EA017753B1

EA017753B1 - Способы лечения неоплазии при помощи комбинации клофарабина и облучения

Info

Publication number: EA017753B1
Application number: EA200970949A
Authority: EA
Inventors: Бо Ксу
Original assignee: Саузерн Рисерч Инститьют
Priority date: 2007-04-14
Filing date: 2008-04-14
Publication date: 2013-02-28
Also published as: CA2683637C; ZA200907072B; AU2008240118B2; HK1139006A1; EP2136631A1; PT2136631E; EP2136631B1; EP2136631A4; AU2008240118A1; CN101686673B; CN101686673A; ES2390801T3; MX2009011104A; KR101449579B1; US20080262003A1; CA2683637A1; BRPI0809937A2; US9757380B2; NZ580463A; JP2010523721A

Abstract

Согласно настоящему изобретению предложены способы лечения неоплазии при помощи клофарабина и облучения. Описанная комбинация радиотерапии и клофарабина создает синергический эффект при лечении раковых заболеваний. Клофарабин сенсибилизирует клетки, делая их более чувствительными к действию радиотерапии.

Description

Настоящее изобретение относится в целом к области молекулярной биологии, радиационной онкологии и терапии рака. Более конкретно, согласно настоящему изобретению было обнаружено, что сочетание некоторой молекулярной химиотерапии и лечения облучением усиливает терапевтическое воздействие, направленное против рака.

Уровень техники

Рак является мировой проблемой, с которой ежегодно сталкиваются миллионы людей. Поэтому поиск способов его лечения является жизненно важной задачей. Для лечения рака используют как химиотерапию, так и облучение. Химиотерапией называют применение химических соединений или лекарственных препаратов для лечения заболеваний, хотя термин химиотерапия чаще всего ассоциируется с лечением рака. Противораковые химиотерапевтические агенты обычно называют противоопухолевыми (антинеопластическими) средствами. Тяжелые побочные эффекты, связанные с большинством противораковых химиотерапевтических средств, являются результатом неспецифичной природы этих препаратов, которые не различают здоровые и раковые клетки и разрушают те и другие. Специфичные препараты, воздействующие на клеточный цикл, разработаны для ослабления этих эффектов путем воздействия, направленного на фазы клеточного цикла, связанные с размножением и делением клеток. Однако эти препараты также не отличают раковые клетки от здоровых клеток, претерпевающих нормальное деление. Такие типы химиотерапии оказываются особенно опасными для клеток, которые часто делятся, включая клетки крови, клетки волосяных фолликулов и клетки половых путей и желудочно-кишечного тракта.

Наиболее распространенными побочными эффектами химиотерапевтических агентов являются тошнота и рвота. Большая часть индивидуумов также страдают от миелосупрессии или подавления костного мозга, в котором образуются эритроциты, лейкоциты и тромбоциты. Эти и другие побочные эффекты усиливаются также в результате подавления иммунной системы, сопровождающегося разрушением и недостатком образования лейкоцитов и связанной с этим риском оппортунистической инфекции. Другие широко распространенные побочные эффекты химиотерапевтических агентов включают выпадение волос (алопецию), потерю аппетита, снижение веса, изменения вкусовых ощущений, стоматит и эзофагит (воспаление и боли в пищеводе), запор, диарею, утомляемость, нарушение сердечной деятельности, изменения нервной системы, поражение легких, поражение репродуктивной ткани, поражение печени, поражение почек и мочевыделительной системы.

Облучение представляет собой другой широко применяемый способ лечения рака, который используют примерно в 60% лечебных схем. Часто сочетаемая с химиотерапией и/или хирургией радиотерапия включает как местное, так и общее облучение тела, а также ряд новых разработок, в том числе радиоиммунотерапию. Цитотоксический эффект облучения неопластических клеток связан со способностью излучения вызывать разрыв одной или обеих цепей молекулы ДНК внутри клеток. Клетки являются чувствительными к этому эффекту во всех фазах клеточного цикла. Однако повреждение ДНК является летальным с большей вероятностью для раковых клеток, поскольку они обладают меньшей способностью к репарации поврежденной ДНК. Здоровые клетки, содержащие функциональные белки контроля клеточного цикла и ферменты репарации, с гораздо большей вероятностью будут способны восстановить радиационные повреждения и нормально функционировать после лечения.

Побочные эффекты от облучения аналогичны эффектам от химиотерапии и возникают по той же причине, заключающейся в повреждении здоровой ткани. Облучение обычно бывает более локализованным, чем химиотерапия, однако лечение все-таки сопровождается повреждением первоначально здоровой ткани. Многие побочные эффекты являются неприятными, и облучение само по себе обладает мутагенностью, канцерогенностью и тератогенностью, которые представляют собой недостатки, присущие также химиотерапии. Хотя нормальные клетки обычно начинают восстанавливаться в течение 2 ч после облучения, оно может вызвать мутации в генах здоровых клеток. Риск этого повышен для определенных тканей, в частности для тканей репродуктивной системы. Кроме того, установлено, что пациенты поразному переносят облучение. На практике, дозы, которые могут и не привести к образованию новых опухолей у одного индивидуума, могут вызвать появление дополнительных опухолей у другого индивидуума. Это может быть связано с предсуществующими мутациями белков контроля клеточного цикла и ферментов репарации, однако современный уровень практики не позволяет прогнозировать величину опасной дозы для конкретного индивидуума. Распространенные побочные эффекты облучения включают раздражение мочевого пузыря, утомляемость, диарею, низкое число форменных элементов крови, раздражение ротовой полости, изменение вкусовых ощущений, потерю аппетита, алопецию, раздражение кожи, изменение функции легких, энтерит, нарушения сна и прочие.

Химиотерапию и облучение можно комбинировать для лечения раковых заболеваний, однако часто пациент подвергается повышенному риску вследствие кумулятивных побочных эффектов и токсичности каждого способа лечения. Синергический эффект обеспечивает сниженное воздействие токсичных химиотерапевтических агентов и радиотерапии и тем самым снижает побочные эффекты, обеспечивая достижение более высокого благоприятного результата.

- 1 017753

Краткое описание изобретения

Изобретение относится в целом к способам повышения чувствительности клеток к радиационному воздействию, а также к способам лечения раковых заболеваний клофарабином в сочетании с радиотерапией.

Один из вариантов реализации настоящего изобретения обеспечивает способ придания раковым клеткам чувствительности к облучению, который включает введение в указанную клетку клофарабина.

Еще один вариант реализации обеспечивает способы повышения чувствительности популяция клеток к облучению, при этом указанные способы включают воздействие сенсибилизирующим количеством клофарабина на указанные популяции клеток.

Настоящее изобретение обеспечивает также способы лечения роста опухоли, включающие воздействие на пациента, который в этом нуждается, синергической комбинацией ионизирующего облучения и клофарабина.

Все способы согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать введение клофарабина одновременно с облучением на протяжении курса лечения. Так, например, клофарабин можно вводить ежедневно в течение некоторого периода времени до, после или во время курса радиотерапии. В одном варианте реализации клофарабин вводят после проведения радиотерапии, но достаточно близко по времени, чтобы получить комбинационный или синергический эффект. Аналогично этому клофарабин можно вводить до проведения радиотерапии, но достаточно близко по времени, чтобы получить комбинационный или синергический эффект.

Не ограничивая объем изобретения, раковые заболевания, которые можно лечить раскрытыми в настоящем описании способами, включают, в частности, но не ограничиваются перечисленными, рак толстой кишки, рак прямой и толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак печени, рак мягких тканей, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак желудочно-кишечного тракта, рак молочной железы, рак яичников, лимфому, саркому, меланому шейки матки или эндометрия, рак мочевого пузыря, рак почки или рак глаза.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой иммунофлюоресцентную микрофотографию, которая показывает наличие индуцированных облучением очагов у-Н2АХ в клетках, обработанных различными концентрациями клофарабина.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий среднее число ядерных очагов γ-Η2ΑΧ на одно ядро для облученных клеток, обработанных различными концентрациями клофарабина.

На фиг. 3 показаны кривые выживаемости для фракций клеток, обработанных только клофарабином, и для фракций клеток, обработанных клофарабином и облучением.

На фиг. 4 представлены графики сравнения повышения чувствительности к облучению, вызванного клофарабином, гемцитабином и фторурацилом (5-Εϋ).

Фиг. 5 представляет собой графическую иллюстрацию среднего изменения массы опухолей ίη νίνο, обработанных только клофарабином, только облучением и комбинацией облучения и клофарабина.

Фиг. 6 представляет собой графическую иллюстрацию среднего изменения массы опухоли для опухолей ίη νίνο, обработанных только 5-Εϋ, только клофарабином, только облучением, комбинацией облучения и 5-Εϋ и комбинацией облучения и клофарабина.

Фиг. 7 демонстрирует синергический эффект облучения и клофарабина, которые применяют в сочетании друг с другом, и сравнение результатов с ожидаемым аддитивным эффектом.

На фиг. 8 показано противоопухолевое воздействие клофарабина на клетки 8КОУ-3.

На фиг. 9 показано противоопухолевое воздействие клофарабина на клетки ЮК.ОУ-1.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится в целом к способам повышения чувствительности клеток к действию облучения, а также к способам лечения раковых заболеваний одним или несколькими соединениями согласно настоящему изобретению в сочетании с радиотерапией.

Следующие термины, используемые в данном описании, имеют указанные ниже значения, если не оговорено иного.

В данном описании термины неопластические клетки, неоплазия, опухоль, клетки опухоли, рак и раковые клетки являются равнозначными и относятся к клеткам, которые проявляют относительно автономный рост и соответственно проявляют аберрантный фенотип по росту, который характеризуется значительной потерей контроля пролиферации клеток. Неопластические клетки могут быть злокачественными или доброкачественными.

Термины противоопухолевый агент, противоопухолевый химиотерапевтический агент, химиотерапевтический агент, противоопухолевый и химиотерапевтический являются равноценными и относятся к химическим соединениям или лекарственным препаратам, которые используют для лечения рака, например для уничтожения раковых клеток и/или для ограничения распространения заболевания.

Радиотерапия - термин, который обычно используют в данной области для обозначения многих типов радиотерапии, включая внутреннюю и наружную лучевую терапию, радиоиммунотерапию, а так

- 2 017753 же применение различных типов излучения, включая рентгеновские лучи, гамма-лучи, альфа-частицы, бета-частицы, фотоны, электроны, нейтроны, радиоизотопы и другие формы ионизирующего излучения. В данном описании термины радиотерапия и облучение включают все эти типы радиотерапии, если не указано иного.

Термины подавление роста опухоли, лечение роста опухоли, лечение рака и т.п. относятся к уменьшению скорости роста опухоли, полному прекращению роста опухоли, обеспечению уменьшения размера существующей опухоли, устранению существующей опухоли и/или предотвращению появления дополнительных опухолей после лечения составами, наборами или способами согласно настоящему изобретению. Подавление роста опухоли показывает состояние, в котором рост замедлен по сравнению с ростом без введения соединения согласно настоящему изобретению в сочетании с облучением. Рост клеток опухоли можно оценить любыми способами, известными специалистам в данной области, включая, в частности, но без ограничения, измерение размера опухоли, определение пролиферации клеток опухоли при помощи анализа с введением ³Н-тимидина или подсчет количества клеток опухоли. Подавление роста клеток опухоли означает какое-либо из следующих состояний или все: замедление, задержка и остановка роста опухоли, а также уменьшение размеров опухоли.

Задержка развития опухоли обозначает задержку, затруднение, замедление, торможение, стабилизацию и/или отсрочку развития заболевания. Такая задержка может иметь различную продолжительность в зависимости от истории болезни и/или индивидуума, подвергаемого лечению.

Используемые в данном описании термины синергия или синергический эффект применительно к комбинации введения соединения согласно настоящему изобретению в сочетании с облучением означает, что эффект такой комбинации является большим, чем суммарный (аддитивный) эффект от введения одного или нескольких соединений отдельно и отдельно облучения.

Все термины включают единственное и множественное число, если из контекста однозначно не следует иное.

Термин эффективное количество относится к такому количеству соединения согласно настоящему изобретению, которое может быть терапевтически эффективным для лечения заболевания или нарушения, связанного с настоящим описанием. Точное требуемое количество указанных соединений будет меняться в зависимости от того, какое конкретно соединение или его производное применяют, от возраста и состояния субъекта, подвергаемого лечению, а также от природы и тяжести патологического состояния. Однако средний специалист в соответствующей области может определить эффективную дозу при помощи стандартных опытов. Средний специалист в данной области может определить эффективное количество путем исключительно рутинных опытов. Параметры облучения, в частности величина дозы и частота, хорошо известны в данной области.

Термин фармацевтически приемлемый относится к таким соединениям, материалам, составам и/или лекарственным формам, которые в пределах разумной медицинской оценки являются подходящими для контакта с тканями человека и животного и не вызывают чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других осложнений в сопоставлении с разумным соотношением польза/риск.

Термин фармацевтически приемлемые соли относится к производным соединений согласно настоящему изобретению, в которых исходное соединение модифицировано путем превращения соли с кислот или оснований. Соединения согласно данному изобретению образуют соли присоединения кислот и оснований с разнообразными органическими и неорганическими кислотами и основаниями, включая физиологически приемлемые соли, которые часто используют в фармацевтической химии. Такие соли также являются частью данного изобретения. Примеры неорганических кислот, которые используют для получения таких солей, включают соляную, бромоводородную, йодоводородную, азотную, серную, фосфорную, гидрофосфорную и т.п. Можно использовать также соли, полученные из органических кислот, в частности из алифатических моно- и дикарбоновых кислот, фенилзамещенных алконовых кислот, оксиалкановых и оксиалкандиовых кислот, ароматических кислот, алифатических и ароматических сульфоновых кислот. Таким образом, указанные фармацевтически приемлемые соли включают ацетат, фенилацетат, трифторацетат, акрилат, аскорбат, бензоат, хлорбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, метилбензоат, о-ацетоксибензоат, нафталин-2-бензоат, бромид, изобутират, фенилбутират, β-гидроксибутират, бутин-1,4-диоат, гексин-1,4-диоат, карбонат, каприлат, хлорид, циннамат, цитрат, формиат, фумарат, гликолят, гептаноат, гиппурат, лактат, малат, малеат, гидроксималеат, малонат, манделат, мезилат, никотинат, изоникотинат, нитрат, оксалат, фталат, терафталат, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, пропиолат, пропионат, фенилпропионат, салицилат, себакат, сукцинат, суберат, сульфат, бисульфат, пиросульфат, сульфит, бисульфит, сульфонат, бензолсульфонат, р-бромбензолсульфонат, хлорбензолсульфонат, этансульфонат, 2-гидроксиэтансульфонат, метансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, р-толуолсульфонат, ксиленсульфонат, тартрат и т. п.

- 3 017753

Основания, которые обычно используют для получения солей, включают гидроксид аммония и гидроксиды щелочных и щелочно-земельных металлов, карбонаты, а также алифатические и первичные, вторичные и третичные амины и алифатические диамины. Основания, особенно полезные для получения аддитивных солей, включают гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, карбонат калия, метиламин, диэтиламин и этилендиамин.

Термин пациент относится к животным, включая млекопитающих, предпочтительно людей.

Термин метаболит относится к веществу, образованному в результате химических изменений, связанных с процессами роста и восстановления в живом организме, включая процессы анаболизма и катаболизма.

Термин пролекарство обозначает соединение, которое превращается в организме в активную форму, оказывающую медицинское воздействие. Пролекарства могут быть полезны в тех случаях, когда активный препарат является слишком токсичным для системного введения, активный препарат плохо поглощается в пищеварительном тракте или организм разрушает активный препарат до того, как он достигнет своей мишени. Способы получения пролекарств описаны в работе Нале Виийдаагф Эсвщп о£ Ртойгидв (Е1всу1сг 8с1еисе РиЫщйега В.У. 1985), содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки.

Термин сольваты относится к соединениям, образованным в результате взаимодействия растворителя и растворенного вещества, и включает гидраты. Сольваты обычно представляют собой кристаллические твердые продукты присоединения, которые содержат в кристаллической структуре молекулы растворителя в стехиометрических или нестехиометрических отношениях.

В данном описании термин содержащий (и его грамматические формы), употребляется во включающем смысле, как имеющий или включающий, а не в исключающем смысле состоящий только из. В настоящем описании термин состоящий, по существу, из относится к включению компонентов, которые указаны в явном виде, а также компонентов, которые не вызывают значительного ухудшения основных и новых характеристик указанных или перечисленных компонентов.

В описанных и заявленных согласно настоящему описанию формулах предполагается, что в тех случаях, когда какой-либо символ появляется в конкретной формуле или заместителе более одного раза, его значение в каждом случае не зависит от других.

Один из вариантов реализации настоящего изобретения представляет собой способ потенцирования лечения путем радиотерапии, включающий введение пациенту, который нуждается в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения формулы (I)

где X и Υ являются одинаковыми или различными и представляют собой водород, галоген, ОВ₃, 8В₃, ΝΚ₃Β₄ или ΝΗ-ацил;

Ζ представляет собой галоген или СР₃;

В₃ и В₄ являются одинаковыми или различными и представляют собой водород, низший алкил, содержащий от 1 до 7 атомов углерода, аралкил, выбранный из группы, включающей бензил, бензгидрил или метоксибензил, или арил, выбранный из группы, включающей фенил, хлорфенил, толуил, метоксифенил и нафтил;

ΝΗ-ацил представляет собой алканоил или ароил амид, при этом алканоил представляет собой алкил-карбонильный радикал, в котором алкил представляет собой насыщенный или ненасыщенный углеводородный радикал с линейной или разветвленной цепью, содержащий от 1 до 20 атомов углерода; и

В₁ и В₂ являются одинаковыми или различными и представляют собой водород, ацил или ароил, при этом ацил представляет собой алканоильную группу, содержащую от 1 до 20 атомов углерода, а ароил представляет собой бензоил или нафтоил, а также их соли, сольваты, производные и пролекарства.

Другой вариант реализации настоящего изобретения обеспечивает способ придания клетке опухоли чувствительности к облучению, при этом указанный способ включает введение в указанную клетку соединения формулы (Ι-а). В следующем варианте реализации клетки опухоли, которые сенсибилизируют к действию облучения, не являются любой из или ни одной из перечисленных: клетки опухоли простаты, легкого или глиобластомы.

- 4 017753

Способы синтеза соединения формулы (I) хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны в патенте США № 4751221, Аа1апаЬе с1 а1., содержание которого полностью включено в данное описание посредством ссылки.

Еще один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ потенцирования лечения при помощи радиотерапии, включающий введение пациенту, который нуждается в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения формулы (1-а)

Н_гО'

где Υ представляет собой Е, С1 или Вг;

В₂ представляет собой водород или ацил;

а также солей, сольватов, производных и пролекарств указанных соединений.

Другой вариант реализации настоящего изобретения представляет собой способ сенсибилизации клетки опухоли к облучению, при этом указанный способ включает введение в указанную клетку соединения формулы (Ι-а). В следующем варианте реализации клетки опухоли, которые сенсибилизируют к действию облучения, не являются любой из или ни одной из перечисленных: клетки опухоли простаты, легкого или глиобластомы.

Способы синтеза соединений формулы (Ι-а) хорошо известны и раскрыты в патенте США № 6949640 (МоШдотету с1 а1.) и патенте США № 5034518 (МоШдотету с1 а1.). Оба указанных патента принадлежат 8ои1йегп Векеатсй ИъШШе. являющемуся также заявителем по данной заявке, и содержание обоих патентов полностью включено в данное описание.

Еще один вариант реализации представляет собой способы повышения чувствительности к облучению популяций клеток, при этом указанные способы включают воздействие на указанные популяции клеток сенсибилизирующей дозой соединения согласно настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способы лечения роста опухоли, включающие введение пациент, который нуждается в таком лечении, синергической комбинации облучения и соединения согласно настоящему изобретению. Все указанные способы могут дополнительно включать введение соединения согласно настоящему изобретению одновременно с облучением на протяжении курса лечения. Так, например, соединения согласно настоящему изобретению можно вводить ежедневно в течение некоторого периода времени до, после или во время курса радиотерапии. В одном варианте реализации соединение согласно настоящему изобретению вводят после проведения радиотерапии, но достаточно близко по времени, чтобы обеспечить комбинационный или синергический эффект. Аналогично, соединение согласно настоящему изобретению можно вводить до проведения радиотерапии, но достаточно близко по времени, чтобы обеспечить комбинационный или синергический эффект. В одном варианте реализации способы согласно настоящему изобретению не направлены на любую или ни на одну из опухолей простаты, легкого или глиобластомы.

Без ограничения объема изобретения раковые заболевания, которые можно лечить способами согласно настоящему изобретению, включают, в частности, но без ограничения, рак толстой кишки, рак печени, рак толстой и прямой кишки, рак поджелудочной железы, рак мягких тканей, рак головного мозга, рак головы и шеи, гастроинтестинальный рак, рак молочной железы, рак яичников, лимфому, саркому, меланому шейки матки или эндометрия, рак мочевого пузыря, рак почки или рак глаза.

Пролекарственные формы соединений, содержащих азотсодержащие функциональные группы (амино, гидроксиамино, амид и т. п.), могут включать следующие типы производных, в которых каждая группа В независимо может представлять собой водород, замещенные или незамещенные алкильные, арильные, алкенильные, алкинильные, гетероциклические, алкиларильные, аралкильные, аралкенильные, аралкинильные, циклоалкильные или циклоалкенильные группы, как определено выше.

(а) Карбоксамиды, -ИНС(О)В.

(б) Карбаматы, -ΝΗΟ(Ό)ΟΒ.

(в) (Ацилокси)алкилкарбаматы, ΝΗΟ(Ό)ΟΒΟΟ(Ό)Β.

(г) Енамины, -МНСВ(=СНСО₂В) или -МНСВ(=СНСО1\1В₂).

(д) Основания Шиффа, -№СВ₂.

(е) Основания Манниха (из карбоксимидных соединений), ВСΟNНСН₂NВ₂.

Получение таких пролекарственных производных описано в различных литературных источниках (например, А1ехапбег е1 а1., 1. Меб. Сйет. 1988, 31, 318; Айдак-Матйп е1 а1., РСТ АО рр/41531, р. 30).

- 5 017753

Азотная функциональная группа, подвергающаяся превращениям при получении этих производных, представляет собой один или более атомов азота соединения согласно настоящему изобретению.

Пролекарственные формы карбоксилсодержащих соединений согласно настоящему изобретению включают сложные эфиры (-СО₂В), где группа К. соответствует любому спирту, который выделяется в организме в результате ферментативных или гидролитических процессов на фармацевтически приемлемом уровне. Другое пролекарство, являющееся производным формы карбоновой кислоты согласно настоящему изобретению, может представлять собой четвертичную соль

к структура которой описана в работе Войог с1 а1., 1. Мей. СНет. 1980, 23,469.

При этом следует понимать, что соединения согласно настоящему изобретению включают все оптические изомеры и стереоизомеры с различными возможными атомами молекулы.

Фармацевтически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению включают соли, полученные из фармацевтически приемлемых неорганических или органических кислот. Примеры пригодных кислот включают соляную, бромоводородную, серную, азотную, перхлорную, фумаровую, малеиновую, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол-п-сульфоновую, винную, уксусную, лимонную, метансульфоновую, муравьиную, бензойную, малоновую, нафталин-2сульфоновую, трифторуксусную и бензолсульфоновую кислоту. Соли, полученные из соответствующих оснований, включают соли щелочных металлов, в частности натрия и аммиака.

Специалисты в данной области могут синтезировать соединения согласно настоящему изобретению с учетом данного описания, не проводя излишних опытов. Соответствующие процедуры описаны в химической литературе применительно к получению сахаров или нуклеозидов. См., в частности, ΟΙιοί. 1оид-Вуоо; К1т, 1еоид-Мт; КоН, Кее-Υοοη; СНо, Роид-Суи; К1т, 1ае-Ноид; Н^аид, 1ае-Таед; СНо, Аоо-Уоиид; 1аид, Нуии-8оок; Ьее, СНаид-Но; СНо1, Тае-8аеид; К1т, Сйиид-Μί; К1т, Υοид-Ζи; К1т, Тае-Куии; СНо, 8еиид-1оо; К1т, Суоиид-Аои РСТ ГЫ. Арр1. (2002), 100 рр АО 0257288 А1 20020725. Но1у, Аи1оЫи; УойиЬа, Гуаи; Т1ои81оуа, Еуа; МазоДакоуа, Мйеиа. СоПесРои о! СхесНозкуак СНетка1 Соттишсайоик (2001), 66(10), 1545-1592. ВеДаи, Роткик; МазоДакоуа, Мйеиа; Ре С1егсц, Епс; ВозеиЬегд, 1уаи Шскомае^ Ыис1еойае8 & Ыис1е1с Ас1Й5 (2001), 20(8), 1497-1522; ИЬаза^а, Мазаги; 8ек1уа, КошсЫ РСТ ГЫ. Арр1. (2001), 39 рр АО 0164693 А1 20010907. О1таг, М1го§1ау; Мазофакоуа, Мйеиа; УойиЬа, 1уаи; Но1у, АЫоЫи. Сойесйои о! СхесНозкуак СНетка1 Соттишсайоик (2001), 66(3), 500-506. М1сНа1; Носек, М1сйа1; Но1у, АЫоЫи. Сойесйои о! СхесНо^осак Сйет1са1 Соттишсайоик (2000), 65(8), 1357-1373. 1е!!егу, А.Ь.; К1т, к-Н.; А1етег, Ό.Ε. Тейакеагои (2000), 56(29), 5077-5083. Но1у, АЫоЫи; СиеШег, 1аго§1ау; Оуогакоуа, Наиа; МазоДакоуа, Мйеиа; Аиагер Сгаае1а; 8иоеск, КоЬеР; ВакапЫ, 1аи; Ре С1егсц, Епк. 1оигиа1 о! Меакша1 СйетШгу (1999), 42(12), 2064-2086. 1аиеЬа, Ζ^ΐ^; Но1у, АЫоЫи; Маюракоуа, Мйеиа. Сойесйои о! СхесНо^оуак Сйет1са1 Соттишсайоиз (2001), 66(9), 1393-1406. Но1у, АЫоЫи; СиеШег, ЫгсМау; Оуогакоуа, Наиа; Маюракоуа, Мйеиа; Аиагер Сгаае1а; 8иоеск, КоЬеР; ВакапЫ, 1ащ Ре С1егсц, Епк. 1оигиа1 о! Меакша1 СйетШгу (1999), 42(12), 2064-2086. Оаид, Они; Епои, Магк Ό.; Веаау, М. Кате ВоЬшзюи, Еа^ага Ό.; КаЦЬкаЙа, 8пшуа5 Као; Веаау, К. Ка)а. РСТ 1й. Арр1. (1998), 126 рр АО 9839344 А1 19980911. АптйН, Миг1у Ν.; Сииау, КеииеШ С.; ПоидкеПу, •ГоюрН Р.; К1т, СНоиид и.; О11уа1, Веха; 81е11а, Уа1ейшо 1. РСТ ГЫ. Арр1. (1998), 74 рр АО 9804569. 8ек1уа, КошсЫ; ТаказЫта, Шаеакр Иеаа, №юко; Кат1уа, №-юЫго; Уиа^а, 8а1озЫ; Еиртига, УозЫуик!; ИЬаза^а, Мазаги 1оигиа1 о! Меакша1 СйетШгу (2002), 45(14), 3138-3142. ИЬаза^а, Мазаги; 8ек1уа, КошсЫ; ТаказЫта, Шаеакр Иеаа, №-юко; Уиа^а, БаЮзЫ; Кат1уа, №юЫго. Еиг. РаР Арр1. (1997), 56 рр ЕР 785208 А1 19970723. Носек, МсНа1; Маюракоуа, Мйеиа; Но1у, АЫоЫи, Сойесйои о! СхесНо^оуак СНет1са1 СоттцЫсайоиз (1997), 62(1), 136-146. Но1у, АЫоЫи; УойиЬа, Гуаи; Т1ои81оуа, Еуа; Маюракоуа, Мйеиа. Сойесйои о! СхесНо^оуак Сйет1са1 СоттцЫсакоиз (2001), 66(10), 1545-1592. Но1у, АЫоЫи; Ре С1егсц, Епк Резке Аксе. РСТ ГЫ. Арр1. (1996), 57 рр. АО 9633200 А1 19961024. Кериай Роткик; ВозеиЬегд, Гуаи. Сойесйои о! СхесНозкуак СНет^й СοтшиЫсаΐ^οи8 (1996), 61 (8рес. Гззие), 8122-8123. Но1у, АЫоЫи; Руогакоуа, Наиа; Виалсй, Виалсй; Мазоракоуа, Мйеиа; Виаезшзку, Мйоз; ВакапЫ, 1аи; Аиаге1, Сгас1е11а; Ре С1егсц, Епк. 1оигиа1 о! Меакша1 СНет^ку (1996), 39(20), 4073-4088. СиаЫ1, Сшюрре; Мег1о, Уа1епа; Nа^^заηο. Билса. Теΐ^акеа^οи (1995), 51(35), 9737-46. Така^ита, Шаеакр Гиоие, №-юко; ИЬаза^а, Мазаги; 8ек1уа, КошсЫ; ΥаЬиисН^, 8Ыидо Еиг. РаР Арр1. (1995), 88 рр ЕР 632048 А1 19950104. Акхаиаег, Ре1г; Но1у, АйоЫи; Мазоракоуа, Мйеиа, СоИесРои о! СхесНозкуак Сйет1са1 СοшшиЫсаΐ^οи8 (1994), 59(8), 1853-69. АкхаМет, Ре1г; Но1у, АЫоЫи; Мазоракоуа, Мйеиа; Сойесйои о! СхесНозкуак Сйет1са1 СοтшиЫсаΐ^οи8 (1994), 59(8), 1853-69. Виалсй, Лиапсй; Но1у, Айоит; Руогакоуа, Наиа. СоПесРои о! СхесНозкуак Сйет1са1 СοтшиЫсаΐ^οи8 (1993), 58(7), 1645-67. Но1у, АЫоЫи. СоПесРои о! СхесНозкуак Сйет1са1 СοтшиЫсаΐ^οи8 (1993), 58(3), 649-74. Спайк Сшзерре; Мег1о, Уа1епа; Nаπ8аηο, Еипса; Теΐ^акеа^οи (1995), 51(35), 9737-46. Ет^Нек!, Ри^и8кοΐкаш; Вгоа&еЫег, Раи1 В.; Но^е11, Нету С.; 8аршо, СНеМег, 1г. РСТ ГЫ. Арр1. (1992), 43 рр АО 9202511 А1 19920220. СИа/лег, Ато1а. РСТ ГЫ. Арр1. (1991), 131 рр АО 9119721. К1ш, СНоиид Ии; ЬиН, Вшд Υυ; Мксо, Ре1ег Е.; Вгоизои, Ыйте 1.; Нйсйсоск,

- 6 017753

М1скае1 1.М.; Οΐιαζζοιιΐί. Гктаб; Майш, 1окп С 1оитпа1 ой Меб1С1па1 Скеткку (1990), 33(4), 1207-13. ВокепЬегд, кап; Но1у, Αηΐοπίη; Мако^бком-г МПепа. СоПесРоп ой СУескокксак Скетка1 Соттишса!юпк (1988), 53(11В), 2753-77. ВокепЬегд, кап; Но1у, Ап!ошп; Маκο^^бкονа, МПепа. Со11есбоп ой СУескойогак Скетка1 Соттишса!юпк (1988), 53(11В), 2753-77.

Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, считают, что соединения согласно настоящему изобретению, в частности клофарабин, действуют синергически с радиотерапией путем поддержания повреждения ДНК, что усиливает реакцию опухоли на лучевую терапию. Клофарабин действует путем нарушения метаболизма нуклеотидов, ингибируя ДНК-полимеразы и рибонуклеотидредуктазы (ВпВ), класс ферментов, необходимых для восстановления пула нуклеотидов. ВпВ катализирует восстановление рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды, обеспечивая образование субстратов для синтеза и репарации ДНК. Клофарабин фосфорилируется киназами цитозоля (дезоксицитидинкиназой) в клофарабин-5'монофосфат и моно- и дифосфокиназами в активную форму, клофарабин-5'-трифосфат. Клофарабин-5'трифосфат конкурирует с дезоксиаденозинтрифосфатом (дАТФ) за ДНК-полимеразу-α и -ε и ингибирует ВпВ, путем истощения пулов дезоксирибонуклеотидтрифосфата, состоящих из дезоксицитидинтрифосфата и дАТФ. Такая активность в итоге приводит к ингибированию синтеза ДНК, а также вызывает разрывы цепей и ингибирование репарации ДНК. Также возможно, что клофарабин встраивается в участок репарации, вызывает обрыв цепи в месте встраивания, продлевает сигнал реакции на повреждение ДНК и вызывает более продолжительное повреждение ДНК, инициированное радиотерапией.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют и описывают варианты воплощения настоящего изобретения. В данных примерах показаны и описаны только конкретные варианты реализации, однако следует понимать, что изобретение можно использовать в различных других комбинациях, модификациях и условиях и что возможны изменения или модификации в пределах раскрытой в настоящем описании концепции с учетом идей и/или навыков и знаний в соответствующей области. Процедуры, описанные в нижеследующих примерах, изложены также в работе Саткеаи е! а1., С1ойатаЫп Ас!к ак Вабюкепк^ет Гп Укто апб Гп Уко Ьу Гп!егйеппд \\йк ΌΝΑ Батаде Векропке, Гп!. 1. Ваб1а!юп Опсо1оду Вю1. Ркук., 70(1): 213-220 (2008), содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки.

Пример 1. Химиотерапевтический препарат.

Химиотерапевтический агент, такой как клофарабин (2-хлор-9-(2-дезокси-фтор-3-Барабинофураносил)аденин) (Сеπζуте), гемцитабин (ЕШ ЬШу) или 5-ЕИ (Атепсап Ркаттасеи!1са1 Раг!пегк) растворили в диметилсульфоксиде (б1тейку1ки1йох1бе, БМ8О), в результате чего получили маточный раствор с концентрацией 100 мМ, который хранили при температуре -20°С. Непосредственно перед использованием соединения разбавили с получением рабочих разведений в культуральной среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (Би1Ьессо'к МобШеб Еад1е'к Мебшт, БМЕМ), содержащей эмбриональную бычью сыворотку (йе!а1 Ьосше кегит, ЕВ8), Ь-глутамин (2 мМ) и 1% пенициллинстрептомицина.

Пример 2. Облучение.

Для облучения использовали установку Х-ВАБ 320 Гттаб1а!юп СаЫпе! (РтесЕюп Х-гау, Еак! Науеп, СТ) с напряжением 320 кВ и током 160 мА, с фильтром 0,8 мм 8п + 0,25 мм Си + 1,5 мм А1 (слой половинного ослабления (НУЪ) = 3,7 Си) при расстоянии от поверхности до мишени (!агде!-кшйасе б1к!апсе, Т8Б) 20 см и интенсивности дозы 3,4 Гр/мин. Все облучения проводили при нормальном атмосферном давлении и при температуре окружающей среды.

Пример 3. Анализ образования очагов у-Н2АХ.

Клетки НеЬа и БЬБ-1 (НСТ15) (полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС), ССЬ-2, Мапаккак УА) поддерживали в экспоненциальной фазе роста в БМЕМ - 10% ФБС в увлажненной атмосфере с 5% СО₂. Культуры клеток НеЬа в экспоненциальной фазе роста высеяли на стерильные покровные стекла площадью 22 см² в БМЕМ - 10% ФБС и инкубировали в течение 24 ч при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО₂. Клетки обработали 0, 5, 10 100 или 1000 нМ клофарабина, имитировали облучение или облучили дозой 6 Гр и собрали через 30 мин. Для исследования динамики присутствия очагов у-Н2АХ клетки обработали 0, 5, или 10 нМ клофарабина, имитировали облучение или облучили дозой 6 Гр и собрали через 0, 0,5, 2, 8, и 24 ч. Для определения влияния клофарабина на индукцию и поддержание очагов у-Н2АХ использовали иммунофлюоресцентный анализ. Затем рассчитали количество очагов на одно ядро в популяции по меньшей мере из 25 клеток и построили графики среднего и стандартного отклонения.

Провели анализ, как описано, выше и получили результаты, представленные на фиг. 1, которые показывают, что клофарабин продлевает существование очагов у-Н2АХ, индуцированных облучением. Клетки НеЬа обработали клофарабином в течение 1 ч, облучили дозой 0 (Моск, имитация) или 6 Гр (ГВ), а затем собрали. Для определения очагов у-Н2АХ, индуцированных облучением, использовали иммунофлюоресцентную микроскопию. Фиг. 2 показывает, что клофарабин продлевает существование очагов у-Н2АХ, индуцированных облучением. Определяли среднее количество ядерных очагов у-Н2АХ на одно ядро для каждого изображения при помощи программы Гтаде Рго 5.1. Усы погрешностей представляют ±1 стандартное отклонение среднего по трем независимым опытам.

- 7 017753

Пример 4. Анализ чувствительности клеток к облучению.

Для определения влияния клофарабина на чувствительность клеток к облучению провели анализ колониеобразующей способности клеток с использованием серии доз клофарабина (0-1,000 нМ) с облучением дозой 2 Гр и без облучения. Клетки НеЬа инкубировали с клофарабином в течение 4 ч перед облучением. Определили чувствительность клеток с клофарабином к облучению и получили результаты, представленные на фиг. 3, которые показывают, что клофарабин повышает чувствительность клеток к облучению. Клетки НеЬа посеяли при ограничивающем разбавлении и обработали клофарабином в течение 4 ч перед облучением, непрерывно подвергали воздействию препарата в течение следующих 20 ч, собрали через 10-12 дней и окрасили кристаллическим фиолетовым. Кривые выживаемости, на которых каждая точка представляет собой среднее по трем независимым опытам, показаны с усами погрешностей, соответствующими ±1 8ЕМ (среднеквадратичная ошибка среднего).

Пример 5. Сравнение повышения чувствительности к облучению, вызванного клофарабином, гемцитабином и 5-ЕИ.

Для сравнения радиосенсибилизирующей эффективности клофарабина с другими известными радиосенсибилизирующими антиметаболитами определили чувствительность к облучению клеток НеЬа, обработанных комбинацией клофарабина, гемцитабина или 5-Еи и радиотерапии. Агенты вводили в одинаковых дозах и режимах и определяли срединную летальную дозу (БП₅₀) для каждого препарата. Затем ГИ₅₀ для каждого агента использовали в следующих опытах. Результаты экспериментов с клофарабином, гемцитабином и 5-ЕИ представлены на фиг. 4. Клетки посеяли при ограничивающем разбавлении и обработали клофарабином в течение 4 ч перед облучением, непрерывно подвергали воздействию препарата в течение следующих 20 ч, собрали через 10-12 дней и окрасили кристаллическим фиолетовым. На графиках представлены средние по трем независимым опытам с усами погрешностей, соответствующими ±1 8ЕМ (среднеквадратичная ошибка среднего).

Пример 6. Цитотоксичность, чувствительность к облучению и химиорадиацонный синергизм.

Клетки НеЬа или ИЬИ-1 посеяли при ограниченном разбавлении в 6-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 ч при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Затем для определения цитотоксичности клетки обработали дозами клофарабина, гемцитабина или 5-ЕИ в течение 4 ч и через 20 ч добавили свежую среду.

Для определения чувствительности к облучению клетки обработали клофарабином, гемцитабином или 5-ЕИ, имитировали облучение или только облучили дозой 2 Гр или дозой 1-4 Гр и через 20 ч заменили среды. Затем культуры инкубировали в течение 10-12 дней, собрали и окрасили 0,5% раствором кристаллического фиолетового в метаноле. Количество колоний определили при помощи препаровальной лупы. Популяцию >50 клеток считали одной колонией, и количество колоний выразили в процентах относительно количества необработанных контрольных клеток и клеток, обработанных клофарабином, гемцитабином или 5-ЕИ. Кривые выживаемости построили методом линейного регрессионного анализа, при этом величина И₀ представляет собой дозу облучения, которая приводит к 37% выживаемости. Затем рассчитали коэффициенты усиления чувствительности (5еп5Ш/тд епНапсешеп! га1Ю8, 8ЕК) по значениям И₀, используя следующую формулу:

8ЕК=(И₀ необработанных клеток)/(Э₀ обработанных клеток).

Далее использовали коэффициент комбинирования (сошЫпайои шбех, С1), чтобы определить, является ли взаимодействие синергическим. Коэффициент комбинирования (С1) описан в работах РаитееН е1 а1., Е. Се11 Сус1е ЕГГес! о£ ОетсйаЬше апб ίΐδ Ко1е ш (Не Кабю5еп5Ш/тд Месйапщт ш Уйто, 1п1. 1. Каб1а1. Опсо1. Бю1. РИук., 57:1075-1083 (2003) и Огоуаппейг е1 а1., 8упегщ5бс СуЮохкйу апб РНагтасодепебск оГ ОетсйаЬше апб Ретейехеб СотЬшайоп 1п Рапсгеайс Сапсег Се11 Ьшек, С1ш. Сапсег Кек., 10:2936-2943 (2004), содержание которых полностью включено в данное описание посредством ссылки. Для того, чтобы определить, является ли взаимодействие синергическим (С1<0,7), аддитивным (0,7<С1<0,9) или антагонистическим (0,9<С1<1,1), осуществляют следующие расчеты:

(0)1 (О)г С1 = ----₊ ---(θχ)ι (υ_χ)₂ где (Ό)ι - половинная смертельная доза (летальная доза для 50% испытуемых субъектов) (ГИ₅₀) в наномолях для комбинированного лечения клофарабином с 1К;

(И)₂ - ЕИ₅₀ (в греях) для комбинированного лечения клофарабином с радиотерапией;

(Ό_χ)ι и (И_х)₂ - БП₅₀ клофарабина и радиотерапии отдельно.

Коэффициенты усиления чувствительности (8ЕК) клофарабина, гемцитабина или 5-ЕИ рассчитали по доле выживания при 2 Греях. Каждый опыт повторяли по меньшей мере два раза и определяли статистическую значимость (при р<0,05) при помощи критерия Стьюдента.

Результаты применения описанных выше способов показаны на фиг. 7. На фиг. 7 показан также синергический эффект облучения и клофарабина при их совместном применении и сравнение полученных результатов с ожидаемым аддитивным эффектом, на основании описанного выше способа.

Пример 7. Исследование ксенографтной модели рака толстой кишки.

Опухоли ИЬИ-1 толстой кишки человека имплантировали подкожно самцам бестимусных мышей

- 8 017753 пи/пи вблизи правого бока. До начала лечения опухолям дали достичь массы 100-256 мг (размер 100-256 мм³). Имплантацию произвели достаточному количеству мышей, что позволило выбрать для эксперимента опухоли с максимально близкими на день начала лечения массами (14 день после имплантации опухоли). Провели два отдельных исследования. В первой серии экспериментов мышей лечили только клофарабином или клофарабином плюс облучение дозой 3 Гр на сеанс с суммарной дозой 18 Гр. Во второй серии экспериментов мышам вводили клофарабин, гемцитабин или 5-РИ посредством внутрибрюшинной инъекции или вводили указанные препараты и проводили облучение дозой 3 Гр на сеанс с суммарной дозой 9 Гр. Объем и размер опухоли записывали ежедневно и не допускали растрескивания или изъязвления кожи.

Провели вышеописанный анализ, результаты которого представлены на фиг. 5 и 6. На фиг. 5 показано, что клофарабин повышает чувствительность опухолей к облучению ίη νίνο. Опухоль толстой кишки ИЬИ-1 имплантировали подкожно самцам бестимусных мышей. Осуществляли лечение мышей только клофарабином или клофарабином совместно с облучением. На фиг. 6 показано также сенсибилизирующее влияние клофарабина на опухоли ίη νίνο. Осуществляли лечение мышей клофарабином, гемцитабином или 5-ГИ посредством внутрибрюшинной инъекции или указанными препаратами совместно с облучением. Объем и размер опухоли записывали ежедневно. Показана зависимость средней массы опухоли от времени после имплантации для каждой группы.

Пример 8. Исследования ксенографтных моделей рака головы и шеи, поджелудочной железы и толстой кишки.

Ксенографтные модели, включая ИИ-145 (простата), ΝΟΙ-Η460 И8СЬ (легкое), 8Р-295 ΟΝ8 (глиобластома), 8Ρ475ΗΝ (голова и шея), ΡΛΝί'.'-1 (поджелудочная железа) и НСТ-116 (толстая кишка) использовали для исследования влияния соединений согласно настоящему изобретению в комбинации с радиотерапией. Мышам подкожно имплантировали фрагменты опухолей из опухоли ίη νίνο и позволяли опухоли вырасти. Для исследования отобрали мышей с опухолями с размерами, лежащими в определенном диапазоне. В исследованиях моделей ΝΟ-Η460 и 8Р-295 использовали суммарную дозу облучения 12 Гр, разделенную на четыре сеанса по 3 Гр один раз в три дня в сочетании с внутрибрюшинной инъекцией клофарабина ежедневно в течение 10 дней при дозе 30 мг/кг/инъекция. Остальные модели опухолей получали 20 Гр, по 2 Гр ежедневно по пять дней в течение двух недель в сочетании с внутрибрюшинной инъекцией клофарабина ежедневно в течение 12 дней с дозой 30 мг/кг/инъекция.

- 9 017753

Результаты применения вышеописанных способов представлены в таблице.

Результаты комбинирования . клофарабина и облучения - исследования ίη νίνο

Онухоль	Агент	Лечение	Задержка роста (Т-С, дни)	Выжившие животные без опухоли/ всего

Эи-145 простата	Клофарабин	30 мг/кг/доза, внутрибрюшинно, дни 13-24	4.3	0/6
Облучение	2 Грей, дни 13-17, 20-24	18.3	0/6
Комбинация*		19.8	0/6

ΝΟΙ-Η460 (легкое)	Клофарабин	30 мг/кг/доза, внутрибрюшинно, дни 817	4.6	0/6
Облучение	3 Грей, дни 8, 11,14, 17	9.4	0/6 ,
Комбинация*		16.9	0/6

8Р-295 СИЗ (глиобластома)	Клофарабин	30 мг/кг/доза, внутрибрюшинно, дни 817	-0.8	0/6
Облучение	3 Грей, дни 8,11, 14, 17	7.2	0/6
Комбинация*		9.5	0/6

8К475 (голова и шея)	Клофарабин	30 мг/кг/доза, внутрибрюшинно, дни 19-30	18.2	0/6
Облучение	2 Грей, дни 19-23,26-30	73.2	0/6
Комбинация*		>162.0	4/6

ΡΑΝΟΙ (поджелудоч ная железа)	Клофарабин	30 мг/кг/доза, внутрибрюшинно, дни 12-23	17.2	0/6
Облучение	2 Грей, дни 12-16, 19-23	1.7	0/6
Комбинация*		63.8	0/6

НСТ-116 (толстая кишка)	Клофарабин	30 мг/кг/доза, внутрибрюшинно, дни 13-24	24.2	0/6
Облучение	2 Грей, дни 13-17,20-24	29.3	0/6
Комбинация*		>78.9	5/6

*Вначале вводили клофарабин с последующим облучением 1 ч спустя.

Опухоли головы и шеи 8Κ475ΗΝ радиосенсибилизировали клофарабином при значениях Т-С (для 2 удвоений опухоли) 18,2, 73,2 и >162 дней для клофарабина, облучения и комбинации соответственно. Опухоли поджелудочной железы ΡΛΝί.'-1 радиосенсибилизировали клофарабином при значениях Т-С (для 2 удвоений опухоли) 17,2, 1,7 и 63,8 дня для клофарабина, облучения и комбинации соответственно. Опухоли толстой кишки НСТ-116 радиосенсибилизировали клофарабином при значениях Т-С (для 3 удвоений опухоли) 24,2, 29,3 и >78,9 дня для клофарабина, облучения и комбинации соответственно. Радиосенсибилизирующая способность гемцитабина совпадала с результатами для клофарабина. Клофарабин не оказывал влияния на рост глиобластомы 8Е-295. который не усиливался под действием облучения. Для ксенографтов простаты Όϋ-145 отсутствовало отличие между только облучением и облучением в сочетании с клофарабином. Для опухолей легкого Νί.Ί-Η460 комбинированный эффект оказался аддитивным со значениями Т-С (по времени для 3 удвоений опухоли) 4,6, 9,4 и 16,9 дня для клофарабина, облучения и комбинации соответственно. Три из шести испытанных моделей опухолей проявили заметное повышение чувствительности к облучению с клофарабином, в то время как другая модель опухоли показала аддитивный эффект. Две из шести испытанных моделей не подтвердили взаимодействия между клофарабином и облучением. Эти данные показывают, что клофарабин имеет тенденцию радиосенсибилизировать клетки опухоли.

Пример 9. Противоопухолевая активность клофарабина в клетках опухоли яичников, устойчивых к цисплатину.

Определили цитотоксичность соединений согласно настоящему изобретению по отношению к двум линиям клеток яичников, 8КОУ-3 и ЮКОУ-1. Провели стандартный анализ выживания клоногенных клеток, как описано в работе МипкЫ с1 а1., С1оподешс Се11 8ιΐΓνίν;·ι1 Аккау, Ме11юйк Μοί. Меб., 110-21-8 (2005), содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. Клофарабин, а также цисплатин (используемый для сравнения в качестве контрольного вещества) добавили к клеткам в указанных дозах за 24 ч до удаления.

Результаты применения вышеописанной процедуры представлены на фиг. 8 и 9. Как показано на фиг. 8, в клетках 8КОУ-3, которые считаются устойчивой к цисплатину линией клеток, клофарабин вы

- 10 017753 зывает существенную гибель клеток опухоли по сравнению с цисплатином. Фиг. 9 демонстрирует, что клофарабин проявляет также повышенную активность в клетках 1СЕОУ-1 по сравнению с цисплатином.

Препараты.

Соединения согласно настоящему изобретению можно вводить любыми традиционными средствами, доступными для применения в сочетании с фармацевтическими препаратами, в форме индивидуальных терапевтических агентов или комбинаций терапевтических агентов. Их можно вводить отдельно, но, как правило, вводят с фармацевтическим носителем, который выбирают в соответствии с выбранным путем введения и стандартной фармацевтической практикой.

Рассмотренные в настоящем документе фармацевтически приемлемые носители, например наполнители, адъюванты, эксципиенты или разбавители, хорошо известны специалистам в данной области. Обычно фармацевтически приемлемый носитель является химически инертным по отношению к активным соединениям и не проявляет вредных побочных эффектов или токсичности в тех условиях, в которых его проявляют. Фармацевтически приемлемые носители могут включать полимеры и полимерные матрицы.

Соединения согласно настоящему изобретению можно вводить любым обычным способом, доступным для применения в сочетании с фармацевтическими препаратами, в форме индивидуальных терапевтических агентов или комбинации терапевтических агентов.

Вводимые дозы, разумеется, изменяются в зависимости от таких известных факторов, как характеристики фармакодинамики конкретного агента, режима и пути введения, возраста, состояния здоровья и веса реципиента, природы и степени выраженности симптомов, вида сопутствующего лечения, частоты применения лечения и желаемого эффекта. Ежедневная доза активного ингредиента может составлять примерно от 0,001 до 1000 мг на 1 кг массы тела, предпочтительная доза составляет от 0,1 до примерно 30 мг/кг.

Лекарственные формы (композиции, пригодные для введения) содержат примерно от 1 до примерно 500 мг активного ингредиента на единицу. В указанных фармацевтических композициях активный ингредиент обычно присутствует в количестве примерно 0,5-95 мас.% относительно всей массы состава.

Активный ингредиент можно вводить перорально в твердых лекарственных формах, в частности в капсулах, таблетках и порошках, или в жидких лекарственных формах, в частности в эликсирах, сиропах и суспензиях. Его можно также вводить парентерально в стерильных жидких лекарственных формах. Активный ингредиент можно также вводить интраназально (капли для носа) или путем ингаляции аэрозоля порошкообразного лекарственного средства. Также возможны другие лекарственные формы для чрескожного введения, при помощи пластыря или мази.

Препараты, пригодные для перорального введения, могут представлять собой (а) жидкие растворы, в частности эффективную дозу соединения, растворенную в разбавителях, в частности в воде, физиологическом растворе или апельсиновом соке; (б) капсулы, саше, таблетки, лепешки и пилюли, каждая из которых содержит определенную дозу активного ингредиента в форме твердых частиц или гранул; (в) порошки; (г) суспензии в соответствующей жидкости и (д) пригодные эмульсии. Жидкие препараты могут содержать разбавители, в частности воду и спирты, например этанол, бензиловый спирт, пропиленгликоль, глицерин и полиэтиленовые спирты, с добавлением или без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, суспендирующего агента или эмульгатора. Капсулы могут представлять собой обычные твердые или мягкие оболочки желатинового типа, содержащие, например, поверхностно-активные вещества, лубриканты и инертные наполнители, в частности лактозу, сахарозу, фосфат кальция и кукурузный крахмал. Таблетированные формы могут содержать один или более следующих компонентов: лактозу, сахарозу, маннитол, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновую кислоту, микрокристаллическую целлюлозу, гуммиарабик, желатин, гуаровую камедь, коллоидный диоксид кремния, кроскармеллозу натрия, тальк, стеарат магния, стеарат кальция, стеарат цинка, стеариновую кислоту и другие наполнители, красители, разбавители, буферные вещества, дезинтегрирующие вещества, увлажнители, консерванты, ароматизаторы и фармакологически совместимые носители. Таблетки для рассасывания могут содержать активный ингредиент во вкусовом веществе, обычно в сахарозе и гуммиарабике или трагакантовой камеди. Пастилки могут содержать активный ингредиент в инертной основе, в частности в желатине и глицерине, или в сахарозе и гуммиарабике. Эмульсии и гели, кроме активного ингредиента, содержат носители, известные специалистам в данной области.

Из соединений согласно настоящему изобретению отдельно или в комбинации с другими пригодными компонентами можно приготовить аэрозольные составы, которые вводят посредством ингаляции. Такие аэрозольные составы можно помещать в соответствующие сжатые пропелленты, в частности в дихлордифторметан, пропан и азот. Их также можно получать в форме фармацевтических средств для несжимаемых препаратов, которые используют, в частности, в ингаляторе или распылителе.

Составы, пригодные для парентерального введения, включают водные и неводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические агенты и растворенные вещества, которые делают состав изотоничным по отношению к крови предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут вклю

- 11 017753 чать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Соединение можно вводить в физиологически приемлемом разбавителе в фармацевтическом носителе, в частности в стерильных жидкостях или смеси жидкостей, включая воду, физиологический раствор, водную декстрозу и соответствующие растворы сахаров, спирт, в частности этанол, изопропанол или гексадециловый спирт, гликоли, в частности пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, например поли(этиленгликоль) 400, кетали глицерина, в частности 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-метанол, сложные эфиры, масло, жирную кислоту, сложный эфир или глицерид жирной кислоты или глицерид ацетилированной жирной кислоты с добавлением или без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, в частности мыла или детергента, суспендирующего агента, в частности пектина, карбомеров, метилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы или карбоксиметилцеллюлозы или эмульгаторов и других фармацевтических адъювантов.

Масла, которые можно использовать в составах для парентерального введения, включают вазелин, животные, растительные или синтетические масла. Конкретные примеры масел включают арахисовое, соевое, кунжутное, хлопковое, кукурузное, оливковое, вазелиновое и минеральное масло. Жирные кислоты, пригодные для применения в составах для парентерального введения, включают олеиновую кислоту, стеариновую кислоту и изостеариновую кислоту. Этилолеат и изопропилмиристат являются примерами пригодных сложных эфиров жирных кислот. Мыла, пригодные для применения в составах для парентерального введения, включают соли жирных кислот щелочных металлов, аммония и триэтаноламина, а пригодные детергенты включают (а) катионные детергенты, в частности галоиды диметилдиалкиламмония и галоиды алкилпиридиния; (б) анионные детергенты, в частности алкил-, арил- и олефинсульфонаты, алкил-, олефин-, эфир- и моноглицеридсульфаты и сульфосукцинаты; (в) неионные детергенты, в частности аминоксиды жирных кислот, алканоламиды жирных кислот и сополимеры полиоксиэтилена и полипропилена; (г) амфотерные детергенты, например алкил-З-аминопропионаты и четвертичные аммониевые соли 2-алкилимидазолина; и (д) их смеси.

Составы для парентерального введения содержат примерно от 0,5 до примерно 25 мас.% активного ингредиента в растворе. В таких составах можно использовать пригодные консерванты и буферы. Для минимизации или устранения раздражения в месте инъекции такие составы могут содержать один или более неионных поверхностно-активных веществ с гидрофильно-липофильным балансом (НТВ), равным примерно от 12 до примерно 17. Содержание поверхностно-активых веществ в таких составах лежит в пределах примерно от 5 до примерно 15 мас.%. Пригодные поверхностно-активные вещества включают сложные полиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот, в частности сорбитанмоноолеат, и продукты присоединения этиленоксида с высокой молекулярной массой и гидрофобного основания, полученные путем конденсации пропиленоксида с пропиленгликолем.

Фармацевтически приемлемые наполнители также хорошо известны специалистам в данной области. Выбор наполнителя частично определяется конкретным соединением, а также конкретным способом введения состава. В соответствии с этим существует большое многообразие пригодных препаратов фармацевтического состава согласно настоящему изобретению. Описанные далее способы и наполнители являются исключительно иллюстративными примерами, но ни в какой степени не ограничительными. Фармацевтически приемлемые наполнители предпочтительно не оказывают влияния на действие активных ингредиентов и не имеют вредных побочных эффектов. Пригодные носители и наполнители включают растворители, в частности воду, спирт и пропиленгликоль, твердые поглотители и разбавители, поверхностно-активные агенты, суспендирующий агент, связующие для таблеток, лубриканты, ароматизаторы и красители.

Составы могут содержаться в герметичных контейнерах на одну или несколько доз, в частности в ампулах и флаконах, могут храниться в сублимированном (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильных жидких наполнителей, например воды для инъекций, непосредственно перед применением. Растворы для инъекций и суспензий, приготавливаемые для немедленного использования, можно получить из стерильных порошков, гранул и таблеток. Требования к эффективным фармацевтическим носителям, которые используют в составах для инъекций, хорошо известны специалистам в данной области техники (5, 6). См. Вапкег апб Сйа1тегк Рйагтасеибск апб Рйагтасу Ргасбсе, 238250 (кВ. ЫрртсоИ Со., РЫ1абе1рЫа, РА Ебк. 1982) и Токке1, А8НР НапбЬоок оп 1п)ес1аЬ1е Эгидк. 622-630 (4^4Ь еб. 1986), содержание которых полностью включено в данное описание посредством ссылки.

Составы, пригодные для топического введения, включают таблетки для рассасывания, содержащие активный ингредиент во вкусовом веществе, обычно в сахарозе и гуммиарабике или трагаканте, пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, в частности в желатине и глицерине, или сахарозе и гуммиарабике, и полоскания для рта, содержащие активный ингредиент в пригодном жидком носителе, а также кремы, эмульсии и гели, содержащие, кроме активного ингредиента, носители, известные специалистам.

Кроме того, составы, пригодные для ректального введения, можно получить в форме свечей, путем смешивания с различными основами, в частности с эмульгирующими или водорастворимыми основами. Составы, пригодные для вагинального введения, можно получить в форме пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев, которые, кроме активного ингредиента, содержит носители, известные спе

- 12 017753 циалистам как соответствующие.

Пригодные фармацевтические носители описаны в РсттЦоп'к Рйагтасеийса1 8с1еисек, Маск РиЬШЫид Сотрапу, которая является стандартным справочником в данной области техники.

Доза, которую вводят животному, в частности человеку, в контексте настоящего изобретения должна быть эффективной для того, чтобы вызывать терапевтическую реакцию у животного в течение разумного периода времени. Для специалистов в данной области очевидно, что режим дозирования зависит от различных факторов, включая состояние животного, массу тела животного, а также тяжесть и стадию патологического состояния, подвергаемого лечению.

Пригодной является доза, которая обеспечивает концентрацию активного агента в организме пациента, вызывающую желаемую реакцию. Предпочтительной дозой является количество, которое обеспечивает максимальное подавление патологического состояния, подвергаемого лечению, без неуправляемых побочных эффектов.

Величина дозы определяется также путем, временным режимом и частотой введения, а также наличием, природой и выраженностью вредных побочных эффектов, которые могут сопровождать введение соединений, и желаемым физиологическим эффектом.

Полезные фармацевтические лекарственные формы для введения соединений согласно настоящему изобретению можно иллюстрировать следующим образом.

Капсулы с твердой оболочкой.

Большое количество дозированных капсул получают путем заполнения стандартных двухэлементных твердых желатиновых капсул, каждая из которых содержит 100 мг порошкообразного активного ингредиента, 150 мг лактозы, 50 мг целлюлозы и 6 мг стеарата магния.

Мягкие желатиновые капсулы.

Получают смесь активного ингредиента в перевариваемом масле, в частности в соевом масле, хлопковом масле или оливковом масле, и впрыскивают при помощи насоса вытесняющего действия в расплавленный желатин с получением мягких желатиновых капсул, содержащих 100 мг активного ингредиента. Капсулы промывают и сушат. Активный ингредиент можно растворить в смеси полиэтиленгликоля, глицерина и сорбита с получением смешивающейся с водой лекарственной смеси.

Таблетки.

Большое количество таблеток получают традиционными способами таким образом, чтобы лекарственная форма содержала 100 мг активного ингредиента, 0,2 мг коллоидного диоксида кремния, 5 мг стеарата магния, 275 мг микрокристаллической целлюлозы, 11 мг крахмала и 98,8 мг лактозы. Для увеличения вкусовой привлекательности, улучшения внешнего вида, стабильности и задержки всасывания можно нанести соответствующие растворимые и нерастворимые в воде покрытия.

Таблетки/капсулы с немедленным высвобождением активного ингредиента.

Представляют собой твердые лекарственные формы для перорального приема, которые получают традиционными и новыми способами. Эти препараты принимают перорально без воды для быстрого растворения и доставки лекарства. Активный ингредиент перемешивают в жидкости, содержащей такие ингредиенты, как сахар, желатин, пектин и подсластители. Эти жидкости отверждают с получением твердых таблеток или каплетов путем сублимационной сушки и твердофазной экстракции. Лекарственные соединения можно прессовать с высокоэластичными и термоупругими сахарами и полимерами или с компонентами, выделяющими газ, с получением пористых матриц, предназначенных для быстрого высвобождения активного ингредиента без использования воды.

Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению можно вводить в форме капель для носа или при помощи дозирующего назального или буккального ингалятора. Препарат доставляют в форме назального раствора в виде мелкодисперсного тумана или порошка в форме аэрозоля.

В приведенном выше описании проиллюстрировано настоящее соединение и изложена его сущность. При этом в описании показаны и изложены только предпочтительные варианты реализации. Однако, как указано выше, следует понимать, что изобретение можно использовать в различных других комбинациях, модификациях и условиях с возможными изменениями или модификациями в пределах изложенной в настоящем описании сущности, в соответствии с приведенными выше положениями и/или навыками или знаниями специалистов в данной области техники.

Предполагается также, что вышеописанные варианты реализации поясняют наилучшие режимы, известные из практики, и помогут специалистам в данной области техники использовать изобретение в тех или иных вариантах реализации с различными модификациями, которые требуются для конкретного применения или использования. В соответствии с этим не предполагается, что варианты воплощения, изложенные в описании, ограничивают изобретение. Кроме того, предполагается, что прилагаемая формула изобретения включает альтернативные варианты реализации.

Все публикации, патенты и заявки на патент, цитируемые в данном описании, включены в него посредством ссылки для любых и всех целей, как если бы для отдельной публикации, патента и заявки на патент было указано, что они включены посредством ссылки.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ потенцирования радиотерапевтического лечения, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества клофарабина и проведение радиотерапии.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клофарабин вводят пациенту после проведения радиотерапии.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что клофарабин вводят пациенту перед проведением радиотерапии.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что клофарабин вводят пациенту в суточных дозах.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное радиотерапевтическое лечение направлено на лечение рака толстой кишки, рака печени, рака прямой и ободочной кишки, рака поджелудочной железы, рака мягких тканей, рака головного мозга, рака головы и шеи, рака желудочно-кишечного тракта, рака молочной железы, рака яичников, лимфомы, саркомы, меланомы шейки матки или эндометрия, рака мочевого пузыря, рака почки или рака глаза.
6. Способ повышения чувствительности популяции клеток к облучению, включающий воздействие на указанную популяцию клеток сенсибилизирующим количеством клофарабина и проведение облучения указанной популяции клеток.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная популяция клеток включает клетки опухоли.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанные клетки опухоли выбраны из группы, состоящей из рака толстой кишки, рака печени, рака толстой и прямой кишки, рака поджелудочной железы, рака мягких тканей, рака головного мозга, рака головы и шеи, рака желудочно-кишечного тракта, рака молочной железы, рака яичников, лимфомы, саркомы, меланомы шейки матки или эндометрия, рака мочевого пузыря, рака почки и рака глаза.
9. Способ уменьшения пролиферации популяции клеток, включающий обработку указанной популяции клеток повышающим чувствительность к облучению количеством клофарабина.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная популяция клеток включает клетки опухоли.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанные клетки опухоли выбраны из группы, состоящей из рака толстой кишки, рака печени, рака толстой и прямой кишки, рака поджелудочной железы, рака мягких тканей, рака головного мозга, рака головы и шеи, рака желудочно-кишечного тракта, рака молочной железы, рака яичников, лимфомы, саркомы, меланомы шейки матки или эндометрия, рака мочевого пузыря, рака почки и рака глаза.
12. Способ лечения роста опухоли, включающий воздействие на пациента, который в этом нуждается, синергической комбинацией ионизирующего излучения и клофарабина.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный рост опухоли выбран из группы, состоящей из рака толстой кишки, рака печени, рака толстой и прямой кишки, рака поджелудочной железы, рака мягких тканей, рака головного мозга, рака головы и шеи, рака желудочно-кишечного тракта, рака молочной железы, рака яичников, лимфомы, саркомы, меланомы шейки матки или эндометрия, рака мочевого пузыря, рака почки и рака глаза.