EA046480B1 - МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ МЕНИНГОКОККОВОГО fHbp - Google Patents
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ МЕНИНГОКОККОВОГО fHbp Download PDFInfo
- Publication number
- EA046480B1 EA046480B1 EA202190184 EA046480B1 EA 046480 B1 EA046480 B1 EA 046480B1 EA 202190184 EA202190184 EA 202190184 EA 046480 B1 EA046480 B1 EA 046480B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- fhbp
- seq
- polypeptide
- strains
- amino acid
- Prior art date
Links
- 101710186862 Factor H binding protein Proteins 0.000 title claims description 440
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 200
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 195
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 193
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 139
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 129
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 129
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 124
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 103
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 102
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 102
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 89
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 74
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 67
- 229940090821 bexsero Drugs 0.000 claims description 60
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 58
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 46
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 44
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 34
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 24
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 23
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 23
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 21
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 21
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 20
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 20
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 101000737574 Homo sapiens Complement factor H Proteins 0.000 claims description 6
- 102000045512 human CFH Human genes 0.000 claims description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 3
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 54
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 42
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 41
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 37
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 description 21
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 description 21
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 19
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 19
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 19
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 17
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 14
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 11
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 9
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 description 9
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 description 9
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 9
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 241000040340 Oat mosaic virus Species 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 7
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 7
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 6
- 229940124951 Menveo Drugs 0.000 description 6
- 101150093941 PORA gene Proteins 0.000 description 6
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 6
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 6
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 6
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 5
- 108010031133 Transferrin-Binding Protein A Proteins 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940124904 Menactra Drugs 0.000 description 4
- 108010031127 Transferrin-Binding Protein B Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 4
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101100203230 Neisseria meningitidis serogroup B (strain MC58) siaA gene Proteins 0.000 description 3
- -1 S216 Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 101150059761 ctrA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000001938 differential scanning calorimetry curve Methods 0.000 description 3
- 238000002022 differential scanning fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 208000037909 invasive meningococcal disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 208000037941 meningococcal disease Diseases 0.000 description 3
- 229960005037 meningococcal vaccines Drugs 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 3
- 102220005136 rs33918778 Human genes 0.000 description 3
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 3
- 238000001757 thermogravimetry curve Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940035144 trumenba Drugs 0.000 description 3
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N (3beta,5beta,7alpha)-3,7-Dihydroxycholan-24-oic acid Chemical class OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700018753 Neisseria porin Proteins 0.000 description 2
- 241001212279 Neisseriales Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 2
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 2
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 2
- 241000193990 Streptococcus sp. 'group B' Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 2
- 101150117300 ctrC gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Chemical class C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000004403 ethyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004311 natamycin Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 102200049060 rs11568849 Human genes 0.000 description 2
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 2
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 2
- 239000004307 sodium orthophenyl phenol Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- JARGNLJYKBUKSJ-KGZKBUQUSA-N (2r)-2-amino-5-[[(2r)-1-(carboxymethylamino)-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid;hydrobromide Chemical compound Br.OC(=O)[C@H](N)CCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCC(O)=O JARGNLJYKBUKSJ-KGZKBUQUSA-N 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Chemical class OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZXKALLRCOCGBV-UHFFFAOYSA-N 1-phenyl-2-(propan-2-ylamino)hexan-1-one Chemical compound CCCCC(NC(C)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 AZXKALLRCOCGBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 2-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102100030009 Azurocidin Human genes 0.000 description 1
- 101710154607 Azurocidin Proteins 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000004380 Cholic acid Chemical class 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- SMEROWZSTRWXGI-UHFFFAOYSA-N Lithocholsaeure Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 SMEROWZSTRWXGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 206010027249 Meningitis meningococcal Diseases 0.000 description 1
- 201000010924 Meningococcal meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 101100368144 Mus musculus Synb gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 229940124858 Streptococcus pneumoniae vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 1
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000010913 antigen-directed enzyme pro-drug therapy Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000007707 calorimetry Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N chenodeoxycholic acid Chemical class C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N 0.000 description 1
- 229960001091 chenodeoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical class C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101150019098 cps gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 230000035618 desquamation Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 101150046339 fur gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 108010044804 gamma-glutamyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000002070 germicidal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical class N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108700026078 glutathione trisulfide Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- HOPZBJPSUKPLDT-UHFFFAOYSA-N imidazo[4,5-h]quinolin-2-one Chemical class C1=CN=C2C3=NC(=O)N=C3C=CC2=C1 HOPZBJPSUKPLDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- SMEROWZSTRWXGI-HVATVPOCSA-N lithocholic acid Chemical class C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 SMEROWZSTRWXGI-HVATVPOCSA-N 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 101150084069 mltA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010002832 murein transglycosylase Proteins 0.000 description 1
- RYRIMPODRHVEIW-UHFFFAOYSA-N n-(2-phenylethyl)nitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NCCC1=CC=CC=C1 RYRIMPODRHVEIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 125000002868 norbornyl group Chemical group C12(CCC(CC1)C2)* 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 101150047779 ompB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002888 pairwise sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101150031507 porB gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007739 porin activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150015673 porin gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 101150024840 rmpM gene Proteins 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-UTLSPDKDSA-N ursocholic acid Chemical class C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-UTLSPDKDSA-N 0.000 description 1
- RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N ursodeoxycholic acid Chemical class C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N 0.000 description 1
- 229960001661 ursodiol Drugs 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Description
Область техники
Данное изобретение относится к области инженерии белков, в частности относится к менингококковому белку, связывающемуся с фактором Н (fHbp), представляющему собой полезный иммуноген для вакцин.
Предшествующий уровень техники
Инвазивную менингококковую инфекцию (ИМИ) вызывает бактериальный патоген Neisseria meningitidis. Из пяти серогрупп, преимущественно ассоциированных с ИМИ во всем мире (MenA, B, C, W и Y), преобладающей серогруппой является MenB, вызывая ИМИ в ряде регионов, включая Канаду, Соединенные Штаты Америки, Австралию, Новую Зеландию и Европу. MenB вызывает тяжелое и зачастую фатальное заболевание, главным образом поражающее детей и людей молодого возраста. Оно часто неверно диагностируется, может вызывать летальный исход в течение 24 ч с момента начала и может привести к постоянной утрате трудоспособности, несмотря на оказанное лечение.
В настоящее время лицензированы две вакцины, предназначенные для иммунизации против менингококка серогруппы В: BEXSERO от компании GSK и TRUMENBA от компании Pfizer.
BEXSERO (также известная под непатентованным названием 4CMenB) содержит препарат везикул наружной мембраны (OMV) из эпидемического штамма NZ98/254 менингококка группы В наряду с пятью менингококковыми антигенами: Гепаринсвязывающим белком А нейссерий (NHBA), вариантом 1.1 белка, связывающего фактор Н (fHbp), адгезивным белком А нейссерий (NadA) и вспомогательными белками GNA1030 и GNA2091. Четыре из этих антигенов находятся в виде слитых белков (слитый белок NHBA-GNA1030 и слитый белок GNA2091-fHbp). 4CMenB описана в литературе (например, см. Bai et al. (2011), Expert. Opin. Biol. Ther. 11:969-85, Su & Snape (2011), Expert. Rev. Vaccines, 10:575-88). Термины BEXSERO и 4CMenB в данном документе используются взаимозаменяемо.
TRUMENBA содержит два липидированных антигена fHbp MenB (v1.55 и v3.45), адсорбированных на алюминия фосфате.
fHbp (также известный в области техники как происходящий из генома Neisseria антиген (GNA) 1870, LP2086 и белок 741) связывается с человеческим фактором Н (hfH), который представляет собой крупный (180 кДа) мультидоменный растворимый гликопротеин, состоящий из 20 регулирующих комплемент белковых элементов (ССР), соединенных короткими линкерными последовательностями. hfH циркулирует в плазме человека и регулирует альтернативный путь системы комплемента. Функциональное связывание fHbp с hfH преимущественно зависит от ССР 6-7 элементов (или доменов) hfH и увеличивает резистентность бактерий к комплемент-опосредованному цитолизу. Таким образом, экспрессия fHbp обеспечивает выживаемость в человеческой крови и сыворотке ex vivo.
Предложены различные схемы классификации fHbp, существует специализированная база данных с единой номенклатурой fHbp для обозначения новых подвариантов: (http)://neisseria.org/nm/typing/fhbp (а также (https)://pubmlst.org/neisseria/fHbp/).
В классификации fHbp выделяют три (основных) варианта 1, 2 и 3, которые дополнительно подразделяют на подварианты fHbp-1.x, fHbp-2.x и ШЬр-З.х, где х обозначает определенный подвариант пептида. В отличие от v2 и v3, fHbp v1 является высокогетерогенным и включает несколько подвариантов. Согласно другой номенклатуре, подварианты объединяют в подсемейство А (соответствующее вариантам 2 и 3) и подсемейство В (соответствующее варианту 1) на основе разнообразия последовательностей.
Прогнозируется, что BEXSERO обеспечит широкое перекрывание штаммов MenB, циркулирующих в мире (Medini D. et al., Vaccine, 2015; 33:2629-2636; Vogel U. et al., Lancet Infect Dis. 2013; 13:416-425; Knzova et al., Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 2014; 63:103-106; Tzanakaki G. et al., BMC Microbiol. 2014; 14:111; Wasko I. et al., Vaccine, 2016; 34:510-515; 6. Simoes M.J. et al., PLoS ONE, 12(5):e0176177; и Parikh S.R. et al., Lancet Infect. Dis. 2017; 17:754-62). Кроме того, после введения BEXSERO в национальную программу иммунизации детей в Великобритании в сентябре 2015 г. данные через 10 месяцев показали 83% эффективность вакцины в отношении всех штаммов MenB после введения двух доз (Parikh S.R. et al., Lancet, 2016; 388:2775-82).
Однако бактерицидная активность является вариант-специфичной; антитела против одного из вариантов необязательно будут обеспечивать перекрестную защиту против других вариантов, несмотря на то, что для fHbp v2 и v3 описана перекрестная активность (Masignani V. et al., J. Exp. Med. 2003; 197:789799). Антитела против подварианта fHbpv1.1, включенного в вакцину 44CMenB, обладают высокой перекрестной реактивностью с наиболее часто распространенными подвариантами fHbp v1, но меньшей перекрестной реактивностью с подвариантами v1, обладающие наиболее низкой степенью родства с v1.1. Кроме того, антитела против подварианта fHbpv1.1, включенного в вакцину 44CMenB, характеризуются плохой перекрестной реактивностью с fHbp v2 и v3 (Brunelli В. et al., Vaccine, 2011; 29:1072-1081). Это означает, что 44CMenB не перекрывает некоторые штаммы менингококка, несущие fHbp v2, v3, или штаммы, несущие некоторые подварианты v1.
Таким образом, несмотря на эффективность лицензированных вакцин против менингококка серогруппы В, таких как BEXSERO, остается потребность в разработке вакцин против менингококка, сохраняющих эффективность и не уступающих существующим одобренным вакцинам, таким как 44CMenB, однако отличающихся лучшим перекрыванием штаммов менингококка, несущих варианты fHbp, кото
- 1 046480 рые плохо перекрываются существующими вакцинами.
Краткое изложение сущности изобретения
В первом аспекте изобретения предложен мутантный менингококковый полипептид fHbp v1.13, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности SEQ ID NO: 2, где аминокислотная последовательность указанного мутантного менингококкового полипептида fHbp v1.13 включает мутацию с заменой Е211, S216, Е232 в последовательности SEQ ID NO: 2 или их комбинации.
Во втором аспекте изобретения предложен мутантный менингококковый полипептид fHbp v1.15, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности SEQ ID NO: 6, где аминокислотная последовательность указанного мутантного менингококкового полипептида fHbp v1.15 включает мутацию с заменой Е214, S219, Е235 в последовательности SEQ ID NO: 6 или их комбинации.
В третьем аспекте изобретения предложен слитый полипептид, содержащий все три менингококковых полипептида fHbp v1, v2 и v3, где варианты последовательностей fHbp расположены в порядке v2-v3-v1 от N- к С-концу и где полипептид v1 представляет собой мутантный полипептид fHbp v1.13 согласно первому аспекту изобретения или мутантный полипептид fHbp v1.15 согласно второму аспекту изобретения.
В четвертом аспекте изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, возможно, плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный полипептид fHbp v1.13 согласно первому аспекту изобретения, мутантный полипептид fHbp v1.15 согласно второму аспекту изобретения или слитый полипептид согласно третьему аспекту изобретения.
В пятом аспекте изобретения предложена рекомбинантная клетка-хозяин, трансформированная молекулой нуклеиновой кислоты согласно четвертому аспекту изобретения.
В шестом аспекте изобретения предложены везикулы наружной мембраны, полученные или приготовленные из рекомбинантной клетки-хозяина согласно пятому аспекту изобретения.
В седьмом аспекте изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая мутантный полипептид fHbp v1.13 согласно первому аспекту изобретения, мутантный полипептид fHbp v1.15 согласно второму аспекту изобретения, слитый полипептид согласно третьему аспекту изобретения или везикулу наружной мембраны согласно шестому аспекту изобретения. Указанная иммуногенная композиция является полезной для иммунизации млекопитающего, предпочтительно человека, против инфекции, вызванной Neisseria meningitidis.
Описание графических материалов
Фиг. 1А представляет собой график, демонстрирующий встречаемость штаммов В менингококка, экспрессирующих подварианты fHbp v1.x, и показывающий, какие из этих подвариантов v1.x перекрываются (черный) или не перекрываются (белый) вакциной 44CMenB.
Фиг. 1В представляет собой график, демонстрирующий встречаемость штаммов В менингококка, несущих fHbp v2, и показывающий, какие из этих штаммов перекрываются (черный) или не перекрываются (белый) вакциной 44CMenB.
Фиг. 1С представляет собой график, демонстрирующий встречаемость штаммов В менингококка, несущих fHbp v3, и показывающий, какие из этих штаммов перекрываются (черный) или не перекрываются (белый) вакциной 44CMenB.
Фиг. 2 включает четыре графика (термограммы), где сравниваются данные дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) для fHbp v1.1, fHbp v1.13 (дикий тип) и fHbp v.1.13 Е211А (фиг. 2А); fHbp v.1.13 S216R (фиг. 2В); fHbp v.1.13 Е211А/Е232А (фиг. 2С) и fHbp v.1.13 E211A/S216R (фиг. 2D).
Фиг. 3 включает четыре графика (сенсограммы), где сравнивается связывание доменов 6-7 фактора Н с fHbp v1.1, fHbp v1.13 (дикий тип) и fHbp v.1.13 E211A (фиг. 3А); fHbp v.1.13 S216R (фиг. 3В); fHbp v.1.13 E211A/E232A (фиг. 3С) и fHbp v.1.13 E211A/S216R (фиг. 3D).
Фиг. 4A-D включает четыре графика (сенсограммы), где сравнивается связывание полноразмерного белка фактора Н с fHbp v1.1, fHbp v1.13 (дикий тип) и fHbp v.1.13 Е211А (фиг. 4А); fHbp v.1.13 S216R (фиг. 4В); fHbp v.1.13 E211A/E232A (фиг. 4С) и fHbp v.1.13 E211A/S216R (фиг. 4D).
Фиг. 5A-D включает четыре графика (сенсограммы), где сравнивается связывание доменов 6-7 фактора Н с fHbp v1.1, fHbp v1.15 (дикий тип) и fHbp v.1.15 Е214А (фиг. 5А); fHbp v.1.15 S219R (фиг. 5B); fHbp v.1.15 E214A/E235A (фиг. 5С) и fHbp v.1.15 E214A/S219R (фиг. 5D).
Фиг. 6A-D включает четыре графика (сенсограммы), где сравнивается связывание полноразмерного белка фактора Н с fHbp v1.1, fHbp v1.15 (дикий тип) и fHbp v.1.15 Е214А (фиг. 6A); fHbp v.1.15 S219R (фиг. 6В); fHbp v.1.15 Е214А/Е235А (фиг. 6С) и fHbp v.1.15 E214A/S219R (фиг. 6D).
Фиг. 7А, В включает два графика (сенсограммы), где показано связывание доменов 6-7 фактора Н с двумя различными слитыми белками fHbp по изобретению в сравнении с известными слитыми fHbp. На фиг. 7А сравнивается связывание fHbp 231 дикого типа, fHbp 231S и слитого fHbp 231.13 E211A/S216R. На фиг. 7В сравнивается связывание fHbp 231 дикого типа, fHbp 231S и слитого fHbp 231.13 Е211А/Е232А.
На фиг. 8 сравнивается связывание доменов 6-7 фактора Н с fHbp 231 дикого типа, fHbp 231S и сли
- 2 046480 тым fHbp 231.15 Е214А/Е235А по изобретению.
Фиг. 9А, В включает два графика, где показано связывание полноразмерного белка фактора Н с двумя различными слитыми белками fHbp по изобретению в сравнении с известными слитыми fHbp.
На фиг. 9А сравнивается связывание fHbp 231 дикого типа, fHbp 231S и слитого fHbp 231.13 E211A/S216R.
На фиг. 9В сравнивается связывание fHbp 231 дикого типа, fHbp 231S и слитого fHbp 231.13 Е211А/Е232А.
На фиг. 10 сравнивается связывание полноразмерного белка фактора Н с fHbp 231 дикого типа, fHbp 231S и слитым fHbp 231.15 Е214А/Е235А по изобретению.
На фиг. 11А показаны бактерицидные титры сыворотки, измеренные в присутствии кроличьего комплемента (rSBA) для каждого из шести относящихся к fHbp антигенов и BEXSERO-подобной композиции, в отношении ряда штаммов менингококка, экспрессирующих fHbp v1.x. Каждая точка отображает бактерицидный титр сыворотки в отношении отдельного штамма, измеренный в пулированной сыворотке.
На фиг. 11В показаны бактерицидные титры сыворотки, измеренные в присутствии человеческого комплемента (hSBA) для каждого из шести относящихся к fHbp антигенов и BEXSERO-подобной композиции, в отношении того же ряда штаммов, экспрессирующих fHbp v1.x.
На фиг. 12А показаны бактерицидные титры сыворотки, измеренные в присутствии кроличьего комплемента (rSBA) для каждого из шести относящихся к fHbp антигенов и BEXSERO-подобной композиции, в отношении ряда штаммов менингококка, экспрессирующих fHbp v2 или v3. Каждая точка отображает бактерицидный титр сыворотки в отношении отдельного штамма, измеренный в пулированной сыворотке.
На фиг. 12В показаны бактерицидные титры сыворотки, измеренные в присутствии человеческого комплемента (hSBA) для каждого из шести относящихся к fHbp антигенов и BEXSERO-подобной композиции, в отношении того же ряда штаммов, экспрессирующих fHbp v2 или v3.
На фиг. 13 показана бактерицидная активность пулированной сыворотки, измеренная в присутствии человеческого комплемента (hSBA) для каждой из композиций, в отношении штаммов типов var2/3 (фиг. 13А) и v1.x (фиг. 13В). Сыворотку, полученную у вакцинированных мышей, исследовали в пулированном виде в присутствии человеческой плазмы как источника комплемента (hSBA) на 50 штаммах MenB, сгруппированных как штаммы var1 (30 штаммов) и штаммы var2/3 (20 штаммов). На данной фигуре fHbp 2-3-1.13 относится к слитому белку, содержащему v1.13 дикого типа, fHbp 2-3-1.13 NB ES относится к слитому 231.13_E211A/S216R, fHbp 2-3-1.13 NB ЕЕ относится к слитому 231.13_Е211А/Е232А, fHbp 2-3-1.15 относится к слитому белку, содержащему v1.15 дикого типа, a fHbp 2-3-1.15 NB ЕЕ относится к слитому 231.15_Е214А/Е235А.
На фиг. 14 показан процент перекрывания штаммов, экспрессирующих fHbp var2/3 (А) и fHbp var1 (В), тестируемыми вакцинными композициями в исследовании на мышах. На данной фигуре fHbp 2-3-1.13 относится к слитому белку, содержащему v1.13 дикого типа, fHbp 2-3-1.13 NB ES относится к слитому 231.13_E211A/S216R, fHbp 2-3-1.13 NB ЕЕ относится к слитому 231.13 Е211А/Е232А, fHbp 2-3-1.15 относится к слитому белку, содержащему v1.15 дикого типа, a fHbp 2-3-1.15 NB ЕЕ относится к слитому 231.15_Е214А/Е235А.
На фиг. 15 показаны бактерицидные титры сыворотки мышей, измеренные в присутствии человеческого комплемента (hSBA) в отношении 11 штаммов, включая референтные штаммы BEXSERO и штаммы fHbp вариантов 1.1 и 1.4. На данной фигуре fHbp 2-3-1.13 относится к слитому белку, содержащему v1.13 дикого типа, fHbp 2-3-1.13 NB ES относится к слитому 231.13_E211A/S216R, fHbp 2-3-1.13 NB ЕЕ относится к слитому 231.13_Е211А/Е232А, fHbp 2-3-1.15 относится к слитому белку, содержащему v1.15 дикого типа, a fHbp 2-3-1.15 NB ЕЕ относится к слитому 231.15_Е214А/Е235А.
На фиг. 16 композиции по изобретению, содержащие слитый белок BEXSERO + fHbp231.13_E211A/S216R (обозначенные на графиках как BEXSERO PLUS PLUS), сравниваются со стандартной композицией BEXSERO в отношении панели из четырех индикаторных штаммов BEXSERO: M14459 для fHbp var1.l (фиг. 16А); NZ98/254 для PorA Р1.4 (фиг. 16В); М4407 для NHBA (фиг. 16С) и 96217 для NadA (фиг. 16D).
На фиг. 17 показана бактерицидная активность пулированной сыворотки, измеренная в присутствии человеческого комплемента (hSBA) для каждой из композиций, в отношении штаммов типов var2/3 (фиг. 17А) и v1.x (фиг. 17В). Сыворотку, полученную у вакцинированных кроликов, исследовали в пулированном виде на штаммах MenB, сгруппированных как штаммы var1 и var2/3. На данном графике fHbp 2-3-1.13 относится к слитому белку, содержащему v1.13 дикого типа, fHbp 2-3-1.13 NB ES относится к слитому 231.13_E211A/S216R, fHbp 2-3-1.15 относится к слитому белку, содержащему v1.15 дикого типа, a fHbp 2-3-1.15 NB ЕЕ относится к слитому 231.15_Е214А/Е235А.
На фиг. 18 показан процент перекрывания штаммов, экспрессирующих fHbp var2/3 (А) и fHbp var1 (В), обеспечиваемый вакцинными композициями в исследовании на кроликах. На данной фигуре fHbp 2-3-1S относится к слитому белку 231.1R41S предшествующего уровня техники, fHbp 2-3-1.13 относится к слитому белку, содержащему v1.13 дикого типа, fHbp 2-3-1.13 NB ES относится к слитому
- 3 046480
231.13_E211A/S216R, fHbp 2-3-1.13 NB ЕЕ относится к слитому 231.13_Е211А/Е232А, fHbp 2-3-1.15 относится к слитому белку, содержащему v1.15 дикого типа, a fHbp 2-3-1.15 NB ЕЕ относится к слитому 231.15_Е214А/Е235А.
На фиг. 19 показаны бактерицидные титры сыворотки кроликов, измеренные в присутствии человеческого комплемента (hSBA) в отношении 11 штаммов, включая референтные штаммы BEXSERO и штаммы fHbp вариантов 1.1 и 1.4. На данной фигуре fHbp 2-3-1.13 относится к слитому белку, содержащему v1.13 дикого типа, fHbp 2-3-1.13 NB ES относится к слитому 231.13_E211A/S216R, fHbp 2-3-1.15 относится к слитому белку, содержащему v1.15 дикого типа, a fHbp 2-3-1.15 NB ЕЕ относится к слитому 231.15_Е214А/Е235А.
На фиг. 20 показана динамика бактериального заражения (биолюминесцентным МС58 cc32/var. 1) у иммунизированных и неиммунизированных мышей. Мышей группы А иммунизировали 4CMenB+fHbp 23(S)1.13 дикого типа, тогда как мышей группы В иммунизировали 4CMenB+fHbp 23(S)1.13_E211A/S216R. Неиммунизированная мышь получала только фосфатно-солевой буфер (PBS) в качестве контроля.
На фиг. 21А и В представлена количественная и сравнительная оценка динамики бактериального заражения (биолюминесцентным МС58 cc32/var. 1) у иммунизированных и неиммунизированных мышей. При сравнении использовали необработанные суммарные сигналы (в фотонах в секундах на мышь в каждый момент времени) (фиг. 21А) или отношение сигналов через 30 мин и 6 ч после бактериального заражения (фиг. 21В).
Подробное описание изобретения
Белок, связывающийся с липопротеиновым фактором Н (fHbp), экспрессируется на поверхности всех штаммов MenB. fHbp связывается с человеческим белковым фактором Н (hfH), регулирующим комплемент Н (hfH), образуя комплекс, который защищает бактерий от опосредованного комплементом цитолиза и создает механизм, обеспечивающий выживание N. meningitidis в кровотоке человека. Антитела против fHbp выполняют двойную функцию: они являются бактерицидными сами по себе, а предупреждая связывание с hfH, они делают бактериальные штаммы более подверженными цитолизу. Снижение или устранение способности fHbp связываться с hfH повышает иммуногенность антигена fHbp за счет предотвращения образования между fHbp и hfH защитных комплексов, которые способны маскировать эпитопы fHbp и предотвращать связывание антитела.
Существует три различных генетических и иммуногенных варианта fHbp (v1, v2 и v3) и множество подвариантов. Большинство штаммов MenB, не перекрываемых 44CMenB, экспрессируют fHbp v2 или v3 или подварианты v1 с низкой степенью родства с var1.1.
В современной эпидемиологии с применением подхода MATS (как описано, например, Medini et al. Vaccine 2015; 33(23); 2629-36) показано, что штаммы с v1.1 и v1.4 встречаются наиболее часто, за ними идут v1.15, v1.14 и v1.13, как показано на фиг. 1А. Антитела против подварианта fHbp v1.1, включенные в вакцину 44CMenB, обладают выраженной перекрестной реактивностью с наиболее часто встречающимися подвариантами fHbp v1 (v1.1 и v1.4), но меньшей перекрестной реактивностью с подвариантами v1, которые обладают наиболее низкой степенью родства с v1.1 (например, v1.15 и v1.13). Это показано на фиг. 1, поскольку штаммы менингококка В, экспрессирующие fHbp v1.15 и v1.13, являются наиболее часто встречающимися штаммами, которые не перекрываются вакциной 44CMenB.
Кроме того, антитела против подварианта fHbp v1.1, включенного в вакцину 44CMenB, обладают плохой перекрестной реактивностью с fHbp v2 и v3 (Brunelli В. et al., Vaccine, 2011; 29:1072-1081). На фиг. 1B и С показаны пробелы в перекрывании 44CMenB некоторых наиболее часто встречающихся штаммов, экспрессирующих fHbp v2 или v3.
Это означает, что 44CMenB не перекрывает некоторые штаммы менингококка, несущие fHbp v2, v3, или штаммы, несущие некоторые под варианты v1.
В данном изобретении предложены мутированные полипептиды fHbp варианта 1.13 или варианта 1.15 (v1.13 или v1.15), которые являются иммуногенными и которые могут быть скомбинированы с существующими вакцинами против менингококка для обеспечения лучшего перекрывания штаммов N. meningitidis.
В частности, полипептиды v1 по изобретению являются подвариантами fHbp варианта 1, которые генетически различаются с антигеном fHbp v1.1, включенным в 44CMenB.
Кроме того, полипептиды v1 по изобретению мутированы с целью уменьшения связывания с hfH по сравнению с соответствующим полипептидом v1 дикого типа. Напротив, антиген fHbp v1.1, включенный в BEXSERO, и антигены fHbp v1.55 и v3.45, включенные в TRUMENBA, связываются с hfH.
Полипептиды v1 по изобретению могут быть представлены в отдельном виде или являться компонентом слитого белка, наряду с мутантными формами fHbp вариантов 2 и 3, которые были модифицированы для улучшения стабильности, а также для уменьшения связывания с fHbp. Предложив единый слитый белок, содержащий указанные антигены v2 и v3 наряду с антигеном v1 по изобретению, авторы изобретения добились лучшего перекрывания штаммов по сравнению с существующими лицензированными вакцинами против менингококка В. Для ясности, ни антиген v2, ни v3 не присутствуют, например, в 44CMenB. Присутствие антигенов v2 и v3 в составе слитых белков по данному изобретению улучшает
- 4 046480 перекрывание штаммов по сравнению, например, с 44CMenB.
Полипептиды v1 и слитые белки по изобретению могут применяться в отдельности или в комбинации с менингококковым антигеном NHBA, менингококковым антигеном NadA, менингококковым антигеном fHbp и везикулой наружной мембраны менингококка (например, в комбинации с композицией BEXSERO) для получения комбинированной иммуногенной композиции, обладающей повышенной иммуногенностью (благодаря добавлению/включению несвязывающихся форм вариантов fHbp), и лучшего перекрывания штаммов N. meningitidis (благодаря добавлению новых вариантов/подвариантов fHbp) по сравнению с BEXSERO в отдельности.
Мутантные полипептиды менингококкового fHbp v1.13.
Авторы данного изобретения обнаружили остатки в последовательности fHbp v1.13, которые могут быть модифицированы для уменьшения связывания с hfH. Такие мутанты в данном документе обозначают несвязывающимися мутантами (NB). Авторы изобретения также обнаружили комбинации мутаций в последовательности v1.13, которые особенно эффективны для снижения связывания с hfH. fHbp v1.13 также известен в области техники как вариант fHbp B09.
Зрелый липопротеин fHbp v1.13 дикого типа из штамма М982 (номер доступа в GenBank AAR84475.1) имеет следующую аминокислотную последовательность, где подчеркнута N-концевая полиглициновая сигнальная последовательность:
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLOSLTLDOSVRKNEKLKLAAOGAEKT
YGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQV QDSEDSGI<MVAI<RQFRIGDIAGEHTSFDI<LPI<GGSATYRGTAFGSDDAGGI<LTYTID FAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAYIKPDEKRHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGG QAQEVAGS AEVETANGIHHIGLAAKQ (SEQ Ш NO: 1)
Зрелый липопротеин v1.13 отличается от полноразмерной последовательности дикого типа тем, что полноразмерный полипептид имеет дополнительные 19 остатков N-концевой лидерной последовательности, которая отщепляется от зрелого полипептида. Так, полноразмерный fHbp v1.13 дикого типа имеет следующую аминокислотную последовательность (с N-концевой лидерной последовательностью, показанной жирным шрифтом):
MNRTAFCCFSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLD
QSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGE
FQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATY
RGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAYIKPDEKRHAVISG SVLYNQDEKGSYSLGIFGGQAQEV AGS AEVETANGIHHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 31)
У ΔG формы зрелого липопротеина v1.13 отсутствует N-концевая полиглициновая последовательность зрелого полипептида, т.е. у нее отсутствуют первые 7 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 1, и у нее отсутствуют первые 26 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 31:
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSL
NTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSG
I<MVAI<ROFRIGDIAGEHTSFDI<LPI<GGSATYRGTAFGSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGH
GKIEHLKSPELNVELATAYIKPDEKRHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGGQAQEVAG
SAEVETANGIHHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 2)
Таким образом, в первом аспекте изобретения предложен мутантный менингококковый полипептид fHbp v1.13, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере k% идентичность последовательности SEQ ID NO: 2, при условии, что аминокислотная последовательность указанного мутантного менингококкового полипептида fHbp v1.13 включает мутацию с заменой одного или более чем одного из остатков Е211, S216 или Е232 последовательности SEQ ID NO: 2.
Значение k может быть выбрано из 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100. Предпочтительно оно равно 80 (т.е. аминокислотная последовательность мутантного fHbp v1.13 идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 2), и более предпочтительно равно 85, более предпочтительно равно 90, и более предпочтительно 95. Наиболее предпочтительно аминокислотная последовательность мутантного fHbp v1.13 идентична по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% SEQ ID NO: 2.
Предпочтительно аминокислотная последовательность отличается от SEQ ID NO: 2 по меньшей мере одной или более чем одной заменой Е211А, S216R или Е232А. Более предпочтительно аминокислотная последовательность содержит замены множества остатков, выбранных из следующих: (i) E211A и Е232А или (ii) E211A и S216R. Предпочтительно аминокислотная последовательность содержит замены остатков Е211А и S216R относительно SEQ ID NO: 2.
Без ограничения какой-либо теорией, замена глутаминовой кислоты (Е) на аланин (А) в положении 211 последовательности SEQ ID NO: 2 удаляет отрицательно заряженный остаток, задействованный в рекрутировании hfH, что способствует устранению связывания fH. Замена аргинина (R) на серин (S) в положении 216 последовательности SEQ ID NO: 2 замещает аминокислоту дикого типа соот
- 5 046480 ветствующим остатком из N. gonorrhoeae, который не связывается с hfH.
В предпочтительных воплощениях мутантный полипептид по изобретению имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (v1.13 ΔG E211A/E232A) или SEQ ID NO: 4 (v1.13 ΔG (E211A/S216R). Более предпочтительно мутантный полипептид v1.13 по изобретению имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
После введения животному-хозяину, предпочтительно млекопитающему и более предпочтительно человеку, мутантный полипептид v1.13 по изобретению может вызывать выработку антител, которые способны распознавать менингококковые полипептиды fHbp дикого типа с последовательностью SEQ ID NO: 1. В идеальном варианте такие антитела являются бактерицидными (см. ниже).
Мутантные полипептиды менингококкового fhbp v1.15.
Авторы данного изобретения также обнаружили остатки в последовательности fHbp v1.15, которые могут быть модифицированы для предотвращения связывания с hfH. Такие мутанты в данном документе обозначают несвязывающимися мутантами (NB). Авторы изобретения также обнаружили комбинации мутаций в последовательности v1.15, которые особенно эффективны для предотвращения связывания с hfH. fHbp v1.15 также известен в области техники как вариант fHbp B44.
Зрелый липопротеин fHbp v1.15 дикого типа из штамма NM452 (номер доступа в GenBank ABL14232.1) имеет следующую аминокислотную последовательность, где подчеркнута N-концевая полиглициновая сигнальная последовательность:
CSSGGGGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISONGTLTLSAQG
AERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTA LQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGG KLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISGSVLYNQAEKGSY SLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ (SEQ Ш NO: 5)
Зрелый липопротеин v1.15 отличается от полноразмерной последовательности дикого типа тем, что полноразмерный полипептид имеет дополнительные 19 остатков N-концевой лидерной последовательности, которая отщепляется от зрелого полипептида. Так, полноразмерный fHbp v1.15 дикого типа имеет следующую аминокислотную последовательность (с N-концевой лидерной последовательностью, показанной жирным шрифтом):
MNRTTFCCLSLTAALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLK
SLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQL ITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGKLPK DVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDEK HHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ (SEQ Ш NO: 32)
У ΔG формы зрелого липопротеина v1.15 отсутствует N-концевая полиглициновая последовательность, т.е. у нее отсутствуют первые 12 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 5 и у нее отсутствуют первые 31 аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 32:
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDN
SLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHS GKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQ GHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEV AGSAEVETANGIRHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 6)
Таким образом, во втором аспекте изобретения предложен мутантный менингококковый полипептид fHbp v1.15, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере k% идентичность последовательности SEQ ID NO: 6, при условии, что аминокислотная последовательность указанного мутантного менингококкового полипептида fHbp v1.15 включает мутацию с заменой одного или более чем одного из остатков Е214, S219 или Е235 последовательности SEQ ID NO: 6.
Значение k может быть выбрано из 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100. Предпочтительно оно равно 80 (т.е. аминокислотная последовательность мутантного fHbp v1.15 идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 6), более предпочтительно равно 85, более предпочтительно равно 90 и более предпочтительно 95. Наиболее предпочтительно аминокислотная последовательность мутантного fHbp v1.15 идентична по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% SEQ ID NO: 6.
Предпочтительно аминокислотная последовательность отличается от SEQ ID NO: 6 по меньшей мере одной или более чем одной из замен Е214А, S219R или Е235А. Более предпочтительно аминокислотная последовательность содержит замены остатков, выбранных из следующих: (i) S219R, (ii) E214A и S219R и (iii) E214A и Е235А.
В предпочтительных воплощениях мутантный полипептид v1.15 по изобретению имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (v.1.15_S219R), SEQ ID NO: 8 (v1.15_E214A/S219R) или SEQ ID NO: 9 (v1.15_E214A/E235A).
После введения животному-хозяину, предпочтительно млекопитающему и более предпочтительно
- 6 046480 человеку, мутантный полипептид v1.15 по изобретению может вызывать выработку антител, которые способны распознавать менингококковые полипептиды fHbp дикого типа с последовательностью SEQ ID NO: 5. В идеальном варианте такие антитела являются бактерицидными (см. ниже).
Слитый полипептид.
В изобретении также предложен слитый полипептид, содержащий все три менингококковых полипептида fHbp v1, v2 и v3, где варианты последовательностей fHbp расположены в порядке v2-v3-v1 от N- к С-концу. В предпочтительном воплощении слитый полипептид fHbp имеет аминокислотную последовательность формулы NH2-A-[-X-L]3-B-COOH, где каждый X представляет собой различный вариант последовательности fHbp, L представляет собой аминокислотную последовательность возможного линкера, А представляет собой возможную N-концевую аминокислотную последовательность и В представляет собой возможную С-концевую аминокислотную последовательность.
Компонент, представляющий собой полипептид fHbp v1 слитого полипептида по изобретению, представляет собой либо мутантный полипептид fHbp v1.13, либо мутантный полипептид fHbp v1.13, описанный выше.
Компоненты, представляющие собой полипептиды fHbp v2 и v3 по изобретению, предпочтительно представляют собой мутантные полипептиды v2 и v3, обладающие улучшенной стабильностью и пониженной способностью связываться с hfH по сравнению с полипептидами v2 и v3 дикого типа. Как объяснялось выше, уменьшение связывания fHbp с hfH предпочтительно, поскольку предотвращает образование между fHbp и hfH защитных комплексов, которые способны маскировать эпитопы fHbp, и, таким образом, повышает иммуногенность полипептидного антигена.
Авторы изобретения ранее обнаружили остатки в последовательностях v2 и v3, которые могут быть модифицированы для увеличения стабильности полипептида, а также для уменьшения связывания с hfH. Эти мутированные последовательности v2 и v3 подробно описаны в WO 2015/128480.
Полноразмерный fHbp v2 дикого типа из штамма 2996 имеет следующую аминокислотную последовательность (лидерная последовательность показана жирным шрифтом, а полиглициновая последовательность подчеркнута):
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLD
QSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGE
FQIYI<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHG I<AFSSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IEHLI<TPEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGD TRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ (SEQ Ш NO: 10)
У зрелого липопротеина отсутствуют первые 19 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 10:
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKT
YGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKIN
NPDK ID SLINQRSFLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAF S SDDAGGKLT YTIDF AA KQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRA
QEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ (SEQ ID NO: 11)
У ΔG формы SEQ ID NO: 10 отсутствуют первые 26 аминокислот:
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSL
NTGI<LI<NDI<VSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYI<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSL
INQRSFLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAF S SDD AGGKLTYTIDF AAKQGHGKI EHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSA TVKIGEKVHEIGIAGKQ (SEQ Ш NO: 12)
В предпочтительном воплощении слитый полипептид по изобретению содержит мутантный полипептид fHbp v2, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере k% идентичность последовательности SEQ ID NO: 12, при условии, что аминокислотная последовательность fHbp v2 включает мутацию с заменой одного или более чем одного из остатков S32 и L123 последовательности SEQ ID NO: 12. Предпочтительно замены представляют собой S32V и L123R.
Значение k может быть выбрано из 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100. Предпочтительно оно равно 80 (т.е. аминокислотная последовательность мутантного fHbp v2 идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 12), более предпочтительно равно 85, более предпочтительно равно 90 и более предпочтительно 95.
В некоторых воплощениях полипептид fHbp v2, включенный в слитый белок по изобретению, укорочен относительно SEQ ID NO: 12. По сравнению со зрелой последовательностью дикого типа SEQ ID NO: 12 уже укорочена на N-конце и, в том числе, не включает полиглициновую последовательность (сравните SEQ ID NO: 11 и 12), однако SEQ ID NO: 12 может быть укорочена на С-конце и/или дополнительно укорочена на N-конце.
В предпочтительном воплощении полипептид fHbp v2, включенный в слитый белок, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16.
Полипептид fHbp v2, включенный в слитый белок по изобретению, имеет более высокую стабильность в тех же условиях эксперимента, чем такой же полипептид без отличий в последовательности по
- 7 046480 остаткам S32 и L123, например, более высокую стабильность, чем менингококковый полипептид дикого типа, состоящий из SEQ ID NO: 10. Мутация S32V стабилизирует структуру благодаря возникновению благоприятных гидрофобных взаимодействий. Мутация L123R устраняет связывание fH в результате появления нестыковок с fH и препятствующих связыванию зарядов.
Улучшение стабильности можно оценивать при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), например, как обсуждается Johnson (2013), Arch. Biochem. Biophys. 531:100-9 и Bruylants et al., Current Medicinal Chemistry, 2005; 12:2011-20. DSC ранее применяли для оценки стабильности fHbp v2 (Johnson et al. PLoS Pathogen, 2012; 8:e1002981). Подходящие условия для оценки стабильности при помощи DSC могут заключаться в использовании 20 мкМ полипептида в буферном растворе (например, 25 мМ Tris) с pH между 6 и 8 (например, 7-7,5) с 100-200 мМ NaCl (например, 150 мМ).
Об увеличении стабильности свидетельствует повышение температуры фазового перехода (Tm) по меньшей мере для одного пика на кривой DSC по меньшей мере на 5°С, например, по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35°С или более по сравнению с диким типом. При разворачивании fHbp дикого типа методом DSC обнаруживаются два пика (один для N-концевого домена, а другой для С-концевого домена) и, когда полипептид v2, включенный в слитый белок по изобретению, включает в себя оба таких домена, увеличение стабильности относится к повышению Tm для N-концевого домена по меньшей мере на 5°С. Tm для N-концевого домена в последовательностях v2 дикого типа может составлять 40°С или даже ниже (Johnson et al., (2012), PLoS Pathogen, 8: e1002981), тогда как С-концевые домены могут иметь Tm 80°С или выше. Таким образом, аминокислотная последовательность fHbp v2, включенного в слитый белок по изобретению предпочтительно имеет N-концевой домен с Tm по меньшей мере 45°С, например, >50, >55, >60, >65, >70, >75 или даже >80°С.
Полноразмерный fHbp v3 дикого типа из штамма M1239 имеет следующую аминокислотную последовательность (лидерная последовательность показана жирным шрифтом, а полиглициновая последовательность подчеркнута):
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLK
SLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQ TITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPG GKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKS HAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ (SEQ Ш NO: 13)
У зрелого липопротеина отсутствуют первые 19 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 13: CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQG
AEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVV ALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRL HYSIDFTI<I<QGYGRIEHL1<TLEQNVELAAAEL1<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI<GTYH LALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ (SEQ ID NO: 14)
У AG формы SEQ ID NO: 13 отсутствуют первые 31 аминокислоты (т.е. отсутствует сигнальная последовательность и полиглициновая последовательность):
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDN SLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKT DSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGI<AEYHGI<AFSSDDPNGRLHYSIDFTI<I<QGYG RIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGS ATVKIGEKVHEIGIAGKQ (SEQ Ш NO: 15)
В предпочтительном воплощении слитый полипептид по изобретению содержит мутантный полипептид fHbp v3, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере k% идентичность последовательности SEQ ID NO: 15, при условии, что аминокислотная последовательность fHbp v3 включает мутацию с заменой одного или более чем одного из остатков S32 и L126 последовательности SEQ ID NO: 15. Предпочтительно замены представляют собой S32V и L126R.
Значение k может быть выбрано из 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100. Предпочтительно оно равно 80 (т.е. аминокислотная последовательность мутантного fHbp v2 идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 15) и более предпочтительно равно 85, более предпочтительно равно 90 и более предпочтительно 95.
В некоторых воплощениях полипептид fHbp v3, включенный в слитый белок по изобретению, укорочен относительно SEQ ID NO: 15. По сравнению со зрелой последовательностью дикого типа SEQ ID NO: 15 уже укорочена на N-конце и, в том числе, не включает полиглициновую последовательность (сравните SEQ ID NO: 14 и 15), однако SEQ ID NO: 15 может быть укорочена на С-конце и/или дополнительно укорочена на N-конце.
В предпочтительном воплощении полипептид fHbp v3, включенный в слитый белок по изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17.
Полипептид fHbp v3, включенный в слитый белок по изобретению, имеет в тех же условиях эксперимента более высокую стабильность, чем такой же полипептид без отличий в последовательности по
- 8 046480 остаткам S32 и L126, например, более высокую стабильность, чем менингококковый полипептид дикого типа, состоящий из SEQ ID NO: 13. Мутация S32V стабилизирует структуру благодаря возникновению благоприятных гидрофобных взаимодействий. Мутация L126R устраняет связывание fH в результате появления нестыковок с fH и препятствующих связыванию зарядов.
Улучшение стабильности можно оценивать при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), например, как обсуждается Johnson (2013), Arch. Biochem. Biophys. 531:100-9 и Bruylants et al. (2005), Current Medicinal Chemistry, 12:2011-20. DSC ранее применяли для оценки стабильности fHbp v3 (van der Veen et al. (2014), Infect. Immun. PMID, 24379280). Подходящие условия для оценки стабильности при помощи DSC могут заключаться в использовании 20 мкМ полипептида в буферном растворе (например, 25 мМ Tris) с pH между 6 и 8 (например, 7-7,5) с 100-200 мМ NaCl (например, 150 мМ).
Об увеличении стабильности свидетельствует повышение температуры фазового перехода (Tm) по меньшей мере для одного пика на кривой DSC по меньшей мере на 5°С, например, по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35°С или более по сравнению с диким типом. При разворачивании fHbp дикого типа методом DSC обнаруживаются два пика (один для N-концевого домена, а другой для С-концевого домена) и, когда полипептид v3, включенный в слитый белок по изобретению, включает в себя оба таких домена, увеличение стабильности относится к повышению Tm для N-концевого домена по меньшей мере на 5°С. Tm для N-концевого домена в последовательностях v3 дикого типа может составлять 60°С или ниже (Johnson et al. (2012), PLoS Pathogen, 8:e1002981), тогда как С-концевые домены могут иметь Tm 80°С или выше. Таким образом, аминокислотная последовательность мутантного fHbp v3 по изобретению предпочтительно имеет N-концевой домен с Tm по меньшей мере 65°С, например, >70, >75 или даже >80°С.
Как описано выше, в предпочтительном воплощении слитый полипептид fHbp имеет аминокислотную последовательность формулы NH2-A-[-X-L]3-B-COOH, где каждый X представляет собой различный вариант последовательности fHbp, a L представляет собой аминокислотную последовательность возможного линкера. В предпочтительном воплощении аминокислотная последовательность линкера L представляет собой глициновый или глицин-сериновый полимерный линкер. Примеры линкеров включают GGSG, GGSGG, GSGSG, GSGGG, GGGSG, GSSSG и GSGGGG, но не ограничиваются указанными. Специалисту в области техники будут очевидны другие подходящие глициновые или глицинсериновые полимерные линкеры. В предпочтительном слитом полипептиде по изобретению последовательности v2 и v3 и последовательности v3 и v1 соединены глицин-сериновым полимерным линкером GSGGGG.
В предпочтительном воплощении слитый полипептид по изобретению содержит или состоит из одной из следующих аминокислотных последовательностей (глицин-сериновые линкерные последовательности подчеркнуты, а мутированные остатки указаны жирным шрифтом):
fHbp 23S1.13 Е211А/Е232А (SEQ ID NO: 18)
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKroSLIN QRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHGI<AFSSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IEHL KTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKOGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPONGTLTL SAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHS AVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNG RLHYSIDFTI<I<QGYGRIEHLI<TLEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI<GTYH LALFGDRAOEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHK DKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKL PKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAYIKPDEK RHAVISGSVLYNQDAKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAAVETANGIHHIGLAAKQ fHbp 23S1.13 E211A/S216R (SEQ ID NO: 19)
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGI<LI<NDI<VSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYI<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSLIN QRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHGI<AFSSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IEHL KTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKOGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPONGTLTL SAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHS AVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNG RLHYSIDFTI<I<QGYGRIEHLI<TLEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI<GTYH LALFGDRAOEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHK DKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD
- 9 046480
GKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKL PKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAYIKPDEK RHAVISGSVLYNQDAKGSYRLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ fHbp_23S_1.15 S231R (SEQ ID NO: 20)
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKroSLIN QRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHGI<AFSSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IEHL KTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKOGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPONGTLTL SAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHS AVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNG RLHYSIDFTI<I<QGYGRIEHLI<TLEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI<GTYH LALFGDRAOEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHK DKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEV DGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGK LPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPD EKHHAVISGSVLYNQAEKGSYRLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ fflbp_23S_1.15 E214A/S219R (SEQ ID NO: 21)
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGI<LI<NDI<VSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYI<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSLIN QRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHL KTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTL SAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHS AVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNG RLHYSIDFTI<I<QGYGRIEHLI<TLEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI<GTYH LALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHK DKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEV DGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGK LPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPD EKHHAVISGSVLYNQAAKGSYRLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ fHbp_23S_1.15 E214A/E235A (SEQ ID NO: 22)
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLIN QRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHGI<AFSSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IEHL KTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPONGTLTL SAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHS AVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNG RLHYSIDFTI<I<QGYGRIEHLI<TLEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI<GTYH LALFGDRAOEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHK DKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEV DGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGK LPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPD EKHHAVISGSVLYNQAAKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAAVETANGIRHIGLAAKQ
В предпочтительном воплощении слитый полипептид по изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В альтернативном воплощении слитый полипептид по изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
После введения животному-хозяину, предпочтительно млекопитающему и более предпочтительно человеку, слитый полипептид по изобретению может вызывать выработку антител, которые способны распознавать менингококковые полипептиды fHbp дикого типа, в частности полипептиды с последовательностями SEQ ID NO: 31, 32, 10 и/или 13. В идеальном варианте такие антитела являются бактерицидными (см. ниже).
Как описано выше, в предпочтительном воплощении слитый полипептид fHbp по изобретению имеет аминокислотную последовательность формулы NH2-A-[-X-L]3-B-COOH, где каждый X представляет собой различный вариант последовательности fHbp; А представляет собой возможную N-концевую аминокислотную последовательность. В предпочтительном воплощении слитые полипептиды, описанные в данном документе, дополнительно содержат следующую N-концевую аминокислотную последова
- 10 046480 тельность, которая предпочтительна для обеспечения хорошей экспрессии слитого белка: MGPDSDRLQQRR (SEQ ID NO: 34).
Любой из описанных в данном документе слитых белков (например, SEQ ID NO: 18-22, 29 и 30) может быть модифицирован, чтобы включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 на N-конце слитого полипептида, т.е. аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 34 добавляется к N-концу компонента fHbp v2 слитого полипептида.
Бактерицидные ответы.
Предпочтительные v1.13, v1.15 и/или слитые пептиды по изобретению могут вызывать выработку антител, которые являются бактерицидными в отношении менингококков. Ответ в виде выработки бактерицидных антител удобно определять у мышей, и он служит индикатором эффективности вакцины (например, см. примечание 14 в документе Pizza et al. (2000), Science, 287:1816-1820; а также WO 2007/028408).
Полипептиды по первому воплощению изобретения предпочтительно могут вызывать ответ в виде выработки антител, которые являются бактерицидными в отношении штамма N. meningitidis, экспрессирующего последовательность v1.13 fHbp.
Предпочтительные полипептиды по первому воплощению изобретения могут вызывать у мышей выработку антител, которые в сывороточном бактерицидном тесте являются бактерицидными в отношении штамма N. meningitidis, экспрессирующего последовательность v1.13 fHbp.
Полипептиды по второму воплощению изобретения предпочтительно могут вызывать ответ в виде выработки антител, которые являются бактерицидными в отношении штамма N. meningitidis, экспрессирующего последовательность v1.15 fHbp.
Предпочтительные полипептиды по второму воплощению изобретения могут вызывать у мышей выработку антител, которые в сывороточном бактерицидном тесте являются бактерицидными в отношении штамма N. meningitidis, экспрессирующего последовательность v1.15 fHbp.
Например, иммуногенная композиция, содержащая указанные полипептиды, может обеспечивать бактерицидный титр сыворотки >1:4 при исследовании с человеческим комплементом, как предложено Goldschneider [Goldschneider et al. (1969), J. Exp. Med. 129:1307-26, Santos et al. (2001), Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 8:616-23, и Frasch et al. (2009), Vaccine, 27S:B112-6] и/или обеспечивать бактерицидный титр сыворотки >1:128 при использовании кроличьего комплемента.
Полипептиды.
Полипептиды по изобретению могут быть получены различными способами, например при помощи химического синтеза (по меньшей мере, частично), при помощи разрезания более длинных полипептидов протеазами, при помощи трансляции РНК, при помощи очистки из культуры клеток (например, при рекомбинантной экспрессии или из культуры N. meningitidis) и т.д. Гетерологичная экспрессия в хозяине Е. coli является предпочтительным способом экспрессии.
Полипептиды по изобретению в идеальном варианте имеют длину по меньшей мере 100 аминокислот, например, 150 аминокислот, 175 аминокислот, 200 аминокислот, 225 аминокислот или более. Они включают последовательность мутантного fHbp v1, v2 и/или v3, и последовательность мутантного fHbp v1, v2 и/или v3, аналогично, должна быть длиной по меньшей мере 100 аминокислот, например, 150 аминокислот, 175 аминокислот, 200 аминокислот, 225 аминокислот или более.
В природе fHbp является липопротеином N. meningitidis. Также было обнаружено его липидирование при экспрессии в Е. coli с его нативной лидерной последовательностью или с гетерологичными лидерными последовательностями. Полипептиды по изобретению могут иметь N-концевой остаток цистеина, который может быть липидирован, например содержать пальмитоильную группу, как правило, образуя трипальмитоил^-глицерил-цистеин. В других воплощениях полипептиды не являются липидированными.
Полипептиды предпочтительно получают по существу в чистой или по существу выделенной форме (т.е. по существу свободными от других полипептидов нейссерии или клетки-хозяина). Как правило, полипептиды находятся в неестественном окружении, например, они отделены от их естественного окружения. В некоторых воплощениях полипептиды находятся в композиции, обогащенной полипептидом по сравнению с исходным материалом. Так, предложен очищенный полипептид, где очистка означает, что полипептид находится в составе композиции, которая по существу свободна от других экспрессированных полипептидов, где по существу свободна означает, что более чем 50% (например, >75, >80, >90, >95 или >99%) всех полипептидов в составе композиции являются полипептидом по изобретению.
Полипептиды могут быть в различной форме (например, нативной, слитой, гликозилированной, негликозилированной, липидированной, с дисульфидными мостиками и т.д.).
Если полипептид по изобретению получают при помощи трансляции в биологическом хозяине, необходим стартовый кодон, который обеспечит N-концевой метионин у большинства хозяев. Так, полипептид по изобретению будет, по меньшей мере на стадии формирования, включать остаток метионина, расположенный в 5' направлении от указанной последовательности SEQ ID NO.
Расщепление формирующейся последовательности означает, что аминокислотная последователь
- 11 046480 ность мутантного fHbp v1, v2 или v3 может сама обеспечивать N-конец полипептида. Однако, в других воплощениях полипептид по изобретению может включать N-концевую последовательность, располагающуюся в 5' направлении от аминокислотной последовательности fHbp v1, v2 или v3. В некоторых воплощениях полипептид имеет на N-конце один метионин, непосредственно за которым расположена аминокислотная последовательность мутантного fHbp v1, v2 или v3; в других воплощениях может применяться более длинная расположенная в 5' направлении последовательность. Такая расположенная в 5' направлении последовательность может быть короткой (т.е. 40 аминокислот или менее, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают лидерные последовательности для направления транспорта белков или короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или выделение (например, гистидиновые метки, т.е. Hisn, где n=4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более). Специалистам в области техники будут очевидны другие подходящие N-концевые аминокислотные последовательности.
Полипептид по изобретению может также включать аминокислоты, расположенные в 3' направлении от аминокислотной последовательности мутантного fHbp v1, v2 или v3. Такие С-концевые удлинения могут быть короткими (т.е. 40 аминокислот или менее, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают последовательности для направления транспорта белков, короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или выделение (например, содержащие гистидиновые метки, т.е. Hisn, где n=4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) или последовательности, которые улучшают стабильность полипептида. Специалистам в области техники будут очевидны другие подходящие С-концевые аминокислотные последовательности.
В некоторых воплощениях изобретение не охватывает полипептиды, которые включают гистидиновую метку (ср. Johnson et al. (2012), PLoS Pathogen 8:e1002981, и Pajon et al. (2012), Infect. Immun. 80:2667-77) и, в частности, гексагистидиновую метку на С-конце.
Термин полипептид относится к аминокислотным полимерам любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и прерываться неаминокислотами. Термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным или искусственным образом; например, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидированием, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, например, такой как конъюгирование с компонентом-меткой. Определение также охватывает, например, полипептиды, содержащие один или более чем один аналог аминокислот (включая, например, аминокислоты, не встречающиеся в природе, и т.д.), а также другие модификации, известные в области техники. Полипептиды могут быть одноцепочечными или состоять из нескольких ассоциированных цепей.
Полипептиды по изобретению могут быть присоединены или иммобилизованы на твердом носителе.
Полипептиды по изобретению могут содержать детектируемую метку, например, радиоактивную метку, флуоресцентную метку или биотиновую метку. Это особенно полезно в методах иммунологического анализа.
Полипептиды по изобретению обычно состоят из искусственной аминокислотной последовательности, а именно, последовательности, которая отсутствует в менингококках природного происхождения.
Аффинность к фактору Н можно количественно оценить при помощи поверхностного плазмонного резонанса (например, как описано Schneider et al. (2009), Nature, 458:890-5) с иммобилизованным человеческим fH. Предпочтительны мутации, приводящие к уменьшению аффинности (например, увеличение константы диссоциации KD) по меньшей мере в 10 раз и в идеальном варианте по меньшей мере в 100 раз (по сравнению с таким же пептидом, но без мутации, при проведении эксперимента в тех же самых условиях).
Нуклеиновые кислоты.
В четвертом аспекте изобретения предложена плазмида или иная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный полипептид fHbp v1.13, мутантный полипептид fHbp v1.15 или слитый полипептид, определенные выше.
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены различными способами, например при помощи химического синтеза (например, фосфорамидитного синтеза ДНК) целиком или частично, при помощи разрезания более длинных нуклеиновых кислот нуклеазами (например, рестрикционных ферментов), при помощи объединения более коротких нуклеиновых кислот или нуклеотидов (например, с применением лигаз или полимераз), из геномных библиотек или библиотек кДНК и т.д.
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть в различной форме, например одноцепочечные, двухцепочечные, векторы, праймеры, зонды, меченые, немеченные и т.д.
Предпочтительно нуклеиновые кислоты по изобретению находятся в выделенной или по существу выделенной форме.
Термин нуклеиновая кислота охватывает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие, которые содержат модифицированные остовы, а также пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.
- 12 046480
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть меченными, например, радиоактивной или флуоресцентной меткой.
В изобретении также предложены векторы (такие как плазмиды), содержащие нуклеотидные последовательности по изобретению (например, клонирующие или экспрессирующие векторы, например, которые подходят для иммунизации нуклеиновыми кислотами) и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.
Клетки-хозяева.
В пятом аспекте изобретения предложена клетка-хозяин, трансформированная плазмидой, содержащей нуклеотидные последовательности по изобретению, описанные выше.
Клетка-хозяин по изобретению предпочтительно представляет собой бактерию, которая экспрессирует полипептид по изобретению. Бактерия может, например, представлять собой менингококк или Е. coli. Бактерия может конститутивно экспрессировать полипептид, но в некоторых воплощениях экспрессия может быть под контролем индуцибельного промотора. Бактерия может сверхэкспрессировать полипептид (ср. WO 2006/081259). В идеальном варианте экспрессия полипептида не подвержена фазовой вариации.
Клетка может представлять собой бактерию менингококк, такую как бактерия менингококк, имеющая пониженную экспрессию или нокаут mltA, а также возможно имеющая пониженную экспрессию или нокаут: (i) по меньшей мере одного гена, задействованного в придании токсичности части LPS, представляющей собой липид А, в частности Ipxl1; и/или (ii) по меньшей мере одного гена, задействованного в синтезе или экспортировании капсулярного полисахарида, в частности synX и/или ctrA.
Везикулы.
В шестом аспекте изобретения предложена везикула наружной мембраны, полученная из клеткихозяина по изобретению, в частности из менингококковой клетки-хозяина.
Везикулы, полученные из клетки-хозяина по изобретению, предпочтительно включают полипептид по изобретению, который должен находиться в иммуннодоступной форме в везикулах, т.е. антитело, которое может связываться с очищенным полипептидом по изобретению, должно также быть способным связываться с полипептидом, находящимся в везикулах.
Такие мембранные везикулы включают любые протеолипосомные везикулы, полученные при разрушении или шелушении наружной мембраны менингококка, с образованием из них везикул, которые включают белковые компоненты наружной мембраны. Таким образом, термин охватывает везикулы наружной мембраны (OMV; иногда обозначаемые пузырьками), микровезикулы (MV [WO 02/09643]) и нативные OMV (NOMV [Katial et al. (2002), Infect. Immun. 70:702-707]).
MV и NOMV представляют собой мембранные везикулы естественного происхождения, которые образуются спонтанно при росте бактерий и высвобождаются в культуральную среду. MV могут быть получены при культивировании нейссерий в жидкой культуральной среде, отделении целых клеток от более мелких MV в жидкой культуральной среде (например, путем фильтрации или центрифугировании при низкой скорости для осаждения только клеток, но не более мелких везикул) и дальнейшего сбора MV из обедненной клетками среды (например, путем фильтрования, дифференциальной преципитации или агрегации MV, центрифугирования при высокой скорости для осаждения MV). Штаммы для применения в получении MV, как правило, можно выбирать на основании количества MV, полученных в культуре, например, US 6180111 и WO 01/34642 описывают Neisseria с высокой продукцией MV.
OMV получают из бактерий искусственным способом, и их можно получать посредством обработки детергентами (например, дезоксихолатом) или способами без детергентов (например, см. WO 2004/019977). Методики получения OMV включают обработку бактерий детергентом на основе солей желчных кислот (например, солей литохолевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, холевой кислоты, урсохолевой кислоты и т.д., с дезоксихолатом натрия [см. ЕР 0011243 и Fredriksen et al. (1991), NIPH Ann. 14(2):67-80], которая предпочтительна для обработки Neisseria) при значениях pH достаточно высоких, чтобы не вызвать преципитацию детергента [WO 01/91788]. Другие методики можно осуществлять по существу в отсутствие детергента [WO 2004/019977] с применением таких методик, как воздействие ультразвука, гомогенизация, микрофлюидизация, кавитация, осмотический шок, измельчение, френч-пресс, блендирование и т.д. Способы без применения или с применением малых количеств детергента могут сохранять полезные антигены, такие как NspA и fHbp. Так, в способе можно применять буфер для экстрагирования OMV приблизительно с 0,5% дезоксихолата или менее, например, приблизительно 0,2%, приблизительно 0,1%, <0,05% или 0.
Эффективный процесс для получения OMV описан в WO 2005/004908 и включает ультрафильтрацию первичных OMV, вместо высокоскоростного центрифугирования. Процесс может включать стадию ультрацентрифугирования после проведения ультрафильтрации. OMV также можно очищать с применением процесса двухстадийной гель-фильтрации, описанного в WO 2011/036562.
Везикулы для применения по изобретению могут быть получены из любого штамма менингококка. Везикулы обычно будут происходить из штамма серогруппы В, но возможно их получать из других серогрупп, нежели В, таких как А, С, W135 или Y (например, WO 01/91788 описывает процесс для серо
- 13 046480 группы А). Штамм может быть любого серотипа (например, 1, 2а, 2b, 4, 14, 15, 16 и т.д.), любого сероподтипа и любого иммунотипа (например, L1; L2; L3; L3,3,7; L10 и т.д.). Менингококки могут быть любой подходящей линией, включая гиперинвазивные и гипервирулентные линии, например любой из следующих семи гипервирулентных линий: подгруппы I; подгруппы III; подгруппы IV-1; комплекса ЕТ-5; комплекса ЕТ-37; кластера А4; линии 3.
Помимо кодирования полипептида по изобретению бактерии по изобретению могут иметь одну или более чем одну из следующих модификаций. Например, они могут иметь модифицированный ген fur [WO 98/56901]. Может быть повышена экспрессия nspA при одновременном нокауте porA и cps. Дополнительные мутанты N.meningitidis с нокаутом для получения OMV описаны, например, в WO 2004/014417. Claassen et al. (1996), 14(10):1001-8 описывает получение везикул из штаммов, модифицированных для экспрессии шести различных подтипов PorA. Можно также применять мутантные Neisseria с низкими уровнями эндотоксина, что достигается посредством нокаута ферментов, задействованных в биосинтезе LPS. В изобретении также можно применять мутантные Neisseria, модифицированные для уменьшения или выключения экспрессии по меньшей мере одного гена, задействованного в придании токсичности части LPS, представляющей собой липид А, в частности, гена lpxl1 [Fisseha et al. (2005), Infect. Immun. 73:4070-80]. Аналогично, в изобретении также можно применять мутантные Neisseria, модифицированные для уменьшения или выключения экспрессии по меньшей мере одного гена, задействованного в синтезе или экспортировании капсулярного полисахарида, в частности генов synX и/или ctrA. Все эти или другие мутанты могут применяться в изобретении.
Таким образом, штамм, применяющийся по изобретению, в некоторых воплощениях может экспрессировать более одного подтипа PorA. Ранее были сконструированы 6-валентные и 9-валентные штаммы с PorA. Штамм может экспрессировать PorA 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 подтипов: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1 и/или P1.18-1,3,6. В других воплощениях штамм может иметь пониженную экспрессию PorA, например, когда количество PorA снижено по меньшей мере на 20% (например, >30, >4%, >50, >60, >70, >80, >90, >95% и т.д.) по сравнению с уровнями у штаммов дикого типа (например, по сравнению со штаммом Н44/76) или даже произведен его нокаут.
В некоторых воплощениях штамм может сверхэкспрессировать некоторые белки (по сравнению с соответствующим штаммом дикого типа). Например, штаммы могут сверхэкспрессировать NspA, белок 287 [WO 01/52885], fHbp [WO 2006/081259] (включая fHbp по изобретению), TbpA и/или TbpB [WO 00/25811], Cu,Zn-супероксиддисмутαзу, HmbR и т.д.
Ген, кодирующий полипептид по изобретению, может быть интегрирован в бактериальную хромосому или может находиться в эписомной форме, например, в составе плазмиды.
Предпочтительно для получения везикул менингококк может быть генетически модифицирован, с таким расчетом, чтобы фазовая вариация экспрессии полипептида отсутствовала. Способы уменьшения или устранения фазовой вариации экспрессии генов у менингококка описаны в WO 2004/015099. Например, ген может быть помещен под контроль конститутивного или индуцибельного промотора, либо мотив ДНК, который отвечает за его фазовую вариацию, может быть удален или замещен.
В некоторых воплощениях штамм может включать одну или более чем одну мутацию, обеспечивающую нокаут и/или сверхэкспрессию, изложенную в документах WO 02/09746, WO 01/09350, WO 02/062378 и WO 2004/014417. Например, согласно инструкциям и номенклатуре, представленных в этих четырех документах, полезные гены для снижения экспрессии и/или нокаута, включают:
(a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB,
GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB ; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB; или (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB, SynX и/или SynC.
Когда используют мутантный штамм, в некоторых воплощениях он может иметь одну, или более чем одну, или все из следующих характеристик: (i) снижение экспрессии или нокаут LgtB и/или GalE для укорочения LOS менингококка; (ii) увеличение экспрессии TbpA; (iii) увеличение экспрессии NhhA; (iv) увеличение экспрессии Отр85; (v) увеличение экспрессии LbpA; (vi) увеличение экспрессии NspA; (vii) нокаут PorA; (viii) снижение экспрессии или нокаут FrpB; (ix) снижение экспрессии или нокаут Ора; (х) снижение экспрессии или нокаут Opc; (xii) делецию комплекса генов cps. Укороченный LOS может быть таким, который не включает метку сиалил-лакто-И-неотетраозы, например, он может представлять собой LOS с дефицитом галактозы. LOS может не иметь α цепи.
В зависимости от штамма менингококка, использованного для получения везикул, они могут включать или не включать нативный антиген fHbp штамма (WO 2004/046177).
В одном предпочтительном воплощении менингококк не экспрессирует функциональный белок MltA. Как обсуждалось в WO 2006/046143 и Adu-Bobie et al. (2004), Infect. Immun. 72:1914-19, нокаут
- 14 046480
MltA (мембраносвязанной литической трансгликозилазы, также известной как GNA33) у менингококка позволяет получить бактерии, которые спонтанно высвобождают большие количества мембранных везикул в культуральную среду, из которой их можно легко выделить. Например, везикулы можно выделить при помощи процесса двухстадийной гель-фильтрации согласно WO 2011/036562, включающего: (i) первую стадию фильтрации, на которой везикулы отделяют от бактерий на основании различий в их размере, при этом везикулы проходят в фильтрат и (ii) второй стадии фильтрации, на которой везикулы остаются в ретентате. Мутацию MltA (снижение экспрессии или нокаут) применяли в вакцинах GMMA [Koeberling et al. (2014), Vaccine, 32:2688-95], и ее можно легко комбинировать с дополнительным понижением экспрессии или нокаутом, в частности, по меньшей мере одного гена, задействованного в придании токсичности части LPS, представляющей собой липид А, в частности Ipxl1, и/или по меньшей мере одного гена, задействованного в синтезе или экспортировании капсулярного полисахарида, в частности, генов synX и/или ctrA. GMMA (обобщенные модули для мембранных антигенов) представляют собой генетически обезвреженные OMV, которые получены из штаммов менингококка, которые были генетически модифицированы для высвобождения GMMA с пониженной реактогенностью и повышенной иммуногенностью. При исследовании в тесте активации моноцитов (МАТ) GMMA индуцируют меньше провоспалительных цитокинов, чем OMV.
Предпочтительный штамм менингококка для создания GMMA вакцины с применением указанного подхода экспрессирует мутантный fHbp v2 и/или мутантный fHbp v3 по изобретению, и экспрессия может находиться под контролем сильных промоторов. Везикулы, высвобождающиеся указанным штаммом, включают мутантные белки fHbp v2 и/или v3 в иммуногенной форме, и в ответ на введение везикул могут вырабатываться бактерицидные антитела, как обсуждалось Koeberling et al. (2014), Vaccine, 32:2688-95. Штамм может также экспрессировать fHbp v1 или вместо этого fHbp v1 может быть представлен в виде отдельного рекомбинантного белка в растворимой форме (и fHbp v1 может быть последовательностью дикого типа или мутантной последовательностью, например, мутированной для нарушения его способности связываться с fH, как обсуждалось выше). В изобретении предложены такие штаммы, а также предложены везикулы, которые данные штаммы высвобождают, например, выделенные из культуральной среды после выращивания штаммов. Предпочтительный мутант v2 для экспрессии в этих штаммах имеет мутацию S32 и/или L123, как обсуждалось в данном документе, а предпочтительный мутант v3 для экспрессии в этих штаммах имеет мутацию S32 и/или L126, как обсуждалось в данном документе. Таким образом, везикулы, полученные из менингококков, экспрессирующих такие последовательности мутантных fHbp v2 и v3, являются наиболее предпочтительными иммуногенами для применения в вакцинах по изобретению.
Эффективные промоторы для применения в таких штаммах включают промоторы, описанные в WO 2013/033398 и WO 2013/113917. Например, промотор может представлять собой (а) промотор из гена порина, предпочтительно porA или porB, в частности из N.meningitidis; или (б) промотор гена rRNA (такой как ген 16S rRNA), в частности из N.meningitidis. Когда применяют промотор порина менингококка, предпочтительно он происходит из porA, и, еще более конкретно, -10 область из промотора гена porA менингококка, и/или -35 область промотора гена porA менингококка (предпочтительно, где -10 область и -35 область разделены промежуточной последовательностью из 12-20 нуклеотидов и где промежуточная последовательность либо не содержит последовательность поли-G, либо включает последовательность поли-G, имеющую не более восьми последовательных нуклеотидов G). Когда применяют промотор гена rRNA, в частности, он может содержать (i) -10 область промотора гена rRNA менингококка и/или (ii) -35 область промотора гена rRNA менингококка. Также можно применять гибрид из (а) и (б), например, чтобы он имел -10 область из промотора porA и -35 область из промотора rRNA (которая может быть консенсусной -35 областью). Таким образом, эффективный промотор может представлять собой промотор, который включает либо (i) -10 область из гена rRNA (в частности, менингококкового) и -35 область из гена porA (в частности, менингококкового) или (ii) -10 область из гена porA (в частности, менингококкового) и -35 область из гена rRNA (в частности, менингококкового).
Если в везикуле присутствует LOS, возможно обрабатывать везикулу таким образом, чтобы связать ее LOS и белковые компоненты (внутрипузырьковая конъюгация [WO 2004/014417]).
Иммуногенные композиции.
Полипептиды по изобретению могут применяться в качестве активных ингредиентов иммуногенных композиций, поэтому в седьмом аспекте изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая мутантный полипептид fHbp v1.13 согласно первому аспекту изобретения, мутантный полипептид fHbp v1.15 согласно второму аспекту изобретения, слитый полипептид согласно третьему аспекту изобретения или везикулу наружной мембраны согласно шестому аспекту изобретения. Указанные иммуногенные композиции могут найти применение в иммунизации млекопитающего, предпочтительно человека против инфекции, вызванной Neisseria meningitidis.
В предпочтительном воплощении изобретения в дополнение к полипептидным антигенам по первому, второму или третьему аспектам изобретения иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит один или более чем один антигенный компонент 44CMenB.
Как описано выше, продукт 4CMen (BEXSERO) содержит препарат OMV эпидемического штамма
- 15 046480 менингококка группы В NZ98/254, В:4:Р1.7Ь,4. Такие же OMV обнаруживаются в вакцине MeNZB и обозначаются в данном документе OMVnz. Кроме того, 44CMenB содержит пять менингококковых антигенов: NHBA (287; подвариант 1.2), fHbp (741; подвариант 1.1), NadA (961; подвариант 3.1), GNA1030 (953) и GNA2091 (936). Четыре из этих антигенов находятся в виде слитых белков (слитый белок NHBA-GNA1030 (287-953) и слитый белок GNA2091-fHbp (936-741)).
0,5 мл доза готового продукта 44CMenB составлена таким образом, что содержит 50 мкг каждого из NHBA-GNA1030, NadA и GNA2091-fHbp, адсорбированных на 1,5 мг алюминия гидроксида, служащего адъювантом, и 25 мкг OMV из штамма N. meningitidis NZ98/254. Кроме того, каждая 0,5 мл доза препарата содержит 3,125 мг хлорида натрия, 0,776 мг гистидина и 10 мг сахарозы.
В другом предпочтительном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит готовый вакцинный продукт 44CMenB, представленный на рынке под торговым наименованием BEXSERO.
В другом предпочтительном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит слитый полипептид fHbp последовательности SEQ ID NO: 19 (fHbp 23S_1.13_E211A/S216R) и готовую композицию 44CMenB.
Менингококки серогрупп А, С, W135 и Y.
Композиции по данному изобретению могут также включать антигены капсулярных сахаридов менингококков одной или более чем одной из серогрупп Y, W135, С и А, где антигены конъюгированы с белком(ами)-носителем(ями) и/или являются олигосахаридами. Капсулярные сахариды можно применять в форме олигосахаридов. Их удобно получать посредством фрагментации очищенного капсулярного полисахарида (например, посредством гидролиза), за которым обычно следует выделение фрагментов необходимого размера.
Современные вакцины серогруппы С [Costantino et al.] (1992), Vaccine, 10:691-698, Jones (2001), Curr Opin Investig Drugs, 2:47-49], MENINGITEC и NEISVAC-C) включают конъюгированные сахариды. MENJUGATE и MENINGITEC имеют олигосахаридные антигены, конъюгированные с носителем CRM197, тогда как в NEISVAC-C применяется полноразмерный полисахарид (де-О-ацетилированный), конъюгированный с носителем, представляющим собой столбнячный анатоксин.
Все из вакцинных продуктов, представленных на рынке под торговыми наименованиями MENVEO, MENACTRA и NIMENRIX, содержат конъюгированные капсулярные полисахаридные антигены каждой из серогрупп Y, W135, С и А.
В MENVEO (также известной под непатентованным наименованием как вакцина менингококковая олигосахаридная (группы А, С, Y и W-135), конъюгированная с дифтерийным CRM197) каждый из антигенов А, С, W135 и Y конъюгирован с носителем CRM197.
В MENACTRA (также известной под непатентованным наименованием как вакцина менингококковая полисахаридная (группы А, С, Y и W-135), конъюгированная с дифтерийным анатоксином) каждый из антигенов А, С, W135 и Y конъюгирован с носителем, представляющим собой дифтерийный анатоксин.
В NIMENRIX (также известной под непатентованным наименованием как вакцина конъюгированная менингококковая полисахаридная (группы А, С, Y и W-135), каждый из антигенов А, С, W135 и Y конъюгирован с носителем, представляющим собой столбнячный анатоксин.
В предпочтительном воплощении изобретения в дополнение к полипептидным антигенам по первому, второму или третьему аспектам изобретения иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит один или более чем один конъюгированный капсулярный сахаридный антиген N. meningitidis серогрупп А, С, W135 и/или Y.
В предпочтительном воплощении изобретения в дополнение к полипептидным антигенам по первому, второму или третьему аспектам изобретения иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит готовый продукт 44CMenB наряду с одним или более чем одним конъюгированным капсулярным сахаридным антигеном N. meningitidis серогрупп А, С, W135 и/или Y.
В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция по изобретению в дополнение к полипептидным антигенам по первому, второму или третьему аспектам изобретения содержит готовый продукт 44CMenB наряду с конъюгированными капсульными сахаридными антигенами N. meningitidis каждой из серогрупп А, С, W135 и/или Y, образуя пятивалентную иммуногенную композицию, содержащую антигены против каждого из серотипов менингококка А, В, С, W135 и Y.
В предпочтительных воплощениях композиция включает конъюгаты антигенов А, С, W135 и Y, которые присутствуют в MENVEO, конъюгаты антигенов А, С, W135 и Y, которые присутствуют в MENACTRA, или конъюгаты антигенов А, С, W135 и Y, которые присутствуют в NIMENRIX.
В другом предпочтительном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит слитый полипептид fHbp последовательности SEQ ID NO: 19 (fHbp 23S_1.13_E211A/S216R), готовый продукт 44CMenB и конъюгаты антигенов А, С, W135 и Y, которые присутствуют в MENVEO.
В альтернативном варианте, иммуногенную композицию по изобретению, содержащую полипептидные антигены по первому, второму или третьему аспектам изобретения, можно вводить совместно с одним или более чем одним из BEXSERO и MENVEO, MENACTRA или NIMENRIX. Предпочтительно
- 16 046480 иммуногенную композицию по изобретению вводят совместно с BEXSERO и MENVEO.
Используемый термин вводят совместно означает, что различные иммуногенные композиции/вакцины можно вводить либо раздельно, либо в виде комбинации.
Когда вакцины вводят раздельно, их обычно вводят в различные участки, например, одну вакцину в левое предплечье, а вторую вакцину в правое предплечье. Таким образом, две вакцины можно вводить контралатерально (например, в оба предплечья, или обе ноги, или в руку и ногу, расположенные по разные стороны) или ипсилатерально (например, в руку и ногу, расположенные по одну сторону). Хотя вакцины можно вводить раздельно, их вводят по существу в одно и то же время (например, во время той же врачебной консультации или визита к специалисту-медику или в центр вакцинации), например в течение 1 ч.
Однако, скорее выполняют введение в виде комбинации, нежели совместную иммунизацию с раздельным введением. Таким образом, при совместной иммунизации можно применять комбинированную вакцину, т.е. единую композицию, в которой смешаны различные иммуногены. Преимуществом комбинированных вакцин является выполнение меньшего количества инъекций субъекту, что может повысить комплаентность, что является преимуществом в клинической практике.
Применение иммуногенных композиций по изобретению
Иммуногенные композиции по изобретению подходят для применения в медицине, и в частности, могут применяться для иммунизации млекопитающего против инфекции и/или заболевания, вызванного Neisseria meningitidis, так что у реципиентов иммуногенной композиции вырабатывается иммунный ответ, который обеспечивает защиту от инфекции и/или от заболевания, вызванного бактериями Neisseria meningitidis.
В предпочтительном воплощении иммуногенные композиции по изобретению могут найти применение для иммунизации млекопитающего против инфекции или заболевания, вызванного менингококком В. Однако, в воплощениях изобретения, где антигены менингококка серогруппы В комбинируют с антигенами менингококка других серогрупп (например, антигенами А. С, W и/или Y), иммуногенные композиции могут найти применение для иммунизации млекопитающего против инфекции или заболевания, вызванного менингококком А, В, С, W и/или Y.
Таким образом, иммуногенные композиции по изобретению могут найти применение в способах профилактики для иммунизации субъектов от инфекции и/или заболевания, вызванного Neisseria meningitidis. Иммуногенные композиции также можно применять в способах лечения (т.е. для лечения инфекции, вызванной Neisseria meningitidis).
В изобретении также предложен способ выработки у млекопитающего иммунного ответа in vivo против инфекции, вызванной Neisseria meningitidis, включающий введение млекопитающему иммуногенной композиции по изобретению. В изобретении также предложены полипептиды по изобретению для применения в указанных способах.
Иммунный ответ предпочтительно является защитным и предпочтительно включает антитела и/или клеточно-опосредованный иммунитет. Предпочтительно иммунный ответ представляет собой ответ с выработкой бактерицидных антител. Способ может вызывать бустерный ответ. При выработке иммунного ответа in vivo млекопитающее может быть защищено против заболевания, вызванного нейссерией (в частности, менингококковой инфекции).
В изобретении также предложен способ защиты млекопитающего от нейссериальной (например, менингококковой) инфекции, включающий введение млекопитающему иммуногенной композиции по изобретению.
В изобретении предложены полипептиды по изобретению для применения в качестве лекарственных средств (например, в качестве иммуногенных композиций или вакцин) или в качестве реагентов для диагностики. В изобретении также предложено применение нуклеиновых кислот или полипептидов для изготовления лекарственного средства для предупреждения нейссериальной (например, менингококковой) инфекции у млекопитающего.
Иммунологические композиции по изобретению предпочтительно составлены как вакцинные продукты, которые подходят для терапевтического (т.е. для лечения инфекции) или профилактического (т.е. для предупреждения инфекции) применения. Как правило, вакцины являются профилактическими.
Предпочтительно млекопитающее является человеком. Человек может быть взрослым, подростком или ребенком (например, ребенком ясельного или грудного возраста). Вакцину, предназначенную для детей, также можно вводить взрослым, например, для оценки безопасности, дозировки, иммуногенности и т.д.
Применения и способы особенно эффективны для предупреждения/лечения заболеваний, включающих менингит (в частности, бактериальный, например, менингококковый менингит) и бактериемию, но не ограничивающихся ими. Например, они подходят для активной иммунизации индивидуумов против инвазивной менингококковой инфекции, вызванной N. meningitidis (например, серогруппы В).
Защиту от N. meningitidis можно оценивать эпидемиологически, например, в клиническом исследовании, однако удобно использовать непрямые методы для подтверждения того, что иммуногенная композиция вызывает у реципиентов ответ с выработкой бактерицидных сывороточных антител (SBA). При
- 17 046480 исследовании SBA сыворотку реципиентов композиции инкубируют с бактериями-мишенями (в данном изобретении, N. meningitidis) в присутствии комплемента (предпочтительно человеческого комплемента, хотя вместо него часто используют кроличий комплемент) и оценивают цитолиз бактерий при различных разведениях сыворотки для определения активности SBA. Результаты исследования SBA, можно подкрепить, выполнив конкурентный тест SBA для дополнительного косвенного подтверждения иммуногенной активности антигена(ов), представляющего(их) интерес. В конкурентном тесте SBA сыворотку реципиентов иммуногенной композиции, содержащей антиген(ы), предварительно инкубируют с указанным(и) антигеном(ами) и затем инкубируют с бактериями-мишенями в присутствии человеческого комплемента. Затем оценивают цитолиз бактерий, который будет снижаться или отсутствовать, если в ходе фазы предварительной инкубации бактерицидные антитела в сыворотке реципиента связываются с антигенами, представляющими интерес, и, таким образом, становятся недоступными для связывания с поверхностным антигеном бактерий.
Композиция не обязательно должна защищать от каждого штамма N. meningitidis, или не обязательно должен быть защищен каждый реципиент композиции. Такая универсальная защита не является общепринятым стандартом в данной области техники. Скорее, обычно оценивают защиту против панели референтных лабораторных штаммов, зачастую выбираемых отдельно для каждой страны и, возможно, варьирующих с течением времени, и исследуют в популяции реципиентов.
Предпочтительные композиции по изобретению могут обеспечивать у пациента титр антител, который является превосходящим по показателю серопротекции в отношении каждого антигенного компонента у приемлемого процента людей. Антигены и связанные с ними титры антител, при превышении которых считают, что у хозяина произошла сероконверсия против патогена, хорошо известны, и такие титры опубликованы такими организациями, как ВОЗ. Предпочтительно более 80% статистически значимой выборки субъектов являются сероконвертированными более предпочтительно более 90%, еще более предпочтительно более 93% и наиболее предпочтительно 96-100%.
Иммуногенные композиции содержат иммунологически эффективное количество иммуногена, а при необходимости, и любого другого из иных указанных компонентов.
Под иммунологически эффективным количеством понимают, что введение данного количества индивидууму в виде однократной дозы или как составляющей части серии введении, эффективно для лечения или предупреждения.
Термин предупреждение означает, что прогрессирование заболевания замедляется и/или прекращается, или что заболевание не начинается. Например, иммунная система субъекта может быть примирована (например, посредством вакцинации) для запуска иммунного ответа и противостояния инфекции, таким образом, что заболевание не начинается. Таким образом, вакцинированный субъект может быть инфицирован, но способен лучше противостоять инфекции, чем контрольный субъект. Данное количество варьирует в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, от возраста, таксономической группы индивидуума, подлежащего лечению (например, примата, не являющегося человеком, и т.д.), от способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, от желаемой степени защиты, от состава вакцины, от оценки медицинской ситуации лечащим врачом и других значимых факторов. Предполагается, что количество будет находиться в относительно широком диапазоне, который можно установить с помощью рутинных исследований. Композицию можно вводить в сочетании с другими иммунорегулирующими агентами.
Эффективность вакцины.
Иммуногенные композиции для применения по данному изобретению предпочтительно обеспечивают эффективность вакцин против по меньшей мере одного штамма N. meningitidis по меньшей мере 10%, например, >20, >30, >40, >50, >60, >70, >80, >85, >90% или более.
Эффективность вакцин определяют по снижению относительного риска развития менингококкового заболевания у субъектов, которые получают композицию по изобретению, по сравнению с субъектами, которые не получают такую композицию (например, не являются иммунизированными или получают плацебо или отрицательный контроль). Таким образом, число случаев заболеваний, вызванных менингококком, в популяции, иммунизированной по изобретению, сравнивают с числом случаев заболевания в контрольной популяции, которая не была иммунизирована по изобретению, и получают относительный риск, а эффективность вакцины равна 100% минус данное число.
Эффективность вакцин определяют скорее для популяции, чем для индивидуума. Следовательно, это является полезным эпидемиологическим показателем, но не позволяет предсказать индивидуальную защиту. Например, отдельный субъект может подвергнуться воздействию очень большой дозы инфекционного агента или может иметь другие факторы риска, которые делают его более подверженным инфекции, но это не отразится на надежности или практической ценности меры эффективности. Размер популяции, которую иммунизируют по изобретению и в которой определяют эффективность вакцины, в идеальном варианте составляет по меньшей мере 100 и может быть больше, например, по меньшей мере 500 субъектов. Размер контрольной группы также должен быть по меньшей мере 100, например, по меньшей мере 500.
- 18 046480
Введение.
Композиции по изобретению, как правило, вводят непосредственно пациенту. Непосредственное введение может осуществляться путем парентеральной инъекции (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, в интерстициальное пространство ткани) или посредством ректального, перорального, вагинального, поверхностного, трансдермального, интраназального, глазного, ушного, легочного введения или иного нанесения на слизистую оболочку. Предпочтительно внутримышечное введение в бедро или предплечье. Инъекцию можно осуществлять при помощи иглы (например, иглы для подкожного введения), однако в альтернативном варианте можно осуществлять безыгольную инъекцию. Типичная внутримышечная доза составляет приблизительно 0,5 мл.
Нейссериальные инфекции поражают различные участки организма, поэтому композиции по изобретению можно изготавливать в различных формах. Например, композиции можно изготавливать в виде инъекционных препаратов, как виде жидких растворов, так и в виде суспензий. Также можно изготавливать твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Можно изготавливать композиции для поверхностного нанесения, например, в виде мази, крема или порошка. Можно изготавливать композиции для перорального введения, например, в виде таблеток или капсул, или в виде сиропа (возможно, ароматизированного). Можно изготавливать композиции для введения в легкие, например, в виде ингаляции, с использованием тонкодисперсного порошка или спрея. Можно изготавливать композиции в виде суппозитория или пессария. Можно изготавливать композиции для назального, ушного или глазного введения, например, в виде капель. Наиболее предпочтительны композиции, подходящие для парентеральной инъекции.
Изобретение можно применять для индукции системного и/или мукозного иммунитета.
В данном описании доза композиции представляет собой объем композиции, подходящий для введения субъекту посредством однократной иммунизации. Человеческие вакцины обычно вводят в объеме дозы приблизительно 0,5 мл, хотя можно вводить и дробные дозы (например, детям). Объем дозы может дополнительно варьировать в зависимости от концентрации антигенов в составе композиции.
Кроме того, композиция может быть представлена в виде многодозового набора, т.е. в одном контейнере содержится количество композиции, достаточное для нескольких иммунизаций. Многодозовые варианты могут включать консервант или многодозовый контейнер может иметь асептическое приспособление для отбора отдельных доз композиции.
Введение может включать схему с однократным введением дозы, но обычно будет включать схему с многократными введениями доз. Предпочтительна схема по меньшей мере с тремя введениями доз. Подходящие интервалы между примирующими дозами можно определять рутинными способами, например, составлять от 4 до 16 недель, например, 1 месяц или два месяца. Например, BEXSERO можно вводить в возрасте 2, 4 и 6 месяцев или 2, 3 и 4 месяцев, с возможным четвертым введением дозы в возрасте 12 месяцев.
Субъект, которого иммунизируют, является человеком, который может иметь любой возраст, например, 0-12 месяцев, 1-5 лет, 5-18 лет, 18-55 лет или свыше 55 лет. Предпочтительно субъект, которого иммунизируют, является подростком (например, в возрасте 12-18 лет) или взрослым (18 лет или старше).
Возможно, субъект является подростком или взрослым, в детстве иммунизированным против N. meningitidis (например, в возрасте до 12 лет) и получающим бустерную дозу иммуногенной композиции по изобретению.
Когда изобретение относится к совместной иммунизации, различные иммуногенные композиции/вакцины можно вводить либо по-отдельности, либо в виде комбинации.
Когда вакцины вводят раздельно, их обычно вводят в различные участки, например, одну вакцину в левое предплечье, а вторую вакцину в правое предплечье.
Таким образом, две вакцины можно вводить контралатерально (например, в оба предплечья, или обе ноги, или в руку и ногу, расположенные по разные стороны) или ипсилатерально (например, в руку и ногу, расположенные по одну сторону). Хотя вакцины можно вводить раздельно, их вводят по существу в одно и то же время (например, во время той же врачебной консультации или визита к специалистумедику или в центр вакцинации), например в течение 1 ч.
Однако скорее выполняют введение в виде комбинации, нежели совместную иммунизацию с раздельным введением. Таким образом, при совместной иммунизации можно применять комбинированную вакцину, т.е. единую композицию, в которой смешаны различные иммуногены. Преимуществом комбинированных вакцин является выполнение меньшего количества инъекций субъекту, что может повысить комплаентность, что является преимуществом в клинической практике.
Компоненты, не являющиеся антигенными.
Иммуногенная композиция по изобретению, как правило, будет включать фармацевтически приемлемый носитель, который может представлять собой любое вещество, которое само не вызывает выработку антител, вредных для пациента, получающего композицию, и которое при введении не демонстрирует неспецифической токсичности. Фармацевтически приемлемые носители могут включать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. В таких несущих средах также могут при
- 19 046480 сутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие вещества, буферизующие вещества для поддержания pH и т.п. Подходящие носители подробно обсуждаются в документе Gennaro (2000), Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20- изд., ISBN: 0683306472.
Предпочтительно композиция является стерильной. Предпочтительно она является апирогенной. Предпочтительно она забуферена, например, имеет pH от 6 до 8, как правило, приблизительно pH 7. Когда композиция содержит соль гидроксида алюминия, предпочтительно использовать гистидиновый буфер [WO 03/009869]. Композиции по изобретению могут быть изотоническими для человека.
Адъюванты, которые можно применять в композициях по изобретению, включают нерастворимые соли металлов, эмульсии масло-в-воде (например, MF59 или AS03, обе содержат сквален), сапонины, нетоксичные производные LPS (такие как монофосфорил липид А или 3-О-деацетилированный монофосфорил липид), иммуностимулирующие олигонуклеотиды, обезвреженные бактериальные АДФ-рибозилирующие токсины, липосомы, имидазохинолоны или их смеси, но не ограничиваются перечисленным. Другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты, описаны в главе 7 документа Vaccine Design. (1995), под ред. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.
Особенно предпочтительно применение адъювантов алюминия гидроксида и/или алюминия фосфата, и, как правило, полипептиды адсорбируют на эти соли. Указанные соли включают оксигидроксиды и гидроксифосфаты (например, см. главы 8 и 9 документа Vaccine Design. (1995), под ред. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum). Соли могут принимать любую подходящую форму (например, гелевую, кристаллическую, аморфную и т.д.).
Дополнительные антигенные компоненты.
Иммуногенные композиции по изобретению могут включать антигены для иммунизации против других заболеваний или инфекций. Например, композиция может включать один или более чем один из следующих антигенов:
сахаридный антиген из Streptococcus pneumoniae [например, Watson (2000), Pediatr. Infect. Dis. J. 19:331-332, Rubin (2000), Pediatr. Clin. North Am. 47:269-285 и Jedrzejas (2001), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65:187-207];
антиген вируса гепатита А, такой как инактивированный вирус [например, Bell (2000), Pediatr. Infect. Dis J 19:1187-1188, Iwarson (1995) APMIS 103:321-326];
антиген вируса гепатита В, такой как поверхностные и/или коровые антигены [например, Gerlich et al. (1990), Vaccine, 8 Suppl: S3-68 & 79-80];
дифтерийный антиген, такой как дифтерийный анатоксин [например, глава 3 документа Vaccines (1988), под ред. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0] e.g. the CRM197 mutant [e.g. Del Guidice et al. (1998), Molecular Aspects of Medicine, 19:1-70];
столбнячный антиген, такой как столбнячный анатоксин (например, глава 4 документа Vaccines (1988), под ред. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0);
антиген Bordetella pertussis, такой как голотоксин возбудителя коклюша (РТ) и филаментный гемагглютинин (FHA) В. pertussis, возможно также в комбинации с пертактином и/или агглютиногенами 2 и 3 (например, Gustafsson et al. (1996), N. Engl. J. Med. 334:349-355, и Rappuoli et al. (1991), TIBTECH. 9:232-238);
сахаридный антиген из Haemophilus influenzae В [например, Costantino et al. (1999) Vaccine 17:12511263];
антигены возбудителя полиомиелита [например, Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308 и Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126], такие как инактивированный вирус полиомиелита;
антигены возбудителей кори, свинки и/или краснухи (например, главы 9, 10 и 11 документа Vaccines (1988) под ред. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0);
антигены возбудителя гриппа (например, глава 19 документа Vaccines (1988), под ред. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0), такие как поверхностные белки гемагглютинин и/или нейраминидаза;
антиген Moraxella catarnrnhalis [например, McMichael (2000), Vaccine 19 Suppl 1: S101-107];
белковый антиген из Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В) [например, Schuchat (1999), Lancet, 353 (9146):51-6, WO02/34771];
сахаридный антиген из Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В);
антиген Streptococcus pyogenes (стрептококка группы А) [например, WO 02/34771, Dale (1999), Infect. Dis. Clin. North Am. 13:227-43, Ferretti et al. (2001), PNAS USA, 98: 4658-4663];
антиген Staphylococcus aureus [например, Kuroda et al. (2001), Lancet, 357(9264):1225-1240; см. также с. 1218-1219].
При необходимости можно осуществить детоксикацию токсичных белковых антигенов (например, обезвреживание токсина возбудителя коклюша химическими и/или генетическими способами [Rappuoli et al. (1991), TIBTECH, 9:232-238]).
Когда композиция включает дифтерийный антиген, предпочтительно также включение столбнячного антигена и коклюшного антигена. Аналогично, когда включен столбнячный антиген, предпочтительно также включение дифтерийного и коклюшного антигенов. Аналогично, когда включен коклюшный анти
- 20 046480 ген, предпочтительно также включение дифтерийного и столбнячного антигенов. Таким образом, предпочтительны комбинации дифтерийного, столбнячного и коклюшного антигенов.
Сахаридные антигены предпочтительно находятся в форме конъюгатов. В целом, конъюгирование усиливает иммуногенность сахаридов, поскольку превращает их из Т-независимых антигенов в Т-зависимые антигены, таким образом делая возможным примирование для иммунологической памяти. Конъюгация особенно эффективна для вакцин, используемых в педиатрии, и является хорошо известной методикой.
Типичные белки-носители представляют собой бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсины или анатоксины или их мутантные формы. Мутант дифтерийного токсина CRM197 [Research Disclosure, 453077 (Jan 2002)] эффективен и является носителем в вакцине против Streptococcus pneumoniae, продающейся под торговым наименованием PREVNAR. Другие подходящие белки-носители включают белковый комплекс наружной мембраны N. meningitidis [ЕР-А-0372501], синтетические пептиды [ЕР-А-0378881, ЕР-А-0427347], белки теплового шока [WO 93/17712, WO 94/03208], белки вируса коклюша [WO 98/58668, ЕР-А-0471177], цитокины [WO 91/01146], лимфокины [WO 91/01146], гормоны [WO 91/01146], факторы роста [WO 91/01146], искусственные белки, содержащие множественные человеческие CD4+ Т-клеточные эпитопы различных антигенов патогенного происхождения [Falugi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:3816-3824], такие как N19 [Baraldo et al. (2004), Infect. Immun. 72(8):4884-7], белок D из H.influenzae [EP-A-0594610, Ruan et al. (1990), J. Immunol. 145:33793384], пневмолизин [Kuo et al. (1995), Infect. Immun. 63:2706-13] или его нетоксичные производные [Michon et al. (1998), Vaccine. 16:1732-41], поверхностный белок PspA пневмококка [WO 02/091998], белки, захватывающие железо [WO 01/72337], токсин А или В из C.difficile [WO 00/61761], рекомбинантный экзобелок А из P.aeruginosa (rEPA) [WO 00/33882] и т.д.
Можно применять любую подходящую реакцию конъюгации, при необходимости, с любым подходящим линкером.
Перед конъюгацией обычно осуществляют активацию или функционализацию сахарида. Активация может включать, например, цианилирующие реагенты, такие как CDAP (например, 1-циано-4диметиламинопиридинтетрафторборат [Lees et al. (1996), Vaccine, 14:190-198, WO 95/08348]). В других подходящих способах используют карбодиимиды, гидразиды, активные эфиры, норборан, рнитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU и т.д.
Присоединение через линкерную группу можно осуществлять, используя любой известный способ, например, способы, описанные в US 4882317 и US 4695624. Другие типы присоединений включают восстановительное аминирование полисахарида, присоединение образованной аминогруппы к одному концу адипиновой кислоты, являющейся линкерной группой, а затем присоединение белка к другому концу адипиновой кислоты, являющейся линкерной группой [Porro et al. (1985), Mol. Immunol. 22:907-919, EP 0208375]. Другие линкеры включают B-пропионамидо [WO 00/10599], нитрофенил-этиламин [Gever et al. Med. Microbiol. Immunol, 165:171-288 (1979)], галогенацилгалиды [US 4057685], гликозидные связи [US 4673574; US 4761283; US 4808700], 6-аминокапроновую кислоту [US 4459286], ADH [US 4965338], C4-C12 группировки [US 4663160] и т.д. Альтернативой применению линкера является непосредственное связывание. Непосредственное связывание с белком может включать окисление полисахарида с последующим восстановительным аминированием, как описано, например, в US 4761283 и US 4356170.
Предпочтительным является процесс, включающий введение аминогрупп в сахарид (например, посредством замещения концевых =O групп на -NH2) с последующей дериватизацией адипиновым диэфиром (например, N-гидроксисукцинимидным диэфиром адипиновой кислоты) и реакцией с белкомносителем. В другой предпочтительной реакции применяют активацию CDAP с использованием носителя белка D, например, для MenA или MenC.
Каждый антиген в композиции обычно находится в концентрации по меньшей мере 1 мкг/мл. В целом, концентрация любого заданного антигена будет достаточна для индукции иммунного ответа против данного антигена.
Иммуногенные композиции по изобретению могут применяться терапевтически (т.е. лечить существующую инфекцию) или профилактически (т.е. предупреждать инфекцию в будущем).
В качестве альтернативы использованию белковых антигенов в иммуногенных композициях по изобретению можно использовать нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген (которая может представлять собой РНК, такую как самореплицирующаяся РНК, или ДНК, такую как плазмида).
Общая информация.
Термин содержащий охватывает термины включающий и состоящий из, например композиция, содержащая X, может состоять исключительно из X или может включать нечто дополнительное, например X+Y. Упоминание содержащий (или содержит и т.д.) можно заменить упоминанием состоящий из (или состоит из и т.д.). Термин по существу состоящий из ограничивает объем заявленного конкретными материалами или стадиями и теми, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые характеристики по изобретению.
Применительно к цифровому значению x возможно использование термина приблизительно, который означает, например, x+10%.
- 21 046480
Термин по существу не исключает значения полностью, например композиция, которая по существу свободна от Y, может быть полностью свободна от Y. Термином по существу можно пренебречь в определении изобретения, где это необходимо.
Когда изобретение касается эпитопа, данный эпитоп может представлять собой В-клеточный эпитоп и/или Т-клеточный эпитоп, но обычно является В-клеточным эпитопом. Такие эпитопы можно обнаружить экспериментальным путем (например, с применением PEPSCAN (см., например, Geysen et al. (1984), PNAS USA, 81:3998-4002 и Carter (1994), Methods Mol. Biol. 36:207-23) или аналогичных способов) или их можно предсказать (например, с помощью антигенного индекса Jameson-Wolf (Jameson, B.A. et al. 1988, CABIOS, 4(1):181-186), подходов на основе матриц (Raddrizzani & Hammer (2000), Brief Bioinform. 1(2):179-89), MAPITOPE (Bublil et al. (2007), Proteins, 68(1):294-304), TEPITOPE (De Lalla et al. (1999), J. Immunol. 163:1725-29 и Kwok et al. (2001), Trends Immunol. 22:583-88), нейронных сетей (Brusic et al. (1998), Bioinformatics, 14(2):121-30), OptiMer & EpiMer (Meister et al. (1995), Vaccine, 13(6):581-91 и Roberts et al. (1996), AIDS Res. Hum. Retroviruses, 12(7):593-610), ADEPT (Maksyutov & Zagrebelnaya (1993), Comput. Appl. Biosci. 9(3):291-7), Т-сайтов (Feller & de la Cruz (1991), Nature, 349(6311):720-1), гидрофильности (Норр (1993), Peptide Research, 6:183-190) или антигенного индекса (Welling et al. (1985), FEBS Lett. 188:215-218)). Эпитопы являются частью антигена, которые распознаются и связываются с антигенсвязывающими сайтами антител или Т-клеточных рецепторов, и также могут обозначаться антигенными детерминантами.
В данном описании упоминание процента идентичности последовательностей между искомой аминокислотной последовательностью и найденной схожей аминокислотной последовательностью понимают как обозначающие значение идентичности, которое рассчитывают с применением подходящего алгоритма или программного обеспечения для выполнения попарного выравнивания последовательностей, известных в области техники.
Искомая аминокислотная последовательность может быть описана аминокислотной последовательностью, охарактеризованной в одном или нескольких пунктах приведенной формулы изобретения. Искомая последовательность может быть на 100% идентична найденной схожей последовательности или она может включать некоторое целое число аминокислотных замен (например, точечных мутаций, замен, делеций, вставок и т.д.) по сравнению с найденной схожей аминокислотной последовательностью, так что % идентичности будет менее 100%. Например, искомая последовательность может быть по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична найденной схожей последовательности.
Предпочтительные инструменты выравнивания, используемые для выравнивания и расчета процента (%) идентичности последовательностей, представляют собой инструменты локального выравнивания, такие как алгоритмы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, основной инструмент поиска локального выравнивания). Программы для осуществления анализа BLAST предоставляются в открытый доступ Национальным центром биотехнологической информации (www.ncbi.nlm.nih.gov). Выравнивание можно осуществлять с помощью алгоритма поиска гомологии Смита-Ватермана, с использованием поиска аффинных гэпов со штрафом за открытие гэпа 12, штрафом за продолжение гэпа 2, и матрицы BLOSUM, 62. Алгоритм поиска гомологии Смита-Ватермана описан Smith & Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2:482-489. Другими предпочтительными инструментами выравнивания являются Water (EMBOSS) и Marcher (EMBOSS). В альтернативном варианте, предпочтительные инструменты выравнивания, используемые для выравнивания и расчета процента (%) идентичности последовательностей, представляют собой инструменты выравнивания, обеспечивающие наилучшее соответствие, такие как GENEPAST, также известный как алгоритм KERR.
Для расчета процента идентичности можно сравнить искомую и найденную схожую последовательность и выровнять с максимальным соответствием в обозначенной области (например, области длиной по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 60, 65 или более аминокислот и, которая может доходить до всей длины найденной схожей аминокислотной последовательности). Указанная обозначенная область должна включать область искомой последовательности, содержащую любую конкретную точечную мутацию аминокислотной последовательности. В альтернативном варианте, процент идентичности последовательностей можно рассчитывать по всей длине искомой последовательности. Любые N-концевые или С-концевые аминокислотные участки, которые могут присутствовать в искомой последовательности, такие как сигнальные пептиды или лидерный пептид или С-концевые или N-концевые метки, следует исключать из выравнивания.
Термин фрагмент применительно к полипептидной последовательности означает, что полипептид представляет собой отрезок полноразмерного белка. В данном описании фрагмент мутантного полипептида также содержит мутацию(и). Фрагменты могут обладать качественной биологической активностью наряду с полноразмерным белком, например иммуногенный фрагмент содержит или кодирует один или более чем один эпитоп, такие как иммунодоминантные эпитопы, что обеспечивает выработку такого же или сопоставимого иммунного ответа на фрагмент, как и на полноразмерную последовательность. Фрагменты полипептидов обычно имеют делецию амино- (N-) концевой части и/или карбокси- (С-) концевой части по сравнению с нативным белком, но оставшаяся часть аминокислотной последовательности фрагмента идентична аминокислотной последовательности нативного белка. Фрагменты полипептидов
- 22 046480 могут содержать, например: приблизительно 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262 следующих друг за другом аминокислот референтной полипептидной последовательности, включая все промежуточные целые значения, например от 50 до 260, от 50 до 255, от 50 до 250, от 50 до 200, от 50 до 150 следующих друг за другом аминокислот референтной полипептидной последовательности. Термин фрагмент полностью исключает полноразмерные полипептиды fHbp и его зрелые липопротеины.
В классификации менингококков после серогруппы указывают серотип, сероподтип и затем иммунотип, и в стандартной номенклатуре перечисляются серогруппа, серотип, сероподтип и иммунотип, разделенные двоеточием, например B:4:P1.15:L3,7,9. Внутри серогруппы В некоторые линии вызывают заболевание часто (гиперинвазивные), некоторые линии вызывают более тяжелые формы заболевания по сравнению с другими (гипервирулентные), а другие и вовсе вызывают заболевание редко. Общепризнано семь гипервирулентных линий, а именно подгруппы I, III и IV-1, комплекс ЕТ-5, комплекс ЕТ-37, кластер А4 и линия 3. Их охарактеризовали при помощи мультилокусного электрофореза ферментов (MLEE), однако для классификации менингококков также применяли мультилокусное типирование последовательности (MLST). Четыре основных гипервирулентных кластера - это комплексы ST32, ST44, ST8 и ST11.
Упоминание увеличенной стабильности, или более высокой стабильности, или повышенной стабильности в данном документе означает, что мутантные полипептиды, изложенные в данном документе, обладают более высокой термостабильностью (в ккал/моль) по сравнению с немутированным полипептидом (дикого типа) в таких же условиях эксперимента. Увеличение стабильности можно оценивать при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), например, как обсуждается в документах Bruylants et al. (Differential Scanning Calorimetry in Life Sciences: Thermodynamics, Stability, Molecular Recognition and Application in Drug Design, 2005, Curr. Med. Chem. 12:2011-2020) и Calorimetry Sciences Corporation's Characterizing Protein stability by DSC (Life Sciences Application Note, Doc. No. 20211021306, February 2006) или при помощи дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF). Повышение стабильности можно охарактеризовать как повышение температуры фазового перехода (Tm) по меньшей мере на 5°С при оценке методом DSC или DSF. См., например, Thomas et al., Effect of single-point mutations on the stability and immunogenicity of a recombinant ricin A chain subunit vaccine antigen, 2013 Hum. Vaccin. Immunother. 9(4):744-752.
Следует понимать, что описание изобретения приведено выше исключительно для примера и возможны любые модификации, при условии, что они остаются в границах и в духе изобретения.
Последовательности
SEQ ID NO: 1 [vl.13 зрелый полипептид из штамма М982]
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTY GNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQD SEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAK QGHGKIEHLKSPELNVELATAYIKPDEKRHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGGQAQEV AGSAEVETANGIHHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 2 [vL13 AG]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKM VAI<RQFRIGDIAGEHTSFDI<LPI<GGSATYRGTAFGSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IE
- 23 046480
HLKSPELNVELATAYIKPDEKRHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVE TANGIHHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 3 [vl.13 AG (E211A/E232A)]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKM VAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIE HLKSPELNVELATAYIKPDEKRHAVISGSVLYNQDAKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAAVE TANGIHHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 4 [vl.13 AG (E211A/S216R)]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKM VAI<RQFRIGDIAGEHTSFDI<LPI<GGSATYRGTAFGSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IE HLKSPELNVELATAYIKPDEKRHAVISGSVLYNQDAKGSYRLGIFGGQAQEVAGSAEVE TANGIHHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 5 [vl.15 зрелый полипептид из штамма NM452]
CSSGGGGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAE RTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQT EQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYT IDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGG QAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 6 [vl.15 AG]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSL NTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKM VAI<RQFRIGDIVGEHTSFGI<LPI<DVMATYRGTAFGSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IE HLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVE TANGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 7 [vl.15 AG (S219R)]
- 24 046480
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSL NTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKM VAKRQFRIGDIVGEHTSFGKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIE HLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISGSVLYNQAEKGSYRLGIFGGQAQEVAGSAEVE TANGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 8 [vl.15 AG (E214A/S219R)]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSL NTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKM VAKRQFRIGDIVGEHTSFGKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIE HLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISGSVLYNQAAKGSYRLGIFGGQAQEVAGSAEV ETANGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 9 [vl.15 AG (E214A/E235A)]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSL NTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKM VAKRQFRIGDIVGEHTSFGKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIE HLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISGSVLYNQAAKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAAVE TANGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 10 [v2 дикий тип из штамма 2996]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSV RKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIY I<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHGI<AFSSD DAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IEHLI<TPEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI< GTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
SEQ ID NO: 11 [v2 зрелый полипептид]
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYG NGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPD I<IDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHGI<AFSSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGH
- 25 046480
GKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGS ATVKIGEKVHEIGIAGKQ
SEQ ID NO: 12 [v2 AG]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNT GI<LI<NDI<VSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYI<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSLINQ RSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHGI<AFSSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IEHLI<T PEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEK VHEIGIAGKQ
SEQ ID NO: 13 [v3 дикий тип из штамма М1239]
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLT LEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLA SGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYH GKAF S SDDPNGRLHY S IDFTI<I<QGYGRIEHLI<TLEQN VELA A AELK A DEK SHA VILGDT RYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGS ATVKIGEKVHEIGIAGKQ
SEQ ID NO: 14 [v3 зрелый]
CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAE KTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQI EI<INNPDI<TDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGI<AEYHGI<AFSSDDPNGRLHYSIDF TKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDR AQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
SEQ ID NO: 15 [v3 AG]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSL NTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLI NQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHL KTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKQ
SEQ ID NO: 16 [v2 AG S32V/L123R]
- 26 046480
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKroSLIN QRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHGI<AFSSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IEHL KTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKQ
SEQ ID NO: 17 [v3 AG S32V/L126R]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSL NTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLI NQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHL KTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKQ
SEQ ID NO: 18 [(23S_1.13 E211A/E232A)]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGI<LI<NDI<VSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYI<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSLIN QRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHGI<AFSSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IEHL KTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPONGTLTL SAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHS AVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNG RLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYH LALFGDRAOEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHK DKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKL PKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAYIKPDEK RHAVISGSVLYNQDAKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAAVETANGIHHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 19 [23S_1.13 E211A/S216R]
- 27 046480
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKroSLIN QRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHGI<AFSSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IEHL KTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKOGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPONGTLTL SAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHS AVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNG RLHYSIDFTI<I<QGYGRIEHLI<TLEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI<GTYH LALFGDRAOEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKOGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHK DKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKL PKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAYIKPDEK RHAVISGSVLYNQDAKGSYRLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 20 [23S_1.15 S219R]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGI<LI<NDI<VSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYI<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSLIN QRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGI<AEYHGI<AFSSDDAGGI<LTYTIDFAAI<QGHGI<IEHL KTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKOGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPONGTLTL SAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHS AVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNG RLHYSIDFTI<I<QGYGRIEHLI<TLEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI<GTYH LALFGDRAOEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKOGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHK DKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEV DGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGK LPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPD EKHHAVISGSVLYNQAEKGSYRLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 21 [23S_1.15 E214A/S219R]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGI<LI<NDI<VSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYI<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSLIN
- 28 046480
QRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHL KTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTL SAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHS AVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNG RLHYSIDFTI<I<QGYGRIEHLI<TLEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI<GTYH LALFGDRAOEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHK DKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEV DGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGK LPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPD EKHHAVISGSVLYNQAAKGSYRLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 22 [23S_1.15 E214A/E235A]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGI<LI<NDI<VSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYI<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSLIN QRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAF S SDD AGGKLTYTIDF AAKQGHGKIEHL KTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIG EKVHEIGIAGKOGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPONGTLTL SAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHS AVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNG RLHYSIDFTI<I<QGYGRIEHLI<TLEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI<GTYH LALFGDRAOEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHK DKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEV DGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGK LPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPD EKHHAVISGSVLYNQAAKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAAVETANGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 23 [vl.l AG + His метка]
VAADIGAGL AD ALT APLDHKDKGLQ SLTLDQ S VRKNEKLKL AAQGAEKT YGNGD SLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMV AKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEH LKSPELGLAAKQLNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVA
- 29 046480
GSAEVKTVNGIRHLEHHHHHH
SEQ ID NO: 24 [vl.13 AG + His метка]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKM VAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIE HLKSPELNVELATAYIKPDEKRHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVE TANGIHHIGLAAKQLEHHHHHH
SEQ ID NO: 25 [vl.13 AG (E211A)]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKM VAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIE HLKSPELNVELATAYIKPDEKRHAVISGSVLYNQDAKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVE TANGIHHIGLAAKQLEHHHHHH
SEQ ID NO: 26 [vl.13 AG (S216R)]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKM VAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIE HLKSPELNVELATAYIKPDEKRHAVISGSVLYNQDEKGSYRLGIFGGQAQEVAGSAEVE TANGIHHIGLAAKQLEHHHHHH
SEQ ID NO: 27 [vl.15 AG + His метка]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSL NTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKM VAKRQFRIGDIVGEHTSFGKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIE HLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVE TANGIRHIGLAAKQLEHHHHHH
SEQ ID NO: 28 [vl.15 AG (E214A) + His метка]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSL
- 30 046480
NTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKM VAKRQFRIGDIVGEHTSFGKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIE HLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISGSVLYNQAAKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVE TANGIRHIGLAAKQLEHHHHHH
SEQ ID NO: 29 [слитый полипептид fHbp 231 дикий тип]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNT GI<LI<NDI<VSFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYI<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSLINQRS FLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPE QNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKV HEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQ GAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVV ALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLH YSIDFTI<I<QGYGRIEHLI<TLEQNVELAAAELI<ADEI<SHAVILGDTRYGSEEI<GTYHLAL FGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGL QSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRA TYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAAIKPDGKRHAVISG SVLYNQAEKGSYSLGIFGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 30 [слитый полипептид fHbp 231S]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLN TGI<LI<NDI<VSFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYI<QDHSAVVALQIEI<INNPDI<IDSLINQ RSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAF S SDD AGGKLT YTIDF AAKQGHGKIEHLK TPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGE KVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLS AQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSA VVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGR LHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHL ALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDK GLQSLTLDQSVSKNEKLKLAAQGAEKTYGNGSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLI TLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGR
- 31 046480
ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAAIKPDGKRHAVIS
GSVLYNQAEKGSYSLGIFGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 31 [vl.13 полноразмерная последовательность дикого типа]
MNRTAFCCFSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSV RKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVY KQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFG SDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAYIKPDEKRHAVISGSVLYNQD EKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 32 [vl.15 полноразмерная последовательность дикого типа]
MNRTTFCCLSLTAALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLT
LEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLES GEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGKLPKDVMAT YRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISG SVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 33 [зрелый fHbp vl.l]
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTY GNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSE HSGI<MVAI<RQFRIGDIAGEHTSFDI<LPEGGRATYRGTAFGSDDAGGI<LTYTIDFAAI<Q GNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVA GSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
SEQ ID NO: 34 [возможная N-концевая аминокислотная последовательность]
MGPDSDRLQQRR
Варианты осуществления изобретения
Далее изобретение будет описано более подробно на примерах, которые не являются исчерпывающими.
Примеры
Пример 1. Исследование стабильности стабилизированного слитого fHbp 231, содержащего мутанты варианта 1.13.
Как обсуждалось выше, дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC) дает информацию о температурной стабильности и укладке доменов белков и описана в литературе, например, Johnson (2013), Arch. Biochem. Biophys. 531:100-9 и Bruylants et al., Current Medicinal Chemistry, 2005; 12:2011-20. DSC ранее применяли для оценки стабильности fHbp v2 (Johnson et al., PLoS Pathogen, 2012; 8:e1002981). Подходящие условия для оценки стабильности при помощи DSC могут заключаться в использовании 20 мкМ полипептида в буферном растворе (например, 25 мМ Tris) с pH между 6 и 8 (например, 7-7,5) с 100-200 мМ NaCl (например, 150 мМ).
Авторы данного изобретения использовали данную методику для исследования влияния мутаций подвариантов варианта 1 fHbp на стабильность слитого белка 231S.
Стабилизированный слитый белок fHbp 231 (обозначенный 231S), использованный в данном примере, включает последовательности варианта 2 и варианта 3, содержащие стабилизирующие мутации. В частности, компонент v2 слитого белка 231S имеет последовательность SEQ ID NO: 16, содержащую обе мутации S32V и L123R. Компонент v3 слитого белка 231S имеет последовательность SEQ ID NO: 17, содержащую обе мутации S32V и L126R. Авторы изобретения исследовали влияние вариаций компонента v1 слитого 231S на стабильность.
Каждый из вариантов полипептида fHbp содержит N-концевой и С-концевой домен, которые можно отчетливо различить на термограммах DSC в виде двух самостоятельных переходов (пиков). Тогда как значения Tm, соответствующие переходам С-концевых доменов большинства вариантов fHbp, находятся вблизи 90°С, у N-концевых доменов они широко варьируют между различными вариантами fHbp, при этом наиболее низкие значения наблюдаются у варианта 2.1 дикого типа (42°С), а наиболее высокие - у варианта 1.1 (70°С).
На фиг. 2 показаны четыре различные термограммы, на которых сравниваются данные DSC, где вариант 1, являющийся компонентом слитого fHbp 231S, представляет собой:
fHbp v1.1 или fHbp v1.13 или (A) fHbp v.1.13 E211A (фиг. 2А);
fHbpv1.1 или fHbp v1.13 или (В) fHbp v1.13 S216R (фиг. 2В);
- 32 046480 fHbp v1.1 или fHbp v1.13 или fHbp v.1.13 E211A/E232A (фиг. 2С) и fHbp v1.1 или fHbp v1.13 или fHbp v.1.13 E211A/S216R (фиг. 2D).
На основании каждой из этих четырех термограмм можно заключить, что (i) единицы fHbp в слитых конструкциях свернуты надлежащим образом и ii) что мутации v1 эффективны для стабилизации слитых конструкций, приводя к увеличению температур перехода для С-концевых доменов по сравнению со слитыми конструкциями, содержащими последовательности v1 дикого типа.
Пример 2. Связывание мутантов одного варианта fHbp с hfH.
Создали следующие полипептиды, приведенные в табл. 1 (с добавлением С-концевых меток His6 в тех случаях, когда они не были частью референтной последовательности) для исследования влияния мутаций с заменой на способность подвариантов 1.13 и 1.15 варианта 1 fHbp снижать связывание с человеческим фактором Н (hfH).
Таблица 1
Белок SEQ ID # Очистка Чистота % (эксклюзионная
СВЭЖХ)
| fHbp vl.l | 23 | MATS3 | 98 |
| fHbp vl.13 | 24 | MenB 664 | 95 |
| fHbp V 1.13 E211A | 25 | MenB 672 | 98 |
| fHbp V 1.13 S216R | 26 | MenB 673 | 98 |
| fHbp VI.13 E211A/E232A | 3 | MenB 687 | 92 |
| fHbp VI.13 E211A/S216R | 4 | MenB 686 | 91 |
| fHbp vl.15 | 27 | MenB 669 | 82 |
| fHbp vl.15 E214A | 28 | MenB 679 | 85 |
| fHbpvl.15 E214A/E235A | 9 | MenB 680 | 86 |
| fHbp vl.15 E214A/S219R | 8 | MenB 682 | 82 |
| fHbpvl.15 S219R | 7 | MenB 683 | 83 |
Авторы изобретения исследовали связывание мутантов одного варианта hfH методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR), который представляет собой методику, позволяющую подробно и количественно охарактеризовать белок-белковые взаимодействия и определить их равновесные и кинетические параметры (как описано, например, Karlsson et al. (1994), Methods, 6:99-110).
Способ связывания на основе SPR включает иммобилизацию лиганда на поверхности сенсор-чипа. Представляющий интерес лиганд иммобилизуют на поверхности сенсор-чипа при помощи строго определенных химических реакций, что позволяет пропускать по его поверхности растворы с различными концентрациями аналита и характеризовать их взаимодействия с иммобилизованным лигандом. Сигнал SPR обусловлен изменениями индекса преломления на поверхности золотого сенсор-чипа.
При отслеживании изменений сигнала SPR во времени получают сенсограмму, график зависимости связывания (в единицах RU) от времени, что позволяет визуализировать и оценивать разные стадии события связывания.
При инжектировании аналита ответ нарастает вследствие образования комплексов аналит-лиганд на поверхности, и на сенсограмме преобладает фаза ассоциации. После инжектирования достигается стационарное состояние, при котором связывающиеся и диссоциирующиеся молекулы находятся в равновесии. После окончания инжектирования аналита происходит снижение ответа вследствие диссоциации комплексов, что характеризует фазу диссоциации. Аппроксимация данных сенсограммы с использованием соответствующей модели кинетики связывания позволяет рассчитать кинетические параметры, такие как константы степени ассоциации (ka) и диссоциации (kd), а также аффинность связывания при исследуемом взаимодействии.
Авторы изобретения проводили эксперименты в следующих условиях:
Чип: СМ-5 с иммобилизацией по аминогруппам доменов 6-7 фактора Н, 10 мкг/мл в ацетатном буфере с pH 4,0 до уровня ~400 RU, и иммобилизацией по аминогруппам человеческого фактора Н (Merck Millipore), 20 мкг/мл в ацетатном буфере с pH 4,0 до уровня ~ 2500 RU.
Проточный буфер: 1xHBS-P.
Исследуемые антигены: приведены в табл. 1.
Антигены наносили в постоянной концентрации 250 нМ.
- 33 046480
Время взаимодействия: 120 с, скорость тока: 30 мкл/мин.
Время диссоциации: 120 с.
Буфер для регенерации: 100 мМ глицин-HCl, 3М NaCl, pH 2,0.
Данные, приведенные на фиг. 3A-D, позволяют сравнить связывание доменов 6-7 фактора Н (hfH) с fHbp v1.1 (антиген fHbp, присутствующий в BEXSERO®), fHbp v1.13 (дикий тип) и fHbp v.1.13 Е211А (фиг. 3А); fHbp v.1.13 S216R (фиг. 3В); fHbp v.1.13 Е211А/Е232А (фиг. 3С) и fHbp v.1.13 E211A/S216R (фиг. 3D).
Было показано, что фрагмент hfH, содержащий только домены 6-7, достаточен для имитации взаимодействия fHbp-hfH (Schneider et al. (2009), Nature, 458:890-893), таким образом, получена упрощенная модельная система для оценки аффинности мутантов и конструкций fHbp к hfH.
Тогда как одиночные мутанты fHbp v1.13 демонстрируют пониженное связывание с fH по сравнению с v.1.1 и v1.13 дикого типа (см. фиг. 3А и В), двойные мутанты v1.13 Е211А/Е232А и v1.13 E211A/S216R демонстрируют значительное снижение связывающей активности (см. фиг. 3С и D).
Данные, приведенные на фиг. 4A-D, позволяют сравнить связывание полноразмерного белка фактора Н с fHbp v1.1, fHbp v1.13 (дикий тип) и fHbp v.1.13 Е211А (фиг. 4А); fHbp v1.13 S216R (фиг. 4В); fHbp v.1.13 E211A/E232A (фиг. 4С) и fHbp v.1.13 E211A/S216R (фиг. 4D).
Тогда как одиночные мутанты fHbp v1.13 демонстрируют пониженное связывание с fH по сравнению с v.1.1 и v1.13 дикого типа (см. фиг. 4А и В), двойные мутанты v1.13 Е211А/Е232А и v1.13 E211A/S216R демонстрируют значительное снижение связывающей активности (см. фиг. 4С и D).
Данные, приведенные на фиг. 5A-D, позволяют сравнить связывание доменов 6-7 фактора Н c fHbp v1.1, fHbp v1.15 (дикий тип) и fHbp v.1.15 Е214А (фиг. 5А), fHbp v.1.15 S219R (фиг. 5B), fHbp v.1.15 E214A/E235A (фиг. 5С) и fHbp v.1.15 E214A/S219R (фиг. 5D).
Тогда как одиночные мутанты fHbp v1.15 демонстрируют пониженное связывание с fH по сравнению с v.1.1 и v1.15 дикого типа (см. фиг. 5А и В), двойные мутанты v1.15 Е214А/Е235А и v1.15 E214A/S219R демонстрируют отсутствие существенного связывания с субдоменами fH6-7 фактора Н (см. фиг. 5С и D).
Данные, приведенные на фиг. 6A-D, позволяют сравнить связывание полноразмерного белка фактора Н с fHbp v1.1, fHbp v1.15 (дикий тип) и fHbp v.1.15 Е214А (фиг. 6A), fHbp v.1.15 S219R (фиг. 6в), fHbp v.1.15 E214A/E235A (фиг. 6С) и fHbp v.1.15 E214A/S219R (фиг. 6D).
Тогда как одиночный мутант fHbp v1.15 E214A демонстрирует пониженное связывание fH по сравнению c v.1.1 и v1.15 дикого типа (см. фиг. 6А), одиночный мутант v1.15 S219R и двойной мутант v1.15 E214A/E235A по существу не связываются с полноразмерным белком fH (см. фиг. 6В и С).
Двойной мутант v1.15 E214A/S219R демонстрирует некоторую остаточную связывающую активность с полноразмерным белком fH (см. фиг. 6D).
Таким образом, в итоге наиболее перспективными кандидатами для уменьшения или устранения связывания с hfH являются мутанты fHbp v1.13 Е211А/Е232А, v1.13 E211A/S216R, v1.15 S219R и v1.15 E214A/E235A.
Пример 3. Связывание мутантов слитого fHbp 23(S) 1.13 и 23(S) 1.15 с hfH.
Создали следующие слитые полипептиды (табл. 2) (с добавлением С-концевых меток His6, в тех случаях, когда они не являлись частью референтной последовательности) для исследования влияния мутаций компонентов var1 слитых белков fHbp 231 на способность слитого белка связываться с человеческим фактором Н (hfH).
Таблица 2
| Белок | SEQ ID # | Очистка | Чистота % (эксклюзионная СВЭЖХ) |
| fHbp 231wt | 29 | MENB593 | 85 |
| fHbp 231S | 30 | MENB665 | 92 |
| fHbp 23S_1.13_E211A/S216R | 19 | MENB689 | 93 |
| fHbp-23S_1.15 | |||
| 22 | MENB702 | 91 | |
| E214A/E235A fHbp- | 18 | MENB703 | 90 |
23S_1.13_E211A/E232A
Авторы изобретения исследовали связывание мутантов слитого fHbp 23(S)1.13 и 23(S)1.15 с hfH при помощи SPR, как описано в примере 2.
Слитый белок fHbp 231S (SEQ ID NO: 30), использованный в данном примере, включает последовательности варианта 2 и варианта 3, содержащие стабилизирующие мутации S32V/L123R и S32V/L126R, соответственно, подробно описанные выше. В частности, компонент v2 слитого белка 213S имеет после
- 34 046480 довательность SEQ ID NO: 16, а компонент v3 слитого белка 213S имеет последовательность SEQ ID NO: 17. Компонент v1.1 слитого fHbp 231S включает точечную мутацию (R^S), препятствующую связыванию с fH, которая выделена жирным шрифтом в SEQ ID NO: 30 выше и соответствует мутации R41S, описанной в WO 2011/126863.
Слитый fHbp 231 дикого типа (SEQ ID NO: 29), использованный в данном примере, соответствует слитому белку с последовательностью SEQ ID NO: 30, но без внедрения стабилизирующих мутаций в v2 и v3 и без препятствующей связыванию мутации в v1.1.
Слитый fHbp 23S_1.13E211A/S216R (SEQ ID NO: 19) соответствует слитому белку с последовательностью SEQ ID NO: 30, однако компонент v1 слитого белка представляет собой несвязывающийся мутант v1. 13 E211A/S216R по данному изобретению.
Слитый fHbp 23S_1.15 Е214А/Е235А (SEQ ID NO: 22) соответствует слитому белку с последовательностью SEQ ID NO: 30, однако компонент v1 слитого белка представляет собой несвязывающийся мутант v1.15 Е214А/Е235А по данному изобретению.
Слитый fHbp-23S_1.13E211A/E232A (SEQ ID NO: 18) соответствует слитому белку с последовательностью SEQ ID NO: 30, однако компонент v1 слитого белка представляет собой несвязывающийся мутант v1. 13 E211A/S216R по данному изобретению.
Слитые белки 231 дикого типа (SEQ ID NO: 29) и fHbp 231S (SEQ ID NO: 30) служат в данном эксперименте контролями.
Сенсограммы, приведенные на фиг. 7А, В), позволяют сравнить связывание доменов 6-7 фактора Н с fHbp 231 дикого типа, fHbp 231S и fHbp 23S_1.13E211A/S216R (фиг. 7А), а также fHbp 23S_1.13E211A/E232A (фиг. 7В).
Сенсограммы, приведенные на фиг. 8, позволяют сравнить связывание доменов 6-7 фактора Н с fHbp 231 дикого типа, fHbp 231S и fHbp 23S_1.15 Е214А/Е23 5А.
Было показано, что фрагмент hfH, содержащий только домены 6-7, достаточен для имитации взаимодействия fHbp - hfH (Schneider et al. (2009), Nature, 458:890-893), таким образом, получена упрощенная модельная система для оценки аффинности мутантов и конструкций fHbp к hfH.
Из фиг. 7 и 8 явственно следует, что все три мутанта V1.13/1.15 демонстрируют сильное снижение связывающей активности с доменами 6-7 фактора Н. По сравнению со слитым 2fHbp 31S связывающая активность, демонстрируемая мутантными слитыми белками v1.13 и v1.15, отчетливо снижена.
Сенсограммы, приведенные на фиг. 9А, В, позволяют сравнить связывание полноразмерного белка фактора Н с fHbp 231 дикого типа, fHbp 231S и fHbp 23S_1.13E211A/S216R (фиг. 9А), а также fHbp 23S_1.13E211A/E232A (фиг. 9B).
Сенсограммы, приведенные на фиг. 10, позволяют сравнить связывание полноразмерного белка фактора Н с fHbp 231 дикого типа, fHbp 23S и fHbp 23S_1.15 Е214А/Е235А.
Эти данные свидетельствуют, что все три исследованных мутанта V1.13/1.15 демонстрируют выраженное снижение связывающей активности с полноразмерным фактором Н по сравнению со слитым fHbp 231S.
Пример 4. Исследование иммуногенности, вызываемой слитыми белками fHbp no изобретению в отношении штаммов менингококка, экспрессирующих множество различных подвариантов fHbp v1 (v1.x).
Основная задача:
Исследовать иммуногенность, вызванную слитыми белками 231.13, содержащими мутации, которые снижают или устраняют связывание hfH, в отношении штаммов менингококка, экспрессирующих fHbp в виде множества различных подвариантов fHbp v1, в сравнении с существующими антигенами/слитыми белками fHbp и лицензированной вакциной 44CMenB. Иммуногенность определяли по бактерицидной активности сыворотки в присутствии кроличьего комплемента (rSBA) и бактерицидной активности сыворотки в присутствии человеческого комплемента (hSBA) в отношении следующих подвариантов штамма fHbp v1 (v1.x): v1.1, v1.10, v1.13, v1.14 и v1.15.
Задачей данных экспериментов является оценка, демонстрируют ли слитые белки fHbp по данному изобретению сопоставимую (не уступающую) иммуногенность в отношении панели штаммов, экспрессирующих fHbp v1.x, при сравнении с существующими композициями антигенов/слитых белков и лицензированной вакциной 44CMenB.
Схема иммунизации:
Семь групп по 10 мышей (самки CD1 в возрасте 6-8 недель) получали три отдельные дозы по 200 мкл одной из семи различных антигенных композиций, как подробно представлено в табл. 3.
Мышей иммунизировали внутрибрюшинно (в/б) в 1, 22 и 36 дни.
У мышей брали кровь в 0, 35 и 50 дни.
- 35 046480
Таблица 3
| Г руппа | Число животных | Воздействие | |||
| Антиген | Доза антигена | Доза адъюванта | Объем и способ инъекции | ||
| 1 | 10 | 231.13Е21 1A/S216R (SEQ Ш NO: 19) | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
| 2 | 10 | 231.13Е21 1А/Е211А/Е 232А (SEQ IDNO: 18) | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
| 3 | 10 | 231.13 (SEQ Ш NO:29) | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
| 4 | 10 | 231.IS (SEQ ID NO:30) | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
| 5 | 10 | fHbp vl.l (SEQ ID NO: 33) | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
| 6 | 10 | 936-741* | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
| 7 | 10 | BEXSEROподобный* * | 20 мкг антигена + 10 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
*936-741 представляет собой слитый GNA2091-fHbp, включенный в вакцину 44CMenB.
^BEXSERO-подобный означает готовый продукт BEXSERO, но необязательно из партии, одобренной для выпуска.
Конечная точка:
Выработка суммарных IgG против fHbp через две недели после третьей иммунизации.
Исследование пулированной сыворотки в тестах rSBA и hSBA с применением панели штаммов Neisseria meningitidis, экспрессирующих fHbp v1.1, v1.10, v1.13, v1.14 и v1.15.
Результаты:
На фиг. 11А показаны бактерицидные титры сыворотки, измеренные в присутствии кроличьего комплемента (rSBA) в отношении каждой из 7 композиций антигенов в исследовании на различных штаммах менингококка, экспрессирующих fHbp v1 .x. При отображении результатов SBA каждая точка представляет бактерицидный титр сыворотки в отношении отдельного штамма, измеренный в пулированной сыворотке. На фиг. 11В показаны бактерицидные титры сыворотки, измеренные в присутствии человеческого комплемента (hSBA) в отношении каждой из 7 композиций антигенов в исследовании против того же набора штаммов, экспрессирующих fHbp v1 .x.
Результаты показывают, что слитые белки fHbp по изобретению (группы 1 и 2) демонстрируют сопоставимую (не уступающую) иммуногенность в отношении панели v1 .x при сравнении с лицензированным продуктом BEXSERO и антигеном BEXSERO fHbp (936-741).
Любопытно, что данные результаты также указывают, что слитые белки fHbp по изобретению (группы 1 и 2) являются более иммуногенными, чем существующие слитые белки, известные в области техники (в частности, слитый 231.1S (в данном документе SEQ ID NO: 30)), в отношении панели штаммов v1 .x, как в определении с применением rSBA, так и с hSBA.
Пример 5. Исследование иммуногенности, вызываемой слитыми белками fHbp по изобретению, в отношении штаммов менингококка, экспрессирующих fHbp v2/v3.
Основная задача:
Исследовать иммуногенность, вызываемую слитыми белками 231.13, содержащими мутации, которые снижают или устраняют связывание с hfH, в отношении штаммов менингококка, экспрессирующих
- 36 046480 fHbp v2 или v3, в сравнении с существующими антигенами/слитыми белками fHbp и лицензированной вакциной 44CMenB. Задачей данных экспериментов была оценка, позволит ли включение трех различных мутированных вариантов fHbp расширить перекрывание штаммов по сравнению с существующими композициями антигенов.
Иммуногенность определяли по бактерицидной активности сыворотки в присутствии кроличьего комплемента (rSBA) и бактерицидной активности сыворотки в присутствии человеческого комплемента (hSBA) в отношении следующих штаммов fHbp v2 и v3: v2.16, v3.31 и v3.42.
Схема иммунизации:
Семь групп по 10 мышей (самки CD1 в возрасте 6-8 недель) получали три отдельные дозы по 200 мкл одной из семи различных антигенных композиций, как подробно представлено в табл. 4 ниже.
Мышей иммунизировали внутрибрюшинно (в/б) в 1, 22 и 36 дни.
У мышей брали кровь в 0, 35 и 50 дни.
Таблица 4
| Г руппа | Число животных | Воздействие | |||
| Антиген | Доза антигена | Доза адъюванта | Объем и способ инъекции | ||
| 1 | 10 | 231.13Е21 1A/S216R (SEQ Ш NO: 19) | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
| 2 | 10 | 231.13Е21 1А/Е211А/Е 232А (SEQ IDNO: 18) | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
| 3 | 10 | 231.13 (SEQ Ш NO:29) | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
| 4 | 10 | 231.IS (SEQ IDNO:30) | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
| 5 | 10 | fHbp vl.l (SEQ ID NO: 33) | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
| 6 | 10 | 936-741* | 20 мкг антигена | А1(ОН)3 | 200 мкл ВБ |
| 3 мг/мл | |||||
| 7 | 10 | BEXSEROподобный** | 20 мкг антигена + 10 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ |
*93 6-741 представляет собой слитый GNA2091-fHbp, включенный в вакцину 44CMenB.
^BEXSERO-подобный означает готовый продукт BEXSERO, но необязательно из партии, одобренной для выпуска.
Конечная точка:
Выработка суммарных IgG против fHbp через две недели после третьей иммунизации.
Исследование пулированной сыворотки в тестах rSBA и hSBA против панели штаммов Neisseria meningitidis, экспрессирующих fHbp в варианте 2 или варианте 3.
Результаты:
На фиг. 12А показаны бактерицидные титры сыворотки, измеренные в присутствии кроличьего комплемента (rSBA) в отношении каждой из 7 композиций антигенов в исследовании на различных штаммах менингококка, экспрессирующих fHbp v2 или v3. При отображении результатов SBA каждая точка представляет бактерицидный титр сыворотки в отношении отдельного штамма, измеренный в пулированной сыворотке. На фиг. 12В показаны бактерицидные титры сыворотки, измеренные в присутствии человеческого комплемента (hSBA) в отношении каждой из 7 композиций антигена в исследовании против того же набора штаммов, экспрессирующих fHbp v2 или v3.
Результаты показывают, что слитые белки, содержащие все три варианта fHbp, приводят к гораздо более высоким титрам в тестах с rSBA и hSBA по сравнению с fHbp v1.1 в отдельности, со слитым бел- 37 046480 ком 936-741, включенным в BEXSERO, или фактически с самим продуктом BEXSERO. Это свидетельствует о существенном улучшении иммунного ответа против штаммов, экспрессирующих fHbp v2 или v3, по сравнению с существующей вакциной или компонентами вакцины.
Пример 6. Оценка дополнительных преимуществ включения несвязывающихся мутантов fHbp231.x по изобретению в существующую вакцину 44CMenB.
Основная задача:
a) Оценить перекрывание штаммов (определяемое как титры >64 в тесте hSBA) композицией 44CMenB+слитый белок fHbp231.13_E211A/S216R по изобретению в сравнении с существующей вакциной 44CMenB на двух различных моделях на животных (мыши и кролики) через две недели после третьей дозы, при измерении титров в отношении 20 штаммов fHbp вариантов 2 и 3 выбранной серогруппы В Neisseria meningitidis в тесте hSBA.
b) Оценить перекрывание штаммов (определяемое как титры >64 в тесте hSBA) композицией 44CMenB+слитый белок fHbp231.13_E211A/S216R по изобретению в сравнении с существующей вакциной 44CMenB на двух различных моделях на животных (мыши и кролики) через две недели после третьей дозы, при измерении титров в отношении 30 штаммов fHbp вариантов 1.x выбранной серогруппы В Neisseria meningitidis в тесте hSBA.
c) Оценить перекрывание штаммов композицией 44CMenB+слитый белок fHbp231.13_E211A/S216R по изобретению (для доказательства, что она не уступает) при сравнении с существующей вакциной 44CMenB на двух различных моделях на животных (мыши и кролики) через две недели после третьей дозы, при измерении титров в отношении 11 вариантов серогруппы В Neisseria meningitidis, включая референтные штаммы 44CMenB и штаммы, несущие варианты 1.1 и 1.4 fHbp, перекрываемые 44CMenB, в тесте hSBA.
Конечная точка: титры собранной через две недели после третьей инъекции пулированной сыворотки в тесте hSBA (один пул на группу).
Схема исследования на мышах.
Самки мышей линии CD1 в возрасте 4-6 недель получали три инъекции внутрибрюшинно (ВБ) по 200 мкл 44CMenB, адсорбированной на алюминия гидроксиде (Bexsero), или 44CMenB-адсорбированной на алюминия гидроксиде (BEXSERO) плюс различные слитые белки fHbp 231 (как показано в табл. 5) в 1, 22 и 36 дни. Образцы крови брали перед 1-й инъекцией (день 0) и последний забор крови осуществляли через две недели после третьей инъекции (день 49).
Таблица 5
| Г руппа | Число живо тных | Воздействие | Схема иммуниз ации (дни) | Забор образцов (органы, объем крови) и дни | |||
| Вакцина | Доза антигена | Доза адъюва нта | Объем и способ инъекции | ||||
| 1 | 10 | 4СМепВ | 20 мкг белка +10 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
| 2 | 10 | 4CMenB+fHbp 231.13_wt | 20 мкг белка +10 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
| 3 | 10 | 4CMenB + fHbp 231.13-Е211А /S16R | 20 мкг белка +10 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
| 4 | 10 | 4CMenB + fHbp 231.13-Е211А / Е232А | 20 мкг белка +10 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
| 5 | 10 | 4CMenB + fHbp 23IS* | 20 мкг белка +10 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
| 6 | 10 | 4CMenB + fHbp 231.15_wt | 20 мкг белка +10 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
| 7 | 10 | 4CMenB + fHbp 231.15_E214A /Е235А | 20 мкг белка +10 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
- 38 046480
| 8 | 10 | 4СМепВ + fHbp 23IS* | 20 мкг белка +10 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 200 мкл ВБ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
*Слитый белок fHbp 231S включает стабилизирующие мутации в компонентах v2 и v3, в дополнение к точечной мутации (R^S) в компоненте v1.1, препятствующей связыванию с fH, показанной жирным шрифтом в SEQ ID NO: 30, которая соответствует мутации R41S, описанной в WO 2011/126863.
Схема исследования на кроликах.
Самки новозеландских кроликов в возрасте 9 недель получали три инъекции внутримышечно (ВМ) по 500 мкл 44CMenB, адсорбированной на алюминия гидроксиде (BEXSERO), или 44CMenBадсорбированной на алюминия гидроксиде (BEXSERO) плюс различные слитые белки fHbp 231 (как показано в табл. 6) в 1, 21 и 35 дни. Последний забор крови осуществляли через две недели после третьей инъекции.
Таблица 6
| Групп а | Числ о живо тных | Вакцина | Воздействие | Схема иммуниз ации (дни) | Забор образцов (органы, объем крови) и дни | ||
| Доза антигена | Доза адъюва нта | Объем и способ инъекции | |||||
| 1 | 3 | 4СМепВ | 50 + 100 мкг белка + 25 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 500 мкл ВМ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
| 2 | 3 | 4CMenB+fHbp 231.13_wt | 50+100 мкг белка + 25 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 500 мкл ВМ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
| 3 | 3 | 4CMenB + fHbp 231.13-Е211А /S16R | 50+100 мкг белка + 25 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 500 мкл ВМ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
| 4 | 3 | 4CMenB + fHbp 231.15_wt | 50+100 мкг белка + 25 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 500 мкл ВМ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
| 5 | 3 | 4CMenB + fHbp 23IS* | 250+ 100 мкг белка + 25 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 500 мкл ВМ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
| 6 | 3 | 4CMenB + fHbp 231.15_ Е214А/ E235A | 50+100 мкг белка + 25 мкг OMV | А1(ОН)3 3 мг/мл | 500 мкл ВМ | 1,22,36 | Кровь в дни 0, 49 |
*Слитый белок fHbp 231S включает стабилизирующие мутации в компонентах v2 и v3, в дополнение к точечной мутации (R^S) в компоненте v1.1, препятствующей связыванию с fH, показанной жирным шрифтом в SEQ ID NO: 30, которая соответствует мутации R41S, описанной в WO 2011/126863.
Определение размера выборки.
Десять мышей и 3 кролика на группу являются минимальным количеством животных, которое позволяет получить достаточно пулированной сыворотки для проведения теста hSBA в отношении большой панели штаммов (приблизительно 73), с учетом 20% повторных тестов или дополнительных титрований.
Всего с применением hSBA протестировали 61 штамм, несущий fHbp вариантов 1, 2 и 3 выбранной серогруппы В Neisseria meningitides.
Считываемые иммунологические параметры.
Функциональные антитела определяли по бактерицидной активности сыворотки с использованием человеческого комплемента (hSBA) в отношении 61 штамма N. meningitidis, несущего fHbp варианта 1.x, варианта 2 или варианта 3, и панели референтных антигенных штаммов Bexsero.
SBA является единственным общепринятым коррелятом защиты против N. meningitidis у человека. Результаты.
- 39 046480
Гуморальные ответы: функциональные антитела, измеренные с применением rSBA.
Для измерения функциональных антител, вырабатываемых в ответ на различные композиции BEXSERO, способные инициировать комплемент-опосредованный цитолиз штаммов N. meningitidis, исследовали пулированную сыворотку, собранную через две недели после третьей вакцинации, по бактерицидной активности сыворотки с применением сыворотки человека кролика в качестве источника комплемента (hSBA) в отношении панели из приблизительно 60 штаммов N. meningitidis.
Общее количество отобранных штаммов Neisseria разделили на три различные панели штаммов: fHbp вариантов 2 и 3, fHbp вариантов 1.x, а также референтные штаммы BEXSERO и штаммы fHbp вариантов 1.1 и 1.4.
Чтобы продемонстрировать дополнительные преимущества композиции, содержащей слитый белок fHbp231.13_E211A/S216R по изобретению, относительно BEXSERO, отобрали 50 штаммов: 20 штаммов, несущих fHbp варианта 2 или варианта 3.
Отбор был основан на распределении частот встречаемости fHbp и включал штаммы, несущие fHbp v2.16, v2.19, v2.21, v2.24, v3.116, v3.31 и v3.42. 30 штаммов, несущих fHbp вариантов 1.x.
Отбор проводили таким образом, чтобы закрыть пробелы, существующие у BEXSERO, и проанализировать все генетическое разнообразие fHbp варианта 1, и включали штаммы, несущие fHbp v1.1, v1.4, v1.13, v1.15, v1.14, v1.10, v1.260, v1.510, v1.90, v1.275, v1.697, v1.226, v1.110, v1.249, v1.108, v1.227 и v1.215.
Чтобы продемонстрировать, что композиция, содержащая слитый белок fHbp231.13_E211A/S216R по изобретению, не уступает BEXSERO, отобрали 11 штаммов, включая референтные штаммы BEXSERO плюс дополнительные штаммы, которые, как известно, перекрываются BEXSERO (включая fHbp 1.1 и 1.4).
Исследование иммуногенности на мышах.
Для определения дополнительных преимуществ композиций, содержащих слитые белки fHbp по изобретению, относительно BEXSERO, сыворотку, полученную от вакцинированных мышей, исследовали в пулированном виде в присутствии человеческой плазмы как источника комплемента (hSBA) на 50 штаммах MenB, сгруппированных как штаммы варианта 1 (30 штаммов) и штаммы вариантов 2/3 (20 штаммов). Следует отметить, что отбирали 50 штаммов, которые не перекрываются BEXSERO и поэтому не совпадают по всем антигенам BEXSERO. Результаты показаны на фиг. 13А и В.
Как следует из фиг. 13А и В, композиции, содержащие слитые белки fHbp по изобретению, превосходят BESXERO в отношении штаммов вариантов 2/3 и также превосходят BEXSERO в отношении панели штаммов вариантов 1.х.
Для различения перекрываемых и неперекрываемых штаммов выбрали новое пороговое значение 256 (в четыре раза превышающее первоначальное пороговое значение 64). Рассчитанные проценты перекрываемых штаммов представлены на фиг. 14А и В.
Результаты, приведенные на этих графиках, вновь демонстрируют, что композиции, содержащие слитые белки по изобретению, демонстрируют большее перекрывание в отношении панели штаммов вариантов 2 и 3 (фиг. 14А) по сравнению с BEXSERO в отдельности, а также большее перекрывание в отношении большинства штаммов вариантов 1.x (фиг. 14В) по сравнению с BEXSERO.
Наконец, не уступающие свойства композиции, содержащей слитые белки по изобретению, также оценивали в исследовании на мышах, тестируя мышиную антисыворотку на панели из 11 штаммов, включающей референтные штаммы BEXSERO и штаммы fHbp вариантов 1.1 и 1.4 (фиг. 15). Не уступающие свойства оценивали в тесте hSBA с применением пулированной сыворотки мышей к панели 11 штаммов MenB.
Результаты, приведенные на фиг. 15, подтверждают не только то, что все композиции, содержащие слитые белки по изобретению, не уступают BEXSERO, но также свидетельствуют об улучшенной иммуногенности в отношении большинства штаммов вследствие дополнительного вклада антител, направленных против дополнительных компонентов fHbp.
Не уступающие свойства композиций, содержащих слитый белок fHbp231.13_E211A/S216R по изобретению, по сравнению с BEXSERO также оценивали, тестируя сыворотку отдельных мышей с комплементом крольчат в качестве источника комплемента (rSBA) на панели 4 индикаторных штаммов BEXSERO (M14459 для fHbp варианта 1.1; NZ98/254 для PorA P1.4; М4407 для NHBA; 96217 для NadA), для подтверждения того, что специфическая иммуногенность антигенов BEXSERO сохраняется при добавлении нового слитого белка. Результаты показаны на фиг. 16A-D. На этих графиках BEXSERO PLUS PLUS относится к композиции BEXSERO + fHbp 231.13_E211A/S216R.
Исследование иммуногенности на кроликах.
Объединенные данные, полученные в тесте hSBA, для существующей композиции BEXSERO и композиций, содержащих слитые белки по изобретению, дополнительно представлены на фиг. 17А для штаммов типа вар2/3 и на фиг. 17В для штаммов типа вар.1.к. Пунктирная линия представляет порог отсечения для кроличьей сыворотки в тесте hSBA, равный 16.
Все композиции, содержащие слитые белки fHbp по данному изобретению, обеспечивают улучшенное перекрывание в отношении панели штаммов вариантов 2 и 3 по сравнению с BEXSERO в от
-
Claims (25)
- дельности и приводят к более высоким титрам в отношении большинства штаммов вариантов 1.х в тесте hSBA по сравнению с BEXSERO в отдельности.Как и в исследовании на мышах, описанном выше, для анализа данных, полученных у кроликов, в качестве нового порога отсечения выбирали значение 256 (в четыре раза превышающее первоначальное пороговое значение 64).Проводили анализ перекрывания, сводные данные представлены на фиг. 18А (для штаммов вар2/3) и фиг. 18В (для штаммов варДж). Эти результаты подтверждают, что композиции, содержащие слитые белки fHbp по данному изобретению, способны перекрывать больший процент штаммов вар2/3, чем BEXSERO в отдельности, и способны перекрывать больший процент штаммов v1.x, чем BEXSERO в отдельности и BEXSERO + слитый белок fHbp 231.1_R41S, известный из предшествующего уровня техники (обозначенный на фиг. 18 как 2-3-1S).Наконец, то, что композиции, содержащие слитые белки fHbp по данному изобретению, не уступают BEXSERO, подтвердили в исследовании на кроликах, тестируя кроличью антисворотку на панели из 11 штаммов, включая референтные штаммы BEXSERO и штаммы fHbp вар.1.1 и 1.4, как показано на фиг. 19.Эти результаты подтверждают, что все композиции, содержащие слитые белки fHbp по данному изобретению, не уступают по своим свойствам.Пример 7. Оценка иммуногенности мутанта 44CMenB+23(S)1.13 NB в сравнении с 44CMenB+23(S)1.13 дикого типа на модели трансгенных по hFH мышейСхема иммунизации.Две группы по 10 мышей (трансгенные мыши, экспрессирующие hfH) иммунизировали внутрибрюшинно (в.б.) одним из двух составов, А и В:группа А = 4CMenB + fHbp 23(S)1.13 дикого типа;группа В = 4CMenB + fHbp 23(S)1.13_E211A/S216R.Одна мышь (неиммунизированная), служившая контролем, получала только фосфатно-солевой буфер (PBS).Иммунизацию проводили введением трех доз в 1, 22 и 36 дни. Брали образцы крови перед иммунизацией и после третьей дозы. В каждой группе сыворотку, полученную до иммунизации, объединяли в пул.Бактериальное заражение иммунизированных мышей.Девять мышей из каждой группы подвергали заражению (две мыши погибли после взятия образцов и до бактериального заражения; одна мышь из группы А и одна из группы В). Мышей заражали в.б. с применением биолюминесцентного варианта штамма МС58 серогруппы В (107 КОЕ на мышь в 500 мкл физиологического раствора).Результаты.Визуализацию осуществляли в динамике через 30 мин и 6 ч после инфицирования, подсчитывали общее количество фотонов в секунду и выражали в виде общего числа фотонов в секунду на мышь и в виде отношения общего числа фотонов в секунду на мышь через 6 ч инфицирования к общему числу фотонов в секунду на мышь через 0,5 ч инфицирования (фиг. 20).Подсчитывали общее количество испускаемых фотонов на мышь, которое показано на фиг. 21. В обеих группах сигналы существенно снижались по сравнению с неинфицированной мышью. У мышей группы В общее количество фотонов в секунду было меньше по сравнению с группой А, однако это различие не достигало уровня значимости (р=0,2) на фиг. 21А. Однако, при анализе данных, представленных в виде отношения сигналов через 6 ч/0,5 ч (фиг. 21В), различие было достоверным (р=0,007, критерий Манна-Уитни).Заключение.Как показывают фиг. 20 и 21, мыши в обеих группах, иммунизированные составами А и В, были защищены от заражения МС58, о чем свидетельствовала элиминация после инфицирования, отмечавшаяся у мышей обеих групп в момент времени 6 ч по сравнению с 0,5 ч. Напротив, неиммунизированные мыши были не способны к элиминации инфекционного агента через 6 ч после заражения. Однако, элиминация после заражения была более выражена у мышей группы В, иммунизированных 4CMenB+fHbp 23(S)1.13_E211A/S216R, по сравнению с мышами группы А, которых иммунизировали 4CMenB+fHbp 23(S)1.13 дикого типа.Таким образом, эти данные, полученные in vivo, подтверждают улучшенную иммуногенность вакцинной композиции, содержащей мутированный не связывающийся с fH слитый белок по изобретению, по сравнению с эквивалентной композицией, содержащей слитый полипептид, который не включает в себя несвязывающийся двойной мутант полипептида v1.13 по изобретению.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Мутантный менингококковый полипептид fHbp v1.13, обладающий пониженной способностью связываться с человеческим фактором Н (hfH), содержащий аминокислотную последовательность,- 41 046480 имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 2, где аминокислотная последовательность указанного мутантного менингококкового полипептида fHbp v1.13 содержит замены остатков Е211А и S216R последовательности SEQ ID NO: 2.
- 2. Полипептид по п.1, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.
- 3. Слитый полипептид, содержащий менингококковые полипептиды fHbp v1, v2 и v3, где варианты последовательностей fHbp расположены в порядке v2-v3-v1 от N- к С-концу и где полипептид fHbp v1 представляет собой мутантный полипептид fHbp v1.13 по п.1 или 2.
- 4. Слитый полипептид по п.3, где:(а) полипептид fHbp v2 представляет собой мутантный полипептид fHbp v2, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности SEQ ID NO: 12, где аминокислотная последовательность fHbp v2 включает мутацию с заменой остатков S32 и L123 последовательности SEQ ID NO: 12 и где замены представляют собой S32V и L123R; и (б) полипептид fHbp v3 представляет собой мутантный полипептид fHbp v3, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности SEQ ID NO: 15, где аминокислотная последовательность fHbp v3 включает мутацию с заменой остатков S32 и L126 последовательности SEQ ID NO: 15 и где замены представляют собой S32V и L126R.
- 5. Слитый полипептид по п.4, где:(а) полипептид fHbp v2 содержит или состоит из аминокислотной последовательностиSEQ ID NO: 16 и/или (б) полипептид fHbp v3 содержит или состоит из аминокислотной последовательностиSEQ ID NO: 17.
- 6. Слитый полипептид по любому из пп.3-5, где последовательности v2 и v3 и последовательности v3 и v1 соединены глицин-сериновым линкером.
- 7. Слитый полипептид по п.6, где глицин-сериновый линкер представляет собой GSGGGG.
- 8. Слитый полипептид по любому из пп.3-7, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.
- 9. Слитый полипептид по любому из пп.3-8, дополнительно содержащий N-концевую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
- 10. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный полипептид fHbp v1.13 по п.1 или 2.
- 11. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый полипептид по любому из пп.3-9.
- 12. Плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный полипептид fHbp v1.13 по п. 1 или 2 или слитый полипептид по любому из пп.3-9.
- 13. Рекомбинантная клетка-хозяин, трансформированная плазмидой по п.12.
- 14. Иммуногенная композиция, содержащая мутантный полипептид fHbp v1.13 по п.1 или 2 или слитый полипептид по любому из пп.3-9.
- 15. Иммуногенная композиция по п.14, дополнительно содержащая одно или более чем одно из: менингококкового антигена NHBA, менингококкового антигена NadA, менингококкового антигена fHbp и везикул наружной мембраны менингококка (OMV).
- 16. Иммуногенная композиция по п.15, содержащая композицию 44CMenB.
- 17. Иммуногенная композиция по любому из пп.14-16, дополнительно содержащая конъюгированный капсулярный сахарид из N. meningitidis серогрупп А, С, W135 и/или Y.
- 18. Иммуногенная композиция по п.17, дополнительно содержащая конъюгированные капсулярные сахариды из N. meningitidis каждой из серогрупп А, С, W135 и Y.
- 19. Способ выработки иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение иммуногенной композиции по любому из пп.14-18.
- 20. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.14-18 в медицине.
- 21. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.14-18 в качестве вакцины.
- 22. Иммуногенная композиция по любому из пп.14-18, где композиция предназначена для выработки иммунного ответа у млекопитающего.
- 23. Иммуногенная композиция по любому из пп.14-18, где композиция предназначена для иммунизации млекопитающего против инфекции, вызываемой N. meningitidis.
- 24. Способ по п.19, где млекопитающее представляет собой человека.
- 25. Иммуногенная композиция по п.22 или 23, где млекопитающее представляет собой человека.-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18188321.6 | 2018-08-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA046480B1 true EA046480B1 (ru) | 2024-03-20 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240228551A9 (en) | Modified meningococcal fhbp polypeptides | |
| US11939357B2 (en) | Modified meningococcal fHbp polypeptides | |
| US11932671B2 (en) | Modified meningococcal fHbp polypeptides | |
| US20230414736A1 (en) | Meningococcus vaccines | |
| EA046480B1 (ru) | МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ МЕНИНГОКОККОВОГО fHbp | |
| WO2023232807A1 (en) | Immunogenic composition | |
| Creasy | Daugherty et al.(43) Pub. Date: Mar. 22, 2012 | |
| EA043165B1 (ru) | МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МЕНИНГОКОККОВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ fHbp |