менее около 45%, менее около 40%, менее около 35%, менее около 30%, менее около 25% (например, как определено в анализе нейтрализации) по сравнению с инфективностью в образце отрицательного контроля через около 1 неделю, около 2 недели, около 3 недели, около 4 недели, около 5 недель, около 6 недель, около 7 недель, около 8 недель, около 9 недель, около 10 недель, около 1 месяца, около 2 месяца, около 3 месяца, около 4 месяца, около 5 месяцев или около 6 месяцев после инъекции нуклеазного агента (или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) и экзогенной донорной последовательности. Например, инфективность может быть снижена до менее около 65%, менее около 60% или менее около 55% примерно через 2 недели после инъекции.

Нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) и экзогенную донорную последовательность могут быть введены в любой форме (например, ДНК или РНК для направляющих РНК; ДНК, РНК или белок для белков Cas) любым способом доставки (например, AAV, ЛНЧ или HDD) и любым путем введения, как описано в другом месте в данном документе. В одном конкретном примере, нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) доставляют с помощью доставки, опосредованной липидными наночастицами (ЛНЧ), а экзогенную донорную нуклеиновую кислоту доставляют посредством доставки аденоассоциированным вирусом (AAV) (например, опосредованной AAV8 доставки или опосредованной AAV2/8 доставки). Например, нуклеазный агент может представлять собой CRISPR/Cas9, а мРНК Cas9 и нРНК, нацеленные на геномный локус или локус безопасная гавань (например, интрон 1 альбумина), могут быть доставлены посредством опосредованной ЛНЧ доставки, а экзогенную донорную нуклеиновую кислоту может доставляться посредством опосредованной AAV8 доставки или опосредованной AAV2/8 доставки. В другом конкретном примере как нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент), так и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту доставляют посредством опосредованной AAV доставки (например, через два отдельных AAV, например, два отдельных AAV8 или AAV2/8). Например, первый AAV (например, AAV8 или AAV2/8) может нести кассету экспрессии Cas9, а второй AAV (например,

- 22 048264

AAV8 или AAV2/8) может нести кассету экспрессии нРНК и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту. Альтернативно, первый AAV (например, AAV8 или AAV2/8) может нести кассету экспрессии Cas9 и кассету экспрессии нРНК, а второй AAV (например, AAV8 или AAV2/8) может нести экзогенную донорную нуклеиновую кислоту. Для управления экспрессией нРНК можно использовать разные промоторы, такие как промотор U6 или малую тРНК Gln. Аналогичным образом, для управления экспрессией Cas9 можно использовать разные промоторы. В некоторых методах используются малые промоторы, чтобы кодирующую последовательность Cas9 можно было поместить в конструкцию AAV. Примеры таких промоторов включают Efs, SV40 или синтетический промотор, содержащий специфический к печени энхансер (например, E2 из вируса HBV или серпина A из гена серпина A) и коровой промотор (например, описанный в данном документе синтетический промотор E2P или синтетический промотор серпина AP).

Последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, может быть вставлена в определенные типы клеток животного. Способ и носитель для введения нуклеазного агента (или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) и экзогенной донорной последовательности животному могут влиять на то, какие типы клеток у животного являются мишенями. В некоторых способах, например, последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставляют в геномный локус или локус безопасная гавань в клетках печени. Способы и носители для введения нуклеазного агента (или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) и экзогенной донорной последовательности животному (включая способы и носители, нацеленные на печень, такие как опосредованная липидными наночастицами доставка и опосредованная AAV8 доставка или опосредованная AAV2/8 доставка) более подробно описаны в другом месте в данном документе.

Нацеленная вставка последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в геномный локус или локус безопасная гавань, и особенно локус безопасная гавань альбумина, предлагает множество преимуществ. Такие способы приводят к стабильной модификации, обеспечивающей стабильную долгосрочную экспрессию последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок. Что касается локуса безопасная гавань альбумина, в таких способах могут использовать высокую транскрипционную активность нативного энхансера/промотора альбумина. При нацеливании на гены in vivo может оказаться невозможным положительно отобрать измененные клетки, а нацеливание на ограниченное количество клеток часто может не приводить к получению достаточного количества секретируемого белка для коррекции фенотипа заболевания. Направленный на печень перенос генов привлекателен из-за способности печени секретировать большое количество белка в кровь, даже если поражен лишь небольшой процент клеток печени.

Последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, может быть функционально связана с экзогенным промотором экзогенной донорной нуклеиновой кислоты. Примеры типов промоторов, которые можно использовать, описаны в другом месте в данном документе. Альтернативно, последовательность антигенсвязывающего белка может содержать ген без промотора, и вставленная последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, может быть функционально связана с эндогенным промотором в геномном локусе или локусе безопасная гавань. Использование эндогенного промотора является преимуществом, поскольку он устраняет необходимость включения промотора в последовательность экзогенного донора, позволяя упаковывать более крупные трансгены, которые, как правило, не могут упаковываться эффективно, например, в AAV. Например, вставленная последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, может быть вставлена в эндогенный локус альбумина и функционально связана с эндогенным промотором альбумина для получения высоких уровней экспрессии, главным образом, в ткани печени.

Необязательно, некоторые или все эндогенные гены в геномном локусе или локусе безопасная гавань могут быть экспрессированы после вставки последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления ни один из эндогенного геномного гена или гена безопасная гавань не может быть экспрессирован. В качестве одного примера, модифицированный геномный локус или локус безопасная гавань может кодировать химерный белок, содержащий эндогенный сигнал секреции и антигенсвязывающий белок. Например, первый интрон локуса альбумина может представлять собой мишень, потому что первый экзон гена альбумина кодирует секреторный пептид, который отщепляется от конечного белкового продукта. В таком сценарии кассета антигенсвязывающего белка без промотора, несущая акцептор сплайсинга и последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, будет поддерживать экспрессию и секрецию антигенсвязывающего белка. Сплайсинг между экзоном 1 альбумина и интегрированной последовательностью, кодирующей антигенсвязывающий белок, создает химерную мРНК и белок, включающий эндогенный секреторный пептид, функционально связанный с последовательностью антигенсвязывающего белка.

Последовательность, кодирующий антигенсвязывающий белок, в экзогенной донорной последовательности может быть вставлена в геномный локус или локус безопасная гавань любым способом. Репарация в ответ на двухцепочечные разрывы (DSB) происходит главным образом через два консервативных пути репарации ДНК: гомологичная рекомбинация (HR) и негомологичное соединение концов

- 23 048264 (NHEJ). См. Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897, которая включена в полном объеме в данный документ посредством ссылки для всех целей. Точно так же репарация нуклеиновая кислоты-мишени, опосредованная экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, может включать любой процесс обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами.

Термин рекомбинация включает любой процесс обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами и может происходить по любому механизму. Рекомбинация может происходить посредством направляемой гомологией репарации (HDR) или гомологичной рекомбинации (HR). HDR или HR включает форму репарации нуклеиновой кислоты, которая может требовать гомологии нуклеотидной последовательности, использует донорную молекулу в качестве матрицы для репарации молекулы мишени (т.е. той, которая подверглась двуцепочечному разрыву) и приводит к передаче генетической информации от донора к мишени. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, такой перенос может включать коррекцию несоответствия гетеродуплексной ДНК, которая образуется между поврежденной мишенью и донором, и/или зависимую от синтеза гибридизацию цепи, при которой донор используется для повторного синтеза генетической информации, которая станет частью мишени, и/или связанные процессы. В некоторых случаях донорный полинуклеотид, часть донорного полинуклеотида, копия донорного полинуклеотида или часть копии донорного полинуклеотида интегрируется в ДНКмишень. См. Wang et al. (2013) Cell 153:910-918; Mandalos et al. (2012) PLoS ONE 7:e45768:1-9; и Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

NHEJ включает репарацию двухцепочечных разрывов в нуклеиновой кислоте путем прямого лигирования разорванных концов друг с другом или с экзогенной последовательностью без необходимости в гомологичной матрице. Лигирование несмежных последовательностей с помощью NHEJ часто может приводить к делециям, вставкам или транслокациям вблизи места двухцепочечного разрыва. Например, NHEJ может также привести к направленной интеграции экзогенной донорной нуклеиновой кислоты посредством прямого лигирования разорванных концов с концами экзогенной донорной нуклеиновой кислоты (т.е. захват на основе NHEJ). Такая направленная интеграция, опосредованная NHEJ, может быть предпочтительной для введения экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, когда пути направляемой гомологией репарации (HDR) не могут легко применяться (например, в неделящихся клетках, первичных клетках и клетках, которые плохо выполняют гомологичную репарацию ДНК). Кроме того, в отличие от направляемой гомологией репарации, знания о больших областях идентичности последовательностей, фланкирующих сайт расщепления, не требуются, что может быть полезно при попытке направленной вставки в организмы, геномы которых имеют ограниченные знания о геномной последовательности. Интеграция может происходить посредством лигирования тупых концов между экзогенной донорной нуклеиновой кислотой и расщепленной геномной последовательностью или посредством лигирования липких концов (т.е. имеющих 5'- или 3'-выступы) с использованием экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, фланкированной выступами, которые совместимы с теми, которые генерируются нуклеазным агентом в расщепленной геномной последовательности. См., например, US 2011/020722, WO 2014/033644, WO 2014/089290 и Maresca et al. (2013) Genome Res . 23 (3): 539-546, каждый из которых полностью включен в данный документ посредством ссылки для всех целей. Если лигированы тупые концы, может потребоваться удаление мишени и/или донора для создания областей микрогомологии, необходимых для соединения фрагментов, что может создать нежелательные изменения в последовательности-мишени.

В конкретном примере экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть вставлена посредством независимой от гомологии направленной интеграции (например, независимой от гомологии направленной нацеленной интеграции). Например, последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, в экзогенной донорной нуклеиновой кислоте фланкирована с каждой стороны сайтом-мишенью для нуклеазного агента (например, тем же сайтом-мишенью, что и в геномном локусе или локусе безопасная гавань, и тем же самым нуклеазным агентом, используемым для расщепления сайта-мишени в геномном локусе или локусе безопасная гавань). Затем нуклеазный агент может расщеплять сайты-мишени, фланкирующие последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок. В конкретном примере, экзогенную донорную нуклеиновую кислоту доставляют с помощью опосредованной AAV доставки, и расщепление сайтов-мишеней, фланкирующих последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, может удалить инвертированные концевые повторы (ITR) AAV. Удаление ITR может упростить оценку успешного нацеливания, потому что присутствие ITR может препятствовать усилиям по секвенированию из-за повторяющихся последовательностей. В некоторых способах сайт-мишень в геномном локусе или локусе безопасная гавань (например, последовательность-мишень нРНК, включая фланкирующий мотив, прилегающий к протоспейсеру) больше не присутствует, если последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставлена в геномный локус или локус безопасная гавань в правильной ориентации, но он реформируется, если последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставлена в геномный локус или локус безопасная гавань в противоположной ориентации. Это может помочь гарантировать, что последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставлена в правильной ориентации для экспрессии.

- 24 048264

A. Нуклеазы CRISPR/Cas и другие нуклеазные агенты

1. Системы CRISPR/Cas

В способах и композициях, описанных в данном документе, можно использовать системы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR)/CR[SPR-ассоциированных белков (Cas) или компоненты таких систем для модификации генома внутри клетки (например, геномного локуса или локуса безопасная гавань в геноме, например, локуса альбумина). Системы CRISPR/Cas включают транскрипты и другие элементы, участвующие в экспрессии генов Cas или управляющие их активностью. Система CRISPR/Cas может быть, например, системой типа I, типа II, системой типа III или системой типа V (например, подтипом V-A или подтипом V-B). В описанных в данном документе способах и композициях можно использовать системы CRISPR/Cas за счет использования комплексов CRISPR (содержащих направляющую РНК (нРНК) в комплексе с белком Cas) для сайтнаправленного связывания или расщепления нуклеиновых кислот.

Системы CRISPR/Cas, используемые в описанных в данном документе композициях и способах, могут представлять собой не встречающимися в природе системы. Не встречающаяся в природе система включает все, что указывает вмешательство человека, например, один или более компонентов системы, измененных или мутировавших по сравнению с их природным состоянием, по меньшей мере, практически отсутствие, по меньшей мере, одного другого компонента, с которым компоненты системы естественным образом связаны в природе, или связь, по меньшей мере, с одним другим компонентом, с которым компоненты системы не связаны в природе. Например, в некоторых системах CRISPR/Cas используются не встречающиеся в природе комплексы CRISPR, содержащие нРНК и белок Cas, которые не встречаются в природе вместе, используется белок Cas, который не встречается в природе, или используется нРНК, которая не встречается в природе.

а. Белки Cas

Белки Cas, как правило, содержат, по меньшей мере, один распознающий или связывающий домен РНК, который может взаимодействовать с направляющими РНК. Белки Cas также могут содержать нуклеазные домены (например, домены ДНКазы или домены РНКазы), ДНК-связывающие домены, геликазные домены, домены межбелкового взаимодействия, домены димеризации и другие домены. Некоторые такие домены (например, домены ДНКазы) могут происходить из природного белка Cas. Другие такие домены могут быть добавлены для получения модифицированного белка Cas. Нуклеазный домен обладает каталитической активностью в отношении расщепления нуклеиновой кислоты, которое включает разрыв ковалентных связей молекулы нуклеиновой кислоты. Расщепление может приводить к тупым или ступенчатым концам, и оно может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Например, белок Cas9 дикого типа, как правило, создает тупой конец продукта расщепления. Альтернативно, белок Cpf1 дикого типа (например, FnCpf1) может приводить к продукту расщепления с 5'-липким концом из 5 нуклеотидов, при этом расщепление происходит после 18-й пары оснований из последовательности PAM на нецелевой цепи и после 23-го основания на цепи-мишени. Белок Cas может обладать полной активностью расщепления для создания двухцепочечного разрыва в геномном локусе-мишени (например, двухцепочечного разрыва с тупыми концами), или это может быть никаза, которая создает одноцепочечный разрыв в геномном локусе-мишени.

Примеры белков Cas включают Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 или Csx12), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 и Cu1966, и их гомологи или их модифицированные версии.

Примером белка Cas является белок Cas9 или белок, полученный из белка Cas9. Белки Cas9 происходят из системы CRISPR/Cas типа II и обычно имеют четыре ключевых мотива с консервативной архитектурой. Мотивы 1, 2 и 4 представляют собой RuvC-подобные мотивы, а мотив 3 представляет собой мотив HNH. Типовые белки Cas9 происходят из Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, Acaryochloris marina, Neisseria meningitidis или Campylobacter jejuni. Дополнительные примеры членов семейства Cas9 описаны в WO 2014/131833, включенном в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Cas9 из S. pyogenes

- 25 048264 (SpCas9) (которому присвоен номер доступа SwissProt Q99ZW2) представляет собой типовой белок Cas9. Иллюстративная последовательность белка SpCas9 приведена в SEQ ID NO: 62 (кодируется последовательностью ДНК, указанной в SEQ ID NO: 61). Иллюстративная последовательность мРНК SpCas9 указана в SEQ ID NO: 63. Cas9 из S. aureus (SaCas9) (которому присвоен номер доступа UniProt J7RUA5) представляет собой еще один пример белка Cas9. Cas9 из Campylobacter jejuni (CjCas9) (которому присвоен номер доступа UniProt Q0P897) представляет собой другой типовой белок Cas9. См., например, Kim et al. (2017) Nat. Comm. 8: 14500, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. SaCas9 меньше, чем SpCas9, а CjCas9 меньше, чем SaCas9 и SpCas9. Cas9 из Neisseria meningitidis (Nme2Cas9) представляет собой еще один иллюстративный белок Cas9. См., например, Edraki et al. (2019) Mol. Cell 73(4):714-726, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Белки Cas9 из Streptococcus thermophilus (например, Streptococcus thermophilus LMD-9 Cas9, кодируемый локусом CRISPR1 (St1Cas9) или Streptococcus thermophilus Cas9 из локуса CRISPR3 (St3Cas9)) представляют собой другие типовые белки Cas9. Cas9 из Francisella novicida (FnCas9) или вариант Cas9 RHA Francisella novicida, который распознает альтернативный PAM (замены E1369R/E1449H/R1556A) представляют собой другие иллюстративные белки Cas9. Эти и другие иллюстративные белки Cas9 рассмотрены, например, в Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm. Genome 28(7):247-261, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

Другим примером белка Cas является белок Cpf1 (CRISPR из Prevotella и Francisella 1). Cpf1 представляет собой большой белок (около 1300 аминокислот), который содержит RuvC-подобный нуклеазный домен, гомологичный соответствующему домену Cas9, вместе с аналогом характерного богатого аргинином кластера Cas9. Однако в Cpf1 отсутствует нуклеазный домен HNH, который присутствует в белках Cas9, а RuvC-подобный домен является граничащим в последовательности Cpf1, в отличие от Cas9, где он содержит длинные вставки, включая домен HNH. См., например, Zetsche et al. (2015) Cell 163(3):759-771, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Иллюстративные белки Cpf1 происходят из Francisella tularensis 1, Francisella tularensis subsp. novicida, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium MC2017 1, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10, Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17, Smithella sp. SCADC, Acidaminococcus sp. BV3L6, Lachnospiraceae bacterium MA2020, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi 237, Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium ND2006, Porphyromonas crevioricanis 3, Prevotella disiens и Porphyromonas macacae. Cpf1 из Francisella novicida U112 (FnCpf1; которому присвоен номер доступа UniProt A0Q7Q2) представляет собой иллюстративный белок Cpf1.

Белки Cas могут быть белками дикого типа (т.е. белками, которые встречаются в природе), модифицированными белками Cas (т.е. вариантами белков Cas) или фрагментами белков Cas дикого типа или модифицированных белков Cas. Белки Cas также могут быть активными вариантами или фрагментами в отношении каталитической активности белков Cas дикого типа или модифицированных белков Cas. Активные варианты или фрагменты в отношении каталитической активности могут иметь, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с белком Cas дикого типа или модифицированным белком Cas или его частью, при этом активные варианты сохраняют способность разрезать в желаемом сайте расщепления и, следовательно, сохраняют активность, индуцирующую одноцепочечный или двухцепочечный разрыв. Анализы на активность, индуцирующую одноцепочечный или двухцепочечный разрыв, известны и обычно измеряют общую активность и специфичность белка Cas на субстратах ДНК, содержащих сайт расщепления.

Одним из примеров модифицированного белка Cas является модифицированный белок SpCas9HF1, который представляет собой высокоточный вариант Streptococcus pyogenes Cas9, несущий изменения (N497A/R661A/Q695A/Q926A), предназначенный для уменьшения неспецифических контактов ДНК. См., например, Kleinstiver et al. (2016) Nature 529(7587):490-495, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Другим примером модифицированного белка Cas является модифицированный вариант eSpCas9 (K848A/K1003A/R1060A), предназначенный для уменьшения нецелевых воздействий. См., например, Slaymaker et al. (2016) Science 351(6268):84-88, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Другие варианты SpCas9 включают K855A и K810A/K1003A/R1060A. Обзор этих и других модифицированных белков Cas приведен, например, в Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm. Genome 28(7):247-261, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Другим примером модифицированного белка Cas9 является xCas9, который представляет собой вариант SpCas9, который может распознавать расширенный диапазон последовательностей PAM. См., например, Hu et al. (2018) Nature 556: 57-63, полностью включенная в данный документ посредством ссылки для всех целей.

Белки Cas можно модифицировать для увеличения или уменьшения одного или более из следующих параметров: аффинность связывания нуклеиновой кислоты, специфичность связывания нуклеиновой кислоты и ферментативная активность. Белки Cas также можно модифицировать для изменения любой другой активности или свойства белка, например стабильности. Например, один или более нуклеаз- 26 048264 ных доменов белка Cas могут быть модифицированы, удалены или инактивированы, или белок Cas может быть укорочен для удаления доменов, которые не являются существенными для функции белка, или для оптимизации (например, увеличения или уменьшения) активности или свойств белка Cas.

Белки Cas могут содержать, по меньшей мере, один нуклеазный домен, такой как домен ДНКазы. Например, белок Cpf1 дикого типа, как правило, содержит RuvC-подобный домен, который расщепляет обе цепи ДНК-мишени, возможно, в димерной конфигурации. Белки Cas также могут содержать, по меньшей мере, два нуклеазных домена, например, домены ДНКазы. Например, белок Cas9 дикого типа обычно содержит домен RuvC-подобный и HNH-подобный нуклеазный домен. Каждый из доменов RuvC и HNH может разрезать разные цепи двухцепочечной ДНК, чтобы образовать двухцепочечный разрыв в ДНК. См., например, Jinek et al. (2012) Science 337(6096):816-821, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

Один или более, или все нуклеазные домены могут быть удалены или мутированы, так что они больше не функционируют или имеют пониженную нуклеазную активность. Например, если один из нуклеазных доменов удален или мутирован в белке Cas9, полученный белок Cas9 может называться никазой и может генерировать одноцепочечный разрыв в двухцепочечной ДНК-мишени, но не двухцепочечный разрыв (т.е. он может расщеплять комплементарную цепь или некомплементарную цепь, но не обе). Если оба нуклеазных домена удалены или мутированы, полученный белок Cas (например, Cas9) будет иметь пониженную способность расщеплять обе цепи двухцепочечной ДНК (например, белок Cas без нуклеазной активности или нуклеза-неактивный белок Cas, или каталитически мертвый белок Cas (dCas)). Примером мутации, которая превращает Cas9 в никазу, является мутация D10A (аспартат в аланин в положении 10 Cas9) в домене RuvC Cas9 из S. pyogenes. Аналогичным образом, H939A (гистидин в аланин в положении аминокислоты 839), H840A (гистидин в аланин в положении аминокислоты 840) или N863A (аспарагин в аланин в положении аминокислоты N863) в домене HNH Cas9 из S. pyogenes может преобразовывать Cas9 в никазу. Другие примеры мутаций, которые превращают Cas9 в никазу, включают соответствующие мутации Cas9 из S. thermophilus. См., например, Sapranauskas et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39(21):9275-9282 и WO 2013/141680, каждая из которых включена в полном объеме в данный документ посредством ссылки для всех целей. Такие мутации могут быть получены с использованием таких способов, как сайт-направленный мутагенез, ПЦР-опосредованный мутагенез, или синтез полных генов. Примеры других мутаций, создающих никазы, можно найти, например, в WO 2013/176772 и WO 2013/142578, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Если все нуклеазные домены удалены или мутированы в белке Cas (например, оба домена нуклеазы удалены или мутированы в белке Cas9), полученный в результате белок Cas (например, Cas9) будет иметь пониженную способность расщеплять обе цепи двухцепочечной ДНК (например, белок Cas без нуклеазной активности или нуклеаза-неактивный белок Cas). Одним из конкретных примеров является двойной мутант по Cas9 D10A/H840A S. pyogenes или соответствующий двойной мутант по Cas9 от другого вида при оптимальном выравнивании с Cas9 S. pyogenes. Другим конкретным примером является двойной мутант по Cas9 D10A/N863A S. pyogenes или соответствующий двойной мутант по Cas9 от другого вида при оптимальном выравнивании с Cas9 S. pyogenes.

Примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах xCas9 такие же, как описанные выше для SpCas9. Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах белков Cas9 Staphylococcus aureus. Например, фермент Cas9 Staphylococcus aureus (SaCas9) может содержать замену в положении N580 (например, замену N580A) и замену в положении D10 (например, замену D10A) для образования нуклеаза-неактивного белка Cas. См., например, WO 2016/106236, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах Nme2Cas9 (например, комбинация D16A и H588A). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах St1Cas9 (например, комбинация D9A, D598A, H599A и N622A). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах St3Cas9 (например, комбинация D10A и N870A). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах CjCas9 (например, комбинация D8A и H559A). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах FnCas9 и RHA FnCas9 (например, N995A).

Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах белков Cpf1. Что касается белков Cpf1 из Francisella novicida U112 (FnCpf1), Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCpf1), Lachnospiraceae bacterium ND2006 (LbCpf1) и Moraxella bovoculi 237 (MbCpf1 Cpf1), такие мутации могут включать мутации в положениях 908, 993 или 1263 AsCpf1 или в соответствующих положениях в ортологах Cpf1, или в положениях 832, 925, 947 или 1180 LbCpf1 или в соответствующих положениях в ортологах Cpf1. Такие мутации могут включать, например, одну или более мутаций D908A, E993A и D1263A AsCpf1 или соответствующие мутации в ортологах Cpf1, или D832A, E925A, D947A и D1180A LbCpf1 или соответствующие мутации в ортологах Cpf1. См., например, патент США 2016/0208243, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

Белки Cas также могут быть функционально связаны с гетерологичными полипептидами в качестве слитых белков. Например, белок Cas может быть слит с доменом расщепления или доменом эпигенети- 27 048264 ческой модификации. См. WO 2014/089290, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Белки Cas также могут быть слиты с гетерологичным полипептидом, обеспечивая повышенную или пониженную стабильность. Слитый домен или гетерологичный полипептид может быть расположен на N-конце, C-конце или внутри белка Cas.

В качестве одного примера, белок Cas может быть слит с одним или более гетерологичными полипептидами, которые обеспечивают субклеточную локализацию. Такие гетерологичные полипептиды могут содержать, например, один или более клеточных сигналов внутриядерной локализации (NLS), таких как однокомпонентный NLS SV40 и/или двухкомпонентный NLS альфа-импортина для нацеливания на ядро, сигнал митохондриальной локализации для нацеливания на митохондрии, сигнал удержания в ЭР и т.п. См., например, Lange et al. (2007) J. Biol. Chem. 282(8):5101-5105, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Такие сигналы субклеточной локализации могут быть расположены на N-конце, C-конце или где-либо в пределах белка Cas. NLS может содержать отрезок основных аминокислот и может быть однокомпонентной последовательностью или двухкомпонентной последовательностью. Необязательно, белок Cas может содержать два или более NLS, включая NLS (например, NLS альфа-импортина или однокомпонентный NLS) на N-конце и NLS (например, NLS SV40 или двухкомпонентный NLS) на C-конце. Белок Cas также может содержать два или более NLS на N-конце и/или два или более NLS на C-конце.

Белки Cas также могут быть функционально связаны с доменом проникновения в клетку, или доменом трансдукции белка. Например, домен проникновения в клетки, может происходить из белка ТАТ ВИЧ-1, TLM-мотива проникновения в клетки из вируса гепатита В человека, MPG, Pep-1, VP22, пептида проникновения в клетки из вируса простого герпеса или пептидной последовательности полиаргинина. См., например, WO 2014/089290 и WO 2013/176772, каждая из которых включена в полном объеме в данный документ посредством ссылки для всех целей. Домен проникновения в клетку может располагаться на N-конце, C-конце или где-либо в пределах белка Cas.

Белки Cas также могут быть функционально связаны с гетерологичным полипептидом для облегчения отслеживания или очистки, таким как флуоресцентный белок, метка очистки или эпитопная метка. Примеры флуоресцентных белков включают зеленые флуоресцентные белки (например, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, Мономерный Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl), желтые флуоресцентные белки (например, YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), голубые флуоресцентные белки (например, eBFP, eBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), голубые флуоресцентные белки (например, eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), красные флуоресцентные белки (например, mKate, mKate2, mPlum, мономер DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, мономер DsRed, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mRaspberry, mStrawberry, Jred), оранжевые флуоресцентные белки (например, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Мономерный Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) и любой другой подходящий флуоресцентный белок. Примеры меток включают глутатион-S-трансферазу (GST), хитин-связывающий белок (CBP), связывающий мальтозу белок, тиоредоксин (TRX), поли(NANP), метку для тандемной аффинной очистки (TAP), myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, гемагглютинин (HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, гистидин (His), белок-носитель биотин-карбоксила (BCCP) и кальмодулин.

Белки Cas также могут быть присоединены к меченым нуклеиновым кислотам или донорным последовательностям. Такое присоединение (т.е. физическое связывание) может быть достигнуто посредством ковалентных взаимодействий или нековалентных взаимодействий, и связывание может быть прямым (например, посредством прямого слияния или химической конъюгации, что может быть достигнуто путем модификации остатков цистеина или лизина в белке или модификации интеина), или может быть достигнуто с помощью одного или более промежуточных линкеров или адаптерных молекул, таких как стрептавидин или аптамеры. См., например, Pierce et al. (2005) Mini Rev. Med. Chem. 5(1):41-55; Duckworth et al. (2007) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46(46):8819-8822; Schaeffer and Dixon (2009) Australian J. Chem. 62(10):1328-1332; Goodman et al. (2009) Chembiochem. 10(9):1551-1557; и Khatwani et al. (2012) Bioorg. Med. Chem. 20(14):4532-4539, каждая из которых включена в полном объеме в данный документ посредством ссылки для всех целей. Нековалентные стратегии синтеза конъюгатов белок-нуклеиновая кислота включают биотин-стрептавидиновые и никель-гистидиновые методы. Ковалентные конъюгаты белок-нуклеиновая кислота могут быть синтезированы путем соединения соответствующим образом функционализированных нуклеиновых кислот и белков с использованием широкого разнообразия химических процессов. Некоторые из этих химических процессов включают прямое присоединение олигонуклеотида к аминокислотному остатку на поверхности белка (например, лизиновому амину или цистеиновому тиолу), в то время как другие более сложные схемы требуют посттрансляционной модификации белка или участия каталитического или реакционноспособного домена белка. Способы ковалентного присоединения белков к нуклеиновым кислотам могут включать, например, химическое сшивание олигонуклеотидов с остатками лизина или цистеина белка, лигирование экспрессированного белка, химиоферментные методы и использование фотоаптамеров. Меченая нуклеиновая кислота или донорная последовательность может быть присоединена к С-концу, N-концу или к внутренней области в белке Cas. В

- 28 048264 одном примере меченая нуклеиновая кислота или донорная последовательность присоединена к С-концу или N-концу белка Cas. Аналогичным образом, белок Cas может быть привязан к 5'-концу, 3'-концу или к внутренней области внутри меченой нуклеиновой кислоты или донорной последовательности. То есть меченая нуклеиновая кислота или донорная последовательность может быть присоединена в любой ориентации и полярности. Например, белок Cas может быть присоединен к 5'-концу или 3'-концу меченой нуклеиновой кислоты или донорной последовательности.

Белки Cas могут быть представлены в любой форме. Например, белок Cas может быть представлен в форме белка, такого как белок Cas в комплексе с нРНК. Альтернативно, белок Cas может быть представлен в форме нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Cas, такой как РНК (например, матричная РНК (мРНК)) или ДНК. Необязательно, нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может быть оптимизирована по кодонам для эффективной трансляции в белок в конкретной клетке или организме. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может быть модифицирована для замены кодонов, которые чаще используются в бактериальной клетке, дрожжевой клетке, человеческой клетке, клетке отличного от человека животного, клетке млекопитающего, клетке грызунов, клетке мыши, клетке крысы или любой другой представляющей интерес клетке-хозяине по сравнению со встречающейся в природе полинуклеотидной последовательностью. Когда нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas, вводят в клетку, белок Cas может транзиентно, условно или конститутивно экспрессироваться в клетке.

Белки Cas, представленные в виде мРНК, можно модифицировать для улучшения свойств стабильности и/или иммуногенности. Модификации могут быть внесены в один или более нуклеозидов внутри мРНК. Примеры химических модификаций азотистых оснований мРНК включают псевдоуридин, 1метил-псевдоуридин и 5-метилцитидин. Например, можно использовать кэпированную и полиаденилированную мРНК Cas, содержащую N1-метил псевдоуридин. Точно так же мРНК Cas могут быть изменены за счет истощения уридина с использованием синонимичных кодонов.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки Cas, могут быть стабильно интегрированы в геном клетки и функционально связаны с активным в клетке промотором. Альтернативно, нуклеиновые кислоты, кодирующие белки Cas, могут быть функционально связаны с промотором в конструкции экспрессии. Конструкции экспрессии включают любые конструкции нуклеиновых кислот, способные управлять экспрессией гена или другой представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты (например, гена Cas) и которые могут переносить такую представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты в клетку-мишень. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может находиться в векторе, содержащем ДНК, кодирующую нРНК. Альтернативно, он может находиться в векторе или плазмиде, отдельном от вектора, содержащего ДНК, кодирующую нРНК. Промоторы, которые можно использовать в конструкции экспрессии, включают промоторы, активные, например, в одной или более из следующего: эукариотическая клетка, человеческая клетка, клетка отличного от человека животного, клетка млекопитающего, клетка отличного от человека млекопитающего, клетка грызунов, клетка мыши, клетка крысы, плюрипотентная клетка, эмбриональная стволовая (ЭС) клетка, взрослая стволовая клетка, ограниченная стадией развития клетка-предшественник, индуцированная плюрипотентная стволовая (ИПСК) клетка или эмбрион на одноклеточной стадии. Такие промоторы могут быть, например, условными промоторами, индуцибельными промоторами, конститутивными промоторами или тканеспецифическими промоторами. Необязательно, промотор может быть двунаправленным промотором, управляющим экспрессией как белка Cas в одном направлении, так и направляющей РНК в другом направлении. Такие двунаправленные промоторы могут состоять из (1) полного обычного однонаправленного промотора Pol III, который содержит 3 внешних элемента регуляции: элемент дистальной последовательности (DSE), элемент проксимальной последовательности (PSE) и блок TATA; и (2) второй основной промотор Pol III, который включает PSE и TATA-бокс, слитый с 5'-концом DSE в обратной ориентации. Например, в промоторе H1 DSE находится рядом с PSE и TATA-боксом, и промотор можно сделать двунаправленным путем создания гибридного промотора, в котором транскрипция в обратном направлении контролируется путем добавления блока PSE и TATA, полученного из промотора U6. См., например, патент США 2016/0074535, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Применение двунаправленного промотора для экспрессии генов, кодирующих белок Cas, и направляющей РНК одновременно позволяет создавать компактные кассеты экспрессии для облегчения доставки.

Для управления экспрессией Cas или Cas9 можно использовать разные промоторы. В некоторых способах используются малые промоторы, чтобы кодирующую последовательность Cas или Cas9 можно было поместить в конструкцию AAV. Примеры таких промоторов включают Efs, SV40 или синтетический промотор, содержащий специфический к печени энхансер (например, E2 из вируса HBV или серпина A из гена серпина A) и коровой промотор (например, синтетический промотор E2P или синтетический промотор серпина AP).

b. Направляющие РНК

Направляющая РНК или нРНК представляет собой молекулу РНК, которая связывается с белком Cas (например, с белком Cas9) и направляет белок Cas в определенное место внутри ДНК-мишени. Направляющие РНК могут включать два сегмента: нацеленный на ДНК сегмент и белок-связывающий

- 29 048264 сегмент. Сегмент включает часть или область молекулы, такую как непрерывный участок нуклеотидов в РНК. Некоторые нРНК, например, для Cas9, могут содержать две отдельные молекулы РНК: РНКактиватор (например, тракрРНК) и РНК-нацеливатель (например, CRISPR-РНК или крРНК). Другие нРНК представляют собой одну молекулу РНК (полинуклеотид с одной РНК), которую также можно назвать одномолекулярной нРНК, одиночной направляющей РНК или онРНК (sgRNA). См., например, WO 2013/176772, WO 2014/065596, WO 2014/089290, WO 2014/093622, WO 2014/099750, WO 2013/142578 и WO 2014/131833, каждая из которых включена в полном объеме в данный документ посредством ссылки для всех целей. Для Cas9, например, единая направляющая РНК может содержать сгРНК, слитую с tracrРНК (например, через линкер). Для Cpf1, например, только сгРНК необходима для достижения связывания последовательности-мишени. Термины направляющая РНК и нРНК включают как двухмолекулярные (то есть модульные) нРНК, так и одномолекулярные нРНК.

Типовая двухмолекулярная нРНК включает сгРНК-подобную (CRISPR-РНК или РНКнацеливатель, или сгРНК или повтор крРНК) молекулу и соответствующую tracrРНК-подобную (транс-активирующую CRISPR-РНК или РНК-активатор или tracrРНК) молекулу. сгРНК содержит как нацеленный на ДНК сегмент (одноцепочечный) нРНК, так и участок нуклеотидов, который формирует половину дуплекса дцРНК из белок-связывающего сегмента нРНК. Пример хвоста крРНК, расположенного ниже (направлении 3'-конца) нацеленнего на ДНК сегмента, включает, по существу состоит из или состоит из GUUUUAGAGCUAUGCU (SEQ ID NO: 51). Любой из описанных в данном документе нацеленных на ДНК сегментов может быть присоединен к 5'-концу SEQ ID NO: 51 с образованием сгРНК.

Соответствующая tгacгРНК (РНК-активатор) содержит участок нуклеотидов, который формирует другую половину дуплекса дцРНК белок-связывающего сегмента нРНК. Участок нуклеотидов сгРНК комплементарен участку нуклеотидов тракрРНК и гибридизуется с участком нуклеотидов tгacгРНК с образованием дуплекса дцРНК белка-связывающего домена нРНК. Таким образом, можно сказать, что каждая сгРНК имеет соответствующую tгacгРНК. Иллюстративные последовательности tгacгРНК содержат, состоят по существу или состоят из AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA CUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU (SEQ ID NO: 52), AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 121), или GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 122).

В системах, в которых необходимы как сгРНК, так и tгacгРНК, сгРНК и соответствующая tгacгРНК гибридизуются с образованием нРНК. В системах, в которых необходима только сгРНК, сгРНК может представлять собой нРНК. сгРНК дополнительно обеспечивает одноцепочечный нацеленный на ДНК сегмент, который гибридизуется с комплементарной цепью ДНК-мишени. Если используется для модификации внутри клетки, точная последовательность данной молекулы сгРНК или tгacгРНК может быть разработана так, чтобы быть специфичной для видов, в которых будут использоваться молекулы РНК. См., например, Mali et al. (2013) Science 339(6121):823-826; Jinek et al. (2012) Science 337(6096):816-821; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(3):227-229; Jiang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(3):233-239; и Cong et al. (2013) Science 339(6121):819-823, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

Нацеленный на ДНК сегмент (сгРНК) данной нРНК содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна последовательности на комплементарной цепи ДНК-мишени, как более подробно описано ниже. Нацеленный на ДНК сегмент нРНК взаимодействует с ДНК-мишенью специфическим для последовательности образом посредством гибридизации (то есть спаривания оснований). По существу, нуклеотидная последовательность нацеленного на ДНК сегмента может варьироваться и определяет локализацию внутри ДНК-мишени, с которой будут взаимодействовать нРНК и ДНК-мишень. Нацеленный на ДНК сегмент заявленной нРНК может быть модифицирован для гибридизации с любой желаемой последовательностью в ДНК-мишени. Встречающиеся в природе сгРНК различаются в зависимости от системы CRISPR/Cas и организма, но часто содержат направляющий сегмент длиной от 21 до 72 нуклеотидов, фланкированный двумя прямыми повторами (ПП, DR) длиной от 21 до 46 нуклеотидов (см., например, WO 2014/131833, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей). В случае S. pyogenes длина ПП составляет 36 нуклеотидов, а длина направляющего сегмента составляет 30 нуклеотидов. 3'-расположенный ПП комплементарен и гибридизуется с соответствующей tгacгРНК, которая, в свою очередь, связывается с белком Cas.

Нацеленный на ДНК сегмент может иметь длину, например, по меньшей мере, около 12, 15, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40 нуклеотидов. Такие нацеленные на ДНК сегменты могут иметь длину, например, от около 12 до около 100, от около 12 до около 80, от около 12 до около 50, от около 12 до около 40, от около 12 до около 30, от около 12 до около 25 или от около 12 до около 20 нуклеотидов. Например, ДНКнаправляющий сегмент может составлять от около 15 до около 25 нуклеотидов (например, от около 17 до около 20 нуклеотидов, или около 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов). См., например, патент США 2016/0024523, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Для Cas9 из S. pyogenes типичный нацеленный на ДНК сегмент имеет длину от 16 до 20 нуклеоти- 30 048264 дов или от 17 до 20 нуклеотидов. Для Cas9 из S. aureus типичный нацеленный на ДНК сегмент имеет длину от 21 до 23 нуклеотидов. Для Cpf1 типичный нацеленный на ДНК сегмент имеет длину по меньшей мере 16 нуклеотидов или по меньшей мере 18 нуклеотидов.

TracrРНК могут быть в любой форме (например, полноразмерные tracrРНК или активные частичные tracrРНК) и различной длины. Они могут включать первичные транскрипты или формы, прошедшие процессинг. Например, tracrРНК (как часть единая направляющей РНК или как отдельная молекула нРНК из двух молекул) могут содержать, состоять по существу из или состоять из всей или части последовательности tracrРНК дикого типа (например, около или более чем около 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 или более нуклеотидов последовательности tracrРНК дикого типа). Примеры последовательностей tracrРНК дикого типа из S. pyogenes включают версии, состоящие из 171 нуклеотида, 89 нуклеотидов, 75 нуклеотидов и 65 нуклеотидов. См., например, Deltcheva et al. (2011) Nature 471 (7340): 602-607; WO 2014/093661, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей. Примеры tracrРНК в одиночных направляющих РНК (онРНК) включают сегменты tracrРНК, обнаруженные в +48, +54, +67 и +85 версиях онРНК, где +n означает, что до +n нуклеотида tracrРНК дикого типа включена в онРНК. См. патент США 8697359, который включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Процент комплементарности между нацеленным на ДНК сегментом направляющей РНК и комплементарной цепью целевой ДНК может составлять по меньшей мере 60% (например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%). Процент комплементарности между нацеленным на ДНК сегментом и комплементарной цепью целевой ДНК может составлять по меньшей мере 60% в отношении около 20 смежных нуклеотидов. Например, процент комплементарности между нацеленным на ДНК сегментом и комплементарной цепью целевой ДНК может составлять 100% в 14 смежных нуклеотидах на 5'-конце комплементарной цепи целевой ДНК и до 0% в оставшихся нуклеотидах. В таком случае можно считать, что нацеленный на ДНК сегмент имеет длину 14 нуклеотидов. В качестве другого примера, процент комплементарности между нацеленным на ДНК сегментом и комплементарной цепью целевой ДНК может составлять 100% в семи смежных нуклеотидах на 5'-конце комплементарной цепи целевой ДНК и составлять 0% в оставшихся нуклеотидах. В таком случае можно считать, что нацеленный на ДНК сегмент имеет длину 7 нуклеотидов. В некоторых направляющих РНК по меньшей мере 17 нуклеотидов в нацеленном на ДНК сегменте комплементарны комплементарной цепи целевой ДНК. Например, нацеленный на ДНК сегмент может иметь длину 20 нуклеотидов и может содержать 1, 2 или 3 несовпадения с комплементарной цепью целевой ДНК. В одном примере несовпадения не примыкают к области комплементарной цепи, соответствующей последовательности мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM) (т.е. обратному комплементу последовательности PAM) (например, несовпадения находятся на 5'-конце нацеленнего на ДНК сегмента направляющей РНК, или несовпадения находятся по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 пар оснований от области комплементарной цепи, соответствующей последовательности PAM).

Белок-связывающий сегмент нРНК может содержать два участка нуклеотидов, комплементарных друг другу. Комплементарные нуклеотиды белок-связывающего сегмента гибридизуются с образованием дуплекса двухцепочечной РНК (дцРНК). Сегмент связывания с белком заявленной нРНК взаимодействует с белком Cas, и нРНК направляет связанный белок Cas к определенной нуклеотидной последовательности в целевой ДНК посредством нацеленнего на ДНК сегмента.

Одиночные направляющие РНК могут содержать нацеленный на ДНК сегмент и каркасную последовательность (т.е. связывающую белок или Cas-связывающую последовательность направляющей РНК). Например, такие направляющие РНК могут иметь 5'-нацеленный на ДНК сегмент, соединенную с 3'-каркасной последовательностью. Иллюстративные каркасные последовательности включают, по существу или состоят из: GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA CUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU (версия 1; SEQ ID NO: 53); GUUGGAACCAUUCAAAAC AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG C (версия 2; SEQ ID NO: 54); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC GUUAUCAACUUGAAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (версия 3; SEQ ID NO: 55); GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUG AAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (версия 4; SEQ ID NO: 56); и GUUUUAGAGCUAGAAAU AGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU UUU (версия 5; SEQ ID NO: 57); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (версия 6; SEQ ID NO: 123); или GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA AAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (версия 7; SEQ ID NO: 124). Направляющие РНК, нацеленные на любую из описанных в данном документе последовательностей-мишеней направляющих РНК, могут включать, например, нацеленный на ДНК сегмент на 5'-конце направляющей РНК, слитый с любой из иллюстративных каркасных последовательностей направляющей РНК на 3'-конце направляющей

- 31 048264

РНК. То есть любой из описанных в данном документе нацеленных на ДНК сегментов может быть присоединен к 5'-концу любой из указанных выше каркасных последовательностей с образованием одиночной направляющей РНК (химерной направляющей РНК).

Направляющие РНК могут включать модификации или последовательности, которые обеспечивают дополнительные желательные свойства (например, модифицированную или регулируемую стабильность; субклеточное нацеливание; отслеживание с помощью флуоресцентной метки; сайт связывания для белка или белкового комплекса и т.п.). Примеры таких модификаций включают, например, 5'-кэп (например, 7метилгуанилатный кэп (m7G)); 3'-полиаденилированный хвост (т.е. 3'-поли(А) хвост); последовательность рибопереключателя (например, для обеспечения регулируемой стабильности и/или регулируемой доступности для белков и/или белковых комплексов); последовательность контроля устойчивости; последовательность, которая образует дуплекс дцРНК (т.е. шпильку); модификацию или последовательность, которая направляет РНК в субклеточную локализацию (например, ядро, митохондрии, хлоропласты и тому подобное); модификацию или последовательность, которая обеспечивает отслеживание (например, прямая конъюгация с флуоресцентной молекулой, конъюгация с фрагментом, который облегчает флуоресцентное детектирование, последовательность, которая позволяет проводить флуоресцентное детектирование и тому подобное); модификацию или последовательность, которая обеспечивает формирование сайта связывания для белков (например, белков, которые действуют на ДНК, включая активаторы транскрипции, репрессоры транскрипции, ДНК-метилтрансферазы, ДНК-деметилазы, гистоновые ацетилтрансферазы, гистоновые деацетилазы и тому подобное); и их комбинации. Другие примеры модификаций включают сконструированные дуплексные структуры петля на стебле, сконструированные области петель, сконструированные шпильки на 3' конце дуплексной структуры петля на стержне или любую их комбинацию. См., например, US 2015/0376586, полностью включенный в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Петля может представлять собой неспаренную областью нуклеотидов внутри дуплекса, состоящую из стРНК-подобной области и минимальной тракрРНКподобной области. Петля может содержать на одной стороне дуплекса неспаренный 5'-XXXY-3', где X представляет собой любой пурин, а Y может представлять собой нуклеотид, который может формировать неоднозначную пару с нуклеотидом на противоположной цепи, и регион неспаренных нуклеотидов на другой стороне дуплекса.

Немодифицированные нуклеиновые кислоты могут быть подвержены деградации. Экзогенные нуклеиновые кислоты также могут вызывать врожденный иммунный ответ. Модификации могут способствовать повышению стабильности и снижению иммуногенности. Направляющие РНК могут содержать модифицированные нуклеозиды и модифицированные нуклеотиды, включая, например, одно или более из следующего: (1) изменение или замена одного или обоих несвязанных фосфатных атомов кислорода и/или одного или более связывающих фосфатных атомов кислорода в связи фосфодиэфирного остова; (2) изменение или замена компонента сахара рибозы, такая как изменение или замена 2'-гидроксила в сахаре рибозе; (3) замена фосфатной части дефосфорилированными линкерами; (4) модификация или замена встречающегося в природе азотистого основания; (5) замена или модификация рибозо-фосфатного остова; (6) модификация 3'-конца или 5'-конца олигонуклеотида (например, удаление, модификация или замена концевой фосфатной группы или конъюгация фрагмента); и (7) модификация сахара. Другие возможные модификации направляющей РНК включают модификации или замену урацилов или полиурациловых трактов. См., например, WO 2015/048577 и патент США 2016/0237455, каждый из которых полностью включен в полном объеме в данный документ посредством ссылки для всех целей. Аналогичные модификации могут быть внесены в нуклеиновые кислоты, кодирующие Cas, такие как мРНК Cas. Например, мРНК Cas могут быть изменены за счет истощения уридина с использованием синонимичных кодонов.

В качестве одного примера, нуклеотиды на 5'- или 3'-конце направляющей РНК могут содержать фосфоротиоатные связи (например, основания могут содержать модифицированную фосфатную группу, которая представляет собой фосфоротиоатную группу). Например, направляющая РНК может содержать фосфоротиоатные связи между 2, 3 или 4 концевыми нуклеотидами на 5'- или 3'-конце направляющей РНК. В качестве другого примера, нуклеотиды на 5'- и/или 3'-конце направляющей РНК могут содержать 2'-O-метильные модификации. Например, направляющая РНК может содержать 2'-O-метильные модификации в 2, 3 или 4 концевых нуклеотидах на 5'- и/или 3'-конце направляющей РНК (например, на 5'конце). См., например, WO 2017/173054 A1 и Finn et al. (2018) Cell Rep. 22 ( 9): 2227-2235, каждая из которых включена в полном объеме в данный документ посредством ссылки для всех целей. В одном конкретном примере направляющая РНК содержит 2'-O-метильные аналоги и 3'-фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в первых трех 5'- и 3'-концевых остатках РНК. В другом конкретном примере направляющая РНК модифицируется таким образом, что все группы 2'OH, которые не взаимодействуют с белком Cas9, заменяются 2'-O-метиловыми аналогами, а хвостовая часть направляющей РНК, которая характеризуется минимальным взаимодействием с белком Cas9, модифицирована с помощью 5'- и 3'фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. Кроме того, нацеленный на ДНК сегмент также имеет модификации 2'-фтор на некоторых основаниях. См., например, Yin et al. (2017) Nat. Biotech. 35(12):11791187, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Другие

- 32 048264 примеры модифицированных направляющих РНК представлены, например, в WO 2018/107028 A1, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Такие химические модификации могут, например, обеспечивать большую стабильность и защиту от экзонуклеаз для направляющих РНК, позволяя им сохраняться в клетках дольше, чем немодифицированные направляющие РНК. Такие химические модификации могут также, например, защищать от врожденных внутриклеточных иммунных ответов, которые могут активно разрушать РНК или запускать иммунные каскады, ведущие к гибели клеток.

Направляющие РНК могут быть представлены в любой форме. Например, нРНК может быть представлена в форме РНК, либо в виде двух молекул (отдельные сгРНК и tracrРНК), либо в виде одной молекулы (онРНК), и необязательно в форме комплекса с белком Cas. нРНК также может быть представлена в форме ДНК, кодирующей нРНК. ДНК, кодирующая нРНК, может кодировать одну молекулу РНК (онРНК) или отдельные молекулы РНК (например, отдельные сгРНК и tracrРНК). В последнем случае ДНК, кодирующая нРНК, может быть представлена в виде одной молекулы ДНК или в виде отдельных молекул ДНК, кодирующих сгРНК и tracrРНК, соответственно.

Когда нРНК представляют в форме ДНК, нРНК может транзиентно, условно или конститутивно экспрессироваться в клетке. ДНК, кодирующие нРНК, могут быть стабильно интегрированы в геном клетки и функционально связаны с активным в клетке промотором. Альтернативно, ДНК, кодирующие нРНК, могут быть функционально связаны с промотором в конструкции экспрессии. Например, ДНК, кодирующая нРНК, может находиться в векторе, содержащем гетерологичную нуклеиновую кислоту, такую как нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas. Альтернативно, он может находиться в векторе или плазмиде, отдельном от вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas. Промоторы, которые можно использовать в таких конструкциях экспрессии, включают промоторы, активные, например, в одной или более из следующего: эукариотическая клетка, человеческая клетка, клетка отличного от человека животного, клетка млекопитающего, клетка отличного от человека млекопитающего, клетка грызунов, клетка мыши, клетка крысы, плюрипотентная клетка, эмбриональная стволовая (ЭС) клетка, взрослая стволовая клетка, ограниченная стадией развития клетка-предшественник, индуцированная плюрипотентная стволовая (ИПСК) клетка или эмбрион на одноклеточной стадии. Такие промоторы могут быть, например, условными промоторами, индуцибельными промоторами, конститутивными промоторами или тканеспецифическими промоторами. Такие промоторы также могут быть, например, двунаправленными промоторами. Конкретные примеры подходящих промоторов включают: промотор РНК-полимеразы III, такой как промотор U6 человека, промотор полимеразы III U6 крысы или промотор полимеразы III U6 мыши. В другом примере для управления экспрессией направляющей РНК можно использовать малую тРНК Gln.

Альтернативно, нРНК могут быть получены различными другими методами. Например, нРНК могут быть получены путем транскрипции in vitro с использованием, например, РНК-полимеразы T7 (см., например, WO 2014/089290 и WO 2014/065596, каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей). Направляющие РНК также могут быть синтетически полученной молекулой, полученной путем химического синтеза. Например, направляющая РНК может быть химически синтезирована таким образом, чтобы содержать 2'-O-метильные аналоги и 3'фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в первых трех 5'- и 3'-концевых остатках РНК.

Направляющие РНК (или нуклеиновые кислоты, кодирующие направляющие РНК) могут находиться в композициях, содержащих одну или более направляющих РНК (например, 1, 2, 3, 4 или более направляющих РНК) и носитель, увеличивающий стабильность направляющей РНК (например, при заданных условиях продлевающий период хранения (например, -20°C, 4°C или температура окружающей среды), в течение которого продукты деградации остаются ниже порогового значения, например, ниже 0,5% от массы исходной нуклеиновой кислоты или белка; или повышающий стабильность in vivo). Неограничивающие примеры таких носителей включают микросферы из поли(молочной кислоты) (PLA), микросферы из поли(D, L-молочной-ко-гликолевой кислоты) (PLGA), липосомы, мицеллы, инверсные мицеллы, липидные кохлеаты и липидные микротрубочки. Такие композиции могут дополнительно содержать белок Cas, такой как белок Cas9, или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas.

с. Последовательности-мишени направляющей РНК

ДНК-мишени для направляющих РНК включают последовательности нуклеиновых кислот, присутствующие в ДНК, с которыми будет связываться нацеленный на ДНК сегмент нРНК, при условии, что обеспечены достаточные условия для связывания. Подходящие условия связывания ДНК/РНК включают физиологические условия, обычно присутствующие в клетке. Другие подходящие условия связывания ДНК/РНК (например, условия в бесклеточной системе) известны в данной области (см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001), которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей). Цепь ДНК-мишени, которая комплементарна и гибридизуется с нРНК, может быть названа комплементарной цепью, а цепь целевой ДНК, которая комплементарна комплементарной цепи (и, следовательно, не комплементарна белку Cas или нРНК) может быть названа некомплементарной цепью или цепью-матрицей.

ДНК-мишень содержит как последовательность на комплементарной цепи, с которой гибридизует

- 33 048264 ся направляющая РНК, так и соответствующую последовательность на некомплементарной цепи (например, смежную с мотивом, примыкающим к протоспейсеру (PAM)). Если не указано иное, используемый в данном документе термин последовательность-мишень направляющей РНК относится конкретно к последовательности на некомплементарной цепи (т.е. обратному комплементу), соответствующей последовательности, с которой гибридизуется направляющая РНК на комплементарной цепи. То есть последовательность-мишень направляющей РНК относится к последовательности на некомплементарной цепи, смежной с PAM (например, до или на 5'-конце относительно PAM в случае Cas9). Последовательность-мишень направляющей РНК эквивалентна ДНК-направляющему сегменту направляющей РНК, но содержит тимины вместо урацилов. В качестве одного примера, последовательность-мишень направляющей РНК для фермента SpCas9 может относиться к последовательности до 5'-NGG-3' PAM на некомплементарной цепи. Направляющая РНК разработана таким образом, чтобы быть комплементарной к комплементарной цепи ДНК-мишени, при этом гибридизация между ДНК-направляющим сегментом направляющей РНК и комплементарной цепью ДНК-мишени способствует образованию комплекса CRISPR. Полная комплементарность не обязательно требуется при условии, что комплементарность достаточна, чтобы вызвать гибридизацию и способствовать образованию комплекса CRISPR. Если направляющая РНК упоминается в данном документе как нацеленная на последовательность-мишень направляющей РНК, это означает, что направляющая РНК гибридизируется с последовательностью комплементарной цепи ДНК-мишени, которая представляет собой обратный комплемент последовательностимишени направляющей РНК на некомплементарной цепи.

Последовательность-мишень ДНК-мишени или направляющей РНК может содержать любой полинуклеотид и может располагаться, например, в ядре или цитоплазме клетки или в органелле клетки, такой как митохондрия или хлоропласт. Последовательность-мишень ДНК-мишени или направляющей РНК может представлять собой любую последовательность нуклеиновой кислоты, эндогенной или экзогенной для клетки. Последовательность-мишень направляющей РНК может представлять собой последовательность, кодирующую продукт гена (например, белок), или некодирующую последовательность (например, регуляторную последовательность), или может содержать и то, и другое.

Сайт-специфическое связывание и расщепление ДНК-мишени белком Cas может происходить в местах, определяемых как (i) комплементарностью спаривания оснований между направляющей РНК и комплементарной цепью ДНК-мишени, так и (ii) коротким мотивом, называемым мотивом, примыкающим к протоспейсеру (PAM) в некомплементарной цепи ДНК-мишени. PAM может фланкировать последовательность-мишень направляющей РНК. Необязательно, последовательность-мишень направляющей РНК может быть фланкирована на 3'-конце с помощью PAM (например, в случае Cas9). Альтернативно, последовательность-мишень направляющей РНК может быть фланкирована на 5'-конце с помощью PAM (например, в случае Cpf1). Например, сайт расщепления белков Cas может составлять от примерно 1 до примерно 10 или от примерно 2 до примерно 5 пар оснований (например, 3 пары оснований) выше или ниже последовательности PAM (например, в пределах целевой последовательности направляющей РНК). В случае SpCas9 последовательность PAM (то есть на некомплементарной цепи) может представлять собой 5'-N₁GG-3', где N₁ представлять собой любой нуклеотид ДНК, а PAM находится непосредственно на 3' конце последовательности-мишени направляющей РНК на некомплементарной цепи ДНК-мишени. Таким образом, последовательность, соответствующая РАМ на комплементарной цепи (т.е., обратный комплемент) будет представлять собой 5'-CCN₂-3', где N₂ представляет собой любой ДНК нуклеотид и располагается сразу на 5' конце последовательности, с которой ДНК-направляющий сегмент направляющей РНК гибридизуется на комплементарной цепи ДНК-мишени. В некоторых таких случаях N1 и N2 могут быть комплементарны, и пара оснований N₁-N₂ может представлять собой любую пару оснований (например, N1=C и N2=G; N1=G и N2=C; N1=A и N2=T; или N1=T, и N₂=A). В случае Cas9 из S. aureus, PAM может представлять собой NNGRRT или NNGRR, где N может представлять собой A, G, C или T, а R может представлять собой G или A. В случае Cas9 из C. jejuni , PAM может представлять собой, например, NNNNACAC или NNNNRYAC, где N может представлять собой A, G, C или T, а R может представлять собой G или A. В некоторых случаях (например, в случае FnCpf1) последовательность PAM может располагаться до 5'-конца и иметь последовательность 5'-TTN-3'.

Примером последовательности-мишени направляющей РНК является последовательность ДНК из 20 нуклеотидов, непосредственно предшествующая мотиву NGG, распознаваемому белком SpCas9. Например, два примера последовательностей-мишеней направляющей РНК плюс PAM представляют собой GN₁₉NGG (SEQ ID NO: 58) или N20NGG (SEQ ID NO: 59). См., например, WO 2014/165825, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Гуанин на 5'-конце может способствовать транскрипции РНК-полимеразой в клетках. Другие примеры последовательностей-мишеней направляющих РНК плюс PAM могут содержать два гуаниновых нуклеотида на 5'-конце (например, GGN20NGG; SEQ ID NO: 60) для облегчения эффективной транскрипции полимеразой Т7 in vitro. См., например, WO 2014/065596, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Другие последовательности-мишени направляющей РНК плюс PAM могут иметь длину от 4 до 22 нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 58-60, включая 5' G или GG и 3' GG или NGG. Другие последовательности-мишени направляющей РНК плюс PAM могут иметь длину от 14

- 34 048264 до 20 нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 58-60.

Направляющие РНК, нацеленные на ген альбумина, могут быть нацелены, например, на первый интрон гена альбумина или последовательность, примыкающую к первому интрону гена альбумина (например, в первом экзоне или втором экзоне гена альбумина.

Образование комплекса CRISPR, гибридизованного с ДНК-мишенью, может приводить к расщеплению одной или обеих цепей целевой ДНК внутри или вблизи области, соответствующей последовательности-мишени направляющей РНК (т.е. последовательности-мишени направляющей РНК на некомплементарной цепи ДНК-мишени и обратному комплементу на комплементарной цепи, с которой гибридизуется направляющая РНК). Например, сайт расщепления может располагаться в последовательностимишени направляющей РНК (например, в определенном месте относительно последовательности PAM). Сайт расщепления включает позицию целевой ДНК, в которой белок Cas вызывает одноцепочечный разрыв или двухцепочечный разрыв. Сайт расщепления может располагаться только на одной цепи (например, в случае, когда используется никаза) или на обеих цепях двухцепочечной ДНК. Сайты расщепления могут находиться в одном и том же положении на обеих цепях (образуя тупые концы; например, в случае Cas9)) или могут находиться в разных сайтах на каждой цепи (создавая липкие концы (например, выступы); например, в случае Cpf1). Липкие концы могут быть получены, например, с использованием двух белков Cas, каждый из которых вызывает одноцепочечный разрыв в отличающемся сайте расщепления на другой цепи, тем самым приводя к образованию двухцепочечного разрыва. Например, первая никаза может создавать одноцепочечный разрыв на первой цепи двухцепочечной ДНК (дцДНК), а вторая никаза может создавать одноцепочечный разрыв на второй цепи дцДНК, формируя таким образом выступающие последовательности. В некоторых случаях последовательность-мишень направляющей РНК или сайт расщепления никазы на первой цепи отделены от последовательности-мишени направляющей РНК или сайта расщепления никазы на второй цепи по меньшей мере на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 10о, 250, 500 или 1000 пар оснований.

2. Другие нуклеазные агенты и последовательности-мишени для нуклеазных агентов

Любой нуклеазный агент, который вызывает одноцепочечный или двухцепочечный разрыв в желаемой последовательности-мишени, можно использовать в способах и композициях, описанных в данном документе. Можно использовать встречающийся в природе или нативный нуклеазный агент при условии, что нуклеазный агент вызывает одноцепочечный или двухцепочечный разрыв в желаемой последовательности-мишени. В качестве альтернативы можно использовать модифицированный или сконструированный нуклеазный агент. Сконструированный нуклеазный агент включает нуклеазу, которая сконструирована (модифицирована или получена) из ее нативной формы, чтобы специфически распознавать и индуцировать одноцепочечный или двухцепочечный разрыв в желаемой последовательностимишени. Таким образом, сконструированный нуклеазный агент может быть получен из нативного природного нуклеазного агента или может быть создан или синтезирован искусственно. Сконструированная нуклеаза может вызывать одноцепочный или двухцепочечный разрыв в последовательности-мишени, например, при этом последовательность-мишень не является последовательностью, которая была бы распознана нативным (несконструированным или немодифицированным) нуклеазным агентом. Модификация нуклеазного агента может представлять собой изменение всего одной аминокислоты в белке расщепляющего агента или одного нуклеотида в нуклеиновой кислоте расщепляющего агента. Получение одноцепочечного или двухцепочечного разрыва в последовательности-мишени или другой ДНК может быть обозначено в данном документе как разрезание или расщепление последовательности-мишени или другой ДНК.

Также представлены активные варианты и фрагменты приведенных в качестве примеров последовательностей-мишеней. Такие активные варианты могут иметь, по меньшей мере, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с данной последовательностью-мишенью, при этом активные варианты сохраняют биологическую активность и, следовательно, способны распознаваться и расщепляться нуклеазным агентом специфичным для последовательности образом. Способы измерения двухцепочечного разрыва последовательностимишени нуклеазным агентом известны в данной области техники (например, анализ методом кПЦР TaqMan®, Frendewey et al. (2010) Methods in Enzymology 476:295-307, который полностью включен в данный документ посредством ссылки для всех целей).

Последовательность-мишень нуклеазного агента может располагаться в любом месте или рядом с целевым локусом. Последовательность-мишень может находиться в кодирующей области гена или в регуляторных областях, которые влияют на экспрессию гена. Последовательность-мишень нуклеазного агента может быть расположена в интроне, экзоне, промоторе, энхансере, регуляторной области или любой небелковой кодирующей области. Альтернативно, последовательность-мишень может быть расположена внутри полинуклеотида, кодирующего селективного маркера. Такое положение может быть находиться в кодирующей области селективного маркера или внутри регуляторных областей, которые влияют на экспрессию селективного маркера. Таким образом, последовательность-мишень нуклеазного агента может быть расположена в интроне селективного маркера, промоторе, энхансере, регуляторной области или любой не кодирующей белок области полинуклеотида, кодирующей селективный маркер.

- 35 048264

Разрыв или двухцепочечный разрыв в последовательности-мишени может нарушить активность селективного маркера, и известны методы анализа присутствия или отсутствия маркера функциональной селекции.

Одним из типов нуклеазных агентов является эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции (TALEN). Эффекторные нуклеазы TAL представляют собой класс последовательностьспецифичных нуклеаз, которые можно использовать для создания двухцепочечных разрывов определенных целевых последовательностей в геноме прокариотического или эукариотического организма. Эффекторные нуклеазы TAL создаются путем слияния природного или сконструированного эффектора, подобного активатору транскрипции (TAL), или его функциональной части, с каталитическим доменом эндонуклеазы, такой как, например, FokI. Уникальный модульный эффекторный ДНК-связывающий домен TAL позволяет создавать белки с потенциально любой заданной специфичностью распознавания ДНК. Таким образом, ДНК-связывающие домены эффекторных нуклеаз TAL могут быть сконструированы для распознавания специфических сайтов-мишеней ДНК и, таким образом, использованы для создания двухцепочечных разрывов в желаемых последовательностях-мишенях. См. WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107(50):21617-21622; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nucleic Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; and Miller et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:143-148, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

Примеры подходящих нуклеаз TAL и способы получения подходящих нуклеаз TAL раскрыты, например, в патенте US 2011/0239315 A1, US 2011/0269234 A1, US 2011/0145940 A1, US 2003/0232410 A1, US 2005/0208489 A1, US 2005/0026157 A1, US 2005/0064474 A1, US 2006/0188987 A1, и US 2006/0063231 A1, каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. В различных вариантах осуществления эффекторные нуклеазы TAL сконструированы таким образом, что они разрезают последовательность нуклеиновой кислоты-мишени или рядом с ней, например, в представляющем интерес локусе или представляющем интерес геномном локусе, причем последовательность-мишень нуклеиновой кислоты находится в или рядом с последовательностью, которая должна быть модифицирована посредством нацеливающего вектора. TAL-нуклеазы, подходящие для использования с различными способами и композициями, представленными в данном документе, включают те, которые специально разработаны для связывания с последовательностями нуклеиновых кислот-мишеней или рядом с ними, которые должны быть модифицированы нацеливающими векторами, как описано в данном документе.

В некоторых TALEN каждый мономер TALEN содержит 33-35 повторов TAL, которые распознают одну пару оснований через два гипервариабельных остатка. В некоторых TALEN нуклеазный агент представляет собой химерный белок, содержащий ДНК-связывающий домен на основе TAL-повтора, функционально связанный с независимой нуклеазой, такой как эндонуклеаза FokI. Например, нуклеазный агент может содержать ДНК-связывающий домен на основе первого TAL-повтора и второй ДНКсвязывающий домен на основе TAL-повтора, при этом каждый из первого и второго ДНК-связывающих доменов на основе TAL-повторов функционально связан с нуклеазой FokI, при этом первый и второй ДНК-связывающий домен на основе TAL-повтора распознает две смежные последовательности ДНКмишени в каждой цепи последовательности ДНК-мишени, разделенных спейсерной последовательностью различной длины (12-20 п.н.), и при этом субъединицы нуклеазы FokI димеризуются с образованием активной нуклеазы, которая делает двойной разрыв в последовательности-мишени.

Нуклеазный агент, используемый в различных раскрытых в данном документе способах и композициях, может дополнительно включать нуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN). В некоторых ZFN каждый мономер ZFN содержит 3 или более ДНК-связывающих домена с цинковыми пальцами, при этом каждый ДНК-связывающий домен с цинковыми пальцами связывается с субсайтом из 3 п.н. В других ZFN, ZFN представляет собой химерный белок, содержащий ДНК-связывающий домен с цинковыми пальцами, функционально связанный с независимой нуклеазой, такой как эндонуклеаза FokI. Например, нуклеазный агент может содержать первый ZFN и второй ZFN, при этом каждый из первого ZFN и второго ZFN функционально связан с субъединицей нуклеазы FokI, при этом первый и второй ZFN распознают две смежные последовательности ДНК-мишени в каждой цепи последовательности ДНК-мишени, разделенные спейсером около 5-7 п.н., и при этом субъединицы нуклеазы FokI димеризуются с образованием активной нуклеазы, которая делает двухцепочечный разрыв. См., например, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; WO/2011/017293A2; и Gaj et al. (2013) Trends Biotechnol., 31(7):397-405, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей.

Также представлены активные варианты и фрагменты нуклеазных агентов (т.е. сконструированные нуклеазные агенты). Такие активные варианты могут иметь, по меньшей мере, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с нативным нуклеазным агентом, при этом активные варианты сохраняют способность разрезать желаемую последовательность-мишень и, следовательно, сохраняют активность, индуцирующую одноцепочечный или двухцепочечный разрыв. Например, любой из описанных в данном документе нуклеазных агентов

- 36 048264 может быть модифицирован из последовательности нативной эндонуклеазы и разработан для распознавания и индуцирования одноцепочечных или двухцепочечных разрывов в последовательности-мишени, которая не распознается нативным нуклеазным агентом. Таким образом, некоторые сконструированные нуклеазы обладают специфичностью, индуцирующей одноцепочечный или двухцепочечный разрыв в последовательности-мишени, которая отличается от соответствующей последовательности-мишени нативного нуклеазного агента. Анализы на активность, индуцирующую разрыв или двухцепочечный разрыв, известны и обычно измеряют общую активность и специфичность эндонуклеазы на субстратах ДНК, содержащих целевую последовательность.

Нуклеазный агент может быть введен в клетку любыми способами, известными в данной области техники. Полипептид, кодирующий нуклеазный агент, может быть непосредственно введен в клетку. Альтернативно, в клетку можно ввести полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент. Когда полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент, вводят в клетку, нуклеазный агент может транзиенто, условно или конститутивно экспрессироваться внутри клетки. Таким образом, полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент, может содержаться в кассете экспрессии и быть функционально связан с условным промотором, индуцибельным промотором, конститутивным промотором или тканеспецифическим промотором. Такие представляющие интерес промоторы более подробно обсуждаются в другом месте в данном документе. В качестве альтернативы, нуклеазный агент вводят в клетку в виде мРНК, кодирующей нуклеазный агент.

Полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент, может быть стабильно интегрирован в геном клетки и функционально связан с активным в клетке промотором. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент, может находиться в нацеливающем векторе (например, нацеливающем векторе, содержащем полинуклеотид вставки, или в векторе или плазмиде, которые являются отдельными от нацеливающего вектора, содержащего полинуклеотид вставки).

Когда нуклеазный агент вводят в клетку посредством внесения полинуклеотида, кодирующего нуклеазный агент, такой полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент, может быть модифицирован для замены кодонов, имеющих более высокую частоту использования в представляющей интерес клетке, по сравнению с встречающейся в природе полинуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазный агент. Например, полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент, может быть модифицирован для замены кодонов, имеющих более высокую частоту использования в данной представляющей интерес прокариотической или эукариотической клетке, включая бактериальную клетку, дрожжевую клетку, человеческую клетку, клетку отличного от человека животного, клетку млекопитающего, клетку грызуна, клетку мыши, клетку крысы или любую другую представляющую интерес клетку-хозяина по сравнению с встречающейся в природе полинуклеотидной последовательностью.

Термин последовательность-мишень для нуклеазного агента включает последовательность ДНК, в которой нуклеазный агент индуцирует разрыв или двухцепочечный разрыв. Последовательностьмишень для нуклеазного агента может быть эндогенной (или нативной) по отношению к клетке, или последовательность-мишень может быть экзогенной по отношению к клетке. Последовательность-мишень, экзогенная по отношению к клетке, в природе не встречается в геноме клетки. Последовательностьмишень также может быть экзогенной по отношению к представляющим интерес полинуклеотидам, которые желательно расположить в локусе-мишени. В некоторых случаях последовательность-мишень присутствует только в виде одной копии в геноме клетки-хозяина.

Длина последовательности-мишени может варьироваться и включает, например, последовательности-мишени, которые составляют около 30-36 п.н. для пары нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN) (т.е. около 15-18 п.н. для каждой ZFN), около 36 п.н. для эффекторной нуклеазой, подобной активатору транскрипции (TALEN), или около 20 п.н. для направляющей РНК CRISPR/Cas9.

В. Экзогенные донорные нуклеиновые кислоты и последовательности, кодирующие антигенсвязывающий белок

1. Экзогенные донорные нуклеиновые кислоты

В описанных в данном документе способах и композициях используются экзогенные донорные нуклеиновые кислоты для модификации геномного локуса-мишени (например, геномного локуса или локуса безопасная гавань) после расщепления геномного локуса-мишени нуклеазным агентом, таким как белок Cas.

В таких способах белок Cas расщепляет геномный локус-мишень, создавая одноцепочечный разрыв (ник) или двухцепочечный разрыв, а расщепленный или разрезанный локус репарируется экзогенной донорной нуклеиновой кислотой посредством опосредованного негомологичным соединением концов (NHEJ) лигирования или направляемой гомологией репарации. Необязательно, репарация экзогенной донорной нуклеиновой кислотой удаляет или разрушает последовательность-мишень нуклеазы, так что аллели, которые были нацелены, не могли быть повторно нацелены нуклеазным агентом.

Экзогенная донорная нуклеиновая кислота может нацеливаться на любую последовательность в геномном локусе или локусе безопасная гавань, таком как локус альбумина. Некоторые экзогенные донорные нуклеиновые кислоты включают плечи гомологии. Другие экзогенные донорные нуклеиновые кислоты не включают плечи гомологии. Экзогенные донорные нуклеиновые кислоты могут быть спо

- 37 048264 собны вставляться в геномный локус или локус безопасная гавань посредством направляемой гомологией репарации, и/или они могут быть способны вставляться в геномный локус или локус безопасная гавань посредством негомологичного соединения концов. В одном примере экзогенная донорная нуклеиновая кислота (например, нацеливающий вектор) может нацеливаться на интрон 1, интрон 12 или интрон 13 локуса альбумина. Например, экзогенная донорная нуклеиновая кислота может нацеливаться на интрон 1 гена альбумина.

Экзогенные донорные нуклеиновые кислоты могут включать дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК), они могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, и они могут иметь линейную или кольцевую форму. Например, экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть одноцепочечным олигодезоксинуклеотидом (оцОДН). См., например, Yoshimi et al. (2016) Nat. Commun. 7:10431, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Экзогенные донорные нуклеиновые кислоты могут быть голыми нуклеиновыми кислотами или могут доставляться вирусами, такими как AAV. В конкретном примере экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть доставлена посредством AAV и может быть способной вставляться в геномный локус или локус безопасная гавань посредством негомологичного соединения концов (например, экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть такой, которая не содержит плечи гомологии).

Иллюстративная экзогенная донорная нуклеиновая кислота имеет длину от около 50 нуклеотидов до около 5 т.п.н. или от около 50 нуклеотидов до около 3 т.п.н. Альтернативно, экзогенная донорная нуклеиновая кислота может иметь длину от около 1 т.п.н. до около 1,5 т.п.н., от около 1,5 т.п.н. до около 2 т.п.н., от около 2 т.п.н. до около 2,5 т.п.н., от около 2,5 т.п.н. до около 3 т.п.н., от около 3 т.п.н. до около 3,5 т.п.н. от около 3,5 т.п.н. до около 4 т.п.н., от около 4 т.п.н. до около 4,5 т.п.н. или от около 4,5 т.п.н. до около 5 т.п.н. Альтернативно, экзогенная донорная нуклеиновая кислота может иметь, например, длину не более 5 т.п.н., 4,5 т.п.н., 4 т.п.н., 3,5 т.п.н., 3 т.п.н. или 2,5 т.п.н.

В одном примере экзогенная донорная нуклеиновая кислота представляет собой оцОДН, длина которого составляет от около 80 нуклеотидов до около 3 т.п.н. Такой оцОДН может иметь плечи гомологии или короткие одноцепочечные области на 5'-конце и/или 3'-конце, которые комплементарны одному или более выступам, созданным опосредованным нуклеазным агентом расщеплением в геномном локусемишени, например, каждый из которых имеет длину от около 40 нуклеотидов до около 60 нуклеотидов. Такой оцОДН также может иметь плечи гомологии или комплементарные области, например, каждая из которых имеет длину от около 30 нуклеотидов до 100 нуклеотидов. Плечи гомологии или комплементарные области могут быть симметричными (например, каждые 40 нуклеотидов или каждые 60 нуклеотидов в длину) или они могут быть асимметричными (например, одно плечо гомологии или комплементарная область длиной 36 нуклеотидов и одно плечо гомологии или комплементарная область 91 нуклеотид в длину).

Экзогенные донорные нуклеиновые кислоты могут включать модификации или последовательности, которые обеспечивают дополнительные желательные свойства (например, модифицированную или регулируемую стабильность; отслеживание или обнаружение с помощью флуоресцентной метки; сайт связывания для белка или белкового комплекса и так далее). Экзогенные донорные нуклеиновые кислоты могут содержать одну или более флуоресцентных меток, меток очистки, эпитопных меток или их комбинации. Например, экзогенная донорная нуклеиновая кислота может содержать одну или более флуоресцентных меток (например, флуоресцентные белки или другие флуорофоры или красители), такие как по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 флуоресцентных меток. Примеры флуоресцентных меток включают флуорофоры, такие как флуоресцеин (например, 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM)), Texas Red, HEX, Cy3, Cy5, Cy5.5, Pacific Blue, 5-(и6)-карбокситетраметилродамин (TAMRA) и Cy7. Для мечения олигонуклеотидов коммерчески доступен широкий спектр флуоресцентных красителей (например, от Integrated DNA Technologies). Такие флуоресцентные метки (например, внутренние флуоресцентные метки) можно использовать, например, для обнаружения экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, которая была непосредственно интегрирована в расщепленную нуклеиновую кислоту-мишень, имеющую выступающие концы, совместимые с концами экзогенной донорной нуклеиновой кислоты. Маркер или метка может находиться на 5'-конце, 3'конце или внутри экзогенной донорной нуклеиновой кислоты. Например, экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть конъюгирована на 5'-конце с флуорофором IR700 от Integrated DNA Technologies (5'IRDYE®700).

Раскрытые в данном документе экзогенные донорные нуклеиновые кислоты также содержат вставки нуклеиновых кислот, включая сегменты ДНК, которые должны быть интегрированы в геномные локусы-мишени (т.е. кодирующие последовательности для антигенсвязывающих белков). Интеграция вставки нуклеиновой кислоты в геномный локус-мишень может привести к добавлению представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты в геномный локус-мишень или замене представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты в геномном локусе-мишени (т.е. делеция и вставка). Некоторые экзогенные донорные нуклеиновые кислоты предназначены для встраивания вставки нуклеиновой кислоты в геномный локус-мишень без какой-либо соответствующей делеции в геномном локусе-мишени. Другие экзогенные донорные нуклеиновые кислоты предназначены для удаления пред- 38 048264 ставляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты в геномном локусе-мишени и замены ее вставкой нуклеиновой кислоты.

Вставка нуклеиновой кислоты или соответствующая нуклеиновая кислота в удаляемом и/или заменяемом геномном локусе-мишени может иметь различную длину. Иллюстративная вставка нуклеиновой кислоты или соответствующая нуклеиновая кислота в геномном локусе-мишени, который удаляется и/или заменяется, имеет длину от около 1 нуклеотида до около 5 т.п.н. или от около 1 нуклеотида до около 3 т.п.н. нуклеотидов в длину. Например, вставка нуклеиновой кислоты или соответствующая нуклеиновая кислота в геномном локусе-мишени, который удаляется и/или заменяется, может иметь длину в диапазоне от около 1 до около 100, от около 100 до около 200, от около 200 до около 300, от около 300 до около 400, от около 400 до около 500, от около 500 до около 600, от около 600 до около 700, от около 700 до около 800, от около 800 до около 900 или от около 900 до около 1000 нуклеотидов. Аналогичным образом, вставка нуклеиновой кислоты или соответствующая нуклеиновая кислота в геномном локусемишени, который удаляется и/или заменяется, может иметь длину от около 1 до около 1,5 т.п.н., от около 1,5 т.п.н. до около 2 т.п.н., от около 2 т.п.н. до около 2,5 т.п.н. от около 2,5 т.п.н. до около 3 т.п.н., от около 3 т.п.н. до около 3,5 т.п.н., от около 3,5 т.п.н. до около 4 т.п.н., от около 4 т.п.н. до около 4,5 т.п.н., от около 4,5 т.п.н. до около 5 т.п.н. или длиннее.

Вставка нуклеиновой кислоты или соответствующая нуклеиновая кислота геномном локусемишени, который удаляется и/или заменяется, может представлять собой кодирующую область, такую как экзон; некодирующую область, такую как интрон, нетранслируемую область или регуляторную область (например, промотор, энхансер или элемент, связывающий транскрипционный репрессор); или любую их комбинацию.

Вставка нуклеиновой кислоты также может содержать условный аллель. Условный аллель может быть многофункциональным аллелем, как описано в US 2011/0104799, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Например, условный аллель может содержать: (а) активирующую последовательность в смысловой ориентации относительно транскрипции генамишени; (b) кассету для отбора по чувствительности к лекарственному препарату (DSC) в смысловой или антисмысловой ориентации; (c) представляющую интерес нуклеотидную последовательность (NSI) в антисмысловой ориентации; и (d) модуль условной инверсии (COIN, который использует интрон, расщепляющий экзоны, и обратимый модуль, подобный генной ловушке) в обратной ориентации. См., например, US 2011/0104799. Условный аллель может дополнительно содержать рекомбинируемые единицы, которые рекомбинируют при воздействии первой рекомбиназы с образованием условного аллеля, который (i) лишен активирующей последовательности и DSC; и (ii) содержит NSI в смысловой ориентации и COIN в антисмысловой ориентации. См., например, US 2011/0104799.

Вставки нуклеиновой кислоты также могут содержать полинуклеотид, кодирующий селективный маркер. Альтернативно, во вставках нуклеиновых кислот может отсутствовать полинуклеотид, кодирующий селективный маркер. Селективный маркер может содержаться в селекционной кассете. Необязательно, селекционная кассета может представлять собой самоудаляющуюся кассету. См., например, US 8697851 и US 2013/0312129, каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством ссылки для всех целей. В качестве примера, самоудаляющаяся кассета может содержать ген Crei (включает два экзона, кодирующих рекомбиназу Cre, которые разделены интроном), функционально связанный с промотором мышиного Prm1 и геном устойчивости к неомицину, функционально связанным с промотором убиквитина человека. Используя промотор Prm1, самоудаляющаяся кассета может быть удалена специфически в мужских половых клетках животных F0. Примеры селективных маркеров включают неомицин фосфотрансферазу (neo^r), гигромицин-Б-фосфотрансферазу (hyg^r), пуромицин-Nацетилтрансферазу (puror), бластицидин-S-дезаминазу (bsrr), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазу (gpt), или тимидинкиназу простого герпеса (HSV-k) или их комбинацию. Полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, может быть функционально связан с промотором, активным в целевой клетке. Примеры промоторов описаны в данном документе в другом месте.

Вставка нуклеиновой кислоты также может содержать репортерный ген. Иллюстративные репортерные гены включают гены, кодирующие люциферазу, β-галактозидазу, зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP), усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP), синий флуоресцентный белок (BFP), усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), DsRed, ZsGreen, MmGFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, Cerulean, T-Sapphire и щелочную фосфатазу. Такие репортерные гены могут быть функционально связаны с промотором, активным в целевой клетке. Примеры промоторов описаны в данном документе в другом месте.

Вставка нуклеиновой кислоты может также содержать одну или более кассет экспрессии или кассет делеции. Данная кассета может содержать одну или более представляющих интерес нуклеотидных последовательностей, полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, и репортерный ген, а также различные регуляторные компоненты, которые влияют на экспрессию. Примеры селектируемых маркеров и репортерных генов, которые могут быть включены, подробно обсуждаются в другом месте в данном до- 39 048264 кументе.

Вставка нуклеиновой кислоты может содержать нуклеиновую кислоту, фланкированную последовательностями-мишенями сайт-специфической рекомбинации. Альтернативно вставка нуклеиновой кислоты может содержать одну или более последовательностей-мишеней сайт-специфической рекомбинации. Хотя вся вставка нуклеиновой кислоты может быть фланкирована такими последовательностямимишенями сайт-специфической рекомбинации, любой представляющий интерес участок или отдельный полинуклеотид внутри вставки нуклеиновой кислоты также может быть фланкирован такими сайтами. Последовательности-мишени сайт-специфической рекомбинации, которые могут фланкировать вставку нуклеиновой кислоты или любой представляющий интерес полинуклеотид во вставке нуклеиновой кислоты, могут включать, например, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox или их комбинацию. В одном примере сайты сайт-специфической рекомбинации фланкируют полинуклеотид, кодирующий селективный маркер и/или репортерный ген, содержащийся во вставке нуклеиновой кислоты. После интеграции вставки нуклеиновой кислоты в целевой локус последовательности между сайтами сайт-специфической рекомбинации могут быть удалены. Необязательно могут использоваться две экзогенные донорные нуклеиновые кислоты, каждая со вставкой нуклеиновой кислоты, содержащей сайт сайт-специфической рекомбинации. Экзогенные донорные нуклеиновые кислоты могут быть нацелены на 5'- и 3'-области, фланкирующие представляющую интерес нуклеиновую кислоту. После интеграции двух вставок нуклеиновых кислот в геномный локус-мишень, представляющая интерес нуклеиновая кислота между двумя вставленными сайтами сайт-специфической рекомбинации может быть удалена.

Вставки нуклеиновых кислот могут также содержать один или более сайтов рестрикции для эндонуклеаз рестрикции (т.е. рестрикционных ферментов), которые включают эндонуклеазы типа I, типа II, типа III и типа IV. Эндонуклеазы рестрикции типа I и типа III распознают специфические сайты рестрикции, но, как правило, расщепляют в вариабельном положении от сайта связывания нуклеазы, который может находиться на расстоянии сотен пар оснований от сайта расщепления (сайта узнавания). В системах типа II рестрикционная активность не зависит от какой-либо активности метилазы, а расщепление, как обычно, происходит в определенных сайтах внутри или рядом с сайтом связывания. Большинство ферментов типа II разрезают палиндромные последовательности, однако ферменты типа IIa распознают непалиндромные сайты распознавания и расщепляют за пределами сайта узнавания, ферменты типа IIb дважды разрезают последовательности, при этом оба сайта находятся за пределами сайта узнавания, а ферменты типа IIs распознают асимметричный сайт узнавания и расщепляют с одной стороны и на определенном расстоянии около 1-20 нуклеотидов от сайта узнавания. Ферменты рестрикции типа IV нацелены на метилированную ДНК. Рестрикционные ферменты дополнительно описаны и классифицированы, например, в базе данных REBASE (веб-страница на rrebase.neb.com; Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420; Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31:1805-1812; и Belfort et al. (2002) in Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al. (ASM Press, Вашингтон, округ Колумбия)).

а. Донорные нуклеиновые кислоты для опосредованной негомологичным присоединением концов вставки

Некоторые экзогенные донорные нуклеиновые кислоты способны вставляться в геномный локус или локус безопасная гавань за счет негомологичного соединения концов. В некоторых случаях такие экзогенные донорные нуклеиновые кислоты не содержат плеч гомологии. Например, такие экзогенные донорные нуклеиновые кислоты могут быть вставлены в двухцепочечный разрыв с тупым концом после расщепления нуклеазным агентом. В конкретном примере экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть доставлена посредством AAV и может быть способной вставляться в геномный локус или локус безопасная гавань посредством негомологичного соединения концов (например, экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть такой, которая не содержит плечи гомологии).

В конкретном примере экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть вставлена посредством независимой от гомологии направленной интеграции. Например, последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, в экзогенной донорной нуклеиновой кислоте фланкирована с каждой стороны сайтом-мишенью для нуклеазного агента (например, тем же сайтом-мишенью, что и в геномном локусе или локусе безопасная гавань, и тем же самым нуклеазным агентом, используемым для расщепления сайта-мишени в геномном локусе или локусе безопасная гавань). Затем нуклеазный агент может расщеплять сайты-мишени, фланкирующие последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок. В конкретном примере, экзогенную донорную нуклеиновую кислоту доставляют с помощью опосредованной AAV доставки, и расщепление сайтов-мишеней, фланкирующих последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, может удалить инвертированные концевые повторы (ITR) AAV. В некоторых способах сайт-мишень в геномном локусе или локусе безопасная гавань (например, последовательность-мишень нРНК, включая фланкирующий мотив, прилегающий к протоспейсеру) больше не присутствует, если последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставлена в геномный локус или локус безопасная гавань в правильной ориентации, но он реформируется, если последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, вставлена в геномный локус или локус безопасная гавань в противоположной ориентации. Это может помочь гарантировать, что последовательность, ко

- 40 048264 дирующая антигенсвязывающий белок, вставлена в правильной ориентации для экспрессии.

Другие экзогенные донорные нуклеиновые кислоты имеют короткие одноцепочечные области на 5'конце и/или 3'-конце, которые комплементарны одному или более выступам, созданным в результате опосредованного нуклеазным агентом расщепления в геномном локусе-мишени. Например, некоторые экзогенные донорные нуклеиновые кислоты имеют короткие одноцепочечные области на 5'-конце и/или 3'-конце, которые комплементарны одному или более выступам, созданным опосредованным нуклеазой расщеплением на 5'- и/или 3''-последовательностях-мишенях в геномном локусе-мишени. Некоторые из таких экзогенных донорных нуклеиновых кислот имеют дополнительную область только на 5'-конце или только на 3'-конце. Например, некоторые такие экзогенные донорные нуклеиновые кислоты иметь комплементарную область только на 5'-конце, комплементарном выступу, созданному на 5'-целевой последовательности в геномном локусе-мишени, или только на 3'-конце, комплементарном выступу, созданному на 3''-последовательности-мишени в геномном локусе-мишени. Другие подобные экзогенные донорные нуклеиновые кислоты имеют дополнительные области на 5'- и 3''-концах. Например, другие подобные экзогенные донорные нуклеиновые кислоты имеют комплементарные области на обоих 5'- и 3'концах (например, комплементарные первому и второму выступам, соответственно), генерируемые нуклеазным расщеплением в геномном локусе-мишени. Например, если экзогенная донорная нуклеиновая кислота является двухцепочечной, одноцепочечные комплементарные области могут выступать от 5'конца верхней цепи донорной нуклеиновой кислоты и 5'-конца нижней цепи донорной нуклеиновой кислоты, создавая 5'-выступы на каждом конце. В качестве альтернативы, одноцепочечная комплементарная область может выступать от 3'-конца верхней цепи донорной нуклеиновой кислоты и с 3'-конца нижней цепи матрицы, создавая 3'-выступы.

Комплементарные области могут иметь любую длину, достаточную для облегчения лигирования между экзогенной донорной нуклеиновой кислотрй и нуклеиновой кислотой-мишенью. Иллюстративные комплементарные области имеют длину от около 1 до около 5 нуклеотидов, от около 1 до около 25 нуклеотидов или от около 5 до около 150 нуклеотидов. Например, комплементарная область может иметь длину по меньшей мере около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов. Альтернативно, комплементарная область может иметь длину от около 5 до около 10, от около 10 до около 20, от около 20 до около 30, от около 30 до около 40, от около 40 до около 50, от около 50 до около 60, от около 60 до около 70, около, от 70 до около 80, от около 80 до около 90, от около 90 до около 100, от около 100 до около 110, от около 110 до около 120, от около 120 до около 130, от около 130 до около 140, от около 140 до около 150 нуклеотидов, или длиннее.

Такие комплементарные области могут быть комплементарными к выступам, созданным двумя парами никаз. Два двухцепочечных разрыва со ступенчатыми концами могут быть созданы с использованием первой и второй никаз, которые расщепляют противоположные цепи ДНК для создания первого двухцепочечного разрыва, и третьей и четвертой никаз, которые расщепляют противоположные цепи ДНК для создания второго двухцепочечного разрыва. Например, белок Cas можно использовать для разрыва последовательностей-мишеней первой, второй, третьей и четвертой направляющих РНК, соответствующих первой, второй, третьей и четвертой направляющими РНК. Последовательности-мишени первой и второй направляющих РНК могут быть расположены таким образом, чтобы создать первый сайт расщепления, так что ники, созданные первой и второй никазами на первой и второй цепях ДНК, создают двухцепочечный разрыв (т.е. первый сайт расщепления включает одноцепочечные разрывы в первой и второй последовательностях-мишенях направляющей РНК). Аналогичным образом, третья и четвертая последовательности-мишени направляющих РНК могут быть расположены так, чтобы создать второй сайт расщепления, так что одноцепочечные разрывы, созданные третьей и четвертой никазами на первой и второй цепях ДНК, создают двухцепочечный разрыв (т.е. второй сайт расщепления включает одноцепочечные разрывы в третьей и четвертой последовательностях-мишенях направляющих РНК). Одноцепочечные разрывы в первой и второй последовательностях-мишенях направляющей РНК и/или третьей и четвертой последовательностях-мишенях направляющей РНК могут быть смещенными одноцепочечными разрывами, которые создают выступы. Окно смещения может составлять, например, по меньшей мере около 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 и более. См. Ran et al. (2013) Cell 154:1380-1389; Mali et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:833-838; and Shen et al. (2014) Nat. Methods 11:399-404, каждый из которых полностью включен в данный документ посредством ссылки для всех целей. В таких случаях двухцепочечная экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть сконструирована с одноцепочечными комплементарными областями, которые комплементарны выступам, создаваемым одноцепочечными разрывами в первой и второй последовательностях-мишенях направляющих РНК и одноцепочечными разрывами в третьей и четвертой последовательностях-мишенях направляющих РНК. Такая экзогенная донорная нуклеиновая кислота затем может быть вставлена при помощи опосредованного негомологичного соединения концов лигирования.

b. Донорные нуклеиновые кислоты для введения при помощи направляемой гомологией репарации

Некоторые экзогенные донорные нуклеиновые кислоты включают плечи гомологии. Если экзогенная донорная нуклеиновая кислота также содержит вставку нуклеиновой кислоты, плечи гомологии могут фланкировать вставку нуклеиновой кислоты. Для простоты ссылки плечи гомологии обозначаются в

- 41 048264 данном документе как 5'- и 3'- (т.е. расположенные по ходу и против хода транскрипции) плечами гомологии. Эта терминология относится к относительному положению плеч гомологии относительно вставки нуклеиновой кислоты внутри экзогенной донорной нуклеиновой кислоты. 5'-и 3'-плечи гомологии соответствуют областям в геномном локусе-мишени, которые упоминаются в данном документе как 5'последовательность-мишень и 3'-последовательность-мишень, соответственно.

Плечо гомологии и последовательность-мишень соответствуют или являются соответствующими друг другу тогда, когда две области обладают достаточным уровнем идентичности последовательностей друг к друг, чтобы действовать в качестве субстратов для реакции гомологичной рекомбинации. Термин гомология включает последовательности ДНК, которые либо идентичны, либо имеют долю идентичности последовательности с соответствующей последовательностью. Идентичность последовательности между данной последовательностью-мишенью и соответствующим плечом гомологии, обнаруженным в донорной нуклеиновой кислоте, может иметь любую степень идентичности последовательностей, которая допускает гомологичную рекомбинацию. Например, степень идентичности последовательностей, общих для плеча гомологии экзогенной донорной нуклеиновой матрицы (или ее фрагмента) и последовательности-мишени (или ее фрагмента), может составлять по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательностей, так что последовательности подвергаются гомологичной рекомбинации. Кроме того, соответствующая область гомологии между плечом гомологии и соответствующей последовательностью-мишенью может иметь любую длину, достаточную для стимуляции гомологичной рекомбинации. Иллюстративные плечи гомологии имеют длину от около 25 нуклеотидов до около 2,5 т.п.н., от около 25 нуклеотидов до около 1,5 т.п.н. или от около 25 до около 500 нуклеотидов. Например, данное плечо гомологии (или каждое из плеч гомологии) и/или соответствующая последовательность-мишень могут включать соответствующие области гомологии, которые имеют длину в диапазоне от около 25 до около 30, от около 30 до около 40, от около 40 до около 50, от около 50 до около 60, от около 60 до около 70, от около 70 до около 80, от около 80 до около 90, от около 90 до около 100, от около 100 до около 150, от около 150 до около 200, от около 200 до около 250, от около 250 до около 300, от около 300 до около 350, от около 350 до около 400, от около 400 до около 450 или от около 450 до около 500 нуклеотидов, так что плечи гомологии имеют достаточную гомологию для проведения гомологичной рекомбинации с соответствующими последовательностями-мишенями в нуклеиновой кислоте-мишени. Альтернативно, данное плечо гомологии (или каждое плечо гомологии) и/или соответствующая последовательность-мишень могут содержать соответствующие области гомологии, которые имеют длину от около 0,5 т.п.н. до около 1 т.п.н., от около 1 т.п.н. до около 1,5 т.п.н., от около 1,5 т.п.н. до около 2 т.п.н. или от около 2 т.п.н. до около 2,5 т.п.н. Например, каждое плечо гомологии может иметь длину около 750 нуклеотидов. Плечи гомологии могут быть симметричными (каждое плечо приблизительно одинакового размера по длине) или асимметричными (одно плечо длиннее другого).

Когда система CRISPR/Cas или другой нуклеазный агент используется в комбинации с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, 5'- и 3'-последовательности-мишени могут быть расположены в достаточной близости от сайта расщепления нуклеазой (например, в достаточной близости от последовательности-мишени направляющей РНК), чтобы способствовать возникновению события гомологичной рекомбинации между последовательностями-мишенями и плечами гомологии при одноцепочечном разрыве (нике) или двухцепочечном разрыве в сайте расщепления нуклеазой или сайте расщепления нуклеазой. Термин сайт расщепления нуклеазой включает последовательность ДНК, в которой нуклеазный агент создает одноцепочечный разрыв или двухцепочечный разрыв (например, белок Cas9 в комплексе с направляющей РНК). Последовательности-мишени в локусе-мишени, которые соответствуют 5'- и 3'плечам гомологии экзогенной донорной нуклеиновой кислоты расположен в достаточной близости к сайту расщепления нуклеазой, если расстояние таково, что способствует возникновению события гомологичной рекомбинации между 5'- и 3'-последовательностями-мишенями и плечами гомологии при одноцепочечном или двухцепочечном разрыве в сайте расщепления нуклеазой. Таким образом, последовательности-мишени, соответствующие 5'- и 3'-плечам гомологии экзогенной донорной нуклеиновой кислоты может находиться, например, в пределах, по меньшей мере, 1 нуклеотида от данного сайта расщепления нуклеазой или от по меньшей мере 10 нуклеотидов до около 1000 нуклеотидов от данного сайта расщепления данной нуклеазой. Например, сайт расщепления нуклеазой может непосредственно примыкать по меньшей мере к одной или обеим последовательностям-мишеням.

Пространственное соотношение последовательностей-мишеней, которые соответствуют плечам гомологии экзогенной донорной нуклеиновой кислоты и сайту расщепления нуклеазой, может варьироваться. Например, последовательности-мишени могут быть расположены 5' от сайта расщепления нуклеазой, последовательности-мишени могут быть расположены 3' от сайта расщепления нуклеазой, или последовательности-мишени могут фланкировать сайт расщепления нуклеазой.

2. Антигенсвязывающие белки

Описанные в данном документе экзогенные донорные нуклеиновые кислоты содержат кодирующие последовательности для антигенсвязывающих белков. Описанный в данном документе антигенсвязывающий белок включает любой белок, который связывается с антигеном. Примеры антигенсвязываю- 42 048264 щих белков включают антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело), scFV, бис-scFV, диатело, триатело, тетратело, V-NAR, VHH, VL, F (ab), F (ab)₂, DVD (антигенсвязывающий белок с двумя вариабельными доменами), SVD (антигенсвязывающий белок с одним вариабельным доменом), привлекающий T-клетки биспецифический активатор (BiTE), или антитело Дэвиса (патент США № 8586713, включенный в данный документе посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей).

Термин антитело включает молекулы иммуноглобулина, содержащие четыре полипептидных цепи, две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи содержит три домена: СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи и константную область легкой цепи (C_L). Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи могут быть дополнительно поделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые перемежаются более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждый вариабельный домен тяжелой и легкой цепи содержит три CDR и четыре FR, расположенные от N-конца до C-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDR тяжелой цепи могут быть сокращены как HCDR1, HCDR2 и HCDR3; CDR легкой цепи могут быть сокращены как LCDR1, LCDR2 и LCDR3). Термин антитело с высокой аффинностью относится к антителу, которое имеет K_D по отношению к его целевому эпитопу около 10^-9 M или ниже (например, около 1х10^-9 M, 1х10^-1 M, 1х10^-1 M, или около 1х10^-12 M). В одном варианте осуществления KD измеряют с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, BIACORE™; в еще одном варианте осуществления KD измеряют при помощи ИФА.

Антигенсвязывающий белок или антитело может быть, например, нейтрализующим антигенсвязывающим белком или антителом или нейтрализующим антигенсвязывающим белком или антителом широкого спектра действия. Нейтрализующее антитело представляет собой антитело, которое защищает клетку от антигена или инфекционного тела, нейтрализуя любой биологический эффект, который они оказывают. Нейтрализующие антитела широкого спектра действия (bNAb) влияют на несколько штаммов определенных бактерий или вирусов. Например, нейтрализующие антитела широкого спектра действия могут фокусироваться на консервативных функциональных мишенях, атакуя уязвимое место на консервативных бактериальных или вирусных белках (например, уязвимое место на гемагглютинине вирусного белка гриппа). Антитела, вырабатываемые иммунной системой при инфицировании или вакцинации, имеют тенденцию сосредотачиваться на легкодоступных петлях на бактериальной или вирусной поверхности, которые часто имеют большую последовательность и конформационную изменчивость. Это проблема по двум причинам: популяция бактерий или вирусов могут быстро уклоняться от этих антител, а антитела атакуют части белка, которые не являются необходимыми для функционирования. Нейтрализующие антитела широкого спектра действия, называемые широкого спектра действия, потому что они атакуют многие штаммы бактерий или вирусов, и нейтрализующие, потому что они атакуют ключевые функциональные участки бактерий или вирусов и блокируют инфекцию, - могут преодолеть эти проблемы. К сожалению, эти антитела, как правило, появляются слишком поздно и не обеспечивают эффективной защиты от болезни.

Описанные в данном документе антигенсвязывающие белки могут нацеливаться на любой антиген. Термин антиген относится к веществу, будь то целая молекула или домен внутри молекулы, которое способно вызывать продукцию антител со специфичностью связывания с этой субстанцией. Термин антиген также включает вещества, которые в организмах-хозяевах дикого типа не вызывают выработку антител в результате распознавания своего, но могут вызывать такой ответ у животного-хозяина с помощью соответствующей генной инженерии, чтобы нарушить иммунологическую толерантность.

В качестве одного из примеров антиген-мишень может быть ассоциированным с заболеванием антигеном. Термин ассоциированный с заболеванием антиген относится к антигену, присутствие которого коррелирует с возникновением или прогрессированием конкретного заболевания. Например, антиген может находиться в ассоциированном с заболеванием белке (т.е. белке, экспрессия которого коррелирует с возникновением или прогрессированием заболевания). Необязательно, ассоциированный с заболеванием белок может представлять собой белок, который экспрессируется при конкретном типе заболевания, но, как правило, не экспрессируется в здоровой ткани взрослого человека (т.е. белок со специфической для заболевания экспрессией или ограниченной заболеванием экспрессией). Однако ассоциированный с заболеванием белок не обязательно должен иметь специфичную для заболевания или ограниченную заболеванием экспрессию.

В качестве одного примера, ассоциированный с заболеванием антиген может представлять собой ассоциированный с раком антиген. Термин ассоциированный с раком антиген относится к антигену, присутствие которого коррелирует с возникновением или прогрессированием одного или нескольких типов рака. Например, антиген может находиться в ассоциированном с раком белке (т.е. белке, экспрессия которого коррелирует с возникновением или прогрессированием одного или более типов рака). Например, ассоциированный с раком белок может представлять собой онкогенный белок (то есть белок с

- 43 048264 активностью, которая может способствовать прогрессированию рака, например, белками, которые регулируют рост клеток), или он может представлять собой белок-супрессор опухоли (то есть белок, который, как правило, снижает вероятность образования рака, например, за счет негативной регуляции клеточного цикла или за счет стимуляции апоптоза). Необязательно, ассоциированный с раком белок может представлять собой белок, который экспрессируется при конкретном типе рака, но, как правило, не экспрессируется в здоровой взрослой ткани (то есть белок со специфической для рака экспрессией, ограниченной раком экспрессией, опухолеспецифической экспрессией, или ограниченной опухолью экспрессией). Однако ассоциированный с раком белок не обязательно должен иметь специфическую для рака, ограниченную раком, опухолеспецифическую или ограниченную опухолью экспрессию. Примерами белков, которые считаются специфичными для рака или ограниченными раком, являются раковые антигены яичка или онкофетальные антигены. Раковые антигены семенников (CTA) представляют собой большое семейство опухолевых антигенов, экспрессируемых в опухолях человека различного гистологического происхождения, но не в нормальной ткани, за исключением мужских половых клеток. При раке эти антигены развития могут повторно экспрессироваться и могут служить локусом иммунной активации. Онкофетальные антигены (OFA) представляют собой белки, которые обычно присутствуют только во время развития плода, но обнаруживаются у взрослых с некоторыми видами рака.

В качестве другого примера ассоциированный с заболеванием антиген может представлять собой антиген, ассоциированный с инфекционным заболеванием. Термин антиген, ассоциированный с инфекционным заболеванием относится к антигену, присутствие которого коррелирует с возникновением или прогрессированием конкретного инфекционного заболевания. Например, антиген может находиться в белке, ассоциированном с инфекционным заболеванием (т.е. белке, экспрессия которого коррелирует с возникновением или прогрессированием инфекционного заболевания). Необязательно, белок, ассоциированный с инфекционным заболеванием, может представлять собой белок, который экспрессируется при определенном типе инфекционного заболевания, но, как правило, не экспрессируется в здоровой ткани взрослого человека (т.е. белок со специфической для инфекционного заболевания экспрессией или белок с ограниченной инфекционным заболеванием экспрессией). Однако белок, ассоциированный с инфекционным заболеванием, не обязательно должен иметь экспрессию, специфичную для инфекционного заболевания или ограниченную инфекционным заболеванием. Например, антиген может представлять собой вирусный антиген или бактериальный антиген. Такие антигены включают, например, молекулярные структуры на поверхности вирусов или бактерий (например, вирусные белки или бактериальные белки), которые распознаются иммунной системой и способны вызывать иммунный ответ.

Примеры вирусных антигенов включают антигены в белках, экспрессируемых вирусом Зика или вирусами гриппа (грипп). Вирус Зика представляет собой вирус, который передается людям в первую очередь через укус инфицированного комара вида Aedes (Ae. aegypti и Ae. Albopictus). Инфекция, вызванная вирусом Зика, во время беременности может вызвать микроцефалию и другие серьезные дефекты головного мозга. Например, антиген вируса Зика может представлять собой, но не ограничиваясь им, антиген в белке оболочки вируса Зика (Env). Вирус гриппа представляет собой вирус, вызывающий инфекционное заболевание, называемое гриппом (широко известное как грипп). Людей поражают три типа вирусов гриппа: тип A, тип B и тип C. Антиген гриппа может представлять собой, но не ограничиваясь этим, антиген в белке гемагглютинина. Вирусные антигены и бактериальные антигены также включают антигены других вирусов и других бактерий. Примеры антител, нацеленных на гемагглютинин гриппа, представлены, например, в WO 2016/100807, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

Примеры бактериальных антигенов включают антигены в белках, экспрессируемых Pseudomonas aeruginosa (например, антиген в PcrV, который является белком транслокации системы вирулентности типа III). Pseudomonas aeruginosa представляет собой условно-патогенный бактериальный патоген, вызывающий смертельные острые легочные инфекции у тяжелобольных. Его патогенез связан с бактериальной вирулентностью, обеспечиваемой системой секреции типа III (TTSS), посредством которой P. aeruginosa вызывает некроз эпителия легких и распространяется в кровоток, что приводит к бактериемии, сепсису и смертности. TTSS позволяет P. aeruginosa напрямую перемещать цитотоксины в эукариотические клетки, вызывая гибель клеток. V-антиген P. aeruginosa PcrV, гомолог V-антигена Yersinia LcrV, является незаменимым участником транслокации токсина TTS.

Термин эпитоп относится к сайту на антигене, с которым связывается антигенсвязывающий белок (например, антитело). Эпитоп может быть образован из смежных аминокислот или несмежных аминокислот, наложенных друг на друга путем третичного фолдинга одного или более белков. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот (также известные как линейные эпитопы), как правило, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные в результате третичного фолдинга (также известные как конформационные эпитопы), как правило, разрушаются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3, а чаще по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Mo- 44 048264 lecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996), включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

Термин тяжелая цепь или тяжелая цепь иммуноглобулина включает последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина, включая последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, из любого организма. Вариабельные домены тяжелой цепи содержат три CDR тяжелой цепи и четыре области FR, если не указано иное. Фрагменты тяжелых цепей включают CDR, CDR и FR и их комбинации. Типичная тяжелая цепь после вариабельного домена (от N-конца до C-конца) имеет домен CH1, шарнир, домен CH2 и домен CH3. Функциональный фрагмент тяжелой цепи включает фрагмент, который способен специфически распознавать эпитоп (например, распознавать эпитоп с K_D в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне), который способен экспрессироваться и секретироваться из клетки, и который содержит по меньшей мере одну CDR. Вариабельные домены тяжелой цепи кодируются нуклеотидной последовательностью вариабельной области, которая, как правило, включает сегменты V_H, D_H, and J_H, происходящие из репертуара сегментов V_H , DH и JH, присутствующих в зародышевой линии. Последовательности, расположение и номенклатуру сегментов тяжелой цепи V, D и J для различных организмов можно найти в базе данных IMGT, доступной через интернет во всемирной паутине (www) по URL-адресу imgt.org.

Термин легкая цепь включает последовательность легкой цепи иммуноглобулина из любого организма и, если не указано иное, включает легкие каппа (к) и лямбда (λ) цепи человека и VpreB, а также суррогатные легкие цепи. Вариабельные домены легкой цепи включают три CDR легкой цепи и четыре каркасных (FR) области, если не указано иное. Как правило, полноразмерная легкая цепь включает от Nконца до C-конца вариабельный домен, который включает FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи. Вариабельные домены легкой цепи кодируются нуклеотидной последовательностью вариабельной области легкой цепи, которая, как правило, включает генные сегменты V_L легкой цепи и J_L легкой цепи, происходящие из репертуара генных сегментов V и J легкой цепи, присутствующих в зародышевой линии. Последовательности, расположение и номенклатуру генных сегментов V и J легкой цепи для различных организмов можно найти в базе данных IMGT, доступной через Интернет по адресу imgt.org. Легкие цепи включают те, которые, например, не связывают селективно ни первый, ни второй эпитоп, селективно связываются эпитопсвязывающим белком, в котором они появляются. Легкие цепи также включают те, которые связываются и распознают или помогают тяжелой цепи связывать и распознавать один или более эпитопов, избирательно связанных эпитоп-связывающим белком, в котором они появляются.

Используемый в данном документе термин определяющая комплементарность область или CDR включает аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты генов иммуноглобулинов организма, которая в норме (т.е. у животного дикого типа) появляется между двумя каркасными областями в вариабельной области легкой или тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина (например, антитела или рецептора Т-клеток). CDR может кодироваться, например, последовательностью зародышевой линии или реаранжированной последовательностью, и, например, наивной или зрелой В-клеткой или Т-клеткой. CDR может быть соматически мутирован (например, отличаться от последовательности, кодируемой в зародышевой линии животного), гуманизирован и/или модифицирован с помощью аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых случаях (например, для CDR3) CDR могут кодироваться двумя или более последовательностями (например, последовательностями зародышевой линии), которые не являются смежными (например, в реаранжированной последовательности нуклеиновой кислоты), но являются смежными в последовательности нуклеиновой кислоты Вклетки, например, в результате сплайсинга или соединения последовательностей (например, рекомбинации VDJ с образованием CDR3 тяжелой цепи.

Термин неперестроенный включает состояние локуса иммуноглобулина, в котором сегменты гена V и сегменты гена J (для тяжелых цепей, также сегменты гена D) сохраняться отдельно, но способны соединяться с образованием реаранжированного гена V(D)J. который включает единичный V, (D), J репертуара V(D)J. Термин реаранжированный включает конфигурацию иммуноглобулинового локуса тяжелой цепи или легкой цепи, где сегмент V расположен непосредственно рядом с сегментом DJ или J в конформации, кодирующей по существу полный домен V_H или V_L, соответственно.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие антигенсвязывающие белки в экзогенных донорных нуклеиновых кислотах, могут быть РНК или ДНК, могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут быть линейными или кольцевыми. Они могут быть частью вектора, например, вектора экспрессии или нацеливающего вектора. Вектор также может представлять собой вирусный вектор, такой как аденовирусный, аденоассоциированный вирусный (AAV), лентивирусный и ретровирусный векторы. Например, экзогенная донорная нуклеиновая кислота может представлять собой часть AAV, такого как AAV8 или AAV2/8.

Необязательно, нуклеиновые кислоты могут быть оптимизированы по кодонам для эффективной трансляции в белок в конкретной клетке или организме. Например, нуклеиновая кислота может быть модифицирована для замены кодонов, которые чаще используются в человеческой клетке, клетке отличного от человека животного, клетке млекопитающего, клетке грызунов, клетке мыши, клетке крысы или

- 45 048264 любой другой представляющей интерес клетке-хозяине.

Кодирующая последовательность антигенсвязывающего белка в экзогенной донорной нуклеиновой кислоте необязательно может быть функционально связана с любым подходящим промотором для экспрессии in vivo внутри животного или ex vivo внутри клетки. Альтернативно, экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть сконструирована так, что последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, будет функционально связана с эндогенным промотором в геномном локусе или локусе безопасная гавань после того, как она будет интегрирована в геном. Животное может представлять собой любое подходящее животное, как описано в данном документе в другом месте. Промотор может быть конститутивно активным промотором (например, промотором CAG или промотором U6), условным промотором, индуцибельным промотором, временно ограниченным промотором (например, промотором, регулируемым развитием) или пространственно ограниченным промотором (например, специфическим к клетке или тканеспецифическим промотором). Такие промоторы хорошо известны и обсуждаются в данном документе в другом месте. Промоторы, которые можно использовать в конструкции экспрессии, включают промоторы, активные, например, в одной или более из эукариотической клетки, человеческой клетки, клетки отличного от человека животного, клетки млекопитающего, клетки отличного от человека млекопитающего, клетки грызунов, клетки мыши, клетки крысы, клетки хомяка, клетки кролика, плюрипотентной клетки, эмбриональной стволовой (ES) клетки или зиготы. Такие промоторы могут быть, например, условными промоторами, индуцибельными промоторами, конститутивными промоторами или тканеспецифическими промоторами.

Необязательно, промотор может быть двунаправленным промотором, управляющим экспрессией одного гена (например, гена, кодирующего легкую цепь) и второго гена (например, гена, кодирующего тяжелую цепь) в другом направлении. Такие двунаправленные промоторы могут состоять из (1) полного обычного однонаправленного промотора Pol III, который содержит 3 внешних элемента регуляции: элемент дистальной последовательности (DSE), элемент проксимальной последовательности (PSE) и блок TATA; и (2) второй основной промотор Pol III, который включает PSE и TATA-бокс, слитый с 5'-концом DSE в обратной ориентации. Например, в промоторе H1 DSE находится рядом с PSE и TATA-боксом, и промотор можно сделать двунаправленным путем создания гибридного промотора, в котором транскрипция в обратном направлении контролируется путем добавления блока PSE и TATA, полученного из промотора U6. См., например, патент США 2016/0074535, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Использование двунаправленного промотора для одновременной экспрессии двух генов позволяет создавать компактные кассеты экспрессии для облегчения доставки.

Антигенсвязывающий белок может представлять собой одноцепочечный антигенсвязывающий белок, такой как scFv. Альтернативно, антигенсвязывающий белок не является одноцепочечным антигенсвязывающим белком. Например, антигенсвязывающий белок может включать отдельные легкие и тяжелые цепи. Кодирующая последовательность тяжелой цепи может располагаться выше кодирующей последовательности легкой цепи, или кодирующая последовательность легкой цепи может располагаться выше кодирующей последовательности тяжелой цепи. В одном конкретном примере кодирующая последовательность тяжелой цепи расположена выше кодирующей последовательности легкой цепи. Например, кодирующая последовательность тяжелой цепи может содержать сегменты V_H, D_H, и J_H, а кодирующая последовательность легкой цепи может содержать генные сегменты V_L легкой цепи и J_L легкой цепи. Последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, может быть функционально связана с экзогенным промотором в экзогенной донорной нуклеиновой кислоте, или экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть сконструирована так, что последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, будет функционально связана с эндогенным промотором в геномном локусе или локусе безопасная гавань после его геномной интеграции. В одном конкретном примере экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть сконструирована так, что последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, будет функционально связана с эндогенным промотором в геномном локусе или локусе безопасная гавань после того, как она будет интегрирована в геном. Аналогичным образом, последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, в экзогенной донорной нуклеиновой кислоте может включать экзогенную сигнальную последовательность для секреции, и/или экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть сконструирована так, чтобы последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, была функционально связана с эндогенной сигнальной последовательностью в геномном локусе или локусе безопасная гавань после ее интеграции в геном. В одном примере экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть сконструирована таким образом, что последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, будет функционально связана с эндогенной сигнальной последовательностью в геномном локусе или локусе безопасная гавань после ее интеграции в геном. В конкретном примере антигенсвязывающий белок содержит отдельные легкие и тяжелые цепи, а экзогенная донорная нуклеиновая кислота сконструирована таким образом, что кодирующая последовательность для одной цепи будет функционально связана с эндогенной сигнальной последовательностью в геномном локусе или локусе безопасная гавань после ее интеграции в геном, а кодирующая последовательность для другой цепи функционально связана с отдельной экзогенной сигнальной последовательно

- 46 048264 стью. В конкретном примере антигенсвязывающий белок содержит отдельные легкие и тяжелые цепи, и экзогенная донорная нуклеиновая кислота сконструирована таким образом, что любая последовательность, кодирующая цепь, расположенная выше в экзогенной донорной нуклеиновой кислоте, будет функционально связана с эндогенной сигнальной последовательностью в геномном локусе или локусе безопасная гавань после ее интеграции в геном, а экзогенная сигнальная последовательность функционально связана с любой последовательностью, кодирующей цепь, которая находится ниже в экзогенной донорной нуклеиновой кислоте. Альтернативно, экзогенная донорная нуклеиновая кислота может быть сконструирована таким образом, что кодирующие последовательности для обеих цепей будут функционально связаны с эндогенной сигнальной последовательностью в геномном локусе или локусе безопасная гавань после ее интеграции в геном, или кодирующая последовательность для обеих цепей может быть функционально связана с одной и той же экзогенной сигнальной последовательностью, или кодирующая последовательность для каждой цепи может быть функционально связана с отдельными экзогенными сигнальными последовательностями.

Сигнальные последовательности (т.е. N-концевые сигнальные последовательности) опосредуют нацеливание формирующихся секреторных и мембранных белков на эндоплазматический ретикулум (ЭР) зависимым от частиц распознавания сигнала (SRP) образом. Как правило, сигнальные последовательности отщепляются при совместной трансляции, так что генерируются сигнальные пептиды и зрелые белки. Примеры экзогенных сигнальных последовательностей или сигнальных пептидов, которые можно использовать, включают, например, сигнальную последовательность/пептид из альбумина мыши, альбумина человека, ROR1 мыши, ROR1 человека, азуроцидина человека, МОРС 63-подобной V-111-области каппа-цепи Ig Cricetulus griseus, и области VG V III каппа-цепи человеческого 1g. Также можно использовать любую другую известную сигнальную последовательность/пептид. В конкретном примере используется сигнальная последовательность ROR1. Пример такой сигнальной последовательности приведен в SEQ ID NO: 33 (кодируется SEQ ID NO: 31 или 32).

Одна или более нуклеиновых кислот в последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок (например, последовательность, кодирующая тяжелую цепь, и последовательность, кодирующая легкую цепь), могут находиться вместе в полицистронной конструкции экспрессии. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь и легкую цепь, может находиться вместе в бицистронной конструкции экспрессии. См., например, фиг. 1. Полицистронные векторы экспрессии одновременно экспрессируют два или более отдельных белка из одной и той же мРНК (т.е. транскрипт продуцируется из одного и того же промотора). Подходящие стратегии для полицистронной экспрессии белков включают, например, использование пептида 2А и использование участка внутренней посадки рибосомы (IRES). В качестве одного из примеров такие полицистронные векторы могут использовать один или более участков внутренней посадки рибосомы (IRES) для инициации трансляции из внутренней области мРНК. В качестве другого примера такие полицистронные векторы могут использовать один или более пептидов 2А. Эти пептиды представляют собой небольшие саморасщепляющиеся пептиды, как правило, имеющие длину 18-22 аминокислот и продуцирующие эквимолярные уровни множества генов из одной и той же мРНК. Рибосомы пропускают синтез глицил-пролиловой пептидной связи на С-конце пептида 2А, что приводит к расщеплению между пептидом 2А и его непосредственно расположенным ниже пептидом. См., например, Kim et al. (2011) PLoS One 6(4): el8556, полностью включенный в данный документ посредством ссылки для всех целей. Расщепление происходит между остатками глицина и пролина, обнаруженными на С-конце, что означает, что расположенный выше цистрон будет иметь несколько дополнительных остатков, добавленных к концу, в то время как расположенный ниже цистрон будет начинаться с пролина. В результате отщепленный расположенный ниже пептид имеет пролин на своем Nконце. Опосредованное 2А расщепление является универсальным явлением для всех эукариотических клеток. Пептиды 2А были идентифицированы у пикорнавирусов, вирусов насекомых и ротавирусов типа С. См., например, Szymczak et al. (2005) Expert Opin Biol Ther 5:627-638, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Примеры пептидов 2А, которые можно использовать, включают вирус Theasigna 2А (Т2А); тешовирус свиньи-1 2А (Р2А); вирус ринита А лошадей (ERAV) 2А (Е2А); и вирус ящура 2А (F2A). Иллюстративные последовательности Т2А, Р2А, Е2А и F2A включают следующее: Т2А (EGRGSLLTCGDVEENPGP; SEQ ID NO: 29); Р2А (ATNFSLLKQAGDVEENPGP; SEQ ID NO: 25); E2A (QCTNYALLKLAGDVESNPGP; SEQ ID NO: 30); и F2A (VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP; SEQ ID NO: 27). Остатки GSG могут быть добавлены к 5'-концу любого из этих пептидов для повышения эффективности расщепления.

В некоторых экзогенных донорных нуклеиновых кислотах нуклеиновая кислота, кодирующая сайт расщепления фурина, включена между кодирующей последовательностью легкой цепи и кодирующей последовательностью тяжелой цепи. В некоторых экзогенных донорных нуклеиновых кислотах нуклеиновая кислота, кодирующая линкер (например, GSG), включена между кодирующей последовательностью легкой цепи и кодирующей последовательностью тяжелой цепи (например, непосредственно перед кодирующей последовательностью пептида 2А). Например, сайт расщепления фурина может быть включен перед пептидом 2А, причем как сайт расщепления фурина, так и пептид 2А расположены между легкой цепью и тяжелой цепью (т.е. против хода транскрипции цепи - сайт расщепления фурина - пептид 2А

-47048264

- по ходу транскрипции цепи). Во время трансляции первое событие расщепления произойдет в последовательности пептида 2А. Однако большая часть пептида 2A останется прикрепленным в виде остатка к C-концу расположенной выше цепи (например, легкой цепи, если легкая цепь находится выше тяжелой цепи, или тяжелой цепи, если тяжелая цепь находится выше легкой цепи), с одной аминокислотой, добавленной к N-концу расположенной ниже цепи (или N-концу сигнальной последовательности, если сигнальная последовательность включена выше расположенной ниже цепи). Второе событие расщепления, инициированное в сайте расщепления фурина, дает расположенную выше цепь без остатков 2А, чтобы получить более нативную тяжелую цепь или легкую цепь путем посттрансляционного процессинга.

Экзогенные донорные нуклеиновые кислоты также могут содержать сигнал полиаденилирования или терминатор транскрипции ниже последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок. Экзогенные донорные нуклеиновые кислоты могут также содержать сигнал полиаденилирования или терминатор транскрипции выше последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок. Сигнал полиаденилирования или терминатор транскрипции перед кодирующей последовательностью антигенсвязывающего белка может фланкироваться сайтами узнавания рекомбиназы, распознаваемыми сайтспецифической рекомбиназой. Необязательно, сайты узнавания рекомбиназы также фланкируют селекционную кассету, содержащую, например, кодирующую последовательность для белка устойчивости к лекарственному препарату. Возможно, сайты узнавания рекомбиназы не фланкируют селекционную кассету. Сигнал полиаденилирования или терминатор транскрипции предотвращает транскрипцию и экспрессию белка или РНК, кодируемых кодирующей последовательностью (например, химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, направляющая РНК или рекомбиназа). Однако при воздействии сайтспецифической рекомбиназы сигнал полиаденилирования или терминатор транскрипции будет вырезан, и белок или РНК могут экспрессироваться.

Такая конфигурация может обеспечивать тканеспецифическую экспрессию или специфическую для стадии развития экспрессию у животных, имеющих последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, если сигнал полиаденилирования или терминатор транскрипции вырезается тканеспецифичным или специфичным для стадии развития образом. Вырезание сигнала полиаденилирования или терминатора транскрипции тканеспецифическим или специфичным для стадии развития образом может быть достигнуто, если животное, имеющее кассету экспрессии антигенсвязывающего белка, дополнительно содержит кодирующую последовательность для сайт-специфической рекомбиназы, функционально связанной с тканеспецифичным промотором или специфичным для стадии развития промотором. Сигнал полиаденилирования или терминатор транскрипции будет затем вырезаться только в этих тканях или на этих стадиях развития, обеспечивая тканеспецифическую экспрессию или специфическую для стадии развития экспрессию. В одном примере антигенсвязывающий белок может экспрессироваться специфическим для печени образом. Примеры таких промоторов хорошо известны.

Можно использовать любой терминатор транскрипции или сигнал полиаденилирования. Используемый в данном документе термин терминатор транскрипции относится к последовательности ДНК, которая вызывает прекращение транскрипции. У эукариот терминаторы транскрипции распознаются белковыми факторами, и за терминацией следует полиаденилирование, процесс добавления поли(А)хвоста к транскриптам мРНК в присутствии поли(А)-полимеразы. Поли(A)-сигнал млекопитающих, как правило, состоит из коровой последовательности длиной около 45 нуклеотидов, которая может быть фланкирована различными вспомогательными последовательностями, которые служат для повышения эффективности расщепления и полиаденилирования. Коровая последовательность состоит из высококонсервативного расположенного выше элемента (AATAAA или AAUAAA) в мРНК, называемого мотивом узнавания поли(А) или последовательностью узнавания поли(А)), распознаваемого посредством фактора специфичности расщепления и полиаденилирования (CPSF), и плохо определенной расположенной ниже области (богатой U или G и U), связанной при помощи фактором стимуляции расщепления (CstF). Примеры терминаторов транскрипции, которые можно использовать, включают, например, сигнал полиаденилирования гормона роста человека (HGH), сигнал позднего полиаденилирования вируса обезьяны 40 (SV40), сигнал полиаденилирования бета-глобина кролика, сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (BGH), сигнал полиаденилирования фосфоглицераткиназы (PGK), последовательность терминации транскрипции AOX1, последовательность терминации транскрипции CYC1 или любую последовательность терминации транскрипции, которая, как известно, подходит для регуляции экспрессии генов в эукариотических клетках.

Сайт-специфические рекомбиназы включают ферменты, которые могут облегчить рекомбинацию между сайтами узнавания рекомбиназы, причем два сайта рекомбинации физически разделены в одной нуклеиновой кислоте или на отдельных нуклеиновых кислотах. Примеры рекомбиназ включают рекомбиназы Cre, Flp и Dre. Одним из примеров гена рекомбиназы Cre является Crei, в котором два экзона, кодирующие рекомбиназу Cre, разделены интроном для предотвращения его экспрессии в прокариотической клетке. Такие рекомбиназы могут дополнительно содержать сигнал ядерной локализации для облегчения локализации в ядре (например, NLS-Crei). Сайты узнавания рекомбиназы включают нуклеотидные последовательности, которые распознаются сайт-специфической рекомбиназой и могут служить

- 48 048264 субстратом для события рекомбинации. Примеры сайтов узнавания рекомбиназы включают FRT, FRT11,

FRT71, attp, att, rox и lox сайты, такие как loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2 и lox5171.

Описанные в данном документе экзогенные донорные нуклеиновые кислоты также могут содержать другие компоненты. Такие экзогенные донорные нуклеиновые кислоты могут дополнительно содержать 3'-последовательность сплайсинга (сайт акцептора сплайсинга) на 5'-конце последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок. Термин '^'-последовательность сплайсинга относится к последовательности нуклеиновой кислоты на границе З'-интрона/экзона, которая может распознаваться и связываться с помощью сплайсингового механизма. Экзогенные донорные нуклеиновые кислоты могут также содержать посттранскрипционные регуляторные элементы, такие как посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка.

Конкретный пример донорной нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенсвязывающий белок, нацеленный на белки оболочки вируса Зика (Env), включает SA-LC-P2A-HC-pA, где SA означает сайт акцептора сплайсинга, LC означает легкую цепь антитела, P2A означает к пептиду P2A, HC означает тяжелую цепь антитела, а pA означает сигнал полиаденилирования. Пример такого донора указан в SEQ ID NO: 1. Нуклеотидная последовательность легкой цепи указана в SEQ ID NO: 2 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 3. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи указана в SEQ ID NO: 4 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 5. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи указана в SEQ ID NO: 103 и кодирует белок, указанный в SEQ ID NO: 104. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи указана в SEQ ID NO: 105 и кодирует белок, указанный в SEQ ID NO: 106. Три CDR легкой цепи указаны в SEQ ID NO: 64-66, соответственно, и кодируются SEQ ID NO: 85-87, соответственно. Три CDR тяжелой цепи указаны в SEQ ID NO: 67-69, соответственно, и кодируются SEQ ID NO: 88-90, соответственно. Пример антитела к вирусу Зика содержит легкую цепь, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 3 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 64-66), и тяжелую цепь, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SeQ ID NO: 5 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 67-69). Пример антитела к вирусу Зика содержит вариабельную область легкой цепи, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 104 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 64-66), и вариабельную область тяжелой цепи, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 106 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 67-69). В конкретном примере модифицированный локус альбумина (содержащий эндогенный экзон 1 альбумина мыши и интегрированную последовательность, кодирующую антитело) может содержать кодирующую последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в SEQ ID NO: 115.

Другие конкретные примеры донорных нуклеиновых кислот, кодирующих антигенсвязывающий белок, нацеленный на белки оболочки вируса Зика (Env), включают SA-HC-F2A-Albss-LC-pA, SA-HCP2A-Albss-LC-pA, Sa-HC- T2A-Albss-LC-pA или HC-T2A-RORss-LC-pA, где SA означает сайт акцептора сплайсинга, LC означает легкую цепь антитела, P2A означает пептид P2A, HC означает тяжелую цепь антитела, Albss означает сигнальную последовательность альбумина (например, из мышиного альбумина), а pA означает сигнал полиаденилирования. Примеры таких доноров приведены в SEQ ID NO: 6-9. Нуклеотидная последовательность легкой цепи указана в SEQ ID NO: 12 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 13. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи указана в SEQ ID NO: 14 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 15. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи указана в SEQ ID NO: 107 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 108. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи указана в SEQ ID NO: 109 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 110. Три CDR легкой цепи указаны в SEQ ID NO: 70-72, соответственно, и кодируются SEQ ID NO: 91-93, соответственно. Три CDR тяжелой цепи указаны в SEQ ID NO: 73-75, соответственно, и кодируются SEQ ID NO: 94-96, соответственно. Пример антитела к вирусу Зика содержит легкую цепь, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 13 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 70-72), и тяжелую цепь, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 15 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SeQ ID NO: 73-75). Пример антитела к вирусу Зика содержит вариабельную область легкой цепи, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 108 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 70-72), и вариабельную область тяжелой цепи, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%,

- 49 048264

98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 110 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 73-75). В конкретном примере модифицированный локус альбумина (содержащий эндогенный экзон 1 альбумина мыши и интегрированную последовательность, кодирующую антитело) может содержать кодирующую последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в любой из SEQ ID NO: 116-119.

Конкретный пример донорной нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенсвязывающий белок, нацеленный на белок гемагглютинина (HA) вируса гриппа, включает SA-LC-P2A-HC-pA, где SA означает сайт акцептора сплайсинга, LC означает легкую цепь антитела, P2A означает пептид P2A, HC означает тяжелую цепь антитела, а pA означает сигнал полиаденилирования. Другой конкретный пример донорной нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенсвязывающий белок, нацеленный на белок гемагглютинина (HA) вируса гриппа, включает SA-LC-T2A-HC-pA, где SA означает сайт акцептора сплайсинга, LC означает легкую цепь антитела, T2A означает пептид T2A, HC означает тяжелую цепь антитела, а pA означает сигнал полиаденилирования. Пример такого донора приведен в SEQ ID NO: 16. Нуклеотидная последовательность легкой цепи указана в SEQ ID NO: 17 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 18. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи указана в SEQ ID NO: 19 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 20. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи указана в SEQ ID NO: 111 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 112. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи указана в SEQ ID NO: 113 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 114. Три CDR легкой цепи указаны в SEQ ID NO: 76-78, соответственно, и кодируются SEQ ID NO: 97-99, соответственно. Три CDR тяжелой цепи указаны в SEQ ID NO: 79-81, соответственно, и кодируются SEQ ID NO: 100-102, соответственно. Пример антитела к HA содержит легкую цепь, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 18 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 76-78), и тяжелую цепь, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 20 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 79-81). Пример антитела к HA содержит вариабельную область легкой цепи, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 112 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 76-78), и вариабельную область тяжелой цепи, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 114 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 79-81). В конкретном примере модифицированный локус альбумина (содержащий эндогенный экзон 1 альбумина мыши и интегрированную последовательность, кодирующую антитело) может содержать кодирующую последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в SEQ ID NO: 120.

Другой конкретный пример донорной нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенсвязывающий белок, нацеленный на белок гемагглютинина (НА) вируса гриппа, включает SA-LC-T2A-RoRss-HC-pA, где SA означает сайт акцептора сплайсинга, LC означает легкую цепь антитела, T2A означает пептид T2A, RORss означает сигнальную последовательность ROR, HC означает тяжелую цепь антитела, а pA означает сигнал полиаденилирования. Пример такого донора указан в SEQ ID NO: 145. Нуклеотидная последовательность легкой цепи указана в SEQ ID NO: 125 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 126. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи указана в SEQ ID NO: 127 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 128. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи указана в SEQ ID NO: 141 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 142. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи указана в SEQ ID NO: 143 и кодирует последовательность белка, указанную в SEQ ID NO: 144. Три CDR легкой цепи указаны в SEQ ID NO: 129-131, соответственно, и кодируются SEQ ID NO: 135-137, соответственно. Три CDR тяжелой цепи указаны в SEQ ID NO: 132-134, соответственно, и кодируются SEQ ID NO: 138-140, соответственно. Пример антитела к HA содержит легкую цепь, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 126 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 129-131), и тяжелую цепь, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 128 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SeQ ID NO: 132-134). Пример антитела к HA содержит вариабельную область легкой цепи, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 142 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SeQ ID NO: 129-131), и вариабельную область тяжелой цепи, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 144 (необязательно содержит CDR, которая на по меньшей мере 90%, 95%,

- 50 048264

96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична тем, которые указаны в SEQ ID NO: 132-134). В конкретном примере модифицированный локус альбумина (содержащий интегрированную последовательность, кодирующую антитело) может содержать кодирующую последовательность, которая на по меньшей мере

90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в SEQ ID NO: 146.

Конкретный пример донорной нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенсвязывающий белок, нацеленный на белок PcrV Pseudomonas aeruginosa, включает SA-HC-T2A-LC-pA, где SA означает сайт акцептора сплайсинга, LC означает легкую цепь антитела, T2A означает пептид T2A, HC означает тяжелую цепь антитела, а pA означает сигнал полиаденилирования.

C. Локусы безопасная гавань и локус альбумина

Последовательности, кодирующие антигенсвязывающий белок, описанные в другом месте в данном документе, могут быть интегрированы в геном в геномный локус-мишень в клетке или животном. Можно использовать любой геномный локус-мишень, способный экспрессировать ген, например локус безопасная гавань (ген безопасная гавань). Взаимодействия между интегрированной экзогенной ДНК и геномом хозяина могут ограничивать надежность и безопасность интеграции и могут приводить к явным фенотипическим эффектам, которые возникают не из-за целевой генетической модификации, а из-за непреднамеренных эффектов интеграции на окружающие эндогенные гены. Например, случайно вставленные трансгены могут подвергаться позиционным эффектам и сайленсингу, что делает их экспрессию ненадежной и непредсказуемой. Точно так же интеграция экзогенной ДНК в хромосомный локус может влиять на окружающие эндогенные гены и хроматин, тем самым изменяя поведение и фенотипы клеток. Локусы безопасная гавань включают хромосомные локусы, в которых трансгены или другие экзогенные вставки нуклеиновых кислот могут стабильно и надежно экспрессироваться во всех представляющих интерес тканях без явного изменения клеточного поведения или фенотипа (т.е. без какого-либо вредного воздействия на клетку-хозяина). См., например, Sadelain et al. (2012) Nat. Rev. Cancer 12:51-58, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Например, локус безопасная гавань может представлять собой локус, в котором экспрессия вставленной генной последовательности не нарушается какой-либо сквозной экспрессией из соседних генов. Например, локусы безопасная гавань могут включать хромосомные локусы, в которых экзогенная ДНК может интегрироваться и функционировать предсказуемым образом без неблагоприятного воздействия на структуру или экспрессию эндогенного гена. Локусы безопасная гавань могут включать экстрагенные области или внутригенные области, такие как, например, локусы в генах, которые не являются необходимыми, необязательными или могут быть нарушены без явных фенотипических последствий.

Такие локусы безопасная гавань могут обеспечивать открытую конфигурацию хроматина во всех тканях и могут повсеместно экспрессироваться во время эмбрионального развития и у взрослых. См., например, Zambrowicz et al. (1997) Proc. Natl. Акад. Sci. USA 94: 3789-3794, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Кроме того, на локусы безопасная гавань можно нацеливать с высокой эффективностью, а локусы безопасная гавань могут быть разрушены без явного изменения фенотипа. Примеры локусов безопасная гавань включают альбумин, CCR5, HPRT, AAVS1 и Rosa26. См., например, патенты США №№ 7888121; 7972854; 7914796; 7951925; 8110379; 8409861; 8586526; и публикации патентов США №№ 2003/0232410; 2005/0208489; 2005/0026157; 2006/0063231; 2008/0159996; 2010/00218264; 2012/0017290; 2011/0265198; 2013/0137104; 2013/0122591; 2013/0177983; 2013/0177960; и 2013/0122591, которые полностью включены в данный документ посредством ссылки для всех целей. Другой пример подходящего локуса безопасная гавань представляет собой TTR.

Последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, может быть интегрирована в любую часть геномного локуса или локуса безопасная гавань. Например, они могут быть вставлены в интрон или экзон локуса безопасная гавань или могут заменять один или более интронов и/или экзонов геномного локуса или локуса безопасная гавань. Кассеты экспрессии, интегрированные в геномный локусмишень, могут быть функционально связаны с эндогенным промотором в геномном локусе-мишени (например, эндогенным промотором альбумина) или могут быть функционально связаны с экзогенным промотором, гетерологичным по отношению к геномному локусу-мишени. В одном примере последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, интегрирована в геномный локус-мишень (например, локус альбумина) и функционально связана с эндогенным промотором в геномном локусе-мишени (например, промоторе альбумина). В другом примере последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, интегрирована в геномный локус-мишень (например, локус альбумина) и функционально связана с гетерологичными промоторами (например, промотором CMV).

В одном примере локус безопасная гавань представляет собой локус альбумина. Альбумин представляет собой белок, который вырабатывается в печени и выделяется в кровь. Сывороточный альбумин представляет собой большую часть белков, содержащихся в крови человека. Локус альбумина экспрессируется на высоком уровне, что приводит к выработке у человека примерно 15 г белка альбумина каждый день. Альбумин не имеет аутокринной функции, и, по-видимому, не существует какого-либо фенотипа, связанного с моноаллельными нокаутами, а для двуаллельных нокаутов обнаружены лишь умеренные фенотипические изменения. См., например, Watkins et al (1994) Proc. Natl. Акад. Sci. USA 91: 9417- 51 048264

9421, которая включена в данный документ посредством ссылки для всех целей. Локус гена альбумина является безопасным и эффективным сайтом для вставки и экспрессии терапевтического гена. Вставка в локус альбумина в печени для долговременной экспрессии является привлекательным терапевтическим способом. В одном примере последовательность антигенсвязывающего белка интегрирована в интрон локуса альбумина, такой как первый интрон локуса альбумина. См., например, фиг. 1. Структура гена альбумина подходит для нацеливания трансгена на интронные последовательности, поскольку его первый экзон кодирует секреторный пептид (сигнальный пептид или сигнальную последовательность), который отщепляется от конечного белкового продукта. Например, интеграция кассеты без промотора, несущей акцептор сплайсинга и терапевтический трансген, будет поддерживать экспрессию и секрецию многих различных белков.

Человеческий ALB сопоставляется с 4q13.3 человека на хромосоме 4 (NCBI RefSeq Gene ID 213; сборка GRCh38.p12 (GCF_000001405.38); расположение NC_000004.12 (73404239..73421484 (+))). Сообщается, что ген имеет 15 экзонов. Белку альбумина человека дикого типа был присвоен номер доступа UniProt P02768. Известны по меньшей мере три изоформы (с P02768-1 по P02768-3). Alb мыши сопоставляется 5 E1; 5 44.7 cM мыши на хромосоме 5 (NCBI RefSeq Gene ID 11657; сборка GRCm38.p4 (GCF_000001635.24); расположение NC_000071.6 (90460870..90476602 (+))). Сообщается, что ген имеет 15 экзонов. Белку альбумина мыши дикого типа был присвоен номер доступа UniProt P07724. Также известны последовательности альбумина для многих других животных, кроме человека. К ним относятся, например, крупный рогатый скот (номер доступа UniProt P02769, идентификатор гена NCBI RefSeq 280717), крыса (номер доступа UniProt P02770; идентификатор гена NCBI RefSeq 24186), курица (номер доступа UniProt P19121), суматранский орангутанг (номер доступа UniProt Q5NVH5; идентификатор гена NCBI RefSeq 100174145), лошадь (номер доступа UniProt P35747; идентификатор гена NCBI RefSeq 100034206), кот (номер доступа UniProt P49064; номер доступа NCBI RefSeq 448843), кролик (номер доступа UniProt P49065; идентификатор гена NCBI RefSeq 100009195), собака (номер доступа UniProt P49822; идентификатор гена NCBI RefSeq 403550), свинья (номер доступа UniProt P08835; номер доступа NCBI RefSeq 396960), монгольская песчанка (номер доступа UniProt O35090), макака-резус (номер доступа UniProt Q28522., идентификатор гена NCBI RefSeq 704892), осел (номер доступа UniProt Q5XLE4; идентификатор гена NCBI RefSeq 106835108), овцы (номер доступа UniProt P14639; идентификатор гена NCBI RefSeq 443393), американская лягушка-бык (номер доступа UniProt P21847), золотой хомяк (номер доступа UniProt A6YF56.; идентификатор гена NCBI RefSeq 101837229) и коза (номер доступа UniProt P85295).

D. Введение нуклеазных агентов и донорных нуклеиновых кислот в клетки и животных

Описанные в данном документе способы включают введение в клетку или животных нуклеазных агентов (или нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазные агенты) и экзогенных донорных нуклеиновых кислот. Введение включает представление клетке или животному нуклеиновой кислоты или белка таким образом, что нуклеиновая кислота или белок получают доступ внутрь клетки или внутрь клеток внутри животного. Введение можно осуществить любыми способами, и два или более компонентов (например, два компонента или все компоненты) могут быть введены в клетку или животное одновременно или последовательно в любой комбинации. Например, нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) может быть введена в клетку или животное перед введением экзогенной донорной нуклеиновой кислоты. Кроме того, два или более компонентов могут быть введены в клетку или животное одним и тем же способом доставки или разными способами доставки. Точно так же два или более компонентов могут быть введены животному одним и тем же путем введения или разными путями введения.

Направляющая РНК может быть введена в клетку в форме РНК (например, РНК, транскрибируемой in vitro) или в форме ДНК, кодирующей направляющую РНК. Аналогичным образом, белковые компоненты, такие как белки Cas9, ZFN или TALEN, могут быть введены в клетку в форме ДНК, РНК или белка. Например, и направляющая РНК, и белок Cas9 могут быть введены в форме РНК. При введении в форме ДНК, указанная ДНК, кодирующая направляющую РНК, может быть функционально связана с промотором, активным в клетке. Например, направляющая РНК может доставляться при помощи AAV и экспрессироваться in vivo под управлением промотора U6. Такие ДНК могут быть в одной или более конструкциях экспрессии. Например, такие конструкции экспрессии могут быть компонентами одной молекулы нуклеиновой кислоты. Альтернативно, они могут быть разделены в любой комбинации между двумя или более молекулами нуклеиновой кислоты (т.е. ДНК, кодирующие одну или более РНК CRISPR, и ДНК, кодирующие одну или более tracrРНК, могут быть компонентами отдельных молекул нуклеиновой кислоты).

Нуклеиновые кислоты, кодирующие направляющие РНК или нуклеазные агенты, могут быть функционально связаны с промотором в конструкции экспрессии. Конструкции экспрессии включают любые конструкции нуклеиновых кислот, способные управлять экспрессией гена или другой представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты и которые могут переносить такую представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты в клетку-мишень. Подходящие промоторы, которые можно использовать в конструкции экспрессии, включают промоторы, активные, например, в одной или

- 52 048264 более из следующего: эукариотическая клетка, человеческая клетка, клетка отличного от человека животного, клетка млекопитающего, клетка отличного от человека млекопитающего, клетка грызунов, клетка мыши, клетка крысы, клетка хомяка, клетка кролика, плюрипотентная клетка, эмбриональная стволовая (ЭС) клетка, взрослая стволовая клетка, ограниченная стадией развития клеткапредшественник, индуцированная плюрипотентная стволовая (ИПСК) клетка или эмбрион на одноклеточной стадии. Такие промоторы могут быть, например, условными промоторами, индуцибельными промоторами, конститутивными промоторами или тканеспецифическими промоторами. Необязательно, промотор может быть двунаправленным промотором, управляющим экспрессией как направляющей РНК в одном направлении, так и другого компонента в другом направлении. Такие двунаправленные промоторы могут состоять из (1) полного обычного однонаправленного промотора Pol III, который содержит 3 внешних элемента регуляции: элемент дистальной последовательности (DSE), элемент проксимальной последовательности (PSE) и блок TATA; и (2) второй основной промотор Pol III, который включает PSE и TATA-бокс, слитый с 5'-концом DSE в обратной ориентации. Например, в промоторе H1 DSE находится рядом с PSE и TATA-боксом, и промотор можно сделать двунаправленным путем создания гибридного промотора, в котором транскрипция в обратном направлении контролируется путем добавления блока PSE и TATA, полученного из промотора U6. См., например, патент США 2016/0074535, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Использование двунаправленного промотора для экспрессии генов, кодирующих направляющую РНК и другой компонент, одновременно позволяет создавать компактные кассеты экспрессии для облегчения доставки.

Направляющие РНК или нуклеиновые кислоты, кодирующие направляющие РНК (или другие компоненты), могут быть представлены в композициях, содержащих носитель, увеличивающий стабильность направляющей РНК (например, при заданных условиях продлевающий период хранения (например, -20°C, 4°C или температура окружающей среды), в течение которого продукты деградации остаются ниже порогового значения, например, ниже 0,5% от массы исходной нуклеиновой кислоты или белка; или повышающий стабильность in vivo). Неограничивающие примеры таких носителей включают микросферы из поли(молочной кислоты) (PLA), микросферы из поли(D, L-молочной-ко-гликолевой кислоты) (PLGA), липосомы, мицеллы, инверсные мицеллы, липидные кохлеаты и липидные микротрубочки.

В данном документе представлены различные способы и композиции, позволяющие ввести нуклеиновую кислоту или белок в клетку или животное. Такие способы введения нуклеиновой кислоты или белков в клетку или животное могут включать, например, доставку вектора, доставку, опосредованную частицами, доставку, опосредованную экзосомами, доставку, опосредованную липидными наночастицами (ЛНЧ), доставку, опосредованную проникающими в клетки пептидами, или доставку, опосредованную имплантируемым устройством. В качестве конкретных примеров нуклеиновую кислоту или белок можно вносить в клетку или животное в носителе, таком как микросфера из поли(молочной кислоты) (PLA), микросфера из поли(D, L-молочной-ко-гликолевой кислоты) (PLGA), липосома, мицелла, инверсная мицелла, липидный кохелат или липидная микротрубочка. Некоторые конкретные примеры доставки животному включают гидродинамическую доставку, вирус-опосредованную доставку (например, доставку, опосредованную аденоассоциированным вирусом (AAV) или аденовирусом, лентивирусом или ретровирусом) и доставку, опосредованную липидными наночастицами. В одном конкретном примере как нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент), так и экзогенная донорная последовательность могут быть доставлены посредством опосредованной ЛНЧ доставки. В еще одном конкретном примере как нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент), так и экзогенная донорная последовательность могут быть доставлены посредством опосредованной AAV доставки. Например, нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) и экзогенная донорная последовательность могут быть доставлены при помощи нескольких разных векторов AAV (например, двух разных векторов AAV). В конкретном примере, в котором нуклеазный агент представляет собой CRISPR/Cas (например, CRISPR/Cas9), первый вектор AAV может доставлять Cas (например, Cas9) или нуклеиновую кислоту, кодирующую Cas, а второй вектор AAV может доставлять нРНК (или нуклеиновую кислоту, кодирующую нРНК) и экзогенную донорную последовательность. Например, можно использовать малые промоторы, чтобы кодирующую последовательность Cas9 можно было поместить в конструкцию AAV. Примеры таких промоторов включают Efs, SV40 или синтетический промотор, содержащий специфический к печени энхансер (например, E2 из вируса HBV или серпина A из гена серпина A) и коровой промотор (например, описанный в данном документе синтетический промотор E2P или синтетический промотор серпина AP). Примеры промоторов включают: (1) фактор элонгации 1 альфа-короткий (EF) (SEQ ID NO: 40); (2) обезьяний вирус 40 (SV40) (SEQ ID NO: 41); и два синтетических промотора ((3) промотор ранней области 2 (E2P) (SEQ ID NO: 42) и (4) серпин AP (SEQ ID NO: 43)). Однако можно использовать и другие промоторы.

Когда Cas9 (нуклеиновую кислоту, кодирующую Cas9) доставляют в первом AAV, а нРНК (нуклеиновую кислоту, кодирующую нРНК) и экзогенную донорную последовательность доставляют во втором AAV, первый и второй AAV могут быть доставлены в любом подходящем соотношении (например,

- 53 048264 соотношении доставленных вирусных геномов). Например, отношение первого AAV ко второму AAV может составлять от около 25: 1 до около 1:25, от около 10: 1 до около 1:10, от около 5: 1 до около 1: 5, от около 10: 1 до около 1:10, от около 5: 1 до около 1: 5, от около 4: 1 до около 1: 4, от около 4: 1 до около 1: 1, от около 1: 1 до около 1: 4, от около 3: 1 до около 1: 3, от около 3: 1 до около 1: 1, от около 1: 1 до около 1: 3, от около 2: 1 до около 1: 2, от около 2: 1 до около 1: 1, от около 1: 1 до около 1: 2 или около 1: 1. В конкретном примере отношение первого AAV ко второму AAV составляет около 1: 2. В еще одном конкретном примере отношение первого AAV ко второму AAV составляет около 2: 1. В еще одном конкретном примере отношение первого AAV ко второму AAV составляет около 1: 1. В еще одном конкретном примере отношение первого AAV ко второму AAV составляет около 5: 1. В еще одном конкретном примере отношение первого AAV ко второму AAV составляет около 10: 1. В еще одном конкретном примере отношение первого AAV ко второму AAV составляет около 1: 5. В еще одном конкретном примере отношение первого AAV ко второму AAV составляет около 1: 10.

В еще одном конкретном примере, нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, или одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) может быть доставлена посредством опосредованной ЛНЧ доставки, а экзогенная донорная последовательность может быть доставлена посредством опосредованной AAV доставки. В другом конкретном примере, нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, или одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) может быть доставлена посредством опосредованной AAV доставки, а экзогенная донорная последовательность может быть доставлена посредством опосредованной ЛНЧ доставки.

Введение нуклеиновых кислот и белков в клетки или животных может осуществляться при помощи гидродинамической доставки (HDD). Гидродинамическая доставка стала известна как способ внутриклеточной доставки ДНК in vivo. Для доставки генов в паренхимные клетки необходимо вводить только основные последовательности ДНК через выбранный кровеносный сосуд, что устраняет проблемы безопасности, связанные с современными вирусными и синтетическими векторами. При попадании в кровоток ДНК способна достигать клеток в различных тканях, доступных для крови. Гидродинамическая доставка использует силу, создаваемую быстрой инъекцией большого объема раствора в несжимаемую кровь в кровотоке, чтобы преодолеть физические барьеры эндотелия и клеточных мембран, которые предотвращают попадание крупных и непроницаемых для мембран соединений в паренхимные клетки. Помимо доставки ДНК, этот способ полезен для эффективной внутриклеточной доставки РНК, белков и других небольших соединений in vivo. См., например, Bonamassa et al. (2011) Pharm. Res. 28 (4): 694-701, которая полностью включен в данный документ посредством ссылки для всех целей.

Введение нуклеиновых кислот также может осуществляться посредством опосредованной вирусом доставки, такой как опосредованная AAV доставка или опосредованная лентивирусом доставка. Другие иллюстративные вирусы/вирусные векторы включают ретровирусы, аденовирусы, вирусы осповакцины, поксвирусы и вирусы простого герпеса. Вирусы могут инфицировать делящиеся клетки, неделящиеся клетки или как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Вирусы могут интегрироваться в геном хозяина или, альтернативно, не интегрироваться в геном хозяина. Такие вирусы также могут быть созданы для снижения иммунитета. Вирусы могут быть репликационно-компетентными или могут быть репликационно-дефектными (например, дефектными в одном или нескольких генах, необходимых для дополнительных раундов репликации и/или упаковки вириона). Вирусы могут вызывать транзиентую экспрессию, длительную экспрессию (например, по меньшей мере 1 неделю, 2 недели, 1 месяц, 2 месяца или 3 месяца) или постоянную экспрессию (например, Cas9 и/или нРНК). Иллюстративные вирусные титры (например, титры AAV) включают 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, и 10¹⁶ геномов векторов/мл.

Геном оцДНК AAV состоит из двух открытых рамок считывания, Rep и Cap, фланкированных двумя инвертированными концевыми повторами, которые обеспечивают синтез комплементарной цепи ДНК. При конструировании плазмиды для переноса AAV трансген помещают между двумя ITR, и Rep и Cap могут быть представлены в транс-положении. В дополнение к Rep и Cap для AAV может потребоваться вспомогательная плазмида, содержащая гены аденовируса. Эти гены (E4, E2a и VA) опосредуют репликацию AAV. Например, переносимая плазмида Rep/Cap и вспомогательная плазмида могут быть трансфицированы в клетки HEK293, содержащие ген аденовируса E1+, для получения инфекционных частиц AAV. Альтернативно, гены-помощники Rep, Cap и аденовируса могут быть объединены в единую плазмиду. Аналогичные упаковочные клетки и способы можно использовать для других вирусов, например, ретровирусов.

Идентифицировано несколько серотипов AAV. Эти серотипы различаются типами клеток, которые они инфицируют (т.е. их тропизмом), что позволяет осуществлять преимущественную трансдукцию определенных типов клеток. Серотипы для тканей ЦНС включают AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 и AAV9. Серотипы для сердечной ткани включают AAV1, AAV8 и AAV9. Серотипы для ткани почек включают AAV2. Серотипы для легочной ткани включают AAV4, AAV5, AAV6 и AAV9. Серотипы для ткани поджелудочной железы включают AAV8. Серотипы для фоторецепторных клеток включают AAV2, AAV5 и AAV8. Серотипы для пигментного эпителия сетчатки включают AAV1, AAV2, AAV4, AAV5 и AAV8. Серотипы для ткани скелетных мышц включают AAV1, AAV6, AAV7, AAV8 и AAV9.

- 54 048264

Серотипы для ткани печени включают AAV7, AAV8 и AAV9 и особенно AAV8.

Тропизм может быть дополнительно уточнен с помощью псевдотипирования, которое представляет собой смешение капсида и генома из разных вирусных серотипов. Например, AAV2/5 указывает на вирус, содержащий геном серотипа 2, упакованный в капсид серотипа 5. Использование псевдотипированных вирусов может улучшить эффективность трансдукции, а также изменить тропизм. Гибридные капсиды, полученные из разных серотипов, также можно использовать для изменения вирусного тропизма. Например, AAV-DJ содержит гибридный капсид восьми серотипов и демонстрирует высокую инфективность в широком диапазоне типов клеток in vivo. AAV-DJ8 представляет собой еще один пример, который демонстрирует свойства AAV-DJ, но с улучшенным захватом мозгом. Серотипы AAV также могут быть изменены посредством мутаций. Примеры мутационных модификаций AAV2 включают Y444F, Y500F, Y730F и S662V. Примеры мутационных модификаций AAV3 включают Y705F, Y731F и T492V. Примеры мутационных модификаций AAV6 включают S663V и T492V. Другие псевдотипированные/модифицированные варианты AAV включают AAV2/1, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2.5, AAV8.2, и AAV/SASTG. В конкретном примере AAV представляет собой AAV2/8 (геном AAV2 и белки rep с капсидными белками AAV8).

Для ускорения экспрессии трансгена можно использовать самокомплементарные варианты AAV (scAAV). Поскольку AAV зависит от механизма репликации ДНК клетки для синтеза комплементарной цепи генома в виде одноцепочечной ДНК AAV, экспрессия трансгена может задерживаться. Чтобы устранить эту задержку, можно использовать scAAV, содержащие комплементарные последовательности, которые способны спонтанно ренатурировать при инфицировании, что устраняет потребность в синтезе ДНК клетки-хозяина. Однако, также можно использовать одноцепочечные векторы AAV (ssAAV).

Чтобы увеличить упаковочную способность, более длинные трансгены могут быть разделены между двумя плазмидами для переноса AAV, первая с 3'-донором сплайсинга, а вторая с 5'-акцептором сплайсинга. При совместном инфицировании клетки эти вирусы образуют конкатемеры, соединяются вместе, и может экспрессироваться полноразмерный трансген. Хотя это позволяет более длительную экспрессию трансгена, экспрессия менее эффективна. В подобных способах увеличения емкости используется гомологичная рекомбинация. Например, трансген можно разделить между двумя плазмидами для переноса, но со значительным перекрытием последовательностей, так что совместная экспрессия вызывает гомологичную рекомбинацию и экспрессию полноразмерного трансгена.

В некоторых AAV карго может включать нуклеазный агент (или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент). В некоторых AAV карго может включать направляющую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую направляющую РНК. В некоторых AAV карго может включать мРНК, кодирующую нуклеазу Cas, такую как Cas9, и направляющую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую направляющую РНК. В некоторых AAV карго может включать экзогенную донорную последовательность. В некоторых AAV карго может включать нуклеазный агент (или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) и экзогенную донорную последовательность. В некоторых AAV карго может включать мРНК, кодирующую нуклеазу Cas, такую как Cas9, направляющую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую направляющую РНК, и экзогенную донорную последовательность.

Введение нуклеиновых кислот и белков также может осуществляться путем доставки, опосредованной липидными наночастицами (ЛНЧ). Например, опосредованная ЛНЧ доставка может использоваться для доставки направляющей РНК в форме РНК. В конкретном примере направляющая РНК и белок Cas вводят в форме РНК посредством опосредованной ЛНЧ доставки в одной и той же ЛНЧ. Как обсуждается более подробно в другом месте в данном документе, одна или более РНК могут быть модифицированы, чтобы включать одну или более модификаций стабилизирующего конца на 5'-конце и/или 3'конце. Такие модификации могут включать, например, одну или более фосфоротиоатных связей на 5'конце и/или 3'-конце или одну или более 2'-O-метильных модификаций на 5'-конце и/или 3'-конце. Доставка такими способами приводит к временному присутствию направляющей РНК, а биоразлагаемые липиды улучшают клиренс, улучшают переносимость и снижают иммуногенность. Липидные составы могут защищать биологические молекулы от деградации, улучшая их клеточный захват. Липидные наночастицы представляют собой частицы, содержащие множество липидных молекул, физически связанных друг с другом межмолекулярными силами. К ним относятся микросферы (включая однослойные и многослойные везикулы, например, липосомы), дисперсную фазу в эмульсии, мицеллы или внутреннюю фазу в суспензии. Такие липидные наночастицы можно использовать для инкапсуляции одной или более нуклеиновых кислот или белков для доставки. Составы, содержащие катионные липиды, полезны для доставки полианионов, таких как нуклеиновые кислоты. Другие липиды, которые могут быть включены, представляют собой нейтральные липиды (т.е. незаряженные или цвиттерионные липиды), анионные липиды, вспомогательные липиды, которые усиливают трансфекцию, и липиды-невидимки, которые увеличивают продолжительность существования наночастиц in vivo. Примеры подходящих катионных липидов, нейтральных липидов, анионных липидов, вспомогательных липидов и липидов-невидимок можно найти в WO 2016/010840 A1 и WO 2017/173054 A1, каждый из которых полностью включен в

- 55 048264 настоящий документ посредством ссылки для всех целей. Иллюстративная липидная наночастица может содержать катионный липид и один или более других компонентов. В одном примере другой компонент может содержать вспомогательный липид, такой как холестерин. В другом примере другие компоненты могут содержать вспомогательный липид, такой как холестерин, и нейтральный липид, такой как DSPC. В еще одном примере другие компоненты могут содержать вспомогательный липид, такой как холестерин, необязательный нейтральный липид, такой как DSPC, и липид-невидимка, такой как S010, S024, S027, S031 или S033.

ЛНЧ может содержать одно или более или все из следующего: (i) липид для инкапсуляции и для эндосомального высвобождения; (ii) нейтральный липид для стабилизации; (iii) вспомогательный липид для стабилизации; и (iv) липид-невидимка. См., например, Finn et al. (2018) Cell Rep. 22 (9): 2227-2235 и WO 2017/173054 A1, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей. В некоторых ЛНЧ карго может включать нуклеазный агент (или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент). В некоторых ЛНЧ карго может включать направляющую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую направляющую РНК. В некоторых ЛНЧ карго может включать мРНК, кодирующую нуклеазу Cas, такую как Cas9, и направляющую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую направляющую РНК. В некоторых ЛНЧ карго может включать экзогенную донорную последовательность. В некоторых ЛНЧ карго может включать нуклеазный агент (или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент) и экзогенную донорную последовательность. В некоторых ЛНЧ карго может включать мРНК, кодирующую нуклеазу Cas, такую как Cas9, направляющую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую направляющую РНК, и экзогенную донорную последовательность.

Липид для инкапсуляции и эндосомального высвобождения может представлять собой катионный липид. Липид также может представлять собой биологически деградируемый липид, такой как биологически деградируемый ионизируемый липид. Одним из примеров подходящего липида является липид A или LP01, который представляет собой (9Z, 12Z)-3-((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3-(диэтил амино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропилоктадека-9,12-диеноат, также называемый 3-((4,4-бис (октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3-(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропил (9Z, 12Z)-окта дека-9,12-диеноат. См., например, Finn et al. (2018) Cell Rep. 22 (9): 2227-2235 и WO 2017/173054 A1, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей. Другим примером подходящего липида является липид B, который представляет собой ((5((диметиламино)метил)-1,3-фенилен)бис(окси))бис(октан-8,1-диил)бис(деканоат), также называется ((5((диметиламино)метил)-1,3-фенилен)бис(окси))бис(октан-8,1-диил)бис(деканоат). Другим примером подходящего липида является липид C, который представляет собой 2-(4-(((3-(диметиламино) пропокси)карбонил)окси)гексадеканоил)окси)пропан-1,3-диил(9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-бис(октадека-9,12-диено ат). Другим примером подходящего липида является липид D, который представляет собой 3-(((3(диметиламино)пропокси)карбонил)окси)-13-(октаноилокси)тридецил-3-октилундеканоат. Другие подходящие липиды включают: гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино)бутаноат (также известный как [(6Z,9Z,28Z,31Z-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил] 4-(диметиламино)бутаноат или Dlin-MC3-DMA (MC3))).

Некоторые такие липиды, подходящие для использования в описанных в данном документе ЛНЧ, являются биоразлагаемыми in vivo. Например, ЛНЧ, содержащие такой липид, включают те, в которых по меньшей мере 75% липида выводится из плазмы в течение 8, 10, 12, 24 или 48 часов, или 3, 4, 5, 6, 7 или 10 дней. В качестве другого примера, по меньшей мере 50% ЛНЧ выводится из плазмы в течение 8, 10, 12, 24 или 48 часов, или 3, 4, 5, 6, 7 или 10 дней.

Такие липиды могут быть ионизируемыми в зависимости от pH среды, в которой они находятся. Например, в слабокислой среде липиды могут быть протонированы и, таким образом, нести положительный заряд. И наоборот, в слабощелочной среде, такой как, например, кровь, где pH составляет приблизительно 7,35, липиды могут не протонироваться и, таким образом, не иметь заряда. В некоторых вариантах осуществления липиды могут быть протонированы при pH по меньшей мере около 9, 9,5 или 10. Способность такого липида нести заряд связана с его собственным pKa. Например, липид может независимо иметь pKa в диапазоне от около 5,8 до около 6,2.

Нейтральные липиды стабилизируют и улучшают процессинг ЛНЧ. Примеры подходящих нейтральных липидов включают множество нейтральных, незаряженных или цвиттерионных липидов. Примеры нейтральных фосфолипидов, подходящих для использования в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, 5-гептадецилбензол-1,3-диол(резорцин), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дистеароилфосфатидилхолин. или 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), фосфохолин (DOPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), фосфатидилхолин (PLPC), 1,2-диарахидоноил-snглицеро-3-фосфохолин (DAPC), фосфатидилэтаноламин (PE), яичный фосфатидилхолин (EPC), дилаурилоилфосфатидилхолин (DLPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), 1-миристоил-2пальмитоилфосфатилфосфатил-2-пальмитоилфосфатилхолин (MPPC) 1-пальмоитил-2миристоилфосфатидилхолин (PMPC), 1-пальмитоил-2-стеароилфосфатидилхолин (PSPC), 1,2

- 56 048264 диарахидоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DBPC), 1-стеароил-2-пальмитоилфосфатидилхолин (SPPC), 1,2диейкозеноил-sn глицеро-3-фосфохолин (DEPC), пальмитоил-олеоил-фосфатидилхолин (POPC), лизофосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), дилинолеоилфосфатидилхолин дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), пальмитоил-фосфатидилэтаноламин (DPPE), пальмитоилолеилфосфатидилэтаноламин (POPE), лизофосфатидилэтаноламин, 1-стеароил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (SOPC) и их комбинации. Например, нейтральный фосфолипид может быть выбран из группы, состоящей из дистеароилфосфатидилхолина (DSPC) и димиристоилфосфатидилэтаноламина (DMPE).

Вспомогательные липиды включают липиды, которые усиливают трансфекцию. Механизм, с помощью которого вспомогательный липид усиливает трансфекцию, может включать повышение стабильности частиц. В некоторых случаях вспомогательный липид может усиливать слияние мембран. Вспомогательные липиды включают стероиды, стерины и алкилрезорцины. Примеры подходящих вспомогательных липидов включают холестерин, 5-гептадецилрезорцин и холестерин гемисукцинат. В одном примере вспомогательный липид может представлять собой холестерин или холестерин гемисукцинат.

Липиды-невидимки включают липиды, которые изменяют продолжительность существования наночастиц in vivo. Липиды-невидимки могут способствовать процессу приготовления, например, уменьшая агрегацию частиц и контролируя размер частиц. Липиды-невидимки могут модулировать фармакокинетические свойства ЛНЧ. Подходящие липиды-невидимки включают липиды, имеющие гидрофильную головную группу, связанную с липидным фрагментом.

Гидрофильная головная группа липида-невидимки может включать, например, полимерный фрагмент, выбранный из полимеров на основе PEG (иногда называемого поли(этиленоксидом)), поли(оксазолина), поли(винилового спирта), поли(глицерина), поли(Л-винилпирролидона), полиаминокислот и поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида. Термин PEG означает любой полиэтиленгликоль или другой полимер на основе простого полиалкиленового эфира. В некоторых составах ЛНЧ PEG представляет собой PEG-2K, также называемый PEG 2000, который имеет среднюю молекулярную массу около 2000 дальтон. См., например, WO 2017/173054 A1, полностью включенную в данный документ посредством ссылки для всех целей.

Липидный фрагмент скрытого липида может быть получен, например, из диацилглицерина или диацилгликамида, включая группы, содержащие диалкилглицериновую или диалкилгликамидную группу, имеющую длину алкильной цепи, независимо содержащую от около C4 до около C40 насыщенных или ненасыщенных атомов углерода, где цепь может содержать одну или более функциональных групп, таких как, например, амид или сложный эфир. Диалкилглицериновая или диалкилгликамидная группа может дополнительно содержать одну или более замещенных алкильных групп.

В качестве одного примера, скрытый липид может быть выбран из PEG-дилауроилглицерина, PEGдимиристоилглицерина (PEG-DMG), PEG-дипальмитоилглицерина, PEG-дистеароилглицерина (PEGDSPE), PEG-дилаурилглицерина, PEG-диплимид и PEG-димиламида, PEG-димиламида PEGдистеароилгликамида, PEG-холестерин (1-[8-(холест-5-ен-3[бета]-окси)карбоксамидо-3',6'-диоксаокта нил]карбамоил-[омега] -метил-поли(этиленгликоль), PEG-DMB (3,4-дитетрадекоксилбензил-[омега] метил-поли(этиленгликоль)эфир), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэти ленгликоль)-2000] (PEG2k-DMG), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэти ленгликоль)-2000] (PEG2k-DSPE), 1,2-дистеароил-sn-глицерин, метоксиполиэтиленгликоль (PEG2kDSG), поли(этиленгликоль)-2000-диметакрилат (PEG2k-DMA) и 1,2-дистеарилоксипропил-3-амин-N[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (PEG2k-DSA). В одном конкретном примере липид-невидимка может представлять собой PEG2k-DMG.

ЛНЧ могут содержать различные соответствующие молярные соотношения компонентов липидов в составе. Мол.% липида CCD может составлять, например, от около 30 мол.% до около 60 мол.%, от около 35 мол.% до около 55 мол.%, от примерно 40 мол.% до около 50 мол.%, от около 42 мол.% до около 47 мол.%, или около 45%. Мол.% вспомогательного липида может составлять, например, от около 30 мол.% до около 60 мол.%, от около 35 мол.% до около 55 мол.%, от около 40 мол.% до около 50 мол.%, от около 41 мол.% до около 46 мол.%, или около 44 мол.%. Мол.% нейтрального липида может составлять, например, от около 1 мол.% до около 20 мол.%, от около 5 мол.% до около 15 мол.%, от около 7 мол.% до около 12 мол.% или около 9 мол.%. Мол.% липида-невидимки может составлять, например, от около 1 мол.% до около 10 мол.%, от около 1 мол.% до около 5 мол.%, от около 1 мол.% до около 3 мол.%, около 2 мол.% или около 1 мол.%.

ЛНЧ могут иметь разные соотношения между положительно заряженными аминогруппами биологически деградируемого липида (N) и отрицательно заряженными фосфатными группами (P) нуклеиновой кислоты, которую необходимо инкапсулировать. Это может быть математически представлено уравнением N/P. Например, соотношение N/P может составлять от около 0,5 до около 100, от около 1 до около 50, от около 1 до около 25, от около 1 до около 10, от около 1 до около 7, от около 3 до около 5, от около 4 до около 5, около 4, около 4,5 или около 5.

В некоторых ЛНЧ карго может содержать мРНК Cas (например, мРНК Cas9) и нРНК. мРНК Cas (например, мРНК Cas9) и нРНК могут находиться в разных соотношениях. Например, состав ЛНЧ может

- 57 048264 иметь отношение мРНК Cas (например, мРНК Cas9) к нуклеиновой кислоте нРНК в диапазоне от около 25: 1 до около 1: 25, в диапазоне от около 10: 1 до около 1: 10, в диапазоне от около 5: 1 до около 1: 5 или около 1: 1. Альтернативно, состав ЛНЧ может иметь отношение мРНК Cas (например, мРНК Cas9) к нуклеиновой кислоте нРНК от около 1: 1 до около 1: 5 или около 10: 1. Альтернативно, состав ЛНЧ может иметь отношение мРНК Cas (например, мРНК Cas9) к нуклеиновой кислоте нРНК около 1:10, 25: 1, 10: 1, 5: 1, 3: 1, 1: 1, 1: 3, 1: 5, 1:10 или 1:25. Альтернативно, состав ЛНЧ может иметь отношение мРНК Cas (например, мРНК Cas9) к нуклеиновой кислоте нРНК от около 1: 1 до около 1: 2. В конкретных примерах отношение мРНК Cas (например, мРНК Cas9) к нРНК может составлять около 1: 1 или около 1: 2.

В некоторых ЛНЧ карго может включать экзогенную донорную нуклеиновую кислоту и нРНК. Экзогенная донорная нуклеиновая кислота и нРНК могут находиться в разных соотношениях. Например, композиция ЛНЧ может иметь отношение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты к нуклеиновой кислоте нРНК в диапазоне от около 25: 1 до около 1:25, в диапазоне от около 10: 1 до около 1:10, в диапазоне от около 5: 1 до около 1: 5 или около 1: 1. Альтернативно, состав ЛНЧ может иметь отношение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты к нуклеиновой кислоте нРНК от около 1: 1 до около 1: 5, от около 5: 1 до около 1: 1, около 10: 1 или около 1:10. Альтернативно, состав ЛНЧ может иметь отношение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты к нуклеиновой кислоте нРНК около 1:10, 25: 1, 10: 1, 5: 1, 3: 1, 1: 1, 1: 3, 1: 5, 1:10 или 1:25.

Конкретный пример подходящего ЛНЧ имеет отношение азота к фосфату (N/P) 4,5 и содержит биологически деградируемый катионный липид, холестерин, DSPC и PEG2k-DMG в молярном соотношении 45: 44: 9: 2. Биологически деградируемый катионный липид может представлять собой (9Z,12Z)-3-((4,4бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3-(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропилоктадека9,12-диеноат, также называемый 3-((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3 -(диэтиламино)пропокси) карбонил)окси)метил)пропил (9Z,12Z)-октадека-9,12-диеноат. См., например, Finn et al. (2018) Cell Rep. 22 (9): 2227-2235, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей. мРНК Cas9 может находиться в соотношении 1: 1 по массе к направляющей РНК. Еще один конкретный пример подходящего ЛНЧ содержит Dlin-MC3-DMA (MC3), холестерин, DSPC и PEG-DMG в молярном соотношении 50:38,5:10:1,5.

Еще один конкретный пример подходящего ЛНЧ имеет соотношение азота к фосфату (N/P), равное 6, и содержит биологически деградируемый катионный липид, холестерин, DSPC и PEG2k-DMG в молярном соотношении 50: 38: 9: 3. Биологически деградируемый катионный липид может представлять собой (9Z,12Z)-3-((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3-(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси) метил)пропилоктадека-9,12-диеноат, также называемый 3-((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропил (9Z,12Z)-октадека-9,12-диеноат. мРНК Cas9 может находиться в соотношении 1:2 по массе к направляющей РНК.

Способ доставки может быть выбран для снижения иммуногенности. Например, разные компоненты могут доставляться разными способами (например, бимодальная доставка). Эти разные способы могут придавать разные фармакодинамические или фармакокинетические свойства доставляемой субъекту молекуле. Например, разные способы могут привести к разному распределению в тканях, разному периоду полужизни или разному временному распределению. Некоторые способы доставки (например, доставка вектора нуклеиновой кислоты, который сохраняется в клетке путем автономной репликации или геномной интеграции) приводят к более устойчивой экспрессии и присутствию молекулы, тогда как другие способы доставки являются временными и менее устойчивыми (например, доставка РНК или белка). Доставка компонентов более временным образом, например, в виде РНК, может гарантировать, что комплекс Cas/нРНК присутствует и активен только в течение короткого периода времени, и может снизить иммуногенность. Такая транзиентная доставка может также снизить вероятность нецелевых модификаций.

Введение in vivo может осуществляться любым подходящим путем, включая, например, парентеральный, внутривенный, пероральный, подкожный, внутриартериальный, интракраниальный, интратекальный, внутрибрюшинный, местный, интраназальный или внутримышечный. Системные способы введения включают, например, пероральный и парентеральный пути. Примеры парентеральных путей включают внутривенный, внутриартериальный, внутрикостный, внутримышечный, внутрикожный, подкожный, интраназальный и внутрибрюшинный пути. Конкретный пример представляет собой внутривенную инфузию. Местные способы введения включают, например, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, интрапаренхимальный (например, локализованную интрапаренхимальную доставку в полосатое тело (например, в хвостатую часть или в путамен), кору головного мозга, прецентральную извилину, гиппокамп (например, в зубчатую извилину или область CA3), височную кору, миндалину, лобную кору, таламус, мозжечок, продолговатый мозг, гипоталамус, тектум, тегментум или черную субстанцию), внутриглазной, внутриглазничный, субконъюнктивальный, интравитреальный, субретинальный и трансклеральный пути. Значительно меньшие количества компонентов (по сравнению с системными подходами) могут оказывать эффект при местном введении (например, внутрипаренхиматозном или интравитреальном) по сравнению с системным введением (например, внутривенным). Способы местного введения могут также снижать или устранять частоту потенциально токсичных побочных эффектов, которые мо

- 58 048264 гут возникать при системном введении терапевтически эффективных количеств компонента.

Конкретный пример представляет собой внутривенную инъекцию или инфузию. Композиции, содержащие нуклеазные агенты или нуклеиновые кислоты, кодирующие нуклеазные агенты (например, мРНК Cas9 и направляющие РНК или нуклеиновые кислоты, кодирующие направляющие РНК) и/или экзогенные донорные нуклеиновые кислоты, могут быть составлены с использованием одного или более физиологически и фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей, эксципиентов или вспомогательных веществ. Состав может зависеть от выбранного пути введения. Термин фармацевтически приемлемый означает, что носитель, разбавитель, эксципиент или вспомогательное вещество совместимы с другими ингредиентами препарата и не являются по существу вредными для их реципиента.

Частота введения и количество доз могут зависеть от периода полужизни экзогенных донорных нуклеиновых кислот или направляющих РНК (или нуклеиновых кислот, кодирующих направляющие РНК) и пути введения среди других факторов. Введение нуклеиновых кислот или белков в клетку или животное можно проводить один или более раз в течение определенного периода времени. Например, введение можно проводить только один раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере два раза в течение некоторого периода времени, по меньшей мере три раза в течение некоторого периода времени, по меньшей мере четыре раза в течение некоторого периода времени, по меньшей мере пять раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере шесть раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере семь раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере восемь раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере девять раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере десять раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере одиннадцать раз, по меньшей мере двенадцать раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере тринадцать раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере четырнадцать раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере пятнадцать раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере шестнадцать раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере семнадцать раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере восемнадцать раз в течение некоторого периода времени, по меньшей мере девятнадцать раз в течение некоторого периода времени или по меньшей мере двадцать раз в течение некоторого периода времени.

E. Измерение экспрессии и активности интегрированных последовательностей, кодирующих антигенсвязывающий белок, in vivo

Описанные в данном документе способы могут дополнительно включать оценку экспрессии и/или активности вставленной последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок. Для идентификации клеток, имеющих целевую генетическую модификацию, можно использовать различные способы. Скрининг может включать количественный анализ для оценки модификации аллеля (MOA) исходной хромосомы. Например, количественный анализ можно проводить с помощью количественной ПЦР, такой как ПЦР в реальном времени (кПЦР). В ПЦР в реальном времени может использоваться первый набор праймеров, который распознает локус-мишень, и второй набор праймеров, который распознает нецелевой эталонный локус. Набор праймеров может включать флуоресцентный зонд, распознающий амплифицированную последовательность. Другие примеры подходящих количественных анализов включают флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), сравнительную геномную гибридизацию, изотермическую амплификацию ДНК, количественную гибридизацию с иммобилизованным(и) зондом(ами), зонды INVADER®, зонды типа молекулярный маяк TaqMan® или технологию зондов ECLIPSE™ (см., например, US 2005/0144655, который полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей).

Секвенирование следующего поколения (NGS) также можно использовать для скрининга. Секвенирование следующего поколения также может называться NGS, массово-параллельное секвенирование или высокопроизводительное секвенирование. NGS можно использовать в качестве инструмента скрининга в дополнение к анализам MOA для определения точной природы целевой генетической модификации и ее соответствия между типами клеток, типами тканей или типами органов.

Оценка модификации геномного локуса или локуса безопасная гавань у отличного от человека животного может находиться в любом типе клеток из любой ткани или органа. Например, оценка может проводиться на нескольких типах клеток из одной ткани или органа или на клетках из нескольких мест в ткани или органе. Это может предоставить информацию о том, какие типы клеток в ткани или органемишени являются мишенями, или какие участки ткани или органа достигаются направленным на человеческий альбумин реагентом. В качестве другого примера, оценка может проводиться на нескольких типах тканей или на нескольких органах. В способах, в которых нацеливается на конкретную ткань, орган или тип клеток, это может предоставить информацию о том, насколько эффективно нацеливается эта ткань или орган, и есть ли побочные эффекты в других тканях или органах.

Способы измерения экспрессии антигенсвязывающих белков могут включать, например, измерение уровней антител в плазме или сыворотке животного. Такие способы хорошо известны. Такие способы могут также включать оценку экспрессии мРНК антитела, кодируемой экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, или оценку экспрессии антитела. Это измерение может проводиться в печени или определенных типах клеток или областях в печени, или оно может включать измерение уровней секретируемых

- 59 048264 антител в сыворотке. Анализы, которые могут быть выполнены, включают, например, ИФА для определения титра (hIgG), ИФА для связывания с антигеном-мишенью и вестерн-блоттинг для определения качества антител, как описано в Примере 1 ниже.

Одним из примеров анализа, который можно использовать, являются анализы на основе гибридизации in situ РНК (ISH) RNASCOPE™ и BASESCOPE™, которые являются методами, которые могут количественно определять специфические к клеткам отредактированные транскрипты, включая изменения единичных нуклеотидов, в контексте интактной фиксированной ткани. Анализ на основе гибридизации РНК in situ BASESCOPE™ может дополнять NGS и кПЦР при характеристике редактирования генов. В то время как NGS/кПЦР может предоставить количественные средние значения последовательностей дикого типа и отредактированных последовательностей, они не предоставляют информации о гетерогенности или процентном содержании отредактированных клеток в ткани. Анализ на основе гибридизации in situ BASESCOPE™ может обеспечить обзор всей ткани и количественную оценку транскриптов дикого типа по сравнению с отредактированными транскриптами с одноклеточным разрешением, где можно количественно определить фактическое количество клеток в ткани-мишени, содержащей отредактированный транскрипт мРНК. Анализ BASESCOPE™ обеспечивает обнаружение единой молекулы РНК с использованием парных олигозондов (ZZ) для усиления сигнала без неспецифического фона. Тем не менее, конструкция зонда BASESCOPE™ и система амплификации сигнала позволяют обнаруживать одиночную РНК с помощью зонда ZZ и могут дифференцированно обнаруживать единичные нуклеотидные изменения и мутации в интактной фиксированной ткани.

Анализы для измерения активности антигенсвязывающего белка могут включать анализы нейтрализации вирусов или бактерий, если антигенсвязывающий белок является нейтрализующим антигенсвязывающим белком, нацеленным на вирусный или бактериальный антиген. Примеры включают реакции нейтрализации бляшкообразования (анализы вирусных бляшек) или анализы бляшкообразующих единиц, в которых используются методы иммуноокрашивания с использованием флуоресцентно-меченых антител, специфичных к вирусному или бактериальному антигену, для обнаружения инфицированных клеток-хозяев и инфекционных вирусных частиц. Подобные анализы хорошо известны. См., например, Shan et al. (2017) EBioMedicine 17: 157-162 и Wilson et al. (2017) J. Clin. Microbiol. 55 (10):3104-3112, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей.

Активность антигенсвязывающего белка также можно тестировать, подвергая животное воздействию вируса или бактерий, на которые нацелен антигенсвязывающий белок, и оценивая, защищает ли антигенсвязывающий белок от инфекции. Подобные модели анализа опухолей можно использовать для антигенсвязывающих белков, нацеленных на ассоциированные с раком антигены. Подобные анализы существуют или могут быть разработаны для антигенсвязывающих белков, нацеленных на другие ассоциированные с заболеванием антигены.

III. Профилактическое или терапевтическое применение

Описанные в данном документе способы можно использовать для лечения или проведения профилактики заболевания у животного (человека или отличного от человека животного), имеющего заболевание или подверженного риску заболевания. Человек подвергается повышенному риску заболевания, если у него есть хотя бы один известный фактор риска (например, генетический, биохимический, семейный анамнез, ситуационное воздействие), что ставит людей с этим фактором риска на статистически значимый больший риск развития заболевания, чем у людей без фактора риска.

Например, такие способы могут включать введение животному нуклеазного агента (или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент), которая нацелена на сайт-мишень в геномном локусе или локусе безопасная гавань, и экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, при этом антигенсвязывающий белок нацелен на антиген, ассоциированный с заболеванием. Нуклеазный агент может расщеплять целевой сайт, а последовательность, кодирующую антигенсвязывающую белок, может быть вставлен в геномный локус или локус безопасная гавань для получения модифицированного геномного локуса или локуса безопасная гавань. Затем антигенсвязывающий белок может экспрессироваться в животном и связывать антиген, ассоциированный с заболеванием. Способы вставки последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, в геномный локус или локус безопасная гавань у животного in vivo более подробно обсуждаются в другом месте в данном документе.

Антигенсвязывающий белок или антитело может представлять собой, например, терапевтический антигенсвязывающий белок или антитело. Такие антигенсвязывающие белки или антитела можно использовать для нейтрализации или удаления белков-мишеней, вызывающих заболевание, или для избирательного уничтожения или очистки ассоциированных с заболеванием клеток (например, раковых клеток). Такие антитела могут действовать посредством нескольких различных механизмов действия, включая, например, нейтрализации, активности антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) или активности комплемент-зависимой цитотоксичности (КЗЦ).

Антигенсвязывающий белок или антитело может быть, например, нейтрализующим антигенсвязы- 60 048264 вающим белком или антителом или нейтрализующим антигенсвязывающим белком или антителом широкого спектра действия. Нейтрализующее антитело представляет собой антитело, которое защищает клетку от антигена или инфекционного тела, нейтрализуя любой биологический эффект, который они оказывают. Нейтрализующие антитела широкого спектра действия (bNAb) влияют на несколько штаммов определенных бактерий или вирусов.

Ассоциированные с заболеванием антигены описаны более подробно в другом месте в данном настоящем документе. В качестве нескольких примеров такие антигены могут представлять собой ассоциированные с раком антигены, ассоциированные с инфекционными заболеваниями антигены, бактериальные антигены или вирусные антигены. Примеры каждого из них описаны в данном документе в другом месте.

IV. Клетки, животные или геномы, содержащие последовательность, кодирующую антигенсвязывающий белок, вставленные в локус безопасная гавань

Также представлены геномы, клетки и животные, полученные способами, описанными в данном документе, или содержащие последовательности, кодирующие антигенсвязывающий белок в геномном локусе или локусе безопасная гавань, как описано в данном документе. Антигенсвязывающие белки и кодирующие последовательности, которые могут быть вставлены, более подробно описаны в другом месте в данном документе. Аналогичным образом, примеры геномных локусов генома или локусов безопасная гавань, таких как локус альбумина, более подробно описаны в других местах данного документа. Геномный локус или локус безопасная гавань, в который стабильно интегрирована последовательность, кодирующая антигенсвязывающий белок, может быть гетерозиготным по последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок, или гомозиготным по последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок. Диплоидный организм имеет два аллеля в каждом генетическом локусе. Каждая пара аллелей представляет собой генотип определенного генетического локуса. Генотипы описываются как гомозиготные, если есть два идентичных аллеля в определенном локусе, и как гетерозиготные, если эти два аллеля различаются. Животное, имеющее последовательности, кодирующие антигенсвязывающий белок, в геномном локусе или локусе безопасная гавань, как описано в данном документе, может содержать последовательности, кодирующие антигенсвязывающий белок, в геномном локусе или локусе безопасная гавань в своей зародышевой линии.

Представленные в данном документе геномы, клетки или животные могут быть, например, эукариотическими, включая, например, животное, млекопитающее, отличное от человека млекопитающее, и человека. Термин животное включает млекопитающих, рыб и птиц. Млекопитающее может быть, например, отличным от человека млекопитающим, человеком, грызуном, крысой, мышью или хомяком. К другим отличным от человека млекопитающим, относятся, например, отличные от человека приматы, обезьяны, мартышки, кошки, собаки, кролики, лошади, быки, олени, бизоны, домашний скот (например, такие виды крупного рогатого скота, как коровы, кастрированные быки и т.д.; виды овечьих, такие как овцы, козы и т.д., и виды свинообразных, такие как свиньи и кабаны). К птицам относятся, например, куры, индюки, страусы, гуси, утки и т.д. Включены также домашние животные и сельскохозяйственные животные. Термин отличный от человека исключает людей.

Клетки также могут находиться в недифференцированном или дифференцированном состоянии любого типа. Например, клетка может быть тотипотентной клеткой, плюрипотентной клеткой (например, плюрипотентной клеткой человека или плюрипотентной клеткой нечеловеческого происхождения, такой как эмбриональная стволовая (ЭС) клетка мыши или ЭС клетка крысы) или неплюрипотентной клеткой. Тотипотентные клетки включают недифференцированные клетки, которые могут давать начало любому типу клеток, а плюрипотентные клетки включают недифференцированные клетки, которые обладают способностью развиваться в более чем один тип дифференцированных клеток.

Представленные в данном документе клетки также могут быть половыми клетками (например, сперматозоидами или ооцитами). Клетки могут быть митотически компетентными клетками или митотически неактивными клетками, мейотически компетентными клетками или мейотически неактивными клетками. Точно так же клетки также могут быть первичными соматическими клетками или клетками, которые не являются первичными соматическими клетками. Соматические клетки включают любые клетки, не являющиеся гаметами, зародышевыми клетками, гаметоцитами или недифференцированными стволовыми клетками. Например, клетки могут быть клетками печени, почек, кроветворными клетками, эндотелиальными клетками, эпителиальными клетками, фибробластами, мезенхимальными клетками, кератиноцитами, клетками крови, меланоцитами, моноцитами, мононуклеарными клетками, моноцитарными предшественниками, В-клетками, эритроид-мегакариоцитарными клетками, эозинофилы, макрофаги, Т-клетки, островковые бета-клетки, экзокринные клетки, предшественники поджелудочной железы, эндокринные предшественники, адипоциты, преадипоциты, нейроны, глиальные клетки, нервные стволовые клетки, нейроны, гепатобласты, гепатоциты, кардиомиоциты, скелетные миобласты, клетки гладких мышц, протоковые клетки, ацинарные клетки, альфа-клетки, бета-клетки, дельта-клетки, клетки PP, холангиоциты, белые или коричневые адипоциты или глазные клетки (например, клетки трабекулярной сети, пигментные эпителиальные клетки сетчатки, эндотелиальные клетки микрососудов сетчатки, перициты сетчатки, эпителиальные клетки конъюнктивы, фибробласты конъюнктивы, пигментные эпители- 61 048264 альные клетки радужки, кератоциты, эпителиальные клетки хрусталика, непигментные ресничные эпителиальные клетки, фибробласты сосудистой оболочки глаза, фоторецепторные клетки, ганглиозные клетки, биполярные клетки, горизонтальные клетки или амакриновые клетки). Например, клетки могут быть клетками печени, такими как гепатобласты или гепатоциты.

Представленные в данном документе клетки могут быть нормальными, здоровыми клетками или могут быть больными или несущими мутанты клетками.

Представленные в данном документе животные могут быть людьми или отличными от людей животными. Отличные от человека животные, имеющие нуклеиновую кислоту или кассету экспрессии, как описано в данном документе, могут быть получены способами, описанными в другом месте в данном документе. Термин животное включает млекопитающих, рыб и птиц. Млекопитающие включают, например, людей, приматов, не относящихся к человеку, обезьян, мартышек, кошек, собак, лошадей, быков, оленей, бизонов, овец, кроликов, грызунов (например, мышей, крыс, хомяков и морских свинок) и домашний скот (например, виды крупного рогатого скота, такие как коровы и кастрированные бычки; виды овечьих, такие как овцы и козы; и виды свинообразных, такие как свиньи и кабаны). К птицам относятся, например, куры, индюки, страусы, гуси и утки. Включены также домашние животные и сельскохозяйственные животные. Термин отличное от человека животное исключает людей. Конкретные примеры отличных от человека животных, включают грызунов, таких как мыши и крысы.

Отличные от человека животные могут иметь любое генетическое происхождение. Например, подходящие мыши могут быть из линии 129, линии C57BL/6, линии 129 и C57BL/6, линии BALB/c или линии Swiss Webster. Примеры линий 129 включают 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, и 129T2. См., например, Festing et al. (1999) Mamm. Genome 10(8):836, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей. Примеры линий C57BL включают C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, и C57BL/Ola. Подходящие мыши также могут происходить из комбинации вышеупомянутой линии 129 и вышеупомянутой линии C57BL/6 (например, 50% 129 и 50% C57BL/6). Подобным образом подходящие мыши могут происходить из комбинации вышеупомянутых линии 129 или из комбинации вышеупомянутых линий BL/6 (например, штамма 129S6 (129/SvEvTac)).

Аналогичным образом крысы могут быть из любой линии крыс, включая, например, линию крыс ACI, линию крыс Dark Agouti (DA), линию крыс Wistar, линию крыс LEA, линию крыс Sprague Dawley (SD) или линию крыс Fischer, таких как Fisher F344 или Fisher F6. Крыс также можно получить из линии, полученной из комбинации двух или более линий, перечисленных выше. Например, подходящая крыса может происходить из линии DA или линии ACI. Линия крыс ACI характеризуется черными агути, белыми животом и лапами и гаплотипом RT1^av1. Такие линии доступны из различных источников, включая Harlan Laboratories. Линия крыс Dark Agouti (DA) характеризуется наличием шерсти агути и гаплотипом RT1a^v1. Такие крысы доступны из различных источников, включая Charles River и Harlan Laboratories. В некоторых случаях подходящие крысы могут быть из инбредной линии крыс. См., например, US 2014/0235933, который полностью включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

У некоторых животных экспрессия антигенсвязывающего белка в сыворотке или плазме составляет по меньшей мере около 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 110000, 120000, 130000 или 140000, 150000, 200000, 250000, 300000, 350000 или 400000 нг/мл (т.е., по меньшей мере, около 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 или 140, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 мкг/мл). Например, экспрессия может составлять по меньшей мере около 2500, 5000, 10000, 100000 или 400000 нг/мл (то есть по меньшей мере около 2,5, 5, 10, 100 или 400 мкг/мл).

Все патентные заявки, веб-сайты, другие публикации, номера доступа и т.п., указанные выше или ниже в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждый отдельный элемент был специально и отдельно указан как включенный в данный документ посредством ссылки. Если разные версии последовательности связаны с номером доступа в разное время, то подразумевается та версия, которая связана с номером доступа на действительную дату подачи данной заявки. Действительная дата подачи означает более раннюю дату из даты фактической подачи или даты подачи приоритетной заявки со ссылкой на номер доступа, если это применимо. Аналогичным образом, если разные версии публикации, веб-сайта и т.п. публикуются в разное время, то подразумевается та версия, которая была опубликована последней на действительную дату подачи данной заявки, если не указано иное. Любые признак, этап, элемент, вариант реализации или аспект, описанные в данном документе, можно применять в комбинации с любым другим, если специально не указано иное. Несмотря на то, что варианты реализации данного изобретения описаны довольно подробно с помощью иллюстраций и примеров для ясности и понимания, будет очевидно, что могут быть осуществлены определенные изменения и модификации в пределах объема прилагаемой формулы данного изобретения.

- 62 048264

Краткое описание графических материалов

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, перечисленные в сопроводительном списке последовательностей, представлены с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований и трехбуквенного кода для аминокислот. Нуклеотидные последовательности следуют стандартному соглашению: они начинаются с 5'-конца последовательности и продолжаются вперед (т.е. слева направо в каждой строке) до 3'-конца. Показана только одна цепь каждой нуклеотидной последовательности, но подразумевается, что комплементарная цепь включается любой ссылкой на отображаемую цепь. Когда предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, понятно, что также предложены ее варианты с вырожденными кодонами, которые кодируют ту же аминокислотную последовательность. Аминокислотные последовательности следуют стандартному соглашению: они начинаются с аминоконца последовательности и продолжаются вперед (т.е. слева направо в каждой строке) к карбокси-концу.

Таблица 2

Описание последовательностей

SEQ ID NO	Тип	Описание
1	ДНК	Донорная нуклеиновая кислота к Env (вирус Зика) SA-LC-P2A-HC-pA REGN4504 (pAAV AlbSA REGN4504)
2	ДНК	Нуклеотид LC к вирусу Зика REGN4504
3	Белок	Белок LC к вирусу Зика REGN4504
4	ДНК	Нуклеотид НС к вирусу Зика REGN4504
5	Белок	Белок НС к вирусу Зика REGN4504
6	ДНК	hPHKI hU6 REGN4446 НС F2A Albss LC
7	ДНК	hPHKI hU6 REGN4446 НС P2A Albss LC
8	ДНК	hPHKI hU6 REGN4446 НС T2A Albss LC
9	ДНК	hPHKI hU6 REGN4446 НС T2A RORss LC
10	Днк	AAV CAS1 REGN4446 НС T2A LC
11	ДНК	AAV CMV REGN4446 LC T2A HC
12	Днк	Нуклеотид LC к вирусу Зика REGN4446
13	Белок	Белок LC к вирусу Зика REGN4446
14	Днк	Нуклеотид НС к вирусу Зика REGN4446
15	Белок	Белок НС к вирусу Зика REGN4446
16	Днк	Донорная нуклеиновая кислота SA-LC-P2A-HC-pA к НА REGN3263
17	Днк	Нуклеотид LC к НА REGN3263
18	Белок	Белок LC к НА REGN3263
19	Днк	Нуклеотид НС к НА REGN3263
20	Белок	Белок НС к НА REGN3263
21	Днк	AlbSA
22	Днк	Сайт расщепления фурина (нуклеиновая кислота)
23	Белок	Сайт расщепления фурина (белок)
24	Днк	Нуклеиновая кислота Р2А
25	Белок	Белок Р2А
26	Днк	Нуклеиновая кислота F2A
27	Белок	Белок F2A
28	Днк	Нуклеиновая кислота Т2А

- 63 048264

29	Белок	Белок Т2А
30	Белок	Белок Е2А
31	ДНК	Нуклеиновая кислота версии 1 mRORss
32	ДНК	Нуклеиновая кислота версии 2 mROR ss
33	Белок	Белок mRORss
34	ДНК	Нуклеиновая кислота mAlbss
35	Белок	Белок mAlbss
36	ДНК	sWPRE
37	ДНК	Поли(А) SV40
38	ДНК	tRNAGln
39	ДНК	SerpinAP.Cas9
40	Днк	EF
41	ДНК	SV40p
42	Днк	E2P
43	Днк	SerpinAP
44	Днк	Энхансер E2
45	Днк	Энхансер серпина A
46	Днк	Коровой промотор Р
47	Днк	tGln нРНК EF Cas9
48	Днк	tGln нРНК SV40 Cas9
49	Днк	tGln нРНК E2P Cas9
50	Днк	tGln нРНК Серпин AP Cas9
51	РНК	Хвост сгРНК
52	РНК	tracrPHK
53	РНК	Каркас нРНК версии 1
54	РНК	Каркас нРНК версии 2
55	РНК	Каркас нРНК версии 3
56	РНК	Каркас нРНК версии 4
57	РНК	Каркас нРНК версии 5
58	ДНК	Последовательность-мишень направляющей РНК плюс РАМ версии 1
59	ДНК	Последовательность-мишень направляющей РНК плюс РАМ версии 2
60	ДНК	Последовательность-мишень направляющей РНК плюс РАМ версии 3
61	ДНК	ДНК Cas9
62	Белок	Белок Cas9

- 64 048264

63	ДНК	мРНК Cas9
64	Белок	CDR1 LC к вирусу 3nKaREGN4504
65	Белок	CDR2 LC к вирусу Зика REGN4504
66	Белок	CDR3 LC к вирусу 3nKaREGN4504
67	Белок	CDR1 НС к вирусу 3nKaREGN4504
68	Белок	CDR2 НС к вирусу 3nKaREGN4504
69	Белок	CDR3 НС к вирусу 3nKaREGN4504
70	Белок	CDR1 LC к вирусу Зика REGN4446
71	Белок	CDR2 LC к вирусу Зика REGN4446
72	Белок	CDR3 LC к вирусу Зика REGN4446
73	Белок	CDR1 НС к вирусу Зика REGN4446
74	Белок	CDR2 НС к вирусу Зика REGN4446
75	Белок	CDR3 НС к вирусу Зика REGN4446
76	Белок	CDR1 LC к НА REGN3263
77	Белок	CDR2 LC к НА REGN3263
78	Белок	CDR3 LC к НА REGN3263
79	Белок	CDR1 НС к НА REGN3263
80	Белок	CDR2 НС к НА REGN3263
81	Белок	CDR3 НС к НА REGN3263
82	ДНК	Прямой праймер ITR AAV
83	ДНК	Эталонный праймер ITR AAV
84	ДНК	Зонд ITR AAV
85	ДНК	CDR1 LC к вирусу 3nKaREGN4504
86	ДНК	CDR2 LC к вирусу Зика REGN4504
87	ДНК	CDR3 LC к вирусу 3nKaREGN4504
88	ДНК	CDR1 НС к вирусу 3nKaREGN4504
89	ДНК	CDR2 НС к вирусу 3HKaREGN4504
90	ДНК	CDR3 НС к вирусу 3nKaREGN4504
91	Днк	CDR1 LC к вирусу Зика REGN4446
92	ДНК	CDR2 LC к вирусу Зика REGN4446
93	Днк	CDR3 LC к вирусу Зика REGN4446
94	Днк	CDR1 НС к вирусу Зика REGN4446
95	Днк	CDR2 НС к вирусу Зика REGN4446
96	Днк	CDR3 НС к вирусу Зика REGN4446

- 65 048264

97	ДНК	CDRl LC к НА REGN3263
98	ДНК	CDR2 LC к НА REGN3263
99	ДНК	CDR3 LC к НА REGN3263
100	ДНК	CDR1 НС к НА REGN3263
101	ДНК	CDR2 НС к НА REGN3263
102	ДНК	CDR3 НС к НА REGN3263
103	ДНК	Нуклеотид VL к вирусу Зика REGN4504
104	Белок	Белок VL к вирусу Зика REGN4504
105	ДНК	Нуклеотид VH к вирусу Зика REGN4504
106	Белок	Белок VH к вирусу Зика REGN4504
107	ДНК	Нуклеотид VL к вирусу Зика REGN4446
108	Белок	Белок VL к вирусу Зика REGN4446
109	ДНК	Нуклеотид VH к вирусу Зика REGN4446
ПО	Белок	Белок VH к вирусу Зика REGN4446
111	ДНК	Нуклеотид VL к НА REGN3263
112	Белок	Белок VL к НА REGN3263
113	ДНК	Нуклеотид VH к НА REGN3263
114	Белок	Белок VH к НА REGN3263
115	ДНК	Кодирующая последовательность для интегрированного mAlbss-LCP2A-mRORss-HC REGN4504 (включая эндогенный экзон 1 альбумина мыши)
116	ДНК	Кодирующая последовательность для интегрированного mAlbss-HCF2A-Albss-LC REGN4446 (включая эндогенный экзон 1 альбумина мыши)
117	ДНК	Кодирующая последовательность для интегрированного mAlbss-HCP2A-Albss-LC REGN4446 (включая эндогенный экзон 1 альбумина мыши)
118	Днк	Кодирующая последовательность для интегрированного mAlbss-HCT2A-Albss-LC REGN4446 (включая эндогенный экзон 1 альбумина мыши)
119	ДНК	Кодирующая последовательность для интегрированного mAlbss-HCT2A-RORss-LC REGN4446 (включая эндогенный экзон 1 альбумина мыши)
120	Днк	Кодирующая последовательность для интегрированного mAlbss-LC-

- 66 048264

		Р2А-НС REGN3263 (включая эндогенный экзон 1 альбумина мыши)
121	РНК	tracrPHK версии 2
122	РНК	tracrPHK версии 3
123	РНК	Каркас нРНК версии 6
124	РНК	Каркас нРНК версии 7
125	ДНК	Нуклеотид LC к НА Н1Н11829N2
126	Белок	Белок LC к НА Н1Н11829N2
127	ДНК	Нуклеотид НС к НА Н1Н11829N2
128	Белок	Белок НС к НА Н1Н11829N2
129	Белок	CDR1 LC к НА H1H11829N2
130	Белок	CDR2 LC к НА Н1Н11829N2
131	Белок	CDR3 LC к НА H1H11829N2
132	Белок	CDR1 НС к НА H1H11829N2
133	Белок	CDR2 НС к НА H1H11829N2
134	Белок	CDR3 НС к НА H1H11829N2
135	ДНК	CDR1 LC к НА H1H11829N2
136	ДНК	CDR2 LC к НА Н1Н11829N2
137	ДНК	CDR3 LC к НА H1H11829N2
138	ДНК	CDR1 НС к НА H1H11829N2
139	ДНК	CDR2 НС к НА H1H11829N2
140	ДНК	CDR3 НС к НА H1H11829N2
141	ДНК	Нуклеотид VL к НА Н1Н11829N2
142	Белок	Белок VL к НА Н1Н11829N2
143	ДНК	Нуклеотид VH к НА Н1Н11829N2
144	Белок	Белок VH к НА Н1Н11829N2
145	ДНК	H1H11829N2 к НА (LC_T2A_RORss_HC)
146	ДНК	Кодирующая последовательность для интегрированного Н1Н11829N2 к НА (LC_T2A_RORss_HC)

Примеры

Пример 1. Вставка генов антител к вирусу Зика в локус мышиного альбумина

Введение липидных наночастиц и опосредованного AAV антитела в локус альбумина мыши

Локус гена альбумина является безопасным и эффективным сайтом для вставки и экспрессии терапевтического гена. Комбинация технологии CRIPSR/Cas9 и безопасного вектора AAV для включения профилактического или терапевтического гена антитела в локус альбумина в печени для долгосрочной экспрессии является привлекательным терапевтическим методом.

Для включения профилактического или терапевтического гена антитела в локус альбумина в печени мы использовали липидные наночастицы (ЛНЧ), несущие мРНК Cas9 и нРНК, нацеленные на первый интрон гена альбумина мыши и AAV2/8, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, с помощью саморасщепляющегося пептида для вставки генов антител в локус альбумина мыши для экспрессии антител, как показано на фиг. 1 и более подробно описано ниже. AAV2/8 имеет геном AAV2 и белки rep, объединенные с капсидными белками AAV8. Последовательность, кодирующая тяжелую цепь, включала сегменты V_H, DH, и JH, а последовательность, кодирующая легкую цепь, включала генные сегменты VL легкой цепи и JL легкой цепи.

Стратегия вставки включала использование липидных наночастиц для доставки мРНК и нРНК Cas9 в печень мыши, чтобы вызвать двухцепочечный разрыв в первом интроне гена альбумина мыши. Структура гена альбумина подходит для нацеливания трансгена на интронные последовательности, поскольку его первый экзон кодирует секреторный пептид (сигнальный пептид или сигнальную последовательность), который отщепляется от конечного белкового продукта. Таким образом, интеграция кассеты без промотора, несущей акцептор сплайсинга, и трансген терапевтического антитела поддерживала экспрессию и секрецию трансгена терапевтического антитела. Затем AAV2/8, кодирующие легкую цепь и тяже- 67 048264 лую цепь антитела, смог интегрироваться в сайт двухцепочечного разрыва через путь негомологичного соединения концов (NHEJ), и ген антитела был транскрибирован эндогенным промотором альбумина, как показано на фиг. 1.

Геном AAV (pAAV-AlbSA-REGN4504; SEQ ID NO: 1), используемый в эксперименте, фланкирован двумя инвертированными концевыми повторами (ITR). AAV включал акцептор сплайсинга для первого интрона гена альбумина мыши (AlbSA; SEQ ID NO: 21), кДНК легкой цепи антитела REGN4504 (4504LC; SEQ ID NO: 2 (нуклеиновая кислота) и SEQ ID NO: 3 (белок)) с двумя дополнительными основаниями C для сохранения последовательности в правильной открытой рамке считывания, сайтом расщепления фурина (SEQ ID NO: 22 (нуклеиновая кислота) и SEQ ID NO: 23 (белок)), линкер, состоящий из аминокислот GSG, сигнальную последовательность Ror1 мыши (mRORss; SEQ ID NO: 31 или 32 (нуклеиновая кислота) и SEQ ID NO: 33 (белок)), последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела REGN4504 (4504HC; SEQ ID NO: 4 (нуклеиновая кислота) и SEQ ID NO: 5 (белок)), короткой формы посттранскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурка (sWPRE; SEQ ID NO: 36) и поли(А) SV40 (SV40polyA; SEQ ID NO: 37). Кодирующая последовательность для донорной конструкции, интегрированной в локус альбумина мыши (включая эндогенный экзон 1 эндогенного альбумина мыши: mAlbss-LC-P2A-mRORss-HC REGN4504), представлена в SEQ ID NO: 115.

В первом эксперименте донорная последовательность AAV представляла собой донорную последовательность антитела к Env (Zika) AAV2/8 AlbSA 4504, указанную в SEQ ID NO: 1. Донор включал легкую цепь антитела перед тяжелой цепью антитела, связанную саморасщепляющимся пептидом P2A. Идентификаторы последовательностей для последовательностей представлены в табл. 3 ниже.

Таблица 3

Последовательности антител к вирусу Зика (REGN 4504)

Последовательность	Белок SEQ ID NO	ДНК SEQ ID NO
Легкая цепь	3	2
Вариабельная область легкой цепи	104	103
CDR1 легкой цепи	64	85
CDR2 легкой цепи	65	86
CDR3 легкой цепи	66	87
Тяжелая цепь	5	4
Вариабельная область тяжелой цепи	106	105
CDR1 тяжелой цепи	67	88
CDR2 тяжелой цепи	68	89
CDR3 тяжелой цепи	69	90

Липидные наночастицы были разработаны для доставки двух разных версий направляющих РНК, нацеленных на интрон 1 локуса альбумина мыши. Первая версия (нРНК 1 версия 1) была модифицирована N-cap и содержала 2'-O-метuльные аналоги и 3'-фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в первых трех 5'- и 3'-концевых остатках РНК. Вторая версия (нРНК 1 версии 2) была модифицирована таким образом, что все 2'OH группы, которые не взаимодействуют с белком Cas9, были заменены на 2'-Oметиловые аналоги, а хвостовая часть направляющей РНК, которая имеет минимальное взаимодействие с белком Cas9, модифицирована 5'- и 3'-фосфоротиоатными межнуклеотидными связями. Кроме того, нацеленный на ДНК сегмент также имеет модификации 2'-фтор на некоторых основаниях.

Составы липидных наночастиц представлены в табл. 4. мРНК Cas9 (кэпированная и включающая модифицированный уридин) и нРНК (были включены в соотношении 1:1 по массе. ЛНЧ были приготовлены на настольном NANOASSEMBLER™. Наночастицы самособираются в микрожидкостные чипы.

- 68 048264

Таблица 4 Состав ЛНЧ

Липид	Молярное соотношение в смеси	Молекулярный вес (г/моль)
Dlin-MC3-DMA (МСЗ)	50	642,09
DSPC	10	790,14
Холестерин	38,5	386,65
PEG-DMG	1,5	2000

Дизайн эксперимента представлен на фиг. 2. На группу использовали по три мыши C57BL/6. Липидные наночастицы (ЛНЧ) вводили внутривенно в концентрации 1 мг/кг, а AAV AlbSA 4504 (3E11 ГВ/мышь) вводили совместно на 0 день. В эксперимент были включены три группы: (1) ЛНЧ, доставляющая мРНК Cas9 и первую версию направляющей РНК 1 v1 плюс AAV2/8 AlbSA 4504; (2) ЛНЧ, доставляющая мРНК Cas9 и вторую версию описанной выше направляющей РНК 1 плюс AAV2/8 AlbSA 4504; и (3) отрицательный контроль солевым раствором. Как показано на фиг. 2, инъекции ЛНЧ и AAV2/8 выполняли на 0 день. Заборы плазмы крови проводили на 7, 14 и 28 дни (т.е. на 1, 2 и 4 недели).

Получение аденоассоциированного вируса проводили с использованием метода тройной трансфекции клетками HEK293. См., например, Arden and Metzger (2016) J. Biol. Methods 3(2): e38, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей. Клетки высевали за один день до трансфекции, опосредованной PEFpro (Polyplus, Нью-Йорк, Нью-Йорк), соответствующими векторами, одной вспомогательной плазмидой, pHelper (Agilent, кат. № 240074), одной плазмидой, содержащей ген rep/cap AAV (pAAV RC2 (Cell biolabs, кат. № VPK-422), pAAV RC2/8 (Cell Biolabs, кат. № VPK-426) и одну плазмиду, обеспечивающую ITR AAV и трансген (pAAV-AlbSA-REGN4504; SEQ ID NO: 1). Через 72 часа после трансфекции среду собирали и клетки лизировали в буфере [50 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl и 0,5% дезоксихолат натрия (Sigma, кат. № D6750-100G)]. Затем бензоназу (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури) добавляли как к среде, так и к клеточному лизату до конечной концентрации 0,5 Ед/мкл перед инкубацией при 37°C в течение 60 мин. Лизат клеток центрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 минут. Лизат клеток и среду объединяли и осаждали PEG 8000 (Teknova, кат. № P4340) до конечной концентрации 8%. Осадок ресуспендировали в 400 мМ NaCl и центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут. Вирусы в супернатанте осаждали при помощи ультрацентрифугирования при 149000 g в течение 3 ч и титровали с помощью кПЦР.

Для количественной ПЦР для титрования геномов AAV образцы AAV обрабатывали ДНКазой (Thermofisher Scientific, кат. № EN0525) при 37°C в течение одного часа и лизировали с использованием набора DNA Extract All Reagents (Thermofisher Scientific, кат. № 4403319). Инкапсидированные вирусные геномы были количественно определены с использованием системы ПЦР в реальном времени QuantStudio 3. (Thermofisher Scientific) с использованием праймеров, направленных на ITR AAV2. Последовательности праймеров ITR AAV2 были 5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3' (прямой ITR; SEQ ID NO: 82) и 5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3' (обратный ITR; SEQ ID NO: 83), полученные из последовательности левого внутреннего инвертированного повтора (ITR) из AAV и последовательности правого внутреннего инвертированного повтора (ITR) из AAV, соответственно. Последовательность зонда ITR AAV2 представляла собой 5'-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 84). См., например, Aurnhammer et al. (2012) Hum. Gene Ther. Methods 23(1):18-28, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки для всех целей. После стадии активации 95°C в течение 10 мин проводили двухэтапный цикл ПЦР при 95°C в течение 15 с и 60°C в течение 30 с в течение 40 циклов. Универсальный мастер-микс для ПЦР TAQMAN (Thermofisher Scientific, кат. № 4304437) использовали для количественной ПЦР. ДНК-плазмиду (Agilent, кат. № 240074) использовали в качестве стандарта для определения абсолютных титров.

Для количественного определения титра антител в сыворотке был проведен анализ методом ИФА. Черные 96-луночные планшеты Maxisorp (ThermoFisher, № 437111) покрывали 1 мкг/мл козьего антитела AffiniPure к гамма-фрагменту IgG человека (Jackson ImmunoResearch, № 109-005-098) в течение ночи при 4°C. Планшет промывали промывочным буфером KPL (VWR, № 5151-0011), а затем блокировали блокирующим буфером с 3% BSA (SeraCare, № 5140-0008) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали 4 раза и затем инкубировали либо с очищенным антителом REGN4504 (Ат к вирусу Зика) в качестве стандарта, либо с сывороткой мыши в серийных разведениях 1:3 после начального разведения 1: 100 в 0,5% BSA, 0,05% Твин-20, растворе ADB (SeraCare, № 5140-0000, ThermoFisher, № 85114) в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации со стандартным антителом и сывороткой планшеты промывали 4 раза и инкубировали с конъюгированным с ПХ козьим антителом к IgG человека (ThermoFisher, № 31412) в соотношении 1:10000 в растворе ADB в течение 1 ч при комнатной температуре. Наконец, планшеты промывали 8 раз и затем проявляли с использованием субстрата SuperSignal

- 69 048264

ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (ThermoFisher, № 37070) с последующим считыванием на ридере

PerkinElmer 2030 Victor X3 Multilabel.

Совместная инъекция ЛНЧ и AAV приводила к примерно 1 мкг/мл экспрессии антител у мышей, которым вводили нРНК 1 версии 1, и 0,5 мкг/мл экспрессии антител у мышей, которым вводили нРНК1 версии 2 (фиг. 3). Экспрессия антител продолжала увеличиваться до 4 недели. Совместная инъекция ЛНЧ с нРНК 1 версии 1 и AAV2/8-AlbSA-REGN4504 привела к экспрессии антител около 10 мкг/мл на 4 неделе и 5 мкг/мл антитела у мышей, которым вводили нРНК 1 версии 2 (фиг. 3). ЛНЧ с первой версией направляющей РНК (N-кэпированная нРНК) работали лучше, чем вторая версия направляющей РНК. Десять мкг/мл антител в сыворотке достигают терапевтического окна при многих заболеваниях, например, инфекционных. Антитела, экспрессируемые из интегрированного AAV, могут защищать мышей от летального заражения вирусом Зика, гриппа или другими возбудителями инфекционных заболеваний.

Чтобы определить, было ли антитело, полученное из интегрированного AAV, функциональным и имело ли оно нейтрализующую активность против вируса Зика, был проведен анализ нейтрализации вируса Зика с использованием образцов плазмы, взятых через четыре недели после инъекции ЛНЧ Cas9нРНК и донорной последовательностью антитела к вирусу Зика AAV2/8 AlbSA 4504. Десять тысяч клеток Vero (кат. № CCL-81, ATCC, Манассас, штат Вирджиния) высевали на лунку в полную среду DMEM (10% FBS, PSG) (кат. № 10313-021, Life Technologies, Карлсбад, штат Калифорния) в черные 96луночные планшеты с прозрачным дном для культуры клеток (кат. № 3904, Corning, Тетерборо, штат Нью-Джерси), и инкубировали при 37°C, 5% CO₂, за один день до заражения. Затем 12 мкл сыворотки использовали в качестве отправной точки. Затем плазму разбавляли DMEM с коэффициентом разбавления 1:3, сохраняя общий объем 12 мкл. Двенадцать мкл 2,0Е+04 БОЕ/мл вируса MR766 (полученного из эталонной коллекции арбовирусов UTMB) инкубировали с плазмой и добавляли к клеткам после 30 минут инкубации. Через день после заражения клетки фиксировали ледяной смесью метанола и ацетона в соотношении 1: 1 в течение 30 мин при 4°C, пермеабилизировали с помощью PBS, содержащего 5% FBS и 0,1% Тритон-X, в течение 15 мин при комнатной температуре, блокировали с PBS+5% FBS в течение 30 мин при комнатной температуре, окрашенные первичным антителом (асцитная жидкость, иммунизированных вирусом Зика мышами, полученная из Медицинского отделения Техасского университета в разведении 1:10000 в PBS+5% FBS) в течение 1 ч при комнатной температуре, и инкубировали со вторичным антителом (1 мкг/мл конъюгированного с Alexa Fluor 488 козьего антимышиного антитела в PBS+5% FBS, кат. № A11001, ThermoFisher, Уолтем, штат Массачусетс) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты считывали на планшетном ридере Spectramax i3 (кат. № 353701346, Molecular Devices) с модулем MiniMax. Антитела в сыворотке мышей не обладали нейтрализующей активностью (фиг. 4).

Вестерн-блоттинг использовали для оценки качества антител в сыворотке из терминального забора крови. Вкратце, 15 мкг сыворотки разводили в буфере для образцов NuPAGE LDS (ThermoFisher, № NP0007) с восстанавливающим агентом для образцов NuPAGE (ThermoFisher, № NP0009) и без него и инкубировали при 70°C в течение 10 мин. Затем образцы загружали в гели NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels (ThermoFisher, № NP0321BOX) и прогоняли в течение около 35 мин при 200 В в рабочем буфере NuPAGE MOPS SDS (ThermoFisher, № NP0001). В качестве лэддера использовали MagicMark Western Standard (ThermoFisher, № LC5602), а в качестве положительного контроля для геля использовали REGN4504 (антитела к вирусу Зика). Гель переносили в iBlot2 PVDF MiniStacks (ThermoFisher, № IB24002) с помощью системы для сухого блоттинга iBlot2 (ThermoFisher, № IB21001). Мембрану блокировали в 5% молоке (VWR, № M203-10G-10PK) в TBST (ThermoFisher, № 28360) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем зондировали конъюгированным с ПХ козьими антителами к IgG человека (ThermoFisher, № 31412) в соотношении 1:5000 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем блот проявляли с использованием субстрата с максимальной чувствительностью SuperSignal West Femto (ThermoFisher, № 34095) и затем визуализировали на системе визуализации BioRad ChemiDoc MP. Вестерн-блоттинг показал, что экспрессия легкой цепи является ненормальной, и предположил, что легкая цепь была неправильно расщеплена (фиг. 5).

Вставка антител в локус альбумина мыши у готовых к Cas9 мышей

После первоначальной экспериментальной проверки концепции был разработан трансген для нацеленной независимо от гомологии опосредованной вставкой однонаправленной нацеленной вставки AAVREGN4446 в первый интрон гена альбумина мыши у готовых к Cas9 мышей (фиг. 6). Готовые к Cas9 мыши, которые имеют последовательность, кодирующую Cas9, интегрированную в первый интрон локуса Rosa26 генома мыши, описаны в US 2019/0032155 и WO 2019/028032, каждая из которых включена в полном объеме в данный документ посредством ссылки для всех целей.

В этой стратегии сегмент, кодирующий тяжелую цепь, находился выше сегмента, кодирующего легкую цепь (фиг. 6), поэтому секреция тяжелой цепи управлялась эндогенным сигналом секреции альбумина. Различные пептиды 2A, F2A (SEQ ID NO: 26 (нуклеиновая кислота) и 27 (белок)), P2A (SEQ ID NO: 24 (нуклеиновая кислота) и 25 (белок)) и T2A (SEQ ID NO: 28 (нуклеиновая кислота) и 29 (белок)), и как альбумин (SEQ ID NO: 34 (нуклеиновая кислота) и 35 (белок)), так и сигнальная последовательность Ror1 мыши (SEQ ID NO: 31 или 32 (нуклеиновая кислота) и 33 (белок)) были протестированы в отноше- 70 048264 нии управления экспрессией легкой цепи (фиг. 6). Кроме того, в отличие от описанного выше эксперимента с REGN4504 были удалены ITR. Четыре различные инсерционные конструкции ((1) нРНК1 AAV2/8.hU6. REGN4446 HC F2A Albss LC (SEQ ID NO: 6); (2) нРНК AAV2/8. hU6. REGN4446 HC P2A Albss LC (SEQ ID NO: 7); (3) нРНК1 AAV2/8.hU6. REGN4446 HC T2A Albss LC (SEQ ID NO: 8); и (4) нРНК1 AAV2/8.hU6. REGN4446 HC T2A RORss LC (SEQ ID NO: 9)) и две конструкции экспрессии эписомальных антител ((5) AAV2/8. CMV. REGN4446 LC T2A HC (SEQ ID NO: 11) и (6) AAV2/8.CASI.REGN4446 HC T2A LC (SEQ ID NO: 10)) вводили готовым к Cas9 мышам (табл. 5). Идентификаторы последовательностей для последовательностей представлены в табл. 6 ниже. Кодирующие последовательности для донорных конструкций, интегрированные в локус мышиного альбумина (включая эндогенный экзон мышиного альбумина 1: (1) mAlbss-HC-F2A-Albss-LC REGN4446; (2) mAlbss-HCP2A-Albss-LC REGN4446; (3) mAlbss-HC-T2A-Albss-LC REGN4446 и (4) mAlbss-HC-T2A-RORss-LC REGN4446) приведены в SEQ ID NO: 116-119, соответственно.

Таблица 5

Дизайн исследования для сравнения различных трансгенных форматов REGN4446 у готовых к Cas9 мышей

Группа	Вирус	ГВ/Мышь
1	Солевой раствор	-
2	AAV2/8.CMV.REGN4446 RORss LC T2ARORss НС	5.00Е+П
3	AAV2/8.CASI.REGN4446 Albss НС Т2А RORss LC	5.00Е+П
4	hPHKIvI AAV2/8.hU6 REGN4446 HC F2AAlbss LC	LOOE+12
5	hPHKIvl AAV2/8.hU6 REGN4446 НС P2A Albss LC	LOOE+12
6	hPHKIvI AAV2/8.hU6 REGN4446 HC T2AAlbss LC	LOOE+12
7	hPHKIvI AAV2/8.hU6 REGN4446 HC T2ARORss LC	LOOE+12

Таблица 6 Последовательности антител к вирусу Зика REGN4446

Последовательность	Белок SEQ ID NO	ДНК SEQ ID NO
Легкая цепь	13	12
Вариабельная область легкой цепи	108	107
CDR1 легкой цепи	70	91
CDR2 легкой цепи	71	92
CDR3 легкой цепи	72	93
Тяжелая цепь	15	14
Вариабельная область тяжелой цепи	ПО	109
CDR1 тяжелой цепи	73	94
CDR2 тяжелой цепи	74	95
CDR3 тяжелой цепи	75	96

Дизайн эксперимента представлена на фиг. 7. В каждой группе использовали трех мышей-самцов pRosa26@XbaI-loxP-Cas9-2A-eGFP (2600KO/3040WT) в возрасте 7-11 недель. AAV2/8 вводили на 0 день (внутривенная инъекция 200 мкл). Как показано на фиг. 7, инъекции AAV2/8 производились на 0 день, а заборы сыворотки крови производили на 10 день, 28 день или 56 день. Мышей выводили из эксперимента на 70 день после инъекции для дальнейшего анализа. Тесты, проведенные после отбора крови из сыворотки, включали ИФА для определения титра (hIgG; фиг. 8), ИФА для определения связывания (вирус Зика; фиг. 10), вестерн-блоттинг для определения качества антител (фиг. 9) и анализы нейтрализации для определения функциональности (фиг. 11). Также проводили анализы мышиных антител к человеческим антителам (MAHA) (данные не показаны).

Конструкции для экспрессии эписомальных антител приводили к титрам антител в сыворотке мышей от около 100 мкг/мл до 1000 мкг/мл после 28-го дня. Вставленные AAV с сигнальной последовательностью альбумина перед легкой цепью приводили к экспрессии антитела около 5 мкг/мл. Неожиданно, интегрированный AAV с сигнальной последовательностью mRor1 перед легкой цепью экспрессировал около 1000 мкг/мл антитела в сыворотке мыши (фиг. 8). Титры с использованием сигнальной после- 71 048264 довательности ROR перед легкой цепью были значительно выше, чем титры с использованием сигнальной последовательности альбумина выше легкой цепи. Вестерн-блоттинг продемонстрировал, что молекулярная масса тяжелой цепи и легкой цепи антитела, экспрессируемого из интегрированного AAV, была аналогична очищенному антителу (фиг. 9).

ИФА использовали для измерения аффинности связывания антител, экспрессируемых из эписомального AAV и интегрированного AAV. Вирус Зика (prM80E)-mmh (партия № REGN4233-L4 5/12/16 PBSG 0,279 мг/мл) инкубировали в черных 96-луночных планшетах Maxisorp (ThermoFisher, № 437111) в течение ночи при 4°C. Затем планшет промывали промывочным буфером KPL (VWR, № 5151-0011), а затем блокировали блокирующим буфером с 3% BSA (SeraCare, № 5140-0008) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали 4 раза и затем инкубировали либо с очищенным антителом REGN4446 (Ат к вирусу Зика) в качестве стандарта, либо с сывороткой мыши (из проб терминального забора крови) в серийных разведениях 1:3 после начального разведения 1: 100 в 0,5% BSA, 0,05% Твин20, растворе ADB (SeraCare, № 5140-0000, ThermoFisher, № 85114) в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации со стандартным антителом и сывороткой планшеты промывали 4 раза и инкубировали с конъюгированным с ПХ козьим антителом к IgG человека (ThermoFisher, № 31412) в соотношении 1:10000 в растворе ADB в течение 1 ч при комнатной температуре. Наконец, планшеты промывали 8 раз и затем проявляли с использованием субстрата SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (ThermoFisher, № 37070) с последующим считыванием на ридере PerkinElmer 2030 Victor X3 Multilabel. ИФА продемонстрировал, что связывающая способность антител, экспрессируемых как из эписомальных AAV, так и из интегрированных AAV, сравнима с очищенным REGN4446 (фиг. 10).

Чтобы определить, являются ли антитела, продуцируемые мышами, функциональными, был проведен анализ нейтрализации вируса Зика с сыворотками из терминального забора крови. Анализ нейтрализации вируса Зика (проведенный, как описано для фиг. 4) показал, что нейтрализующие активности антител, экспрессируемых как из эписомальных AAV, так и из интегрированных AAV, были аналогичны очищенному REGN4446 (фиг. 11). Анализ инделей методом NGS у мышей, умерщвленных для сбора тканей, продемонстрировал, что частоты инделей (вызванные разрезанием Cas9/нРНК1 в первом интроне гена альбумина) аналогичны у мышей, которым вводили конструкции вставки, в то время как мыши, которым вводили физиологический раствор и эписомальный AAV, имели фоновые частот инделей (фиг. 12А). кПЦР TAQMAN qPCR с одним связыванием праймера с экзоном 1 альбумина и одним связыванием с тяжелой цепью антитела показала, что уровни мРНК антител были сходными, что указывает на то, что сигнальная последовательность mRor1 перед легкой цепью способствует продукции антитела более чем на 2 log в печени мыши (фиг. 12B). Сравнивая T2A/Albss и T2A/RORss, в которых единственное различие между двумя конструкциями заключается в сигнальной последовательности выше кодирующей последовательности легкой цепи, оказывается, что RORss значительно способствует секреции антител по сравнению с сигнальной последовательностью альбумина. Сравните фиг. 8 с фиг. 12В.

Вставка двух AAV-опосредованных антител в ген альбумина

Как показано выше, вставка генов антител в интрон 1 локуса мышиного альбумина у готовых к Cas9 мышей приводило к высокому уровню экспрессии антител. Для выполнения вставки в организмы, не готовые к Cas9, можно использовать другой AAV, несущий кассету экспрессии Cas9. Поскольку кДНК Cas9 (4,1 т.п.н.) близка к упаковочной способности AAV), мы сначала проверили несколько небольших промоторов, которые могли бы поместиться в конструкцию AAV/Cas9 и управлять экспрессией Cas9 в печени.

Небольшой промотор tRNAGln (SEQ ID NO: 38) использовали для управления экспрессией направляющей РНК, нацеленной на ген-мишень 1. Четыре промотора были протестированы в отношении управления экспрессией Cas9: (1) фактор элонгации 1 альфа-короткий (EF) (SEQ ID NO: 40); (2) обезьяний вирус 40 (SV40) (SEQ ID NO: 41); и два синтетических промотора ((3) промотор ранней области 2 (E2P) (SEQ ID NO: 42) и (4) серпин AP (SEQ ID NO: 43)). Синтетические промоторы состояли из специфического для печени энхансера-E2 из вируса HBV (SEQ ID NO: 44) или энхансера серпина A из гена серпина A (SEQ ID NO: 45) - и корового промотора (SEQ ID NO: 46) (фиг. 13).

1E12 ГВ вирусов AAV2/8, несущих нРНК tRNAGln и Cas9, управляемые четырьмя разными промоторами (tGln нРНК EF Cas9 (SEQ ID NO: 47), tGln нРНК SV40 Cas9 (SEQ ID NO: 48), tGln нРНК E2P Cas9 (SEQ ID NO: 49) и tGln нРНК Серпин AP Cas9 (SEQ ID NO: 50)) инъецировали мышам. Были протестированы пять групп: (1) контрольный солевой раствор; (2) нРНК AAV2/8.tGln e2P Cas9; (3) нРНК Серпин AP Cas9 AAV2/8.tGln; (4) нРНК AAV2/8.tGln Efs Cas9; и (5) нРНК AAV2/8.tGln SV40p Cas9.

Через пять недель брали сыворотку и анализировали уровни целевого белка 1 с помощью ИФА в соответствии с протоколом производителя (фиг. 14). Уровни целевого белка 1 были снижены у мышей, которым вводили синтетические промоторы, при этом промотор серпина A, по-видимому, работал лучше всего (фиг. 14).

Затем мы вводили два AAV, либо 5E11 ГВ, либо 1E12 ГВ/мышь AAV2/8.SerpinAP.Cas9 (SEQ ID NO: 39) и 1E12 ГВ/мышь AAV2/8.hU6gRNA1.REGN4446 HC T2A mRORss LC (SEQ ID NO: 9) самкам мышей C57BL/6 в возрасте 5 недель или самкам мышей BALB/c в возрасте 8 недель. Использовали по три мыши на группу. Дизайн эксперимента представлен на фиг. 20 и в табл. 7.

- 72 048264

Таблица 7

Дизайн исследования

Группа	Вирус	Эписомальный, ГВ/Мышь	Cas9, ГВ/ Мышь	нРНК и REGN4446, ГВ/Мышь
1	Солевой раствор	-	-	-
2	AAV2/8.hU6.gRNAl .REGN444 6HC.T2A.RoRss.LC	-	-	L00E+12
3	AAV2/8 CASIREGN4446 НС T2A.RoRss.LC_LOW	5.00E+11	-	-
4	AAV2/8.ScrpinAP.mspCas9.SV 40pA_LOW	—	5.00Е+11	1.00Е+12
5	AAV2/8.SerpinAP.mspCas9.SV 40pA_HIGH	—	1.00Е+12	L00E+12

Последовательность, кодирующая нРНК1, была включена в REGN4446 HC T2A mRORss LC AAV вместо Cas9 AAV, чтобы только клетки, инфицированные обоими AAV, имели инсерции и вставку гена антитела. Эписомальный AAV2/8.CASI.REGN4446 HC T2A LC (SEQ ID NO: 10) использовали в качестве положительного контроля. Через четыре недели после инъекции уровень экспрессии антител в группах с высоким титром AAV2/8.SerpinAP.Cas9 составлял около 100 мкг/мл, в то время как в группе с низким титром у мышей C57BL/6 был около 50 мкг/мл (фиг. 15), в то время как инъецированные AAV2/8.hU6gRNA1v1.REGN4446 HC T2A mRORss LC мыши (без инъекции Cas9 AAV) не имели экспрессии антител. Продолжительность для группы с высоким титром была увеличена до 118 дней для мышей, которым инъецировали AAV2/8, SerpinAP.Cas9 (SEQ ID NO: 39; 1E12 ГВ/ мышь) и AAV2/8.hU6gRNA1.REGN4446 HC T2A mRORss LC (SEQ ID NO: 9; 1E12 ГВ/мышь) и для мышей, которым вводили эписомальный AAV2/8.CASI.REGN4446 (5E11 ГВ/мышь). Использовали как мышей C57BL/6, так и мышей BALB/c. Через 118 дней после инъекции уровень экспрессии антител у мышей, которым для интеграции вводили AAV2/8, SerpinAP.Cas9 (SEQ ID NO: 39) и AAV2/8.hU6gRNA1.REGN4446 HC T2A mRORss LC (SEQ ID NO: 9), приближался к 1000 мкг/мл и был эквивалентен уровню экспрессии антител в эписомальной контрольной группе AAV2/8.CASI.REGN4446 HC T2A LC (SEQ ID NO: 10) у мышей C57BL/6 (фиг. 18, левая панель). Такая же тенденция наблюдалась и у мышей BALB/c - стойкое повышение уровней антител (человеческого IgG) наблюдалось с течением времени, приближаясь к уровням экспрессии в эписомальной контрольной группе (фиг. 18, правая панель), что свидетельствует о том, что эти результаты не были специфичными для линии.

Чтобы определить, являются ли антитела, продуцируемые мышами, функциональными, был проведен анализ нейтрализации вируса Зика с использованием сыворотки с 28-го дня из группы с высоким титром на фиг. 15. Анализ нейтрализации вируса Зика (проведенный, как описано для фиг. 4) показал, что антитела, полученные этим методом, нейтрализовали вирус Зика в равной степени с очищенным REGN4446 (фиг. 16). Кроме того, способность к связыванию (связывание с белком оболочки вируса Зика) оценивали, как описано выше, для сравнения связывания очищенного REGN4446 с антителом, экспрессируемым из эписомального AAV или после опосредованной Cas9 интеграции AAV. ИФА продемонстрировал, что связывающая способность антител, экспрессируемых как из эписомальных AAV, так и из интегрированных AAV, сравнима с очищенным REGN4446. См. фиг. 19. Таким образом, моноклональные антитела, экспрессируемые с помощью стратегий эписомы и вставки, были функционально эквивалентны CHO-продуцируемым очищенным антителам по оценке как анализами связывания, так и анализами нейтрализации. Количественная оценка результатов связывания и нейтрализации представлена в табл. 8 ниже.

- 73 048264

Таблица 8

Эписомальные и вставленные в печень моноклональные антитела к вирусу Зика эквивалентны CHO-продуцируемым очищенным антителам in vitro и у мышей дикого типа

Трансгенный формат - Линия	Связывание, ЕС50	Нейтрализация, ЕС50
Сыворотка с солевым раствором+очищенный REGN4446	2.53Е-10	6.87Е-10
Эписомальный - C57BL/6	2.96Е-10	4.69Е-10
Эписомальный - BALB/c	5.21Е-10	6.05Е-10
Вставленный - C57BL/6	3.10Е-10	4.32Е-10
Вставленный - BALB/c	1.62Е-10	8.49Е-10

Для нейтрализации клетки Vero высевали за 1 день до инфицирования из расчета 10000 клеток/лунку в полную среду DMEM (10% FBS, PSG) в черные 96-луночные планшеты с прозрачным дном для культуры клеток и инкубировали при 37°C, 5% CO2 до момента заражения. В день инфицирования образцы сыворотки мышей разводили в средах для заражения DMEM (2% FBS, PSG) до двухкратной их конечной концентрации в реакции нейтрализации. Сыворотку добавляли к среде до начальной концентрации 12 мкл сыворотки на лунку нейтрализации (24 мкл сыворотки на разведение, что даст 12 мкл/сыворотку в лунке конечной нейтрализации при объединении 1:1 с вирусом). Затем образцы серийно разводили в 3 раза на 96-луночном микротитрационном планшете с V-образным дном для получения в общей сложности 11 концентраций сыворотки, заканчивая 0,0002 мкл сыворотки на лунку нейтрализации. Контрольное антитело REGN4446 (партия H4yH25703N) также разводили в среде для заражения DMEM до двукратной их конечной концентрации в реакции нейтрализации вместе с сывороткой от мыши, которой вводили носитель, до начальной концентрации 5 мкг/мл (3,33E-08 M, или 33,33 нМ) в реакции нейтрализации и серийно разводили в 3 раза на 96-луночном микротитрационном планшете, получая в общей сложности 11 разведений, заканчивая 0,00008 мкг/мл (5,65E-13 M или 565 фМ). Также были приготовлены контрольные лунки, содержащие среду для заражения DMEM или среду для заражения DMEM, смешанную с максимальным объемом сыворотки, использованной в анализе, чтобы обеспечить неинфицированные и инфицированные контрольные сыворотки/среды. Вирус был приготовлен разбавлением вируса MR766 (полученного из эталонной коллекции арбовирусов UTMB и размноженного в клетках Vero до пассажа 3) от его исходной концентрации 2,0E+06 БОЕ/мл в среде для заражения DMEM, чтобы получить множественность заражения 2 БОЕ/клетку, или 20000 КОЕ/лунку для нейтрализации. Разведения антител и сыворотки объединяли 1:1 с разведенным вирусом в 96-луночном микротитрационном планшете с V-образным дном и инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 30 минут. Затем к клеткам добавляли разведения вируса/антитела/сыворотки. После 1 часа инкубации инокулят удаляли, клетки покрывали 100 мкл DMEM+1% FBS, PSG, 1% метилцеллюлозы и инкубировали в течение ночи (16-20 часов) при 37°C, 5% CO₂. Покрытие из метилцеллюлозы удаляли с клеток и их дважды промывали PBS. Затем клетки фиксировали, окрашивали и количественно определяли в соответствии с протоколом, приведенным на фиг. 4. Результаты показаны на фиг. 21, которая демонстрирует эквивалентную нейтрализацию эписомальными антителами к вирусу Зика и вставленными в печень антителами в сыворотке от мышей, которым инъецировали AAV. Эписомальные и вставленные в печень моноклональные антитела к вирусу Зика в сыворотке мышей C57BL/6 и BALB/c были функционально эквивалентны СНО-очищенным антителам, введенным в сыворотку наивных мышей.

Для проверки функциональности моноклональных антител, продуцируемых либо с помощью эписомальной, либо двойной стратегии вставки AAV, использовали модель заражения вирусом Зика in vivo. См. фиг. 22. Самок мышей с нокаутом по альфа- и бета-рецепторам 1 (IFNAR) в возрасте от 10 до 11 недель делили на 7 групп по N=4 мышей. Группы получали либо инъекцию (1) PBS; (2) AAV2/8 для эписомальной экспрессии контрольного антитела с нецелевым связыванием, управляемого промотором CAG; (3) низкую дозу (1,0E+11 ГВ/мышь) или (4) высокую дозу (5,0E+11 ГВ/мышь) AAV2/8.CASI.REGN4446 HC T2A LC (SEQ ID NO: 10) для эписомальной экспрессии антитела к вирусу Зика REGN4446; (5) низкую дозу (5,0E+11 ГВ/мышь/вектор) или (6) высокую дозу (1,0E+12 ГВ/мышь/вектор) обоих AAV2/8. SerpinAP.Cas9 (SEQ ID NO: 39) и AAV2/8.hU6gRNA1.REGN4446 HC T2A mRORss LC (SEQ ID NO: 9; 1E12 ГВ/мышь) для экспрессии в печени антитела к вирусу Зика REGN4446; или (7) 200 мкг СНО-очищенного антитела к вирусу Зика REGN4446. Группам (1)-(6) вводили внутривенно при помощи инъекции в хвостовую вену. Группам (5) и (6) вводили за 21 день до начала заражения. Группа (1)-(4) вводили за 14 дней до контрольного заражения. Группе (7) вводили подкожную инъекцию за 2 дня до контрольного заражения. За день до заражения у всех мышей осуществляли забор крови из ретроорбитального синуса и собирали сыворотку, чтобы запустить ИФА на человеческий FC и определить титры циркулирующих человеческих моноклональных антител (либо нецелевой контроль, либо REGN4446) у каждой мыши. Мышей взвешивали перед контрольным заражением и затем

- 74 048264 внутрибрюшинно инфицировали 10⁵ БОЕ вируса FSS13025. Затем мышей взвешивали каждые 24 часа в течение 14 дней после доставки вируса Зика. Мышей умерщвляли, когда потеря массы достигала > 20% от массы в день заражения. Все оставшиеся мыши были умерщвлены на 14-й день.

На фиг. 23 показан титр hIgG, обнаруженный с помощью ИФА на FC у каждого животного за сутки до заражения. Высота каждой полосы представляет собой средний титр для каждой группы, где каждая точка представляет титр для отдельного животного в этой группе. Тот же протокол ИФА на FC, представленный на фиг. 3, применяли для сывороток, собранных у каждой мыши. Расчетная выживаемость представлена пунктирными линиями на основании предшествующих экспериментов с заражением с использованием СНО-очищенных антител к вирусу Зика REGN4504 или REGN4446. Эписомальные инъекции и инъекции PBS выполняли за 14 дней до заражения, а вставку (двойной AAV) выполняли за 21 день до заражения. Группе, очищенной СНО, инъецировали 200 мкг REGN4446 за два дня до контрольного заражения.

На фиг. 24A показаны данные о выживаемости животных, сгруппированных по доставленным ГВ/мышь. Как показано на фиг. 23, для каждой группы доз существует высокая вариабельность количества циркулирующих мкАт, измеренных за 1 день до заражения, особенно в эписомальных группах. Кроме того, в каждой группе было по четыре мыши. Следовательно, другой способ взглянуть на данные - сгруппировать мышей по количеству циркулирующих мкАт во время заражения, а не по типу доставки и дозе AAV, как показано на фиг. 24B. На фиг. 24B показаны данные с фиг. 24A, перегруппированные таким образом, что животные сгруппированы по титру циркулирующего AAV-доставленного REGN4446 независимо от того, был ли он доставлен с помощью эписомы или стратегии двойного AAV в высокой или низкой дозе. Значения в таблице в верхней части фиг. 24B представляют собой уровни мкАт, измеренные за 1 день до заражения в мкг/мл, а кодирование - это тип AAV, который доставлял матрицу мкАт (либо одиночный AAV для эписомальной экспрессии, либо двойной AAV для Cas9-опосредованной интеграции и низкая или высокая доза для любого из них). Хотя ответ на дозу неясен, данные, нанесенные на график и сгруппированные по типу AAV, доставляемого, как на фиг. 24A, так и на фиг. 24B, демонстрируют, что мы получали функциональные мкАт, которые демонстрировали ответ дозозависимый ответ на заражение.

Пример 2. Вставка генов антител к гемагглютинину или антител к PcrV в локус альбумина мыши

Та же стратегия используется для интеграции и экспрессии антител к гемагглютинину (антитело к НА; грипп) или антител к PcrV (Pseudomonas aeruginosa). См., например, WO 2016/100807, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. Затем проводятся тесты, чтобы определить, предотвращают ли антитела, экспрессируемые из локуса альбумина, инфицирование мышей.

В первом эксперименте донорная последовательность AAV представляла собой донорную последовательность антитела к НА (гриппа) AAV2/8 AlbSA 3263, указанную в SEQ ID NO: 16. Донор включал легкую цепь антитела и тяжелую цепь антитела, связанную саморасщепляющимся пептидом P2A. Идентификаторы последовательностей для последовательностей представлены в табл. 9 ниже. См. также WO 2016/100807 (H1H11729P), полностью включенную в данный документ посредством ссылки для всех целей. Кодирующая последовательность для донорной конструкции, интегрированной в локус альбумина мыши (включая эндогенный экзон 1 альбумина мыши: mAlbss-LC-P2A-HC REGN3263), указанный в SEQ ID NO: 120.

Таблица 9 Последовательности антител к НА (REGN3263)

Последовательность	Белок SEQ ID NO	ДНК SEQ ID NO
Легкая цепь	18	17
Вариабельная область легкой цепи	112	111
CDR1 легкой цепи	76	97
CDR2 легкой цепи	77	98
CDR3 легкой цепи	78	99
Тяжелая цепь	20	19
Вариабельная область тяжелой цепи	114	113
CDR1 тяжелой цепи	79	100
CDR2 тяжелой цепи	80	101
CDR3 тяжелой цепи	81	102

Дизайн эксперимента для первого эксперимента (антитело к НА) представлен на фиг. 17. На группу

- 75 048264 использовали пять мышей C57BL/6. Липидные наночастицы (ЛНЧ) вводят в концентрации 2 мг/кг, а AAV AlbSA 3263 (3E11) или AAV CMV 3263 (1E11) вводят на 0 день без ЛНЧ или с совместной инъекцией ЛНЧ на 0 день. В эксперимент включены шесть групп: (1) ЛНЧ, доставляющая мРНК Cas9 и нРНК 1 версии 1 плюс AAV2/8 AlbSA 3263; (2) только AAV2/8 AlbSA 3263; (3) только AAV2/8 CMV 3263; (4) инъекция антитела REGN 3263 (высокая доза); (5) инъекция антитела REGN3263 (низкая доза); и (6) отрицательный контроль с солевым раствором. Как показано на фиг. 17, инъекции ЛНЧ и AAV2/8 производятся на 0 день, а инъекции антител (положительные контроли с высокой и низкой дозой) - на 9 день. Заборы плазмы крови проводили на 7-й день (т.е. на 1-ю неделю). После этого вводят вирус гриппа, чтобы проверить, предотвращают ли антитела, экспрессируемые из локуса альбумина, инфицирование мышей.

Чтобы продемонстрировать экспрессию дополнительных моноклональных антител с использованием как эписомальной, так и двойной стратегии AAV, самкам мышей C57BL/6 (возраст 9 недель) инъецировали одно из 3 мкАт в эписомальном формате AAV2/8: (1) AAV2/8.CASI. REGN4446 HC T2A LC (SEQ ID NO: 10); (2) H1H29339P к PcrV (промотор CAG HC_T2A_RORss_LC); или (3) H1H11829N2 к HA (промотор CAG LC_T2A_RORss_HC). REGN4446 представляет собой суперневидимый формат IgG4. См., например, US 10556952, полностью включенный в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. H1H29339P и H1H11829N2 представляют собой форматы IgG1. Идентификаторы последовательностей для последовательностей антитела H1H11829N2 представлены в табл. 10 ниже. См. также WO 2016/100807, полностью включенную в данный документ посредством ссылки для всех целей. Вирус доставляли в дозе 1E12 ГВ/мышь при помощи инъекции в хвостовую вену. У мышей осуществляли забор крови из ретроорбитального синуса, и сыворотку собирали для анализа на 5, 20 и 30 день. Титры циркулирующих человеческих IgG измеряли с помощью ИФА на FC. Тот же протокол ИФА на FC, представленный на фиг. 3, применяли для сывороток, собранных у каждой мыши. Соответствующий очищенный СНО белок, соответствующий каждому мкАт, использовали для построения стандартных кривых для каждого набора образцов сыворотки независимо. На фиг. 25 показаны только значения для первого момента времени.

Таблица 10

Последовательности антител к НА (H1H11829N2)

Последовательность	Белок SEQ ID NO	Днк SEQ ID NO
Легкая цепь	126	125
Вариабельная область легкой цепи	142	141
CDR1 легкой цепи	129	135
CDR2 легкой цепи	130	136
CDR3 легкой цепи	131	137
Тяжелая цепь	128	127
Вариабельная область тяжелой цепи	144	143
CDR1 тяжелой цепи	132	138
CDR2 тяжелой цепи	133	139
CDR3 тяжелой цепи	134	140

Кроме того, самкам мышей pRosa26@XbaI-loxP-Cas9-2A-eGFP (возраст 22 недели) инъецировали AAV2/8, несущий нРНК1 и одну из двух кассет экспрессии антител: (1) H1H29339P к PcrV (HC_T2A_RORss_LC); или (2) H1H11829N2 к HA (LC_T2A_RORss_HC) (SEQ ID NO: 145). Вирус доставляли в дозе 1E12 ГВ/мышь при помощи инъекции в хвостовую вену. У мышей осуществляли забор крови из ретроорбитального синуса, и сыворотку собирали для анализа на 12, 27 и 37 день. Титры циркулирующих человеческих IgG измеряли с помощью ИФА на FC. Тот же протокол ИФА на FC, представленный на фиг. 3, применяли для сывороток, собранных у каждой мыши. Соответствующий очищенный СНО белок, соответствующий каждому мкАт, использовали для построения стандартных кривых для каждого набора образцов сыворотки независимо. На фиг. 25 показаны только значения для первого момента времени. Отображаются значения hIgG, обнаруженные с помощью ИФА на FC человека для отдельных самок мышей pRosa26@XbaI-loxP-Cas9-2A-eGFP (возраст 22 недели), которым инъецировали AAV2/8, несущий нРНК1 и кассету экспрессии H1H29339P к PcrV (HC_T2A_RORss_LC) в табл. 11. Данные на фиг. 25 демонстрируют, что, как и антитела к вирусу Зика, моноклональные антитела к PcrV и HA могут экспрессироваться in vivo с использованием AAV-опосредованных стратегий вставки.

- 76 048264

Таблица 11 Значения hIgG

Образец PcrV	Титр D12 (мкг/мл)	Титр D27 (мкг/мл)	Титр D37 (мкг/мл)
Вставленный 1	412,65	602,74	1017,94
Вставленный 2	617,43	904,37	1081,30
Вставленный 3	308,00	408,60	1000,25

На фиг. 26 и 27, соответственно, показаны данные связывания и нейтрализации/цитотоксичности для сывороточных мкАт к PcrV H1H29339P от мышей в описанном выше эксперименте. Образцы включали СНО-очищенное H1H29339P, добавленное в PBS, СНО-очищенное H1H29339P, добавленное в сыворотку мыши, инъецированную носителем, сыворотку мыши, инъецированной мкАт к вирусу Зика REGN4446 в эписомальном формате AAV2/8.CASI.REGN4446 HC T2A LC (SEQ ID NO: 10), сыворотку от мыши, инъецированной мкАт к PcrV H1H29339P в эписомальном формате (CAG HC_T2A_RORss_LC), и сыворотку от мыши, инъецированной мкАт к PcrV в формате вставки H1H29339P (HC_T2A_RORss_LC). Образцы для эписом были взяты из сыворотки крови через 5 дней после инъекции. Образец для вставки были взяты из сыворотки через 12 дней после инъекции. Эписомальные и вставленные в печень моноклональные антитела к PcrV оказались немного менее эффективными в связывании и нейтрализации по сравнению с СНО-продуцируемыми очищенными антителами in vitro. На фиг. 26 и в табл. 12 показано, что связывание эписомальных и вставленных в печень моноклональных антител к PcrV из сыворотки мышей немного слабее, чем СНО-продуцируемых моноклональных антител. На фиг. 27 и в табл. 12 показано, что нейтрализация эписомальных и вставленных в печень моноклональных антител к PcrV из сыворотки мышей находится в пределах 2-5 раз по сравнению с СНО-продуцируемыми моноклональными антителами.

Связывание методом ИФА анти-PcrV-содержащей сыворотки от доставки AAV к рекомбинантным белкам PcrV P. aeruginosa (фиг. 26) проводили следующим образом: 96-луночные планшеты MicroSorp покрывали 0,2 мкг на лунку рекомбинантного полноразмерного PcrV P. aeruginosa (GenScript) и инкубировали в течение ночи при 4°C. На следующее утро планшеты трижды промывали промывочным буфером (забуференный имидазолом солевой раствор с Твин-20) и блокировали в течение 2 часов при 25°C 200 мкл блокирующего буфера (3% BSA в PBS). Планшеты промывали один раз и титровали антитела к PcrV (в диапазоне от 333 нМ - 0,1 пМ с серийными разведениями 1:3 в 0,5% BSA/0,05% Твин-20/PBS) или разведениями сыворотки (начиная с разведения 1: 300 с серийными разведениями 1:3 в 0,5% BSA/0,05% Твин-20/PBS) добавляли в лунки, содержащие белок, и инкубировали в течение одного часа при 25°C. Лунки промывали трижды и затем инкубировали со 100 нг/мл вторичного конъюгированного с ПХ античеловеческого антитела на лунку в течение одного часа при 25°C. 100 мкл субстрата SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate добавляли в каждую лунку и детектировали сигнал (планшетном ридере Victor X3, Perkin Elmer). Значения люминесценции анализировали с помощью четырехпараметрического логистического уравнения по 12-точечной кривой ответа (GraphPad Prism).

Анализ нейтрализации/цитотоксичности для фиг. 27 выполняли следующим образом: клетки A549 высевали с плотностью приблизительно 5x105 клеток на мл в среде Хэма F-12K (с добавлением 10% инактивированного нагреванием FBS и L-глутамина) в черные 96-луночные планшеты с прозрачным дном для культуры клеток и инкубировали в течение ночи при 37°C с 5% CO2. На следующий день среду удаляли из клеток и заменяли на 100 мкл аналитической среды (DMEM без фенолового красного, с добавлением 10% инактивированной теплом FBS). Между тем, лог-фазу культуры штаммов P. aeruginosa 6077 (Джеральд Пьер, Бригам и женская больница, Гарвардский университет) готовили следующим образом: культуру P. aeruginosa в течение ночи выращивали в LB, разбавляли 1:50 свежим LB и выращивали до ОП₆₀₀, = ~ 1 при 37°C при встряхивании. Культуру один раз промывали аналитической средой и разбавляли до ОП₆₀₀=0,03 в PBS. Равный объем бактерий в 50 мкл был смешан с 50 мкл титров антител к PcrV (в диапазоне от 333 нМ до 17 пМ с серийными разведениями 1:3) или разведений сыворотки (начиная с разведения 1: 100 с серийными разведениями 1:3 и инкубировали в течение 30-45 мин при 25°C. Среду удаляли из клеток A549, заменяли 100 мкл смеси бактерии: Ат и инкубировали в течение двух часов при 37°C с 5% CO2. Гибель клеток определяли с помощью набора для анализа CytoTox-Glo™ (Promega). Значения люминесценции анализировали с помощью четырехпараметрического логистического уравнения по 10-точечной кривой ответа (GraphPad Prism).

- 77 048264

Таблица 12

Связывание и нейтрализация мкАт к PcrV

Трансгенный формат	Связывание, ЕС50	Нейтрализация, IC50
Эписомальный - антитело к вирусу Зика	2.04Е-07	~ 8.89Е-12
Очищенные антитела к PcrV в РВ S	6.83Е-11	5.15Е-10
Очищенные антитела к PcrV в сыворотке	L40E-10	3.07Е-09
Эписомальный - антитело к PcrV	9.13Е-10	6.48Е-09
Вставленный - антитело к PcrV	L18E-09	L40E-08

На фиг. 28 и 29, соответственно, показаны данные связывания и нейтрализации сывороточных мкАт к HA H1H11829N2 от мышей в описанном выше эксперименте. Образцы включали CHOочищенное H1H11829N2, добавленное в PBS, CHO-очищенное H1H11829N2, добавленное в сыворотку мыши, инъецированную носителем, сыворотку мыши, инъецированной мкАт к вирусу Зика REGN4446 в эписомальном формате AAV2/8.CASI.REGN4446 HC T2A LC (SEQ ID NO: 10), сыворотку от мыши, инъецированной мкАт к HA H1H11829N2 в эписомальном формате (CAG HC_T2A_RORss_LC), и сыворотку от мыши, инъецированной мкАт к HA в формате вставки H1H11829N2 (HC_T2A_RORss_LC) (SEQ ID NO: 145). Образцы для эписом были взяты из сыворотки крови через 5 дней после инъекции. Образец для вставки были взяты из сыворотки через 12 дней после инъекции. Изотипический контроль представляет собой CHO-очищенное антитело к FELD1. Эписомальные и вставленные в печень моноклональные антитела к НА были функционально эквивалентны CHO-продуцируемым очищенным антителам in vitro. На фиг. 28 показано сопоставимое связывание эписомальных и вставленных в печень моноклональных антител к НА в сыворотке мышей, а на фиг. 29 показана эквивалентная нейтрализация эписомальных и вставленных в печень моноклональных антител к НА в сыворотке мыши.

Клетки MDCK London высевали из расчета 40000 клеток/лунку в 50 мкл инфекционной среды (DMEM, содержащая 1% пирувата натрия, 0,21% раствор BSA с низким содержанием IgG и 0,5% гентамицина) в 96-луночный планшет. Клетки инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение четырех часов. Затем планшеты инфицировали 50 мкл H1N1 A/Puerto Rico/08/1934 при разведении 10^-4, осторожно постукивали и снова помещали при 37°C в 5% CO2 на 20 ч. Затем планшеты один раз промывали PBS, фиксировали 50 мкл 4% PFA в PBS и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Планшеты трижды промывали PBS и блокировали 300 мкл блокирующего буфера StartingBlock в течение одного часа при комнатной температуре. CHO-очищенное антитело к НА H1H11829N2, добавленное в PBS или сыворотку наивных мышей (начиная с концентрации антитела 100 мкг/мл), или сыворотку мышей, которым инъецировали AAV с эписомальным или вставленным антителом к HA H1H11892N2 или антителом к вирусу Зика REGN4446 в эписомальных форматах, титровали 1:4 до конечной концентрации 1,2E-4 мкг/мл в блокирующем буфере StartingBlock. После инкубации блокирующий буфер удаляли с планшетов, и разбавленные антитела добавляли к клеткам в количестве 75 мкл/лунку. Планшеты инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. После инкубации планшеты трижды промывали буфером для промывки (забуференный имидазолом солевой раствор и Tween® 20, разведенный до 1X в воде Milli-Q) и покрывали 75 мкл/лунку вторичного антитела (конъюгированного с ПХ ослиного антитела к IgG человека), разведенного 1:2000 в блокирующем буфере. Вторичный раствор инкубировали на планшетах в течение одного часа при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали буфером для промывки и добавляли 75 мкл/лунку проявляющего субстрата для ИФА Pico, приготовленного в соотношении 1:1. Планшеты немедленно считывали на люминесценцию при помощи планшетного ридера Molecular Devices Spectramax i3x.

Клетки MDCK London ранее 10 пассажа засевали с плотностью около 8х10³ клеток на лунку в среде MDCK (DMEM с добавлением 10% инактивированного нагреванием FBS HyClone, L-глутамина и гентамицина) в черные 96-луночные планшеты с прозрачным дном для культуры клеток и инкубировали в течение ночи при 37°C с 5% CO2. Сыворотку от мышей, которым инъецировали либо эписомальный формат, либо формат вставки антитела к НА H1H11829N2, разводили 1:10, а затем образцы серийно разводили в 6 раз в 96-луночном микротитрационном планшете с V-образным дном для получения в общей сложности 11 концентраций сыворотки. CHO-очищенное антитело к НА H1H11829N2 разводили в исходной мышиной сыворотке в качестве положительного контроля. CHO-очищенное антитело к FELD1 также добавляли в сыворотку наивных мышей в качестве отрицательного изотипического контроля в дозе 200 мкг/мл. Вирус гриппа A H1N1 A/PR/08/34 (ATCC, кат. № VR-1469, партия № 58101202) размораживали на льду, разбавляли непосредственно перед использованием и объединяли 1:1 с предварительно разведенными сывороточными антителами. Среду удаляли из клеток MDCK и заменяли 60 мкл смеси антитело: вирус в двух повторностях. Затем клетки инкубировали в течение 20 часов при 37°C, 5% CO2

- 78 048264 чтобы обеспечить образование бляшек. На следующий день смесь антитело: вирус аспирировали, клетки промывали и затем фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 минут. Затем планшеты промывали, блокировали 200 мкл блокирующего буфера (Life Technologies, кат. № 37538 и 0,1% Triton X-100) в течение 1 часа при комнатной температуре. Блокирующий буфер удаляли и добавляли 75 мкл разведенного первичного антитела (мышиное антитело к вирусу гриппа A NP Millipore, кат. № MAB8251) для инкубации в течение ночи при 4°C. Затем планшеты 2 раза промывали PBS и наносили вторичное антитело (козье антимышиное антитело, конъюгированное с AlexaFluor 488) на 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза PBS и сразу считывали с помощью CTL Universal Immunospot Analyzer. Планшеты визуализировали с помощью автоматической фокусировки, а неинфицированные контрольные лунки и лунки, содержащие только вирусы, использовали для установки минимальных и максимальных настроек флуоресценции. Флуоресцирующие очаги выбирали в качестве параметров для подсчета, и планшеты считывали. Затем данные наносили на график в GraphPad Prism как количество подсчитанных флуоресцирующих (инфицированных) клеток по сравнению с LOG M концентрации антитела.

Для проверки функциональности моноклональных антител к PcrV, продуцируемых либо с помощью эписомальной, либо двойной стратегии вставки AAV, использовали модель заражения вирусом Pseudomonas in vivo. См. фиг. 30. Самок мышей C57 BL/6NCrl-Elite и самок BALB/c-Elite (возраст 5 недель) делили на 10 групп по N=5 мышей/группу/вид. Группы получали либо инъекцию (1) PBS, (2) AAV2/8 для эписомальной экспрессии изотипического контрольного антитела к НА H1H11829N2 (CAG LC_T2A_RORss_HC), (3) низкую дозу (1.0E+10 ГВ/мышь) или (4) высокую дозу (1,0E+11 ГВ/мышь) AAV2/8 для эписомальной экспрессии антитела к PcrV H1H29339P, управляемого промотором CAG (формат HC_T2A_RORss_LC), (5) низкую дозу (1E+11 ГВ/мышь/вектор) или (6) высокую дозу (1E+12 ГВ/мышь/вектор) двух AAV, один из которых несет нРНК1 и кассету экспрессии мкАт к PcrV H1H29339P (HC_T2A_RORss_LC) и AAV2/8.SerpinAP.Cas9 (SEQ ID NO: 39), (7) низкую дозу (0,2 мг/кг) или (8) высокую дозу (1,0 мг/кг) CHO-очищенных мкАт к PcrV H1H29339P, или (9) 1,0 мг/кг изотипического контроля hIgG1 REGN684. Группа 10 представляла собой группу мышей, которые служили неинфицированным контролем. Другая группа (Группа 11) служила незащищенным инфицированным контролем (только бактерии). Группы (1)-(6) инъецировали внутривенно при помощи инъекции в хвостовую вену за 16 дней до начала заражения. Группы (7)-(9) вводили подкожно за 2 дня до контрольного заражения. Дополнительным N=5 мышам также вводили подкожно PBS дополнительным контрольным мышам, получавшим только носитель, в результате чего общее количество мышей в группе (1) составляло 10/вид. За семь дней до заражения у мышей в группах (1)-(6) осуществляли забор крови из ретроорбитального синуса и собирали сыворотку, чтобы запустить ИФА на FC человека и определить титры циркулирующих антител человека (изотипический контроль или H1H23933P) у каждой мыши. Мышей взвешивали в день заражения и затем инокулировали Pseudomonas aeruginosa штамм 6077 путем интраназальной инъекции. Затем мышей взвешивали каждые 24 ч в течение 7 дней после введения бактерий. Мышей забивали по достижении потери массы >20% или мыши проявляли другие симптомы клинического расстройства, такие как: летаргия; нечувствительность к раздражителям; взъерошенный мех, сутулость, тряска; или неврологические симптомы (наклон головы, вращение, падение на бок). Мышей, которые оказались умирающими и неспособными выпрямиться, когда их клали на спину, также умерщвляли. Всех оставшихся мышей умерщвляли на 7-й день после бактериальной инфекции.

На фиг. 31 показаны титры hIgG мышей, которым инъецировали AAV за девять дней до заражения (это за 7 дней до заражения). Для определения уровня hIgG, циркулирующего в сыворотке мыши через 9 дней после доставки кассет моноклональных антител, с использованием AAV, как описано в эксперименте выше, выполняли ИФА на FC человека (как описано в способах на фиг. 3). Некоторые значения были ниже пределов обнаружения (100 нг/мл) анализа в этот момент времени. В отдельном эксперименте соответствующим по возрасту мышам BALB/c-Elite вводили низкую дозу (0,2 мг/кг) или высокую дозу (1,0 мг/кг) СНО-очищенного моноклонального антитела к PcrV H1H29339P, и сыворотку собирали два раза дней спустя, чтобы определить ожидаемые уровни циркулирующего человеческого IgG во время заражения, которые соответствуют этим дозам. Эти значения представляют собой столбцы в правой части графика. В соответствии с предыдущими наблюдениями, AAV8 трансдуцирует мышей C57BL/6 более эффективно, чем BALB/c. В результате значения секретируемого белка, который является результатом успешной трансдукции либо стратегии одиночного AAV (эписомального), либо двойного AAV (вставленного), были ниже у мышей BALB/c, как и ожидалось. Поскольку стратегия вставки требует успешной трансдукции двух разных AAV, снижение инфективности снижает наблюдаемые титры между штаммами даже больше, чем когда требуется только один AAV, чтобы привести к секреции белка.

На фиг. 32A и 32B показана результаты групп (2)-(6) и (10)-(11) в эксперименте с заражением Pseudomonas, описанном выше (фиг. 30). Это группы с доставкой AAV моноклональных антител наряду с неинфицированными и содержащими только бактерии контролями. У мышей C57BL/6NCrl-Elite все мыши с эписомальной доставкой AAV изотипического контроля (2) и незащищенные инфицированные мыши (11) не выжили при заражении. Все неинфицированные мыши (10) и мыши, генерирующие мкАт к PcrV H1H29339P из печени либо посредством эписомальной экспрессии AAV, либо путем вставки в пер

-

Claims (78)

1. вый интрон локуса альбумина с использованием стратегии двойного AAV, выжили независимо от того, вводили низкую или высокую дозу (3)-(6). См. фиг. 32A. У мышей BALB/c-Elite 4 из 5 мышей с эписомальной доставкой AAV изотипического контроля (2), все незащищенные инфицированные мыши (11) и все мыши с низкой дозой стратегии двойной вставки AAV (5) не выжили при заражении. Все неинфицированные мыши (10) и мыши, генерирующие мкАт к PcrV H1H29339P из печени посредством эписомальной экспрессии AAV, выживали независимо от того, вводили ли им низкие или высокие дозы (3)(4). Все мыши, генерирующие мкАт к PcrV H1H29339P в результате двойной стратегии AAV, выжили, получив высокие дозы (6). См. фиг. 32B.

   Таким образом, мы продемонстрировали успешную вставку множества различных генов антител в локус альбумина, и мы продемонстрировали, что продуцируемое антитело функционально эквивалентно СНО-продуцируемому очищенному антителу in vitro и обеспечивает защиту в моделях заражения in vivo. Эти эксперименты проводили с антителами нескольких типов IgG. Все данные о вирусе Зика относятся к REGN4504, которое представляет собой IgG1, или REGN4446, которое представляет собой суперневидимый IgG4, а антитела к PcrV и антитела к HA имеют формат IgG1. Мы продемонстрировали экспрессию, функциональность и защитные эффекты с антителами, нацеленными на вирус (антитело к вирусу Зика или антитело к HA), и с антителами, нацеленными на бактерии (антитело к PcrV). Точно так же мы протестировали вставленные гены антител, в которых тяжелая цепь является первой (антитело к PcrV и антитело к вирусу Зика), и мы протестировали гены антител, в которых легкая цепь является первой (антитело к HA и антитело к вирусу Зика). Аналогичным образом, мы протестировали несколько различных белков 2A между двумя цепями антител (антитело к PcrV был T2A с первой тяжелой цепью, антитело к HA имело T2A с первой легкой цепью, и мы протестировали F2A, P2A и T2A в антителе к вирусу Зика с первой тяжелой цепью).

   ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ вставки последовательности, кодирующей антитело в первый интрон локуса альбумина в одной или более клетках печени у животного in vivo или в клетке печени in vitro или in vivo, включающий введение в одну или более клеток печени животного или клетку печени: (а) нуклеазного агента, который нацелен на сайт-мишень в первом интроне локуса альбумина, или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент; и (b) экзогенную донорную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую антитело, причем нуклеазный агент расщепляет сайт-мишень, и последовательность, кодирующую антитело, вставляют в первый интрон локуса альбумина в одной или более клетках печени у животного или в клетке печени для получения модифицированного локуса альбумина, причем антитело не является одноцепочечным антителом, причем антитело содержит тяжелую цепь и отдельную легкую цепь, причем последовательность, кодирующая тяжелую цепь, расположена выше последовательности, кодирующей легкую цепь, в последовательности, кодирующей антитело, причем тяжелая цепь и легкая цепь связаны пептидом 2А, причем пептид 2А представляет собой пептид Т2А, причем нуклеиновая кислота, кодирующая сайт расщепления фурином, включена между последовательностью, кодирующей тяжелую цепь, и последовательностью, кодирующей легкую цепь, и причем сайт расщепления фурином находится выше пептида 2А, причем последовательность, кодирующая тяжелую цепь, функционально связана с эндогенной сигнальной последовательностью секреции альбумина в модифицированном локусе альбумина, и последовательность, кодирующая антитело, содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше последовательности, кодирующей легкую цепь, и причем вставленная последовательность, кодирующая антитело, функционально связана с эндогенным промотором альбумина в модифицированном локусе альбумина.
2. 2. Способ по п.1, где антитело нацелено на ассоциированный с заболеванием антиген.
3. 3. Способ по п.2, где экспрессия антитела у животного оказывает профилактическое или терапевтическое действие в отношении заболевания у животного.
4. 4. Способ лечения или проведения профилактики заболевания у животного, имеющего заболевание или подверженного риску заболевания, включающий введение в одну или более клеток печени животного: (а) нуклеазного агента, нацеленного на сайт-мишень в первом интроне локуса альбумина, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент; и (b) экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антитело, причем антитело нацелено на ассоциированный с заболеванием антиген, причем нуклеазный агент расщепляет сайт-мишень, а последовательность, кодирующую антитело, вставляют в первый интрон локуса альбумина в одной или более клетках печени для получения модифицированного локуса альбумина, причем антитело не является одноцепочечным антителом, причем антитело содержит тяжелую цепь и отдельную легкую цепь, причем последовательность, кодирующая тяжелую цепь, расположена выше последовательности, кодирующей легкую цепь, в последовательности, кодирующей антитело,

   - 80 048264 причем тяжелая цепь и легкая цепь связаны пептидом 2А, причем пептид 2А представляет собой пептид Т2А, причем нуклеиновая кислота, кодирующая сайт расщепления фурином, включена между последовательностью, кодирующей тяжелую цепь, и последовательностью, кодирующей легкую цепь, и причем сайт расщепления фурином находится выше пептида 2А, и причем последовательность, кодирующая тяжелую цепь, функционально связана с эндогенной сигнальной последовательностью секреции альбумина в модифицированном локусе альбумина, и последовательность, кодирующая антитело, содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше последовательности, кодирующей легкую цепь, и причем вставленная последовательность, кодирующая антитело, функционально связана с эндогенным промотором альбумина в модифицированном локусе альбумина, и посредством чего антитело экспрессируется у животного и связывает ассоциированный с заболеванием антиген.
5. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нуклеазный агент представляет собой нуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN), нуклеазу на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALEN), или белок (Cas), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК).
6. 6. Способ по п.5, где нуклеазный агент представляет собой белок Cas и нРНК, при этом белок Cas представляет собой белок Cas9, и причем нРНК содержит:

   (a) CRISPR-РНК (сгРНК), которая нацелена на сайт-мишень, причем сайт-мишень непосредственно фланкирован последовательностью мотива, прилегающего к протоспейсеру (РАМ); и (b) трансактивирующую РНК CRISPR (tracrРНК).
7. 7. Способ по п.6, где по меньшей мере одна нРНК содержит 2'-О-метильные аналоги и 3'фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в первых трех 5'- и 3'-концевых остатках РНК.
8. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где последовательность, кодирующую антитело, вставляют посредством негомологичного соединения концов.
9. 9. Способ по любому из пп.1-7, где последовательность, кодирующую антитело, вставляют посредством направляемой гомологией репарации.
10. 10. Способ по любому из пп.1-8, где экзогенная донорная нуклеиновая кислота не содержит плеч гомологии.
11. 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где экзогенная донорная нуклеиновая кислота является одноцепочечной.
12. 12. Способ по любому из пп.1-10, где экзогенная донорная нуклеиновая кислота является двухцепочечной.
13. 13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где последовательность, кодирующая антитело, в экзогенной донорной нуклеиновой кислоте фланкирована с каждой стороны сайтом-мишенью для нуклеазного агента, причем нуклеазный агент расщепляет сайты-мишени, фланкирующие последовательность, кодирующую антитело.
14. 14. Способ по п.13, где сайт-мишень в локусе альбумина больше не присутствует, если последовательность, кодирующую антитело, вставляют в локус альбумина в правильной ориентации, но он преобразуется, если последовательность, кодирующую антитело, вставляют в локус альбумина в противоположной ориентации.
15. 15. Способ по п.13 или 14, где экзогенную донорную нуклеиновую кислоту доставляют при помощи опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) доставки, и расщепление сайтов-мишеней, фланкирующих последовательность, кодирующую антитело, удаляет инвертированные концевые повторы AAV.
16. 16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где последовательность, кодирующая тяжелую цепь, содержит сегменты V_H, DH, и JH, и последовательность, кодирующая легкую цепь, содержит генные сегменты V_L и J_L.
17. 17. Способ по любому из предшествующих пунктов, где экзогенная сигнальная последовательность секреции представляет собой сигнальную последовательность секреции ROR1.
18. 18. Способ по любому из пп.2-17, где ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой ассоциированный с раком антиген.
19. 19. Способ по любому из пп.2-17, где ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой ассоциированный с инфекционным заболеванием антиген.
20. 20. Способ по п.19, где ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой вирусный антиген.
21. 21. Способ по п.20, где вирусный антиген представляет собой антиген гриппа или антиген вируса Зика.
22. 22. Способ по п.21, где вирусный антиген представляет собой антиген гемагглютинина вируса гриппа.
23. 23. Способ по п.22, где антитело содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, причем:

    - 81 048264 (I) легкая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 18, а тяжелая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 20, необязательно причем три CDR легкой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 76-78, соответственно, а три CDR тяжелой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 79-81, соответственно; или (II) легкая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 126, а тяжелая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 128, необязательно причем три CDR легкой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 129-131, соответственно, а три CDR тяжелой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 132-134, соответственно.
24. 24. Способ по п.21, где вирусный антиген представляет собой антиген оболочки вируса Зика (Env).
25. 25. Способ по п.24, где антитело содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, причем:

    легкая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3, а тяжелая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5, необязательно причем три CDR легкой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 64-66, соответственно, а три CDR тяжелой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 67-69, соответственно.
26. 26. Способ по п.25, где антитело содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, причем:

    легкая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13, а тяжелая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 15, необязательно причем три CDR легкой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 70-72, соответственно, а три CDR тяжелой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 73-75, соответственно.
27. 27. Способ по п.19, где ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой бактериальный антиген, причем бактериальный антиген необязательно представляет собой антиген PcrV Pseudomonas aeruginosa.
28. 28. Способ по любому из предшествующих пунктов, где антитело представляет собой нейтрализующее антитело.
29. 29. Способ по п.28, где антитело представляет собой нейтрализующее антитело широкого спектра действия.
30. 30. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят в отдельных средствах доставки.
31. 31. Способ по любому из пп.1-29, где нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят вместе в одном и том же средстве доставки.
32. 32. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят одновременно.
33. 33. Способ по любому из пп.1-30, где нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту, вводят последовательно.
34. 34. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят в виде однократных доз.
35. 35. Способ по любому из пп.1-33, где нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и/или экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят в виде множественных доз.
36. 36. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту доставляют посредством внутривенной инъекции.
37. 37. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят

    - 82 048264 посредством опосредованной липидными наночастицами доставки или опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) доставки, необязательно причем нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят посредством опосредованной AAV доставки, и необязательно причем нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят двумя разными векторами AAV.
38. 38. Способ по п.37, где нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, вводят посредством опосредованной липидными наночастицами доставки.
39. 39. Способ по п.38, где нуклеазный агент представляет собой белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК).
40. 40. Способ по п.39, где Cas9 в липидной наночастице находится в форме мРНК, и нРНК в липидной наночастице находится в форме РНК.
41. 41. Способ по любому из пп.37-40, где экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят посредством опосредованной AAV доставки.
42. 42. Способ по п.41, где AAV представляет собой одноцепочечный AAV (ssAAV).
43. 43. Способ по п.41, где AAV представляет собой самокомплементарный AAV (scAAV).
44. 44. Способ по любому из пп.41-43, где AAV представляет собой AAV8 или AAV2/8.
45. 45. Способ по любому из пп.1-37, где нуклеазный агент содержит белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК), причем способ включает введение нРНК и мРНК, кодирующей Cas9, посредством опосредованной липидными наночастицами доставки, и экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят посредством опосредованной AAV8 или опосредованной AAV2/8 доставки.
46. 46. Способ по любому из пп.1-37, где нуклеазный агент содержит белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК), причем способ включает введение ДНК, кодирующей Cas9, посредством опосредованной AAV8 доставки в первом AAV8 или посредством опосредованной AAV2/8 доставки в первом AAV2/8, и введение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты и ДНК, кодирующей нРНК, осуществляют посредством опосредованной AAV8 доставки во втором AAV8 или посредством опосредованной AAV2/8 доставки во втором AAV2/8.
47. 47. Способ по любому из предшествующих пунктов, где экспрессия антитела у животного приводит к уровням в плазме, равным по меньшей мере приблизительно 2,5 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 5 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 10 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 200 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 300 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 400 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 500 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 600 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 700 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 800 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 900 мкг/мл или по меньшей мере приблизительно 1000 мкг/мл через приблизительно 2 недели, приблизительно 4 недели, приблизительно 8 недель, приблизительно 12 недель или приблизительно 16 недель после введения нуклеазного агента или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенной донорной последовательности.
48. 48. Способ по любому из предшествующих пунктов, где животное представляет собой отличное от человека животное.
49. 49. Способ по п.48, где животное представляет собой отличное от человека млекопитающее.
50. 50. Способ по п.49, где отличное от человека млекопитающее представляет собой крысу или мышь.
51. 51. Способ по любому из пп.1-47, где животное представляет собой человека.
52. 52. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нуклеазный агент представляет собой белок 9 (Cas9), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и направляющую РНК (нРНК), причем нуклеазный агент или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенную донорную последовательность доставляют посредством опосредованной липидными наночастицами доставки, опосредованной аденоассоциированным вирусом 8 (AAV8) доставки, или опосредованной AAV2/8 доставки, причем последовательность, кодирующую антитело, вставляют в первый интрон локуса альбумина посредством негомологичного соединения концов, причем антитело нацелено на вирусный антиген или бактериальный антиген, и причем антитело представляет собой нейтрализующее антитело широкого спектра действия.
53. 53. Способ по п.52, где экзогенная сигнальная последовательность секреции представляет собой сигнальную последовательность секреции ROR1.
54. 54. Животное, содержащее экзогенную последовательность, кодирующую антитело, интегрированную в первый интрон локуса альбумина в одной или более клетках печени у животного, причем животное не является человеком, причем антитело не является одноцепочечным антителом,

    - 83 048264 причем антитело содержит тяжелую цепь и отдельную легкую цепь, причем последовательность, кодирующая тяжелую цепь, расположена выше последовательности, кодирующей легкую цепь, в последовательности, кодирующей антитело, причем тяжелая цепь и легкая цепь связаны пептидом 2А, причем пептид 2А представляет собой пептид Т2А, причем нуклеиновая кислота, кодирующая сайт расщепления фурином, включена между последовательностью, кодирующей тяжелую цепь, и последовательностью, кодирующей легкую цепь, и причем сайт расщепления фурином находится выше пептида 2А, причем последовательность, кодирующая тяжелую цепь, функционально связана с эндогенной сигнальной последовательностью секреции альбумина в локусе альбумина, и последовательность, кодирующая антитело, содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше последовательности, кодирующей легкую цепь, и причем вставленная последовательность, кодирующая антитело, функционально связана с эндогенным промотором альбумина в локусе альбумина.
55. 55. Животное по п.54, где последовательность, кодирующая тяжелую цепь, содержит сегменты V_H, DH, и J_H, и последовательность, кодирующая легкую цепь, содержит генные сегменты V_L и J_L.
56. 56. Животное по п.54 или 55, где экзогенная сигнальная последовательность секреции представляет собой сигнальную последовательность секреции ROR1.
57. 57. Животное по любому из пп.54-56, где антитело нацелено на ассоциированный с заболеванием антиген.
58. 58. Животное по п.57, где экспрессия антитела у животного оказывает профилактическое или терапевтическое действие в отношении заболевания у животного.
59. 59. Животное по п.57 или 58, где ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой ассоциированный с раком антиген.
60. 60. Животное по п.57 или 58, где ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой ассоциированный с инфекционным заболеванием антиген.
61. 61. Животное по п.60, где ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой вирусный антиген.
62. 62. Животное по п.61, где вирусный антиген представляет собой антиген вируса гриппа или антиген вируса Зика.
63. 63. Животное по п.62, где вирусный антиген представляет собой антиген гемагглютинина гриппа.
64. 64. Животное по п.63, где антитело содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, причем:

    (I) легкая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 18, а тяжелая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 20, необязательно причем три CDR легкой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 76-78, соответственно, а три CDR тяжелой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 79-81, соответственно; или (II) легкая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 126, а тяжелая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 128, необязательно причем три CDR легкой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 129-131, соответственно, а три CDR тяжелой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 132-134, соответственно.
65. 65. Животное по п.62, где вирусный антиген представляет собой антиген оболочки вируса Зика (Env).
66. 66. Животное по п.65, где антитело содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, причем:

    легкая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3, а тяжелая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5, необязательно причем три CDR легкой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 64-66, соответственно, а три CDR тяжелой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 67-69, соответственно.
67. 67. Животное по п.65, где антитело содержит легкую цепь, содержащую три CDR легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую три CDR тяжелой цепи, причем:

    легкая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13, а тяжелая цепь содержит или состоит из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 15,

    - 84 048264 необязательно причем три CDR легкой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 70-72, соответственно, а три CDR тяжелой цепи содержат или состоят из последовательностей, по меньшей мере на 90% идентичных последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 73-75, соответственно.
68. 68. Животное по п.60, где ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой бактериальный антиген, причем бактериальный антиген необязательно представляет собой антиген PcrV Pseudomonas aeruginosa.
69. 69. Животное по любому из пп.54-68, где антитело представляет собой нейтрализующее антитело.
70. 70. Животное по п.69, где антитело представляет собой нейтрализующее антитело широкого спектра действия.
71. 71. Животное по любому из пп.54-70, где экспрессия антитела у животного приводит к уровням в плазме по меньшей мере приблизительно 2,5, по меньшей мере приблизительно 5, по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 200 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 300 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 400 мкг/мл или по меньшей мере приблизительно 500 мкг/мл через приблизительно 2 недели, приблизительно 4 недели или приблизительно 8 недель после введения нуклеазного агента или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенной донорной последовательности.
72. 72. Животное по любому из пп.54-71, где животное представляет собой отличное от человека млекопитающее.
73. 73. Животное по п.72, где отличное от человека млекопитающее представляет собой крысу или мышь.
74. 74. Животное по любому из пп.54-73, где антитело нацелено на вирусный антиген или бактериальный антиген, и причем антитело представляет собой нейтрализующее антитело широкого спектра действия.
75. 75. Животное по п.74, где экзогенная сигнальная последовательность секреции представляет собой сигнальную последовательность секреции ROR1.
76. 76. Клетка, содержащая экзогенную последовательность, кодирующую антитело, интегрированную в первый интрон локуса альбумина, причем антитело не является одноцепочечным антителом, причем антитело содержит тяжелую цепь и отдельную легкую цепь, причем последовательность, кодирующая тяжелую цепь, расположена выше последовательности, кодирующей легкую цепь, в последовательности, кодирующей антитело, причем тяжелая цепь и легкая цепь связаны пептидом 2А, причем пептид 2А представляет собой пептид Т2А, причем нуклеиновая кислота, кодирующая сайт расщепления фурином, включена между последовательностью, кодирующей тяжелую цепь, и последовательностью, кодирующей легкую цепь, и причем сайт расщепления фурином находится выше пептида 2А, причем последовательность, кодирующая тяжелую цепь, функционально связана с эндогенной сигнальной последовательностью секреции альбумина в локусе альбумина, и последовательность, кодирующая антитело, содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше последовательности, кодирующей легкую цепь, причем вставленная последовательность, кодирующая антитело, функционально связана с эндогенным промотором альбумина в локусе альбумина, и причем клетка представляет собой клетку печени.
77. 77. Экзогенная донорная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую антитело, для вставки в первый интрон локуса альбумина в клетке печени, причем антитело не является одноцепочечным антителом, причем антитело содержит тяжелую цепь и отдельную легкую цепь, причем последовательность, кодирующая тяжелую цепь, расположена выше последовательности, кодирующей легкую цепь, в последовательности, кодирующей антитело, причем тяжелая цепь и легкая цепь связаны пептидом 2А, причем пептид 2А представляет собой пептид Т2А, причем нуклеиновая кислота, кодирующая сайт расщепления фурином, включена между последовательностью, кодирующей тяжелую цепь, и последовательностью, кодирующей легкую цепь, и причем сайт расщепления фурином находится выше пептида 2А, причем последовательность, кодирующая антитело содержит экзогенную сигнальную последовательность секреции выше последовательности, кодирующей легкую цепь, и где после вставки последовательность, кодирующая тяжелую цепь, функционально связана с эндогенной сигнальной последовательностью секреции альбумина в локусе альбумина, и причем после вставки вставленная последовательность, кодирующая антитело, функционально связана с эндогенным промотором альбумина в локусе альбумина.
78. 78. Применение нуклеазного агента или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазный агент, и экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую антитело, для вставки последовательности, кодирующей антитело, в первый интрон локуса альбу-

    -