EA048091B1 - Клеточные анализы клостридиальных нейротоксинов - Google Patents
Клеточные анализы клостридиальных нейротоксинов Download PDFInfo
- Publication number
- EA048091B1 EA048091B1 EA202190892 EA048091B1 EA 048091 B1 EA048091 B1 EA 048091B1 EA 202190892 EA202190892 EA 202190892 EA 048091 B1 EA048091 B1 EA 048091B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- clostridial neurotoxin
- activity
- seq
- polypeptide
- cell
- Prior art date
Links
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title claims description 5
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 title description 24
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 title description 24
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 title description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 4
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 claims description 290
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 214
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 113
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 97
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 95
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 94
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 94
- 230000007900 neurotoxin activity Effects 0.000 claims description 87
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 59
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 53
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 42
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 40
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 32
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 26
- 102100030701 Synaptic vesicle glycoprotein 2A Human genes 0.000 claims description 25
- 101710084141 Synaptic vesicle glycoprotein 2A Proteins 0.000 claims description 25
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 20
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 20
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 20
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 11
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 6
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 6
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 claims 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 60
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 description 54
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 30
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 description 28
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 description 22
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 14
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 14
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 13
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 13
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 13
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 13
- 102000013090 Thioredoxin-Disulfide Reductase Human genes 0.000 description 12
- 108010079911 Thioredoxin-disulfide reductase Proteins 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 10
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 10
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 102000000583 SNARE Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010041948 SNARE Proteins Proteins 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 8
- 108010057722 Synaptosomal-Associated Protein 25 Proteins 0.000 description 8
- 102100030552 Synaptosomal-associated protein 25 Human genes 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 7
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 7
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 101710117515 Botulinum neurotoxin type E Proteins 0.000 description 6
- 101710117520 Botulinum neurotoxin type F Proteins 0.000 description 6
- 101000761935 Clostridium botulinum Botulinum neurotoxin type X Proteins 0.000 description 6
- 101000985023 Clostridium botulinum C phage Botulinum neurotoxin type C Proteins 0.000 description 6
- 108090000169 Vesicle-associated membrane protein 2 Proteins 0.000 description 6
- 102000003786 Vesicle-associated membrane protein 2 Human genes 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 6
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 101710117524 Botulinum neurotoxin type B Proteins 0.000 description 5
- 101000933563 Clostridium botulinum Botulinum neurotoxin type G Proteins 0.000 description 5
- 101000985020 Clostridium botulinum D phage Botulinum neurotoxin type D Proteins 0.000 description 5
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 5
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 102000015799 Qa-SNARE Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000013265 Syntaxin 1 Human genes 0.000 description 5
- 108010090618 Syntaxin 1 Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 5
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000005917 R-SNARE Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 4
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 4
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 3
- 241000186542 Clostridium baratii Species 0.000 description 3
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 3
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 3
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 101000655985 Plasmodium falciparum (isolate FCH-5) Thioredoxin reductase Proteins 0.000 description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 3
- 101000772462 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Thioredoxin reductase 1 Proteins 0.000 description 3
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- PDRJLZDUOULRHE-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-amino-3-pyridin-2-ylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=N1 PDRJLZDUOULRHE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- DFZVZEMNPGABKO-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-amino-3-pyridin-3-ylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CN=C1 DFZVZEMNPGABKO-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- FQFVANSXYKWQOT-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-azaniumyl-3-pyridin-4-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=NC=C1 FQFVANSXYKWQOT-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 4-fluoro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(F)C=C1 XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000639146 Homo sapiens Vesicle-associated membrane protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000639143 Homo sapiens Vesicle-associated membrane protein 5 Proteins 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 231100000911 LD50 test Toxicity 0.000 description 2
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 2
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 108091060545 Nonsense suppressor Proteins 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 SNAP-25 Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000016253 Synaptobrevin/Vesicle-associated membrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 108050004777 Synaptobrevin/Vesicle-associated membrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010017743 Vesicle-Associated Membrane Protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010017749 Vesicle-Associated Membrane Protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100037105 Vesicle-associated membrane protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100031486 Vesicle-associated membrane protein 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100031489 Vesicle-associated membrane protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100031484 Vesicle-associated membrane protein 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100035054 Vesicle-fusing ATPase Human genes 0.000 description 2
- 101150016810 YKT6 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N cis-4-Hydroxy-L-proline Chemical compound O[C@@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UJXJZOCXEZPHIE-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(2-hydroxyethylamino)-4-sulfanylbutanoic acid Chemical compound OCCN[C@H](C(O)=O)CCS UJXJZOCXEZPHIE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FXGZFWDCXQRZKI-VKHMYHEASA-N (2s)-5-amino-2-nitramido-5-oxopentanoic acid Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)N[N+]([O-])=O FXGZFWDCXQRZKI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- CCAIIPMIAFGKSI-DMTCNVIQSA-N (2s,3r)-3-hydroxy-2-(methylazaniumyl)butanoate Chemical compound CN[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CCAIIPMIAFGKSI-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- CNPSFBUUYIVHAP-WHFBIAKZSA-N (2s,3s)-3-methylpyrrolidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound C[C@H]1CCN[C@@H]1C(O)=O CNPSFBUUYIVHAP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDUUKBXTEOFITR-BYPYZUCNSA-N 2-methyl-L-serine Chemical compound OC[C@@]([NH3+])(C)C([O-])=O CDUUKBXTEOFITR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XEVFXAFXZZYFSX-UHFFFAOYSA-N 3-azabicyclo[2.1.1]hexane-4-carboxylic acid Chemical compound C1C2CC1(C(=O)O)NC2 XEVFXAFXZZYFSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100371033 Caenorhabditis elegans trxr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000611330 Chryseobacterium Species 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100371034 Drosophila melanogaster Trxr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 206010015995 Eyelid ptosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- YZJSUQQZGCHHNQ-UHFFFAOYSA-N Homoglutamine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(N)=O YZJSUQQZGCHHNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N L-pipecolic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]1CCCC[NH2+]1 HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101150005609 MED20 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010081735 N-Ethylmaleimide-Sensitive Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000033952 Paralysis flaccid Diseases 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006384 Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010019040 Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108030001722 Tentoxilysin Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710101493 Viral myc transforming protein Proteins 0.000 description 1
- 241000202221 Weissella Species 0.000 description 1
- 101000761936 Weissella oryzae (strain DSM 25784 / JCM 18191 / LMG 30913 / SG25) Putative botulinum-like toxin Wo Proteins 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 102000036861 Zinc-dependent endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091006982 Zinc-dependent endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- CDUUKBXTEOFITR-UHFFFAOYSA-N alpha-methylserine Natural products OCC([NH3+])(C)C([O-])=O CDUUKBXTEOFITR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000000689 aminoacylating effect Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013584 assay control Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009141 biological interaction Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002920 convulsive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002003 electron diffraction Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 208000028331 flaccid paralysis Diseases 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010055409 ganglioside receptor Proteins 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWFRVMDVLYIXJF-BYPYZUCNSA-N hydroxyethylcysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSCCO MWFRVMDVLYIXJF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000002952 image-based readout Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GCHPUFAZSONQIV-UHFFFAOYSA-N isovaline Chemical compound CCC(C)(N)C(O)=O GCHPUFAZSONQIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N l-pipecolic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 238000005222 photoaffinity labeling Methods 0.000 description 1
- 210000003105 phrenic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 201000003004 ptosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000018448 secretion by cell Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000016978 synaptic transmission, cholinergic Effects 0.000 description 1
- 102000003137 synaptotagmin Human genes 0.000 description 1
- 108060008004 synaptotagmin Proteins 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N tert-butylglycine Chemical compound CC(C)(C)C(N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000028973 vesicle-mediated transport Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Description
Изобретение относится к клеточным анализам клостридиальных нейротоксинов.
Бактерии рода Clostridia продуцируют высокоэффективные и специфичные белковые токсины, которые могут отравлять нейроны и другие клетки, в которые они попадают. Примеры таких клостридиальных нейротоксинов включают нейротоксины, продуцируемые С. Tetani (TeNT) и С. Botulinum (BoNT) серотипов AG и X (см. WO 2018/009903 А2), а также продуцируемые С. Baratii и С. butyricum.
Среди клостридиальных нейротоксинов присутствуют одни из самых сильных известных токсинов. Например, ботулинические нейротоксины имеют значения средней летальной дозы (LD50) для мышей в диапазоне от 0,5 до 5 нг/кг, в зависимости от серотипа. И столбнячный, и ботулинический токсины действуют посредством подавления функции пораженных нейронов, в частности, высвобождения нейромедиаторов. Ботулинический токсин действует в нервно-мышечном соединении и подавляет холинергическую передачу в периферической нервной системе; столбнячный токсин действует в центральной нервной системе.
В природе клостридиальные нейротоксины синтезируются как одноцепочечный полипептид, который подвергается посттрансляционной модификации в результате протеолитического расщепления с образованием двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью. Расщепление происходит в определенном сайте расщепления, часто называемом сайтом активации, который расположен между остатками цистеина, обеспечивающими межцепочечную дисульфидную связь. Именно эта двухцепочечная форма является активной формой токсина. Две цепи называются тяжелой цепью (Н-цепью), которая имеет молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепью), которая имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа. Н-цепь содержит N-концевой компонент транслокации (домен HN) и С-концевой компонент нацеливания (домен НС). Сайт расщепления располагается между L-цепью и компонентами домена транслокации. После связывания домена НС с его нейроном-мишенью и интернализации связанного токсина в клетку через эндосому домен HN перемещает L-цепь через эндосомную мембрану в цитозоль, а L-цепь обеспечивает функцию протеазы (также известную как нецитотоксическая протеаза).
Нецитотоксические протеазы действуют путем протеолитического расщепления внутриклеточных транспортных белков, известных как SNARE-белки (например, SNAP-25, VAMP или синтаксин) - см. Gerald K. (2002) Cell and Molecular Biology (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. Сокращение SNARE происходит от термина (Soluble NSF Attachment Receptor (рецептор связывания растворимых NSF), где NSF означает чувствительный к N-этилмалеимиду фактор. SNARE-белки являются неотъемлемым элементом слияния внутриклеточных везикул, и, таким образом, секреции молекул посредством везикулярного транспорта из клетки. Функция протеазы представляет собой цинк-зависимую эндопептидазную активность и демонстрирует высокую субстратную специфичность для белков SNARE. Соответственно, после доставки в желаемую клетку-мишень нецитотоксическая протеаза способна ингибировать клеточную секрецию из клетки-мишени. Протеазы L-цепи клостридиальных нейротоксинов являются нецитотоксическими протеазами, которые расщепляют SNARE-белки.
Анализ LD50 для мышей в настоящее время является единственным тестом, одобренным FDA для высвобождения ботулотоксинов. Анализ одновременно проверяет действие всех трех доменов ботулинического нейротоксина (т.е. связывания, транслокации и протеазного). Более подробно, он определяет среднюю летальную внутрибрюшинную дозу токсина в определенный момент времени, обычно через 2-4 дня после введения дозы (активность выражается в единицах LD50 для мышей). Однако, к сожалению, в анализах LD50 используется большое количество животных. Более того, единицы LD50 не являются абсолютными измерениями, потому что они не являются биологическими константами - таким образом, они сильно зависят от условий анализа. В частности, ошибки, связанные с этим анализом, могут достигать 60% между различными испытательными центрами (Sesardic и соавт. 2003; Biologicals 31 (4): 265276).
Тест на периферический паралич мышей, который также известен как анализ абдоминального птоза мышей, соотносит активность ботулинического токсина со степенью вздутия живота, наблюдаемого после подкожной инъекции токсина в левую пахово-грудную область мыши - величина паралича зависит от дозы. Этот подход был предложен в качестве усовершенствования теста LD50 для мышей, поскольку он основан на гуманной конечной точке. Этот анализ примерно в 10 раз более чувствителен, чем анализ LD50, использует сублетальную дозу токсина и является более быстрым, чем тест LD50, поскольку дает результаты в течение 24-48 ч, по сравнению с 72-96 ч для типового анализа LD50. Результаты этого анализа демонстрируют превосходное соответствие со значениями LD50 (Sesardic и соавт., 1996; Pharmacol Toxicol, 78 (5): 283-8). Хотя в этом анализе используется 20% от числа животных, использованных в анализе LD50, использование животных все еще является необходимым.
Анализы, такие как гемидиафрагмальный анализ диафрагмального нерва мыши/крысы (который основан на использовании нервных/мышечных препаратов ех vivo), сопоставляют активность ботулинического нейротоксина с уменьшением амплитуды конвульсивного ответа на препарат после его нанесения в поддерживающую среду. Обычной конечной точкой анализа является время, необходимое для наблюдения 50%-ного уменьшения амплитуды. Однако, к сожалению, гемидиафрагмальный анализ (как и анализ LD50) приводит к использованию большого количества животных. Кроме того, для проведения
- 1 048091 анализа требуется высококвалифицированный персонал, обученный использованию сложного и дорогостоящего оборудования.
Все вышеперечисленные анализы имеют определенные недостатки, особенно проблемы с благополучием животных. Более того, ни один из вышеупомянутых анализов не подходит для высокопроизводительного тестирования, например, для обнаружения генетических или химических регуляторов клостридиального нейротоксина. Таким образом, в данной области техники существует потребность в альтернативных и/или улучшенных анализах клостридиального нейротоксина.
Настоящее изобретение решает одну или более из вышеупомянутых проблем.
В одном из аспектов изобретение предоставляет способ идентификации гена, который регулирует активность клостридиального нейротоксина, включающий:
a) получение образца нейронных клеток человека, экспрессирующих полипептид, который содержит С-концевую обнаруживаемую метку, при этом полипептид может расщепляться клостридиальным нейротоксином;
b) изменение экспрессии гена-мишени клеток;
c) контактирование клеток с клостридиальным нейротоксином;
d) измерение количества детектируемой С-концевой метки, посредством чего количественно определяют активность клостридиального нейротоксина; и
e) идентификацию гена-мишени как регулятора активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина отличается от количественно определенной активности клостридиального нейротоксина для случая, когда экспрессия гена-мишени не изменяется.
Альтернативно, способ может включать определение того, что ген-мишень не является регулятором активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина эквивалентна количественно определенной активности клостридиального нейротоксина в случае, когда экспрессия гена-мишени не изменяется.
В одном из вариантов осуществления клетки могут контактировать с клостридиальным нейротоксином до изменения экспрессии гена-мишени.
В родственном аспекте изобретение предоставляет способ идентификации агента, регулирующего активность клостридиального нейротоксина, включающий:
a) получение образца нейронных клеток человека, экспрессирующих полипептид, который содержит С-концевую обнаруживаемую метку, при этом полипептид расщепляется клостридиальным нейротоксином;
b) контактирование клеток с клостридиальным нейротоксином и агентом, при этом контактирование является последовательным или одновременным;
c) измерение количества детектируемой С-концевой метки, посредством чего количественно определяют активность клостридиального нейротоксина; и
d) идентификацию агента как регулятора активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина отличается от количественно определенной активности клостридиального нейротоксина в отсутствие агента.
Альтернативно, способ может включать идентификацию того, что агент не является регулятором активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина эквивалентна количественно определенной активности клостридиального нейротоксина в отсутствие агента.
Агент может быть идентифицирован как отрицательный регулятор активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина ниже, чем количественно определенная активность клостридиального нейротоксина в отсутствие агента. Альтернативно, агент может быть идентифицирован как положительный регулятор активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина выше, чем количественно определенная активность клостридиального нейротоксина в отсутствие агента.
В настоящем изобретении применяются нейронные клетки человека, и это связано с рядом преимуществ, отсутствующих в обычных клеточных анализах, таких как анализы с использованием мышиных клеток. Человеческие нейронные клетки позволяют использовать библиотеки сайленсинга человеческих генов (например, библиотеки человеческих siRNA) или библиотеки агентов (например, библиотеки человеческих лекарственных соединений). Таким образом, настоящее изобретение имеет более высокие прогностические возможности, чем обычные клеточные анализы, и имеет повышенную терапевтическую значимость для человека.
Таким образом, в одном из аспектов изобретение предоставляет нейронную клетку человека, экспрессирующую полипептид, который может расщепляться клостридиальным нейротоксином и содержит С-концевую обнаруживаемую метку. Клетка, предпочтительно, представляет собой стабильную клеточную линию, содержащую нуклеотидную последовательность или вектор по изобретению.
Нейронная клетка человека по изобретению, предпочтительно, не является раковой клеткой. Предпочтительно, нейронная клетка человека по изобретению представляет собой иммортализованную клет
- 2 048091 ку-предшественник нейронов человека или клетку, эквивалентную ей (например, функционально эквивалентную ей). Например, клетка может являться клеткой-предшественником нейронов человека ReNcell® (коммерчески доступной от Sigma-Aldrich), экспрессирующей полипептид по изобретению. Предпочтительно, нераковые клетки являются генетически более близкими к природным нейронам человека по сравнению с линиями раковых клеток (например, клетками нейробластомы) и, таким образом, представляют собой улучшенную модель нейронных клеток для применения в анализах, описанных в настоящем описании.
Клетку-предшественник нейронов человека, предпочтительно, дифференцируют перед применением в способе по настоящему изобретению. Таким образом, в одном из вариантов осуществления нейронная клетка человека по изобретению или для применения в способе по изобретению (например, нейрон человека или его предшественник) происходит из клетки-предшественника нейронов человека. Более предпочтительно, человеческая нейронная клетка по изобретению или для применения в способе по изобретению представляет собой человеческий нейрон или клетку, эквивалентную ему (например, функционально эквивалентную ему).
Полипептид, экспрессируемый нейронной клеткой человека, описанной в настоящем описании, может содержать обнаруживаемую метку как на N-конце, так и на С-конце. В одном из вариантов осуществления обнаруживаемые метки N-конца и С-конца различаются.
Обнаруживаемая метка, предпочтительно, является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах осуществления полипептид по изобретению не содержит дополнительной нефлуоресцентной метки.
В одном из вариантов осуществления N-концевая или С-концевая обнаруживаемая метка представляет собой красный флуоресцентный белок (RFP). Более предпочтительно, один конец белка имеет обнаруживаемую метку RFP, а другой конец белка имеет обнаруживаемую метку, выбранную из: зеленого флуоресцентного белка (GFP), голубого флуоресцентного белка (CFP) и желтого флуоресцентного белка (YFP). Предпочтительно, RFP антигенно отличается от GFP, CFP и YFP, поэтому способы по настоящему изобретению позволяют применять (вторичные/подтверждающие) методики иммуногенного обнаружения, такие как вестерн-блоттинг. Полипептиды, в которых обе метки выбраны из GFP, CFP и YFP, обычно не подходят для применения с такими методиками иммуногенного обнаружения ввиду перекрестной реактивности антител. Предпочтительно, полипептид, описанный в настоящем описании, содержит N-концевую обнаруживаемую метку RFP и С-концевую обнаруживаемую метку GFP.
Предпочтительно, чтобы полипептид по изобретению не содержал метку для иммобилизации и/или очистки; поскольку анализ основан на клетках, в таких метках нет необходимости. В одном из вариантов осуществления полипептид по изобретению может не содержать His-метку (например, полигистидиновую метку, такую как 6-И^-метку), FLAG-метку, метку белка А, метку связывающего мальтозу белка и/или Мус-метку.
Следовательно, в одном из аспектов изобретение относится к полипептиду, который расщепляется клостридиальным нейротоксином и содержит N-концевую обнаруживаемую метку RFP и С-концевую обнаруживаемую метку GFP. В родственном аспекте изобретение предоставляет нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный полипептид, а также вектор (например, плазмиду), содержащий нуклеотидную последовательность по изобретению, функционально связанную с промотором. Можно использовать любой промотор, подходящий для экспрессии в нейронной клетке человека, такой как промотор CMV.
Полипептид содержит субстрат клостридиального нейротоксина или его часть. Субстрат (или его часть) выбирают соответствующим образом на основе анализируемого клостридиального нейротоксина.
В одном из вариантов осуществления полипептид содержит субстрат ботулинического нейротоксина (или его часть), такой как SNARE-белок. Таким образом, полипептид может содержать субстрат (или его часть) BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G или BoNT/X. Предпочтительно, полипептид содержит субстрат (или его часть) BoNT/A.
Полипептид по изобретению может содержать синаптосомальный белок 25 кДа (SNAP-25), синаптобревин/ассоциированный с везикулами мембранный белок (VAMP, например, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4 или VAMP5), синтаксин (например, синтаксин 1, синтаксин 2 или синтаксин 3), Ykt6, или часть указанного.
Предпочтительно, полипептид по изобретению содержит SNAP-25 или его часть, более предпочтительно, полноразмерный SNAP-25.
BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G расщепляют синаптобревин/ассоциированный с везикулами мембранный белок (VAMP); BoNT/C1, BoNT/A и BoNT/E расщепляют синаптосомальный белок 25 кДа (SNAP-25); и BoNT/C1 расщепляет синтаксин 1, синтаксин 2 и синтаксин 3. Было обнаружено, что BoNT/X расщепляет SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, Ykt6 и синтаксин 1.
Термин часть указанного в отношении субстрата клостридиального нейротоксина включает сайт, в котором расщепляется клостридиальный нейротоксин, и может дополнительно включать ряд аминокислотных остатков, окружающих указанный сайт, например, если указанные дополнительные аминокислотные остатки являются необходимыми для расщепления субстрата посредством расщепления кло
- 3 048091 стридиальным нейротоксином. Например, фрагмент может содержать <50, <25 или <15 аминокислот субстрата клостридиального нейротоксина.
Полипептид по изобретению может содержать один или более полипептидов, имеющих по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 и/или 12. В одном из вариантов осуществления полипептид по изобретению содержит один или более полипептидов, имеющих по меньшей мере 80% или 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 и/или 12. Предпочтительно, полипептид по изобретению содержит один или более полипептидов, показанных как SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 и/или 12.
Полипептид по изобретению может содержать полипептиды, имеющие по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12. В одном из вариантов полипептид по изобретению содержит полипептиды, имеющие по меньшей мере 80% или 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12. Предпочтительно, полипептид по изобретению содержит полипептиды, показанные как SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO: 12.
Полипептид по изобретению может содержать полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO:2. В одном из вариантов осуществления полипептид по изобретению содержит полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% или 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO:2. Предпочтительно, полипептид по изобретению содержит (более предпочтительно, состоит из) полипептидную последовательность, показанную как SEQ ID NO:2.
Нуклеотидная последовательность по изобретению (например, которая кодирует полипептидную последовательность по изобретению) может содержать одну или более нуклеотидных последовательностей, имеющих по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 и/или 11. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность по изобретению содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, имеющих по меньшей мере 80% или 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 и/или 11. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность по изобретению содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, показанных как SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 и/или 11.
Нуклеотидная последовательность по изобретению может содержать одну или более нуклеотидных последовательностей, имеющих по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 3, 9 и/или 11. В одном из вариантов нуклеотидная последовательность по изобретению содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, имеющих по меньшей мере 80% или 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 3, 9 и/или 11. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность по изобретению содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, показанных как SEQ ID NO: 3, 9 и/или 11.
Нуклеотидная последовательность по изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% или 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность по изобретению содержит (более предпочтительно, состоит из) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID NO: 1.
Как упоминалось выше, изобретение предоставляет способы идентификации регулятора (например, гена или агента) активности клостридиального нейротоксина. Регуляция активности клостридиального нейротоксина может являться повышающей/положительной регуляцией (например, повышенная активность клостридиального нейротоксина) или понижающей/отрицательной регуляцией активности клостридиального нейротоксина (например, пониженной активностью клостридиального нейротоксина). Например, регуляция активности клостридиального нейротоксина может являться прямой регуляцией на уровне:
i) связывания клостридиального нейротоксина с клеткой;
ii) интернализации клостридиального нейротоксина;
iii) транслокации L-цепи клостридиального нейротоксина из эндосомы (включая уменьшение дисульфидной связи между L-цепью и Н-цепью);
iv) катализа (например, ингибирования или активации расщепления SNARE); или
v) продолжительности эффекта (например, сохранения активности L-цепи в цитоплазме клетки).
В других вариантах осуществления регуляция активности клостридиального нейротоксина может являться косвенной регуляцией. Косвенная регуляция может включать регуляцию пути, необходимого для активности клостридиального нейротоксина. Примером косвенной регуляции является регуляция клеточного переноса рецептора клостридиального нейротоксина, такого как гликопротеин 2А синаптических везикул (SV2).
Предпочтительно, регуляция активности клостридиального нейротоксина является прямой регуляцией.
Сведения о косвенных регуляторах можно использовать для дальнейшей проверки любых генов или агентов, идентифицированных с помощью способа по изобретению. В одном из вариантов осущест
- 4 048091 вления рецептор клостридиального нейротоксина (предпочтительно, SV2) может быть применен для определения того, регулирует ли ген или агент миграцию рецептора клостридиального нейротоксина косвенно, или напрямую регулирует активность клостридиального нейротоксина (например, посредством миграции клостридиального нейротоксина).
Таким образом, в одном из вариантов осуществления способы по изобретению включают дальнейшую проверку гена или агента, идентифицированного в способе по изобретению, при этом проверка дополнительно включает обнаружение присутствия или отсутствия рецептора клостридиального нейротоксина в клетке, когда экспрессия гена-мишени была изменена в клетке, или когда клетка контактировала с агентом. Подходящий способ проверки представлен в примере 5 настоящего описания.
Обнаруженное количество рецептора клостридиального нейротоксина можно сравнить с отрицательным контролем, в котором экспрессия гена-мишени не была изменена или в котором клетка не контактировала с агентом. Альтернативно или дополнительно, отрицательный контроль может включать клетки, которые не контактировали с клостридиальным нейротоксином. Когда клетка не контактировала с клостридиальным нейротоксином, происходит интернализация и последующая рециркуляция рецептора клостридиального нейротоксина на поверхность клетки. Напротив, когда клетка контактировала с клостридиальным нейротоксином, расщепление белков SNARE посредством указанного клостридиального нейротоксина предотвращает эффективную рециркуляцию рецептора на поверхность клетки.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления количество детектируемого рецептора клостридиального нейротоксина меньше количества, детектируемого на поверхности клетки, которая не контактировала с клостридиальным нейротоксином.
В одном из вариантов осуществления обнаружение пониженного количества рецептора клостридиального нейротоксина на поверхности клетки: а) в которой была изменена экспрессия гена-мишени; и b) которая контактировала с клостридиальным нейротоксином, может указывать на то, что ген-мишень косвенно регулирует активность клостридиального нейротоксина.
Упомянутое выше понижение может иметь место по сравнению с эквивалентной клеткой, в которой экспрессия гена-мишени не изменяется.
Путем дальнейшего использования известного прямого ингибитора активности клостридиального нейротоксина можно подтвердить, что ген-мишень косвенно регулирует активность клостридиального нейротоксина на уровне миграции рецептора клостридиального нейротоксина. Например, косвенная регуляция может быть подтверждена, если количество рецептора на поверхности клетки, обнаруженного в присутствии ингибитора, меньше количества рецептора, обнаруженного в эквивалентной клетке (в которой экспрессия гена-мишени не изменена), которая также контактировала с клостридиальным нейротоксином и ингибитором (и наоборот).
В одном из вариантов осуществления обнаружение эквивалентного или большего количества рецептора клостридиального нейротоксина на поверхности клетки: а) в которой была изменена экспрессия гена-мишени, и b) которая контактировала с клостридиальным нейротоксином, может указывать на то, что ген-мишень не регулирует косвенно активность клостридиальных нейротоксинов.
Эквивалентное или большее количество, упомянутое выше, может иметь место по сравнению с эквивалентной клеткой, в которой экспрессия гена-мишени не изменена.
Аналогичным образом, в одном из вариантов осуществления обнаружение пониженного количества рецептора клостридиального нейротоксина в клетке, контактирующей с: а) клостридиальным нейротоксином и b) агентом, может указывать на то, что агент косвенно регулирует активность клостридиального нейротоксина.
Пониженное количество, упомянутое выше, может иметь место по сравнению с эквивалентной клеткой в отсутствие агента.
Путем дальнейшего использования известного прямого ингибитора активности клостридиального нейротоксина можно подтвердить, что агент косвенно регулирует активность клостридиального нейротоксина на уровне миграции рецептора клостридиального нейротоксина. Например, косвенная регуляция может быть подтверждена, если количество рецептора, обнаруженное в присутствии ингибитора, меньше количества рецептора, обнаруженного в эквивалентной клетке, которая также контактировала с клостридиальным нейротоксином и ингибитором, но не контактировала с агентом (и наоборот).
В одном из вариантов осуществления обнаружение эквивалентного или большего количества рецептора клостридиального нейротоксина на поверхности клетки, контактирующей с: а) клостридиальным нейротоксином и b) агентом, может указывать на то, что агент не регулирует косвенно активность клостридиального нейротоксина.
Эквивалентное или большее количество, упомянутое выше, может иметь место по сравнению с эквивалентной клеткой в отсутствие агента.
Предпочтительно, рецептором клостридиального нейротоксина является SV2.
Настоящее изобретение преодолевает ограничение предшествующих анализов, заключающееся в том, что во многих типах клеток нормальные уровни SV2 на клеточной поверхности являются низкими и их трудно обнаружить, и поэтому невозможно/трудно определить, изменяются ли эти уровни, когда экспрессия гена-мишени изменена или в присутствии агента.
- 5 048091
В одном из вариантов осуществления известным прямым ингибитором активности клостридиального нейротоксина является миРНК или кшРНК, которая подавляет экспрессию тиоредоксинредуктазы.
Способы по настоящему изобретению являются особенно подходящими для высокопроизводительного скрининга. В этом отношении способы могут включать использование множества образцов клеток, предпочтительно, при этом экспрессия разных генов-мишеней изменяется в каждом из образцов клеток. Библиотеки РНКи (или эквивалентные библиотеки сайленсинга генов) особенно хорошо подходят для применения в таких высокопроизводительных методах, как библиотеки лекарственных препаратов.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления способ по изобретению включает:
a) предоставление множества образцов нейронных клеток человека, экспрессирующих полипептид, который содержит С-концевую обнаруживаемую метку, при этом полипептид может расщепляться клостридиальным нейротоксином;
b) изменение экспрессии разных генов-мишеней в каждом из множества образцов, при этом генмишень отличается в каждом образце клеток;
c) контактирование клеток с клостридиальным нейротоксином;
d) измерение количества С-концевой обнаруживаемой метки, посредством чего количественно определяют активность клостридиального нейротоксина; и
e) идентификацию одного или более генов-мишеней в качестве регуляторов активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина отличается от количественно определенной активности клостридиального нейротоксина для случая, когда экспрессия одного или более генов-мишеней не изменена; или
f) идентификацию того, что один или более генов-мишеней не являются регуляторами активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина эквивалентна количественно определенной активности клостридиального нейротоксина в случае, когда экспрессия одного или более генов-мишеней не изменена.
В другом варианте осуществления способ включает:
a) предоставление множества образцов нейронных клеток человека, экспрессирующих полипептид, который содержит С-концевую обнаруживаемую метку, при этом полипептид может расщепляться клостридиальным нейротоксином;
b) контактирование клеток с клостридиальным нейротоксином и агентом, при этом контактирование является последовательным или одновременным, и при этом каждый из образцов контактирует с разным агентом;
c) измерение количества С-концевой обнаруживаемой метки, посредством чего количественно определяют активность клостридиального нейротоксина; и
d) идентификацию одного или более агентов в качестве регуляторов активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина отличается от количественно определенной активности клостридиального нейротоксина в отсутствие одного или более агентов; или
e) идентификацию того, что один или более агентов не являются регуляторами активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина эквивалентна количественно определенной активности клостридиального нейротоксина в отсутствие одного или более агентов.
Используемый в настоящем описании термин множество означает два или более. Предпочтительно, термин множество означает более двух, например, >50, >100, >150, >200, >250 или >300.
Способ может включать использование многолуночного планшета, в котором каждая лунка содержит один из множества образцов. Чувствительность и высокое отношение сигнал/шум способов по настоящему изобретению позволяют использовать многолуночные планшеты, содержащие >150 лунок (предпочтительно, >300 лунок, например, 384-луночный планшет). Предпочтительно, это позволяет повысить производительность по сравнению со способами, в которых используются планшеты с количеством лунок <150 (например, 96-луночные планшеты).
Количественное определение активности клостридиального нейротоксина путем измерения количества обнаруживаемой С-концевой метки в соответствии со способами по настоящему изобретению особенно хорошо подходит для простого и быстрого получения изображений и количественной оценки с применением автоматизированных и/или высокопроизводительных средств (например, микроскопия в сочетании с программным обеспечением для автоматического анализа). Более того, нейронные клетки человека по настоящему изобретению являются высокочувствительными к клостридиальным нейротоксинам, что позволяет сократить время воздействия для генерирования сигнала, достаточного для обнаружения. Это особенно подходит для применения в автоматическом скрининге с меньшими форматами многолуночных планшетов, например, содержащими >150 лунок (например, 384-луночные планшеты), поскольку более короткое время инкубации делает логистику планирования автоматизированных этапов в способе менее сложной. Снижается сложность узких мест при продвижении группы планшетов (в процессе скрининга) от одной стадии к другой, когда некоторые стадии завершаются за минуты, а другие
- 6 048091 за часы или дни; требуется меньшее количество и более короткие этапы удержания, и оборудование занято меньше времени.
Способы идентификации гена, который регулирует активность клостридиального нейротоксина, включают изменение экспрессии гена-мишени. Изменение может представлять собой повышающую или понижающую регуляцию экспрессии (по сравнению с уровнем экспрессии в эквивалентной клетке, в которой экспрессия не была изменена, т.е., в которой экспрессия гена-мишени не изменена). Изменение экспрессии гена-мишени может быть достигнуто с применением любого способа, известного в данной области техники, например, путем редактирования гена, сверхэкспрессии или сайленсинга гена.
В одном из вариантов осуществления экспрессия изменяется посредством понижающей регуляции экспрессии гена-мишени (например, посредством сайленсинга гена). Предпочтительным способом понижающей регуляции экспрессии гена-мишени является РНК-интерференция (РНКи), например, с использованием коротких интерферирующих или коротких шпилечных РНК (миРНК или кшРНК).
В вариантах осуществления, в которых экспрессию изменяют посредством понижающей регуляции экспрессии гена-мишени, ген-мишень может быть идентифицирован как положительный регулятор активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина ниже, чем количественно определенная активность клостридиального нейротоксина в случае, когда экспрессия гена-мишени не изменена. Альтернативно, ген-мишень может быть идентифицирован как отрицательный регулятор активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина выше, чем количественно определенная активность клостридиального нейротоксина в случае, когда экспрессия гена-мишени не изменена.
Напротив, в вариантах осуществления, в которых экспрессию изменяют посредством повышающей регуляции экспрессии гена-мишени, ген-мишень может быть идентифицирован как отрицательный регулятор активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина ниже, чем количественно определенная активность клостридиального нейротоксина в случае, когда экспрессия гена-мишени не изменена. Альтернативно, ген-мишень может быть идентифицирован как положительный регулятор активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина выше, чем количественно определенная активность клостридиального нейротоксина в случае, когда экспрессия гена-мишени не изменена.
Способы идентификации агента, который регулирует активность клостридиального нейротоксина, включают контактирование клеток с клостридиальным нейротоксином и агентом, при этом контактирование является последовательным (например, контактирование с клостридиальным нейротоксином, а затем с агентом, или контакт с агентом, а затем с клостридиальным нейротоксином) или одновременным. Предпочтительно, контактирование является последовательным.
В одном из вариантов осуществления клетки контактируют с агентом перед контактом с клостридиальным нейротоксином. Такие способы являются особенно подходящими для идентификации агентов, способных предотвратить интоксикацию клостридиальным нейротоксином. Агенты, способные предотвратить интоксикацию, могут являться подходящими для применения в терапии в качестве профилактических средств.
Альтернативно, клетки могут контактировать с агентом после контакта с лостридиальным нейротоксином. Такие способы являются особенно подходящими для идентификации агентов, способных ингибировать активность клостридиального нейротоксина после интоксикации, и могут являться подходящими для применения в терапии после интоксикации в качестве терапевтических средств.
Агент, идентифицированный как положительный регулятор активности клостридиального нейротоксина, может представлять собой агент, являющийся сенсибилизирующим в отношении клостридиального нейротоксина. Такие агенты могут применяться в терапии в сочетании с клостридиальным нейротоксином для модуляции местной активности клостридиальных нейротоксинов (например, в целях снижения дозировки и сведения к минимуму распространения на другие ткани).
Активность клостридиального нейротоксина может быть определена количественно путем измерения количества обнаруживаемой С-концевой метки. Предпочтительно, активность клостридиального нейротоксина может быть определена количественно путем измерения количества детектируемой Сконцевой метки и детектируемой N-концевой метки.
Количество С-концевой обнаруживаемой метки после контакта клеток с клостридиальным нейротоксином можно сравнивать с количеством С-концевой обнаруживаемой метки, измеренным в отсутствие клостридиального нейротоксина. Например, количество детектируемой С-концевой метки можно измерять в образце одних и тех же клеток до и после контакта с клостридиальным нейротоксином. В качестве альтернативы, количество С-концевой обнаруживаемой метки можно измерять после контакта с клостридиальным нейротоксином и сравнивать с количеством С-концевой обнаруживаемой метки, присутствующей в эквивалентном образце клеток в эквивалентных условиях, которые не контактировали с клостридиальным нейротоксином.
В одном из вариантов осуществления потеря С-концевой обнаруживаемой метки (например, с течением времени) по сравнению с эквивалентной клеткой, которая не контактировала с клостридиальным
- 7 048091 нейротоксином, или по сравнению с той же клеткой до контакта с клостридиальным нейротоксином, указывает на наличие активности клостридиального нейротоксина. В качестве альтернативы, в одном из вариантов осуществления отсутствие потери (или обнаружение эквивалентного количества) С-концевой обнаруживаемой метки (например, с течением времени) по сравнению с эквивалентной клеткой, которая не контактировала с клостридиальным нейротоксином, или по сравнению с той же клеткой до контакта с клостридиальным нейротоксином, указывает на отсутствие активности клостридиального нейротоксина. В одном из вариантов осуществления частичная потеря С-концевой обнаруживаемой метки (например, с течением времени) по сравнению с эквивалентной клеткой, которая не контактировала с клостридиальным нейротоксином, или по сравнению с той же клеткой до контакта с клостридиальным нейротоксином, может указывать на наличие пониженной активности клостридиального нейротоксина (и наоборот).
Способ может дополнительно включать измерение количества N-концевой обнаруживаемой метки. Аналогично С-концевой метке, количество N-концевой обнаруживаемой метки после контактирования клеток с клостридиальным нейротоксином можно сравнивать с количеством N-концевой обнаруживаемой метки, измеренным в отсутствие клостридиального нейротоксина. Например, количество Nконцевой обнаруживаемой метки можно измерять в образце одних и тех же клеток до и после контакта с клостридиальным нейротоксином. В качестве альтернативы, количество N-концевой обнаруживаемой метки можно измерять после контактирования с клостридиальным нейротоксином и сравнивать с количеством N-концевой обнаруживаемой метки, присутствующей в эквивалентном образце клеток в эквивалентных условиях, которые не контактировали с клостридиальным нейротоксином.
Предпочтительно, активность клостридиального нейротоксина определяют путем сравнения количества N-концевой метки и С-концевой метки. Большее количество N-концевой метки по отношению к С-концевой метке, предпочтительно, указывает на то, что полипептид был расщеплен клостридиальным нейротоксином.
Обнаруживаемую метку по изобретению могут измерять в один или более моментов времени после контактирования клеток с клостридиальным нейротоксином. Посредством этого можно рассчитать уровень активности клостридиального нейротоксина.
В одном из вариантов осуществления обнаруживаемую метку могут измерять после контактирования клеток с клостридиальным нейротоксином в течение, по меньшей мере, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 или 70 ч. В других вариантах осуществления обнаруживаемую метку могут измерять после контактирования клеток с клостридиальным нейротоксином в течение менее 100, 80, 70, 60 или 50 ч. Предпочтительно, обнаруживаемую метку могут измерять после контактирования клеток с клостридиальным нейротоксином в течение менее 72 ч, более предпочтительно менее 50 ч. Таким образом, обнаруживаемую метку могут измерять после контактирования клеток с клостридиальным нейротоксином в течение 20-60 ч, предпочтительно, 40-55 ч (например, около 48 ч). Клетки могут быть зафиксированы до измерения количества обнаруживаемой метки.
При сравнении клеток по способу изобретения с контролем (например, эквивалентной клеткой, в которой экспрессия гена-мишени не изменена или которая не контактировала с агентом по изобретению, или другим контролем, упомянутым выше), предполагается, что измерения выполняют одним и тем же способом (например, в один и тот же момент времени после контактирования клеток с клостридиальным нейротоксином). Это позволяет сравнивать количественно определенную активность клостридиального нейротоксина клеток по способу и контроля, с тем чтобы идентифицировать наличие или отсутствие различия в активности клостридиального нейротоксина.
Этап измерения или обнаружения по изобретению может быть выполнен с применением любых подходящих средств, известных специалисту. В одном из вариантов осуществления флуоресцентную метку, присутствующую на полипептиде (или присутствующую на антителе, связывающемся с рецептором клостридиального нейротоксина), возбуждают светом подходящей длины волны и детектируют результирующую флуоресценцию. Таким образом, в изобретении можно применять флуоресцентную микроскопию. В предпочтительном варианте осуществления этап измерения или обнаружения включает применение высокопроизводительной системы скрининга. Примером подходящей системы является система скрининга Opera Phenix™ High-Content, которая коммерчески доступна от PerkinElmer, и/или применение подходящего программного обеспечения для обработки изображений, такого как программное обеспечение Columbus™ (коммерчески доступно от PerkinElmer). В некоторых вариантах осуществления этап измерения или обнаружения изобретения автоматизирован и может включать применение робототехники.
В способе по изобретению, предпочтительно, не используется электронная связь между обнаруживаемыми метками, описанными в настоящем описании. В частности, является предпочтительным, чтобы метки не располагались таким образом, чтобы донорная метка (например, N-концевая метка) могла передавать энергию акцепторной метке (например, С-концевой метке), например, с помощью механизма диполь-дипольного связывания. Предпочтительно, изобретение не предполагает использование резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).
Способы по изобретению могут включать этап проверки, на котором количественно определенную активность клостридиального нейротоксина, обнаруженную в способе, сравнивают с положительным
- 8 048091 контролем. Положительная проверка может иметь место, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина эквивалентна активности положительного контроля.
Способ по изобретению может включать дополнительную проверку того, что регулятор действительно является положительным регулятором. В одном из вариантов осуществления способ включает контактирование клеток с известным отрицательным регулятором активности клостридиального нейротоксина и демонстрацию того, что влияние на активность клостридиального нейротоксина является обратимым. В одном из вариантов осуществления способ включает повышающую регуляцию экспрессии известного отрицательного регулятора активности клостридиального нейротоксина и демонстрацию того, что влияние на активность клостридиального нейротоксина является обратимым. Предпочтительно, способ включает понижающую регуляцию экспрессии известного положительного регулятора активности клостридиального нейротоксина и демонстрацию того, что влияние на активность клостридиального нейротоксина является обратимым.
Способ по изобретению может включать дополнительную проверку того, что регулятор действительно является отрицательным регулятором. В одном из вариантов осуществления способ включает контактирование клеток с известным положительным регулятором активности клостридиального нейротоксина и демонстрацию того, что влияние на активность клостридиального нейротоксина является обратимым. В одном из вариантов осуществления способ включает понижающую регуляцию экспрессии известного отрицательного регулятора активности клостридиального нейротоксина и демонстрацию того, что влияние на активность клостридиального нейротоксина является обратимым. В одном из вариантов осуществления способ включает повышающую регуляцию экспрессии известного положительного регулятора активности клостридиального нейротоксина и демонстрацию того, что влияние на активность клостридиального нейротоксина является обратимым.
Известным (положительным) регулятором активности клостридиальных нейротоксинов является тиоредоксинредуктаза. В одном из вариантов осуществления экспрессия тиоредоксинредуктазы подвергается повышающей регуляции. Предпочтительно, экспрессия тиоредоксинредуктазы подвергается понижающей регуляции.
Используемый в настоящем описании термин эквивалент может означать, что два или более сравниваемых значения не отличаются на статистически значимом уровне. Используемый в настоящем описании термин эквивалент, предпочтительно, означает, что два или более значений идентичны. Точно так же, термин не изменена, используемый в настоящем описании, может означать, что два или более сравниваемых значения не отличаются на статистически значимом уровне. Предпочтительно, термин не изменена, используемый в настоящем описании, означает, что два или более значений идентичны.
Упомянутое в настоящем описании различие или изменение (например, повышение или понижение) предпочтительно, означает статистически значимое различие или изменение (например, статистически значимое повышение или понижение). Таким образом, различие в количественно определенной активности клостридиального нейротоксина, предпочтительно, является статистически значимым различием в количественно определенной активности клостридиального нейротоксина. В одном из вариантов осуществления различие в количественно определенной активности клостридиального нейротоксина составляет, по меньшей мере, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% или 50% по сравнению с количественно определенной активностью клостридиального нейротоксина для отрицательного контроля (например, эквивалентная клетка, в которой экспрессия гена-мишени не изменена или которая не контактировала с агентом по изобретению или другим контролем, упомянутым выше).
Способы по настоящему изобретению представляют собой способы in vitro.
В одном из вариантов осуществления способы по изобретению представляют собой способы с использованием живых клеток, и, необязательно, в этих способах применяется мониторинг активности клостридиального нейротоксина в реальном времени, когда изменяется экспрессия гена-мишени и/или когда клетки контактируют с агентом.
Предпочтительно, термин контактирование клетки с клостридиальным нейротоксином означает, что поверхность клетки контактирует с клостридиальным нейротоксином. Соответственно, клостридиальный нейротоксин может быть добавлен в среду, в которой присутствует клетка, например, в среду для культивирования клеток. Термин контактирование клетки с клостридиальным нейротоксином, предпочтительно, исключает контактирование посредством экспрессии клостридиального нейротоксина в клетке, поскольку эта методика не дает информации относительно связывания, интернализации и/или транслокации клостридиального нейротоксина.
Способ по изобретению обычно включает контактирование клеток с клостридиальным нейротоксином в концентрации менее 1500 нМ. В одном из вариантов осуществления клетки контактируют с клостридиальным нейротоксином в концентрации менее чем 1000 нМ, например, менее чем 500 нМ, 250 нМ или 100 нМ.
Способ по изобретению может включать контактирование клеток с клостридиальным нейротоксином в концентрации, по меньшей мере, 1 нМ, 5 нМ, 10 нМ, 20 нМ или 50 нМ.
В одном из вариантов осуществления способ по изобретению может включать контактирование клеток с клостридиальным нейротоксином в концентрации 1-1000 нМ, например, с клостридиальным нейротоксином в концентрации 1-500 нМ или 1-200 нМ.
- 9 048091
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что посредством контактирования клеток с буфером, содержащим GDNF и проницаемый для клеток сАМР (и, необязательно, дополнительно содержащим CaCl2 и KCl), можно повысить чувствительность способов по настоящему изобретению. В присутствии буфера клетки становятся высокочувствительными к клостридиальному нейротоксину при концентрации менее 100 нМ, предпочтительно, менее 50 нМ, более предпочтительно, 5-15 нМ (например, ~10 нМ).
Буфер может содержать GDNF, d-cAMP, CaCl2 и KCl. GDNF может присутствовать в количестве 1100 нг/мл, предпочтительно, 10 нг/мл. d-cAMP может присутствовать в концентрации 0,1-5 мМ, предпочтительно, 1 мМ. CaCl2 может присутствовать в концентрации 0,1-7 мМ, предпочтительно, 2 мМ. KCl может присутствовать в количестве 1-100 мМ, предпочтительно, 56 мМ.
Буфер может являться компонентом набора по настоящему изобретению.
Таким образом, в одном из аспектов изобретение предоставляет композицию, содержащую:
a) клостридиальный нейротоксин и
b) буфер, содержащий GDNF, проницаемый для клеток циклический аденозинмонофосфат (сАМР), CaCl2 и KCl.
В одном из вариантов осуществления композиция содержит GDNF, присутствующий в концентрации 1-100 нг/мл, d-cAMP, присутствующий в концентрации 0,1-5 мМ, CaCl2, присутствующий в концентрации 0,1-7 мМ, и KCl, присутствующий в концентрации 1-100 мМ. Предпочтительно, буфер содержит GDNF в концентрации 10 нг/мл, d-cAMP в концентрации 1 мМ, CaCl2 в концентрации 2 мМ и KCl в концентрации 56 мМ.
Ссылка в настоящем описании на сАМР, предпочтительно, является взаимозаменяемой с d-cAMP.
Композиция может содержать менее 1500 нМ клостридиального нейротоксина. В одном из вариантов осуществления композиция содержит менее 1000 нМ, например, менее 500, 250 или 100 нМ клостридиального нейротоксина. В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать, по меньшей мере 1 нМ, 5 нМ, 10 нМ, 20 нМ или 50 нМ клостридиального нейротоксина. В одном из вариантов осуществления композиция содержит 1-1000 нМ клостридиального нейротоксина, например, 1-500 нМ или 1-200 нМ клостридиального нейротоксина. Предпочтительно, композиция содержит клостридиальный нейротоксин в концентрации менее 100 нМ, предпочтительно, менее 50 нМ, более предпочтительно, 5-15 нМ (например, ~10 нМ).
В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетки, такие как нейронные клетки человека, описанные в настоящем описании.
Клетки можно инкубировать с клостридиальным нейротоксином в течение любого подходящего времени. В одном из вариантов осуществления клетки можно инкубировать с клостридиальным нейротоксином в течение, по меньшей мере, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 или 70 ч. В других вариантах осуществления клетки можно инкубировать с клостридиальным нейротоксином в течение менее 100, 80, 70, 60 или 50 ч. Предпочтительно, клетки инкубируют с клостридиальным нейротоксином менее 72 ч, более предпочтительно, менее 50 ч. Таким образом, клетки можно инкубировать с клостридиальным нейротоксином в течение 20-60 ч, предпочтительно, 40-55 ч (например, около 48 ч). Предпочтительно, нейронные клетки человека по настоящему изобретению являются высокочувствительными к клостридиальным нейротоксинам, что обеспечивает короткие периоды инкубации с клостридиальным нейротоксином, составляющие менее 72 ч (~48 ч), и, таким образом, сокращает время, необходимое для проведения анализа.
Клетки можно инкубировать с клостридиальным нейротоксином при любой подходящей температуре. В одном из вариантов осуществления клетки инкубируют с клостридиальным нейротоксином при 30-40°С, предпочтительно 37°С.
Ген-мишень или агент, идентифицированный посредством способа по настоящему изобретению, можно использовать в способе лечения расстройства. Таким образом, в одном из аспектов изобретение предоставляет способ лечения расстройства, включающий введение субъекту агента, идентифицированного посредством способа по изобретению. В другом аспекте изобретение предоставляет способ лечения расстройства, включающий изменение экспрессии гена у субъекта, при этом ген был идентифицирован посредством способа по изобретению.
В одном из аспектов изобретение предоставляет набор, содержащий: клетку согласно изобретению; и, необязательно, инструкции по ее применению (например, в способе, описанном в настоящем описании). В родственном аспекте изобретение предоставляет набор, содержащий нуклеотидную последовательность согласно изобретению; и, необязательно, инструкции по ее применению (например, в способе, описанном в настоящем описании). В родственном аспекте изобретение предоставляет набор, содержащий вектор согласно изобретению; и, необязательно, инструкции по его применению (например, в способе, описанном в настоящем описании). В одном из вариантов осуществления набор содержит клетку (предпочтительно, клетку, идентичную типу клеток по настоящему изобретению, но не содержащую нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению и не экспрессирующую полипептид по настоящему изобретению), нуклеотидную последовательность или вектор по настоящему изобретению и, необязательно, инструкции по их применению (например, в способе, описанном в настоящем описании). Указанные наборы могут содержать один или более отдельных контейнеров, каждый из которых содержит указанный компонент набора.
- 10 048091
Настоящее изобретение является подходящими для применения ко многим различным разновидностям клостридиального нейротоксина. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термин клостридиальный нейротоксин охватывает токсины, продуцируемые С. Botulinum (серотипы ботулинического нейротоксина А, В, Cl, D, E, F, G, Н и X), С. Tetani (столбнячный нейротоксин), С. Butyricum (ботулинический нейротоксин серотипа Е) и С. Baratii (ботулинический нейротоксин серотипа F), а также модифицированные клостридиальные нейротоксины или производные, полученные из любого из вышеперечисленных нейротоксинов. Термин клостридиальный нейротоксин также охватывает ботулинический нейротоксин серотипа Н.
Ботулинический нейротоксин (BoNT) продуцируется С. Botulinum в форме большого белкового комплекса, состоящего из самого BoNT, соединенного с рядом дополнительных белков. В настоящее время существует девять различных классов ботулинических нейротоксинов, а именно: серотипы ботулинического нейротоксина А, В, Cl, D, E, F, G, Н и X, которые имеют схожие структуры и механизмы действия. Различные серотипы BoNT можно различить на основе инактивации специфическими нейтрализующими антисыворотками, при этом такая классификация по серотипу коррелирует с процентной идентичностью последовательностей на аминокислотном уровне. Белки BoNT заданного серотипа далее разделяют на разные подтипы на основе процента идентичности аминокислотных последовательностей.
BoNT абсорбируются в желудочно-кишечном тракте и, попадая в общий кровоток, связываются с пресинаптической мембраной холинергических нервных окончаний и предотвращают высвобождение их нейромедиатора ацетилхолина.
Столбнячный токсин продуцируется в единственном серотипе С. tetani. С. Butyricum продуцирует BoNT/E, а С. Baratii продуцирует BoNT/F.
Термин клостридиальный нейротоксин также предназначен для охвата модифицированных клостридиальных нейротоксинов и их производных, включая, но не ограничиваясь ими, описанные ниже. Модифицированный клостридиальный нейротоксин или его производная может содержать одну или более аминокислот, которые были модифицированы по сравнению с нативной (немодифицированной) формой клостридиального нейротоксина, или могут содержать одну или более вставленных аминокислот, которые отсутствуют в нативной (немодифицированной) форме клостридиального нейротоксина. Например, модифицированный клостридиальный нейротоксин может иметь модифицированные аминокислотные последовательности в одном или более доменах относительно нативной (немодифицированной) последовательности клостридиального нейротоксина. Такие модификации могут изменять функциональные аспекты токсина, например, биологическую активность или персистенцию. Таким образом, в одном из вариантов осуществления клостридиальный нейротоксин по изобретению представляет собой модифицированный клостридиальный нейротоксин, или модифицированную производную клостридиального нейротоксина, или производную клостридиального нейротоксина.
Модифицированный клостридиальный нейротоксин может иметь одну или более модификаций в аминокислотной последовательности тяжелой цепи (например, модифицированный домен HC), при этом указанная модифицированная тяжелая цепь связывается с нервными клетками-мишенями с более высокой или более низкой аффинностью, чем нативный (немодифицированный) клостридиальный нейротоксин. Такие модификации в домене HC могут включать модифицирующие остатки в сайте связывания ганглиозидов домена HC или в сайте связывания белка (SV2 или синаптотагмин), которые изменяют связывание с рецептором ганглиозида и/или рецептором белка нервной клетки-мишени. Примеры таких модифицированных клостридиальных нейротоксинов описаны в WO 2006/027207 и WO 2006/114308, которые включены в настоящее описание во всей их полноте посредством ссылки.
Модифицированный клостридиальный нейротоксин может иметь одну или более модификаций в аминокислотной последовательности легкой цепи, например, модификации в связывающем субстрате или каталитическом домене, которые могут изменять или модифицировать специфичность SNARE-белка модифицированной L-цепи. Примеры таких модифицированных клостридиальных нейротоксинов описаны в WO 2010/120766 и US 2011/0318385, которые включены в настоящее описание во всей их полноте посредством ссылки.
Модифицированный клостридиальный нейротоксин может содержать одну или более модификаций, которые повышают или понижают биологическую активность и/или биологическую персистенцию модифицированного клостридиального нейротоксина. Например, модифицированный клостридиальный нейротоксин может содержать мотив на основе лейцина или тирозина, при этом указанный мотив повышает или понижает биологическую активность и/или биологическую персистенцию модифицированного клостридиального нейротоксина. Подходящие мотивы на основе лейцина включают xDxxxLL (SEQ ID NO: 22), xExxxLL (SEQ ID NO: 23), xExxxIL (SEQ ID NO: 24) и xExxxLM (SEQ ID NO: 25) (где х представляет собой произвольную аминокислоту). Подходящие мотивы на основе тирозина включают YxxHy (SEQ ID NO: 26) (где Ну представляет собой гидрофобную аминокислоту). Примеры модифицированных клостридиальных нейротоксинов, содержащих мотивы на основе лейцина и тирозина, описаны в WO 2002/08268, которая включены в настоящее описание во всей ее полноте посредством ссылки.
Термин клостридиальный нейротоксин охватывает гибридные и химерные клостридиальные нейротоксины. Гибридный клостридиальный нейротоксин содержит, по меньшей мере, часть легкой цепи
- 11 048091 одного клостридиального нейротоксина или его подтипа и, по меньшей мере, часть тяжелой цепи другого клостридиального нейротоксина или клостридиального нейротоксина другого подтипа. В одном из вариантов гибридный клостридиальный нейротоксин может содержать всю легкую цепь легкой цепи одного подтипа клостридиального нейротоксина и тяжелую цепь другого подтипа клостридиального нейротоксина. В другом варианте осуществления химерный клостридиальный нейротоксин может содержать часть (например, связывающий домен) тяжелой цепи одного подтипа клостридиального нейротоксина, при этом другая часть тяжелой цепи принадлежит другому подтипу клостридиального нейротоксина. Аналогично или альтернативно, терапевтический элемент может содержать части легкой цепи из различных клостридиальных нейротоксинов. Такие гибридные или химерные клостридиальные нейротоксины являются полезными, например, в качестве средства доставки терапевтических преимуществ таких клостридиальных нейротоксинов пациентам, которые являются иммунологически устойчивыми к данному подтипу клостридиальных нейротоксинов, пациентам, которые могут иметь концентрацию рецепторов к заданному домену связывания тяжелой цепи клостридиального нейротоксина ниже среднего уровня, или пациентам, которые могут иметь устойчивый к протеазе вариант мембранного или везикулярного токсинового субстрата (например, SNAP-25, VAMP и синтаксин). Гибридные и химерные клостридиальные нейротоксины описаны в патенте США 8071110, публикация которого включена в настоящий документ посредством ссылки во всей ее полноте. Таким образом, в одном из вариантов осуществления клостридиальный нейротоксин по изобретению представляет собой гибридный клостридиальный нейротоксин или химерный клостридиальный нейротоксин.
Термин клостридиальный нейротоксин может также охватывать недавно обнаруженные члены семейства белков ботулинического нейротоксина, экспрессируемые неклостридиальными микроорганизмами, такие как кодируемый энтерококком токсин, который имеет наибольшую идентичность последовательности с BoNT/X, кодируемый Weissella oryzae токсин, называемый BoNT/Wo (NCBI Ref Seq: WP_027699549.1), который расщепляет VAMP2 на W89-W90, кодируемый Enterococcus faecium токсин (GenBank: ОТО22244.1), который расщепляет VAMP2 и SNAP-25, кодируемый Chryseobacterium pipero токсин (NCBI Ref Seq: WP_034687872.1 ).
В предпочтительном варианте осуществления клостридиальный нейротоксин представляет собой ботулинический нейротоксин, более предпочтительно, BoNT/A.
В одном из вариантов осуществления клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/A. Референсная последовательность BoNT/A представлена как SEQ ID NO: 13.
В другом варианте осуществления клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/B. Референсная последовательность BoNT/B представлена как SEQ ID NO: 14.
В другом варианте осуществления клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/C. Референсная последовательность BoNT/C представлена как SEQ ID NO: 15.
В другом варианте осуществления клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/D. Референсная последовательность BoNT/D представлена как SEQ ID NO: 16.
В другом варианте осуществления клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/E. Референсная последовательность BoNT/E представлена как SEQ ID NO: 17.
В другом варианте осуществления клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/F. Референсная последовательность BoNT/F представлена как SEQ ID NO: 18.
В другом варианте осуществления клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/G. Референсная последовательность BoNT/G представлена как SEQ ID NO: 19.
В одном из вариантов осуществления клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/X. Референсная последовательность BoNT/X представлена как SEQ ID NO: 20.
В другом варианте осуществления клостридиальный нейротоксин может представлять собой TeNT. Референсная последовательность TeNT представлена как SEQ ID NO: 21.
Варианты осуществления, относящиеся к различным способам изобретения, в равной степени предназначены для применения к другим способам, клеткам, полипептидам, нуклеотидным последовательностям, наборам и композициям согласно изобретению, и наоборот.
Гомология последовательности
Для определения процента идентичности можно применить любой из множества методов выравнивания последовательностей, включая, без ограничения, методы глобального выравнивания, методы локального выравнивания и гибридные методы, такие как, например, методы сегментного подхода. Протоколы для определения процента идентичности являются обычными процедурами в пределах компетенции специалиста в данной области техники. Методы глобального выравнивания выравнивают последовательности от начала до конца молекулы и определяют наилучшее выравнивание посредством сложения оценок отдельных пар остатков и применения штрафов за пропуски. Неограничивающие методы включают, например, Clustal W., см., например, Julie D. Thompson и соавт., Clustal W.: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 46734680 (1994); и итеративное уточнение, см., например, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996). Методы локального выравнивания выравнивают последовательности посредством
- 12 048091 идентификации одного или более консервативных мотивов, являющихся общими для всех входных последовательностей. Неограничивающие методы включают, например, Match-box, см., например, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); выборка Гиббса, см., например, С.Е. Lawrence и соавт., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262 (5131) Science 208-214 (1993); Align-M., см., например, Ivo Van Walle и соавт., Align-M. - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics: 1428-1435 (2004).
Таким образом, процент идентичности последовательностей определяется обычными методами; см., например, Altschul и соавт., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 и Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-19, 1992. Вкратце, две аминокислотные последовательности выравниваются для оптимизации оценок выравнивания с применением штрафа за открытие пропуска, равного 10, штрафа за удлинение пропуска, равного 1, и матрицы замен blosum 62 Хеникофф и Хеникофф (там же), как показано ниже (аминокислоты обозначены стандартными однобуквенными кодами).
Процент идентичности последовательностей между двумя или более последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот является функцией количества идентичных позиций, общих для последовательностей. Таким образом, % идентичности можно рассчитать как количество идентичных нуклеотидов/аминокислот, деленное на общее количество нуклеотидов/аминокислот, и затем умноженное на 100. При расчете % идентичности последовательности также можно учитывать количество пропусков и длину каждого пропуска, которые необходимо ввести для оптимизации выравнивания двух или более последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя или более последовательностями можно проводить с использованием определенных математических алгоритмов, таких как BLAST, которые будут знакомы специалисту в данной области техники.
Оценки выравнивания для определения идентичности последовательностей ARNDCQEGHI LKMFPSTWYV
А 4
R -15
N -2 06
D -2 -2 16
СО -3-3-3 9
Q -1 1 0 0 -35
Е -1 0 0 2 -4 25
G0 -2 0 -1-3 -2 -2 6
Н -2 0 1 -1 -3 0 0 -28
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -34
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4-3 24
К -1 2 0 -1 -3 1 1 -2-1 -3 -25
Μ -1 -1 -2 -3 -1 0 -2-3-2 1 2-15
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 06
Р -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -47
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -14
Т 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2-11 5 w -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -211
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 27
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3-1 4
Затем процент идентичности рассчитывают как:
Общее количество совпадающих символов ------z----------------------------------х 100 длина более длинной последовательности плюс количество пропусков, внесенных в более длинную последовательность для выравнивания двух последовательностей
По существу гомологичные полипептиды характеризуются наличием одной или более аминокис лотных замен, делеций или вставок. Эти изменения, предпочтительно, носят незначительный характер, то есть, являются консервативными аминокислотными заменами (см. ниже) и другими заменами, которые существенно не влияют на сворачивание или активность полипептида; небольшие делеции, обычно от одной до около 30 аминокислот; и небольшие удлинения на амино- или карбоксильном конце, такие как аминоконцевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид длиной вплоть до около 20-25 остатков, или аффинная метка.
- 13 048091
Консервативные аминокислотные замены
Основные:
аргинин, лизин, гистидин. Кислотные: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота.
Полярные:
глутамин, аспарагин.
Гидрофобные:
лейцин, изолейцин, валин.
Ароматические:
фенилаланин, триптофан, тирозин.
Малые:
глицин, аланин, серин, треонин, метионин.
Помимо 20 стандартных аминокислот, нестандартные аминокислоты (такие как 4-гидроксипролин, 6-Ы-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и α-метилсерин) могут заменять аминокислотные остатки в полипептидах по настоящему изобретению. Ограниченное количество неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, и неприродных аминокислот могут замещать аминокислотные остатки полипептида. Полипептиды по настоящему изобретению могут также содержать не встречающиеся в природе аминокислотные остатки.
Не встречающиеся в природе аминокислоты включают, без ограничения, транс-3-метилпролин, 2,4метанопролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4фторфенилаланин. В данной области техники известно несколько способов включения не встречающихся в природе аминокислотных остатков в белки. Например, можно использовать систему in vitro, в которой нонсенс-мутации подавляются с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области техники. Транскрипция и трансляция плазмид, содержащих нонсенс-мутации, осуществляется в бесклеточной системе, содержащей экстракт E.coli S30 и коммерчески доступные ферменты, и другие реагенты. Белки очищают посредством хроматографии; см., например, Robertson и соавт., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman и соавт., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung и соавт., Science 259: 806-9, 1993 и Chung и соавт., Proc. Natl. Акад. Sci. USA 90: 10145-9, 1993). Во втором способе трансляция осуществляется в ооцитах Xenopus путем микроинъекции мутированной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (Turcatti и соавт., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). В рамках третьего способа клетки E.coli культивируют в отсутствие естественной аминокислоты, которую необходимо заменить (например, фенилаланин), и в присутствии желаемой не встречающейся в природе аминокислоты (аминокислот) (например, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин или 4-фторфенилаланин). Не встречающаяся в природе аминокислота встраивается в полипептид вместо своего природного аналога; см. Koide и соавт., Biochem. 33: 7470-6, 1994. Встречающиеся в природе аминокислотные остатки могут быть преобразованы в не встречающиеся в природе виды путем химической модификации in vitro. Химическая модификация может быть объединена с сайт-направленным мутагенезом для дальнейшего расширения диапазона замен (Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).
Ограниченное количество неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, не встречающихся в природе аминокислот и неприродных аминокислот, могут заменять собой аминокислотные остатки полипептидов по настоящему изобретению.
Незаменимые аминокислоты в полипептидах по настоящему изобретению можно идентифицировать в соответствии с процедурами, известными в данной области техники, такими как сайтнаправленный мутагенез или мутагенез с аланиновым сканированием (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Сайты биологического взаимодействия также могут быть определены с помощью физического анализа структуры, в соответствии с определенным посредством таких методик, как ядерный
- 14 048091 магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или фотоаффинное мечение, в сочетании с мутацией предполагаемых аминокислот сайта контакта; см., например, de Vos и соавт., Science 255: 306-12, 1992; Smith и соавт., J. Mol. Биол. 224: 899-904, 1992; Wlodaver и соавт., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Идентичность незаменимых аминокислот также может быть выведена из анализа гомологий с родственными компонентами (например, транслокационными или протеазными компонентами) полипептидов по настоящему изобретению.
Множественные аминокислотные замены могут быть произведены и протестированы с применением известных способов мутагенеза и скрининга, таких как раскрытые Reidhaar-Olson и Sauer (Science 241: 53-7, 1988) или Bowie и Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989). Вкратце, эти авторы раскрывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, отбора функционального полипептида и последующего секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие способы, которые можно применять, включают фаговый дисплей (например, Lowman и соавт., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner и соавт., патент США № 5223409; Huse, публикация WIPO WO 92/06204) и регион-направленный мутагенез (Derbyshire и соавт., Gene 46: 145, 1986; Ner и соавт., DNA 7: 127, 1988).
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится настоящее раскрытие. Синглтон и соавт., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991), предоставляют общий словарь многих терминов, используемых в данном раскрытии, для квалифицированных специалистов.
Настоящее раскрытие не ограничивается типовыми способами и материалами, раскрытыми в настоящем описании, и любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем описании, могут применяться на практике или при тестировании вариантов осуществления настоящего раскрытия. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, любые последовательности нуклеиновых кислот записываются слева направо в ориентации от 5' к 3'; аминокислотные последовательности написаны слева направо в ориентации от амино к карбокси, соответственно.
Заголовки, представленные в настоящем описании, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления настоящего раскрытия.
В настоящем описании аминокислоты указываются с использованием названия аминокислоты, трехбуквенного сокращения или однобуквенного сокращения. Используемый в настоящем описании термин белок включает белки, полипептиды и пептиды. Используемый в настоящем описании термин аминокислотная последовательность является синонимом термина полипептид и/или термина белок. В некоторых случаях, термин аминокислотная последовательность является синонимом термина пептид. В некоторых случаях термин аминокислотная последовательность является синонимом термина фермент. Термины белок и полипептид используются в настоящем описании взаимозаменяемо. В настоящем раскрытии и формуле изобретения могут использоваться обычные однобуквенные и трехбуквенные коды для аминокислотных остатков. Трехбуквенный код для аминокислот определен в соответствии с Совместной комиссией IUPACIUB по биохимической номенклатуре (JCBN). Также следует понимать, что полипептид может кодироваться более чем одной нуклеотидной последовательностью вследствие вырожденности генетического кода.
В описании могут встречаться и другие определения терминов. Прежде чем типовые варианты осуществления будут описаны более подробно, следует понимать, что настоящее раскрытие не ограничивается конкретными описанными вариантами осуществления, и, следовательно, может варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем описании терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего раскрытия будет определяться только прилагаемой формулой изобретения.
Если предоставляется диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение, вплоть до одной десятой единицы нижнего предела, если контекст явно не диктует иное, между верхним и нижним пределами этого диапазона также конкретно раскрывается. Каждый меньший по размеру диапазон между любым заявленным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим заявленным или промежуточным значением в этом указанном диапазоне охвачен настоящим раскрытием. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться или исключаться из диапазона, и каждый диапазон, в котором любой, ни один, либо оба предела включены в меньшие диапазоны, также охватывается настоящим раскрытием, с учетом любого специально исключенного предела в заявленном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба из этих включенных пределов, также включены в настоящее раскрытие.
Следует отметить, что используемые в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явно не диктует иное. Таким образом, например, ссылка на некоторый клостридиальный нейротоксин включает множе
- 15 048091 ство таких кандидатов-агентов, а ссылка на указанный клостридиальный нейротоксин включает ссылку на один или более клостридиальных нейротоксинов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области техники, и так далее.
Обсуждаемые в настоящем описании публикации предназначены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем описании не должно толковаться как признание того, что такие публикации составляют предшествующий уровень техники по отношению к прилагаемой формуле изобретения.
Краткое описание чертежей
Варианты осуществления изобретения теперь будут описаны только в качестве примера со ссылкой на следующие фигуры и примеры.
На фиг. 1 показан способ создания ReNcell VM, стабильно эспрессирующей TagRFPT-SNAP25TagGFP. Изображения (внизу) показывают красную флуоресценцию (справа) и зеленую флуоресценцию (справа).
На фиг. 2 показан BoNT/A-индуцированный распад С-концевого фрагмента конструкции. Клетки ReD SNAPR дифференцировались в течение 14 дней без факторов роста, затем к клеткам добавляли 100 нМ BoNT/A и подвергали интоксикации в течение 48 ч. (А) Клетки были визуализированы с использованием флуоресцентной микроскопии, и соответствующие объединенные каналы GFP, RFP и GFP/RFP показаны на фигуре. (В) Лизаты подвергали SDS-PAGE для вестерн-блоттинга. Для вестерн-блоттинга использовали кроличьи антитела против tagRFPT и tagGFP.
На фиг. 3 показана диаграмма, обобщающая распад конструкции под действием BoNT/A.
На фиг. 4 показано, что буфер повышенной дифференцировки и стимуляции сенсибилизировал клетки ReD SNAPR к BoNT/A. (А) Клетки ReD SNAPR подвергались воздействию среды для дифференцировки ReNcell с добавлением и без GDNF и d-cAMP во время дифференцировки и буфера с высоким содержанием калия во время интоксикации. Полученная в результате модифицированная среда известна как среда ReDS (усиленная дифференцировка и стимуляция ReNcell). Потеря флуоресценции tagGFP при расщеплении конструкции SNAP25 с двойной меткой наблюдалась в зависимости от дозы. Клетки ReD SNAPR в среде ReDS проявляли повышенную чувствительность к BoNT/A по сравнению с нормальной средой ReNcell, что обнаружено с помощью конфокальной микроскопии. (В) Количественная оценка BoNT/A-опосредованного расщепления при обоих условиях показала, что ЕС5о улучшилось с 43 до 6 нМ в ReD SNAPR, подвергнутых воздействию среды ReDS. (С) Вестерн-блоттинг обнаружение BoNT/Aопосредованного расщепления конструкции SNAP25 в клетках ReD SNAPR в нормальной среде и среде ReDS. Верхний блот показывает клеточные лизаты, зондированные антителом tRFP, а нижний блот зондированные антителом tGFP.
На фиг. 5 показана siRNA против TrxR, предотвращающая BoNT/A-опосредованное расщепление конструкции. Показаны графики уровней нокдауна TrxR1 и расщепления конструкции. Верхняя панель (ReD SNAPR) показывает зеленую и красную флуоресценцию (siNT3, -BoNT/A), только красную флуоресценцию (siNR3, + BoNT/A), зеленую и красную флуоресценцию (siTrxR, -BoNT/A), а также зеленую и красную флуоресценцию (siTrxR, -BoNT/A). На нижней панели показано окрашивание на TrxR1 в присутствии siNT3 (для условий как -BoNT/A, так и+BoNT/A) и отсутствие окрашивания на TrxR1 в присутствии siTrxR (для условий как -BoNT/A, так и для+BoNT/A).
На фиг. 6 показано, что интоксикация BoNT/A предотвращает перенос SV2 на поверхность клетки. А) Клетки ReNcell VM обрабатывали siNT3, siVAMP2 и siTrxR1 в течение 72 ч перед добавлением BoNT/A. Клетки фиксировали и окрашивали первичным антителом против SV2A (без пермеабилизации). Против первичного антитела использовали вторичное антитело Alexa-488. (В) Иллюстрация BoNT/Aопосредованного снижения доставки SV2 на поверхность клетки.
На фиг. 7 представлена схема проведения полногеномного скрининга миРНК с применением клеточной линии по настоящему изобретению.
Список последовательностей
Если исходный аминокислотный остаток Met или соответствующий начальный кодон указан в любой из следующих SEQ ID NO, то указанный остаток/кодон может являться необязательным.
SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность конструкции TagRFPT-SNAP25TagGFP)
ATGGTGTCTAAGGGCGAAGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGT ACATGGAGGGCACCGTGAACAACCACCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGC AAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCT CCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACCAGCTTCATGTACGGCAGCAGAACCTTCAT CAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTTAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCAC ATGGGAGAGAGTCACCACATACGAAGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACA CCAGCCTCCAGGACGGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTC CCATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCAACACCGA GATGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAGAACCGACATGGCCCTGAAGC
- 16 048091
TCGTGGGCGGGGGCCACCTGATCTGCAACTTCAAGACCACATACAGATCCAAGAAA CCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCGTCTACTATGTGGACCACAGACTGGAAAG AATCAAGGAGGCCGACAAAGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCTGTGGCC AGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAACTTAATGGCATGGACGAGCT GTACAAGGGCTCGGGCTCGGGCTCGGGCGTGGCCGAAGACGCAGACATGCGCAATG AGCTGGAGGAGATGCAGCGAAGGGCTGACCAGTTGGCTGATGAGTCGCTGGAAAGC ACCCGTCGTATGCTGCAACTGGTTGAAGAGAGTAAAGATGCTGGTATCAGGACTTTG GTTATGTTGGATGAACAAGGAGAACAACTCGATCGTGTCGAAGAAGGCATGAACCA TATCAACCAAGACATGAAGGAGGCTGAGAAAAATTTAAAAGATTTAGGGAAATGCT GTGGCCTTTTCATATGTCCTTGTAACAAGCTTAAATCAAGTGATGCTTACAAAAAAG CCTGGGGCAATAATCAGGACGGAGTGGTGGCCAGCCAGCCTGCTCGTGTAGTGGAC GAACGGGAGCAGATGGCCATCAGTGGCGGCTTCATCCGCAGGGTAACAAATGATGC CCGAGAAAATGAAATGGATGAAAACCTAGAGCAGGTGAGCGGCATCATCGGGAAC CTCCGTCACATGGCCCTGGATATGGGCAATGAGATCGATACACAGAATCGCCAGAT CGACAGGATCATGGAGAAGGCTGATTCCAACAAAACCAGAATTGATGAGGCCAACC AACGTGCAACAAAGATGCTGGGAAGTGGTTACGGCGGCTCGGGCTCGGGCGTGAGC GGGGGCGAGGAGCTGTTCGCCGGCATCGTGCCCGTGCTGATCGAGCTGGACGGCGA CGTGCACGGCCACAAGTTCAGCGTGCGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCGACTACG GCAAGCTGGAGATCAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCC ACCCTGGTGACCACCCTCTGCTACGGCATCCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGAGCAC ATGAAGATGAACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACATCCAGGAGCG CACCATCCAGTTCCAGGACGACGGCAAGTACAAGACCCGCGGCGAGGTGAAGTTCG AGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCAAGGACTTCAAGGAGGA CGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAGCTTCAACAGCCACAACGTGTACA TCCGCCCCGACAAGGCCAACAACGGCCTGGAGGCTAACTTCAAGACCCGCCACAAC ATCGAGGGCGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGACCAACGTGCCCCTGGG CGACGGCCCCGTGCTGATCCCCATCAACCACTACCTGAGCACTCAGACCAAGATCA GCAAGGACCGCAACGAGGCCCGCGACCACATGGTGCTCCTGGAGTCCTTCAGCGCC TGCTGCCACACCCACGGCATGGACGAGCTGTACAGGTAA
SEQ ID NO: 2 (полипептидная последовательность конструкции TagRFPT-SNAP25TagGFP)
MVSKGEELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEG GPLPFAFDILATSFMYGSRTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTS LQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVMQKKTLGWEANTEMLYPADGGLEGRTDMALKLVG GGHLICNFKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDHRLERIKEADKETYVEQHEVAVARYCDL PSKLGHKLNGMDELYKGSGSGSGVAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQ LVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLDRVEEGMNHINQDMKEAEKNLKDLGKCCGLFICPC NKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDEN LEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSGYG GSGSGVSGGEELFAGIVPVLIELDGDVHGHKFSVRGEGEGDADYGKLEIKFICTTGKLPV
- 17 048091
PWPTLVTTLCYGIQCFARYPEHMKMNDFFKSAMPEGYIQERTIQFQDDGKYKTRGEVK FEGDTLVNRIELKGKDFKEDGNILGHKLEYSFNSHNVYIRPDKANNGLEANFKTRHNIE GGGVQLADHYQTNVPLGDGPVLIPINHYLSTQTKISKDRNEARDHMVLLESFSACCHTH GMDELYR*
SEQ ID NO: 3 (нуклеотидная последовательность TagRFPT)
ATGGTGTCTAAGGGCGAAGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGT ACATGGAGGGCACCGTGAACAACCACCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGC AAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCT CCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACCAGCTTCATGTACGGCAGCAGAACCTTCAT CAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTTAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCAC ATGGGAGAGAGTCACCACATACGAAGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACA CCAGCCTCCAGGACGGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTC CCATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCAACACCGA GATGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAGAACCGACATGGCCCTGAAGC TCGTGGGCGGGGGCCACCTGATCTGCAACTTCAAGACCACATACAGATCCAAGAAA CCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCGTCTACTATGTGGACCACAGACTGGAAAG AATCAAGGAGGCCGACAAAGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCTGTGGCC AGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAACTTAATGGCATGGACGAGCT GTACAAG
SEQ ID NO: 4 (полипептидная последовательность TagRFPT)
MVSKGEELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEG GPLPFAFDILATSFMYGSRTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTS LQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVMQKKTLGWEANTEMLYPADGGLEGRTDMALKLVG GGHLICNFKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDHRLERIKEADKETYVEQHEVAVARYCDL PSKLGHKLNGMDELYK
SEQ ID NO: 5 (нуклеотидная последовательность Glycine-Serine rich linker 1)
GGCTCGGGCTCGGGCTCGGGC
SEQ ID NO: 6 (полипептидная последовательность глицин-серин богатого линкера η
GSGSGSG
SEQ ID NO: 7 (нуклеотидная последовательность глицин-серин богатого линкера 2)
GGCGGCTCGGGCTCGGGC
SEQ ID NO: 8 (полипептидная последовательность глицин-серин богатого линкера 21
GGSGSG
SEQ ГО NO: 9 (нуклеотидная последовательность SNAP25)
GTGGCCGAAGACGCAGACATGCGCAATGAGCTGGAGGAGATGCAGCGAAGG GCTGACCAGTTGGCTGATGAGTCGCTGGAAAGCACCCGTCGTATGCTGCAACTGGTT GAAGAGAGTAAAGATGCTGGTATCAGGACTTTGGTTATGTTGGATGAACAAGGAGA
- 18 048091
ACAACTCGATCGTGTCGAAGAAGGCATGAACCATATCAACCAAGACATGAAGGAGG CTGAGAAAAATTTAAAAGATTTAGGGAAATGCTGTGGCCTTTTCATATGTCCTTGTA ACAAGCTTAAATCAAGTGATGCTTACAAAAAAGCCTGGGGCAATAATCAGGACGGA GTGGTGGCCAGCCAGCCTGCTCGTGTAGTGGACGAACGGGAGCAGATGGCCATCAG TGGCGGCTTCATCCGCAGGGTAACAAATGATGCCCGAGAAAATGAAATGGATGAAA ACCTAGAGCAGGTGAGCGGCATCATCGGGAACCTCCGTCACATGGCCCTGGATATG GGCAATGAGATCGATACACAGAATCGCCAGATCGACAGGATCATGGAGAAGGCTGA TTCCAACAAAACCAGAATTGATGAGGCCAACCAACGTGCAACAAAGATGCTGGGAA GTGGTTAC
SEQ ID NO: 10 (полипептидная последовательность SNAP25)
VAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQ GEQLDRVEEGMNHINQDMKEAEKNLKDLGKCCGLFICPCNKLKSSDAYKKAWGNNQD GVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMG NEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSGY
SEQ ID NO: 11 (нуклеотидная последовательность TagGFP)
GTGAGCGGGGGCGAGGAGCTGTTCGCCGGCATCGTGCCCGTGCTGATCGAGC TGGACGGCGACGTGCACGGCCACAAGTTCAGCGTGCGCGGCGAGGGCGAGGGCGA CGCCGACTACGGCAAGCTGGAGATCAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCG TGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTCTGCTACGGCATCCAGTGCTTCGCCCGCT ACCCCGAGCACATGAAGATGAACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTAC ATCCAGGAGCGCACCATCCAGTTCCAGGACGACGGCAAGTACAAGACCCGCGGCGA GGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCAAGGACT TCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAGCTTCAACAGCCAC AACGTGTACATCCGCCCCGACAAGGCCAACAACGGCCTGGAGGCTAACTTCAAGAC CCGCCACAACATCGAGGGCGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGACCAACG TGCCCCTGGGCGACGGCCCCGTGCTGATCCCCATCAACCACTACCTGAGCACTCAGA CCAAGATCAGCAAGGACCGCAACGAGGCCCGCGACCACATGGTGCTCCTGGAGTCC TTCAGCGCCTGCTGCCACACCCACGGCATGGACGAGCTGTACAGGTAA
SEQ ID NO: 12 (полипептидная последовательность TagGFP)
VSGGEELFAGIVPVLIELDGDVHGHKFSVRGEGEGDADYGKLEIKFICTTGKLPV PWPTLVTTLCYGIQCFARYPEHMKMNDFFKSAMPEGYIQERTIQFQDDGKYKTRGEVK FEGDTLVNRIELKGKDFKEDGNILGHKLEYSFNSHNVYIRPDKANNGLEANFKTRHNIE GGGVQLADHYQTNVPLGDGPVLIPINHYLSTQTKISKDRNEARDHMVLLESFSACCHTH GMDELYR*
SEQ ID NO: 13 (BoNT/A - UniProt P10845)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNVGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDL N
PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGG STIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGY GSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPN
- 19 048091
RVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNK A
KSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFK V
LNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNF T
GLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEE ITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNG KKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKAT EA
AMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSG AVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAK VNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKA MININ KFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKD К
VNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINI GSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNN EYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTIT NNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELN EKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLK GPR
GSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQ A
GVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIA К
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEO ID NO: 14 (BoNT/B - UniProt P10844)
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFN KSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLG DRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNH FASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGL Y
GIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIV DRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETN IAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQA YEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSN YIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQY LYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVND FVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLI PVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGM
- 20 048091 γ
KALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSV SYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFD L
SIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFK LTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNS GWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYING KLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSY SEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRD LY
IGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISD SDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCIS KWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
SEQ ID NO: 15 (BoNT/C - UniProt P18640)
MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNK PPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNN NTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTF AAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYG IAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSI AKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTE FNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNP A
LRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRK DINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQN VDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFL M
WANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILL EAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQF NNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNI N
KFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSF QNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQ LNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIID SVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGN M
KIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKEL DGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRR NNN
DFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIY A
- 21 048091
IGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYR HNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
SEO ID NO: 16 (BoNT/D - UniProt P19321)
MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSK PPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDS STPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSN PSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYG INIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDI AKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSE VVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPA LQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDE TNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYL NSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWAN E
VVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFP EFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHIN YQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFI R
ECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTM PFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTI YTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNS GWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYI N
GELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQI LRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSV SDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNY GIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLS TSSFWKFISRDPGWVE
SEO ID NO: 17 (BoNT/E - UniProt 000496)
MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTS LKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTP DNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHRFGS IAIVTFSPEYSFRFNDNCMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPL ITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYK DVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLRTKFQVKCRQTYIGQYKYFKL SNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKG IRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESA PGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSS IDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADIS IVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNK
- 22 048091
NKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTII E
SKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKIINEVKIN KLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYF NKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVN I
SQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTUNCMRDNNSGWKVSLNHNEII WTFEDNRGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNL GNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYL LYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDN LVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNCTM NF
KNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK SEO ID NO: 18 (BoNT/F - UniProt A7GBG3)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFD PPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGN EHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVY DPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGAR GVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNirrSAMKEKIYNNLLANYEKIATR LSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANK F
KVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKG LVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLN NNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFF YLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIR DFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELL IPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRK EQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIER F
ITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNN SIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIY STNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTimC IRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGN SRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETL YSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSN TRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKL IRTSNSNNSLGQUVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTS SNGCFWSFISKEHGWQEN
SEO Ю NO: 19 (BoNT/G - UniProt 060393)
MPVNIKXFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFN
- 23 048091
ASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYL G
NASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGH SPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLY GIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIA NRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETN L
AGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAY EEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYN TQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGD SLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWV К
GVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFI PELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTI KERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFI NQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKD S
IPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFND IGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTII SCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSrriTNDRLG NANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVS SLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNA AI
NYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQ LFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTY D
NYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE
SEQ ID NO: 20 (полипептидная последовательность BoNT/X)
MKLEINKFNYNDPIDGINVITMRPPRHSDKINKGKGPFKAFQVIKNIWIVPERYNFTNNT NDLNIPSEPIMEADAIYNPNYLNTPSEKDEFLQGVIKVLERIKSKPEGEKLLELISSSIP LPLVSNGALTLSDNETIAYQENNNIVSNLQANLVIYGPGPDIANNATYGLYSTPISNGEG TLSEVSFSPFYLKPFDESYGNYRSLVNIVNKFVKREFAPDPASTLMHELVHVTHNLYGIS NRNFYYNFDTGKIETSRQQNSLIFEELLTFGGIDSKAISSLIIKKIIETAKNNYTTLISE RLNTVTVENDLLKYIKNKIPVQGRLGNFKLDTAEFEKKLNTILFVLNESNLAQRFSILVR KHYLKERPIDPIYVNILDDNSYSTLEGFNISSQGSNDFQGQLLESSYFEKIESNALRAFI KICPRNGLLYNAIYRNSKNYLNNIDLEDKKTTSKTNVSYPCSLLNGCIEVENKDLFLISN KDSLNDINLSEEKIKPETTVFFKDKLPPQDITLSNYDFTEANSIPSISQQNILERNEELY EPIRNSLFEIKTIYVDKLTTFHFLEAQNIDESIDSSKIRVELTDSVDEALSNPNKVYSPF KNMSNTINSIETGITSTYIFYQWLRSIVKDFSDETGKIDVIDKSSDTLAIVPYIGPLLNI GNDIRHGDFVGAIELAGITALLEYVPEFTIPILVGLEVIGGELAREQVEAIVNNALDKRD
- 24 048091
QKWAEVYNITKAQWWGTIHLQINTRLAHTYKALSRQANAIKMNMEFQLANYKGNIDD КАК
IKNAISETEILLNKSVEQAMKNTEKFMIKLSNSYLTKEMIPKVQDNLKNFDLETKKTLDK FIKEKEDILGTNLSSSLRRKVSIRLNKNIAFDINDIPFSEFDDLINQYKNEIEDYEVLNL GAEDGKIKDLSGTTSDINIGSDIELADGRENKAIKIKGSENSTIKIAMNKYLRFSATDNF SISFWIKHPKPTNLLNNGIEYTLVENFNQRGWKISIQDSKLIWYLRDHNNSIKIVTPDYI AFNGWNLITITNNRSKGSIVYVNGSKIEEKDISSIWNTEVDDPIIFRLKNNRDTQAFTLL DQFSIYRKELNQNEVVKLYNYYFNSNYIRDIWGNPLQYNKKYYLQTQDKPGKGLIREY WS
SFGYDYVILSDSKTITFPNNIRYGALYNGSKVLIKNSKKLDGLVRNKDFIQLEIDGYNMG ISADRFNEDTNYIGTTYGTTHDLTTDFEIIQRQEKYRNYCQLKTPYNIFHKSGLMSTETS KPTFHDYRDWVYSSAWYFQNYENLNLRKHTKTNWYFIPKDEGWDED
SEO ID NO: 21 (TeNT - UniProt P04958)
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFN PPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGN SYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDN KNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLH GLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYK AIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTE IELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNT NAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAE KNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAP EYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVI SKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGN FIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYK LVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLK N
KLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIG ITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDIS GFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVP К
VSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLP DKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNN NQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDV QLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYV SYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLY DD
KNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND Примеры
Пример 1. Создание стабильной клеточной линии.
Синтез генов и субклонирование.
Нуклеотидные последовательности tagRFPT и tagGFP были получены от Evrogen и синтезированы GeneArt (Thermo Fisher Scientific). Продукт гена, tRFPT-SNAP25-tGFP, фланкировали последовательностями attB для клонирования Gateway®. Затем синтезированный генный продукт субклонировали в лентивирусный вектор pLenti6.3/V5-dest с использованием набора ферментов ВР clonase (Thermo Fisher) в соответствии с протоколом производителя. Полученный вектор pLenti6.3-tRFPT-SNAP25-tGFP трансформировали в клетки E.coli BL21 и отбирали с использованием антибиотика ампициллина. Положительные клоны бактерий были предварительно обработаны с использованием набора Machery-Nagel Maxiprep, не содержащего эндотоксинов, в соответствии с протоколом производителя.
Генерация лентивируса из клеток HEK293FT.
Для подготовки к генерации лентивируса клетки HEK293FT культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы с 4500 мг/л глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Gibco), затем высевали в колбу Т75 см2 при 80% степени смыкания и инкубировали в течение ночи при 37°С с 5% СО2. Затем клетки котрансфицировали плазмидой plenti6.3-tRFPT-SNAP25-tGFP и смесью для упаковки лентивирусов ViraPower (Invitrogen Cat No. K497000) с использованием реагента Lipofactamine 3000 (Invitrogen) в соответствии с руководством, предоставленным поставщиком, и инкубировали в колбе в течение 6 ч при 37°С с 5% СО2. Через 6 ч после трансфекции среду, содержащую комплексы липид-ДНК, осторожно удаляли и выгружали из колбы и
- 25 048091 заменяли 10 мл предварительно нагретой среды. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С с 5% СО2. 10 мл клеточного супернатанта (первая партия вируса) собирали через 24 ч после трансфекции и хранили в конических пробирках на 15 мл при 4°С. Собранную среду заменяли 10 мл предварительно нагретой среды, и колбу инкубировали в течение ночи при 37°С с 5% СО2. Вторую партию вируса собирали через 48 ч после трансфекции. Обе партии супернатанта центрифугировали на 2000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре для удаления продуктов клеточного распада. Осветленный лентивирусный супернатант собирали после центрифугирования и фильтровали с использованием фильтра с размером пор 0,45 мкм для удаления любых оставшихся продуктов клеточного распада. Вирус разделяли на аликвоты по 1 мл и хранили при -80°С.
Измерение титра лентивирусов посредством GFP-селекции.
Клетки HEK293FT высевали в 96-луночный планшет (Nunc) при плотности 10000 клеток/лунку в 100 мкл культуральной среды. Серийные разведения вируса от 10-1 до 10-4 были сделаны с использованием свежей культуральной среды с 8 мг/мл (конечная концентрация) реагента Polybrene (каталожный номер Sigma H9268). Клетки трансдуцировали путем удаления существующей среды и заменяли на 100 мкл приготовленных разведений в соответствующую лунку. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С с 5% СО2. На следующий день культуральную среду меняли на свежую без полибрена. Клетки инкубировали в течение дополнительных 3 дней перед вычислением титра вируса. Соответствующий фактор разведения использовали для расчета титра в единицах трансдукции (TU) на мл на основе процента GFP-положительных клеток. Желаемый диапазон трансдукции составлял 1-20%. Следовательно, титр вируса определяли по следующей формуле: Титр = (FXC/V) XD, где F=частота GFP-положительных клеток (процент GFP-положительных клеток/100), С=количество клеток на лунку в момент трансдукции, V=объем посевного материала в мл (0,1 мл) и D=коэффициент разведения лентивируса.
Генерация стабильной клеточной линии ReNcell VM из лентивирусов.
Клетки ReNcell VM (Millipore) высевали в 24 лунки, покрытые ламинином (конечная концентрация 20 мкг/мл) при 80% степени смыкания, и инкубировали в течение ночи при 37°С с 5% СО2. Среду удаляли и добавляли 500 мкл лентивируса на лунку с реагентом Polybrene до конечной концентрации 8 мг/мл. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С с 5% СО2. На следующий день среду заменяли свежей средой без полибрена. Трансдуцированные клетки были размножены и отсортированы по FAC с использованием длины волны GFP.
Результаты.
Конструкцию для анализа, состоящую из полноразмерного SNAP25, фланкированного tagRFPT и tagGFP, клонировали в остов лентивирусного вектора. Создание стабильной клеточной линии было достигнуто с использованием модифицированного протокола генерации лентивируса, состоящего из липофекции конструкции с упаковкой лентивирусных плазмид в клеточную линию HEK293T. Полученный лентивирус был очищен и добавлен к клеткам ReNcell VM, которые в конечном итоге были отсортированы с использованием FACS (см. фигуру 1), и было подтверждено создание стабильной клеточной линии. Эту иммортализованную клеточную линию v-myc получают из клеток-предшественников нейронов (NPC) человека, которые являются генетически более близкими к природным нейронам человека по сравнению с линиями раковых клеток и, следовательно, являются лучшей моделью нейронных клеток для использования в анализах, описанных в настоящем описании.
Пример 2. Конструкция является чувствительной к расщеплению BoNT/A.
Материалы и методы.
Планшеты для визуализации Perkin Elmer CellCarrier 384 Ultra™ и 24-луночные чашки для культур тканей Nunc инкубировали с 20 мкг/мл ламинина (Invitrogen) в течение ночи при 4°С.
Визуализация.
Стабильная клеточная линия по изобретению (называемая клеточной линией ReD SNAPR) была дифференцирована в соответствии с протоколом производителя клеток ReNcell VM. Вкратце, клетки высевали на планшеты для визуализации Perkin Elmer CellCarrier 384 Ultra™ с предварительно нанесенным покрытием из расчета 3000 клеток на лунку. Клетки поддерживали в поддерживающей среде ReNcell NSC без факторов роста (EGF и FGF2) (среда для дифференцировки) в течение 14 дней, со сменой среды каждые 3 дня. Клетки инкубировали со 100 нМ BoNT/A в среде для дифференцировки в течение 48 ч. Клетки фиксировали фиксатором (4% параформальдегида и 2% сахарозы). Фиксированные клетки были визуализированы с помощью Opera™ Phenix.
Вестерн-блоттинг.
Клетки ReD SNAPR дифференцировали согласно протоколу производителя клеток ReNcell VM. Вкратце, клетки высевали на 24-луночную чашку для культуры ткани Nunc по 30000 клеток на лунку. Клетки поддерживали в поддерживающей среде ReNcell NSC без факторов роста (EGF и FGF2) (среда для дифференцировки) в течение 14 дней, со сменой среды каждые 3 дня. Клетки инкубировали со 100 нМ BoNT/A в среде для дифференцировки в течение 48 ч. Среду аспирировали и клетки лизировали лизисным буфером NP-40 (150 мМ NaCl, 1% NP-40, 50 нМ Трис-Cl, рН 8,0). Для того, чтобы подготовить образцы для загрузки в гель SDS-PAGE, к образцам добавляли 10% DTT и 6Х загрузочный буфер (Bio
- 26 048091
Rad) и кипятили в течение 5 минут. 20 мкл образцов добавляли в каждую дорожку геля NuPAGE Bis-tris 4-12% (Thermo Fisher) и прогоняли при 120 В до тех пор, пока не кончился фронт красителя. Гель переносили на нитроцеллюлозную мембрану и зондировали анти-tRFP и анти-tag (CGY) FP (Evrogen) в течение ночи.
Результаты.
На фиг. 2 продемонстрировано, что конструкция для анализа является чувствительной к распаду под действием BoNT/A. Обычные клеточные анализы фокусируются на взаимодействиях FRET или прямом вестерн-блоттинге расщепленного SNAP25 в клеточном лизате, что не подходит для приложений высокопроизводительного скрининга (HTS). В нормальных условиях С-концевой фрагмент полноразмерного SNAP25, расщепленный BoNT/A, трудно обнаружить из-за малой молекулярной массы, поэтому его судьба обычно неизвестна. Это ранее не отмеченное наблюдение показывает, что С-концевой фрагмент разрушается вместе с флуорофором, который присоединяется к нему. Относительная простота этой методологии хорошо подходит для ряда приложений с низкой и высокой пропускной способностью.
На фиг. 3 представлена схема, показывающая опосредованный BoNT/A распад С-конца конструкции SNAP25. После интернализации BoNT/A в клетках ReD SNAPR легкая цепь BoNT/A проникает в цитоплазму и расщепляет tagRFPT-SNAP25-tagGFP (стабильно экспрессируется в клетках ReD SNAPR). Это приводит к распаду С-концевого фрагмента при сохранении N-концевой конструкции. Распад можно обнаружить с помощью флуоресцентной микроскопии и вестерн-блоттинга.
Пример 3. Повышение чувствительности клеток ReD SNAPR к BoNT/A.
Клетки ReD SNAPR высевали на 384-луночные планшеты, как описано выше. Для усиленной дифференцировки клетки ReD SNAPR культивировали в нормальной среде ReNcell с 10 нг/мл GDNF и 1 мМ d-cAMP (проницаемой для клеток cAMP). Различные концентрации (0-1 мкМ) BoNT/A добавляли к нормальной среде и среде ReDS, где среда ReDS содержала 10 нг/мл GDNF, 1 мМ d-cAMP, 2 мМ CaCl2 и 56 мМ KCl.
Дифференцированные клетки ReD SNAPR подвергали интоксикации посредством среды, содержащей BoNT/A, фиксировали и визуализировали, как описано выше.
Результаты.
На фиг. 4 показано, что добавление GDNF и d-cAMP во время дифференцировки и условия с высоким содержанием калия во время интоксикации повышали чувствительность клеточной линии к BoNT/A. Были определены кривые зависимости ответа от дозы и значения ЕС50 для BoNT/A в анализе (см. фигуру 4b) с низкими значениями нМ, когда клетки подвергались воздействию среды ReDS.
Пример 4. Тиоредоксинредуктаза (TrxR1) в качестве контроля анализа.
Клетки ReD SNAPR высевали на 384-луночные планшеты и дифференцировали, как описано выше. Дифференцированные клетки обрабатывали 25 нмоль либо нецелевого контроля миРНК, NT3, либо миРНК против TrxR1 с использованием Lipofectamine RNAimax в соответствии с протоколом производителя и оставляли на клетках на 72 ч. Среду ReDS, содержащую 10 нМ BoNT/A, добавляли к клеткам на 48 ч, а затем фиксировали и визуализировали, как описано выше. Вкратце, клетки фиксировали и использовали антитело против TrxR1 для обнаружения TrxR1 и визуализации флуоресценции с помощью Opera Phenix. Были зафиксированы и измерены средние уровни интенсивности флуоресценции каналов GFP, RFP и дальнего красного.
Результаты.
На фиг. 5 показано, что обработанные siTrxR клетки являются более устойчивыми к BoNT/Aопосредованному расщеплению по сравнению с контролем. Таким образом, TrxR1 можно использовать в качестве подходящего положительного контроля для идентификации генов, участвующих во внутриклеточном перемещении BoNT/A. В частности, нокдаун TrXR1 может применяться, чтобы показать, что интоксикация BoNT/A может быть устранена, посредством чего дополнительно подтверждаются гены, идентифицированные в анализе.
Пример 5. Использование рецептора BoNT SV2.
Клетки ReNcell VM высевали на 384-луночные планшеты и дифференцировали, как описано ранее. Дифференцированные клетки обрабатывали 25 нмоль siNT3, siVAMP2 или siTrxR с использованием Lipofectamine RNAimax в соответствии с протоколом производителя и оставляли на клетках на 72 ч. Среду ReDS, содержащую 10 нМ BoNT/А, добавляли к клеткам на 48 ч и затем фиксировали. Для иммуноокрашивания клетки блокировали 0,5% BSA/PBS в течение 1 ч, к клеткам добавляли антитело против SV2A (Cell Signaling, #66724) и инкубировали в течение по меньшей мере 1 ч. Вторичное антитело, конъюгированное с Alexa-488, добавляли в клетки на 1 ч и визуализировали клетки с помощью Opera Phenix. Затем клетки были визуализированы с помощью Opera Phenix с показанными каналами GFP и DAPI.
Результаты.
Хотя SV2 является основным рецептором BoNT/A, он ранее не изучался на предмет его постинтоксикационного пути в клетке. На фиг. 6 показано, что интоксикация BoNT/A приводит к снижению SV2 на поверхности клетки, что может быть типичным следствием опосредованного BoNT/A дефектного переноса на поверхность клетки. В этом случае возврат SV2 обратно на поверхность клетки блокируется. Следовательно, SV2 может использоваться в качестве индикатора интоксикации BoNT/A.
- 27 048091
Многие гены могут регулировать активность BoNT/A в клетке. Примером косвенной регуляции может быть уровень миграции рецептора BoNT SV2 (вместо модуляции самой активности токсина). Для того, чтобы отсеять кандидатов, вовлеченных в трафик SV2, окрашивание поверхности SV2 может быть идеальным критерием отбора. Пример, показанный в настоящем описании, представляет собой клетки, обедненные VAMP2, которые после интоксикации BoNT/A приводили к снижению окрашивания поверхности SV2. Это может быть связано с синергическим действием блокирования экзоцитоза везикул на поверхности клетки за счет снижения интоксикации VAMP2 и BoNT/A.
Поверхностный SV2 может быть восстановлен за счет истощения TrxR, что показывает, что сам TrxR не влияет на экзоцитоз SV2 на поверхности клетки, но напрямую модулирует активность BoNT/A посредством высвобождения его легкой цепи (LC). Это непреднамеренно приводит к восстановлению поверхности SV2 из-за снижения BoNT/A LC в цитоплазме.
Таким образом, SV2 является полезным в анализе по изобретению, поскольку его можно использовать для отделения генов-кандидатов, непосредственно участвующих в передаче BoNT/А, от тех, которые модулируют передачу рецептора BoNT/A SV2.
Пример 6. Полногеномный скрининг миРНК.
На фиг. 7 представлена схема, показывающая способ проведения полногеномного скрининга миРНК с клеточной линией по изобретению. Клетки ReD SNAPR высевают и дифференцируют, как описано выше. Библиотеку миРНК готовят и объединяют с Lipofectamine™ RNAiMAX с использованием стандартных протоколов, и клетки ReD SNAPR трансфецируют миРНК. BoNT/A в буфере для стимуляции добавляется к клеткам перед фиксацией и визуализацией с использованием Opera™ Phenix и количественной оценкой с помощью программного обеспечения Columbus™.
Положительные результаты могут быть подвергнуты дальнейшей проверке путем оценки восстановления в присутствии siRNA против TrxR1. Подтверждение того, что гены непосредственно регулируют активность BoNT, подтверждают путем окрашивания поверхности клеток SV2, как описано выше.
Пример 7. Определение профилактических терапевтических средств против ботулизма.
Клетки ReD SNAPR высевают и дифференцируют, как описано выше, и подвергают воздействию агента (например, низкомолекулярного лекарственного средства). BoNT/A в буфере для стимуляции добавляют к клеткам перед фиксацией и визуализацией с использованием Opera™ Phenix и количественной оценкой с помощью программного обеспечения Columbus™.
Агент идентифицируют как профилактическое средство против ботулизма, если расщепление конструкции ингибируется.
Пример 8. Определение терапевтических средств против ботулизма после интоксикации.
Клетки ReD SNAPR высевают и дифференцируют, как описано выше, и к клеткам добавляют BoNT/A в буфере для стимуляции и наблюдают расщепление конструкции (потерю GFP). Затем клетки подвергаются воздействию агента (например, низкомолекулярного лекарственного средства). Наконец, клетки фиксируют и визуализируют с помощью Opera™ Phenix и подвергают количественному анализу с помощью программного обеспечения Columbus™.
Агент идентифицируют как средство против ботулизма после интоксикации, если наблюдается восстановление GFP.
Пример 9. Идентификация агентов, повышающих чувствительность к BoNT.
Клетки ReD SNAPR высевают и дифференцируют, как описано выше, и подвергают воздействию агента (например, низкомолекулярного лекарственного средства). BoNT/A в буфере для стимуляции добавляют к клеткам перед фиксацией и визуализацией с использованием Opera™ Phenix и количественной оценкой с помощью программного обеспечения Columbus™.
Агент идентифицируют как агент, повышающий чувствительность к BoNT, если расщепление конструкции улучшается (например, происходит быстрее или очевидно большее расщепление). Сенсибилизирующий агент предлагается для дальнейшего изучения на предмет его применения в качестве сопутствующего продукта для модуляции локальной активности клостридиальных нейротоксинов (например, в целях обеспечения возможности снижения дозировки и минимизации распространения на другие ткани).
Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены в настоящее описание посредством ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и системы по настоящему изобретению без отклонения от объема и формы настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники. Хотя настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявляемое изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, предполагается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые будут очевидны для специалистов в области биохимии и биотехнологии или в смежных областях, входят в объем приведенной ниже формулы изобретения.
-
Claims (5)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ для идентификации гена, который регулирует активность клостридиального нейротоксина, включающий:a) получение образца нейронных клеток человека, модифицированных для экспрессии полипептида, который содержит С-концевую обнаруживаемую метку, где полипептид может расщепляться клостридиальным нейротоксином;b) изменение экспрессии гена-мишени клеток;c) контактирование клеток с клостридиальным нейротоксином;d) измерение количества С-концевой обнаруживаемой метки, посредством чего количественно определяют активность клостридиального нейротоксина; иe) идентификацию гена-мишени как регулятора активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина отличается от количественно определенной активности клостридиального нейротоксина в случае, когда экспрессия гена-мишени не изменена; илиf) идентификацию того, что ген-мишень не является регулятором активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина эквивалентна количественно определенной активности клостридиального нейротоксина в случае, когда экспрессия гена-мишени не изменена.2. Способ по п.1, где экспрессию изменяют путем подавления экспрессии гена-мишени.3. Способ по п.2, где ген-мишень идентифицируют как положительный регулятор активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина ниже, чем количественно определенная активность клостридиального нейротоксина в случае, когда экспрессия гена-мишени не изменена.4. Способ по п.2 или 3, где ген-мишень идентифицируют как отрицательный регулятор активности клостридиального нейротоксина, когда количественно определенная активность клостридиального нейротоксина выше, чем количественно определенная активность клостридиального нейротоксина в случае, когда экспрессия гена-мишени не изменена.5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где предоставляется множество образцов нейронных клеток человека и в каждом из образцов нейронных клеток человека изменена экспрессия отличающегося гена-мишени.6. Способ по п.5, где экспрессия отличающегося гена-мишени изменена в каждом из образцов с использованием библиотеки РНКи человека.7. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий определение того, является ли ген-мишень прямым регулятором активности клостридиального нейротоксина или косвенным регулятором активности клостридиального нейротоксина, где: (i) прямой регулятор регулирует активность клостридиального нейротоксина на уровне:1) связывания клостридиального нейротоксина с клеткой;
- 2) интернализации клостридиального нейротоксина;
- 3) транслокации L-цепи клостридиального нейротоксина из эндосомы;
- 4) катализа и/или
- 5) сохранения активности L-цепи в цитоплазме клетки; и/или (ii) косвенный регулятор регулирует процесс клеточной миграции рецептора клостридиального нейротоксина.8. Способ по п.7, где определение включает обнаружение присутствия или отсутствия рецептора клостридиального нейротоксина в клетке, когда экспрессия гена-мишени была изменена.9. Способ по п.7 или 8, где обнаружение меньшего количества рецептора клостридиального нейротоксина на поверхности клетки, когда экспрессия гена-мишени изменена (предпочтительно снижена) по сравнению с эквивалентной клеткой, контактирующей с клостридиальным нейротоксином, в которой экспрессия генамишени не изменена, указывает на то, что ген-мишень косвенно регулирует активность клостридиального нейротоксина; или обнаружение эквивалентного или большего (предпочтительно большего) количества рецептора клостридиального нейротоксина на поверхности клетки, когда экспрессия гена-мишени была изменена (предпочтительно имела понижающую регуляцию) по сравнению с эквивалентной клеткой, контактирующей с клостридиальным нейротоксином, в которой экспрессия гена-мишени не изменена, указывает на то, что ген-мишень напрямую регулирует активность клостридиального нейротоксина.10. Способ по любому из пп.7-9, где рецептор клостридиального нейротоксина представляет собой гликопротеин 2А синаптических везикул (SV2).11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нейронная клетка человека является нераковой клеткой.12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нейронная клетка человека представляет собой иммортализованную клетку-предшественник нейронов человека или предпочтительно нейронная клетка человека была получена (например, дифференцирована) из иммортализованной клетки- 29 048091 предшественника нейронов человека.13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полипептид дополнительно содержит N-концевую обнаруживаемую метку и N-концевая обнаруживаемая метка отличается от С-концевой обнаруживаемой метки.14. Способ по п.13, где одна из обнаруживаемых меток представляет собой красный флуоресцентный белок (RFP), и одну из обнаруживаемых меток выбирают из зеленого флуоресцентного белка (GFP), голубого флуоресцентного белка (CFP) и желтого флуоресцентного белка (YFP).15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полипептид содержит N-концевой RFP и С-концевой GFP.16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полипептид:а) кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей:i) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 3;ii) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 9; и/или iii) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 11; илиb) кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1; илиc) содержит полипептидную последовательность, содержащую:i) полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 4;ii) полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 10; и/или iii) полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12; илиd) содержит полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2.17. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полипептид:a) кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей:i) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 3;ii) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 9; и/или iii) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 11; илиb) кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 80% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1; илиc) содержит полипептидную последовательность, содержащую:i) полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 4;ii) полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 10; и/или iii) полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12; илиd) содержит полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2.18. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полипептид:а) кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей:i) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 3;ii) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 9; и/или iii) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 11; илиb) кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1; илиc) содержит полипептидную последовательность, содержащую:i) полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 4;ii) полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 10; и/или iii) полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последова- 30 048091 тельности с SEQ ID NO: 12; илиd) содержит полипептидную
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1815870.9 | 2018-09-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA048091B1 true EA048091B1 (ru) | 2024-10-24 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220113310A1 (en) | Cellular vamp cleavage assay | |
| US8535941B2 (en) | Lipophilic dye-based FRET assays for clostridial toxin activity | |
| DK1543329T3 (en) | CELL BASED RESONANCE FLUORESCEN ENERGY TRANSFER ASSAYS (FRET) FOR CLOSTRIDIUM TOXINES | |
| US8067231B2 (en) | Clostridial toxin activity assays | |
| US8492109B2 (en) | Methods for the delivery of toxins or enzymatically active portions thereof | |
| SG174353A1 (en) | Immuno-based retargeted endopeptidase activity assays | |
| JP7604365B2 (ja) | 細胞ベースのクロストリジウム神経毒アッセイ | |
| EA048091B1 (ru) | Клеточные анализы клостридиальных нейротоксинов | |
| Takuma et al. | Trafficking of green fluorescent protein-tagged SNARE proteins in HSY cells | |
| RU2807994C2 (ru) | Анализ расщепления клеточного vamp | |
| AU2023343039A1 (en) | Cell-free clostridial neurotoxin assays | |
| AU2012200830A1 (en) | Clostridial toxin activity assays |