EA022163B1 - ДВОЙНЫЕ ИНГИБИТОРЫ PI3 КИНАЗЫ/mTOR - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение обеспечивает соединение имидазо[4,5-с]хинолин-2-она или его фармацевтически приемлемую соль, которое ингибирует как PI3K, так и mTOR и поэтому подходит для лечения рака.

Description

Фосфоинозитид-3-киназы (Р13Кк) представляют собой семейство липидных киназ, которые запускают внутриклеточные сигнальные каскады, регулирующие широкий спектр клеточных процессов. Например, активация Р13К инициирует каскад сигнальной трансдукции, который способствует росту, выживаемости и метаболизму раковых клеток. Мишень рапамицина у млекопитающих (тТОК) является ключевым узлом сигналлинга, координирующим прохождение по клеточному циклу и рост клеток в ответ на генетические, эпигенетические условия и условия окружающей среды. Регуляция путей, участвующих в передаче сигналов тТОК, нарушена в предраковых тканях человека. С учетом роли, которую играют Р13К и тТОК в путях клеточного цикла, ингибирование и Р13К, и тТОК может быть полезным для лечения некоторых заболеваний человека, таких как рак.

Ингибиторы Р13К и двойные ингибиторы Р13К/тТОК широко известны в данной области техники. В публикации \УО 2010/038165 описаны некоторые соединения имидазол[1,5]нафтиридина, которые относят к модуляторам или ингибиторам фермента Р13-Ка и/или двойным ингибиторам Р13-Ка/тТОК. В публикациях \УО 2010/139731 и \УО 2010/139747 описаны некоторые соединения имидазолхинолина, предложенные для применения для лечения заболеваний, опосредованных протеинкиназами или липидными киназами, в частности заболеваний, опосредованных Р13К.

Сохраняется необходимость в создании альтернативных ингибиторов Р13К/тТОК, особенно в мощных ингибиторах Р13К/тТОК с полезными физическими свойствами, такими как улучшенная растворимость, и/или желательными клиническими свойствами, такими как улучшенная активность ίη νίνο, и/или фармакокинетическими свойствами, которые могут быть использованы при лечении заболеваний, обусловленных пролиферацией клеток, таких как рак. Настоящее изобретение обеспечивает мощные ингибиторы Р13К/тТОК. Более конкретно, настоящее изобретение обеспечивает мощные ингибиторы Р13К/тТОК с полезными физическими свойствами и/или желательными клиническими свойствами, которые являются полезными противораковыми агентами.

Настоящее изобретение обеспечивает соединение, которое представляет собой 8-[5-(1-гидрокси-1метилэтил)пиридин-3 -ил] -1-[(2 §)-2-метоксипропил] -3 -метил-1,3 -дигидро -2Н-имидазо [4,5-с] хинолин-2он или его фармацевтически приемлемую соль.

Согласно конкретному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает соединение, которое представляет собой 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2§)-2-метоксипропил]-3метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он.

В другом варианте реализации оно представляет собой 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3ил]-1-[(2§)-2-метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он в кристаллической форме.

Настоящее изобретение также обеспечивает 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2§)-2метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он в кристаллической форме, которая характеризуется рентгеновской порошковой дифрактограммой, содержащей характеристические пики, в 2θ±0,2 при 8,57 и один или несколько из 9,06, 15,93, 18,29 и 18,87.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую 8-[5-(1гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2§)-2-метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5с]хинолин-2-он или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую 8-[5-(1гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2§)-2-метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5с]хинолин-2-он или его фармацевтически приемлемую соль, дополнительно содержащую один или несколько лекарственных ингредиентов.

Настоящее изобретение обеспечивает способ лечения рака, включающий введение пациенту, который в этом нуждается, эффективного количества 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2§)-2метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-она или его фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение обеспечивает использование 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]1-[(2§)-2-метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-она или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения рака.

Настоящее изобретение обеспечивает 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2§)-2метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он или его фармацевтически приемлемую соль для применения для лечения.

Настоящее изобретение обеспечивает 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2§)-2метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он или его фармацевтически приемлемую соль для применения для лечения рака.

Более того, настоящее изобретение обеспечивает предпочтительные варианты реализации способов и применений согласно настоящему описанию, в которых рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака желудка, рака головы и шеи, НМРЛ, рака молочной железы, меланомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, глиобластомы,

- 1 022163 рака легкого, рака почки, саркомы, рака кроветворной и лимфоидной тканей, рака центральной нервной системы, рака шейки матки, рака эндометрия, рака печени, рака кожи, рака желудка, рака щитовидной железы, рака верхних отделов желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей и рака мочеполовой системы.

Следует понимать, что используемые выше и во всем описании изобретения следующие термины, если не указано иное, имеют следующие значения.

Термин фармацевтически приемлемая соль или фармацевтически приемлемые соли обозначает относительно нетоксичные, неорганические и органические соли соединений согласно настоящему изобретению.

Термины лечение, лечить и т.п. включают замедление или реверсию прогрессирования заболевания. Эти термины также включают облегчение, уменьшение интенсивности симптомов, ослабление, устранение или уменьшение одного или нескольких симптомов расстройства или состояния, даже если расстройство или состояние в действительности не устранено и даже если прогрессирование заболевания или состояния само по себе не замедлилось или направление хода заболевания не изменено.

Терапевтически эффективное количество или эффективное количество означает количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно настоящему изобретению, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ или оказывать желаемый терапевтический эффект на ткань, систему, животное, млекопитающее или человека, которого добивается исследователь, ветеринар, врач или другой доктор-клиницист.

Соединения по настоящему изобретению способны вступать в реакцию, например, с рядом неорганических и органических кислот с образованием фармацевтически приемлемых солей. Такие фармацевтически приемлемые соли и обычная методика их получения хорошо известны в данной области. См., например, Р. 8!аЬ1, е! а1., НапбЬоок οί РЬаттасеиЬса1 8аЬь: РгорегЪек, 8с1ссЧоп. апб Ике, (УСНАЖбеуУСН, 2002); 8.М. Вегде, е! а1., РЬагтасеибса1 8аЪ8, 1онгпа1 οί РЬагтасеибса1 8с1епсе8, Уо1. 66, Ыо. 1, •Гапиагу 1977.

Соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно изготавливают в виде фармацевтических композиций с использованием одного или нескольких фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или наполнителей и вводят различными путями. Предпочтительно такие композиции предназначены для перорального, подкожного или внутривенного введения. Такие фармацевтические композиции и способы их приготовления хорошо известны в данной области техники. См., например, КетшдГоп: ТЬе 8шепсе апб РгасЬсе оГ РЬагтасу (А. Оеппаго, е! а1., ебк., 2151 еб., Маск РиЬЬкЫпд Со., 2005).

Количество соединения согласно настоящему изобретению, которое будут фактически вводить, определит лечащий врач при соответствующих обстоятельствах, включая состояние, подлежащее лечению, выбранный путь введения, вводимое конкретное соединение согласно настоящему изобретению, возраст, вес и реакцию отдельного пациента, а также тяжесть симптомов пациента. Дневная доза обычно находится в пределах от примерно 1 до примерно 2000 мг. В некоторых случаях уровни доз меньше нижнего предела вышеуказанного диапазона могут быть более чем достаточными, тогда как в других случаях могут быть использованы еще большие дозы.

Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены различными методами, известными в данной области техники, а также согласно описанию в разделах Приготовления и Примеры ниже. Специфические этапы синтеза для каждого из описанных путей могут быть объединены различными способами для получения соединений согласно настоящему изобретению.

Реагенты и исходные материалы обычно доступны в готовом виде для специалиста в данной области. Другие могут быть получены стандартными методами органической химии и химии гетероциклических соединений и методами аналогичных синтезу известных структурно подобных соединений, и процедурам, описанным в разделах Приготовления и Примеры ниже, включая любые новые процедуры. Следующие разделы Приготовления и Примеры приведены с целью более подробной иллюстрации изобретения и представляют собой типичный синтез соединений. Названия соединений согласно настоящему изобретению обычно присваиваются с использованием 8уту\Эга\у 3.2.

Согласно настоящему описанию следующие термины имеют указанные значения: АТФ означает аденозинтрифосфат; АИС означает площадь под кривой; ЦНС означает центральную нервную систему; ΌΜΕΜ означает среду Игла в модификации Дульбекко; ДМСО означает диметилсульфоксид; ДТТ означает дитиотреитол; 4Е-ВР1 означает белок 1, связывающий 4Е; ФБС означает фетальную бычью сыворотку; ЭДТА означает этилендиаминтетрауксусную кислоту; ЕСТА обозначает этиленгликоль-бис-(ааминоэтиловый эфир)-ЦЫ,№,№-тетрауксусную кислоту; СЕР означает зеленый флуоресцентный белок; С8Т означает глутатион-8-трансферазу; ГЭЦ означает гидроксиэтилцеллюлозу; НЕРЕ8 обозначает N-2гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этансульфоновую кислоту; ВЭЖХ обозначает жидкостную хроматографию при высоких давлениях; 1С₅₀ обозначает ингибирующую концентрацию, равную половине максимальной; ΙΜΌΜ обозначает среду Дульбекко в модификации Исков; МЕМ обозначает минимально обогащенную среду; МС обозначает масс-спектроскопию; ЯМР обозначает ядерный магнитный резонанс;

- 2 022163

НМКРЛ обозначает немелкоклеточный рак легкого; РВ§ обозначает фосфатно-солевой буфер; РОК обозначает фосфоглицерат киназу; Р1Р2 обозначает фосфатидилинозитол-(4,5)-бисфосфат; РО обозначает перорально; РОР8 обозначает пальмитил-олеил фосфатидилсерин; РР1 обозначает ингибитор протонной помпы; КРМ1 обозначает мемориальный институт Ро5\\е11 Рагк; КТ обозначает комнатную температуру; ТТЛ обозначает трифторуксусную кислоту; ΤΜΕΌ50 обозначает порог минимальной эффективной дозы; ТК-РКЕТ обозначает резонансный перенос энергии возбуждения с временным разрешением; Тп5 обозначает трис(гидроксиметил)аминометан; ТпЮп-Х обозначает 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенилполиэтиленгликоль ΐ-октилфеноксиполиэтоксиэтанол полиэтиленгликоль трет-октилфенил эфир, Т\\ееп20 обозначает полисорбат 20; ΧΚΌ обозначает рентгеновскую дифракцию порошка.

Пример получения 1. (2§)-2-Метоксипропан-1-амин гидрохлорид

Охладить раствор трет-бутил [(2§)-2-гидроксипропил]карбамата (870 г, 4,96 моль) в тетрагидрофуране (10 л) до 5°С. Добавить гидрид натрия (60% дисперсия, 248 г, 6,21 моль, 1,25 экв.) порциями в течение 8 мин. Перемешивать реакционную смесь при 5°С в течение 30 мин. Добавить метилйодид (387 мл, 6,21 моль, 1,25 экв.) по каплям в течение 5 мин и дать реакции продолжаться при 5-10°С в течение 45 мин. Остановить реакцию добавлением воды (1 л) и провести экстракцию этилацетатом (4 л). Получить органический слой и сконцентрировать его в вакууме для получения остатка. Провести одновременное испарение с толуолом (2х 1 л), разбавить дихлорметаном (2 л) и отфильтровать. Промыть остаток дополнительным дихлорметаном (500 мл). Концентрировать объединенный жидкий фильтрат дихлорметана в вакууме для получения неочищенного промежуточного соединения трет-бутил Ν-[(2δ)-2метоксипропил]карбамата (880 г, 94%).

Суспендировать неочищенное промежуточное соединение трет-бутил Ν-[(2δ)-2метоксипропил]карбамат (806 г, 4,26 ммоль) в дихлорметане (3,22 л) и добавить 4М НС1 в диоксане (2,66 л) по каплям в течение 30 мин при 15°С. Перемешивать реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 ч. Отфильтровать и промыть остаток дополнительным дихлорметаном (2х250 мл) и удалить летучие вещества в вакууме для получения сухого остатка. Добавить трет-бутил эфир (2 л) к осадку и отфильтровать; промыть осадок дополнительным метил трет-бутил эфиром (2х500 мл), высушить и дальше промыть осадок ацетоном (4х500 мл) для получения белого порошка соединения, обозначенного в названии (171 г, 32%).

'II ЯМР (300,13 МГц, ΌΜδΟ): 8,11 (5, 3Н), 3,62-3,55 (т, 1Н), 3,26 (5, 3Н), 2,87 (άά, 1 = 3,6, 13,2 Гц, 1Н), 2,68 (άά, 1 = 8,5, 13,2 Гц, 1Н), 1,10 (ά, 1 = 6,3 Гц, 3Н).

Пример получения 2. Этил 6-бром-4-хлорхинолин-3-карбоксилат

Суспендируют этиловый эфир 6-бром-4-гидроксихинолин-3-карбоксикислоты (11 г, 37 ммоль) в безводном диметилформамиде (148,6 мл) в атмосфере азота. Добавляют фосфорилхлорид (20,7 мл, 222 ммоль, 6 экв.) с помощью шприца в течение 5 мин и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Останавливают реакцию посредством выливания смеси в ледяную воду (1,5 л) и продолжают перемешивать до тех пор, пока лед не растает. Образовавшийся осадок получают фильтрованием, промывают водой и оставляют до полного высыхания для получения обозначенного в названии соединения (11,4 г, 94%). Μδ (ΕδΙ) т/ζ (М+Н)+ 314,0, 316,0.

В другом случае готовят этиловый эфир 6-бром-4-гидроксихинолин-3-карбоксикислоты согласно описанию ниже и используют для приготовления обозначенного в названии соединения. Растворяют диэтил 2-(((4-бромфенил)амино)метилен)малонат (25,6 г, 74,8 ммоль) в 2-метилтетрагидрофуране (107 мл) и переносят в насос. Затем насос подает от 19 до 21 мл данного раствора в реактор 25 мл при 240-260°С при давлении азота 575-700 ρδί для того, чтобы оставаться выше упругости пара раствора реагентов. Через приблизительно 60-180 мин нахождения при данной температуре полученная суспензия выходит из реактора через клапан и затем через погружную трубу в зону разгерметизации и охлаждения объемом 10 мл на дне реактора. Затем второй по очереди клапан отправляет суспензию в находящийся на одной оси нагнетательный фильтр. Эту последовательность опустошения реактора дополнительно повторяют два раза перед повторным заполнением реактора согласно описанию выше для гарантии того, что остатки суспензии удаляются до минимального объема и для обеспечения давления азота на каждом листовом фильтре. Автоматический цикл повторяют несколько раз, и осадок накапливается со временем на одном и том же листовом фильтре. Если выработку проводят в течение нескольких дней, будут параллельно

- 3 022163 использоваться по меньшей мере 2 фильтра для того, чтобы можно было промыть отключенный фильтр и удалить осадок без остановки реактора с прерывистым потоком. После проведения 5 дополнительных циклов подобным образом в реактор направляют 2-метилтетрагидрофуран (20 мл) и переносят в фильтр. Этот режим можно назвать режимом с прерывистым потоком, полунепрерывным или последовательным автоматизированным. В любом случае, аспекты этого режима работы, которые делают его похожим на непрерывную реакцию, заключаются в том, что температура и давление в реакторе не меняются со временем, а всегда остаются в условиях реакции, нагревание и охлаждение происходит очень быстро для реагентов, поступающих в реактор, и продуктов, вытекающих из реактора, период нагревания и охлаждения являются масштабируемыми, и время нахождения реагентов и продуктов в реакторе одинаковы в любом масштабе благодаря контролю входящих и исходящих потоков и возможности внешнего нагрева/охлаждения по отношению к реактору. После высушивания собирают этиловый эфир 6-бром-4гидроксихинолин-3-карбоксикислоты (4,66 г, 21%). Полученные фильтраты, обогащенные этил 2-(((4бромфенил)амино)метилен)малонатом, концентрируют для удаления этанола, достигающего 7,8 г, и перерастворяют в 2-метилтетрагидрофуране. Часть данного материала (4,8 г) повторно подвергают воздействию условий реакции и собирают дополнительный этиловый эфир 6-бром-4-гидроксихинолин-3карбоксикислоты (0,56 г) для получения общей доли выхода 25%.

¹Н-ЯМР: (399,84 МГц, ТРА-й), δ (ррт): 1,52 (3Н, ΐ, I = 7,04 Гц), 4,67 (2Н, ц, I = 7,03 Гц), 8,03 (1Н, й, 1 = 8,79 Гц), 8,28 (1Н, й, 1 = 8,79 Гц), 8,80 (1Н, 5), 9,32 (1Н, 5); ¹³С ЯМР (100,54 МГц, ТРА-й), δ (ррт): 11,9; 64,7; 105,3; 121,0; 121,2; 124,9; 126,9; 137,9; 141,1; 145,0; 167,2; 172,4.

Пример получения 3. 2-(5-Бром-3-пиридил)пропан-2-ол

Способ 1.

Добавляют раствор этил 5-бромпиридин-3-карбоксилата (22,5 г, 98 ммоль) в тетрагидрофуране (350 мл) в раствор 3М бромида метилмагния в диэтиловом эфире (98 мл, 293 ммоль, 3 экв.) при внутренней температуре ниже 30°С. После завершения реакции охлаждают смесь на ледяной бане и останавливают реакцию насыщенным водным хлоридом аммония и продолжают перемешивать до растворения большей части осадка. Добавляют воду (500 мл) и проводят экстракцию с использованием этилацетата (3x500 мл). Высушивают органический слой над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют органический слой до осадка. Очищают осадок с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с элюцией этилацетатом:гексаном (1:1) для получения обозначенного в названии продукта в виде масла (19,4 г, 92%). МБ (ΕδΙ) т/ζ (М+Н)+ 214,9, 216,9.

Способ 2.

Добавляют раствор метил 5-бромпиридин-3-карбоксилата (173 г, 800 ммоль) в тетрагидрофуране (2,6 л) по каплям в 3М раствор метилмагнийбромида в диэтиловом эфире (800 мл, 3,0 экв.) в течение 30 мин в охлаждающей бане при внутренней температуре ниже 18°С. Перемешивают смесь при комнатной температуре в течение 1 ч, затем охлаждают ее до 0°С и останавливают реакцию насыщенным водным раствором хлорида аммония (500 мл). Добавляют насыщенный водный раствор бикарбоната натрия (1 л) и оставляют разделяться на слои. Получают органический слой и концентрируют его толуолом (1 л) для азеотропного связывания воды для получения обозначенного в названии соединения (168 г, 97%) в виде оранжевого масла.

Ή ЯМР (300,13 МГц, ΌΜδΟ): 8,66 (й, 1 = 1,9 Гц, 1Н), 8,55 (й, 1 = 2,2 Гц, 1Н), 8,06 (ΐ, I = 2,2 Гц, 1Н), 5,38 (5, 1Н), 1,45 (5, 6Н).

Пример получения 4. 2-[5-(4,4,5,5-Тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-3-пиридил]пропан-2-ол

Тщательно продували азотом смесь 2-(5-бром-3-пиридил)пропан-2-ола (18,5 г, 85,7 ммоль), бис(пинаколат)диборона (44 г, 171 ммоль, 2 экв.) и ацетата калия (25,2 г, 257 ммоль, 3 экв.) в 1,4диоксане (428 мл). Добавляют (1,1'-бис(дифенилфосфин)ферроцен)палладий(11) хлорид (3,5 г, 4,3 ммоль), удаляют смесь и продувают через реакцию дважды азот. Нагревают смесь при 90°С в течение ночи. Охлаждают и разбавляют этилацетатом (1 л) и обрабатывают ультразвуком в течение 30 мин. Фильтруют через подложку из СеШе® и высушивают жидкий фильтрат над сульфатом натрия. После фильтрации концентрируют органическую жидкость и повторно растворяют в этилацетате (1 л) и снова фильтруют через подложку из СеШе®. Концентрируют фильтрат и суспендируют осадок в диэтиловом эфире (100 мл), а затем в гексане (700 мл). В течение короткого времени обрабатывают ультразвуком и фильтруют для получения сухого остатка для получения обозначенного в названии соединения в виде неочищенного

- 4 022163 осадка (18,5 г). Μδ (ΕδΙ) т/ζ (М+Н)+ 264,0.

Пример получения 5. 3τπΛ-6-6ροΜ-4-[[(2δ)-2-Μ€τοκ№προππΛ]αΜΠΗθ]χπΗθΛΠΗ-3-καρ6οκ№Λατ

Суспендировали этил-6-бром-4-хлорхинолин-3-карбоксилат (389 г, 1,24 моль) и (2δ)-2метоксипропан-1-амин гидрохлорид (171 г, 1,36 моль, 1,1 экв.) в этаноле (5,84 л). Добавляют диизопропилэтиламин (474 мл) и нагревают смесь при 50°С в течение ночи. Через 16 ч охлаждают реакцию до комнатной температуры и концентрируют в вакууме. Добавляют метил-трет-бутиловый эфир (2 л) к осадку и перемешивают в течение 20 мин. Фильтруют концентрат и промывают его метил-третбутиловым эфиром (2x250 мл). Концентрируют и фильтруют в вакууме для получения обозначенного в названии соединения, по существу, с количественным выходом. Это соединение будет использовано на следующем этапе без дальнейшей очистки. Μδ (ΕδΙ) т/ζ (М+Н)+ 367,0, 369,0.

Пример получения 6. 6-Бροм-4-[[(2δ)-2-меτοκсиπροπил]аминο]χинοлин-3-κаρбοκсиκислοτа

Добавляют раствор гидроксида натрия (296,7 г, 7,42 моль, 6 экв.) в воде (454 мл) в раствор этил-6бροм-4-[[(2δ)-2-меτοκсиπροπил]аминο]χинοлин-3-κаρбοκсилаτа (454 г, 1,24 моль) в тетрагидрофуране (4,54 л) при комнатной температуре. Нагревают смесь при 50°С в течение ночи. Через 18 ч охлаждают реакцию до 0°С, добавляют 37% водный НС1 по каплям в течение 30 мин до рН 6 (приблизительно 450 мл) при температуре ниже 23°С. Фильтруют образовавшийся осадок через фильтровальную бумагу и промывают его последовательно в воде (2 л), ацетоне (2 л) и метил-трет-бутиловом эфире (2 л). Высушивают белый остаток для получения обозначенного в названии соединения (359 г, 86%). Μδ (ΕδΙ) т/ζ (М+Н)+ 338,9, 340,9.

Пример получения 7. 8-Бροм-1-[(2δ)-2-меτοκсиπροπил]-3Н-имидазοл[4,5-с]χинοлин-2-οн

Суспендируют 6-бροм-4-[[(2δ)-2-меτοκсиπροπил]аминο]χинοлин-3-κаρбοκсиκислοτу (510 г, 1,5 моль) в диметилформамиде (7,65 л) и добавляют триэтиламин (419 мл, 3 моль, 2 экв.) при 70°С. Добавляют дифенилфосфоновый азид (390 мл, 1,8 моль, 1,2 экв.) по каплям в течение 30 мин. Нагревают смесь до 70°С (внутренняя температура) в течение 1 ч. Охлаждают до 10°С и разбавляют водой (5 мл). Перемешивают смесь в течение 1 ч, фильтруют осадок, промывают его водой (2x1 л) и метил-трет-бутиловым эфиром (2x1 л) и затем оставляют его сушиться для получения обозначенного в названии соединения в виде белого порошка (445 г, 88%). Μδ (ΕδΙ) т/ζ (М+Н)+ 335,9, 337,9.

Пример получения 8. 8-Бροм-1-[(2δ)-2-меτοκсиπροπил]-3-меτилимидазοл[4,5-с]χинοлин-2-οн

Способ 1.

Суспендируют 8-бροм-1-[(2δ)-2-меτοκсиπροπил]-3Н-имидазοл[4,5-с]χинοлин-2-οн (10 г, 30 ммоль)

- 5 022163 и тетра-Ы-бутиламмоний бромид (3 г, 9,3 ммоль) в дихлорметане (150 мл). Добавляют 2М водного гидроксида натрия (75 мл, 150 ммоль) при комнатной температуре. Добавляют йодометан (7,5 мл, 120 ммоль) и интенсивно перемешивают смесь в течение ночи при 28°С. Дают произойти разделению фаз. Концентрируют органические соединения в вакууме. Промывают осадок в ацетоне (50 мл) для удаления тетра-Ы-бутиламмоний бромида. Фильтруют смесь для получения обозначенного в названии соединения в виде сухого порошка (5 г, 48%). Μδ (ΕδΙ) т/ζ (М+Н)+ 350,0, 352,0.

Способ 2.

Суспендируют 8-бром-1-[^)-2-метоксипропил]-3Н-имидазол[4,5-с]хинолин-2-он (285 г, 847,7 ммоль) и тетра-Ы-бутиламмоний бромид (82 г, 254 ммоль) в дихлорметане (2,85 л). Добавляют 2М водного гидроксида натрия (1,7 л, 3,4 моль) при комнатной температуре. Добавляют диметилсульфат (160,8 мл, 1,7 моль) и интенсивно перемешивают смесь в течение 3 ч. Дают произойти разделению фаз и получают органический слой. Концентрируют органический слой в вакууме и суспендируют в воде (2,4 л) в течение 30 мин. Фильтруют образовавшийся твердый осадок и промывают его в воде (2x500 мл), гексане (2x500 мл) и высушивают. Обозначенное соединение получают в виде белого порошка (207 г, 70%). Μδ (ΕδΙ) т/ζ (М+Н)+ 350,0, 352,0.

Способ 3.

Суспендируют 8-бром-1-[(2δ)-2-метоксипропил]-3Н-имидазол[4,5-с]хинолин-2-он (50 г, 149 ммоль) и тетра-Ы-бутиламмоний бромид (14,4 г, 44,7 ммоль) в дихлорметане (500 мл). Добавляют 8% раствор гидроксида натрия (600 ммоль). Добавляют йодметан (23,2 г, 163,4 ммоль) и перемешивают при комнатной температуре в течение 22 ч. Отделяют органическую фазу и промывают водой (250 мл). Затем органическую фазу концентрируют и перекристаллизуют из дихлорметана, потом высушивают при температуре ниже 65°С для получения обозначенного в названии соединения (42,7 г, 82%).

Ή ЯМР (СЭС1₃, 400 МГц) δ 8,70 (к, 1Н), 8,50 (б, 1Н, 1 = 2,4 Гц), 7,97 (б, 1Н, 1 = 9,2 Гц), 7,65 (б, 1Н, 1 = 9,2, 2 Гц), 4,32 (т, 2Н), 3,82 (т, 1Н), 3,79 (к, 3Н), 3,28 (к, 3Н), 1,32 (б, 3Н, 1 = 6,4 Гц).

Пример получения 9. Этил 5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пиридин-3-карбоксилат

Добавляют трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (3,98 г, 4,35 ммоль), трициклогексилфосфин (2,44 г, 8,7 ммоль) и ацетат калия (42,65 г, 435 ммоль) в раствор бис(пинаколат)диборона (35,88 г, 141,3 ммоль) в диметилформамиде (175 мл). Продувают азот через смесь в течение 15 мин и затем нагревают до 80-85°С. Затем медленно добавляют в смесь этил 5-бромникотинат (25,0 г, 108,8 ммоль) в диметилформамиде (75 мл) при 80-85°С и перемешивают образовавшуюся смесь при 80-85°С в течение 4-5 ч. Охлаждают реакционную смесь до 15-35°С и затем добавляют метил-трет-бутиловый эфир (250 мл) и воду (250 мл). Фильтруют смесь через диатомит и разделяют органический и водный слои. Проводят обратную экстракцию водного слоя метил-трет-бутиловым эфиром (250 мл). Промывают объединенный органический слой солевым раствором (150 мл) и водой (150 мл). Концентрируют органические соединения в вакууме, проводят перекристаллизацию сырого продукта метил-трет-бутиловым эфиром/гептаном (1:6) и затем высушивают его при температуре ниже 55°С для получения обозначенного в названии соединения в виде серого твердого вещества (18,67 г, 62%).

Ή ЯМР (ацетон-б₆, 400 МГц) δ 1,40-1,43 (т, 15Н), 4,44 (ц, 1=7,1 Гц, 2Н), 8,57 (1, 1=1,9 Гц, 1Н), 9,02 (б, 1=1,5 Гц, 1Н), 9,225 (б, 1=2,3 Гц, 1Н).

Пример получения 10. Этил-5-[1-[(2δ)-2-метоксипропил]-3-метил-2-оксоимидазо[4,5-с]хинолин-8ил] пиридин-3 -карбоксилат

В трехгорлую колбу, содержащую 8-бром-1-[(2δ)-2-метоксипропил]-3-метилимидазо[4,5с]хинолин-2-он (35 г, 100 ммоль), этил 5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пиридин-3карбоксилат (29,1 г, 105 ммоль), этилацетат натрия (28,7 г, 350 ммоль), 1,1'-бис(дифенилфосфин)ферроцен-палладия(П) дихлорид дихлорметан (0,817 г, 1,0 ммоль), добавляют 1,4-диоксан (200 мл) и воду (200 мл) в атмосфере Ν₂. Затем нагревают реакционную смесь до 85°С и продолжают перемешивать в течение 10 ч. Охлаждают реакционную смесь до комнатной температуры. Фильтруют смесь через ЮсксЦиНг® δί1ίαα-Τ1ιίο1 для удаления катализатора. Добавляют воду (400 мл) по капле и осаждают осадок. Фильтруют смесь и промывают твердый осадок водой (400 мл). Перемешивают твердый осадок в этилацетате (70

- 6 022163 мл) при комнатной температуре в течение 1 ч; фильтруют, промывают этилацетатом (70 мл) и высушивают в вакууме при температуре ниже 65°С для получения обозначенного в названии соединения (33,6 г, 80%).

¹Н ЯМР (СЭС1₃, 400 МГц) δ 9,25 (б, 1Н, 1 = 2 Гц), 9,15 (б, 1Н, 1 = 2,4 Гц), 8,75 (5, 1Н), 8,73 (б, 1Н, 1 = 1,6 Гц), 8,65 (1, 1Н), 8,24 (б, 1Н, 1 = 8,8 Гц), 7,89 (б1, 1Н, 1 = 8,8, 1,6 Гц), 4,47 (ц, 2Н), 4,38 (т, 2Н), 3,90 (т, 1Н), 3,64 (5, 3Н), 3,26 (5, 3Н), 1,45 (1, 3Н), 1,37 (б, 3Н, 1 = 6 Гц).

Пример 1. 8-[5-(1-Г идрокси-1 -метилэтил)пиридин-3 -ил]-1-[(28)-2-метоксипропил] -3 -метил-1,3дигидро -2Н -имидазо [4,5-с] хинолин-2 -он

Способ 1.

Растворяли 8-бром-1-[(28)-2-метоксипропил]-3-метилимидазол[4,5-с]хинолин-2-он (0,600 г, 1,7 ммоль) и 2-[5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-3-пиридил]пропан-2-ол (0,9 г, 3,43 ммоль) в тетрагидрофуране (75 мл) и воде (7,5 мл) в закрытой пробирке. Продували через смесь азот. Добавляли фторид калия (400 мг, 6,89 ммоль), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (200 мг, 0,22 ммоль) и тритрет-бутилфосфония тетрафторборат (200 мг, 0,68 ммоль). Закрывали реакцию в азоте и нагревали при 65-70°С в течение ночи. Охлаждали смесь до комнатной температуры, фильтровали для удаления неорганического остатка. Концентрировали фильтрат и разбавляли его дихлорметаном (120 мл) и водой (30 мл). Отделяли органический слой и высушивали его над порошком сульфата магния. Концентрировали его в вакууме до коричневого масла. Очищали осадок с использованием хроматографии на колонке с силикагелем с элюирующим растворителем, состоящим на 30-65% из этилацетата в гексане, затем с 0-7% метанолом в дихлорметане. Концентрировали фракции, содержащие продукт, и одновременно выпаривали по очереди с диэтиловым эфиром (2x10 мл), ацетоном (10 мл), ацетоном и диэтиловым эфиром (по 10 мл). Высушивали твердый остаток для получения обозначенного в названии соединения в виде оранжевого порошка (0,30 г, 44%). Μδ (ΕδΙ) т/ζ (М+Н)+ 407,0.

Способ 2.

Продували азот через суспензию 2-(5-бром-3-пиридил)пропан-2-ола (100 г, 464 ммоль, 1,25 экв.), 4,4,5,5-тетраметил-2-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1,3,2-диоксаборолана (141,4 г, 557 ммоль, 1,5 экв.) и ацетата калия (127,5 г, 1,3 моль) в 1,4-диоксане (2,6 л) в течение 30 мин при комнатной температуре. Добавляли аддукт дихлор-((бис-дифенилфосфин)ферроцетенил)палладий(11) дихлорметана (9 г, 11,14 ммоль) в атмосфере азота и нагревали смесь до 90°С. Перемешивали смесь в течение 3 ч. Охлаждали реакционную смесь до 80°С и затем добавляли 8-бром-1-[(28)-2-метоксипропил]-3-метилимидазо[4,5-с]хинолин-2-он (130 г, 371 ммоль), раствор карбоната натрия (118 г, 1,1 моль) в воде (910 мл) и аддукт дихлор-((бис-фенилфосфин)ферроценил)палладий(11) дихлорметана (9 г, 11,14 ммоль). Перемешивали смесь в течение 1,5 ч при той же температуре. Давали разделиться на фазы для получения органического слоя и охлаждали до 40°С перед концентрированием в вакууме. Очищали осадок (350 г) с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с градиентом смеси элюирующего растворителя из дихлорметана/этилацетата/метанола от 1:1:1 до 1:1:20. Получали фракции, содержащие продукт. Концентрировали и суспендировали в этилацетате (10 л/кг) при 40°С в течение 15 мин, фильтровали и промывали осадок в этилацетате (2x1 л/кг) и метил-трет-бутиловом эфире (2x2 л/кг). Растворяли промытый осадок в метаноле (10 л/кг), обрабабывали ЗШаВоиб® Т1йо1 (0,4 г/г) для удаления остатков металлов. Перемешивали суспензию при 23°С в течение 4 ч и фильтровали. Промывали осадок метанолом (1 л/кг). Смешивали все фильтраты и то, что осталось после промывки метанолом, и концентрировали в вакууме. Оставляли осадок в растворителе (приблизительно 100 мл). Материал кристаллизовался из растворителя. Фильтровали твердый материал и высушивали его при 1 мбар/40°С в течение ночи для получения обозначенного в названии соединения в виде белого порошка (77 г, 51%). Μδ (ΕδΙ) т/ζ (М+Н)+ 407,1.

Ή ЯМР (500,23 МГц, ΌΜδΘ): 9,05 (5, 1Н), 8,95 (б, 1 = 2,2 Гц, 1Н), 8,79 (б, 1 = 2,0 Гц, 1Н), 8,69 (б, 1 = 1,5 Гц, 1Н), 8,33 (ΐ, 1 = 2,1 Гц, 1Н), 8,18 (б, 1 = 8,8 Гц, 1Н), 8,12 (бб, 1 = 1,7, 8,8 Гц, 1Н), 5,41 (5, 1Н), 4,56 (бб, 1 = 8,3, 15,2 Гц, 1Н), 4,37 (бб, 1 = 4,2, 15,2 Гц, 1Н), 3,85-3,80 (т, 1Н), 3,57 (5, 3Н), 3,12 (5, 3Н), 1,56 (б, 1 = 1,2 Гц, 6Н), 1,26 (б, 1 = 6,1 Гц, 3Н).

Способ 3.

В раствор этил 5-[1-[(2δ)-2-метоксипропил]-3-метил-2-оксоимидазо[4,5-с]хинолин-8-ил]пиридин-3карбоксилата (32,0 г, 76,1 ммоль) в тетрагидрофуране (320 мл) медленно добавляли раствор МеМгВг (1,4М в тетрагидрофуране/толуоле, 221,4 г, 6,92Х) под защитой Ν₂ при температуре ниже 0°С. Перемешивали смесь при -5-0°С в течение 1 ч под защитой Ν₂. Медленно добавляли раствор ΝΠ·|Ο (15%, 320 мл) для остановки реакции при поддержании температуры ниже 25°С. Затем добавляли этилацетат (320

- 7 022163 мл). Нагревали смесь до 25-30°С и перемешивали ее в течение получаса. После разделения на два слоя проводили обратную экстракцию водного слоя тетрагидрофураном (160 мл). Промывали объединенный органический слой солевым раствором (192 мл). Добавляли активированный уголь (1,6 г) в органический слой и перемешивали при 65-75°С в течение 4-5 ч. Фильтровали смесь с использованием К|С5с1диНг® 8Шса-Тйю1 (1,6 г). Перемешивали органический слой при 65-75°С в течение 2-3 ч; затем фильтровали смесь через К1е5е1дцйг® 8Шса-ТЬю1. Органический слой удаляли в вакууме и затем проводили перекристаллизацию этилацетат/тетрагидрофураном для получения 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3ил]-1-[(2§)-2-метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-она в виде светложелтого твердого вещества (22,34 г, 72,2%).

В трехгорлую колбу добавляли 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2§)-2метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он, полученный согласно описанию в данном способе 3 (50,0 г, 123 ммоль), и тетрагидрофуран (1500 мл). Перемешивали смесь и нагревали ее до 45-55°С для получения абсолютного раствора. Фильтровали, затем концентрировали фильтрат в вакууме ниже 45°С до 2,0-3,0 V и добавляли этилацетат (500 мл), затем концентрировали в вакууме ниже 45°С до 7-8 V. Перемешивали смесь при 70-80°С в течение 6-10 ч, затем охлаждали ее до 20-25°С и фильтровали. Добавляли этилацетат (135-140 г) и этанол (13,5-14,0 г) к осадку. Перемешивали смесь при 70-80°С в течение 6-10 ч, затем охлаждали ее до 20-25°С и фильтровали. Концентрировали в вакууме для получения обозначенного в названии соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (37,9 г, 75,8%).

'Н ЯМР (СЭС1₃, 400 МГц) δ 8,86 (ά 1Н, 1 = 2 Гц), 8,76 (ά 1Н, 1 = 2,4 Гц), 8,71 (5, 1Н), 8,64 (ά 1Н, 1 = 1,6 Гц), 8,21 (1, 2Н), 7,85 (ά, 1Н, 1 = 6,8 Гц), 4,36 (ц, 2Н), 3,88 (т, 1Н), 3,62 (5, 3Н), 3,23 (5, 3Н), 2,79 (5, 1Н), 1,95 (5, 1Н), 1,71 (ά, 6Н, 1 = 0,8 Гц), 1,33 (ά, 3Н, 1 = 6,4 Гц).

Пример 2. 8-[5-(1-Гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2§)-2-метоксипропил]-3-метил-1,3дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он, форма I.

Способ 1.

Неочищенное свободное основание (пример 1) смешивали с этилацетатом, при этом из коричневатого раствора начинал выпадать белый осадок. Осадок фильтровали в герметизированном рабочем боксе с вмонтированными перчатками, размещенном внутри вытяжки, и оставляли сушиться в вакууме в герметизированном рабочем боксе в течение ночи. Продукт оставляли в вакууме в течение ночи (11 г, выход 63,18%).

Порошковые рентгеновские дифрактограммы (ΧΡΌ) кристаллического осадка получали с использованием порошкового дифрактометра Вгикег Ό4 Εηάеаνο^, оснащенного источником излучения СиКа (λ = 1,54060 А) и детектором Vаηΐес, работающим при 35 кВ и 50 мА. Образец исследовали в интервале 20углов от 4 до 40° с шагом 0,0087° и экспозицией 0,5 с/шаг, с дивергенцией 0,6 мм, 5,28 мм фиксированным антирассеивающим растром и щелью детектора 9,5 мм. Сухой порошок упаковывали в кварцевый держатель образца и гладкую поверхность получали с использованием предметного стекла. Хорошо известно в области кристаллографии, что для любой кристаллической формы расположения угловых пиков могут слегка отличаться. Например, положения пиков могут смещаться из-за различий в температуре или влажности, при которых анализируют образец, смещения образца или от присутствия или отсутствия внутреннего стандарта. В данном случае вариабельность положений пиков ±0,2 20-углов учитывает такие возможные вариации, не препятствуя однозначной идентификации указанной кристаллической формы. Определение кристаллической формы может быть сделано на основе любого уникального сочетания отличительных пиков (в единицах ° 20), обычно наиболее выдающихся пиков. Дифрактограммы кристаллической формы, полученные при температуре и влажности окружающей среды, корректируются с учетом стандартных пиков ΝΙδΤ 675 при 20° 8,85 и 26,77.

Таким образом, полученный образец соединения характеризуется рентгеновской порошковой дифрактограммой, полученной с использованием излучения СиКа, имеющей пики дифракции (значения 20), приведенные ниже в табл. 1. В частности, дифрактограмма содержит характеристические пики при 8,57 и один или несколько из 9,06, 15,93, 18,29 и 18,87, с допустимой ошибкой углов дифракции 0,2°.

- 8 022163

Таблица 1

Пики порошковой рентгеновской дифрактограммы, пример 2, способ 1

Способ 2.

Растворяли приемлемое количество свободного основания согласно примеру 1 в этаноле или тетрагидрофуране для получения раствора. Выпаривали раствор для получения обозначенного в названии соединения.

Таким образом, полученный образец соединения характеризуется рентгеновской порошковой дифрактограммой, полученной с использованием излучения СиКа, имеющей пики дифракции (значения 2θ), приведенные ниже в табл. 2. В частности, дифрактограмма содержит характеристические пики при 8,60 в сочетании с одним или несколькими пиками, выбранными из группы, состоящей из 9,08, 15,93, 18,25 и 18,83, с допустимой ошибкой углов дифракции 0,2°.

Таблица 2

Пики порошковой рентгеновской дифракции, пример 2, способ 2

- 9 022163

Пример 3. 8-[5-(1-Г идрокси-1 -метилэтил)пиридин-3 -ил]-1-[(28)-2-метоксипропил] -3 -метил-1,3дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он моногидрат

Пример 3 может быть получен посредством перемешивания смеси метанолатной формы свободного основания (метанолат представляет собой кристаллическую форму, получаемую из раствора свободного основания в метаноле) вместе с безводной формой свободного основания (см. пример 2) в приемлемом количестве воды в течение 24 ч. В другом случае суспендировали безводную форму свободного основания (см. пример 2) в растворе ацетон/вода (соотношение 95:5, а„ = 0,57), и затравливание моногидратной формой приводило к полному превращению безводной формы I в желаемый моногидрат в течение 24 ч.

Условия получения порошковой рентгеновской дифрактограммы (ΧΡΌ) в примере 3 точно такие же, как и условия, описанные в примере 2.

Таким образом, полученный образец обозначенного в названии соединения характеризуется порошковой рентгеновской дифрактограммой, полученной с использованием излучения СиКа, имеющей пики дифракции (величины 2θ), приведенные ниже в табл. 3. В частности, дифрактограмма содержит пик при 13,57 в сочетании с одним или несколькими пиками, выбранными из группы, состоящей из 6,75, 9,71, 16,35, 16,98 и 19,54, с допустимой ошибкой углов дифракции 0,2°.

Таблица 3

Пики порошковой рентгеновской дифрактограммы, пример 3

Пример 4. 8-[5-(1-Гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(28)-2-метоксипропил]-3-метил-1,3дигидро -2Н -имидазо [4,5-с] хинолин-2 -он малат

Пример 4 можно получить посредством суспендирования свободного основания (53,5 мг) в ацетоне (2 мл) и последующего встраивания Ь-малеиновой кислоты (22 мг). Твердые вещества растворяли до прозрачного раствора. Белый кристаллический осадок осаждали из раствора. Осадок фильтровали в вакууме и высушивали. Высушивали соль малата в вакуумной печи (65°С) в течение ночи для получения обозначенного в названии соединения.

Условия получения порошковой рентгеновской дифрактограммы (ΧΡΌ) в примере 4 точно такие же, как и условия, описанные в примере 2.

Таким образом, полученный образец обозначенного в названии соединения характеризуется порошковой рентгеновской дифрактограммой, полученной с использованием излучения СиКа, имеющей пики дифракции (величины 2θ), приведенные ниже в табл. 4. В частности, дифрактограмма содержит пик при 5,39 в сочетании с одним или несколькими пиками, выбранными из группы, состоящей из 10,33, 12,16, 15,57 и 0,08, с допустимой ошибкой углов дифракции 0,2°.

- 10 022163

Таблица 4

Пики порошковой рентгеновской дифракции, пример 4

Пример 5. 8-[5-(1-Г идрокси-1 -метилэтил)пиридин-3 -ил]-1-[(2§)-2-метоксипропил] -3 -метил-1,3дигидро -2Н -имидазо [4,5-с] хинолин-2 -он фумарат

Пример 5 можно получить посредством добавления свободного основания 8-[5-(1-гидрокси-1метилэтил)пиридин-3 -ил] - 1-[(2§)-2-метоксипропил] -3 -метил- 1,3-дигидро-2Н-имидазо [4,5-с]хинолин-2она (60,2 мг) к 1-бутанолу (0,5 мл) и последующего добавления 21,9 мг фумаровой кислоты. Добавление гептана (5x0,5 мл) дает густую белую суспензию, которую затем перемешивали при 90°С/500 об/мин. Пропускали через фильтр в вакууме и высушивали в атмосфере азота. Осадок терялся при восстановлении из фильтрата, но этого было достаточно для ХКП. Дополнительно кристаллическую соль фумарата получали при добавлении свободного основания (101,0 мг) в 1-бутаноле (0,5 мл) и затем добавляли 34 мг фумаровой кислоты. Добавляли гептан (6x0,5 мл) и кристаллы-затравки соли фумарата из первого примера получения и перемешивали смесь при 90°С/500 об/мин в течение 1 ч. Получали осадок с помощью вакуумной фильтрации и высушивали осадок в атмосфере азота. Затем высушивали осадок в вакуумной печи (65°С) в течение ночи для получения обозначенного в названии соединения.

Условия получения порошковой рентгеновской дифрактограммы (ХКЭ) в примере 5 точно такие же, как и условия, описанные в примере 2.

Таким образом, полученный образец обозначенного в названии соединения характеризуется порошковой рентгеновской дифрактограммой, полученной с использованием излучения СиКа, имеющей пики дифракции (величины 2θ), приведенные ниже в табл. 5. В частности, дифрактограмма содержит пик при 5,10 в сочетании с одним или несколькими пиками, выбранными из группы, состоящей из 8,55, 15,45, 15,78 и 22,50 с допустимой ошибкой углов дифракции 0,2°.

- 11 022163

Таблица 5

Пики порошковой рентгеновской дифракции, пример 5

Пик

Угол (2-тета °)

Интенсивность

		(%)
1	5,10	100,00
2	8,55	17,1
3	12,14	6,0
4	15,45	26,7
5	15,78	11,0
6	18,50	5,9
7	19,94	7,4
8	20,88	5,1
9	21,55	4,5
10	22,50	14,5
11	24,92	7,9
12	26,41	5,9

Ферментный анализ тТОК (РКАР1) ίη νίΐτο.

Использовали анализ киназы тТОК Ьап1йа8сгееп™ (ΙηνίίΓΟβοη) для определения значений 1С₅₀ соединения по отношению к киназе тТОК. Он представляет собой формат анализа флуоресцентный резонансный перенос энергии с временным разрешением (Пте РекокеО Ииотексепсе Кекопапсе Епетду ТгапНег. ТК-РКЕТ), при котором используется антитело, меченное тербием с длительным периодом полураспада в качестве донора, и 4Е-ВР1, меченный зеленым флуоресцентным белком (ОРР) в качестве акцептора. Использовали соотношение ТК-РКЕТ для наблюдения за активностью тТОК, при этом усиление фосфорилирования белка приводит к повышению соотношения ТК-РКЕТ. Проводили киназную реакцию с использованием объема реакции 12,5 мкл в неглубоких черных 384-луночных планшетах Ртох1р1а1е. Добавляли реагент для получения конечных условий реакции: 50-миллимолярная N-2гидроксиэтилпиперазин-№-2-этансульфоновая кислота (НЕРЕ8) рН 7,5, 1-миллимолярная этиленгликоль-бис-(в-аминоэтиловый эфир)-^^№,№-тетрауксусная кислота (ЕОТА), 0,01% Т\\ееп 20, 10 мМ хлорид марганца, 2 мМ ΌΕ-дитиотреит (ИТТ), 0,4-микромолярный ОРР-4Е-ВР1 (физиологический субстрат тТОК, 4Е-ВР1, экспрессированный и очищенный в виде гибридного белка с зеленым флуоресцентным белком, 1п\Т1годеп)„ 70 нг/мл тТОК (рекомбинантный человеческий тТОК, остатки 1360-2549, меченный глутатион-§-трансферазой (О8Т), эксперссированный в клетках насекомых, 1^йтодеп), 4% диметилсульфоксид и серийные разведения соединения (разведенные 1:3 от 20,000 до 1 нМ). Добавляли фермент и субстрат соединения и затем добавляли аденозинтрифосфат (АТФ) до 10 мкМ для начала реакции. Инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин и затем добавили 12,5 мкл буфера для разведения антител, содержащего 4 нМ антитела против фосфотреонин-46 4Е-ВР1, меченного тербием, и 20 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЕИТА), 0,67 мМ трис(гидроксиметил)аминоэтан гидрохлорида (Тп/та®®) рН 7,5, 0,02% азида натрия и 0,01% нонилфенилполиэтилен гликоля (№тбе1® Р40). Инкубировали при КТ в течение 60 мин и считывали результат с использованием ридера планшетов ЕпУыоп с фильтром возбуждения с длиной волны 340 нм и фильтром испускания с длиной волны 495 нм и 520 нм. Сигнал, полученный с помощью фильтра на 520 нм (специфичного к ОРР), делили на сигнал, полученный с помощью фильтра 495 нм (специфичного для тербия), для вычисления соотношения ТК-РКЕТ. Получали значение 1С₅₀ для каждого соединения с использованием данных относительного ингибирования, которые рассчитывали исходя из данных реакции по сравнению с контролями на планшетах (соотношение ТК-РКЕТ данных анализа по сравнению с контролями АТФ на планшетах). Использовали АСТ1У1ТУВА§Е 4,0 для соответствия данных относительного ингибирования и данных десятибалльных концентраций соединений четырехпараметрическому логистическому уравнению.

Соединение согласно настоящему изобретению исследуют с помощью данного анализа, проводимого согласно описанию выше. Например, соединение с примером 1 проанализировали и оказалось, что его абсолютное значение 1С₅₀ равно 0,165 мкМ (±0,0925, п=5). Полученные результаты показывают, что соединения в рамках настоящего изобретения, являются сильными ингибиторами тТОК.

- 12 022163

Ферментный анализ фосфоинозитид-3-киназы α (ΡΙ3Κα) ίη νίΐΓΟ.

Использовали сцинтилляционный анализ сближения ΡΙ3Κα (ΡΙ3Κα δΡΑ) для определения значений Κ₅₀ соединений в отношении ΡΙ3Κα киназы. В этом анализе измеряется активность ΡΙ3Κα в присутствии ингибиторов соединений посредством измерения встраивания γ-Ρ³³-ΑΤΦ в фосфотидилинозитол (4,5) бисфосфат (ΡΙΡ2) Проводили киназные реакции в объеме 40 мкл в 96-луночных белых плоскодонных полистирольных планшетах с половинным объемом лунок с прозрачным дном. Добавляли ΡΙ3Κα для начала реакции. Конечные условия реакции составляют 43,75 мМ 2,2-бис(гидроксиметил)-2,2',2нитрилотриэтанола (бис-трис) рН 7,0, 306 мМ хлорида натрия (ЫаС1), 1,76 мМ октилфенилового эфира полиэтиленгликоля (Τήίοη™ Х-100), 10 мкМ аденозинтрифосфата (АТФ), 2,9 мМ хлорида магния (Μ§Ο2) и 1 μθ на лунку γ-Ρ³³-аденοзингρифοсфаτа (γ-Ρ³³-ΑΤΡ), 5,0 нМ рекомбинантного человеческого фермента ΡΙ3Κα, 0,2 мМ пальмитил-олеил-фосфатидилсерина (ΡΟΡδ), 0,04 мМ фосфотидилинозитол (4,5) бисфосфата (ΡΙΡ2), 4% ΌΜδΟ и серийные разведения соединения (разведенное 1:3 от 20,000 до 1 нМ). Инкубировали при ΚΤ в течение 90 мин после добавления ΡΙ3Κα. Реакцию останавливали добавлением 40 мкл остановочного буфера, содержащего 2,5 мг/мл бусин, связанных с неомицином (АтегкЬат, Са!# ΡΡΝΟ0506) и 21 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ΕΌΤΑ). Центрифугировали планшеты в течение 30 мин при 1000 об/мин и измеряли радиоактивность с использованием Аа11ас Μ^с^οЬеίа Τπΐιιχ. нормализованного по Р³³. Получали значение Κ.'₅₀ для примера 1 посредством использования данных относительного ингибирования, которые рассчитывали исходя из данных реакции по сравнению с контролями на планшетах (активный фермент по сравнению с контролем фермента, ингибированным 62,5 ммоль ЭДТА). С использованием ΑСΤIVIΤΥΒΑδΕ 4,0 проводили соответствие данных относительного ингибирования и данных десятибалльных концентраций соединений четырехпараметрическому логистическому уравнению.

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали с помощью данного анализа, проведенного в точности согласно описанию выше. Например, проанализировали соединение согласно примеру 1, и оказалось, что его абсолютное значение Ю₅₀ составляет 0,00607 мкМ (±0,00338, η=2). Полученные результаты показывают, что соединения в рамках настоящего изобретения являются сильными ингибиторами ΡΙ3Κα.

Ферментный анализ фосфоинозитид-3-киназы β (ΡΙ3Κβ) ίη νίίτο.

Использовали сцинтилляционный анализ сближения ΡΙ3Κβ (ΡΙ3Κβ δΡΑ) для определения значений Юзе соединений в отношении ΡΙ3Κβ киназы. В этом анализе измеряется активность ΡΙ3Κβ в присутствии ингибиторов соединения посредством измерения встраивания γ-Ρ³³-ΑΤΦ в фосфотидилинозитол (4,5) бисфосфат (ΡΙΡ2). Проводили киназные реакции в объеме 40 мкл в 96-луночных белых плоскодонных полистирольных планшетах с половинным объемом лунок с прозрачным дном. Добавляли ΡΙ3Κα для начала реакции. Конечные условия реакции составляли 43,75 мМ 2,2-бис(гидроксиметил)-2,2',2нитрилотриэтанола (бис-трис) рН 7,0, 87,5 мМ хлорида натрия (№С1), 1,76 мМ октилфенилового эфира полиэтиленгликоля (Ττίΐοη™ Х-100), 40 мкМ аденозинтрифосфата (АТФ), 1 мМ хлорида магния (Μ§Ο2) и 1 μιΟ на лунку γ-Ρ³³-аденοзинτρифοсфаτа (γ-Ρ³³-ΑΤΡ), 6,0 нМ рекомбинантного человеческого фермента ΡΙ3Κβ, 0,2 мМ пальмитил-олеил-фосфатидилсерина (ΡΟΡδ), 0,04 мМ фосфотидилинозитола (4,5) бисфосфата (ΡΙΡ2), 4% ΌΜδΟ и серийные разведения соединения (разведенное 1:3 от 20,000 до 1 нМ). Инкубировали при ΚΤ в течение 90 мин после добавления ΡΙ3Κα. Реакцию останавливали добавлением 40 мкл остановочного буфера, содержащего 2,5 мг/мл бусин, связанных с неомицином (АтегкЬат, Са1 #ΡΡΝΟ0506) и 21 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ΕΌΤΑ). Центрифугировали планшеты в течение 30 мин при 1000 об/мин и измеряли радиоактивность с использованием Аа11ас Μ^с^οЬеίа Τπ1ιιχ, нормализованного по Р³³. Получали значение Ιί\₀ для соединения посредством использования данных относительного ингибирования, которые рассчитывали исходя из данных реакции по сравнению с контролями на планшетах (активный фермент по сравнению с контролем фермента, ингибированным 62,5 ммоль ЭДТА). С использованием ΑСΤIVIΤΥΒΑδΕ 4,0 проводили соответствие данных относительного ингибирования и данных десятибалльных концентраций соединений четырехпараметрическому логистическому уравнению.

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали с помощью данного анализа, проведенного в точности согласно описанию выше. Например, проанализировали соединение согласно примеру 1, и оказалось, что его абсолютное значение Ιί\₀ составляет 0,0776 мкМ (±0,0401, η=2). Полученные результаты показывают, что соединения в рамках настоящего изобретения являются сильными ингибиторами ΡΙ3Κβ.

Ферментные анализы ίη νίίτο фосфоинозитид-3-киназы δ (ΡΙ3Κδ) и фосфоинозитид-3-киназы γ (ΡΙ3Κγ).

Использовали анализ киназы Αάаρίа® для иммунологического определения АДФ на основе флуоресценции. Он представляет собой формат анализа флуоресцентный резонансный перенос энергии с временным разрешением (ΤΚ-ΡΚΕΤ), в котором используется антитело к АДФ, меченное европием, и антитело к метке АДФ, меченное Α1еxа Р1иог® 647 (ΑΡ647), для наблюдения за выработкой АДФ кина- 13 022163 зой. Использовали соотношение ТК-РКЕТ для наблюдения за активностью ΡΙ3Κδ или ΡΙ3Κγ, при этом увеличение фосфорилирования липидов и соответствующая повышенная продукция АДФ приводит к увеличению ТК-РКЕТ.

Ферментативные реакции: проводили киназую реакцию для ΡΙ3Κδ с использованием объема реакции 10 мкл в белых 384-луночных планшетах Согшид® для маленьких объемов (Согшид® # 3674). Добавляли реагенты для получения следующих конечных условий реакции: 0,47-2,6 нг ΡΙ3Κδ (рекомбинантная полноразмерная человеческая ΡΙ3Κδ, экспресированная и выделенная из клеток насекомых, Ιηνίйодеи) и 50-микромолярный ΡΙΡ2: Ρδ в 32,5-миллимолярном НЕРЕ8, рН 7,5, 50-миллимолярный хлорид натрия, 0,015% ί'ΉΑΡδ, 1,5-миллимолярный хлорид магния, 0,5-миллимолярная ЕСТЛ, 25миллимолярный АТФ, 1% ΌΜδΘ и серийные разведения соединения (разведенного 1:3 от 20,000 до 1наномолярного). Добавляли АТФ к соединению, затем добавляли смесь субстрата/киназы для начала реакции. Встряхивали планшеты в течение 30 с и затем инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин. Проводили киназную реакцию на ΡΙ3Κγ с использованием 10 мкл объема реакции в белом 384-луночном планшете Согшид® для маленьких объемов (Согшид® # 3674). Добавляли реагенты для получения конечных условий реакции: 3,5-26 нг ΡΙ3Κγ (рекомбинантная полноразмерная человеческая ΡΙ3Κγ, экспрессированная и выделенная из клеток насекомых, [пуЦгодеп) и 50-микромолярный ΡΙΡ2: Ρδ в 32,5-миллимолярном НЕΡЕδ, рН 7,5, 0,5-миллимолярном ЕСТА ,1,5-миллимолярный хлорид магния, 25микромолярный АТФ, 1% ΌΜδΘ и серийно разведенное соединение (разбавленное 1:3 от 20,000 до 1наномолярного). Добавляли к соединению АТФ и затем добавляли смесь субстрата/киназы для начала реакции. Встряхивали планшеты в течение 30 с, центрифугировали в течение 2 мин при 1000 х д и затем инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин.

Определение АДФ: добавляли 5 мкл смесь для детекции (30 мМ ЕИТА, 30 нМ антитела к АДФ, меченного европием, ЕС₆₀ концентрация метки АДФ для реакции с 5-100 мкМ АТФ, Шуфодеи) в ферментные реакции ΡΙ3Κ δ и γ. Встряхивали планшеты в течение 30 с, центрифугировали в течение 2 мин при 1000 х д и затем инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин. Считывали планшеты на планшетном ридере флуоресценции с использованием фильтра возбуждения на длину волны 340 нм и фильтров испускания на длину волны 665 нм и 615 нм. Сигнал, полученный с использованием фильтра на 665 нм (специфичный для эмиссии АР647 полиСТ), делили на сигнал, полученный с использованием фильтра на 615 нм (специфичный для европия), для вычисления соотношения ТК-РКЕТ. Использовали соотношение ТК-РКЕТ для вычисления концентрации АДФ посредством обратного вычисления стандартной кривой АТФ/АДФ, которая соответствует сигмоидальной модели доза-отклик номер 205 (ХЬ£й от ΙΌΒδ). Получали значения Ιί\₀ для каждого соединения с использованием данных относительного ингибирования, которые вычисляли из данных реакции по сравнению с контролями на планшетах (концентрация АДФ экспериментальных точек по сравнению с контролями АДФ на планшетах). Использовали ХЬй! (ΙΌΒδ) для соответствия данных относительного ингибирования и данных десятибалльных концентраций соединений сигмоидальной модели доза-отклик номер 205 (ХЬй!: от ΙΌΒδ).

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали в указанных анализах в точности согласно описанию выше. Например, проанализировали соединение согласно примеру 1, и оказалось, что его абсолютная величина Ιί\₀ составляет 0,0380 мкМ для ΡΌΚδ и абсолютная величина Ιί\₀ составляет 0,0238 мкМ для ΡΙ3Κγ. Полученные результаты показывают, что соединения согласно настоящему изобретению являются сильными ингибиторами ΡΙ3Κδ и ΡΙ3Κγ.

Ферментный анализ ДНК-зависимой протеинкиназы (ΌΝΑ-ΡΚ) ш уйго.

Использовали формат 2Е¥ТЕ® киназного анализа Диуйгодеи) для определения значений ГС₅₀ против ДНК-ПК для соединения. Он представляет собой флуоресцентный сопряжённый ферментный формат анализа, основанный на чувствительности к протеолизу фосфорилированного дважды меченного субстрата пептида по сравнению с нефосфорилированным (Соишегт на аминоконце, флуоресцеин на карбоксиконце). Используют соотношение резонансного переноса энергии флуоресценции (РКЕТ) для наблюдения за активностью ДНК-ПК, при этом фосфорилирование пептида защищает пептид от протеолитического расщепления и РКЕТ субстрата сохраняется. Проводили реакцию с использованием объема реакции 10 мкл в 384-луночных черных планшетах Согшид® для малых объемов ΝΒδ (Согшид® #3676). Добавляли реагенты для получения конечных условий реакции: 50-миллимолярная Ν-2гидроксиэтилпипепразин-№-2-этансульфоновая кислота (НЕΡЕδ) рН 7,5, 0,01% ΒΚΌ-35 неионный сурфактант, 10-миллимолярный хлорид магния, 1-миллимолярная этиленгликоль-бис-ф-аминоэтиловый эфир)-^^№,№-тетрауксусная кислота (ЕСТА), 1 мМ ΌΕ-дитиотритол (ОТТ), 2,5 мкл/мл ДНК из тимуса теленка (СТ ΌΝΑ), 3,88-27,3 нг ДНК-ПК, 2-микромолярного меченного δе^/ТЬ^ 26 пептида Диуйгодеи), 1% диметилсульфоксил и серийные разведения соединения (разведенного 1:3 от 20,000 до 1 нМ). Добавляли фермент и субстрат к соединению и затем добавляли 25,0-микромолярный аденозинтрифосфат (АТФ) для начала реакции. Встряхивали планшеты в течение 30 с и затем инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин. Добавляли 5 мкл разведения 1:16 раствора В Оеуе1оршеи1 Кеадеи! (Ιπνίйодеи). Встряхивали планшеты в течение 30 с и затем инкубировали при комнатной температуре в тече- 14 022163 ние 60 мин. Считывали планшеты на планшетном ридере флуоресценции с использованием фильтра возбуждения на длину волны 400 нм и фильтров испускания на длину волны 445 нм и 520 нм. Сигнал, полученный с использованием фильтра на 445 нм (специфичный для эмиссии Кумарина), делили на сигнал, полученный с использованием фильтра на 520 нм (специфичный для флуоресцеина), для вычисления соотношения ТК-РКЕТ. Получали значения 1С₅₀ для соединения с использованием данных относительного ингибирования, которые вычисляли из данных реакции по сравнению с контролями на планшетах (контроль ΌΜδΟ для 0% ингибирования и отсутствие реакции АТФ для 100% ингибирования). Использовали ХЕГп (ΙΌΒδ) для соответствия данных относительного ингибирования и данных десятибалльных концентраций соединений сигмоидальной модели доза-отклик (модель номер 205).

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали с помощью данного анализа, проведенного в точности согласно описанию выше. Например, проанализировали соединение согласно примеру 1, и оказалось, что его абсолютное значение 1С₅₀ составляет 0,00424 мкМ. Полученные результаты показывают, что соединения согласно настоящему изобретению являются сильными ингибиторами ДНКПК.

Детекция ΛΙρΙιαδαίΌοη διποΡίΐΌ фосфорилированных киназ ρ70δ6 (Тйг389), АКТ (Тйг308) и АКТ (δβΓ473) в клетках И87МО.

Использовали ΑΙρΙιαδαίΌοη διποΡίπ;® для киназы ρ-ρ70δ6 (Тйг389) (ТОК Вюкшепсек, ТОКАδ50К), р-АКТ(ТЬг308) (ТОК Вюкшепсек, ТОКА2δ50К) и р-АКТ(8ег473) (ТОК Вюкшепсек, ТОКАδ50К) для определения влияния примера 1 на образование эндогенной фосфорилированных киназ ρ70δ6 (ТЬг389), АКТ(ТЬг308) и АКТ^ег473) соответственно. В данном гомогенном анализе используется захватывание фосфорилированного аналита иммуно-сэндвичем и последующая детекция с помощью бусин Афйаксгееп с целью сгенерировать усиленный сигнал.

Культивировали клетки И87МО в питательной среде И87МО, состоящей из ЭМЕМ (О1ВСО 11965092) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ΡΒδ, О1ВСО, 10091-141), 1% заменимых аминокислот (О1ВСО, 11140-050) и 1% пирувата натрия (О1ВСО, 11360-070). Собирали клетки с использованием стандартных процедур культивирования и затем посчитали с использованием νΐ-СеИ. Посеяли 100 мкл клеток И87МО в питательную среду (50,000 клеток/лунка) в 96-луночные планшеты Сок1аг #3596 и инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂.

В день анализа обрабатывали клетки примером 1 (20 мкл/лунка), разбавленным в среде, содержащей 6% ^ΜδΟ. Инкубировали в течение часа при 37°С, затем удаляли среду и добавляли 50 мкл 1х лизирующего буфера διιΐΌΡίΐΌ (ТОК Вюкшеисек, компонент набора δωΐΡίκ®) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, осторожно встряхивая. Переносили 6 мкл лизата и 10 мкл реакционной смеси (60 частей реакционного буфера/10 частей активирующего буфера/1 часть донорских и 1 часть акцепторных бусин, Регкш Е1тег, 6760617К) в 384-луночный проксипланшет (Регкш Е1тег, 6006280) для анализов киназы ρ-ρ70δ6 ктаке (ТЬг389) и ρ-АКТ(δе^473). Закрывали планшет и инкубировали при КТ в течение 4 ч. Переносили 4 мкл лизата и 5 мкл реакционной смеси (40 частей реакционного буфера/10 частей активирующего буфера/1 часть акцепторных бусин) в 384-луночный проксипланшет для анализа р-АКТ (ТЬг308). Инкубировали при КТ в течение 2 ч и затем добавляли 2 мкл смеси для разведения (20 частей буфера для разведения/1 часть донорских бусин) в каждую лунку. Закрывали планшет и инкубировали при КТ еще 2 ч. Считывали планшеты с помощью Регкш Е1тег Εηνίκίοη, оснащенного ТигЬоМоби1е, с использованием стандартных настроек АфК^сгееп®® (Ех_680нм и Ет_520620нм). Получали данные относительного ингибирования из данных реакции по сравнению с контролем на планшетах. Затем использовали ЛСТIVIТΥΒЛδЕ 4,0 соответствия данных относительного ингибирования от данных десятибалльных концентраций соединения четырехпараметрическому логистическому уравнению для получения значения 1С₅₀ для примера 1.

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали с помощью данного анализа, проведенного в точности согласно описанию выше. Например, проанализировали соединение согласно примеру 1, и оказалось, что его абсолютные значения 1С₅₀ равны представленным в табл. 6. Полученные результаты показали, что соединения в рамках настоящего изобретения подавляют ферменты путей Р13К и тТОК в клетках И87МО.

Таблица 6

	АКТ1(рТ308)	АКТ1(р3473)	Р7036(рТ389)	86КР(р824О/242)
Пример	Абсолютная 1С50 (мкМ)	Абсолютная 1С50 (мкМ)	Абсолютная 1С50 (мкМ)	Абсолютная [С?о (мкМ)
1	0,106 (±0,0649, п=4)	0,0942 (±0,0421, п=4)	0,0106 (±0,00296, п=4)	0,0191 (±0,00204, п=3)

Анализ пролиферации клеток.

Использовали систему люминисцентного анализа жизнеспособности клеток Се11Тйег-О1о (коммер- 15 022163 чески доступна у Рготеда) для измерения антипролиферативной активности примера 1 посредством определения количества жизнеспособных клеток в культуре на основе количественного определения присутствующего АТФ, который свидетельствует о наличии метаболически активных клеток.

Посеяли клетки в 96-луночный планшет с плотностью 2000 клеток/лунка в 100 мкл специализированной для клеток среды (для И87МС использовали ΌΜΕΜ, 10% ΡΒδ, 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1пиперазинэтансульфоновой кислоты (НЕРЕБ), 1,0 мМ пирувата натрия и 0,1 мМ заменимых аминокислот (АТСС Са1. # 30-2002); для НТ1080 использовали среду МЕМ в модификации Игла, 10% ΡΒδ (АТСС Са1. # 30-2003); для Н1975, А2780, Б1БА-1 и 786-Ο использовали РРМ1 1640, 10% ΡΒδ (АТСС Са1. # 302001); для А204 использовали МакКоя 5А, 10% ΡΒδ (АТСС Са1.# 30-2007), в первую колонку добавляли только среду в качестве отрицательного контроля. Инкубировали планшеты в течение ночи при 37°С и 5% СО₂. На следующий день готовили стоковые растворы соединений в 1 мМ в ИМБО и серийно разводили в ИМБО в 96-луночном полипропиленовом планшете с круглым дном. Анализировали соединения в 10 концентрациях в двух повторностях, 4 соединения на планшет.

Переносили 4 мкл серийных разведений в ИМБО в 96-луночный планшет и добавляли 196 мкл питательной среды для получения 10 X стокового раствора для дозирования. Аккуратно переносили 11 мкл каждого стокового раствора для дозирования в соответствующую лунку планшета с клетками, получая концентрацию 0,2% в ИМБО и конечный объем 111 мкл. Добавляли 11 мкл среды в контрольные колонки (колонка 12) и фоновой колонки (колонка 1). Инкубировали клетки с соединениями при 37°С, 5% СО₂ в течение 72 или 96 ч (для Н1975, 786-Ο, НТ1080, А2780, А204 и Б1БА-1 использовали 72 ч и для И87МС использовали 96 ч).

Готовили реагент Се11ТПег-01о° (Рготеда, Са1: 07571) и добавляли 100 л в каждую лунку после окончания инкубации, гомогенизировали клетки с помощью перемешивания на орбитальном шейкере в течение 2 мин и затем инкубировали при КТ в течение 10 мин для стабилизации люминисцентного сигнала. Считывали необработанные данные люминисценции на ридере планшетов \Уа11ас У|с1ог V. Рассчитывали значения 1С₅₀ для примера 1 с использованием данных о проценте ингибирования. Четырехпараметрическую логистическую кривую подстраивали для ответа каждой дозы.

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали с помощью данного анализа, проведенного в точности согласно описанию выше. Например, исследовали соединение согласно примеру 1, и оказалось, что его абсолютные значения 1С₅₀ равны представленным в табл. 7. Полученные результаты показывают, что соединения согласно настоящему изобретению полезны для ингибирования пролиферации клеточных линий И87М0, Н1975, 786-Ο, А2780, НТ-1080, А204 и 818А-1.

Таблица 7

1187МО 1С50 (мкМ)	Н1975 1См(мкМ)	786-0 1Сзо(мкМ)	А2780 Ю50 (мкМ)	НТ-1080 Юзо (мкМ)	А204 Юзо (мкМ)	МЗА-1 Юзо (мкМ)
0,074	0,102	0,126	0,090	0,072	0,097	0,096

Клоногенный анализ опухоли Опсо1е51.

Использовали коллекцию опухолевых ксенографтов человека, выращенных подкожно в иммунокомпрометированных голых мышах, Опсо1е51 (ОтЬН о£ РгеФигд. Оегтапу) для измерения ответа примера 1 на различные типы опухолей.

Ксенографты, непосредственно трансплантированные от пациентов и выращенные в голых мышах, сохраняли большую часть характеристик родительских опухолей пациента, включая гистологию и чувствительность к противораковым лекарственным средствам, что повторяло ответ пациента донора на стандартные противораковые средства в большой степени. Получали клетки опухоли непосредственно из человеческих донорских ксенографтов, выращенных в голых мышах. Измеряли ингибирование образования неприкрепленных колоний опухолевых клеток в мягком агаре.

Тестировали пример 1 на моделях человеческих опухолевых ксенографтов, полученных от пациентов, представленных в табл. 10, которые включают 2-10 моделей 13 различных гистотипов опухолей человека, а именно рак мочевого пузыря, толстой кишки, желудка, головы и шеи, немелкоклеточный рак легкого (адено, плоскоклеточный рак и крупноклеточный), рак молочной железы, рак яичников, поджелудочной железы, предстательной железы и рак почек, а также меланома, плевромезотелиома и саркома, где тй означает умеренно дифференцированная, рй - слабо дифференцированная, ий - недифференцированная и \\'й - хорошо дифференцированная.

Приготовление суспензий отдельных клеток из ксенографтов опухоли человека.

Выращивали ксенографты солидных опухолей человека подкожно посредством серии пассажей в бестимусных голых мышах (ЯМР I штамм пи/пи) и в стерильных условиях удаляли опухоли, механически дезагрегировали и затем инкубировали с коктейлем ферментов, состоящим из коллагеназы IV типа (41 и/мл), ДНазы I (125 и/мл), гиалуронидазы (100 и/мл) и диспазы II (1,0 и/мл) в среде КРМ1 1640 при 37°С в течение 45 мин. Пропускали клетки через фильтр с размером пор 200 мкм и 50 мкм и дважды промывали стерильным буфером РΒδ. Определяли процент жизнеспособных клеток в камере Нойбауэра

- 16 022163 с использованием исключения трипанового синего.

Процедура клоногенного анализа с использованием клеток из ксенографтов опухолей человека.

Проводили клоногенный анализ в формате 24-луночного планшета согласно модифицированному анализу на двухслойном агаре (НатЬитдет е1 а1., δ<^η<χ 197:461-643, 1997). Нижний слой состоял из 0,2 мл/лунка ΙΜΌΜ (с добавлением 20% (ν/ν) фетальной бычьей сыворотки, 0,01% (те/ν) гентамицина) и 0,75% (те/ν) агара. Добавляли 0,8-10⁴ - 5 10⁴ клеток в 0,2 мл такой же питательной среды с добавлением 0,4% (те/ν) агара и сеяли в нижний слой в 24-луночные планшеты. Наносили исследуемое соединение посредством постоянного предъявления (наложение лекарственного средства) в 0,2 мл питательной среды. Добавляли наложение лекарственного средства 24 ч после посева клеток в виде трехкратного концентрированного раствора. Включали шесть необработанных контрольных лунок и шесть обработанных концентрацией лекарственного средства лунок в каждом планшете. Инкубировали культуры при 37°С и 7,5% СО₂ в увлажненной атмосфере в течение 20 дней и внимательно наблюдали за образованием колоний с использованием инвертированного микроскопа. В течение этого времени ίη νίίτο рост опухоли приводил к образованию колоний с диаметром >50 мкм. В момент наибольшего роста колоний считали колонии с использованием автоматической системы анализа изображений (ΟΜΝΙΟΟΝ 3600, Βίοκγδ ОтЬН). Окрашивали жизнеспособные колонии за 24 ч перед оценкой с использованием стерильного водного раствора 2-(4-йодфенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенилтетразолия хлорида (1 мг/мл, 100 мкл/лунка).

Выражали действие лекарства в виде процента образования колоний. Сравнивали среднее число колоний в обработанных лунках со средним числом колоний в необработанном контроле (выражали относительное количество колоний в виде значения исследуемая группа против контроля, Т/С-значение [%]):

— (ЧИСЛО КОЛОНИИ (обработанная фуппа))^(чиСЛО КОЛОНИИ(конуродьная группа)) 100

С

Строили зависимость концентрации соединения от относительного числа колоний и определяли абсолютные значения 1С₅₀ и 1С₇₀ или концентрации лекарственного средства, необходимые для ингибирования образования колоний на 50% (Т/С = 50%) и 70% (Т/С = 30%) соответственно, посредством подбора кривой по двум точкам.

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали с помощью данного анализа, проведенного в точности согласно описанию выше. Например, исследовали соединение согласно примеру 1, и оказалось, что его абсолютные величины 1С₅₀ равны указанным в табл. 8. Данные результаты показывают, что соединения согласно настоящему изобретению полезны для ингибирования пролиферации данных клеточных линий, полученных от пациентов.

- 17 022163

Таблица 8

Человеческие ксенографты, исследованные в ходе клоногенного анализа

Обозначение опухоли	Модель опухоли	Гистология	Абсолютная 1С50 (мМ)
Мочевой пузырь	ВХР 1218	Переходно-клеточная карцинома	0,048
	ВХР 1228	Переходно-клеточная карцинома, ν«1	0,031
Толстая кишка	СХР 1103	аденокарцинома, ρά	>0,2
	СХР 1729	аденокарцинома, τνά	0,176
	СХР 1783	Карцинома толстой кишки, дас1	0,029
	СХР 243	Аденокарцинома, ρά	0,237
	СХР 280	Аденокарцинома, ρά	0,007
	СХР 676	Аденокарцинома, τηά	0,35
	СХР 975	Аденокарцинома, тд	0,142
Желудок	СХР 1172	перстневидно-клеточный рак, ρά	0,141
	СХР 209	перстневидно-клеточный рак, ид	0,184
	ОХР 97	Аденокарцинома, ννά	0,101
Голова и шея	ΗΝΧΡ 536	плоскоклеточная карцинома,	0,055
	ΗΝΧΡ 908	плоскоклеточная карцинома, тд	0,052
НМКРК	ЬХРА 1041	Аденокарцинома, тд	0,205
	ЬХРА 1584	Аденокарцинома, ρά	0,085
	ЬХРА 526	Аденокарцинома , ρά	0,084
	ЬХРА 629	Аденокарцинома , ρά	0,026
	ЬХРА 983	Аденокарцинома, ρά	0,103
	ЬХРЕ 1422	плоскоклеточная карцинома, ид	0,231
	ЬХРЕ 211	плоскоклеточная карцинома, ид	0,108
	ЬХРЬ 1072	крупноклеточный рак легкого, рд	0,214
	ЬХРЬ 430	крупноклеточный рак легкого, рд	0,056

- 18 022163

	ЬХП 529	крупноклеточный рак легкого, рс1	0,128
Молочная железа	МАХР 1322	Папиллярная аденокарцинома , ρά	0,003
	МАХР 1384	Аденокарцинома, ρά	0,243
	МАХР 401	Папиллярная аденокарцинома, ж)	0,15
	МАХР 583	Аденокарцинома протокол, тй	0,088
Меланома	МЕХР 1539	беспигментная меланома, ιτιά	0,246
	МЕХР 276	беспигментная меланома, πιά	0,157
	МЕХР 462	беспигментная меланома, ηιά	0,156
	МЕХР 989	беспигментная меланома, ηιά	0,185
Яичники	ОУХР 1353	Аденокарцинома, ρά	>,2
	ΟνΧΡ 550	Карцинома	0,028
	ОУХР 899	папиллярная серозная аденокарцинома, πκΐ	0,59
Поджелудочная железа	РАХР 546	ίηΓ., железистая плоскоклеточная карцинома	0,105
	РАХР736	Аденокарцинома, ρά	0,174
Предстательная железа	РК.ХР ϋυΐ45	Аденокарцинома, ιιά	0,269
	РКХР РСЗМ	Аденокарцинома, метастатическая, ρά	0,208
Ппевромезотелиома	РХР 1752	Плевромезотелиома	0,032
	РХР 541	Инвазивная плевромезотелиома	0,056
Почки	КХР 1220	Гипернефрома, ρά	0,191
	КХР 393	Гипернефроидная карцинома, ρά	0,044
	КХР 486	Гипернефроидная аденокарцинома , прозрачные клетки	0,112
	КХР 631	Г ипернефроидная аденокарцинома, ινά	0,08
Саркома	ЗХР 1186	Оегеобластная остеосаркома, ηιά	о,п
	ЗХР 1301	Злокачественная рабдомиосаркома, ιιά	>0,2
	ЗХР 627	Плейоморфная рабдомиосаркома, ρά	0,095

Модель лейкемии Е545Кр110а.

Получение клеточной линии с лейкемией: проводили трансдукцию клеток эмбриональной печени, полученных из трансгенных эмбрионов, В6.Сд-Т§[1§ЬМус]22ВпЛ (1аск8оп ЬаЬога1огу, Ваг НагЬог, МЕ), ретровирусом, экспрессировавшим активирующую мутацию, выявленную клинически, р110а человека (Е545К на уровне замены аминокислоты, О1633Л на уровне нуклеотида) под контролем вирусного 5' ЬТК (длинный терминальный повтор) и экспрессирующий ОРР (зеленый флуоресцентный белок) под контролем промотора РОК (М8СУ6 РЬЛО-р110а О1633А РОК/ОРР) для получения клеток лейкемии, ориентированных на мишень. Переносили трансдуцированные клетки в летально облученного животного-хозяина. Трансдуцированные клети заменяли популяцию гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге реципиента и спасали животного-реципиента от смерти от радиации вследствие абляции собственного костного мозга реципиента. Наблюдали за развитием лейкемии спасенных первичных животных посредством еженедельного отслеживания числа лейкоцитов в небольшом объеме крови (10 мкл), собранной ретроорбитально. Собирали кровь от первично облученных животных с подтвержденной лейкемией и серийно пассировали вторичным (не облученным) животным-хозяевам для получения лейкемической клеточной линии.

Испытуемые животные. Использовали самок мышей С57ВЬ/6 (Тасотс, СатЬгйде СПу, ΙΝ), в возрасте 8-10 недель и весом 20-22 г в качестве животных-реципиентов лейкемии. Акклиматизировали животных на нормальной диете с пониженным содержанием жиров (4,5%) перед инокуляцией и содержали на такой диете аб НЬйит на протяжении всего исследования. Обозначали отдельных мышей в каждой группе с помощью проколов ушей. Инокулировали животных лейкемическими клетками от донорских животных (день 0).

Сингенная модель лейкемии. От животного-донора, ранее инокулированного соответствующей лейкозной клеточной линией, собирали небольшое количество крови ретро-орбитально (10 мкл) и измеряли нагрузку лейкемическими клетками с помощью подсчета лейкоцитов в крови. От животных с дос- 19 022163 таточной лейкозной нагрузкой собирали донорскую кровь, разбавляли фосфатно-солевым буфером (РВ8) до 500000 лейкоцитов в 200 мкл и вводили 200 мкл животному ретро-орбитально в день 0 для инициирования лейкемии. Распределяли мышей, инокулированных клетками р110а (Е545К)/Мус, по группам из пяти для обработки примером 1 и контрольную группу из десяти для введения носителя. С 5 по 11 день после инокуляции вводили каждой группе ежедневно с помощью желудочного зонда только растворитель; пример 1 при 5, 10, 20 мг тестируемого ΟΌ на 1 кг массы тела (мг/кг). Собирали не менее 10 мкл крови ретро-орбитально от животных на 12 день для оценки прогрессирования лейкемии с помощью анализа лейкемических клеток.

Анализ лейкемических клеток. Собирали десять (10) мкл цельной крови от каждого исследованного животного и обрабатывали на СоиЙег Тф-Ргер так, что красные кровяные клетки лизировали и фиксировали оставшиеся ядерные лейкоциты для анализа. Анализировали фиксированные клетки непосредственно или хранили их в темноте при 4°С для последующего анализа. Анализировали клетки методом флуоресцентно-активированный клеточный сортинг (ЕАС8) с использованием Су1ош1С8 ЕС 500 (Весктап СоиНег). Подсчитывали лейкемические клетки в определенном регионе диаграммы прямого/бокового светорассеяния (Е8/88) в каждом образце (определен как регион, показывающий мало/отсутствие лейкемических клеток у нормальных животных, но достаточно лейкемических клеток у контрольных животных с лейкемией). Нормализовали данные в лейкемических клетках в единице объема крови с использованием фиксированного отсечения флуоросфер Весктап СоиИег Р1о\\-С’оип1 в образце (одинаковое количество флуоросфер изначально добавляли в каждый образец крови, при этом равные количества в образце были равны равному объему, подсчитанному в образце).

Исследуемое вещество. Еженедельно смешивали пример 1 с 1% гидроксиэтилцеллюлозой (ГЭЦ)/0,25% полисорбатом 80/0,05% понегасителем/очищенной водой и обрабатывали ультразвуком с использованием ргоЬе 8отса1ог для суспендирования. Помещали полученное исследуемое вещество при 4°С и хранили в темноте до применения (ресуспендировали перед каждым введением).

Статистический анализ. Сводили в таблицу данные проточной цитометрии с использованием программного обеспечения Весктап СоиЙег'к СХР. Определили статистическую значимость эффектов в примере 1 с помощью критерия Даннета, однопараметрического ΑΝΟνΑ с использованием группы носителя в качестве контроля (ДМР 81аЙ8бса1 П18соуегу 8оП\\аге. 8А8 1п8Йи1е).

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали с помощью данного анализа, проведенного в точности согласно описанию выше. Например, проанализировали соединение согласно примеру 1, и оказалось, что его значения %ТО1 равны представленным в табл. 9. Полученные результаты показывают, что соединения согласно настоящему изобретению ингибируют рост опухолей, чей рост управляется Е545К Р13Ка, одной из распространенных мутаций, обнаруживаемых при многих видах рака у человека.

Таблица 9

Результаты Е545Кр110а на модели лейкемии для примера 1

Доза (мг/кг)	Схема	%ТО1	%ТО1 ЗЕМ
5		50,5	7,7
10	см	76,1	5,0
20	СМ	90,1	4,1

%ТО1 представляет собой % ингибирования роста опухоли по сравнению с контрольной необработанной группой, %ТО1 8ЕМ представляет собой стандартную ошибку среднего %ТО1.

Модели опухолевых ксенографтов.

Культивировали клетки глиобластомы человека И87МО и клетки карциномы почек человека 786-Ο, собирали и подкожно вводили в заднюю часть тела атимических голых мышей. Культивировали клетки немелкоклеточного рака легкого человека ΝΟ-Η1975, собирали и подкожно вводили в заднюю часть тела мышей СО-1 пи/пи. Готовили исследуемые соединения в приемлемом носителе и вводили с помощью зонда, когда образовывались опухоли (7-21 дней после имплантации). Ответ опухоли определяли посредством измерения объемов опухоли, проводимого дважды в неделю во время лечения. Массу тела брали в качестве общего параметра токсичности.

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали с помощью данного анализа, проведенного в точности согласно описанию выше. Например, проанализировали соединение согласно примеру 1, и оказалось, что его значения %ТО1 равны представленным в табл. 10. Полученные результаты показывают, что соединения согласно настоящему изобретению являются полезными для проявления дозозависимой противоопухолевой активности на модели И87МО, 786-Ο и ΝΟΉ1975.

- 20 022163

Таблица 10

Модель опухоли	Доза (мг/кг)	Схема	%ТО1	%ТО1 8Е
Э87МО	3	В1Э	38,6	13

%ΤΟΙ ЗЕМ представляет собой стандартную ошибку среднего %ТС1, и подчеркнутые величины указывают значимость.

Определение ингибирования мишени ΡΙ3Κα и тТОК ίη νίνο.

Имплантировали клетки глиобластомы человека И87МС (5х10⁶) подкожно в заднюю часть атомических голых мышей в 0,2 мл матригеля. Через 10 дней после имплантации вводили дозу мышам перорально по протоколу определения зависимости от времени, однократной дозе/отдельному моменту времени или дозозависимому протоколу для определения ТМЕЭ₅₀ (пороговая минимальная эффективная доза). Мгновенно замораживали ткани при сборе и собирали кровь для определения содержания родительского соединения в плазме и расчета ТМЕС₅₀ (пороговая минимальная эффективная концентрация) в случае исследований влияния дозы на эффективность. Гомогенизировали опухоли в 500 мкл ΧΥ лизирующего буфера (10 мкг/мл лейпептина, 10 мкг/мл ингибитора трипсина-химотрипсина, 10 мкг/мл тозилфенил-аланил-хлорметил кетона, 10 мкг/мл Апротинина, 60 мМ β-Глицеролфосфата, 1% Тритон Х100, 25 мМ Трис рН 7,5, 2,5 мМ пирофосфата, 150 мМ №С1. 2 мМ р-тозил-Ь-аргининметил эфир, 15 мМ паранитрофенил фосфат, 5 мМ бензамидин, 1 мМ ваданат натрия, 10 мМ фторид натрия, 50 мкг/мл фенилметан сульфонил фторид, 1 мМ 1,4-дитиотритол (ЭТТ), 15 мМ ЕЭТА рН 8,0, 5 мМ ЕОТА рН 8,0, 1 мкМ микроцистина, 1 мкМ окадаевой кислоты и 1 минитаблетка полного ингибитора протеазы Косйе на 10 мл) с использованием пестика, не содержащего РНКаз (КшЫе-Койек). Лизаты аликвотировали и анализировали немедленно или хранили при -80°С для дальнейшего анализа. Использовали мультиплексный формат ИФА Меко Зса1е Эйсогегу (СаййегкЬигд, МЭ) и измеряли ίη νίνο ингибирование мишени ΡΙ3Κ и тТОК для оценки влияния на фосфорилирование треонина в положении 308 АКТ, даунстрим эффектора ΡΙ3Κ; фосфорилирование треонина в положении 389 р70 З6К и серина в положении 240/244 36ΚΡ, даунстрим эффекторов тТОКС1; фосфорилирования серина в положении 473 АКТ, даунстрим эффектора тТОКС2. Добавляли 20 мкг лизата к карбоновому электроду, содержащему 96-луночные планшеты, предварительно меченые соответствующими связывающими антителами. Гибридизовали интересующий белок с использованием детектирующего антитела, меченного рутением. Пропускали ток по электроду в присутствии буфера для считывания, содержащего сореагент ТРА, и количественно определяли и записывали свет, генерируемый электрохемилюминесценцией с использованием МЗЭ ЗеСог 6000. Рассчитывали процент ингибирования относительно группы сравнения, обработанной носителем, и проводили дисперсионный анализ с использованием ^Ρ пакета программного обеспечения для определения статистической значимости.

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали с помощью данного анализа, проведенного в точности согласно описанию выше. Например, проанализировали соединение согласно примеру 1, и оказалось, что активность равна представленной в табл. 11, при этом подчеркнутые значения указывают значимость. Полученные результаты показали, что соединения согласно настоящему изобретению проявляют способность ингибировать ΡI3Κ и тТОК ίη νίνο.

- 21 022163

Таблица 11

Определение растворимости.

Готовили раствор 2 мг/мл примера 2 в каждой требуемой среде посредством взвешивания приблизительно 1 мг соединения в пробирке и добавляли требуемый объем (т.е. 0,5 мл) соответствующей среды в каждую пробирку. Помещали закрытые пробирки на вращающую смесь в течение ночи (~16 ч) при комнатной температуре и затем пропускали через фильтр с использованием фильтров 0,22 мкм иНгаТгееМС (МННроге™) и измеряли рН фильтрата (Опои 720А рН метр). Готовили образец для анализа ВЭЖХ посредством переноса 100 мкл фильтрата в пробирку ВЭЖХ и добавляли 900 мкл раствора 50% ацетонитрила в воде. Определяли растворимость с использованием метода ВЭЖХ (мобильная фаза ВЭЖХ из 15% ацетонитрила с 0,1% ТРА и 85% воды с 0,1% ТРА; колонка Вопик КР, 4,6x75 мМ, 3,5 см; детекторы на 264 нм ИУ; температура колонки 40°С; скорость пропускания 1,5 мл/мин; вводимый объем 1 мкл).

- 22 022163

Таблица 12

Результаты растворимости

Образец среды	Пример	2
	Среднее мг/мл	Среднее рН
0,ШНС1	>2,0	1,15
рН2*	>2,0	2,31
рН 4*	1,0524	4,92
рН 6*	0,7178	6,14
рН8*	0,6352	8,00
8ОР*	1,7529	3,52
Сытое *	>2,0	5,09
Натощак*	1,0203	6,45

* рН 2 = 50 мМ фосфатного буфера при рН 2 рН 4 = 50 мМ фосфатного буфера при рН 4 рН 6 = 50 мМ фосфатного буфера при рН 6 рН 8 = 50 мМ фосфатного буфера при рН 8

8СЕ = имитация желудочного сока (АЬигиЬ е! а1., 1п!. 1.

оГ РЬагтасеиЬск, 347:16-22, 2008)

Сытое = имитация желудочного сока в сытом состоянии (Огекктап I е! а1., РЬагта. Кек., 15(1):11-21, 1998)

Натощак = имитация желудочного сока натощак Огекктап I. е! а1., РЬагта. Кек., 15(1):11-21, 1998)

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали с помощью данного анализа, проведенного в точности согласно описанию выше. Например, проанализировали соединение согласно примеру 2, и оказалось, что результаты его растворимости равны представленным в табл. 12. Полученные результаты показывают, что пример 2 проявляет желаемую растворимость выше физиологического рН желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Это физико-химическое свойство поможет избежать изменчивости воздействия у онкологических больных, которые, скорее всего, будут принимать несколько препаратов, таких как ингибиторы протонной помпы (ИПП), что может привести к лекарственному взаимодействию с лекарственным средством, которое имеет переменную растворимость при рН ЖКТ выше физиологического. Это происходит из-за того, что изменения рН желудка (т.е. пациенты, принимающие или не принимающие ИПП или пищевой эффект) может привести к изменчивости воздействия из-за различий в растворимости. Предотвращение потенциального лекарственного взаимодействия особенно важно в онкологии из-за многочисленных препаратов, которые пациенты обычно получают в одно и то же время, узкого терапевтического окна многих противораковых препаратов и больших меж- и внутрииндивидуальных отличий пациентов. Соединение, имеющее предпочтительную растворимость, также позволяет избежать необходимости в сложных и дорогих лекарственных формах, которые могут быть использованы для увеличения системного воздействия, необходимого для эффективности из-за низкой растворимости или для уменьшения изменчивости воздействия из-за пищевого эффекта и ИПП.

Исследование фармакокинетических свойств на собаках.

Собаки породы бигль обычно используются для определения ш у1уо воздействия и фармакокинетических параметров фармацевтических продуктов. Хотя физиология желудка собак в некоторых аспектах отличается от человеческой, это полезно для прогнозирования абсорбции лекарственного средства и идентификации потенциальных проблем при нелинейной фармакокинетике.

Для определения фармакокинетических параметров примера 1 у собак сукам и кобелям (до 4 животных на дозу, в отдельных исследованиях) давали пример 1 через желудочный зонд в 1% гидроксиэтилцеллюлозе, 0,25% полисорбате 80, 0,05% пеногасителя в суспензии в очищенной воде (суспензия ГЭЦ). Пределы вводимых доз составляют от 1 до 12 мг/кг в суспензии ГЭЦ.

Собирали образцы крови в пробирки, содержащие калиевую соль этилендиаминотетрауксусной кислоты, от каждой собаки в 0 (до дозы), 0,5, 1, 2, 4, 8 и через 24 ч после дозы. Некоторые исследования также включали образцы, собранные в момент времени 0,25 ч и 12 ч. Эти образцы центрифугировали для получения плазмы, которую затем замораживали перед анализом. В образцах проводили осаждение бел- 23 022163 ка и экстракты анализировали на наличие примера 1 с помощью жидкой хроматографии/тандемной массспектрометрии с использованием масс-спектрометра РЕ-§аех ΑΡΙ4000. Стандартные кривые варьировали от 1 до 5000 нг/мл. Концентрации в плазме выше верхнего предела определения измеряли с помощью разведения. Измеренные концентрации примера 1 сохраняли в системе Аа15оп ν.7.4, валидизированной системе управления лабораторной информацией, используемой для хранения и управления электронными данными, и определяли фармакокинетические параметры с помощью некомпартментной модели с использованием программного обеспечения ΑΑΤ8ΘΝ.

Соединение согласно настоящему изобретению исследовали с помощью данного анализа, проведенного в точности согласно описанию выше. Например, проанализировали соединение согласно примеру 1, и оказалось, что средняя АИС соответствует представленным в табл. 13. Значения площади под кривой (АИС) для примера 1 повышается линейно при дозе в пределах от 1 до 12 мг/кг, как показано в таблице ниже. Анализ линейной регрессии отдельных значений АИС дает корреляцию определения К² 0,86 и линейное уравнение у = 1474,3х + 44,311. Анализ линейной регрессии средних значений АИС для каждой дозы приводит к корреляции определения К² 0,96 и линейному уравнению у = 1544,7х-735,34. Эти результаты показывают, что соединения в рамках настоящего изобретения имеют линейные фармакокинетические свойства у собак выше соответствующего фармакологического диапазона доз, без признаков насыщения поглощения. Это является благоприятным свойством для создания лекарственных средств и клинического применения, способствующим предсказуемому увеличению при системном воздействии при пероральном введении.

Таблица 13

	Доза (мг/кг)
	1	3	4,5	6	9	12
Средняя лис ± Стандартное отклонение (нг*час/мл)	1161 ± 440	3783 ± 2163	5920 ± 269	9620 ± 2093	10790 ± 5954	19150 ± 3465
Количество животных	10	10	2	2	2	2

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (6)

1. Соединение, представляющее собой 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2§)-2метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он, или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что представляет собой 8-[5-(1-гидрокси-1метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2§)-2-метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он.

3. Соединение по п.2, отличающееся тем, что представляет собой 8-[5-(1-гидрокси-1метилэтил)пиридин-3 -ил] -1-[(2 §)-2-метоксипропил] -3 -метил-1,3 -дигидро -2Н-имидазо [4,5-с] хинолин-2он в кристаллической форме, характеризующейся рентгеновской порошковой дифрактограммой, содержащей характеристические пики в 20±0,2, при 8,57 и одном или нескольких из 9,06, 15,93, 18,29 и 18,87.

4. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение или соль по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель.

5. Применение соединения или соли по любому из пп.1-3 для лечения рака.

6. Применение по п.5, при этом рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака желудка, рака головы и шеи, немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), рака молочной железы, меланомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, глиобластомы, рака легкого, рака почки, саркомы, рака кроветворной и лимфоидной тканей, рака центральной нервной системы, рака шейки матки, рака эндометрия, рака печени, рака кожи, рака желудка, рака щитовидной железы, рака верхних отделов желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей и рака мочеполовой системы.