EA043487B1

EA043487B1 - BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM 8 STRAIN USED AS A PROBIOTIC

Info

Publication number: EA043487B1
Application number: EA202200070
Authority: EA
Inventors: Елена Андрияновна Терешкова
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "АВАН"
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2023-05-26

Description

Область техники, к которой относится изобретение.The technical field to which the invention relates.

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, фармацевтической и пищевой промышленности и представляет собой штамм бифидобактерий вида Bifidobacterium bifidum, который может быть использован в лекарственных средствах, функциональных и специализированных пищевых продуктах, в том числе, биологически активных добавках к пище.The invention relates to biotechnology, medical microbiology, pharmaceutical and food industries and is a strain of bifidobacteria of the species Bifidobacterium bifidum, which can be used in medicines, functional and specialized food products, including biologically active food additives.

Уровень техники.State of the art.

Бифидобактерий являются основными представителями индигенной микрофлоры человека. Описаны следующие основные функции бифидобактерий в организме человека: бифидобактерий образуют основу микрофлоры, в результате высокой адгезивности к слизистой оболочке кишечника и определяют основные ниши сосуществования для других микроорганизмов, стабилизируют биопленку кишечника; укрепляют эпителиальный барьер кишечника, необходимы для созревания эпителиоцитов; белок клеток бифидобактерий содержит все незаменимые аминокислоты, включая триптофан (Терешкова Е.А. и др., 2020; Иванова Е.В., 2018).Bifidobacteria are the main representatives of the indigenous human microflora. The following main functions of bifidobacteria in the human body are described: bifidobacteria form the basis of the microflora, as a result of high adhesiveness to the intestinal mucosa and determine the main coexistence niches for other microorganisms, stabilize the intestinal biofilm; strengthen the intestinal epithelial barrier, necessary for the maturation of epithelial cells; Bifidobacteria cell protein contains all essential amino acids, including tryptophan (Tereshkova E.A. et al., 2020; Ivanova E.V., 2018).

Вид Bifidobacterium bifidum согласно современным исследованиям преобладает в кишечном микробиоценозе и необходим для нормального функционирования организма человека (Иванова Е.В., 2018; Turroni F. et al., 2019). Вид Bifidobacterium bifidum является доминирующим видом у лиц с нормальным составом микрофлоры и с начальными степенями дисбиоза 1-2 степени. При глубоких нарушениях в микросимбиоценозе (3 степень дисбиоза) выявляемость вида Bifidobacterium bifidum снижается (Иванова Е.В., 2018).The species Bifidobacterium bifidum, according to modern research, predominates in the intestinal microbiocenosis and is necessary for the normal functioning of the human body (Ivanova E.V., 2018; Turroni F. et al., 2019). The species Bifidobacterium bifidum is the dominant species in individuals with a normal microflora composition and with initial degrees of dysbiosis of 1-2 degrees. With deep disturbances in microsymbiocenosis (grade 3 dysbiosis), the detection of the species Bifidobacterium bifidum decreases (Ivanova E.V., 2018).

В литературе имеется много данных, свидетельствующих о том, что Bifidobacterium bifidum может взаимодействовать с человеком и с микроорганизмами микрофлоры кишечника с помощью различных механизмов, в частности, активировать иммунитет человека, адгезировать на слизистую оболочку кишечника и метаболизировать гликаны, такие как муцин (Turroni F. et al., 2019). Примечательно, что вид Bifidobacterium bifidum является единственным представителем среди всех признанных видов бифидобактерий, способным к росту посредством метаболизма муцина (Ruas-Madiedo P. et al., 2008, Turroni F. et al., 2011). Причем метаболизм муцина, осуществляемый Bifidobacterium bifidum, может активировать выработку муцина, тем самым увеличивая глубину слоя слизи, обволакивающей слизистую оболочку, и, таким образом, усиливая функцию эпителиального барьера (Rokhsefat S. et al., 2016). Данные свойства позволяют отнести представителей данного вида бифидобактерий к пробиотическим микроорганизмам.There is a lot of data in the literature indicating that Bifidobacterium bifidum can interact with humans and with microorganisms of the intestinal microflora through various mechanisms, in particular, activate the human immune system, adhere to the intestinal mucosa and metabolize glycans such as mucin (Turroni F. et al., 2019). It is noteworthy that the species Bifidobacterium bifidum is the only representative among all recognized species of bifidobacteria that is capable of growth through mucin metabolism (Ruas-Madiedo P. et al., 2008, Turroni F. et al., 2011). Moreover, the metabolism of mucin carried out by Bifidobacterium bifidum can activate the production of mucin, thereby increasing the depth of the mucus layer enveloping the mucous membrane, and thus enhancing the function of the epithelial barrier (Rokhsefat S. et al., 2016). These properties make it possible to classify representatives of this type of bifidobacteria as probiotic microorganisms.

Штамм Bifidobacterium bifidum 1 и Bifidobacterium bifidum 791 в составе отечественных препаратовпробиотиков применяется в широком масштабе во всех возрастных группах с 1972 года по настоящее время (Терешкова Е.А. и др., 2020).Strain Bifidobacterium bifidum 1 and Bifidobacterium bifidum 791 as part of domestic probiotic preparations have been used on a large scale in all age groups from 1972 to the present (Tereshkova E.A. et al., 2020).

В современной концепции функционального питания существенным весом обладают пребиотики и синбиотики. Согласно общепринятому в научной литературе определению, пребиотики - это пищевые ингредиенты, сочетающие следующие признаки: 1) устойчивые к желудочному соку, гидролизу пищеварительными ферментами человека, и не всасывающиеся в тонком кишечнике, 2) ферментируемые кишечной микрофлорой 3) избирательно стимулируют рост и/или активность одной или ограниченного числа групп бактерий микробиоты кишечника, которые положительно влияют на здоровье хозяина. Смесь синергетически взаимодействующих пробиотиков и пребиотиков, в которой они взаимно усиливают эффективность друг друга, называют синбиотиками (Gibson G.R., Roberfroid M.B., 1995). Также пребиотики часто связывают с так называемым бифидогенным эффектом (Roberfroid M. et al., 2010).In the modern concept of functional nutrition, prebiotics and synbiotics play a significant role. According to the generally accepted definition in the scientific literature, prebiotics are food ingredients that combine the following characteristics: 1) resistant to gastric juice, hydrolysis by human digestive enzymes, and not absorbed in the small intestine, 2) fermentable by intestinal microflora 3) selectively stimulate growth and/or activity one or a limited number of groups of bacteria in the gut microbiota that have a positive effect on the health of the host. A mixture of synergistically interacting probiotics and prebiotics, in which they mutually enhance each other’s effectiveness, is called synbiotics (Gibson G.R., Roberfroid M.B., 1995). Prebiotics are also often associated with the so-called bifidogenic effect (Roberfroid M. et al., 2010).

Известен штамм Bifidobacterium bifidum 792 (патент RU 2215028), который выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, активно размножающийся в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования с высокой концентрацией бифидобактерий. Обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и гнилостной микрофлоры. Это позволяет получить кисломолочные, ферментированные и неферментированные пищевые продукты, закваски, гигиенические и косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, обеспечивающие нормализацию микробиоценозов организма человека. Известны штаммы Bifidobacterium bifidum 79-32 (патент RU 2314340) и Bifidobacterium bifidum B-UH ВКПМ Ac-1875 (патент RU 2453592), выделенные из содержимого кишечника здорового ребенка грудного возраста, которые, кроме указанных выше свойств, заквашивают, либо сквашивают молоко.The known strain Bifidobacterium bifidum 792 (patent RU 2215028), which is isolated from the intestinal contents of a healthy infant, actively multiplies in a nutrient medium with the accumulation of production biomass in a short period of cultivation with a high concentration of bifidobacteria. It has acid-forming and inhibitory properties against pathogenic and putrefactive microflora. This makes it possible to obtain fermented milk, fermented and non-fermented food products, starter cultures, hygiene and cosmetic products, dietary supplements and bacterial preparations that ensure the normalization of microbiocenoses of the human body. Known strains are Bifidobacterium bifidum 79-32 (patent RU 2314340) and Bifidobacterium bifidum B-UH VKPM Ac-1875 (patent RU 2453592), isolated from the intestinal contents of a healthy infant, which, in addition to the above properties, ferment or ferment milk.

Однако, для указанных штаммов не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам, что осложняет возможность их применения в качестве активного компонента лекарственных препаратов в комплексной терапии ряда заболеваний. Также, для всех указанных штаммов видовая принадлежность не подтверждена современными молекулярно-генетическими методами, что для выделенных из природных источников микроорганизмов в настоящее время является обязательным (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 5).However, for these strains no information is provided on resistance to antibacterial substances, which complicates the possibility of their use as an active component of drugs in the complex therapy of a number of diseases. Also, for all of these strains, the species identity has not been confirmed by modern molecular genetic methods, which is currently mandatory for microorganisms isolated from natural sources (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 5).

Известен штамм Bifidobacterium bifidum 791/БАГ (патент RU 2165454), полученный селекцией штамма Bifidobacterium bifidum 791. Штамм более устойчив к повреждающим факторам сред культивирования и агрессивных сред гастроинтестинального тракта человека, обеспечивает утилизацию более широкого спектра аминокислот, т. е. обладает более высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение препаратов и продуктов на его основе с более длительнымиThe known strain Bifidobacterium bifidum 791/BAG (patent RU 2165454), obtained by selection of the strain Bifidobacterium bifidum 791. The strain is more resistant to damaging factors of cultivation media and aggressive environments of the human gastrointestinal tract, ensures the utilization of a wider range of amino acids, i.e. has higher viability and colonizing properties, which ensures the production of drugs and products based on it with longer

- 1 043487 сроками хранения и более высокими лечебно-профилактическими свойствами. Однако, для указанного штамма также не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам, что осложняет возможность его применения как активного компонента лекарственных препаратов в комплексной терапии ряда заболеваний.- 1 043487 shelf life and higher therapeutic and prophylactic properties. However, for this strain there is also no information on resistance to antibacterial substances, which complicates the possibility of its use as an active component of drugs in the complex therapy of a number of diseases.

Известен штамм Bifidobacterium bifidum OV-19 (патент RU 2375444), выделенный из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, который, кроме указанных выше свойств, устойчив к широкому спектру антибиотиков, а также сквашивает молоко с образованием ровного сгустка.The known strain of Bifidobacterium bifidum OV-19 (patent RU 2375444), isolated from the intestinal contents of a healthy infant, which, in addition to the above properties, is resistant to a wide range of antibiotics, and also ferments milk to form an even curd.

Недостатком всех указанных выше штаммов является то, что ни на уровне генотипа, ни на уровне фенотипа не определено отношение к муцину и желчным солям, что, как указывалось выше, является важными особенностями, влияющими на эффективность штамма, как пробиотика.The disadvantage of all the above strains is that neither at the genotype nor at the phenotypic level is the relationship to mucin and bile salts determined, which, as mentioned above, are important features affecting the effectiveness of the strain as a probiotic.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является штамм Bifidobacterium IATA-ES2 WO2010007198A1, выделенный из фекалий здорового ребенка на грудном вскармливании и идентифицированный секвенированием 16S рРНК как представитель вида Bifidobacterium bifidum. Штамм предложено применять с целью улучшения защитных функций и снижения риска заболеваний. Показаны следующие механизмы его действия: 1) регуляция гликозилирования кишечника, благоприятствующую таковому у здоровых людей, 2) модуляция взаимодействия между эпителиальными клетками и микробиотой кишечника, способствующую адгезии полезных бифидобактерий, и 3) регуляцию иммунологического ответа. Однако, для указанного штамма не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам.The closest to the claimed invention is the Bifidobacterium strain IATA-ES2 WO2010007198A1, isolated from the feces of a healthy breastfed child and identified by 16S rRNA sequencing as a representative of the species Bifidobacterium bifidum. The strain is proposed to be used to improve protective functions and reduce the risk of diseases. The following mechanisms of its action have been shown: 1) regulation of intestinal glycosylation, which favors that in healthy people, 2) modulation of the interaction between epithelial cells and intestinal microbiota, promoting the adhesion of beneficial bifidobacteria, and 3) regulation of the immunological response. However, information on resistance to antibacterial substances is not provided for this strain.

Для всех указанных выше штаммов не приведена оценка способности ферментировать селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты - пребиотики, что ограничивает возможность их применения в синбиотических функциональных и специализированных продуктах питания. Данная особенность, как указывалось выше, является основным критерием для разработки на основании штамма синбиотических продуктов. Изучение эффективности in vivo либо не проводилось, либо проводилось на животных моделях, т.е. полученные результаты не могут в полной мере быть перенесены на человека.For all of the above strains, there is no assessment of the ability to ferment carbohydrate substrates that selectively stimulate the growth of bifidobacteria - prebiotics, which limits the possibility of their use in synbiotic functional and specialized food products. This feature, as mentioned above, is the main criterion for the development of synbiotic products based on the strain. In vivo efficacy studies have either not been conducted or have been conducted in animal models, i.e. The results obtained cannot be fully transferred to humans.

Раскрытие сущности изобретения.Disclosure of the invention.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов, с подтвержденной молекулярно-генетическими методами исследования принадлежностью к виду Bifidobacterium bifidum, охарактеризованного по показателям необходимым для включения в состав пробиотических лекарственных средств, функциональных и специализированных пищевых продуктов, в том числе, биологически активных добавок к пище.The objective of the present invention is to obtain a strain of microorganisms confirmed by molecular genetic methods to belong to the species Bifidobacterium bifidum, characterized by the indicators necessary for inclusion in the composition of probiotic medicines, functional and specialized food products, including biologically active food additives.

При решении поставленной задачи достигаются следующие технические результаты: штамм является антагонистом патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, сбраживает молоко с образованием сгустка, отличается активным ростом и образованием органических кислот в средах, содержащих селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты - пребиотики, что обусловливает усиление антагонизма против условно-патогенных микроорганизмов. Штамм устойчив к антимикробным веществам канамицину, гентамицину, амикацину. В результате полногеномного исследования показано, что штамм характеризуется наличием генов, кодирующих пептиды, которые отвечают за адгезию к муцину и слизистой кишечника, а также генов, кодирующих ферменты, осуществляющие гидролиз муцина. В результате полногеномного исследования показано, что штамм характеризуется наличием генов, отвечающих за гидролиз желчных солей, что указывает на устойчивость к желчи и участие в регулировании трансформации указанной группы веществ в цикле печень-кишечник-печень, способствуя пищеварению. Применение ферментированных продуктов и бактерийных препаратов на основе заявляемого штамма приводит к исчезновению клинических проявлений дисбактериоза (дисбиоза) кишечника, боли в желудке, улучшению функции иммунной системы, улучшению общего состояния, повышению работоспособности.In solving this problem, the following technical results are achieved: the strain is an antagonist of pathogenic and opportunistic microorganisms, ferments milk with the formation of a curd, is characterized by active growth and the formation of organic acids in media containing carbohydrate substrates that selectively stimulate the growth of bifidobacteria - prebiotics, which causes increased antagonism against opportunistic microorganisms. The strain is resistant to the antimicrobial substances kanamycin, gentamicin, and amikacin. As a result of a genome-wide study, it was shown that the strain is characterized by the presence of genes encoding peptides that are responsible for adhesion to mucin and the intestinal mucosa, as well as genes encoding enzymes that hydrolyze mucin. As a result of a genome-wide study, it was shown that the strain is characterized by the presence of genes responsible for the hydrolysis of bile salts, which indicates resistance to bile and participation in regulating the transformation of this group of substances in the liver-intestinal-liver cycle, promoting digestion. The use of fermented products and bacterial preparations based on the claimed strain leads to the disappearance of clinical manifestations of intestinal dysbiosis (dysbiosis), stomach pain, improved immune system function, improved general condition, and increased performance.

Осуществление изобретенияCarrying out the invention

Указанный технический результат достигнут получением нового штамма бактерий Bifidobacterium bifidum 8, который выделен из содержимого кишечника здорового человека, идентифицирован по 16S рРНК, и депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ Курчатовский институт - ГосНИИгенетика, коллекционный номер AC-2136.The specified technical result was achieved by obtaining a new strain of bacteria Bifidobacterium bifidum 8, which was isolated from the intestinal contents of a healthy person, identified by 16S rRNA, and deposited in the National Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms of the Kurchatov Institute Research Center - GosNIIgenetika, collection number AC-2136.

Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.The inventive strain has the following properties.

Полноразмерная последовательность гена, кодирующего 16S рибосомальную РНК, SEQ ID NO 1 на 100% гомологична типовому штамму вида Bifidobacterium bifidum DSM 20456 (ATCC 29521).The full-length sequence of the gene encoding 16S ribosomal RNA, SEQ ID NO 1, is 100% homologous to the type strain of the species Bifidobacterium bifidum DSM 20456 (ATCC 29521).

Культурально-морфологические свойстваCultural and morphological properties

Облигатный анаэроб, оптимальная температура роста 36-38°C.Obligate anaerobe, optimal growth temperature 36-38°C.

Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие прямые или слегка изогнутые палочки с утолщением или бифуркацией на одном или обоих концах. Располагаются по одной, чаще по 2 или скоплениями. Характерной особенностью является расположение парных клеток под углом 90° друг к другу на поздних фазах роста.Gram-positive, non-motile, non-sporulating, straight or slightly curved rods with thickening or bifurcation at one or both ends. They are located one at a time, usually 2 at a time or in clusters. A characteristic feature is the arrangement of paired cells at an angle of 90° to each other in the later phases of growth.

При культивировании в среде Блаурокка в модификации Г. И. Гончаровой при температуре 37-38°CWhen cultivated in Blaurock medium modified by G. I. Goncharova at a temperature of 37-38°C

- 2 043487 в течение 36-48 ч образует колонии белого цвета в виде слаборасширяющихся конусов длиной до 10 мм.- 2 043487 within 36-48 hours forms white colonies in the form of slightly expanding cones up to 10 mm long.

При культивировании на поверхности агаризованной (плотной) среды Bifidobacterium Broth фирмы Himedia в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer, температура 37-38°C, продолжительность 72 ч) образует плоские сероватые колонии R-формы, диаметром до 5 мм.When cultivated on the surface of an agar (solid) medium, Bifidobacterium Broth from Himedia under anaerobic conditions (bioMerieux GENbox anaer, temperature 37-38°C, duration 72 hours) forms flat grayish R-form colonies with a diameter of up to 5 mm.

Физиолого-биохимические свойства штаммаPhysiological and biochemical properties of the strain

Штамм желатин не разжижает, каталазу не продуцирует, молоко сквашивает с образованием сгустка. Утилизирует глюкозу без образования газа, с образованием молочной и уксусной кислот, снижая pH среды до 3,8 - 4,2. Утилизирует сахарозу, лактозу, маннозу, целлобиозу. Не утилизирует: арабинозу, ксилозу, инулин (высокой степени очистки), салицин, сорбит.The strain does not liquefy gelatin, does not produce catalase, and ferments milk to form a curd. Utilizes glucose without gas formation, with the formation of lactic and acetic acids, reducing the pH of the medium to 3.8 - 4.2. Utilizes sucrose, lactose, mannose, cellobiose. Does not utilize: arabinose, xylose, inulin (highly purified), salicin, sorbitol.

Штамм устойчив к канамицину, гентамицину, амикацину. Штамм чувствителен к азитромицину, амоксицилину, кларитромицину, доксициклину, тетрациклину, цефтриаксону, ванкомицину, цефепиму, линкомицину, имипенему. В отношении, левофлоксацина, метронидазола, триметоприма, ципрофлоксацина, офлоксацина является промежуточным с учетом концентрации, минимально подавляющей рост (см. примеры).The strain is resistant to kanamycin, gentamicin, amikacin. The strain is sensitive to azithromycin, amoxicillin, clarithromycin, doxycycline, tetracycline, ceftriaxone, vancomycin, cefepime, lincomycin, imipenem. In relation to levofloxacin, metronidazole, trimethoprim, ciprofloxacin, ofloxacin is intermediate, taking into account the concentration that minimally inhibits growth (see examples).

Штамм является активным антагонистом патогенных микроорганизмов. В присутствии пребиотиков фрутоолигосахаридов (ФОС), либо лактулозы в качестве единственного углевода в питательной среде отличается наибольшей степенью подавления микробных контаминантов пищи и возбудителей инфекционных заболеваний на примере тестовых штаммов Bacillus cereus и Staphylococcus aureus.The strain is an active antagonist of pathogenic microorganisms. In the presence of prebiotics frutooligosaccharides (FOS), or lactulose as the only carbohydrate in the nutrient medium, it is distinguished by the highest degree of suppression of microbial food contaminants and pathogens of infectious diseases using the example of test strains Bacillus cereus and Staphylococcus aureus.

Установлена безвредность штамма на белых беспородных мышах массой 14-16 г. Суспензию лиофилизированного штамма вводили из расчета примерно 1х10⁹ КОЕ. В течение 5 суток все мыши остались живы и не потеряли в весе.The harmlessness of the strain was established on white outbred mice weighing 14-16 g. A suspension of the lyophilized strain was administered at a rate of approximately 1x10 ⁹ CFU. Within 5 days, all mice remained alive and did not lose weight.

Штамм хранится в лиофлизированном виде в сахарозо-желатиновой среде высушивания не менее 5 лет в герметично укупоренных флаконах без потери указанных свойств.The strain is stored in lyophilized form in a sucrose-gelatin drying medium for at least 5 years in hermetically sealed vials without loss of these properties.

Пример 1.Example 1.

Для подтверждения антагонистической активности штамма суспензию лиофилизата, восстановленного в физиологическом растворе, высевали на чашки Петри со средой MPC-5 штрихом по диаметру. Инкубировали культуру в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer) при 37°C в течение 48 часов. После этого перпендикулярно зоне роста штамма, но не касаясь ее, высевали тестовые штаммы, используя для каждого отдельную чашку. Через 20 часов определяли зону отсутствия роста (табл. 1). Штамм Bifidobacterium bifidum 8 показал высокую антагонистическую активность в отношении тест-штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.To confirm the antagonistic activity of the strain, a suspension of lyophilisate reconstituted in physiological solution was seeded onto Petri dishes with MPC-5 medium with a streak along the diameter. The culture was incubated under anaerobic conditions (bioMerieux GENbox anaer) at 37°C for 48 hours. After this, test strains were sown perpendicular to the growth zone of the strain, but without touching it, using a separate cup for each. After 20 hours, a zone of no growth was determined (Table 1). Strain Bifidobacterium bifidum 8 showed high antagonistic activity against test strains of pathogenic and opportunistic microorganisms.

Таблица 1Table 1

Антагонистическая активность штамма Bifidobacterium bifidum 8Antagonistic activity of Bifidobacterium bifidum 8 strain

Тест-штамм Test strain Зона отсутствия роста, мм Zone of no growth, mm Staphylococcus aureus 209 Staphylococcus aureus 209 20±2 20±2 Escherichia coli 157 Escherichia coli 157 27±1 27±1 Shigella flexneri 170 Shigella flexneri 170 21±1 21±1 Shigella sonnei 5063 Shigella sonnei 5063 31±1 31±1 Proteus vulgaris 177 Proteus vulgaris 177 28±2 28±2 Proteus mirabilis H-237 Proteus mirabilis H-237 30±3 30±3

Пример 2.Example 2.

Лиофилизированную культуру штамма Bifidobacterium bifidum 8 ресуспендировали в физиологическом растворе и инокулировали предварительно подвергнутую пастеризации 10% суспензию обрата молока из расчета примерно 2х10⁶ КОЕ/мл. Инкубацию проводили при 37°C в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 2. Штамм Bifidobacterium bifidum 8 сквашивает молоко с образованием сгустка.A lyophilized culture of the Bifidobacterium bifidum 8 strain was resuspended in physiological solution and inoculated with a previously pasteurized 10% skim milk suspension at a rate of approximately 2x10 ⁶ CFU/ml. Incubation was carried out at 37°C for 48 hours. The results are presented in Table 2. Strain Bifidobacterium bifidum 8 ferments milk to form a curd.

Таблица 2table 2

Показатели сквашивания молока штаммом Bifidobacterium bifidum 8Indicators of milk fermentation by Bifidobacterium bifidum 8 strain

Время инкубации Incubation time КОЕ/мл CFU/ml pH pH Титруемая кислотность, °Т Titratable acidity, °T Сгусток Clot 12 ч 12 h lx 10⁷ lx 10 ⁷ 5,8 5.8 46 46 Отсутствует Absent 24 ч 24 hours 8х10⁷ 8x10 ⁷ 4,2 4.2 92 92 Со сгустком With a clot

Пример 3.Example 3.

Подтверждение активного роста штамма Bifidobacterium bifidum 8 и образованием органических кислот в средах, содержащих селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты пребиотики, а также их синергетического эффекта против условно-патогенных микроорганизмов проводили по описанному ранее методу (Karetkin B.A. et al., 2019). Представители вида B. cereus являются контаминатами пищевых продуктов и возбудителями кишечных инфекций. В качестве тестового исполь- 3 043487 зовали штамм B. cereus ATCC 9634. Ферментацию смешанной культуры бифидобактерий и тест-штамма проводили при температуре 37°C в анаэробных условиях (2% углекислого газа, 98% азота) при постоянном перемешивании в жидкой среде, содержащей в качестве единственного углевода 1% одного из известных коммерческих пребиотиков: фруктоолигосахариды (ФОС, Orafti ® P95, BENEO ORAFTI, Бельгия), изомальтулоза (Palatinose™, BENEO Palatinit GmbH, Германия), лактулоза сухая Лактусан (ООО Фелицата Холдинг, РФ) и D-раффиноза (ООО ДиаМ, РФ). В начальный момент эксперимента и после 9 ч роста оценивали численность обоих микроорганизмов высевом на селективные среды. Определение кислот проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Agilent 1220 с рефрактометрическим детектором и колонкой Hi-Plex H (4.6x250 мм). Заявляемый штамм Bifidobacterium bifidum 8 характеризуется активным ростом и наибольшим подавлением тест-штамм в синбиотической композиции с ФОС и лактулозой (табл. 3).Confirmation of the active growth of the Bifidobacterium bifidum 8 strain and the formation of organic acids in media containing carbohydrate substrates that selectively stimulate the growth of bifidobacteria, prebiotics, as well as their synergistic effect against opportunistic microorganisms was carried out according to the previously described method (Karetkin B.A. et al., 2019). Representatives of the species B. cereus are food contaminants and causative agents of intestinal infections. The B. cereus strain ATCC 9634 was used as a test strain. Fermentation of a mixed culture of bifidobacteria and the test strain was carried out at a temperature of 37°C under anaerobic conditions (2% carbon dioxide, 98% nitrogen) with constant stirring in a liquid medium containing as the only carbohydrate, 1% of one of the well-known commercial prebiotics: fructooligosaccharides (FOS, Orafti ® P95, BENEO ORAFTI, Belgium), isomaltulose (Palatinose™, BENEO Palatinit GmbH, Germany), dry lactulose Lactusan (Felitsata Holding LLC, Russia) and D -raffinose (DiaM LLC, Russian Federation). At the initial moment of the experiment and after 9 hours of growth, the number of both microorganisms was assessed by plating on selective media. The determination of acids was carried out by high-performance liquid chromatography on an Agilent 1220 chromatograph with a refractometric detector and a Hi-Plex H column (4.6x250 mm). The claimed strain Bifidobacterium bifidum 8 is characterized by active growth and the greatest suppression of the test strain in a synbiotic composition with FOS and lactulose (Table 3).

Таблица 3Table 3

Влияние коммерческих пребиотиков на активность штамма Bifidobacterium bifidum 8 против B. cereus ATCC 9634Effect of commercial prebiotics on the activity of Bifidobacterium bifidum 8 strain against B. cereus ATCC 9634

Субстрат Substrate Кон. численность В. bifidum 8, log(KOE/мл) Con. number of B. bifidum 8, log(KOE/ml) Кон. pH Con. pH Продукция кислот, мМ Acid production, mM В. cereus ATCC 9634 B. cereus ATCC 9634 Мол. Mol. Укс. Ux. Кон. числ., logfKOE/мл) Con. number, logfKOE/ml) Изменение числен. Х9-Х0, КОЕ/мл Change in number X9-X0, CFU/ml ФОС FOS 9,5 9.5 5,30 5.30 7,8 7.8 15,2 15.2 5,9 5.9 Минус 1,6x10⁶ Minus 1.6x10 ⁶ Раффиноза Raffinose 9,4 9.4 5,90 5.90 5,0 5.0 5,8 5.8 6,7 6.7 4,1х10⁶ 4.1x10 ⁶ Изомальтулоза Isomaltulose 9,1 9.1 6,01 6.01 6,6 6.6 4,0 4.0 7,0 7.0 8,7x10⁶ 8.7x10 ⁶ Лактулоза Lactulose 9,5 9.5 4,63 4.63 11,4 11.4 31,2 31.2 4,8 4.8 Минус 3,2x10⁶ Minus 3.2x10 ⁶

Staphylococcus aureus считается одной из основных причин энтероколита и диареи у пациентов, прошедших курс лечения антибиотиками в госпитальных условиях (Lo T.S., Borchardt S.M., 2009). Исследования проводили по аналогичной методике. Заявляемый штамм Bifidobacterium bifidum 8 характеризуется активным ростом и наибольшим подавлением тест-штамм S. aureus ATCC 43300 в синбиотической композиции с ФОС и лактулозой (табл. 4).Staphylococcus aureus is considered one of the main causes of enterocolitis and diarrhea in patients treated with antibiotics in a hospital setting (Lo T.S., Borchardt S.M., 2009). The studies were carried out using a similar technique. The claimed strain Bifidobacterium bifidum 8 is characterized by active growth and the greatest suppression of the test strain S. aureus ATCC 43300 in a synbiotic composition with FOS and lactulose (Table 4).

Таблица 4Table 4

Влияние коммерческих пребиотиков на активность штамма Bifidobacterium bifidum 8 против S. aureus ATCC 43300Effect of commercial prebiotics on the activity of Bifidobacterium bifidum 8 strain against S. aureus ATCC 43300

Субстрат Substrate Кон. численность В. bifidum 8, log (КОЕ/мл) Con. number B. bifidum 8, log (CFU/ml) Продукция кислот, мМ Acid production, mM S. aureus ATCC 43300 S. aureus ATCC 43300 Молочная Dairy Уксусная Vinegar Кон. численность, 1од(КОЕ/мл) Con. number, 1od (CFU/ml) Изменение численности Хю-Хо, КОЕ/мл Change in the number of Hu-Ho, CFU/ml ФОС FOS 9,7 9.7 6,7 6.7 13,7 13.7 7,7 7.7 3,5х10⁷ 3.5x10 ⁷ Раффиноза Raffinose 9,1 9.1 6,7 6.7 5,8 5.8 8,1 8.1 1,3χ10⁸ 1.3χ10 ⁸ Изомальтулоза Isomaltulose 9,4 9.4 6,9 6.9 17,5 17.5 8,1 8.1 Ι,ΙχΙΟ⁸ Ι,ΙχΙΟ ⁸ Лактулоза Lactulose 9,8 9.8 18,7 18.7 45,8 45.8 7,6 7.6 2,9χ10⁷ 2.9χ10 ⁷

Пример 4.Example 4.

Определяли чувствительность заявляемого штамма к антимикробным веществам дискодиффузионным методом и методом серийных разведений в жидкой питательной среде по МУК 4.2.1890-04.The sensitivity of the proposed strain to antimicrobial substances was determined by the disk diffusion method and the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium according to MUK 4.2.1890-04.

Суточную культуру штамма, полученную инкубированием в среде Блаурокка при температуре 37°C, стандартизовали стерильным забуференным физиологическим раствором до OD₅₆₀=2,1 и высевали по 0,1 мл полученной суспензии на чашки со средой Bifidobacterium Broth фирмы Himedia. На поверхность среды помещали диски с антибиотиками (см. табл. 5). Инкубацию проводили в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer) при температуре 37°C в течение 3 суток, после чего определяли диаметр зоны угнетения роста (табл. 5).A daily culture of the strain, obtained by incubation in Blaurock's medium at a temperature of 37°C, was standardized with sterile buffered saline to OD ₅₆₀ = 2.1 and 0.1 ml of the resulting suspension was sown onto dishes with Bifidobacterium Broth medium from Himedia. Disks with antibiotics were placed on the surface of the medium (see Table 5). Incubation was carried out under anaerobic conditions (bioMerieux GENbox anaer) at a temperature of 37°C for 3 days, after which the diameter of the growth inhibition zone was determined (Table 5).

- 4 043487- 4 043487

Таблица 5Table 5

Исследования чувствительности штамма Bifidobacterium bifidum 8 к антимикробным веществам диско-диффузионным методомStudies of the sensitivity of the Bifidobacterium bifidum 8 strain to antimicrobial substances using the disk diffusion method

Антимикробное вещество, доза на диске Antimicrobial substance, dose on disk Диаметр зоны задержки роста, мм Diameter of growth retardation zone, mm Чувствительность Sensitivity Амоксициллин 20 мкг Amoxicillin 20 mcg 36 36 Ч H Цефтриаксон 30 Ceftriaxone 30 24 24 Ч H Цефепим 30 мкг Cefepime 30 mcg 28 28 ч h Имипенем 10 мкг Imipenem 10 mcg 28 28 ч h Доксициклин 30 мкг Doxycycline 30 mcg 26 26 ч h Кларитромицин 30 мкг Clarithromycin 30 mcg 34 34 ч h Линкомицин 15 мкг Lincomycin 15 mcg 30 thirty ч h Ванкомицин 30 мкг Vancomycin 30 mcg 16 16 ч h Ципрофлоксацин 5 мкг Ciprofloxacin 5 mcg 8 8 п P Офлоксацин 5 мкг Ofloxacin 5 mcg 10 10 п P Амикацин 30 мкг Amikacin 30 mcg 0 0 У U

Для метода серийных разведений использовали жидкую питательную среду MRS с цистеином и аскорбиновой кислотой и антимикробные вещества (см. табл. 6) для биохимических исследований. Лекарственные препараты на основе данных веществ наиболее часто применяются в современной терапии. Для каждого вещества готовили серию последовательных двукратных разведений в стерильной среде от 512 до 0,125 мкг/мл. Инокулировали 10% суточной культурой штамма, предварительно стандартизованной по OD₅₆₀=1,5. Через 10 ч инкубирования при температуре 37°C в анаэробных условиях (2% углекислого газа, 98% азота) и при постоянном перемешивании измеряли мутность суспензии, кривые зависимости данной величины от концентрации антимикробного вещества носили сигмоидальный характер. Из зависимостей определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) и минимальную концентрация антимикробного вещества, при которой начинается наблюдаемое подавление роста (табл. 6). Определение данной величины связано со следующими соображениями. Для достижения лечебного действия необходимо попадание в кишечник человека или животного определенного количества живых клеток бифидобактерий, что может быть обеспечено только при минимальном воздействии антибактериальных веществ. Поэтому устойчивость определяли с учетом указанной величины, а не только с учетом МПК, как это принято для патогенных микроорганизмов, когда выживание доже небольшого количества клеток может привести к заболеванию.For the serial dilution method, we used MRS liquid nutrient medium with cysteine and ascorbic acid and antimicrobial substances (see Table 6) for biochemical studies. Medicines based on these substances are most often used in modern therapy. For each substance, a series of serial twofold dilutions was prepared in a sterile medium from 512 to 0.125 μg/ml. They were inoculated with a 10% daily culture of the strain, previously standardized to OD ₅₆₀ = 1.5. After 10 hours of incubation at a temperature of 37°C under anaerobic conditions (2% carbon dioxide, 98% nitrogen) and with constant stirring, the turbidity of the suspension was measured; the curves of the dependence of this value on the concentration of the antimicrobial substance were sigmoidal in nature. From the dependencies, the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum concentration of the antimicrobial substance at which the observed growth inhibition begins were determined (Table 6). The determination of this value is related to the following considerations. To achieve a therapeutic effect, a certain number of living bifidobacteria cells must enter the intestines of a person or animal, which can only be achieved with minimal exposure to antibacterial substances. Therefore, resistance was determined taking into account the specified value, and not only taking into account the MIC, as is customary for pathogenic microorganisms, when survival of even a small number of cells can lead to disease.

- 5 043487- 5 043487

Таблица 6Table 6

Исследование чувствительности штамма к антимикробным веществам методом серийных разведений в жидкой питательной средеStudy of strain sensitivity to antimicrobial substances using serial dilutions in a liquid nutrient medium

Антимикробное вещество Antimicrobial substance Минимальная концентрация начала наблюдаемого подавления роста, мкг/мл Minimum concentration for the onset of observed growth inhibition, µg/ml МПК, мкг/мл MIC, µg/ml Чувствительность Sensitivity Амоксицилин Amoxicillin 0,125 0.125 0,125 0.125 Ч H Цефтриаксон Ceftriaxone 0,125 0.125 1 1 Ч H Тетрациклин Tetracycline 0,125 0.125 2 2 ч h Доксициклин Doxycycline 0,25 0.25 2 2 ч h Азитромицин Azithromycin 0,125 0.125 0,125 0.125 ч h Кларитромицин Clarithromycin 0,125 0.125 0,125 0.125 ч h Ципрофлоксацин Ciprofloxacin 2 2 16 16 п P Левофлоксацин Levofloxacin 0,125 0.125 32 32 п P Метронидазол Metronidazole 0,5 0.5 16 16 п P Нифуроксазид Nifuroxazide 4 4 32 32 п P Триметоприм Trimethoprim 4 4 128 128 п P Канамицин Kanamycin 64 64 более 512 more than 512 У U Г ентамицин Gentamicin 16 16 128 128 У U

Штамм устойчив (У) к канамицину, гентамицину, амикацину. Чувствителен (Ч) к амоксицилину, цефтриаксону, цефепиму, имипенему, тетрациклину, доксициклину, азитромицину, кларитромицину, линкомицину, ванкомицину. В отношении офлоксацина, ципрофлоксацина, левофлоксацина, метронидазола, нифуроксазида, триметоприма является промежуточным (П) с учетом минимальной концентрации начала наблюдаемого подавления роста.The strain is resistant (R) to kanamycin, gentamicin, amikacin. Sensitive (S) to amoxicillin, ceftriaxone, cefepime, imipenem, tetracycline, doxycycline, azithromycin, clarithromycin, lincomycin, vancomycin. In relation to ofloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, metronidazole, nifuroxazide, trimethoprim, it is intermediate (I), taking into account the minimum concentration of the onset of observed growth inhibition.

Результаты полногеномного исследования показали отсутствие генов с маркерами устойчивости к тетрациклину tet(W) (SEQ ID NO: 2) и trp-tet(W) (SEQ ID NO: 3), что также подтверждено фенотипически.The results of a genome-wide study showed the absence of genes with tetracycline resistance markers tet(W) (SEQ ID NO: 2) and trp-tet(W) (SEQ ID NO: 3), which was also confirmed phenotypically.

Пример 5.Example 5.

Молекулярно-биологические признаки штамма определяли на основании полногеномного исследования.The molecular biological characteristics of the strain were determined based on a genome-wide study.

Анализ полученного генома показал, что штамм Bifidobacterium bifidum 8 не содержит плазмид.Analysis of the resulting genome showed that the Bifidobacterium bifidum 8 strain does not contain plasmids.

Анализ полученного генома показал наличие генов, кодирующих пептиды клеточной стенки, отвечающие за специфическую адгезию. Коллаген связывающий протеин участвует в адгезии к эпителию. Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 4) с пептидом фимбринального пили Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: BBA48285.1) составляет 99%.Analysis of the resulting genome showed the presence of genes encoding cell wall peptides responsible for specific adhesion. Collagen binding protein is involved in adhesion to the epithelium. The homology of the discovered structure (SEQ ID NO: 4) with the fimbrinal pili peptide of Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: BBA48285.1) is 99%.

Протеин, кодируемый геном OppA, отвечает за связывание с клетками эпителия кишечника Caco-2 (Guglielmetti S. ety al., 2008). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 5) с олигопептид связывающим протеином OppA Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: KLN80891.1) составляет 100%.The protein encoded by the OppA gene is responsible for binding to Caco-2 intestinal epithelial cells (Guglielmetti S. ety al., 2008). The homology of the discovered structure (SEQ ID NO: 5) with the oligopeptide binding protein OppA of Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: KLN80891.1) is 100%.

Образование трансальдолазы значительно увеличивает степень связывания клеток бактерий - представителей кишечной микробиоты с муцином (Gonzalez-Rodriguez I. et al., 2012). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 6) с трансальдолазой Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: WP003813255.1) составляет 100%.The formation of transaldolase significantly increases the degree of binding of bacterial cells - representatives of the intestinal microbiota - to mucin (Gonzalez-Rodriguez I. et al., 2012). The homology of the discovered structure (SEQ ID NO: 6) with the transaldolase of Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: WP003813255.1) is 100%.

Эндо альфа-N-ацетилгалактозаминидаза участвует в гидролитическом разложении муцина (отщеплении от пептидной цепи углеводных остатков). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 7) с эндо альфа-N-ацетилгалактозаминидазой Bifidobacterium bifidum ATCC 29521 (NCBI GenBank SEQ ID NO: BAQ97477.1) составляет 99%.Endo alpha-N-acetylgalactosaminidase is involved in the hydrolytic decomposition of mucin (cleavage of carbohydrate residues from the peptide chain). The homology of the discovered structure (SEQ ID NO: 7) with endo alpha-N-acetylgalactosaminidase Bifidobacterium bifidum ATCC 29521 (NCBI GenBank SEQ ID NO: BAQ97477.1) is 99%.

Одним из основных механизмов, обуславливающих устойчивость бактерий кишечника к солям желчи, секретируемым печенью, является их расщепление ферментами (Ruiz L. et al., 2013). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 8) с гидролазой солей желчи Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: AAR39435.1) составляет 99%.One of the main mechanisms that determine the resistance of intestinal bacteria to bile salts secreted by the liver is their breakdown by enzymes (Ruiz L. et al., 2013). The homology of the discovered structure (SEQ ID NO: 8) with bile salt hydrolase Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: AAR39435.1) is 99%.

Фосфопируват гидролаза также участвует в расщеплении желчных солей. Г омологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 9) с фосфопируват гидролазой Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: WP_003812660.1) составляет 100%.Phosphopyruvate hydrolase is also involved in the breakdown of bile salts. The homology of the discovered structure (SEQ ID NO: 9) with phosphopyruvate hydrolase of Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: WP_003812660.1) is 100%.

Пример 6.Example 6.

Использование штамма Bifidobacterium bifidum 8 в лекарственных средствах.Use of Bifidobacterium bifidum 8 strain in medicines.

- 6 043487- 6 043487

На основе штамма Bifidobacterium bifidum 8 получали лиофилизированную биомассу бифидобактерий. Из чистой культуры путем проведения 2-3 пассажей получали маточную культуру (инокулят) в среде Блаурокка по одному из известных способов. Инкубирование проводили при 37°C. Далее проводили культивирование с поддержанием pH в интервале 5,5-7,0. Полученную культуру, содержащую не менее 2х10⁹ КОЕ/мл, отделяли от среды культивирования с применением центрифугирования, сепарирования, либо других способов, применяемых для суспензий бактериальных клеток. К полученному концентрату добавляли сахарозо-желатиновую среду высушивания, замораживали во флаконах или на поддонах для сушки из пищевой легированной стали до температуры не выше минус 40-45°C и подвергали лиофильному высушиванию. Остаточная влажность составляла не более 5%. Полученную лиофилизированную биомассу, содержащую не менее 5х10¹⁰ КОЕ/г, используют в качестве активного компонента лекарственных средств, стандартизуя наполнителем из расчета разовой дозы (5-10)х10⁸ КОЕ.Based on the Bifidobacterium bifidum 8 strain, lyophilized bifidobacteria biomass was obtained. From a pure culture, by carrying out 2-3 passages, a mother culture (inoculum) was obtained in Blaurock's medium according to one of the known methods. Incubation was carried out at 37°C. Next, cultivation was carried out while maintaining the pH in the range of 5.5-7.0. The resulting culture, containing at least 2x10 ⁹ CFU/ml, was separated from the culture medium using centrifugation, separation, or other methods used for suspensions of bacterial cells. A sucrose-gelatin drying medium was added to the resulting concentrate, frozen in bottles or on drying trays made of food-grade alloy steel to a temperature not exceeding minus 40-45°C and subjected to freeze-drying. Residual humidity was no more than 5%. The resulting lyophilized biomass, containing at least 5x10 ¹⁰ CFU/g, is used as an active component of drugs, standardized with an excipient based on a single dose of (5-10)x10 ⁸ CFU.

Пример 7.Example 7.

Использование штамма Bifidobacterium bifidum 8 в функциональных и специализированных пищевых продуктах, в том числе, биологически активных добавках к пище.Use of Bifidobacterium bifidum 8 strain in functional and specialized food products, including biologically active food additives.

Полученную аналогично описанному в примере 6 методу лиофилизированную биомассу применяют в качестве основного ингредиента пробиотических биологически активных добавок к пище в различных товарных формах (порошки, капсулы и т.п.) из расчета 1 х 10⁸ - 1х10⁹ КОЕ в разовой дозе. Лиофилизированную биомассу бифидобактерий штамма Bifidobacterium bifidum 8 вносят в жидкие ферментированные продукты для заквашивания и сквашивания, либо для обогащения в ферментированные или не ферментированные продукты из расчета 106-10⁷ КОЕ в 1 г готового продукта. Благодаря этому получаемые продукты могут быть отнесены к функциональным продуктам питания.The lyophilized biomass obtained similarly to the method described in example 6 is used as the main ingredient of probiotic biologically active food additives in various commercial forms (powders, capsules, etc.) at the rate of 1 x 10 ⁸ - 1 x 10 ⁹ CFU per single dose. Lyophilized biomass of bifidobacteria strain Bifidobacterium bifidum 8 is added to liquid fermented products for fermentation and ripening, or for enrichment in fermented or non-fermented products at the rate of 106-10 ⁷ CFU per 1 g of finished product. Thanks to this, the resulting products can be classified as functional foods.

Пример 8.Example 8.

Полученную, как описано в примере 6, суспензию клеток штамма Bifidobacterium bifidum 8 в среде высушивания дозировали в пенициллиновые флаконы из расчета разовой дозы (5-10)х10⁸ КОЕ и лиофилизировали. Применение лиофилизированной биомассы в указанной разовой дозе 4 раза в день внутрь курсами от 8 до 32 дней у добровольцев мужчин и женщин в возрасте 45 лет, 61 год, 66 лет, 72 года, 93 года приводило к исчезновению выраженных болей в желудке, развившихся на фоне обострения хронического гастрита (без приема лекарственных препаратов); исчезновению проявлений дисбактериоза (дисбиоза) кишечника (метеоризм, боли в животе, нерегулярный стул, разжиженный стул, задержка стула); быстрому купированию симптомов ОРВИ (в течение 1-3 дней), особенно при приеме в ранние сроки заболевания; исчезновению лабиального герпеса; улучшению общего состояния, повышению физической, умственной активности, работоспособности, улучшению эмоционального состояния (исчезновение пониженного настроения, раздражительности, эмоциональной лабильности).The suspension of cells of the Bifidobacterium bifidum 8 strain obtained as described in example 6 in a drying medium was dosed into penicillin vials at the rate of a single dose of (5-10)x10 ⁸ CFU and lyophilized. The use of lyophilized biomass in the indicated single dose 4 times a day orally in courses from 8 to 32 days in male and female volunteers aged 45 years, 61 years, 66 years, 72 years, 93 years led to the disappearance of severe stomach pain that developed against the background exacerbation of chronic gastritis (without taking medications); disappearance of manifestations of intestinal dysbacteriosis (dysbiosis) (flatulence, abdominal pain, irregular stool, loose stool, stool retention); rapid relief of ARVI symptoms (within 1-3 days), especially when taken in the early stages of the disease; disappearance of labial herpes; improvement of general condition, increase in physical and mental activity, performance, improvement of emotional state (disappearance of low mood, irritability, emotional lability).

Пример 9.Example 9.

Женщина, 57 лет. Многократные курсы химиотерапии в связи с раком яичников. На этом фоне выраженный дисбактериоз (дисбиоз) кишечника, боли в животе, прием любых продуктов сопровождается метеоризмом, диарейный синдром с водянистым стулом. Употребляла кефир, обогащенный бифидобактерими штамма Bifidobacterium bifidum 8 в количестве 10⁶ КОЕ в 1 мл в течение 4 дней, первые два дня по 300 мл в день, последующее дни по 200 мл в день. Общий объем кефира 1 литр. Диарея полностью исчезла на второй день приема кефира, на четвертый день стул приобрел оформленную консистенцию, исчезли боли в животе, значительно уменьшился метеоризм, улучшилось общее состояние.Woman, 57 years old. Multiple courses of chemotherapy for ovarian cancer. Against this background, severe intestinal dysbacteriosis (dysbiosis), abdominal pain, taking any food is accompanied by flatulence, diarrhea syndrome with watery stools. I consumed kefir enriched with bifidobacterium strain Bifidobacterium bifidum 8 in an amount of 10 ⁶ CFU per 1 ml for 4 days, the first two days 300 ml per day, the subsequent days 200 ml per day. The total volume of kefir is 1 liter. Diarrhea completely disappeared on the second day of taking kefir, on the fourth day the stool acquired a formed consistency, abdominal pain disappeared, flatulence significantly decreased, and general condition improved.

Библиография.Bibliography.

1. Терешкова Е.А., Кареткин Б.А., Дорошенко Е.О., Ланских А.Г. Сорбированные пробиотики. Механизм действия. - М.: ТД ДеЛи, 2020 - 36 с.1. Tereshkova E.A., Karetkin B.A., Doroshenko E.O., Lanskikh A.G. Sorbed probiotics. Mechanism of action. - M.: TD DeLi, 2020 - 36 p.

2. Иванова Е.В. Роль бифидофлоры в ассоциативном симбиозе кишечной миробиоты человека. Дисс. д.м.н. Оренбург. 2018:295.2. Ivanova E.V. The role of bifid flora in the associative symbiosis of the human intestinal microbiota. Diss. Doctor of Medical Sciences Orenburg. 2018:295.

3. Turroni F., Duranti S., Milani C., Lugli G.A., van Sinderen D., Ventura M. Bifidobacterium bifidum: A Key Member of the Early Human Gut Microbiota. //Microorganisms. 2019, 9; 7(11).3. Turroni F., Duranti S., Milani C., Lugli G.A., van Sinderen D., Ventura M. Bifidobacterium bifidum: A Key Member of the Early Human Gut Microbiota. //Microorganisms. 2019, 9; 7(11).

4. Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., Fernandez-Garcia M., de los Reyes-Gavilan C.G., Margolles A. Mucin degradation by Bifidobacterium strains isolated from the human intestinal microbiota. //Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74, 1936-1940.4. Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., Fernandez-Garcia M., de los Reyes-Gavilan C.G., Margolles A. Mucin degradation by Bifidobacterium strains isolated from the human intestinal microbiota. //Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74, 1936-1940.

- 7 043487- 7 043487

5. Turroni F., Milani C., van Sinderen, D., Ventura, M. Genetic strategies for mucin metabolism in Bifidobacterium bifidum PRL2010: An example of possible human-microbe co-evolution. Gut Microbes 2011, 2, 183-189.5. Turroni F., Milani C., van Sinderen, D., Ventura, M. Genetic strategies for mucin metabolism in Bifidobacterium bifidum PRL2010: An example of possible human-microbe co-evolution. Gut Microbes 2011, 2, 183-189.

6. Rokhsefat S., Lin A.F., Comelli E.M. Mucin-Microbiota Interaction During Postnatal Maturation of the Intestinal Ecosystem: Clinical Implications. Dig. Dis. Sci. 2016, 61, 1473— 1486.6. Rokhsefat S., Lin A.F., Comelli E.M. Mucin-Microbiota Interaction During Postnatal Maturation of the Intestinal Ecosystem: Clinical Implications. Dig. Dis. Sci. 2016, 61, 1473—1486.

7. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics П The Journal of Nutrition. 1995, Vol. 125, p. 140114127. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics P The Journal of Nutrition. 1995, Vol. 125, p. 14011412

8. Roberfroid M., Gibson G.R., Hoyles L., et al. Prebiotic effects: metabolic and health benefits. //Br J Nutr. 2010, Vol. 104, S. 2, S1-S638. Roberfroid M., Gibson G.R., Hoyles L., et al. Prebiotic effects: metabolic and health benefits. //Br J Nutr. 2010, Vol. 104, S. 2, S1-S63

9. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 5: The Actinobacteria Editors: Whitman, W., Goodfellow, M., Kampfer, P., Busse, H.-J., Trujillo, M., Ludwig, W., Suzuki, K.-L, Parte, A. (Eds.) 20129. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 5: The Actinobacteria Editors: Whitman, W., Goodfellow, M., Kampfer, P., Busse, H.-J., Trujillo, M., Ludwig, W., Suzuki, K.-L, Parte, A (Eds.) 2012

10. Karetkin B. A., Guseva E. V., Evdokimova S. A. et al. A quantitative model of Bacillus cereus ATCC 9634 growth inhibition by bifidobacteria for synbiotic effect evaluation // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2019. Vol. 35. P. 8910. Karetkin B. A., Guseva E. V., Evdokimova S. A. et al. A quantitative model of Bacillus cereus ATCC 9634 growth inhibition by bifidobacteria for synbiotic effect evaluation // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2019. Vol. 35. P. 89

11. Lo T.S., Borchardt S.M. Antibiotic-associated diarrhea due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Diagnostic microbiology and infectious disease. 2009. Vol.63 (4), P. 388-38911. Lo T.S., Borchardt S.M. Antibiotic-associated diarrhea due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Diagnostic microbiology and infectious disease. 2009. Vol.63 (4), P. 388-389

12. Guglielmetti S., Tamagnini I., Mora D., Minuzzo M., Scarafoni A., Arioli S., Hellman J., Karp M., Parini C. Implication of an outer surface lipoprotein in adhesion of Bifidobacterium bifidum to Caco-2 cells. Applied and environmental microbiology, 2008, 74(15), 4695-470212. Guglielmetti S., Tamagnini I., Mora D., Minuzzo M., Scarafoni A., Arioli S., Hellman J., Karp M., Parini C. Implication of an outer surface lipoprotein in adhesion of Bifidobacterium bifidum to Caco -2 cells. Applied and environmental microbiology, 2008, 74(15), 4695-4702

13. Gonzalez-Rodriguez I., Sanchez B., Ruiz L., Turroni F., Ventura M., Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., Margolles A. Role of extracellular transaldolase from Bifidobacterium bifidum in mucin adhesion and aggregation. Applied and environmental microbiology, 2012,78(11),3992-3998.13. Gonzalez-Rodriguez I., Sanchez B., Ruiz L., Turroni F., Ventura M., Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., Margolles A. Role of extracellular transaldolase from Bifidobacterium bifidum in mucin adhesion and aggregation. Applied and environmental microbiology, 2012,78(11),3992-3998.

14. Ruiz L., Margolles A., Sanchez B. Bile resistance mechanisms in Lactobacillus and Bifidobacterium. //Frontiers in microbiology, 2013, 4, 39614. Ruiz L., Margolles A., Sanchez B. Bile resistance mechanisms in Lactobacillus and Bifidobacterium. //Frontiers in microbiology, 2013, 4, 396

- 8 043487- 8 043487

Перечень последовательностей.List of sequences.

<160>9 <210>1 <211>1534 < 212> DNA < 213> Bifidobacterium bifidum < 400> 1<160>9 <210>1 <211>1534 <212> DNA <213> Bifidobacterium bifidum <400> 1

ttttttgtgg ttttttgtgg agggttcgat agggttcgat tctggctcag tctggctcag gatgaacgct gatgaacgct ggcggcgtgc ggcggcgtgc ttaacacatg ttaacacatg 60 60 caagtcgaac caagtcgaac gggatccatc gggatccatc aagcttgctt aagcttgctt ggtggtgaga ggtggtgaga gtggcgaacg gtggcgaacg ggtgagtaat ggtgagtaat 120 120 gcgtgaccga gcgtgaccga cctgccccat cctgccccat gctccggaat gctccggaat agctcctgga agctcctgga aacgggtggt aacggggtggt aatgccggat aatgccggat 180 180 gttccacatg gttccacatg atcgcatgtg atcgcatgtg attgtgggaa attgtgggaa agattctatc agattctatc ggcgtgggat ggcgtgggat ggggtcgcgt ggggtcgcgt 240 240 cctatcagct cctatcagct tgttggtgag tgttggtgag gtaacggctc gtaacggctc accaaggctt accaaggctt cgacgggtag cgacggggtag ccggcctgag ccggcctgag 300 300 agggcgaccg agggcgaccg gccacattgg gccacattgg gactgagata gactgagata cggcccagac cggccgac tcctacggga tcctacggga ggcagcagtg ggcagcagtg 360 360 gggaatattg gggaatattg cacaatgggc cacaatggggc gcaagcctga gcaagcctga tgcagcgacg tgcagcgacg ccgcgtgagg ccgcgtgagg gatggaggcc gatggaggcc 420 420 ttcgggttgt ttcgggttgt aaacctcttt aaacctcttt tgtttgggag tgtttggggag caagccttcg caagccttcg ggtgagtgta ggtgagtgta cctttcgaat cctttcgaat 480 480 aagcgccggc aagcgccggc taactacgtg taactacgtg ccagcagccg ccagcagccg cggtaatacg cggtaatacg tagggcgcaa tagggcgcaa gcgttatccg gcgttatccg 540 540 gatttattgg gatttattgg gcgtaaaggg gcgtaaaggg ctcgtaggcg ctcgtaggcg gctcgtcgcg gctcgtcgcg tccggtgtga tccggtgtga aagtccatcg aagtccatcg 600 600 cttaacggtg cttaacggtg gatctgcgcc gatctgcgcc gggtacgggc gggtacggggc gggctggagt gggctggagt gcggtagggg gcggtagggg agactggaat agactggaat 660 660 tcccggtgta tcccggtgta acggtggaat acggtggaat gtgtagatat gtgtagatat cgggaagaac cgggaagaac accgatggcg accgatggcg aaggcaggtc aaggcaggtc 720 720 tctgggccgt tctggggccgt cactgacgct cactgacgct gaggagcgaa gaggagcgaa agcgtgggga agcgtgggga gcgaacagga gcgaacagga ttagataccc ttagatacc 780 780 tggtagtcca tggtagtcca cgccgtaaac cgccgtaaac ggtggacgct ggtggacgct ggatgtgggg ggatgtgggg cacgttccac cacgttccac gtgttccgtg gtgttccgtg 840 840 tcggagctaa tcggagctaa cgcgttaagc cgcgttaagc gtcccgcctg gtcccgcctg gggagtacgg ggggagtacgg ccgcaaggct ccgcaaggct aaaactcaaa aaaactcaaa 900 900 gaaattgacg gaaattgacg ggggcccgca ggggcccgca caagcggcgg caagcggcgg agcatgcgga agcatgcgga ttaattcgat ttaattcgat gcaacgcgaa gcaacgcgaa 960 960 gaaccttacc gaaccttacc tgggcttgac tggggcttgac atgttcccga atgttcccga cgacgccaga cgacgccaga gatggcgttt gatggcgttt cccttcgggg cccttcgggg 1020 1020 cgggttcaca cggggttcaca ggtggtgcat ggtggtgcat ggtcgtcgtc ggtcgtcgtc agctcgtgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gtgagatgtt gggttaagtc gggttaagtc 1080 1080 ccgcaacgag ccgcaacgag cgcaaccctc cgcaaccctc gccccgtgtt gccccgtgtt gccagcacgt gccagcacgt tatggtggga tatggtggga actcacgggg actcacgggg 1140 1140 gaccgccggg gaccgccggg gttaactcgg gttaactcgg aggaaggtgg aggaaggtgg ggatgacgtc ggatgacgtc agatcatcat agatcatcat gccccttacg gccccttacg 1200 1200 tccagggctt tccaggggctt cacgcatgct cagcatgct acaatggccg acaatggccg gtacagcggg gtacagcggg atgcgacatg atgcgacatg gcgacatgga gcgacatgga 1260 1260 gcggatccct gcggatccct gaaaaccggt gaaaaccggt ctcagttcgg ctcagttcgg atcggagcct atcggagcct gcaacccggc gcaacccggc tccgtgaagg tccgtgaagg 1320 1320 cggagtcgct cggagtcgct agtaatcgcg agtaatcgcg gatcagcaac gatcagcaac gccgcggtga gccgcggtga atgcgttccc atgcgttccc gggccttgta gggccttgta 1380 1380 cacaccgccc cacaccgccc gtcaagtcat gtcaagtcat gaaagtgggc gaaagtggggc agcacccgaa agcacccgaa gccggtggcc gccggtggcc taaccccttg taaccccttg 1440 1440 tgggatggag tgggatggag ccgtctaagg ccgtctaagg tgaggctcgt tgaggctcgt gattgggact gattggact aagtcgtaac aagtcgtaac aaggtagccg aaggtagccg 1500 1500 taccggaagg taccggaagg tgcggctgga tgcggctgga tcacctcctt tcacctcctt tcta tcta 1534 1534

- 9 043487 < 210> 2 < 211> 23 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence < 400> 2 tggaattctt gcccatgtag acg 23 < 210> 3 < 211> 22 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence < 400> 3 attcagcgac gaactggcac ag 22 < 210> 4 < 211> 534 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum < 400> 4- 9 043487 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 tggaattctt gcccatgtag acg 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 attcagcgac gaactggcac ag 22 < 210> 4 < 211> 534 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum < 400> 4

Met Lys Phe Lys Lys Leu Phe Ala Gly Vai Ala Ala Ala Ala Thr LeuMet Lys Phe Lys Lys Leu Phe Ala Gly Vai Ala Ala Ala Ala Thr Leu

5 10155 1015

Leu Ala Gly Met Ala Phe Gly Thr Gly Ala Ala Asn Ala Ala GluThrLeu Ala Gly Met Ala Phe Gly Thr Gly Ala Ala Asn Ala Ala GluThr

25302530

Thr Vai Asp Thr Ala Ala Thr Vai Thr Phe Lys Ala Ser Lys Glu Lys 35 4045Thr Vai Asp Thr Ala Ala Thr Vai Thr Phe Lys Ala Ser Lys Glu Lys 35 4045

Gin Leu Thr Ser Ala Gin Leu Ser Ala Tyr Lys He Ala Asp Tyr Vai 50 5560Gin Leu Thr Ser Ala Gin Leu Ser Ala Tyr Lys He Ala Asp Tyr Vai 50 5560

Asn Tyr Gly Thr Ala Lys Thr Pro Vai Tyr Gly Vai Lys Thr Ala Ala 65 70 7580Asn Tyr Gly Thr Ala Lys Thr Pro Vai Tyr Gly Vai Lys Thr Ala Ala 65 70 7580

Gly Ala Asn Arg Thr Lys Leu Ala Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gly Phe 85 9095Gly Ala Asn Arg Thr Lys Leu Ala Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gly Phe 85 9095

Gin Asn Vai Pro He Asp Gly Thr Thr Asp Leu Met Ala Trp Ala Met 100 105110Gin Asn Vai Pro He Asp Gly Thr Thr Asp Leu Met Ala Trp Ala Met 100 105110

Asn Gin Lys Thr Thr Thr Asp Thr Asp Gly Thr Vai Thr Gin Vai Gin 115 120125Asn Gin Lys Thr Thr Thr Asp Thr Asp Gly Thr Vai Thr Gin Vai Gin 115 120125

- 10 043487- 10 043487

Phe Asp Gin Ser Glu Thr Arg Pro Trp Asn Asn Pro Ser Vai Thr ArgPhe Asp Gin Ser Glu Thr Arg Pro Trp Asn Asn Pro Ser Vai Thr Arg

130 135140130 135140

Lys Phe Ala Asp Ala Leu Gin Ala Gly Asn Pro Phe Thr Ala Thr AlaLys Phe Ala Asp Ala Leu Gin Ala Gly Asn Pro Phe Thr Ala Thr Ala

145 150 155160145 150 155160

Asp Pro Phe Vai Leu Asn Lys Ala Thr Gly Asn Asp Thr Asp Gly TrpAsp Pro Phe Vai Leu Asn Lys Ala Thr Gly Asn Asp Thr Asp Gly Trp

165 170175165 170175

Thr Ala Thr Asn Lys Thr Ala Leu Thr Ala Gly Vai Tyr Leu Phe LeuThr Ala Thr Asn Lys Thr Ala Leu Thr Ala Gly Vai Tyr Leu Phe Leu

180 185190180 185190

Asp Gly Asn Ala Ser Thr Asp Thr Leu Thr Gin Ala Vai Pro Met HeAsp Gly Asn Ala Ser Thr Asp Thr Leu Thr Gin Ala Vai Pro Met He

195 200205195 200205

Vai Ser Thr Gly Ser Vai Asp Ala Glu Gly Vai Leu Ser Leu Gly AspVai Ser Thr Gly Ser Vai Asp Ala Glu Gly Vai Leu Ser Leu Gly Asp

210 215220210 215220

Ser Thr Ala Glu Vai Asp Met Lys Ser Thr Vai Ser Gly Thr Gin ThrSer Thr Ala Glu Vai Asp Met Lys Ser Thr Vai Ser Gly Thr Gin Thr

225 230 235240225 230 235240

Lys Ser Thr Thr Ser Lys Ser Ala Ser Vai Gly Glu Thr Vai Pro PheLys Ser Thr Thr Ser Lys Ser Ala Ser Vai Gly Glu Thr Vai Pro Phe

245 250255245 250255

Glu Leu Gly Tyr Thr He Pro Asn Pro Vai Pro Thr Asp Phe Thr LeuGlu Leu Gly Tyr Thr He Pro Asn Pro Vai Pro Thr Asp Phe Thr Leu

260 265270260 265270

Gin Phe Lys Asp Vai Pro Ser Lys Gly Leu Thr Vai Asn Phe Ala SerGin Phe Lys Asp Vai Pro Ser Lys Gly Leu Thr Vai Asn Phe Ala Ser

275 280285275 280285

Leu Thr Vai Lys Ala Gly Asp Lys Vai Leu Thr Asp Thr Asp Tyr ThrLeu Thr Vai Lys Ala Gly Asp Lys Vai Leu Thr Asp Thr Asp Tyr Thr

290 295300290 295300

Vai Glu Asn Asn Leu Thr Asp Asn Lys Gly Asp Gly Thr Asn Thr PheVai Glu Asn Asn Leu Thr Asp Asn Lys Gly Asp Gly Thr Asn Thr Phe

305 310 315320305 310 315320

Vai Vai Lys lie Thr Asp Pro Ala Lys Tyr Ala Gly Lys Gin lie ThrVai Vai Lys lie Thr Asp Pro Ala Lys Tyr Ala Gly Lys Gin lie Thr

325 330335 lie Thr Tyr Asn Ala Thr Vai Asn Asp Glu Ala Glu Thr Vai Glu Gly325 330335 lie Thr Tyr Asn Ala Thr Vai Asn Asp Glu Ala Glu Thr Vai Glu Gly

340 345350340 345350

Gin Asp Tyr His Ala Vai Thr Asn Lys Leu Vai Gly Asn Asp Gly ThrGin Asp Tyr His Ala Vai Thr Asn Lys Leu Vai Gly Asn Asp Gly Thr

355 360365355 360365

Pro lie Pro Gly Thr Glu Thr Leu Thr Lys lie Phe Gly Phe Lys PhePro lie Pro Gly Thr Glu Thr Leu Thr Lys lie Phe Gly Phe Lys Phe

370 375380370 375380

Thr Lys Vai Asn Ala Gin Gly Glu Ala Vai Glu Gly Ala Lys Phe ThrThr Lys Vai Asn Ala Gin Gly Glu Ala Vai Glu Gly Ala Lys Phe Thr

385 390 395400385 390 395400

- 11 043487- 11 043487

Leu Ser Vai Ala Lys Asp Gin Asn Gly Vai Leu Pro Asn Ser Asp LysLeu Ser Vai Ala Lys Asp Gin Asn Gly Vai Leu Pro Asn Ser Asp Lys

405 410 415405 410 415

Tyr Pro Leu Glu Vai Thr Ser Gly Ala Asn Gly Vai Vai Lys Phe AspTyr Pro Leu Glu Vai Thr Ser Gly Ala Asn Gly Vai Vai Lys Phe Asp

420 425 430420 425 430

Gly Leu Lys Ala Gly Ser Tyr Thr Vai Thr Glu Thr Ala Vai Ala AspGly Leu Lys Ala Gly Ser Tyr Thr Vai Thr Glu Thr Ala Vai Ala Asp

435 440 445435 440 445

Gly Gly Tyr 4 5 0 Tyr 4 5 0 Gin Asp Gin Asp Phe Lys Ala Ser Phe Thr Vai Ala He Asp Glu Asn Phe Lys Ala Ser Phe Thr Vai Ala He Asp Glu Asn 4 5 5 4 5 5 4 6 0 4 6 0 Gly Gly Lys Lys Vai Thr Vai Thr Phe Ala Gly Thr Phe Ala Gly Thr Asp Ser Trp Gly Leu Ala Pro Lys Asp Ser Trp Gly Leu Ala Pro Lys 4 6 5 4 6 5 4 7 0 4 7 0 475 480 475 480 Gly Gly Ser Ser Ala Asp Ala Asp Asp Tyr Lys Vai Asp Tyr Lys Vai Thr Asn Vai Lys Ser Vai Phe Glu Thr Asn Vai Lys Ser Vai Phe Glu L L 1 8 5 1 8 5 490 495 490 495 Leu Leu Pro Pro Lys Thr Lys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly He Ala Leu Phe Vai Vai lie Ala He Ala Leu Phe Vai Vai lie Ala

500 505 510500 505 510

Ala Leu Leu Gly Gly Ala Ala Ala Thr Vai Tyr Ala Lys Ser Arg Arg 515 520 525Ala Leu Leu Gly Gly Ala Ala Ala Thr Vai Tyr Ala Lys Ser Arg Arg 515 520 525

Thr Ser Arg Ala Leu Arg 5 3 0 <210> 5 <211> 596 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum < 400> 5Thr Ser Arg Ala Leu Arg 5 3 0 <210> 5 <211> 596 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum < 400> 5

Met Gin Ser Met Ser Phe Ala Ser Thr Ala Arg Lys Vai Thr Ala PheMet Gin Ser Met Ser Phe Ala Ser Thr Ala Arg Lys Vai Thr Ala Phe

5 10155 1015

Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ala Leu Gly Ala Cys Gly Asn SerAla Ala Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ala Leu Gly Ala Cys Gly Asn Ser

25302530

Asn Asn Gly Ser Ala Gly Asn Asn Gly Ala Lys Ser Thr Ser Glu Pro 35 4045Asn Asn Gly Ser Ala Gly Asn Asn Gly Ala Lys Ser Thr Ser Glu Pro 35 4045

Gin Glu Gly Vai Pro Thr Asn Tyr Thr Gly Ser Phe Pro Met Pro Asp 50 5560Gin Glu Gly Vai Pro Thr Asn Tyr Thr Gly Ser Phe Pro Met Pro Asp 50 5560

Pro Gly Lys Ala Tyr Asn Asn Pro Lys Asp Arg Gly Glu Leu Lys Gin 65 70 7580Pro Gly Lys Ala Tyr Asn Asn Pro Lys Asp Arg Gly Glu Leu Lys Gin 65 70 7580

- 12 043487- 12 043487

Gly Gly Thr Leu Thr Leu Pro lie Thr Glu lie Gly Pro Asn Trp Asn Gly Gly Thr Leu Thr Leu Pro lie Thr Glu lie Gly Pro Asn Trp Asn 8 5 8 5 9 0 9 0 9 5 9 5 Ala Ala lie Asp Vai Asn Gly Asn lie Asp Vai Asn Gly Asn Thr Vai Tyr Met Ser Thr Vai Tyr Met Ser Gly Leu Trp Arg Gly Leu Trp Arg 1 0 0 100 1 0 5 1 0 5 1 1 0 1 1 0 Phe Phe Tyr Met Pro Cys lie Trp Tyr Met Pro Cys lie Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Glu Tyr Pro Ala Asp Gly Ser Leu Glu Gly Ser Leu Glu 1 1 5 1 1 5 1 2 0 1 2 0 1 2 5 1 2 5 Asn Asn lie Lys Pro Asn Thr Asn lie Lys Pro Asn Thr Asn Tyr Vai Thr Lys Vai Tyr Vai Thr Lys Vai Glu Gin Thr Ser Glu Gin Thr Ser

130 135 140130 135 140

Asp Ser Pro Glu Thr Vai Vai Phe Thr He Asn Asp Lys Ala Ser TrpAsp Ser Pro Glu Thr Vai Vai Phe Thr He Asn Asp Lys Ala Ser Trp

145 150 155160145 150 155160

Asn Asp Gly Thr Pro He Thr Trp Lys Asp Phe Glu Ser Thr Trp LysAsn Asp Gly Thr Pro He Thr Trp Lys Asp Phe Glu Ser Thr Trp Lys

165 170175165 170175

Vai Gin Ser Gly Lys Ser Asp Lys Phe Thr Pro Ala Leu Thr Thr GlyVai Gin Ser Gly Lys Ser Asp Lys Phe Thr Pro Ala Leu Thr Thr Gly

180 185190180 185190

Tyr Asp Gin lie Lys Ser Vai Thr Lys Gly Asp Thr Asp Lys Gin AlaTyr Asp Gin lie Lys Ser Vai Thr Lys Gly Asp Thr Asp Lys Gin Ala

195 200205195 200205

Vai Vai Thr Phe Glu Lys Asp Phe Tyr Pro Tyr Gin Ser Leu Phe AsnVai Vai Thr Phe Glu Lys Asp Phe Tyr Pro Tyr Gin Ser Leu Phe Asn

210 215220210 215220

Leu Leu Tyr Pro Ser Glu Ala Leu Thr Gly Asp Asp Thr Lys Asp GlyLeu Leu Tyr Pro Ser Glu Ala Leu Thr Gly Asp Asp Thr Lys Asp Gly

225 230 235240225 230 235240

Asp Thr Phe Ser Lys Gly Trp Ser Asn Asp Ser His Ser Asp Lys TrpAsp Thr Phe Ser Lys Gly Trp Ser Asn Asp Ser His Ser Asp Lys Trp

245 250255245 250255

Gly Ala Gly Pro Phe Vai Vai Ser Lys Ser Ser Asp Ser Glu Vai ThrGly Ala Gly Pro Phe Vai Vai Ser Lys Ser Ser Asp Ser Glu Vai Thr

260 265270260 265270

Phe Thr Pro Asn Pro Lys Trp Trp Gly Asp Lys Pro Leu Leu Asp LysPhe Thr Pro Asn Pro Lys Trp Trp Gly Asp Lys Pro Leu Leu Asp Lys

275 280285275 280285

Vai Vai Leu Lys Gin Met Glu Pro Ser Ala Ala Met Asn Ala Phe LysVai Vai Leu Lys Gin Met Glu Pro Ser Ala Ala Met Asn Ala Phe Lys

290 295300290 295300

Asn Gly Glu lie Asp Ala Vai Gly Ala Ser Asp Ala Glu Ser Met ThrAsn Gly Glu lie Asp Ala Vai Gly Ala Ser Asp Ala Glu Ser Met Thr

305 310 315320305 310 315320

Ser Ala Lys Thr Vai Lys Asp Ala Tyr Leu Arg Arg Ser Tyr Asp SerSer Ala Lys Thr Vai Lys Asp Ala Tyr Leu Arg Arg Ser Tyr Asp Ser

325 330335325 330335

Gly Vai Tyr Thr Leu Thr lie Asn Thr Lys Asn lie Pro Leu Glu VaiGly Vai Tyr Thr Leu Thr lie Asn Thr Lys Asn lie Pro Leu Glu Vai

340 345350340 345350

- 13 043487- 13 043487

Arg Lys Ala Phe Vai Gin Gly Vai Asp Arg Ser Gin Leu Gin Lys He 355 360365Arg Lys Ala Phe Vai Gin Gly Vai Asp Arg Ser Gin Leu Gin Lys He 355 360365

Asp Phe Gin Gly He Glu Trp Thr Glu Lys Thr Pro Gly Ser Leu lie 370 375380Asp Phe Gin Gly He Glu Trp Thr Glu Lys Thr Pro Gly Ser Leu lie 370 375380

Leu Pro Gin Phe Gin Asp Gly Tyr Glu Asp Asn Met Pro Ala Glu Ser 385 390 395400Leu Pro Gin Phe Gin Asp Gly Tyr Glu Asp Asn Met Pro Ala Glu Ser 385 390 395400

Lys Tyr Ser Thr Ala Asn Ala Thr Lys Thr Leu Glu Asp Ala Gly Tyr 405 410415Lys Tyr Ser Thr Ala Asn Ala Thr Lys Thr Leu Glu Asp Ala Gly Tyr 405 410415

Lys Lys Asn Ser Asp Gly Tyr Tyr Glu Lys Gly Gly Lys Vai Ala Ala 420 425430 lie Thr Tyr Thr Thr Phe Ser Asp Ser Ala Ser Thr Lys Ala Lys Ala 435 440445Lys Lys Asn Ser Asp Gly Tyr Tyr Glu Lys Gly Gly Lys Vai Ala Ala 420 425430 lie Thr Tyr Thr Thr Phe Ser Asp Ser Ala Ser Thr Lys Ala Lys Ala 435 440445

Thr Ala lie Gin Lys Met Ala Lys Thr Vai Gly lie Lys Vai Ser lie 450 455460Thr Ala lie Gin Lys Met Ala Lys Thr Vai Gly lie Lys Vai Ser lie 450 455460

Asp lie Lys Ala Ser Asn Thr Phe Ser Asp Thr Vai Ser Ser Gly Asn 465 470 475480Asp lie Lys Ala Ser Asn Thr Phe Ser Asp Thr Vai Ser Ser Gly Asn 465 470 475480

Trp Asp Met lie Gly Leu Gly Trp Ser Ala Ser Asp Pro Phe Gly Tyr 485 490495Trp Asp Met lie Gly Leu Gly Trp Ser Ala Ser Asp Pro Phe Gly Tyr 485 490495

Ala Ser Ser Ala Tyr Gin Leu Tyr Gly Ser Lys Ser Glu Ser Asn Phe 500 505510Ala Ser Ser Ala Tyr Gin Leu Tyr Gly Ser Lys Ser Glu Ser Asn Phe 500 505510

Ser Phe Thr Gly Thr Asp Glu lie Asp Lys Glu Leu Glu Ser lie Pro 515 520525Ser Phe Thr Gly Thr Asp Glu lie Asp Lys Glu Leu Glu Ser lie Pro 515 520525

Gly lie Lys Asp Ser Thr Lys Ala He Ala Gin Phe Asn Lys Ala Glu 530 535540Gly lie Lys Asp Ser Thr Lys Ala He Ala Gin Phe Asn Lys Ala Glu 530 535540

Lys Glu Ala Gin Lys Leu Tyr Ala Gin lie Pro Phe Glu Asn Gly Gin 545 550 555560 lie Thr Vai Ala Vai Lys Lys Gly Leu Ala Asn Tyr Gly Pro Ala Gly 565 570575Lys Glu Ala Gin Lys Leu Tyr Ala Gin lie Pro Phe Glu Asn Gly Gin 545 550 555560 lie Thr Vai Ala Vai Lys Lys Gly Leu Ala Asn Tyr Gly Pro Ala Gly 565 570575

Tyr Ser Ser Gly Ala Arg Vai Met Vai Thr Vai His Pro Glu Asn Leu 580 585590Tyr Ser Ser Gly Ala Arg Vai Met Vai Thr Vai His Pro Glu Asn Leu 580 585590

Gly Trp Glu Lys 5 9 5 < 210> 6 < 211> 367Gly Trp Glu Lys 5 9 5 < 210 > 6 < 211 > 367

- 14 043487 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum < 400> 6- 14 043487 <212> PRT <213> Bifidobacterium bifidum <400> 6

Met Thr Glu Ala Thr Gin Arg Thr Ser Asp Asn Gly Vai Ser He Trp 1 5 1015Met Thr Glu Ala Thr Gin Arg Thr Ser Asp Asn Gly Vai Ser He Trp 1 5 1015

Leu Asp Asp Leu Ser Arg Thr Arg He Glu Ser Gly Ser Leu Gin Glu 20 2530Leu Asp Asp Leu Ser Arg Thr Arg He Glu Ser Gly Ser Leu Gin Glu 20 2530

Leu He Lys Asp Lys Asn Vai Vai Gly Vai Thr Thr Asn Pro Ser He 35 4045Leu He Lys Asp Lys Asn Vai Vai Gly Vai Thr Thr Asn Pro Ser He 35 4045

Phe Gin Lys Ala Leu Ser Gin Vai Gly Pro Tyr Asp Ala Gin Leu Lys 5 0 5 56 0Phe Gin Lys Ala Leu Ser Gin Vai Gly Pro Tyr Asp Ala Gin Leu Lys 5 0 5 56 0

Glu Leu Gly Lys Vai Asp Vai Glu Thr Ala Vai Arg Glu Leu Thr Thr 65 70 7580Glu Leu Gly Lys Vai Asp Vai Glu Thr Ala Vai Arg Glu Leu Thr Thr 65 70 7580

Thr Asp Vai Arg Asn Ala Thr Asp He Phe Arg Glu He Ala Glu Ala 85 9095Thr Asp Vai Arg Asn Ala Thr Asp He Phe Arg Glu He Ala Glu Ala 85 9095

Thr Asp Phe Vai Asp Gly Arg Vai Ser He Glu Vai Asp Pro Arg Leu 100 105110Thr Asp Phe Vai Asp Gly Arg Vai Ser He Glu Vai Asp Pro Arg Leu 100 105110

Ala His Asp Thr Glu Asn Thr Glu Lys Gin Ala Vai Glu Leu Trp Glu 115 120125Ala His Asp Thr Glu Asn Thr Glu Lys Gin Ala Vai Glu Leu Trp Glu 115 120125

Lys Vai Asn Arg Pro Asn Ala Met He Lys He Pro Ala Thr Leu Glu 130 135140Lys Vai Asn Arg Pro Asn Ala Met He Lys He Pro Ala Thr Leu Glu 130 135140

Gly Leu Pro Ala He Thr Ala Thr Leu Ala Lys Gly He Ser Vai Asn 145 150 155160Gly Leu Pro Ala He Thr Ala Thr Leu Ala Lys Gly He Ser Vai Asn 145 150 155160

Vai Thr Leu He Phe Ser Leu Glu Arg Tyr Glu Gin Vai He Asp Ala 165 170175Vai Thr Leu He Phe Ser Leu Glu Arg Tyr Glu Gin Vai He Asp Ala 165 170175

Tyr He Glu Gly He Ala Gin Ala Ala Ala Asn Gly His Asp Leu Lys 180 185190Tyr He Glu Gly He Ala Gin Ala Ala Ala Asn Gly His Asp Leu Lys 180 185190

His He Gly Ser Vai Ala Ser Phe Phe Vai Ser Arg Vai Asp Thr Ala 195 200205His He Gly Ser Vai Ala Ser Phe Phe Vai Ser Arg Vai Asp Thr Ala 195 200205

Vai Asp Lys Leu Leu Glu Ala Asn Gly Ser Asp Glu Ala Lys Ala Leu 210 215220Vai Asp Lys Leu Leu Glu Ala Asn Gly Ser Asp Glu Ala Lys Ala Leu 210 215220

Glu Gly Lys Ala Ala Vai Ala Asn Ala Arg Leu Ala Tyr Glu LeuPheGlu Gly Lys Ala Ala Vai Ala Asn Ala Arg Leu Ala Tyr Glu LeuPhe

225 230 235240225 230 235240

Glu Lys Lys Phe Ala Ala Asp Pro Arg Trp Ala Asp Leu Ala AlaLysGlu Lys Lys Phe Ala Ala Asp Pro Arg Trp Ala Asp Leu Ala AlaLys

245 250255245 250255

- 15 043487- 15 043487

Gly Ala Lys Vai Gin Arg Pro Leu Trp Ala Ser Thr Gly Thr Lys Asn 260 265270Gly Ala Lys Vai Gin Arg Pro Leu Trp Ala Ser Thr Gly Thr Lys Asn 260 265270

Ala Ala Tyr Ser Asp Cys Lys Tyr Vai Asp Glu Leu Vai Ala Lys His 275 280285Ala Ala Tyr Ser Asp Cys Lys Tyr Vai Asp Glu Leu Vai Ala Lys His 275 280285

He Vai Asn Thr Met Pro Glu Lys Thr Leu Asn Ala Leu Ala Asp His 290 295300He Vai Asn Thr Met Pro Glu Lys Thr Leu Asn Ala Leu Ala Asp His 290 295300

Gly Asn Gly Ala Pro Ser He Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Ser His Ala 305 310 315320Gly Asn Gly Ala Pro Ser He Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Ser His Ala 305 310 315320

Vai lie Asp Lys Leu Ala Glu Leu Gly lie Asn Leu Lys Asp Vai Thr 325 330335Vai lie Asp Lys Leu Ala Glu Leu Gly lie Asn Leu Lys Asp Vai Thr 325 330335

Asp Lys Leu Glu Ala Asp Gly Vai Ala Ala Phe lie Lys Ser Trp Asp 340 345350Asp Lys Leu Glu Ala Asp Gly Vai Ala Ala Phe lie Lys Ser Trp Asp 340 345350

Ser Vai Leu Ala Asp Vai Gin Ser Gly lie Asp Arg Vai Asn Ala 355 360365 < 210> 7 < 211> 1931 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum <400> 7Ser Vai Leu Ala Asp Vai Gin Ser Gly lie Asp Arg Vai Asn Ala 355 360365 < 210> 7 < 211> 1931 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum <400> 7

Met Arg Lys Arg Vai Vai Ser Vai Ala Leu Ala Vai Ala Leu Ala Vai 1 5 1015Met Arg Lys Arg Vai Vai Ser Vai Ala Leu Ala Vai Ala Leu Ala Vai 1 5 1015

Ala Pro Leu Gly Vai Gly Ser Thr Ala Ser Ala Ala Pro Leu Ser Ala 20 2530Ala Pro Leu Gly Vai Gly Ser Thr Ala Ser Ala Ala Pro Leu Ser Ala 20 2530

Ser Asp Leu Gin Thr Leu Ala Leu Arg Ser Ala Ala Ser Ser Asn Asp 35 4045Ser Asp Leu Gin Thr Leu Ala Leu Arg Ser Ala Ala Ser Ser Asn Asp 35 4045

Ala Asn Ala Asn Asp Vai Ala Thr Vai Ala Asp Asp Ala Ala Vai Asn 50 5560Ala Asn Ala Asn Asp Vai Ala Thr Vai Ala Asp Asp Ala Ala Vai Asn 50 5560

Gly Trp Thr lie Asp Arg Asn Thr Ala Lys Gly Gly Glu lie Leu Ala 65 70 7580Gly Trp Thr lie Asp Arg Asn Thr Ala Lys Gly Gly Glu lie Leu Ala 65 70 7580

Ala Gly Thr Gly Asp Tyr Ala Gly Trp Thr His Phe Lys Ser Thr Ser 85 9095Ala Gly Thr Gly Asp Tyr Ala Gly Trp Thr His Phe Lys Ser Thr Ser 85 9095

Ala Asn Gly Asn Ala Thr Ser Ser Ser Gly Tyr Pro Ala Vai Ala lie 100 105110Ala Asn Gly Asn Ala Thr Ser Ser Ser Gly Tyr Pro Ala Vai Ala lie 100 105110

- 16 043487- 16 043487

Ser Gly Lys Thr He Asp Leu Thr Arg Ala Gly Glu Phe Ser He LysSer Gly Lys Thr He Asp Leu Thr Arg Ala Gly Glu Phe Ser He Lys

115 120 125115 120 125

Vai Lys Ser Pro Gin Ala Gly Ser Ala Asn Arg Phe Gly Phe Tyr LeuVai Lys Ser Pro Gin Ala Gly Ser Ala Asn Arg Phe Gly Phe Tyr Leu

130 135 140130 135 140

Gly Tyr Lys Asp Pro Gly Asn Ala Leu Phe Leu Gly Tyr Asp Lys GlyGly Tyr Lys Asp Pro Gly Asn Ala Leu Phe Leu Gly Tyr Asp Lys Gly

145 150 155160145 150 155160

Gly Trp Phe Trp Gin Lys Tyr Vai Asp Gly Asn Gly Asp Trp Tyr AsnGly Trp Phe Trp Gin Lys Tyr Vai Asp Gly Asn Gly Asp Trp Tyr Asn

165 170175165 170175

Gly Thr Arg Vai Ala Ala Pro Ala Ala Asn Ala Glu lie Thr Vai Asn 180 185190Gly Thr Arg Vai Ala Ala Pro Ala Ala Asn Ala Glu lie Thr Vai Asn 180 185190

Vai Ser Trp Thr Ala Ala Lys Vai Ala Thr Leu Thr lie Asp Gly Gin 195 200205Vai Ser Trp Thr Ala Ala Lys Vai Ala Thr Leu Thr lie Asp Gly Gin 195 200205

Lys Ala Phe Asp Vai Asp Tyr Ser Ser Met Thr Ala Leu Thr Asn Lys 210 215220Lys Ala Phe Asp Vai Asp Tyr Ser Ser Met Thr Ala Leu Thr Asn Lys 210 215220

Leu Ala Met Lys Ala Gly Ser Tyr Ser Gly Thr Ser Glu Vai Thr Asp 225 230 235240Leu Ala Met Lys Ala Gly Ser Tyr Ser Gly Thr Ser Glu Vai Thr Asp 225 230 235240

Vai Tyr Phe Lys Asn Phe Thr Vai Gly Glu Vai Ala Lys His Asn Vai 245 250255Vai Tyr Phe Lys Asn Phe Thr Vai Gly Glu Vai Ala Lys His Asn Vai 245 250255

Thr Gly Lys Vai Vai Asp Ala Ser Gly Ala Ala lie Ala Gly Ala Glu 260 265270Thr Gly Lys Vai Vai Asp Ala Ser Gly Ala Ala lie Ala Gly Ala Glu 260 265270

Vai Vai Thr Gly Lys Asn Ser Ala Thr Thr Ala Ala Asp Gly Thr Phe 275 280285Vai Vai Thr Gly Lys Asn Ser Ala Thr Thr Ala Ala Asp Gly Thr Phe 275 280285

Thr Leu Thr Gly Leu Ala Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Thr Vai Ser Ala 290 295300Thr Leu Thr Gly Leu Ala Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Thr Vai Ser Ala 290 295300

Glu Gly Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Vai Thr Vai Ala Asp Gly Asn 305 310 315320Glu Gly Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Vai Thr Vai Ala Asp Gly Asn 305 310 315320

Ala Ser Vai Gly Asn lie Thr Leu Asn Lys Ser Ala Glu Vai Ala Thr 325 330335Ala Ser Vai Gly Asn lie Thr Leu Asn Lys Ser Ala Glu Vai Ala Thr 325 330335

Glu Thr Leu Ser Thr Ala Ala Met Asp Vai Arg Vai Lys Lys Asn Phe 340 345350Glu Thr Leu Ser Thr Ala Ala Met Asp Vai Arg Vai Lys Lys Asn Phe 340 345350

Pro Ser Vai Tyr Asp Tyr Thr Met Lys Lys Phe Gly Gly Lys lie Met 355 360365Pro Ser Vai Tyr Asp Tyr Thr Met Lys Lys Phe Gly Gly Lys lie Met 355 360365

Tyr Gly Gin Pro Lys Asp Vai Arg Vai lie Thr lie Asn Gly Thr Asp 370 375380Tyr Gly Gin Pro Lys Asp Vai Arg Vai lie Thr lie Asn Gly Thr Asp 370 375380

- 17 043487- 17 043487

Vai Vai Thr Thr Leu Leu Lys Asp Ser Asp Vai Thr Phe Lys Lys Vai Ser Ala Thr Lys Asp Ser Asp Vai Thr Phe Lys Lys Vai Ser Ala Thr 3 8 5 Glu 3 8 5 Glu Ala Ala Gin Gin 390 395 400 Tyr Thr Leu Asn Vai Lys Ser Gly Asn Lys lie Asn Ala 390 395 400 Tyr Thr Leu Asn Vai Lys Ser Gly Asn Lys lie Asn Ala Vai Vai Vai Vai Thr Thr 405 410 415 Vai Gin He Lys Vai Vai Asp Asn Thr Leu Lys Leu Asn 405 410 415 Vai Gin He Lys Vai Vai Asp Asn Thr Leu Lys Leu Asn Vai Vai Thr Thr Lys Lys 420 425 430 He Vai Asn Lys Ala Asp Asp Ala Lys Thr Glu Ala Glu 420 425 430 He Vai Asn Lys Ala Asp Asp Ala Lys Thr Glu Ala Glu Glu Glu Asn Asn 4 3 5 Pro 4 3 5 Pro 440 445 Vai Gin Thr He Ala Phe Pro Asn Gin Ser Leu He Ser 440 445 Vai Gin Thr He Ala Phe Pro Asn Gin Ser Leu He Ser

450 455460450 455460

Vai Arg Ser Gly Gin Asp Gly Ala Gin Phe Thr Gly Ala Arg Met SerVai Arg Ser Gly Gin Asp Gly Ala Gin Phe Thr Gly Ala Arg Met Ser

465 470 475480465 470 475480

Ser Asp Thr Ala Arg Pro Gly Asp Thr Asn Phe Gly He Thr Ala AspSer Asp Thr Ala Arg Pro Gly Asp Thr Asn Phe Gly He Thr Ala Asp

485 490495485 490495

Thr Thr Vai Gly Asn Ala Asn Asp Tyr Thr Tyr Gly Phe Vai Ser GlyThr Thr Vai Gly Asn Ala Asn Asp Tyr Thr Tyr Gly Phe Vai Ser Gly

500 505510500 505510

Asn Gly Leu Ser Ala Gly Leu Trp Ser Asn Ser Glu His Asp Gly ThrAsn Gly Leu Ser Ala Gly Leu Trp Ser Asn Ser Glu His Asp Gly Thr

515 520525515 520525

Thr Vai Gly Asn Thr Vai Ala Gly Gly Ala Arg Asn Thr Arg Vai LeuThr Vai Gly Asn Thr Vai Ala Gly Gly Ala Arg Asn Thr Arg Vai Leu

530 535540530 535540

Thr Ser Thr Gin Lys Vai Gly Lys Ala Thr Ser Phe Gly Leu Gly ThrThr Ser Thr Gin Lys Vai Gly Lys Ala Thr Ser Phe Gly Leu Gly Thr

545 550 555560545 550 555560

Ala Pro Trp Tyr Tyr His Arg Vai Vai Thr Asp Thr Lys Lys Arg ThrAla Pro Trp Tyr Tyr His Arg Vai Vai Thr Asp Thr Lys Lys Arg Thr

565 570575565 570575

Tyr Thr Vai Glu Glu Thr Asp Met Pro Lys Met Ala Vai Ala He AlaTyr Thr Vai Glu Glu Thr Asp Met Pro Lys Met Ala Vai Ala He Ala

580 585590580 585590

Gly Asp Glu Asn Glu Asp Gly Thr Vai Asn Trp Glu Asp Gly Ala HeGly Asp Glu Asn Glu Asp Gly Thr Vai Asn Trp Glu Asp Gly Ala He

595 600605595 600605

Ala Tyr Arg Asp He Met Asn Asn Pro Tyr Lys Ser Glu Glu Vai ProAla Tyr Arg Asp He Met Asn Asn Pro Tyr Lys Ser Glu Glu Vai Pro

610 615620610 615620

Glu Leu Vai Ala Trp Arg He Ala Met Asn Phe Gly Ser Gin Ala GinGlu Leu Vai Ala Trp Arg He Ala Met Asn Phe Gly Ser Gin Ala Gin

625 630 635640625 630 635640

Asn Pro Phe Leu Thr Thr Leu Asp Asn Vai Lys Lys Vai Ala Leu AsnAsn Pro Phe Leu Thr Thr Leu Asp Asn Vai Lys Lys Vai Ala Leu Asn

645 650655645 650655

- 18 043487- 18 043487

Thr Asp Gly Leu Gly Gin Ser Vai Leu Leu Lys Gly Tyr Gly Asn GluThr Asp Gly Leu Gly Gin Ser Vai Leu Leu Lys Gly Tyr Gly Asn Glu

660 665670660 665670

Gly His Asp Ser Gly His Pro Asp Tyr Gly Asp lie Asn Thr Arg AlaGly His Asp Ser Gly His Pro Asp Tyr Gly Asp lie Asn Thr Arg Ala

675 680685675 680685

Gly Gly Ala Ala Asp Met Asn Thr Leu Met Glu Lys Gly Thr Glu TyrGly Gly Ala Ala Asp Met Asn Thr Leu Met Glu Lys Gly Thr Glu Tyr

690 695700690 695700

Gly Ala Arg Phe Gly Vai His Vai Asn Ala Ser Glu Met Tyr ProGluGly Ala Arg Phe Gly Vai His Vai Asn Ala Ser Glu Met Tyr ProGlu

705 710 715720705 710 715720

Ala Lys Ala Phe Ser Glu Asp Met Vai Arg Arg Asn Ser Ser GlyGlyAla Lys Ala Phe Ser Glu Asp Met Vai Arg Arg Asn Ser Ser GlyGly

725 730735725 730735

Leu Ser Tyr Gly Trp Asn Trp Leu Asp Gin Gly lie Gly lie Asp GlyLeu Ser Tyr Gly Trp Asn Trp Leu Asp Gin Gly lie Gly lie Asp Gly

740 745750 lie Tyr Asp Leu Ala Ser Gly Met Arg Lys Ser Arg Phe Ala Asp Leu740 745750 lie Tyr Asp Leu Ala Ser Gly Met Arg Lys Ser Arg Phe Ala Asp Leu

755 760765755 760765

Lys Ser Lys Vai Gly Asp Asn Met Asp Phe He Tyr Leu Asp Vai TrpLys Ser Lys Vai Gly Asp Asn Met Asp Phe He Tyr Leu Asp Vai Trp

770 775780770 775780

Gly Asn Asn Thr Ser Gly Ala Glu Asp Ser Trp Glu Thr Arg Lys MetGly Asn Asn Thr Ser Gly Ala Glu Asp Ser Trp Glu Thr Arg Lys Met

785 790 795800785 790 795800

Ser Gin Met lie Asn Gin Asn Gly Trp Arg Met Thr Thr Glu Trp GlySer Gin Met lie Asn Gin Asn Gly Trp Arg Met Thr Thr Glu Trp Gly

805 810815805 810815

Ala Gly Asn Glu Tyr Asp Ala Thr Phe Gin His Trp Ala Ala Asp LeuAla Gly Asn Glu Tyr Asp Ala Thr Phe Gin His Trp Ala Ala Asp Leu

820 825830820 825830

Thr Tyr Gly Gly Ser Gly Met Lys Gly Glu Asn Ser Gin Vai Met ArgThr Tyr Gly Gly Ser Gly Met Lys Gly Glu Asn Ser Gin Vai Met Arg

835 840845835 840845

Phe Leu Arg Asn His Gin Lys Asp Ser Trp Vai Gly Asp Tyr Pro SerPhe Leu Arg Asn His Gin Lys Asp Ser Trp Vai Gly Asp Tyr Pro Ser

850 855860850 855860

Tyr Gly Gin Ala Ala Asn Ala Pro Leu Leu Gly Gly Tyr Ser Met LysTyr Gly Gin Ala Ala Asn Ala Pro Leu Leu Gly Gly Tyr Ser Met Lys

865 870 875880865 870 875880

Asp Phe Glu Gly Trp Gin Gly Arg Asn Asp Tyr Ala Ala Tyr He ArgAsp Phe Glu Gly Trp Gin Gly Arg Asn Asp Tyr Ala Ala Tyr He Arg

885 890895885 890895

Asn Leu Tyr Thr His Asp Vai Ser Thr Lys Phe lie Gin His Phe LysAsn Leu Tyr Thr His Asp Vai Ser Thr Lys Phe lie Gin His Phe Lys

900 905910900 905910

Vai Vai Arg Trp Vai Asn Ser Pro Leu Asp Ala Thr Ser Vai Lys AspVai Vai Arg Trp Vai Asn Ser Pro Leu Asp Ala Thr Ser Vai Lys Asp

915 920925915 920925

- 19 043487- 19 043487

Ala Ser Vai Asn Asn Gly Asn Glu Gin He Thr Leu Lys Asp Asp HisAla Ser Vai Asn Asn Gly Asn Glu Gin He Thr Leu Lys Asp Asp His

930 935 940930 935 940

Gly Asn Vai Vai Vai Leu Ser Arg Gly Ser Asn Asp Thr Asn Asn GlyGly Asn Vai Vai Vai Leu Ser Arg Gly Ser Asn Asp Thr Asn Asn Gly

945 950 955 960945 950 955 960

Ala Tyr Arg Asn Arg Thr He Thr Leu Asn Gly lie Thr Vai Ala Ser 965 970975Ala Tyr Arg Asn Arg Thr He Thr Leu Asn Gly lie Thr Vai Ala Ser 965 970975

Gly Ala Vai Ser Pro Gly Asn Ser Asn Thr Vai Lys Gly Thr Glu Ser 980 985990Gly Ala Vai Ser Pro Gly Asn Ser Asn Thr Vai Lys Gly Thr Glu Ser 980 985990

Tyr Leu Leu Pro Trp Leu Trp Asp Vai Asn Thr Gly Lys Leu Vai Lys 995 10001005Tyr Leu Leu Pro Trp Leu Trp Asp Vai Asn Thr Gly Lys Leu Vai Lys 995 10001005

Ser Ser Asp Glu Lys Leu Tyr His Trp Asn Thr Gin Gly Gly Thr Thr 1010 10151020Ser Ser Asp Glu Lys Leu Tyr His Trp Asn Thr Gin Gly Gly Thr Thr 1010 10151020

Glu Trp Thr Leu Pro Lys Asp Trp Gin Asn Leu Ala Ser Vai Lys Vai 1025 1030 10351040Glu Trp Thr Leu Pro Lys Asp Trp Gin Asn Leu Ala Ser Vai Lys Vai 1025 1030 10351040

Tyr Gin Leu Thr Asp Gin Gly Lys Thr Asn Glu Lys Thr Vai Ala Vai 1045 10501055Tyr Gin Leu Thr Asp Gin Gly Lys Thr Asn Glu Lys Thr Vai Ala Vai 1045 10501055

Ser Gly Gly Lys He Ser Leu Thr Ala Glu Ala Glu Thr Pro Tyr Vai 1060 10651070Ser Gly Gly Lys He Ser Leu Thr Ala Glu Ala Glu Thr Pro Tyr Vai 1060 10651070

Vai Thr Lys Gly Ser Glu Lys Gin lie Ser Vai Lys Trp Ser Glu Gly 1075 10801085Vai Thr Lys Gly Ser Glu Lys Gin lie Ser Vai Lys Trp Ser Glu Gly 1075 10801085

Met His Vai Vai Asp Ala Gly Phe Asn Gly Gly Gin Asn Thr Leu LysMet His Vai Vai Asp Ala Gly Phe Asn Gly Gly Gin Asn Thr Leu Lys

1090 109511001090 10951100

Asp Asp Asn Trp Asn Trp Ala Vai Ser Gly Thr Gly Lys Ala Glu Vai Glu Gly Thr Ala Vai Ser Gly Thr Gly Lys Ala Glu Vai Glu Gly Thr 110 5 110 5 1110 1115 1120 1110 1115 1120 Asn Asn Asn Ala Asn Ala Met Leu Arg Leu Thr Gly Asp Vai Lys Vai Ser Gin Lys 1125 1130 1135 Met Leu Arg Leu Thr Gly Asp Vai Lys Vai Ser Gin Lys 1125 1130 1135 Leu Leu Thr Asp 1 Thr Asp 1 Leu Thr Ala Gly Lys Arg Tyr Ala lie Tyr Vai Gly Vai 140 1145 1150 Leu Thr Ala Gly Lys Arg Tyr Ala lie Tyr Vai Gly Vai 140 1145 1150 Asp Asp Asn Arg 115 5 Asn Arg 115 5 Thr Asn Ser Pro Ala Lys lie Thr Vai Thr Asn Gly Thr 1160 1165 Thr Asn Ser Pro Ala Lys lie Thr Vai Thr Asn Gly Thr 1160 1165 Lys Lys Vai Leu 117 0 Vai Leu 117 0 Ala Thr Asn Glu Thr Gly Lys Ser lie Ala Lys Asn Tyr 1175 1180 Ala Thr Asn Glu Thr Gly Lys Ser lie Ala Lys Asn Tyr 1175 1180

lie Lys Ala Tyr Gly His Asn Thr Tyr Ser Asn Thr Glu Gly Gly Serlie Lys Ala Tyr Gly His Asn Thr Tyr Ser Asn Thr Glu Gly Gly Ser

1185 1190 119512001185 1190 11951200

- 20 043487- 20 043487

Ser Tyr Phe Gin Asn Met Tyr Vai Trp Phe Vai Ala Pro Glu Ser Gly 1205 12101215Ser Tyr Phe Gin Asn Met Tyr Vai Trp Phe Vai Ala Pro Glu Ser Gly 1205 12101215

Asp Vai Lys Vai Thr Leu Ser His Ser Gly Ala Cys Asp Asn Thr Asp 1220 12251230Asp Vai Lys Vai Thr Leu Ser His Ser Gly Ala Cys Asp Asn Thr Asp 1220 12251230

His Vai Tyr Phe Asp Asp Vai Arg Vai Leu Glu Asn Gly Tyr Lys Gly 1235 12401245His Vai Tyr Phe Asp Asp Vai Arg Vai Leu Glu Asn Gly Tyr Lys Gly 1235 12401245

Leu Thr Leu Asn Ala Asp Gly Thr Leu Lys Thr Leu Thr Asn Asp Phe 1250 12551260Leu Thr Leu Asn Ala Asp Gly Thr Leu Lys Thr Leu Thr Asn Asp Phe 1250 12551260

Glu Asp Asn Ala Gin Gly He Trp Pro Phe Vai Vai Ser Gly Ser Glu 1265 1270 12751280Glu Asp Asn Ala Gin Gly He Trp Pro Phe Vai Vai Ser Gly Ser Glu 1265 1270 12751280

Gly Vai Glu Asp Asn Arg lie His Leu Ser Glu Leu His Ala Pro Phe 1285 12901295Gly Vai Glu Asp Asn Arg lie His Leu Ser Glu Leu His Ala Pro Phe 1285 12901295

Thr Gin Ala Gly Trp Asp Vai Lys Lys Met Asp Asp Vai Leu Asp Gly 1300 13051310Thr Gin Ala Gly Trp Asp Vai Lys Lys Met Asp Asp Vai Leu Asp Gly 1300 13051310

Lys Trp Ser Vai Lys Ala Asn Gly Leu lie Gin Lys Gly Thr Leu lie 1315 13201325Lys Trp Ser Vai Lys Ala Asn Gly Leu lie Gin Lys Gly Thr Leu lie 1315 13201325

Tyr Gin Thr lie Pro Gin Asn Vai Lys Leu Glu Pro Gly Glu Thr Tyr 1330 13351340Tyr Gin Thr lie Pro Gin Asn Vai Lys Leu Glu Pro Gly Glu Thr Tyr 1330 13351340

Lys Vai Ser Phe Lys Tyr Gin Ser Gly Ser Asp Asp lie Tyr Ala lie 1345 1350 13551360Lys Vai Ser Phe Lys Tyr Gin Ser Gly Ser Asp Asp lie Tyr Ala lie 1345 1350 13551360

Ala Thr Gly Asp Gly Glu Tyr Asn Ala Ser Thr Vai Lys Leu Thr Asn 1365 13701375Ala Thr Gly Asp Gly Glu Tyr Asn Ala Ser Thr Vai Lys Leu Thr Asn 1365 13701375

Leu Lys Lys Ala Leu Gly Glu Asp Gly Thr Ala Glu Phe Glu lie Thr 1380 13851390Leu Lys Lys Ala Leu Gly Glu Asp Gly Thr Ala Glu Phe Glu lie Thr 1380 13851390

Gly Ser lie Thr Gly Asp Ser Trp Phe Gly lie Tyr Ser Thr Ser Thr 1395 14001405Gly Ser lie Thr Gly Asp Ser Trp Phe Gly lie Tyr Ser Thr Ser Thr 1395 14001405

Ala Pro Asp Leu Gin Asn Thr Ser Asp Ser Ala Ala Ala Phe Gly Gly 1410 14151420Ala Pro Asp Leu Gin Asn Thr Ser Asp Ser Ala Ala Ala Phe Gly Gly 1410 14151420

Tyr Lys Asp Phe Vai Leu Asp Asp Leu Lys Vai Glu His Vai Ala Ser 1425 1430 14351440Tyr Lys Asp Phe Vai Leu Asp Asp Leu Lys Vai Glu His Vai Ala Ser 1425 1430 14351440

Ala Glu Arg Thr Lys Ala Asp Ala Glu Ala Lys Leu Lys Glu Vai Lys 1445 14501455Ala Glu Arg Thr Lys Ala Asp Ala Glu Ala Lys Leu Lys Glu Vai Lys 1445 14501455

Asp Thr Tyr Asn Gly Lys Ser Gly Asp Tyr Ser Ala Glu Vai Trp Thr 1460 14651470Asp Thr Tyr Asn Gly Lys Ser Gly Asp Tyr Ser Ala Glu Vai Trp Thr 1460 14651470

- 21 043487- 21 043487

Thr Туг Vai Asn Thr Vai Ala Glu He Glu Ala Leu He Ala Lys Asp 1475 14801485Thr Thug Vai Asn Thr Vai Ala Glu He Glu Ala Leu He Ala Lys Asp 1475 14801485

Lys Pro Asp Tyr Thr Thr Ala Tyr Asn Lys Ala Vai Ala Leu Ala Glu 1490 14951500Lys Pro Asp Tyr Thr Thr Ala Tyr Asn Lys Ala Vai Ala Leu Ala Glu 1490 14951500

Tyr Met Lys Asn Ala Pro Gly Asp Asp Ser Asn Asp Ala Tyr Asp Vai 1505 1510 15151520Tyr Met Lys Asn Ala Pro Gly Asp Asp Ser Asn Asp Ala Tyr Asp Vai 1505 1510 15151520

Ala Thr Asp Ala Tyr Thr Vai Glu Ala Gly Ser Gin Gin Ala Leu Ser 1525 15301535Ala Thr Asp Ala Tyr Thr Vai Glu Ala Gly Ser Gin Gin Ala Leu Ser 1525 15301535

Gly Gly Asn Glu Gly Pro Ala Ser Leu Ala Gin Asp Gly Asn Ala Gly 1540 15451550Gly Gly Asn Glu Gly Pro Ala Ser Leu Ala Gin Asp Gly Asn Ala Gly 1540 15451550

Thr His Trp His Thr Ser Trp Ser Ala Asn Ala Vai Ser Ala Gly Thr 1555 15601565Thr His Trp His Thr Ser Trp Ser Ala Asn Ala Vai Ser Ala Gly Thr 1555 15601565

Ala Trp Tyr Gin Phe Asn Leu Asn Glu Pro Thr Thr lie Asp Gly Leu 1570 15751580Ala Trp Tyr Gin Phe Asn Leu Asn Glu Pro Thr Thr lie Asp Gly Leu 1570 15751580

Arg Tyr Met Ala Arg Ser Gly Ser Ala Asn Ala Asn Gly Lys lie Lys 1585 1590 15951600Arg Tyr Met Ala Arg Ser Gly Ser Ala Asn Ala Asn Gly Lys lie Lys 1585 1590 15951600

Lys Tyr Lys lie Thr Leu Thr Leu Ser Asp Gly Thr Thr Lys Asp Vai 1605 16101615Lys Tyr Lys lie Thr Leu Thr Leu Ser Asp Gly Thr Thr Lys Asp Vai 1605 16101615

Vai Thr Asn Gly Thr Phe Thr Thr Thr Ser Gly Vai Trp Gin Lys Vai 1620 16251630Vai Thr Asn Gly Thr Phe Thr Thr Thr Ser Gly Vai Trp Gin Lys Vai 1620 16251630

Lys Phe Asp Ala Vai Lys Asn Vai Thr Lys Vai Arg lie Thr Ala Leu 1635 16401645Lys Phe Asp Ala Vai Lys Asn Vai Thr Lys Vai Arg lie Thr Ala Leu 1635 16401645

Glu Thr Ala Gly Gin Ser Ala Gly Glu Vai Asn Thr Tyr Ala Ser Ala 1650 16551660Glu Thr Ala Gly Gin Ser Ala Gly Glu Vai Asn Thr Tyr Ala Ser Ala 1650 16551660

Ala Glu Leu Arg Vai Thr Thr Vai Arg Asp Vai Pro Ser Thr Glu Vai 1665 1670 16751680Ala Glu Leu Arg Vai Thr Thr Vai Arg Asp Vai Pro Ser Thr Glu Vai 1665 1670 16751680

Lys Vai Asn Lys Cys Asp Leu Gin Asn Leu Tyr Asp Asp Ala Ser Ala 1685 16901695Lys Vai Asn Lys Cys Asp Leu Gin Asn Leu Tyr Asp Asp Ala Ser Ala 1685 16901695

Leu Thr Glu Ala Thr Tyr Thr Ala Asp Thr Trp Lys Vai Leu Vai Ala 1700 17051710Leu Thr Glu Ala Thr Tyr Thr Ala Asp Thr Trp Lys Vai Leu Vai Ala 1700 17051710

Lys Arg Asp Ala Ala Lys Lys Vai Leu Asp Asp Glu Asn Ala Thr Ala 1715 17201725Lys Arg Asp Ala Ala Lys Lys Vai Leu Asp Asp Glu Asn Ala Thr Ala 1715 17201725

Tyr Asp Vai Ala Leu Ala Tyr Gin Asn Leu Lys Asp Ala lie Ala AlaTyr Asp Vai Ala Leu Ala Tyr Gin Asn Leu Lys Asp Ala lie Ala Ala

1730 173517401730 17351740

- 22 043487- 22 043487

Leu Glu Glu Arg Vai Asp Thr Ser Lys Leu Ala Gly Leu Vai Ala AspLeu Glu Glu Arg Vai Asp Thr Ser Lys Leu Ala Gly Leu Vai Ala Asp

1745 1750 1755 17601745 1750 1755 1760

Ala Glu Lys Leu Lys Glu Ser Ala Tyr Thr Lys Asp Ser Trp Ala AlaAla Glu Lys Leu Lys Glu Ser Ala Tyr Thr Lys Asp Ser Trp Ala Ala

1765 1770 17751765 1770 1775

Phe Lys Lys Ala Leu Asp Ala Ala Lys Ala Vai Leu Asn Asn Ala Asn 1780 17851790Phe Lys Lys Ala Leu Asp Ala Ala Lys Ala Vai Leu Asn Asn Ala Asn 1780 17851790

Ala Thr Lys Ala Asp Vai Asp Ala Ala Tyr Asn Ala Leu Asn Ala Ala 1795 18001805Ala Thr Lys Ala Asp Vai Asp Ala Ala Tyr Asn Ala Leu Asn Ala Ala 1795 18001805

Met Lys Ala Leu Lys Pro Ala Ser Ser Lys Pro Thr Pro Asn Pro Glu 1810 18151820Met Lys Ala Leu Lys Pro Ala Ser Ser Lys Pro Thr Pro Asn Pro Glu 1810 18151820

Thr Thr Asp Lys Ser Lys Leu Gin Ala Thr He Asp Gin Ala Lys AlaThr Thr Asp Lys Ser Lys Leu Gin Ala Thr He Asp Gin Ala Lys Ala

1825 1830 183518401825 1830 18351840

Leu Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Lys Ser Vai Gin Ala Vai Arg AspLeu Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Lys Ser Vai Gin Ala Vai Arg Asp

1845 185018551845 18501855

Ala Leu Ala Lys Ala Gin Ser Vai Leu Ala Asp Asp Asn Ala Thr Gin 1860 18651870Ala Leu Ala Lys Ala Gin Ser Vai Leu Ala Asp Asp Asn Ala Thr Gin 1860 18651870

Ala Asp lie Asp Ala Ala Gin Lys Ala Leu Ala Asp Ala lie Ala Ala 1875 18801885Ala Asp lie Asp Ala Ala Gin Lys Ala Leu Ala Asp Ala lie Ala Ala 1875 18801885

Leu Glu Lys Ala Asp Ala Asn Gly Asn Ala lie Ser Lys Thr Gly Ala 1890 18951900Leu Glu Lys Ala Asp Ala Asn Gly Asn Ala lie Ser Lys Thr Gly Ala 1890 18951900

Asn Vai Ala Vai He Gly Met Ala Gly Met Met Leu Vai Ala Ala Ala 1905 1910 19151920Asn Vai Ala Vai He Gly Met Ala Gly Met Met Leu Vai Ala Ala Ala 1905 1910 19151920

Gly Ala Vai Phe lie Ala Arg Lys Arg Ala Glu 19251930 <210> 8 <211 > 316 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum <400> 8Gly Ala Vai Phe lie Ala Arg Lys Arg Ala Glu 19251930 <210> 8 <211 > 316 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum <400> 8

Met Cys Thr Gly Vai Arg Phe Ser Met Cys Thr Gly Vai Arg Phe Ser Asp Asp Glu Gly Asn Met Tyr Phe Asp Asp Glu Gly Asn Met Tyr Phe 1 5 Gly Arg Asn Leu Asp Trp Ser Phe 15 Gly Arg Asn Leu Asp Trp Ser Phe 10 15 Ser Tyr Gly Glu Thr lie Leu Vai 10 15 Ser Tyr Gly Glu Thr lie Leu Vai 2 0 Thr Pro Arg Gly Tyr Gin Tyr Asp 20 Thr Pro Arg Gly Tyr Gin Tyr Asp 2 5 3 0 Tyr Vai Tyr Gly Ala Glu Gly Lys 2 5 3 0 Tyr Vai Tyr Gly Ala Glu Gly Lys

- 23 043487- 23 043487

40 4540 45

Ser Glu 5 0 Ser Glu 50 Pro Asn Ala Vai He Gly Vai Gly Vai Vai Met Vai Asp Arg Pro Asn Ala Vai He Gly Vai Gly Vai Vai Met Vai Asp Arg 5 5 5 5 6 0 6 0 Pro Met Pro Met Tyr Phe Asp Cys Ala Tyr Phe Asp Cys Ala Asn Glu His Gly Leu Ala lie Ala Gly Asn Glu His Gly Leu Ala lie Ala Gly 6 5 Leu Asn 6 5 Leu Asn 7 0 Phe Pro Gly Tyr Ala 7 0 Phe Pro Gly Tyr Ala 7 5 8 0 Ser Phe Ala His Glu Pro Vai Glu Gly 7 5 8 0 Ser Phe Ala His Glu Pro Vai Glu Gly Thr Glu Thr Glu 8 5 Asn Vai Ala Thr Phe 8 5 Asn Vai Ala Thr Phe 9 0 9 5 Glu Phe Pro Leu Trp Vai Ala Arg Asn 9 0 9 5 Glu Phe Pro Leu Trp Vai Ala Arg Asn Phe Asp Phe Asp 1 0 0 Ser Vai Asp Glu Vai 100 Ser Vai Asp Glu Vai 105 110 Glu Glu Ala Leu Lys Asn Vai Thr Leu 105 110 Glu Glu Ala Leu Lys Asn Vai Thr Leu

115 120 125115 120 125

Vai Ser Gin Vai Vai Pro Gly Gin Gin Glu Ser Leu Leu His Trp Phe 130 135140Vai Ser Gin Vai Vai Pro Gly Gin Gin Glu Ser Leu Leu His Trp Phe 130 135140

He Gly Asp Gly Thr Arg Ser lie Vai Vai Glu Gin Met Ala Asp Gly 145 150 155160He Gly Asp Gly Thr Arg Ser lie Vai Vai Glu Gin Met Ala Asp Gly 145 150 155160

Met His Vai His His Asp Asp Vai Asp Vai Leu Thr Asn Gin Pro Thr 165 170175Met His Vai His His Asp Asp Vai Asp Vai Leu Thr Asn Gin Pro Thr 165 170175

Phe Asp Phe His Met Glu Asn Leu Arg Asn Tyr Met Cys Vai Ser Asn 180 185190Phe Asp Phe His Met Glu Asn Leu Arg Asn Tyr Met Cys Vai Ser Asn 180 185190

Glu Met Ala Glu Pro Thr Thr Trp Gly Lys Ala Glu Leu Ser Ala Trp 195 200205Glu Met Ala Glu Pro Thr Thr Trp Gly Lys Ala Glu Leu Ser Ala Trp 195 200205

Gly Ala Gly Vai Ser Met His Gly He Pro Gly Asp Vai Ser Ser Pro 210 215220Gly Ala Gly Vai Ser Met His Gly He Pro Gly Asp Vai Ser Ser Pro 210 215220

Ser Arg Phe Vai Arg Vai Ala Tyr Thr Asn Thr His Tyr Pro Gin Gin 225 230 235240Ser Arg Phe Vai Arg Vai Ala Tyr Thr Asn Thr His Tyr Pro Gin Gin 225 230 235240

Asn Asn Glu Ala Ala Asn Vai Ser Arg Leu Phe His Thr Leu Vai Ser 245 250255Asn Asn Glu Ala Ala Asn Vai Ser Arg Leu Phe His Thr Leu Vai Ser 245 250255

Vai Gin Met Vai Asp Gly Met Ser Lys Met Gly Asn Gly Gin Phe Glu 260 265270Vai Gin Met Vai Asp Gly Met Ser Lys Met Gly Asn Gly Gin Phe Glu 260 265270

Arg Thr Leu Phe Thr Ser Gly Tyr Ser Gly Lys Thr Asn Thr Tyr Tyr 275 280285Arg Thr Leu Phe Thr Ser Gly Tyr Ser Gly Lys Thr Asn Thr Tyr Tyr 275 280285

Met Asn Thr Tyr Glu Asp Pro Ala lie Arg Ser Phe Ala Met Ser Asp 290 295300Met Asn Thr Tyr Glu Asp Pro Ala lie Arg Ser Phe Ala Met Ser Asp 290 295300

Phe Asp Met Asp Ser Ser Glu Leu He Thr Ala AspPhe Asp Met Asp Ser Ser Glu Leu He Thr Ala Asp

305 310315305 310315

- 24 043487 < 210> 9 < 211> 432 < 212> PRT < 213 > Bifidobacterium bifidum < 400> 9- 24 043487 <210>9 <211>432 <212>PRT <213>Bifidobacterium bifidum <400>9

Met Ala Ala He Glu Ser Vai Tyr Ala Arg Gin He Leu Asp Ser ArgMet Ala Ala He Glu Ser Vai Tyr Ala Arg Gin He Leu Asp Ser Arg

5 10155 1015

Gly Asn Pro Thr Vai Glu Vai lie Leu Asp Thr Glu Asp Gly Ala GluGly Asn Pro Thr Vai Glu Vai lie Leu Asp Thr Glu Asp Gly Ala Glu

25302530

Gly Arg Gly Leu Vai Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Glu Ala Glu AlaGly Arg Gly Leu Vai Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Glu Ala Glu Ala

40454045

Trp Glu Arg Arg Asp Gly Asp Lys Ser Vai Tyr Gly Gly Lys Gly VaiTrp Glu Arg Arg Asp Gly Asp Lys Ser Vai Tyr Gly Gly Lys Gly Vai

55605560

Leu Asn Ala Vai Lys Ala Vai Asn Glu Vai lie Ala Pro Lys Vai lieLeu Asn Ala Vai Lys Ala Vai Asn Glu Vai lie Ala Pro Lys Vai lie

70 758070 7580

Gly Met Asp Ala Thr Asp Gin Arg Ala Leu Asp Asp Leu Met lie GluGly Met Asp Ala Thr Asp Gin Arg Ala Leu Asp Asp Leu Met lie Glu

90959095

Leu Asp Gly Thr Pro Asn Lys Gly Lys Leu Gly Ala Asn Ala lie LeuLeu Asp Gly Thr Pro Asn Lys Gly Lys Leu Gly Ala Asn Ala lie Leu

100 105110100 105110

Gly Vai Ser Leu Ala Ala Leu Tyr Ala Ser Ala Glu Ser Ala Glu LeuGly Vai Ser Leu Ala Ala Leu Tyr Ala Ser Ala Glu Ser Ala Glu Leu

115 120125115 120125

Pro Leu Tyr Arg Tyr lie Gly Gly Thr Asn Gly His lie Leu Pro VaiPro Leu Tyr Arg Tyr lie Gly Gly Thr Asn Gly His lie Leu Pro Vai

130 135140130 135140

Pro Asn Met Asn lie Met Asn Gly Gly Ala His Ala Asp Phe Ala ThrPro Asn Met Asn lie Met Asn Gly Gly Ala His Ala Asp Phe Ala Thr

145 150 155160145 150 155160

Asp lie Gin Glu Tyr Met He Ser Pro Tyr Gly Phe Asp Thr Tyr SerAsp lie Gin Glu Tyr Met He Ser Pro Tyr Gly Phe Asp Thr Tyr Ser

165 170175165 170175

Glu Ala Leu Arg Ala Gly Vai Glu Vai Tyr His Thr Leu Lys Asn VaiGlu Ala Leu Arg Ala Gly Vai Glu Vai Tyr His Thr Leu Lys Asn Vai

180 185190180 185190

Leu Lys Lys Glu Gly Leu Asn Thr Gly Leu Gly Asp Glu Gly Gly PheLeu Lys Lys Glu Gly Leu Asn Thr Gly Leu Gly Asp Glu Gly Gly Phe

195 200205195 200205

Ala Pro Lys Met Lys Ser Asn Glu Asp Ser Leu Lys Tyr lie Met AspAla Pro Lys Met Lys Ser Asn Glu Asp Ser Leu Lys Tyr lie Met Asp

210 215220210 215220

Ala lie Ser Ala Ala Gly Tyr Glu Pro Gly Lys Gin lie Gly lie CysAla lie Ser Ala Ala Gly Tyr Glu Pro Gly Lys Gin lie Gly lie Cys

225 230 235240225 230 235240

- 25 043487- 25 043487

Leu Asp Vai Ala Ser Ser Glu Phe Tyr Asn Lys Glu Thr Gly Lys TyrLeu Asp Vai Ala Ser Ser Glu Phe Tyr Asn Lys Glu Thr Gly Lys Tyr

245 250255245 250255

Arg Phe Asp Gly Glu Glu Arg Asp Ser Ala Tyr Met Leu Asp Tyr TyrArg Phe Asp Gly Glu Glu Arg Asp Ser Ala Tyr Met Leu Asp Tyr Tyr

260 265270260 265270

Glu Asn Leu He Asn Glu Tyr Pro He Vai Ser He Glu Asp Pro PheGlu Asn Leu He Asn Glu Tyr Pro He Vai Ser He Glu Asp Pro Phe

275 280285275 280285

Asn Glu Glu Gly Trp Glu Asp Trp Ala Glu lie Thr Arg Arg Leu GlyAsn Glu Glu Gly Trp Glu Asp Trp Ala Glu lie Thr Arg Arg Leu Gly

290 295300290 295300

Asp Arg Leu Gin Phe Vai Gly Asp Asp Leu Leu Vai Thr Asn Pro AlaAsp Arg Leu Gin Phe Vai Gly Asp Asp Leu Leu Vai Thr Asn Pro Ala

305 310 315320305 310 315320

Arg Leu Arg Lys Ala lie Asp Met Gly Ala Ala Asn Ser Leu Leu VaiArg Leu Arg Lys Ala lie Asp Met Gly Ala Ala Asn Ser Leu Leu Vai

325 330335325 330335

Lys Leu Asn Gin lie Gly Ser Vai Thr Glu Thr Leu Asp Ala lie GluLys Leu Asn Gin lie Gly Ser Vai Thr Glu Thr Leu Asp Ala lie Glu

340 345350340 345350

Leu Ala Thr Glu Asn Gly Tyr Thr Ser Met Vai Ser His Arg Ser GlyLeu Ala Thr Glu Asn Gly Tyr Thr Ser Met Vai Ser His Arg Ser Gly

355 360365355 360365

Glu Thr Pro Asp Thr Thr lie Ser Asp Leu Ala Vai Ala Lys Asn ThrGlu Thr Pro Asp Thr Thr lie Ser Asp Leu Ala Vai Ala Lys Asn Thr

370 375380370 375380

Arg Gin lie Lys Thr Gly Ala Pro Ala Arg Gly Glu Arg Vai Ala LysArg Gin lie Lys Thr Gly Ala Pro Ala Arg Gly Glu Arg Vai Ala Lys

385 390 395400385 390 395400

Tyr Asn Arg Leu Leu Glu lie Glu Glu Glu Leu Gly Ser Thr Ala GinTyr Asn Arg Leu Leu Glu lie Glu Glu Glu Leu Gly Ser Thr Ala Gin

405 410415405 410415

Tyr Ala Gly Tyr Ser Ala Phe Lys Ala Cys Lys Lys Tyr lie Ala LysTyr Ala Gly Tyr Ser Ala Phe Lys Ala Cys Lys Lys Tyr lie Ala Lys

420 425430420 425430

Claims

CLAIM

Strain Bifidobacterium bifidum 8, collection number VKPM AS-2136, used as a probiotic.

^gj) Eurasian Patent Organization, EAPO