EA012165B1 - Ферментативное получение витамина с - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к вновь идентифицированным микроорганизмам, способным прямо продуцировать L-аскорбиновую кислоту (также называемую здесь витамином С). Изобретение также относится к полинуклеотидным последовательностям, включающим гены, которые кодируют белки, вовлеченные в синтез витамина С. Изобретение также отображает полинуклеотиды, включающие полинуклеотидные последовательности в полную длину новых генов и их фрагменты, новые полипептиды, кодируемые полинуклеотидами и их фрагментами, а также их функциональные эквиваленты. Настоящее изобретение также относится к применению упомянутых полинуклеотидов и полипептидов в качестве биотехнологических приемов для продукции витамина С из микроорганизмов, где модификация упомянутых полинуклеотидов и/или кодируемых полипептидов оказывает прямое или непрямое воздействие на выход, продукцию и/или эффективность продукции продукта ферментации у упомянутого микроорганизма. Также включены способы/процессы применения полинуклеотидов и модифицированных полинуклеотидных последовательностей для трансформации микроорганизма хозяина. Изобретение также относится к генетически измененным микроорганизмам и их применению для прямой продукции витамина С.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к применению полинуклеотидов и полипептидов в качестве биотехнологических приемов при получении витамина С из микроорганизмов, где упомянутые полинуклеотиды и/или кодируемые ими полипептиды оказывают прямое или непрямое воздействие на выход, продукцию и/или эффективность получения продукта ферментации. Изобретение также относится к генетически модифицированным микроорганизмам и их применению для прямого получения витамина С.

Уровень техники

Витамин С является одним из очень важных и незаменимых факторов питания для человеческих существ. Витамин С применяется также при кормлении животных даже в случае, если некоторые сельскохозяйственные животные могут синтезировать его в своем организме.

За последние 70 лет витамин С получают в промышленных масштабах из Ό-глюкозы с помощью хорошо известного способа Райхштайна. Все этапы этого процесса являются химическими, за исключением одного (превращения Ό-сорбита в Ь-сорбозу), который проводят с помощью микробного превращения. После его первоначального внедрения в промышленное производство витамина С применялись некоторые химические и технические модификации для улучшения эффективности способа Райхштайна. Недавние усовершенствования способа получения витамина С суммированы в Ульмановской энциклопедии промышленной химии ЬИтаии'к Еисус1орей1а οί 1пйик1па1 Сйетщру, 5^4Ь Εάίΐίοη, Уо1. А27 (1996), рр. 547ίί.

Различные промежуточные этапы получения витамина С проводят с помощью микроорганизмов или изолированных из них ферментов. Так, 2-кето-Е-гулоновая кислота (2-КГК), промежуточное соединение, которое можно химически превратить в витамин С с помощью реакции щелочной перегруппировки, может быть получена посредством ферментативного процесса из Ь-сорбозы с помощью штаммов, относящихся, например, к родам Ке1оди1ошс1дешит или С1исоиоЬас1ег. или посредством другого ферментативного процесса из Ό-глюкозы с помощью рекомбинантных штаммов, относящихся к родам С1исоиоЬас1ег или РаШоеа.

Современные способы химического получения витамина С обладают некоторыми нежелательными характеристиками, такими как большое потребление энергии и использование больших количеств органических и неорганических растворителей. Поэтому в последние десятилетия проводится исследование других подходов к производству витамина С с применением превращения с участием микроорганизмов, что было бы более экономичным, а также экологичным.

Ферментативное получение витамина С из ряда субстратов, включая Ό-сорбит, Ь-сорбозу или Ьсорбозон, описано у ряда микроорганизмов, таких как водоросли и дрожжи, при применении разных способов культивации. Недостатком применения этих микроорганизмов, однако, является низкий выход получаемого витамина С; поскольку эти микроорганизмы, как известно, способны к производству как 2кето-Ь-гулоновой кислоты, так и витамина С, выход продуцируемого микробиологически витамина С в этой связи ограничен относительно высокой продукцией 2-КГК, которая легче синтезируется упомянутыми микроорганизмами, что приводит, например, к тому, что соотношение концентраций витамина С и 2-КГК составляет менее 0,1.

Поэтому желательно разработать системы, обладающие большей промышленной применимостью, например системы, модифицированные с целью увеличения титров и/или такие, у которых сокращены периоды ферментации. Одна особенно применимая система задействует гены, кодирующие мембраносвязанные Ь-сорбозондегидрогеназы или мембраносвязанные ПХХ (ПХХ, пирролохинолинхинон)зависимые Ό-сорбитдегидрогеназы. Пример такой системы применяет ген из С1исоиоЬас1ег охуйапк N44-1, кодирующий Ь-сорбозондегидрогеназу (здесь и далее называемый §N^Ηа^), которая превращает Ь-сорбозон в Ь-аскорбиновую кислоту. Этот ген и его гомологи уже описаны в XVО 2005/017159, который включен сюда.

Имеется постоянная потребность в еще более оптимизированных ферментативных системах для микробиологического производства витамина С с целью достижения более высоких выходов, чем в системах, описанных выше.

Сущность изобретения

Неожиданно обнаружено, что в подходящих условиях культивации клетки хозяина, экспрессирующие δΝΌΗηΓ можно применять для дальнейшей оптимизации прямой продукции витамина С.

Этого можно достигнуть путем сопутствующего изменения специфического набора генов, как описано здесь далее. Такие гены можно выбирать из группы, состоящей из СДЦ или СМС генов. Эта группа генов/белков и осуществление изменений для каждого набора описаны и проиллюстрированы примерами далее.

Термин «прямая ферментация», «прямая продукция», «прямое превращение» и т.п. означают, что микроорганизм способен превращать определенный субстрат в означенный продукт с помощью одного или более этапов биологического превращения без необходимости какого-либо дополнительного химического этапа превращения. Например, термин «прямое превращение Ό-сорбита в витамин С» обозначает процесс, где микроорганизм продуцирует витамин С и где Ό-сорбит применяется в качестве источника углерода без необходимости промежуточного этапа химического превращения. Одиночный микроор

- 1 012165 ганизм, способный к прямой ферментации витамина С, предпочтителен.

Как применяется здесь, «улучшенный» или «улучшенный выход витамина С», обусловленный генетическим изменением, означает увеличение не менее чем на 5, 10, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200 или даже более чем на 500% по сравнению с клетками, которые не изменены генетически. Такие неизмененные клетки также часто называют клетками дикого типа.

Поэтому, во-первых, объектом настоящего изобретения является предоставление способа прямого ферментативного получения витамина С посредством культивации в подходящих условиях клетки хозяина, геном которой генетически изменен с помощью последовательностей ДНК, включающих следующие полинуклеотиды:

а) полинуклеотид, кодирующий Ь-сорбозондегидрогеназу согласно номеру идентификации последовательности ПОСЛ. № 2 или его активный фрагмент или производное, и

б) не менее одного полинуклеотида, кодирующего белок, выбранный из группы, состоящей из:

1) белков, включенных в систему метаболизма сорбита/сорбозы (СМС), и

2) белков, включенных в систему дыхательной цепи (СДЦ), и посредством выделения витамина С из таких клеток или культуральной среды.

Термин «генетически модифицированный» или «генетически измененный» означает продуманное изменение структуры генетического материала живого организма. Это включает получение и применение рекомбинантных ДНК. Точнее, это применяется, чтобы отличить генетически измененный или модифицированный организм от организма, встречающегося в природе. Генетические изменения могут быть проделаны с помощью ряда технических приемов, известных в данной области, таких как, к примеру, замещение гена, амплификация гена, повреждение гена, трансфекция, трансформация с помощью плазмид, вирусов или других векторов. Генетически модифицированный организм, например генетически модифицированный микроорганизм, часто называют также рекомбинантным организмом, например рекомбинантным микроорганизмом.

СМС белками являются белки, включенные в систему метаболизма сорбита/сорбозы. К полинуклеотидам и белкам, кодируемым этими полинуклеотидами, здесь применяется сокращение СМС. СМС белки функционируют в прямом метаболизме Ό-сорбита или Ь-сорбозы.

СДЦ белки включены в систему дыхательной цепи. К полинуклеотидам и белкам, кодируемым этими полинуклеотидами, здесь применяется сокращение СДЦ. СДЦ белки функционируют в хорошо известной дыхательной цепи организма, известной также как электрон-транспортная система.

В предпочтительном осуществлении белок, выбранный из СМС или СДЦ белков, изменен таким образом, что это приводит к улучшенному выходу и/или эффективности продукции витамина С упомянутой клеткой хозяина по сравнению с клеткой, несущей упомянутый белок дикого типа. Термин «изменен» применяется здесь для обозначения генетической модификации или изменения гена, включающей модификацию уровня его экспрессии, предпочтительно с помощью молекулярно-биологических подходов. В частности, термин включает повышающую и понижающую регуляции активности белка, такая регуляция может быть достигнута путем повышающей или понижающей регуляции гена, кодирующего белок. Другие способы для повышающей и понижающей регуляции активности определенного белка, рассмотренной выше, также можно применять в осуществлении данного изобретения.

Объектом настоящего изобретения также является предоставление векторов, включающих такие полинуклеотиды, предпочтительно в виде экспрессирующих векторов.

Далее, объектом настоящего изобретения является предоставление способа получения клеток хозяина, которые генетически модифицированы, например трансформированы, с помощью таких последовательностей ДНК или векторов. Этого можно достигнуть, например, путем переноса полинуклеотидов, как проиллюстрировано примерами здесь, в рекомбинантные или нерекомбинантные клетки хозяина, которые могут содержать или могут не содержать эндогенный эквивалент соответствующего гена. Такая трансформированная клетка также является объектом изобретения.

Полезные осуществления изобретения становятся очевидными из соответствующих пунктов формулы изобретения. Эти и другие аспекты осуществлений настоящего изобретения должны быть очевидны для специалиста в данной области из вышеприведенного описания.

Любая клетка, служащая реципиентом чужеродных молекул нуклеиновой кислоты, может применяться в качестве клетки хозяина, как, например, клетка, несущая воспроизводимый экспрессирующий вектор или клонирующий вектор, или клетка, генетически модифицированная или генетически измененная с помощью хорошо известных приемов так, что она содержит желаемые ген(ы) в своей хромосоме(ах) или геноме. Клетка хозяина может быть прокариотического или эукариотического происхождения, как, например, бактериальные клетки, клетки животного, включая клетки человека, клетки грибов, включая дрожжевые клетки, и клетки растений. Предпочтительно клетка хозяина является микроорганизмом. Более предпочтительно микроорганизм принадлежит к бактериям, которые могут экспрессировать Ь-сорбозондегидрогеназу в активной форме ίη νίνο.

Примеры известных бактерий, способных прямо продуцировать витамин С в достаточных количествах, будучи измененными в соответствии с настоящим изобретением, включают штаммы из родов КсЮдЫошсфсшит. РапЮеа, Ркеийотопак, или ЕксйепсЫа, или СогупеЬас1егшт и уксусно-кислые бактерии.

- 2 012165

Микроорганизмы, которые можно применять по настоящему изобретению для улучшения прямой продукции витамина С, могут быть общедоступными из разных источников, например Немецкого собрания микроорганизмов и клеточных культур (Оеи1ксйе 8атт1ипд νοη М1кгоогдашктеп ипб 2е11ки11игеп (Ό8ΜΖ), Максйегобег \Уед 1В, Ό-38124 Втаипксйтее1д, Сеттапу), Американской коллекции культур (Атепсап Туре СиЙите Сойесбоп (АТСС), Р.О. Вох 1549, Мапаккак, УА 20108 И8А) или Подразделения коллекций культур (СиЙите Сойесбоп ОМкюп, ΝΙΤΕ Вю1ощса1 Кекоитсе Сеп1ет, 2-5-8, Кахикаката1ап. Кткага/и-кйт СйЬа, 292-0818, 1арап (ранее: 1пкб1и1е £от РеттеШабоп, Окака (ΙΡΟ), 17-85, й.1ко-йоптас1и 2сйоте,¥обода^а-ки, Окака 532-8686, 1арап)). Примерами предпочтительных бактерий, хранящихся в ΙΡΟ, являются, например, С1исопойас1ег охубапк (ранее известная как С. те1аподепик) ΙΡΟ 3293, С1исопойас1ег охубапк (ранее известная как С. те1аподепик) ΙΡΟ 3292, С1исопойас1ег охубапк (ранее известная как С. гиЫдшокик) ΙΡΟ 3244, С1исопоЬас1ет £та1еигб (ранее известная как С. тбикбшк) ΙΡΟ 3260, С1исопойас1ет сегбшк ΙΡΟ 3266, С1исопоЬас1ет охубапк ΙΡΟ 3287 и Асе1оЬас1ет асеб киЬкр. ог1еапик ΙΡΟ 3259, все помещенные на хранение 5 апреля 1954г.; Асе1оЬас1ет асеб киЬкр. хубпит ΙΡΟ 13693, помещенная на хранение 22 октября 1975г., и Асе1оЬас1ет асеб киЬкр. хубпит ΙΡΟ 13773, помещенная на хранение 8 декабря 1977г. Штамм Асе1оЬас1ет кр. АТСС 15164, который также является примером предпочтительной бактерии, помещен на хранение с АТСС. Штамм С1исопоЬас1ет охубапк (ранее известный как С. те1аподепик) N 44-1 в качестве еще одного примера предпочтительной бактерии является производным штамма ΙΡΟ 3293 и описан у 8ищка\\'а е! а1., Адпс. Вю1. Сйет. 54: 1201-1209, 1990.

Уксусно-кислые бактерии являются предпочтительными по настоящему изобретению для прямого производства витамина С с высоким выходом из ряда субстратов, включая Ό-сорбит, Ь-сорбозу и Ь-сорбозон. Штаммы из родов С1исопоЬас!ег, С1исопасе1оЬас1ет и Асе!оЬас!ег являются более предпочтительными, обнаружено, что они способны прямо продуцировать витамин С из Ь-сорбозона, в то время как было обнаружено, что хотя бы С1исопоЬас!ег охубапк Ό8Μ 17078 способен продуцировать витамин С прямо из Ό-сорбита, Ь-сорбозы или Ь-сорбозона. С1исопоЬас!ег охубапк Ό8Μ 17078 (ранее известный как С1исопоЬас!ег охубапк N44-1) помещен в Немецкое собрание микроорганизмов и клеточных культур (Ό8ΜΖ, Максйегобег \Уед ГВ, Ό-38124 Вгаип8сйете1д, Сегтапу) согласно Будапештской конвенции 26 января 2005г.

В частности, настоящее изобретение относится к способу прямой продукции витамина С, где комбинацию полинуклеотидов, как раскрыто здесь, или комбинацию модифицированных полинуклеотидных последовательностей, как описано далее, вводят в подходящий микроорганизм, рекомбинантный микроорганизм культивируют в условиях, позволяющих осуществлять получение витамина С с высокой продуктивностью, выходом и/или эффективностью, полученный продукт ферментации выделяют из культуральной среды и при необходимости далее очищают.

Несколько субстратов можно применять в качестве источников углерода в вышеописанном процессе. Особенно подходящими источниками углерода являются таковые, которые получаются по путям метаболизма Ό-глюкозы или Ό-сорбита, такие как, например, Ό-глюкоза, Ό-сорбит, Ь-сорбоза, Ь-сорбозон, 2-кето-Ь-гулонат, Ό-глюконат, 2-кето-О-глюконат или 2,5-дикетоглюконат. Предпочтительно субстрат выбирают из, например, Ό-глюкозы, Ό-сорбита, Ь-сорбозы или Ь-сорбозона, более предпочтительно из Ό-глюкозы, Ό-сорбита или Ь-сорбозы и наиболее предпочтительно из Ό-сорбита или Ь-сорбозы. Термины «субстрат» и «субстрат продукции» в связи с вышеупомянутым способом с применением микроорганизма являются здесь взаимозаменяемыми.

Превращение субстрата в витамин С по вышеупомянутому способу с применением микроорганизма означает, что превращение субстрата в витамин С осуществляется микроорганизмом, т. е. субстрат может быть прямо превращен в витамин С. Упомянутый микроорганизм культивируют в условиях, позволяющих такое превращение субстрата, как определено выше.

Средой, как применяется здесь по отношению к вышеописанному способу с применением микроорганизмов, может быть любая подходящая для продукции витамина С среда. Обычно средой является водная среда, включающая, например, соли, субстрат(ы) и имеющая определенный рН. Среда, в которой субстрат превращается в витамин С, называется также средой продукции.

«Ферментация», или «продукция», или «процесс ферментации», как применено здесь, могут быть применением растущих клеток с использованием среды, условий и процедур, известных специалисту в данной области, или применением нерастущих, так называемых покоящихся клеток, после того, как их культивировали с применением среды, условий и процедур, известных специалисту в данной области, в условиях, пригодных для превращения соответствующих субстратов в желаемый продукт, такой как витамин С.

Из вышеописанного способа ясно, что вышеупомянутые микроорганизмы включают также синонимы или базонимы этих видов, обладающие такими же физиологическими свойствами, как определено Международным кодом номенклатуры прокариотов. Номенклатура микроорганизмов, как применяется здесь, является официально принятой (на момент регистрации предварительной заявки) Международным комитетом по систематике прокариотов и Отделением бактериологии и прикладной микробиологии Международного союза микробиологических обществ и опубликованной в официальном издании Международного журнала систематической и эволюционной микробиологии (П8ЕМ). Особая ссылка делается

- 3 012165 на ИтЬапсе е! а1., Н8ЕМ (2001) νοί. 51: 1059-1070, с коррекциями по Н8ЕМ (2001) νοί. 51: 1231-1233, описывающими таксономическую реклассификацию С. охубапк Ό8Μ 4025 как Ке1оди1ошсщешит уи1дате.

Как применено здесь, покоящимися клетками называются клетки микроорганизма, которые, например, жизнеспособны, но не являются активно растущими, или которые растут с низкой удельной скоростью [μ], например со скоростью роста менее 0,02 ч^-1, предпочтительно менее 0,01 ч^-1. Клетки, демонстрирующие вышеприведенные скорости роста, называются пребывающими в «покоящемся состоянии».

Процесс по настоящему изобретению можно проводить в несколько этапов или фаз, предпочтительно микроорганизм культивируют на первом этапе (называемом также этапом (а) или фазой роста) в условиях, позволяющих рост. Эта фаза завершается при изменении условий так, что скорость роста микроорганизма замедляется, приводя к покоящимся клеткам, что называют также этапом (б), за чем следует получение витамина С из субстрата с применением (б), что называется также фазой продукции.

Фазу роста и фазу продукции вышеописанного способа с применением микроорганизма можно проводить в той же емкости, например только одной емкости или в двух или более разных емкостях, при необходимости, с этапом отделения клеток между двумя фазами. Выработанный витамин С можно отделять от клеток любым подходящим способом. Отделение означает, например, что образованный витамин С можно выделять из среды продукции. При необходимости, полученный таким образом витамин С можно обрабатывать далее.

Для целей настоящего изобретения, относящихся к вышеупомянутому способу, термины «фаза роста», «этап выращивания», «этап роста» и «период роста» применяются здесь взаимозаменяемо. То же относится к терминам «фаза продукции», «этап продукции», «период продукции».

Одним путем осуществления вышеописанного способа может быть процесс, где микроорганизм выращивают в первой емкости, так называемой емкости для выращивания, в качестве источника покоящихся клеток и хотя бы часть клеток переносят во вторую емкость, так называемую емкость продукции. Условия в емкости для продукции могут быть такими, что перенесенные из емкости для роста клетки становятся покоящимися, как определено выше. Витамин С продуцируется во второй емкости, и его выделяют оттуда.

По вышеописанному процессу этап выращивания можно проводить в водной среде, т.е. среде роста, снабженной необходимыми питательными веществами для роста в аэробных условиях. Культивацию можно проводить, например, в отдельном объеме, в подпитываемом объеме в полунепрерывном или непрерывном режиме. Время выращивания может варьировать в зависимости от рода клеток, рН, температуры и питательной среды, которые применяются, и может составлять, например, от приблизительно 10 ч до приблизительно 10 дней, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 10 дней, более предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 5 дней при проведении в отдельном объеме или в подпитываемом объеме в зависимости от микроорганизма. Если клетки выращивают в непрерывном режиме, продолжительность выдержки может быть, например, от приблизительно 2 до приблизительно 100 ч, предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 50 ч в зависимости от микроорганизма. Если микроорганизм выбран из бактерий, культивацию можно проводить, например, при рН от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0, предпочтительно от приблизительно 4,0 до приблизительно 9,0, более предпочтительно от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,0, еще более предпочтительно от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0. Если применены водоросли или дрожжи, культивацию можно проводить, например, при рН ниже приблизительно 7,0, предпочтительно ниже приблизительно 6,0, более предпочтительно ниже приблизительно 5,5 и наиболее предпочтительно ниже приблизительно 5,0. Подходящий интервал температур для проведения культивации с применением бактерий может быть, например, от приблизительно 13 до приблизительно 40°С, предпочтительно от приблизительно 18 до приблизительно 37°С, более предпочтительно от приблизительно 13 до приблизительно 36°С и наиболее предпочтительно от приблизительно 18 до приблизительно 33 °С. В случае применения водорослей или дрожжей подходящий интервал температур для проведения культивации может находиться, например, от приблизительно 15 до приблизительно 40°С, предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 45°С, более предпочтительно от приблизительно 25 до приблизительно 40°С, и еще более предпочтительно от приблизительно 25 до приблизительно 38°С, и наиболее предпочтительно от приблизительно 30 до приблизительно 38°С. Культуральная среда для выращивания обычно может содержать такие питательные вещества, как усвояемые источники углерода, например Ό-маннит, Ό-сорбит, Ь-сорбоза, эритрит, рибит, ксилит, арабит, инозит, дулыцит, Ό-рибоза, Ό-фруктоза, Ό-глюкоза, сахароза, предпочтительно Ь-сорбоза, Ό-глюкоза, Ό-сорбит, Ό-маннит и глицерин, а также утилизируемые источники азота, такие как органические вещества, например пептон, дрожжевой экстракт и аминокислоты. Среда может содержать или не содержать мочевину, жидкий экстракт зерновых и/или пекарские дрожжи. Различные неорганические вещества также можно применять в качестве источников азота, например нитраты и соли аммония. Далее, среда роста обычно содержит неорганические соли, например сульфат магния, сульфат марганца, фосфат калия и карбонат кальция.

По вышеописанному способу удельные скорости роста составляют, например, не менее 0,02 ч^-1. В случае клеток, растущих в отдельном объеме, или в подпитываемом объеме, или в полунепрерывном режиме, скорость роста зависит, например, от состава среды роста, рН, температуры и т.п. Обычно ско

- 4 012165 рость роста может находиться, например, в интервале от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,2 ч^-1, предпочтительно от приблизительно 0,06 до приблизительно 0,15 ч^-1 и наиболее предпочтительно от приблизительно 0,07 до приблизительно 0,13 ч^-1.

В другом аспекте вышеописанного процесса покоящиеся клетки можно получить с помощью культивации соответствующего микроорганизма на чашках с агаром, служащих таким образом емкостью для роста, с применением, в основном, тех же условий, а именно времени культивации, рН, температуры, питательной среды, как описано выше, с добавлением агар-агара.

Если фазы роста и продукции проводят в двух отдельных емкостях, то клетки после фазы роста можно собрать или концентрировать и перенести во вторую емкость, так называемую емкость продук ции. Эта емкость может сдержать водную среду, дополненную любым подходящим субстратом продукции, который может быть превращен в витамин С с помощью клеток. Клетки из емкости для выращивания можно собрать или сконцентрировать любым подходящим способом, таким как, например, центрифугирование, мембранная фильтрация с поперечным потоком или микрофильтрация, фильтрация, декантация, флоккуляция. Полученные таким образом клетки можно перенести в емкость для продукции в виде исходного бульона из емкости для роста без предварительного сбора, концентрации или промывки, т. е. в форме суспензии клеток. В предпочтительном воплощении клетки переносят из емкости для роста в емкость для продукции в форме клеточной суспензии без этапа промывки или отделения в промежутке.

Если фазы роста и продукции проводят в одной и той же емкости, клетки можно выращивать в подходящих условиях до желаемой клеточной плотности, вслед за чем заместить среду роста средой продукции, содержащей субстрат продукции. Такой заменой может быть, например, подача среды продукции в емкость в то же время и с той же скоростью, как отбор из емкости супернатанта. Чтобы удерживать покоящиеся клетки в емкости, можно применять операции по повторной циркуляции или удерживанию клеток, такие как, например, этапы повторной циркуляции клеток. Такие этапы повторной циркуляции, например, включают, но не ограничиваются этим, способы с применением центрифугирования, фильтров, мембранной микрофильтрации с поперечным потоком из этапов микрофильтрации, мембранные реакторы, флоккуляцию или иммобилизацию клеток на подходящих пористых, непористых или полимерных носителях. После переходной фазы емкость приводят к таким условиям процесса, при которых клетки оказываются на покоящейся стадии, как определено выше, и субстраты продукции эффективно превращаются в витамин С.

Водная среда в емкости для продукции, которая применяется на этапе продукции по вышеописанному процессу с применением микроорганизма, называемая здесь средой для продукции, может содержать только субстрат(ы) продукции для превращения в витамин С или может содержать, например, дополнительные неорганические соли, например хлорид натрия, хлорид кальция, сульфат магния, сульфат марганца, фосфат калия, фосфат кальция и карбонат кальция. Среда продукции может также содержать усвояемые источники азота, такие как, например, органические вещества, например пептон, дрожжевой экстракт, мочевина, аминокислоты, жидкий экстракт зерновых, или неорганические вещества, например аммиак, сульфат аммония, и нитрат натрия, в таких концентрациях, чтобы поддерживать клетки в покоящемся состоянии, как определено выше. Среда может содержать или не содержать мочевину, жидкий экстракт зерновых и/или пекарские дрожжи. Этап продукции можно проводить, например, в отдельном объеме, в подпитываемом объеме в полунепрерывном или непрерывном режиме. В случае подпитываемого объема, полунепрерывного или непрерывного режима как клетки из емкости для роста, так и среду продукции можно подавать постоянно или периодически в емкость для продукции с необходимыми скоростями подачи. Альтернативно, можно подавать в емкость для продукции только среду продукции постоянно или периодически, в то время как клетки, поступающие из емкости для роста, переносят в емкость для продукции только один раз. Клетки из емкости для роста могут применяться внутри емкости для продукции в виде клеточной суспензии или могут применяться, например, как флоккулированные или иммобилизованные клетки на любом твердом носителе, таком как пористый или полимерный носитель. Период продукции, определяемый как период времени между поступлением субстрата в емкость для продукции и сбором супернатанта, содержащего витамин С, так называемого потока сбора, может варьировать в зависимости, например, от рода и концентрации клеток, рН, температуры и питательной среды, которые применяют, и предпочтительно находится между приблизительно 2 и приблизительно 100 ч. Значения рН и температуры могут отличаться от рН и температуры на этапе роста, но, в основном, являются такими же, как на этапе роста.

В предпочтительном осуществлении этап продукции проводят в непрерывном режиме, означающем, что первый подаваемый поток, содержащий клетки из емкости роста, и второй подаваемый поток, содержащий субстрат, подаются непрерывно или периодически в емкость для продукции. Первый поток может либо содержать только клетки, выделенные/отделенные от среды роста, или клеточную суспензию, приходящую прямо с этапа роста без какого-либо промежуточного этапа отделения клеток, промывки и/или выделения. Второй подаваемый поток, как определено здесь, может включать все другие подаваемые потоки, необходимые для проведения этапа продукции, например среду продукции, включающую субстрат в виде одного или нескольких различных потоков, воду для разведения и основание (щелочь) для контроля рН.

- 5 012165

По вышеописанному способу, когда оба потока подают непрерывно, соотношение скорости подачи первого потока к скорости подачи второго потока может варьировать между приблизительно 0,01 и приблизительно 10, предпочтительно между приблизительно 0,01 и приблизительно 5, наиболее предпочтительно между приблизительно 0,02 и приблизительно 2. Это соотношение зависит от концентрации клеток и субстрата в первом и во втором потоках, соответственно.

Другой способ проведения вышеописанного процесса с применением микроорганизма по настоящему изобретению может быть процессом с применением определенной клеточной плотности покоящихся клеток в емкости для продукции. Клеточную плотность измеряют в единицах поглощения (оптической плотности) при 600 нм способами, известными специалисту в данной области. В предпочтительном осуществлении клеточная плотность на этапе продукции составляет не менее приблизительно 10, более предпочтительно между приблизительно 10 и приблизительно 200, еще более предпочтительно между приблизительно 15 и приблизительно 200, еще более предпочтительно между приблизительно 15 и приблизительно 120 и наиболее предпочтительно между приблизительно 20 и приблизительно 120.

Для того, чтобы поддерживать клетки в емкости для продукции на желаемом уровне клеточной плотности в течение проведения фазы продукции, например в непрерывном или полунепрерывном режиме, применяют любые подходы, известные в данной области, такие как, например, повторная циркуляция клеток с помощью центрифугирования, фильтрации, мембранной ультрафильтрации с поперечным потоком или микрофильтрации, декантации, флоккуляции, удержания клеток в емкости с помощью мембранных приспособлений или иммобилизации клеток. Далее, в том случае, когда этап продукции проводят в непрерывном или полунепрерывном режиме и клетки подают непрерывно или периодически из емкости для роста, клеточную плотность в емкости для продукции можно поддерживать на постоянном уровне посредством, например, отбора определенного количества клеток из емкости для продукции, соответствующего количеству клеток, подаваемых из емкости для роста.

По вышеописанному процессу продуцируемый витамин С, содержащийся в так называемом потоке сбора отделяют/отбирают из емкости для выращивания. Поток сбора может включать, например, свободный от клеток или содержащий клетки водный раствор, выходящий из емкости для продукции, который содержит витамин С как результат превращения субстрата продукции покоящимися клетками в емкости для продукции. Клетки, все еще присутствующие в потоке сбора, можно отделить от витамина С с помощью любой операции, известной в данной области, такой как, например, фильтрация, центрифугирование, декантация, мембранная ультрафильтрация с поперечным потоком или микрофильтрация, ультрафильтрация с отклоняющимся потоком (примечание: это то же самое, что с поперечным потоком) или микрофильтрация или фильтрация с прямым потоком. После этой операции по отделению клеток поток сбора, в основном, свободен от клеток.

В дальнейшем аспекте способ по настоящему изобретению можно комбинировать с дальнейшими этапами отделения и/или очистки полученного витамина С от других компонентов, содержащихся в потоке сбора, т.е. так называемыми этапами нисходящей обработки. Эти этапы могут включать любые приемы, известные специалисту в данной области, такие как, например, концентрирование, кристаллизация, осаждение, адсорбция, ионный обмен, электродиализ, электродиализ с биполярной мембраной и/или обратный осмос. Витамин С можно далее очищать в виде свободной кислоты или любой из известных солей с помощью подходов, таких как, например, обработка активированным углем, ионный обмен, адсорбция и элюция, концентрирование, кристаллизация, фильтрация и сушка. В частности, первичное отделение витамина С от других компонентов в потоке сбора можно проводить с помощью любой подходящей комбинации или повторения, например, следующих способов: электродиализ с двумя или тремя отделениями, электродиализ с биполярной мембраной, обратный осмос или адсорбция, например, на ионообменных смолах или неионообменных смолах. Если конечная форма витамина С является солью витамина С, перевод соли в форму свободной кислоты можно проводить, например, с помощью электродиализа с биполярной мембраной, ионного обмена, хроматографических подходов с моделированием движущегося слоя и т.п. Комбинацию вышеупомянутых этапов, например электродиализа и электродиализа с биполярной мембраной, на одном этапе можно также применять, как и комбинацию упомянутых этапов, например этапов ионного обмена с применением хроматографических подходов с моделированием движущегося слоя. Любая из этих процедур сама по себе или в комбинации представляет подходящий способ для выделения и очистки продукта, например витамина С. Продукт, полученный таким способом, можно далее обрабатывать с помощью, например, концентрирования, кристаллизации, осаждения, промывки и сушки кристаллов и/или очищать, например, обработкой активированным углем, ионным обменом и/или перекристаллизацией.

В предпочтительном осуществлении процесса витамин С очищают из потока сбора в серии нисходящих этапов обработки, как описано выше, без переноса в неводный раствор по ходу этой обработки, т.е. все этапы проводят в водном окружении. Такая предпочитаемая процедура нисходящей обработки может включать, например, концентрирование потока сбора, выходящего из емкости для продукции, с помощью электродиализа с двумя или тремя отделениями, превращение витамина С в солевой форме, присутствующего в концентрированном растворе, в кислотную форму с помощью электродиализа с биполярной мембраной и/или ионного обмена, очистку такими способами, как, например, обработка акти

- 6 012165 вированным углем, ионообменными или неионными смолами с последующим этапом концентрирования и кристаллизации. Такие кристаллы можно отделять, промывать и сушить. При необходимости, кристаллы можно опять растворить в воде, обработать активированным углем и/или ионообменными смолами и перекристаллизовать. Эти кристаллы можно далее отделить, промыть и высушить.

Согласно изобретению клетки хозяина (в частности, рекомбинантные микроорганизмы из родов С1исопоЬас1сг. С1исопасс1оЬас1сг и Асе1оЬас1ет), несущие ΞΝΌΗηί ген согласно изобретению и не менее одного генетически модифицированного гена, выбранного из СМС или СДЦ, как показано на примерах здесь, способны прямо продуцировать витамин С из подходящего источника углерода с существенно более высоким выходом, продуктивностью и/или эффективностью, чем другие известные микроорганизмы, например в количествах 300 мг/л или более или 800 мг/л или более из Ό-сорбита или Ь-сорбозы, соответственно, при измерении по способу для покоящихся клеток после периода инкубации 20 ч. Выход витамина С, продуцируемого из Ό-сорбита при измерении по способу для покоящихся клеток после периода инкубации 20 ч, может быть даже таким высоким, как 400, 600, 1000 мг/л или даже превышать 1,5, 2, 4, 10, 20, 50, 100 г/л. Выход витамина С, продуцируемого из Ь-сорбозы, при измерении по способу для покоящихся клеток после периода инкубации 20 ч может быть даже таким высоким, как 1000 мг/л или даже превышать 1,5, 2, 4, 10, 20, 50, 100 г/л.

Белок ΞΝΌΗαί согласно ПОСЛ. № 2, описанный здесь, выполняет важную функцию при прямой продукции витамина С в микроорганизмах, в частности в бактериях, таких как уксусно-кислые бактерии, такие как С1исопоЬас1ег, Лсе1оЬас1ет и С1исопасе1оЬас1ег, т.е. где эта функция по сравнению с представителями дикого типа усилена или улучшена. Это означает, что прямая продукция витамина С усилена и/или увеличена, когда белок с ΞΝΌΗηί активностью экспрессируется или предпочтительно сверхэкспрессируется у особено подходящего организма хозяина.

Продукция витамина С в таком организме хозяина еще более улучшена, когда хотя бы один полинуклеотид, кодирующий белок, выбранный из СМС или СДЦ систем, изменен в дополнение к этому.

Белок ΞΝΌΗηί может кодироваться нуклеотидной последовательностью, как приведено в ПОСЛ. № 1, которая изолирована из С. охуйапк Ό8Μ, или полинуклеотидом, который в значительной степени идентичен этому.

В этом контексте следует упомянуть, что экспрессия «полинуклеотида, который в значительной степени идентичен» по отношению к последовательности, кодирующей δΝΟΗπί, относится к полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

а) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность согласно ПОСЛ. № 1;

б) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность, полученную путем амплификации нуклеиновой кислоты, такой как полимеразная цепная реакция, с применением геномной ДНК из микроорганизма в качестве матрицы и набора праймеров согласно ПОСЛ. № 3 и ПОСЛ. № 4;

в) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент или производное полипептида, включающего аминокислотную последовательность согласно ПОСЛ. № 2, или кодирующую фрагмент или производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а) или (б), где в упомянутом производном или фрагменте один или более аминокислотный остаток консервативно замещен по сравнению с упомянутым полипептидом и упомянутый фрагмент или производное обладает активностью ΞΝΌΗηί полипептида;

г) полинуклеотидов, комплементарные цепочки которых гибридизуются в жестких условиях с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно ПОСЛ. № 2, или полинуклеотидом, как определено по любому из пп.а)-в), и которые кодируют ΞΝΌΗηί полипептид;

д) полинуклеотидов, которые не менее чем на 70%, а именно на 85, 90 или 95% идентичны полинуклеотиду, кодирующему полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно ПОСЛ. № 2, или полинуклеотиду, как определено по любому из пп.а)-в), и которые кодируют ΞΝΌΗηί полипептид, или комплементарной цепочки такого полинуклеотида.

Полипептид согласно ПОСЛ. № 2 изолирован из нескольких различных микроорганизмов по способу, описанному в примере 22, и его аннотированная функция подтверждена с помощью анализа активности, как описано в примерах 23 и 24.

Активность ΞΝΌΗηί определяется здесь как ферментативная активность по превращению Ь-сорбозона прямо в аскорбиновую кислоту.

Нуклеиновую кислоту, как определено выше, можно получать с помощью амплификации, применяя кДНК, мРНК или, альтернативно, геномную ДНК в качестве матрицы и подходящие олигонуклеотидные праймеры, такие как нуклеотидные праймеры согласно ПОСЛ. № 3 и ПОСЛ. № 4, с помощью стандартной техники ПЦР амплификации. Нуклеиновую кислоту, амплифицированную таким способом, можно клонировать в подходящий вектор и характеризовать с помощью анализа последовательности ДНК.

Далее включены нуклеотидные последовательности, кодирующие частичные полипептидные последовательности полипептида, который сохраняет активность Ь-сорбозондегидрогеназы для получения витамина С из Ь-сорбозона, такие как, например, полипептиды, представленные последовательностями

- 7 012165

ПОСЛ. №№ 12, 14, 16, 18, 20, 22 и 27. Полипептиды включают предпочтительно частичные аминокислотные последовательности не менее чем из 25 последовательных аминокислотных остатков, выбранные из аминокислотных последовательностей полипептидов, раскрытых в настоящей заявке. Специалист в данной области осведомлен о том, что определенные участки полипептидов важны для биологической активности. Имеются, однако, другие области, где аминокислоты можно вставлять, удалять или замещать другими аминокислотами, предпочтительно такими аминокислотами, которые сходны с аминокислотами, которые ими собираются замещать.

Как применяется здесь, «активный фрагмент или производное» означает полипептид, который сохраняет, в основном, такую же биологическую функцию или активность, как у полипептида согласно ПОСЛ. № 2. Примерами биологической активности могут быть, например, ферментативная активность, сигнальная активность или реактивность по отношению к антителам. Термин «такая же биологическая функция» или «функциональный эквивалент», как применено здесь, означает, что белок обладает, в основном, такой же биологической активностью, т.е. энзиматической, сигнальной или реактивностью по отношению к антителам, как и полипептид согласно ПОСЛ. № 2.

Метаболизм Ό-сорбита или Ь-сорбозы включает, с одной стороны, поступление этих соединений в цитозоль и дальнейшее превращение в метаболиты, применяемые в путях ассимиляции, таких как путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, пентозофосфатный шунт, путь Энтнера-Дудорова и цикл трикарбоновых кислот, все из них вовлечены во все жизненные энергообразующие и анаболические реакции, необходимые для роста и поддержания живых клеток. С другой стороны, метаболизм Ό-сорбита или Ь-сорбозы также включает превращение этих соединений в более окисленные продукты, такие как Ь-сорбозон, 2КГК и витамин С, с помощью так называемых процессов неполного окисления.

СМС белки определяются здесь как белки, вовлеченные в систему метаболизма сорбита/сорбозы. Предпочтительно СМС белки выбирают из группы, состоящей из мембраносвязанной ПХХ-зависимой Ό-сорбитдегидрогеназы, мембраносвязанной дегидрогеназы Ь-сорбозы, мембраносвязанной Ь-сорбозондегидрогеназы, мембраносвязанной ФАД-зависимой Ό-сорбитдегидрогеназы, цитозольной НАД-зависимой Ό-сорбитдегидрогеназы, НАД(Ф)-зависимой Ό-сорбитдегидрогеназы (также называемой НАДФ-Нзависимая редуктаза сорбозы), НАД-зависимой ксилитдегидрогеназы, НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы, мембраносвязанной дегидрогеназы Ь-сорбозы, НАД(Ф)-Н-зависимой редуктазы Ь-сорбозы, цитозольной НАДФ-зависимой сорбозондегидрогеназы, цитозольной НАД(Ф)-Н-зависимой Ь-сорбозонредуктазы, мембраносвязанной альдегиддегидрогеназы, цитозольной альдегиддегидрогеназы, глицерол-3фосфатдегидрогеназы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Еще более предпочтительно СМС белки выбирают из семейства оксидоредутаз, более предпочтительно оксидоредуктаз [ЕС 1], как рекомендовано Комитетом по номенклатуре международного союза по биохимии и молекулярной биологии (Кошепс1а(иге СошшШее о£ 1йе 1п(егпа(юпа1 Ишоп о£ Вюсйешщйу апй Мо1еси1аг Вю1о§у (ИС-ГОВМВ)). Особенно предпочтительными являются оксидоредуктазы, действующие на СН-ОН группу доноров [ЕС 1.1], в частности оксидоредуктазы с НАД⁺ или НАДФ⁺ в качестве акцептора [ЕС 1.1.1] и оксидоредуктазы с другими акцепторами [ЕС 1.1.99], или оксидоредуктазы, действующие на альдегидную или оксогруппу доноров [ЕС 1.2], в частности оксидоредуктазы с НАД' или НАДФ⁺ в качестве акцептора [ЕС 1.2.1]. Еще более предпочтительно их выбирают из дегидрогеназ, относящихся к классам ферментов [ЕС 1.1.1.1], [ЕС 1.1.1.15] или [ЕС 1.2.1.-].

Биологическая, энзиматическая или другая активность СМС белков может быть измерена способами, хорошо известными специалисту в данной области, как, например, с помощью инкубации клеточной фракции, содержащей СМС белок, в присутствии его субстрата, акцептора(ов) или донора(ов) электронов, включая феназинметосульфат (ФМС), дихлорофенолиндофенол (ДХФИФ), НАД, НАД-Н, НАДФ, НАДФ-Н, потребление которого можно прямо или косвенно замерить с помощью фотометрических, колориметрических или флуориметрических способов, и другие неорганические компоненты, которые могут быть необходимы для развития активности. Так, например, активность мембраносвязанной Ό-сорбитдегидрогеназы можно измерять с помощью такого анализа, когда мембранную фракцию, содержащую этот фермент, инкубируют в присутствии фосфатного буфера при рН 6, Ό-сорбита и искусственных акцепторов электронов ДХФИФ и ФМС. Скорость потребления ДХФИФ можно замерять при 600 нм, и она прямо пропорциональна Ό-сорбитдегидрогеназной активности, присутствующей в мембранной фракции.

Так, например, посредством увеличения активности СМС белков, вовлеченных в неполное окисление на пути метаболизма Ό-сорбита, можно достигнуть повышения выходов превращения Ό-сорбита в такие продукты, как витамин С. В другом примере с помощью понижения активности СМС белков, вовлеченных в потребление Ό-сорбита в центральных метаболических путях, также можно достигнуть повышения выходов превращения Ό-сорбита в такие продукты, как витамин С.

Известно, что СДЦ белки важны для механизмов, посредством которых электроны, полученные за счет любой окислительно-восстановительной реакции в клетке, переносятся далее, в основном, посредством серии окислительно-восстановительных реакций, включающих кофакторы и оксидазы, на конечный акцептор электронов.

Основным механизмом, который применяют живые организмы для получения энергии, необходимой для их жизненной активности, является дыхание. У высших организмов углеводороды, белки, али

- 8 012165 фатические кислоты превращаются в ацетил-КоА посредством гликолитического катаболического пути и окисления в цитоплазме. Ацетил-КоА далее превращается в серии реакций, известных как цикл лимонной кислоты, которые происходят в митохондриях. Энергия, образующаяся по ходу этих реакций, применяется для получения восстановительной силы, сохраняемой в виде таких соединений, как ФАД-Н₂ и НАД-Н. Эти соединения затем используются в так называемой электрон-транспортной цепи, серии окислительно-восстановительных реакций, включающих различные компоненты, расположенные во внутренней мембране митохондрий. Конечным акцептором электронов является кислород, который затем реагирует с протонами, образующимися в цепи реакций, и образует воду. Градиент концентрации протонов, образующийся по ходу этого процесса, является движущей силой для синтеза АТФ.

У бактерий этот основной процесс дыхания следует тому же физиологическому принципу, но может идти различными путями, включающими разные компоненты, интермедиаты, ферментные комплексы и конечные продукты. Эффективность бактериальных дыхательных процессов может сильно варьировать в зависимости от функциональных биологических компонентов, экспрессируемых каждым видом, что, в свою очередь, зависит от задействованного генетического аппарата и от данных условий роста.

Как пример, уксусно-кислые бактерии, которые являются облигатными аэробами, грам-отрицательными микроорганизмами, принадлежащими к родам Асе1оЬае1ег, С1исоиоЬас1ег и С1исоиасе1оЬас1ег, представляют особенные характеристики с точки зрения процессов генерации энергии. Эти бактерии хорошо известны своей способностью к неполному окислению ряда субстратов, таких как спирты, сахара, сладкие спирты и альдегиды. Такие процессы, в основном, известны как окислительная ферментация, и они уже давно нашли свое применение в пищевой и химической промышленности, особенно в производстве уксуса и Ь-сорбозы. Полезными продуктами, которые, как известно, можно получать за счет неполного окисления с применением штаммов, принадлежащих к роду С1исоиоЬас1ег, являются 2-кето-Ьгулоновая кислота (2-КГК), получаемая из И-сорбита и Ь-сорбозы, и 5-кето-И-глюконовая кислота, предшественник в биосинтезе Ό-винно-каменной кислоты, получаемая из Ό-глюкозы. Неполное окисление является основном механизмом генерации энергии у уксусно-кислых бактерий. Они выполняют эти реакции с помощью различных дегидрогеназ, находящихся в периплазматическом пространстве, на периплазматической мембране, а также в цитоплазме.

Различные кофакторы задействованы различными дегидрогеназами, наиболее распространенными являются ПХХ и ФАД в случае мембраносвязанных или периплазматических ферментов и НАД/НАДФ в случае цитоплазматических ферментов. Известно, что электрон-транспортные цепи штаммов О1исоиоЬас1ег/ 61исоиасе1оЬас1ег и Асе1оЬас1ег включают коэнзим 010 (Ко010) и Ко09. соответственно, в качестве универсального электрон-транспортного соединения для всех процессов, а также в некоторых случаях некоторые виды цитохрома с. Показано, что штаммы 01исоиоЬас1ег не содержат цитохром с оксидазы, но обладают другими видами терминальных оксидаз, такими как оксидазы Ьо-типа.

В одном предпочтительном осуществлении СДЦ белки или субъединицы белков, вовлеченные в перенос электронов, выбирают из белков дыхательной цепи, более предпочтительно их выбирают из тех, что заняты в биосинтезе кофакторов, простетических групп, или выступающих в роли транспортных белков, в частности белков, вовлеченных в биосинтез или развитие кофакторов и/или их предшественников, таких как ФАД, НАД, НАДФ, ПХХ, убихинон, включая КоР10, цитохромы а, Ь, с, й и гем. Более предпочтительно их выбирают из белков биосинтеза ПХХ, таких как белки биосинтеза ПХХ А, В, С, И, Е, или экспортеров гема, таких как СстА или СстВ.

Биологическую, энзиматическую или другую активность СДЦ белков можно замерить с помощью подходов, хорошо известных специалисту в данной области, как, например, путем инкубации мембранной фракции или бесклеточного экстракта, содержащего СДЦ белок, в присутствии коэнзима 02 (Ко02), искусственного донора электронов, и измерения потребления кислорода такими способами, как с помощью кислородного электрода Кларка (Каик ВгоШега, СатЬпйде, ИиИей Кшдйот). Так, например, активность убихинолоксидазы Ьй, устойчивой к цианиду терминальной оксидазы, можно замерить в такой пробе, где мембранную фракцию или бесклеточный экстракт, содержащий этот фермент, инкубируют в присутствии 50 мМ фосфатного буфера при рН 6,5, 0,02% детергента Т\гееп20 и 100 мкМ цианида для инактивации других, чувствительных к цианиду оксидаз. Ферментативную реакцию можно начать посредством добавления 30 мМ восстановленного искусственного донора электронов, КоР2_восст, с последующим измерением увеличения оптического поглощения при 275 нм. Скорость потребления кислорода можно замерить с помощью электрода Кларка, и она прямо пропорциональна активности убихинолоксидазы Ьй, присутствующей в мембранной фракции или бесклеточном экстракте.

Так, например, модифицируя СДЦ полинуклеотид/белок, вовлеченные в биосинтез терминальных оксидаз таким образом, что они приобретают увеличенную активность, можно повысить общую активность производства ферментативных продуктов, зависящих от серии дегидрогеназных реакций, таких как витамин С или 2-КГК. В другом примере, модифицируя СДЦ полинуклеотид/белок, вовлеченные в биосинтез таких кофакторов, как, например, КоО10 или цитохром с, так что уровень синтеза этих кофакторов повышается, можно увеличить общую емкость системы электронного переноса у бактерии, которая зависит от этих соединений как важных элементов дыхательной цепи, и оказать положительное воздействие на рост и продукцию соединений, зависящих от окислительно-восстановительных реакций,

- 9 012165 таких как витамин С. Еще в одном примере модификация СДЦ полинуклеотида/белков, вовлеченных в биосинтез устойчивых к цианиду оксидаз обходных путей (типа не образующих энергию) таким образом, что их активность увеличивается, может оказать положительное воздействие на общую емкость производства продукта ферментации бактериями даже в состоянии отсутствия роста или низкого общего метаболизма.

Получение витамина С с помощью прямой ферментации может быть сильно улучшено, когда белок, выбранный из СДЦ или СМС, как раскрыто здесь, экспрессируется или модифицируется, как описано далее, в микроорганизме, который также экспрессирует δΝΏΗαί. Это здесь также называется сопутствующей (дополнительной) экспрессией. Если сопутствующая экспрессия является результатом генетической манипуляции, последняя также называется сопутствующей манипуляцией. Это можно осуществить, например, у микроорганизма, который экспрессирует δΝΏΗαί, такой как рекомбинантный δΝΌΗαί, последний микроорганизм тогда называется рекомбинантным микроорганизмом.

Здесь проиллюстрированы также семь новых СМС генов, которые могут оказывать действие на улучшение продукции витамина С микроорганизмами, экспрессирующими δΝΏΗαί; каждый из таких генетически модифицированных генов можно применять сам по себе или в сочетании не менее чем с одним дополнительным геном, выбранным из той же группы или из СДЦ.

Семь разных генов кодируют СМС полипептид, включающий аминокислотные последовательности согласно ПОСЛ. № 125, ПОСЛ. № 129, ПОСЛ. № 133, ПОСЛ. № 45, ПОСЛ. № 137, ПОСЛ. № 141, ПОСЛ. № 145, соответственно.

Соответствующие нуклеотидные последовательности представлены как ПОСЛ. № 124, ПОСЛ. № 128, ПОСЛ. № 132, ПОСЛ. № 44, ПОСЛ. № 136, ПОСЛ. № 140, ПОСЛ. № 144, соответственно, которые выделены из С. охубапк И8М 17078. Изобретение также охватывает полинуклеотиды, в значительной степени гомологичные одной из этих последовательностей.

В этом контексте следует заметить, что экспрессия «полинуклеотида, который в значительной степени гомологичен» по отношению к последовательности, кодирующей СМС, обозначает полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

а) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность согласно ПОСЛ. № 124, ПОСЛ. № 128, ПОСЛ. № 132, ПОСЛ. № 44, ПОСЛ. № 136, ПОСЛ. № 140, ПОСЛ. № 144, соответственно;

б) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность, полученную с помощью амплификации нуклеиновой кислоты, такой как полимеразная цепная реакция с применением геномной ДНК из микроорганизма в качестве матрицы и набора праймеров согласно ПОСЛ. № 126 и ПОСЛ. № 127, или ПОСЛ. № 130 и ПОСЛ. № 131, или ПОСЛ. № 134 и ПОСЛ. № 135, или ПОСЛ. № 46 и ПОСЛ. № 47, или ПОСЛ. № 138 и ПОСЛ. № 139, или ПОСЛ. № 142 и ПОСЛ. № 143, или ПОСЛ. № 146 и ПОСЛ. № 147, соответственно;

в) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент или производное полипептида, включающего аминокислотную последовательность согласно ПОСЛ. № 125, ПОСЛ. № 129, ПОСЛ. № 133, ПОСЛ. № 45, ПОСЛ. № 137, ПОСЛ. № 141, ПОСЛ. № 145, соответственно, или кодирующую фрагмент или производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по п. а) или б), где у упомянутого производного один или более аминокислотный остаток консервативно замещен по сравнению с упомянутым полипептидом и упомянутый фрагмент или производное обладают активностью СМС белка;

г) полинуклеотидов, комплементарные цепочки которых гибридизуются в жестких условиях с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, включающий аминокислотные последовательности согласно ПОСЛ. № 125, ПОСЛ. № 129, ПОСЛ. № 133, ПОСЛ. № 45, ПОСЛ. № 137, ПОСЛ. № 141, ПОСЛ. № 145, соответственно, или полинуклеотидом, как определено по любому из пп.а)-в), и которые кодируют СМС белок;

д) полинуклеотидов, которые не менее чем на 70%, а именно на 80, 90 или 95% гомологичны полинуклеотиду, кодирующему полипептид, включающий аминокислотные последовательности согласно ПОСЛ. № 125, ПОСЛ. № 129, ПОСЛ. № 133, ПОСЛ. № 45, ПОСЛ. № 137, ПОСЛ. № 141, ПОСЛ. № 145, соответственно, или полинуклеотиду, как определено по любому из пп.а)-в), и которые кодируют СМС белок;

или комплементарной нити такого полинуклеотида.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, перечисленные выше, применены как «последовательности запроса» для проведения поиска с помощью программы В1ак12 (версия 2 или ВЬА8Т из Национального центра биотехнологии (№1юпа1 Сеп1ег Гог Вю1ес11по1оду (ΝΟΕΙ)) по базе данных ΡΚΌ 8^-8тс1ккРго1 (полная версия плюс текущие дополнения). Ген СМС 02 (ПОСЛ. № 124) аннотирован как кодирующий белок, демонстрирующий сходство с НАД(Ф)-зависимой Ό-сорбитдегидрогеназой из ВасШик киЬйШ (ПОСЛ. № 125). Ген СМС 03 (ПОСЛ. № 128) аннотирован как кодирующий белок, демонстрирующий сходство с НАД(Ф)-зависимой сорбитдегидрогеназой из ВасШик киЫШк (ПОСЛ. № 129). Ген СМС 04 (ПОСЛ. № 132) аннотирован как кодирующий НАД(Ф)-зависимую редуктазу Ь-сорбозы (ПОСЛ. № 133). Ген СМС 05 (ПОСЛ. № 44) аннотирован как кодирующий НАД(Ф)-зависимую сорбозондегидрогеназу (ПОСЛ. № 45). Ген СМС 12 (ПОСЛ. № 136) аннотирован как кодирующий мембраносвязанную

- 10 012165 дегидрогеназу Ь-сорбозы (СДГ) ((ПОСЛ. № 137). Ген СМС 13 (ПОСЛ. № 140) аннотирован как кодирующий субъединицу А мембраносвязанной ПХХ-зависимой Ό-сорбитдегидрогеназы (ПОСЛ. № 141). Ген СМС 14 (ПОСЛ. № 144) аннотирован как кодирующий субъединицу В мембраносвязанной ПХХ-зависимой Ό-сорбитдегидрогеназы (ПОСЛ. № 145).

Нуклеиновая кислота, кодирующая СМС белок согласно изобретению, может быть получена из любого подходящего организма посредством амплификации нуклеиновой кислоты с применением кДНК, мРНК или, альтернативно, геномной ДНК в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров, таких как пары нуклеотидных праймеров согласно ПОСЛ. № 126 и ПОСЛ. № 127, или ПОСЛ. № 130 и ПОСЛ. № 131, или ПОСЛ. № 134 и ПОСЛ. № 135, или ПОСЛ. № 46 и ПОСЛ. № 47, или ПОСЛ. № 138 и ПОСЛ. № 139, или ПОСЛ. № 142 и ПОСЛ. № 143, или ПОСЛ. № 146 и ПОСЛ. № 147, соответственно, с помощью стандартных приемов ПЦР амплификации. Нуклеиновые кислоты, амплифицированные таким образом, можно клонировать в соответствующий вектор и характеризовать с помощью анализа последовательности ДНК.

Различные ПОСЛ. № №, относящиеся к СМС белкам и генам, суммированы ниже.

Белок/ген	ПОСЛ № для полинуклеотида	ПОСЛ № для полипептида	ПОСЛ № для праймеров
СМС 02	124	125	126/127
СМС 03	128	129	130/131
СМС 04	132	133	134/135
СМС 05	44	45	46/47
СМС 12	136	137	138/139
СМС 13	140	141	142/143
СМС 14	144	145	146/147

Здесь проиллюстрированы пять новых СДЦ генов, которые могут оказывать действие на улучшение продукции витамина С микроорганизмами, экспрессирующими ΞΝΌΗαί: каждый из этих генетически модифицированных генов можно применять сам по себе или в сочетании хотя бы с одним дополнительным геном, выбранным из той же группы или из СМС.

Пять различных генов кодируют СДЦ полипептид, включающий аминокислотные последовательности согласно ПОСЛ. № 181, ПОСЛ. № 185, ПОСЛ. № 189, ПОСЛ. № 193, ПОСЛ. № 197, соответственно.

Соответствующие нуклеотидные последовательности представлены как ПОСЛ. № 180, ПОСЛ. № 184, ПОСЛ. № 188, ПОСЛ. № 192, ПОСЛ. № 196, соответственно, которые выделены из С. охубапз О8М 17078. Изобретение также охватывает полинуклеотиды, в значительной степени гомологичные одной из этих последовательностей.

В этом контексте следует заметить, что экспрессия «полинуклеотида, который в значительной степени гомологичен» по отношению к последовательности, кодирующей СДЦ, относится к полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

а) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность согласно ПОСЛ. № 180, ПОСЛ. № 184, ПОСЛ. № 188, ПОСЛ. № 192, ПОСЛ. № 196, соответственно;

б) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность, полученную с помощью амплификации нуклеиновой кислоты, такой как полимеразная цепная реакция с применением геномной ДНК из микроорганизма в качестве матрицы и набора праймеров согласно ПОСЛ. № 182 и ПОСЛ. № 183, или ПОСЛ. № 186 и ПОСЛ. № 187, или ПОСЛ. № 190 и ПОСЛ. № 191, или ПОСЛ. № 194 и ПОСЛ. № 195, или ПОСЛ. № 198 и ПОСЛ. № 199, соответственно;

в) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент или производное полипептида, включающего аминокислотную последовательность согласно ПОСЛ. № 181, ПОСЛ. № 185, ПОСЛ. № 189, ПОСЛ. № 193, ПОСЛ. № 197, соответственно, или кодирующую фрагмент или производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по п.а) или б), где у упомянутого производного один или более аминокислотный остаток консервативно замещен по сравнению с упомянутым полипептидом и упомянутый фрагмент или производное обладают активностью СДЦ белка;

г) полинуклеотидов, комплементарные нити которых гибридизуются в жестких условиях с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, включающий аминокислотные последовательности согласно ПОСЛ. № 181, ПОСЛ. № 185, ПОСЛ. № 189, ПОСЛ. № 193, ПОСЛ. № 197, соответственно, или полинуклеотидом, как определено по любому из пп.а)-в), и которые кодируют СДЦ белок;

д) полинуклеотидов, которые не менее чем на 70%, а именно на 80, 90 или 95% гомологичны полинуклеотиду, кодирующему полипептид, включающий аминокислотные последовательности согласно ПОСЛ. № 181, ПОСЛ. № 185, ПОСЛ. № 189, ПОСЛ. № 193, ПОСЛ. № 197, соответственно, или полинуклеотиду, как определено по любому из пп.а)-в), и которые кодируют СДЦ белок;

или комплементарной нити такого полинуклеотида.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, перечисленные выше, применены как «последовательности запроса» для проведения поиска с помощью программы В1а§12 (версия 2 или ВЬА8Т из

- 11 012165

Национального центра биотехнологии (Ыайопа1 Сеп1ег £ог Вю1есйпо1оду (Νί’ΒΙ)) по базе данных РКО 8^-8^ίδδΡΓ0ΐ (полная версия плюс текущие дополнения). Ген СДЦ 21 (ПОСЛ. № 180) аннотирован как кодирующий белок А биосинтеза коэнзима ПХХ (ПОСЛ. № 181). Ген СДЦ 22 (ПОСЛ. № 184) аннотирован как кодирующий белок В биосинтеза коэнзима ПХХ (ПОСЛ. № 185). Ген СДЦ 23 (ПОСЛ. № 188) аннотирован как кодирующий белок С биосинтеза коэнзима ПХХ (ПОСЛ. № 189). Ген СДЦ 24 (ПОСЛ. № 192) аннотирован как кодирующий белок Ό биосинтеза коэнзима ПХХ (ПОСЛ. № 193). Ген СДЦ 25 (ПОСЛ. № 196) аннотирован как кодирующий белок Е биосинтеза коэнзима ПХХ (ПОСЛ. № 197).

Нуклеиновая кислота, кодирующая СДЦ белок согласно изобретению, может быть получена из подходящего организма посредством амплификации нуклеиновой кислоты с применением кДНК, мРНК или, альтернативно, геномной ДНК в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров, таких как пары нуклеотидных праймеров согласно ПОСЛ. № 182 и ПОСЛ № 183, или ПОСЛ. № 186 и ПОСЛ. № 187, или ПОСЛ. № 190 и ПОСЛ. № 191, или ПОСЛ. № 194 и ПОСЛ. № 195, или ПОСЛ. № 198 и ПОСЛ. № 199, соответственно, с помощью стандартных приемов ПЦР амплификации. Нуклеиновые кислоты, амплифицированные таким образом, можно клонировать в соответствующий вектор и характеризовать с помощью анализа последовательности ДНК.

Различные ПОСЛ. № №, относящиеся к СДЦ белкам и генам, суммированы ниже.

белок/ген	ПОСЛ № для полинуклеотида	ПОСЛ № для полипептида	ПОСЛ № для Праймеров
СДЦ 21	180	181	182/183
СДЦ22	184	185	186/187
СДЦ 23	188	189	190/191
СДЦ 24	192	193	194/195
СДЦ 25	196	197	198/199

До того, как сопутствующая экспрессия будет проиллюстрирована далее, создание и экспрессия одиночного гена/полинуклеотида и изменение генома клетки хозяина, как проиллюстрировано выше, будут описаны более детально в отношении δΝΩΗαί. Если не указано обратное, описание также приложимо для создания и экспрессии СМС и СДЦ генов, раскрытых здесь.

Для клонирования двухцепочечных ДНК можно применять большое разнообразие сочетаний хозяин/клонирующий вектор. Предпочтительные векторы для экспрессии генов по настоящему изобретению, например δΝΩΗαί гена, в Е. сой можно выбирать из векторов, обычно применяемых для Е. сой, таких как, например, рОЕ векторы, которые экспрессируют рекомбинантные белки с Ηίδ-концом (ΟΙΛΟΕΝ АС 8^11хсг1апб). рВК322 или его производные, включая, например, рИС18 и рВ1ис5СГ1р1 II (81га1адепе С1ошпд 8у51сш5. СайГ, И8А), рАСУС177 и рАСУС184 и их производные, и векторы, произведенные на основе плазмид для широкого спектра хозяев, таких как КК2 и К8Г1010. Предпочтительный вектор для экспрессии нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению в бактериях, включающих С1исопоЬас1ег, С1исопасе1оЬас1ег, Асе1оЬас1ег и Ркеиботопак, выбирают среди векторов, которые могут реплицироваться в С1исопоЬас1ег, Асе1оЬас1ег, или Ркеиботопак, а также в таком предпочтительном для клонирования организме, как Е. сой. Предпочтительным вектором является вектор для широкого спектра хозяев, как например, космидный вектор вроде рУК100 и его производные и К8Г1010. Число копий и стабильность вектора следует подбирать внимательно для обеспечения стабильной и эффективной экспрессии клонированного гена, а также для эффективного выращивания клетки хозяина, несущей клонированный ген. Молекулы нуклеиновых кислот, содержащие, например, транспонируемые элементы, такие как Тп5, также можно применять в качестве вектора для введения нужного гена в клетки выбранного хозяина, в особенности в хромосому. Молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие любые ДНК, выделенные из клеток предпочтительного хозяина вместе с δΝΩΗηί геном по настоящему изобретению, также можно применять для введения этого гена в клетки предпочтительного хозяина, в особенности в хромосому. Такие молекулы нуклеиновой кислоты можно переносить в клетки предпочтительного хозяина с помощью общепринятых способов, например трансформации, трансдукции, конъюгации или электропорации, которые хорошо известны в данной области, в зависимости от природы клеток хозяина и молекулы нуклеиновой кислоты.

Нуклеотидные последовательности/ген Ь-сорбозондегидрогеназы можно лигировать в подходящий вектор, содержащий регуляторный район, такой как, например, промотор, участок связывания рибосомы и терминатор транскрипции, работающие в вышеописанных клетках хозяина, с помощью хорошо известных в данной области способов для получения экспрессирующего вектора.

Полипептиды и полинуклеотиды, проиллюстрированные примерами здесь, предпочтительно предоставлены в изолированной форме и предпочтительно очищены до гомогенности.

Термин «изолированный» означает, что материал извлечен из своего исходного окружения (например, природного окружения, если он встречается в природе). Например, встречающиеся в природе полипептид или полинуклеотид, присутствующие в живом микроорганизме, не являются изолированными, однако, те же полипептид или полинуклеотид, отделенные от некоторых или всех сосуществующих в

- 12 012165 природной системе материалов, являются изолированными. Такие полинуклеотиды могут быть частью вектора, и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут быть частью композиции и все-таки будут изолированными, поскольку вектор или композиция не являются частью их природного окружения.

Изолированным полинуклеотидом или нуклеиновой кислотой, как применяется здесь, могут быть ДНК или РНК, которые не являются непосредственно смежными с кодирующими последовательностями, с которыми они являются непосредственно смежными (одна с 5'-конца и одна с З'-конца) во встречающемся в природе геноме организма, из которого получены. Так, в одном осуществлении нуклеиновая кислота включает некоторые или все 5'-некодирующие (например, промотор) последовательности, которые являются непосредственно смежными с кодирующей последовательностью. Термин «изолированный полинуклеотид», следовательно, включает, например, рекомбинантную ДНК, которая входит в состав вектора, автономно реплицирующейся плазмиды или вируса или в геномную ДНК прокариота или эукариота или которая существует как отдельная молекула (например, кДНК или фрагмент геномной ДНК, полученный посредством ПЦР или обработки рестриктазами) независимо от других последовательностей. Он также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, которая, в основном, свободна от клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды (при получении с помощью техники рекомбинантных ДНК) или химических предшественников или других химических веществ (при получении посредством химического синтеза). Далее, «изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты» является фрагментом нуклеиновой кислоты, который не встречается в природе в виде фрагмента и который нельзя найти в естественном состоянии.

Как применяется здесь, термины «полинуклеотид», «ген» и «рекомбинантный ген» относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые можно изолировать из хромосомной ДНК, которые включают участок с открытой рамкой считывания, кодирующий белок, например ΞΝΩΗαί белки из О. охуйапк Ό8Μ 17078. Полинуклеотид может включать полинуклеотидную последовательность, как показано в ПОСЛ. № 1, или ее фрагмент и районы до и после последовательностей гена, которые могут включать, например, районы промоторов, регуляторные районы и районы терминаторов, важные для правильной экспрессии и стабилизации полипептида, получаемого таким образом.

Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, такие как, например, нетранслируемые последовательности, расположенные на 3'- и 5'-концах кодирующего района гена, и регуляторные последовательности. Далее, ген относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, как определено здесь. Более того, специалисту в данной области ясно, что полиморфизм последовательности ДНК, ведущий к изменениям аминокислотных последовательностей δΝΩΗαί белков, может существовать внутри популяции, например популяции С1исопоЬас1сг охуйапк. Такой генетический полиморфизм для δΝΌΗαί гена может существовать среди особей внутри популяции благодаря естественным вариациям или в клетках из различных популяций. Такие естественные вариации, обычно, могут приводить к 1-2% различий в нуклеотидной последовательности δΝΩΗαί гена. Все и каждая из этих нуклеотидных вариаций и возникающий вследствие этого аминокислотный полиморфизм δΝΩΗαί являются результатом естественной изменчивости, и те, что не меняют функциональную активность δΝΩΗαί белков, входят в область притязаний данного изобретения.

Как применяется здесь, термин «полинуклеотид» или «молекула нуклеиновой кислоты» включают молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК), и молекулы РНК (например, мРНК), и аналоги ДНК и РНК, полученные с помощью аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с применением аналогов или производных олигонуклеотидов (например, инозина или фосфоротиоата). Такие олигонуклеотиды можно применять, например, для получения нуклеиновых кислот с измененными свойствами образования пар оснований или увеличенной устойчивостью к нуклеазам.

Информацию о последовательностях, предоставленную здесь, не следует толковать столь узко, чтобы требовать включения ошибочно идентифицированных оснований. Отдельные последовательности, раскрытые здесь, можно успешно применять для выделения полных генов из рекомбинантного или нерекомбинантного микроорганизма, способного превращать данный источник углерода прямо в витамин С, в частности С1исопоЬас1сг охуйапк, предпочтительно С1нсопоЬас1сг охуйапк Ό8Μ 17078, который, в свою очередь, можно с легкостью подвергать дальнейшему анализу последовательностей, идентифицируя таким образом ошибки секвенирования.

Если не отмечено обратное, все нуклеотидные последовательности, определенные здесь с помощью секвенирования молекулы ДНК, определены с помощью автоматического секвенатора и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодируемых молекулами ДНК, определенные здесь, предсказаны посредством трансляции последовательностей ДНК, определенных, как описано выше. Поэтому, как известно в данной области техники для любой последовательности ДНК, определенной таким автоматическим способом, любая нуклеотидная последовательность, определенная здесь, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, определенные автоматически, обычно являются не менее чем на 90% идентичными, более типично от не менее чем на 95% до не менее чем на 99,9%

- 13 012165 идентичными действительной нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК. Действительную последовательность можно более точно определить с помощью других подходов, включая способы ручного секвенирования ДНК, хорошо известные в данной области. В данной области техники также хорошо известно, что одиночная вставка или делеция в определенной (путем секвенирования) нуклеотидной последовательности по сравнению с действительной последовательностью приведет к сдвигу рамки считывания при трансляции нуклеотидной последовательности, так что предсказанная аминокислотная последовательность, кодируемая полученной посредством секвенирования нуклеотидной последовательностью, станет совершенно отличной от аминокислотной последовательности, действительно кодируемой секвенируемой молекулой ДНК, начиная от точки такой вставки или делеции.

Специалист в данной области может идентифицировать такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как исправлять подобные ошибки.

Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может включать только часть или фрагмент нуклеотидной последовательности, предоставленной данным изобретением, как, например, последовательности ПОСЛ. № 1, например фрагмент, который можно применять в качестве пробы или праймера, как, например, ПОСЛ. № 3 или ПОСЛ. № 4, или фрагмент, кодирующий часть белка согласно изобретению. Нуклеотидная последовательность, определенная из клонирования δΝΩΗαί гена, позволяет получать пробы или праймеры для применения с целью идентификации и/или клонирования других членов семейства δΝΏΗαί, а также ΞΝΩΗαί гомологов из других видов. Проба/праймер обычно включает в значительной степени очищенные олигонуклеотиды, которые обычно содержат район нуклеотидной последовательности, который гибридизуется предпочтительно в очень жестких условиях хотя бы с приблизительно 12 или 15, предпочтительно с приблизительно 18 или 20, более предпочтительно с приблизительно 22 или 25, еще более предпочтительно с приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, или 75, или более последовательными нуклеотидами или нуклеотидной последовательностью согласно ПОСЛ. № 1 или ее фрагментом или производным.

Молекулу нуклеиновой кислоты, включающую всю или часть нуклеотидной последовательности согласно ПОСЛ. № 1, можно изолировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением синтетических олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе информации о последовательностях, содержащейся здесь.

Нуклеиновую кислоту согласно изобретению можно амплифицировать с применением кДНК, мРНК или, альтернативно, геномной ДНК в качестве матрицы и соответствующих олиигонуклеотидных праймеров с помощью стандартных приемов ПЦР амплификации. Нуклеиновую кислоту, амплифицированную таким способом, можно клонировать в подходящий вектор и характеризовать с помощью анализа последовательности ДНК.

Фрагменты полинуклеотида могут также включать полинуклеотиды, не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут выступать в качестве проб или праймеров для ПЦР реакции.

Нуклеиновые кислоты безотносительно того, кодируют ли они функциональные или нефункциональные полипептиды, можно применять как пробы для гибридизации или праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применения молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, которые не кодируют полипептиды, обладающие δΝΌΗαί активностью, включают, среди прочего: (1) выделение гена, кодирующего белок настоящего изобретения, или его аллельных вариантов из библиотеки кДНК, например из организмов, отличных от С1исопоЬас!ег охубапк, и (2) анализ с помощью блоттинга (ΝογΙΙιογπ Ь1о1) для детектирования эксрессии мРНК упомянутого белка в определенных клетках или (3) применение для усиления и/или улучшения функции или активности гомологов δΝΏΗαί генов в упомянутых организмах.

Пробы, основанные на нуклеотидных последовательностях, предоставленных здесь, можно применять для детектирования транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих те же или гомологичные белки, например, в других организмах. Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие естественным вариантам и происходящим не из С. охубапк гомологам δΝΏΗαί ДНК из С. охубапк согласно изобретению, которые также охвачены настоящим изобретением, можно изолировать, основываясь на их гомологии нуклеиновой кислоте δΝΌΗαί из С. охубапк, раскрытой здесь, с применением ДНК С. охубапк или его части в качестве гибридизационной пробы согласно стандартным техникам гибридизации, предпочтительно в очень жестких условиях гибридизации.

В предпочтительных осуществлениях проба далее включает присоединенную к ней группу маркера, например, группой маркера может быть радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента.

Гомологи или в значительной степени идентичные последовательности генов можно изолировать, например, с помощью ПЦР с применением двух подборок вырожденных праймеров, созданных на основе нуклеотидной последовательности, как описано здесь.

Матрицей для реакции может быть кДНК, полученная с помощью обратной транскрипции мРНК, полученной из штаммов, о которых известно или предполагается, что они экспрессируют полинуклеотид согласно изобретению. Продукт ПЦР можно субклонировать и секвенировать, чтобы удостовериться в том, что амплифицированные последовательности представляют последовательности новой нуклеиновой

- 14 012165 кислоты, как описано здесь, или ее функциональный эквивалент.

ПЦР фрагмент можно далее применять для выделения кДНК клона в полную длину с помощью большого числа известных способов. Например, амплифицированный фрагмент можно пометить и применять для скрининга бактериофаговой или космидной библиотеки кДНК. С другой стороны, меченый фрагмент можно применять для скрининга геномной библиотеки.

Технику ПЦР также можно применять для выделения последовательностей кДНК в полную длину из других организмов. Например, можно изолировать РНК согласно стандартным способам из подходящего источника клеточной или тканевой природы. Реакцию обратной транскрипции можно проводить с применением РНК с применением олигонуклеотидного праймера, специфичного для большей части 5'конца амплифицированного фрагмента для начала синтеза первой цепочки.

К образующемуся РНК/ДНК гибриду можно затем добавить «хвостик» (например, из гуанинов) с помощью стандартной реакции с терминальной трансферазой, гибрид можно обработать с помощью РНКазы Н и начать синтез второй цепочки (например, с помощью поли-Ц праймера). Таким образом, последовательности кДНК, расположенные выше амплифицируемого фрагмента, можно легко изолировать. Для обзора полезных стратегий клонирования см., например, ЗатЬгоок с1 а1., кирга; аиб АикиЬе1 с1 а1., кирга.

Гомологи, в значительной степени идентичные последовательности, функциональные эквиваленты и ортологи генов, проиллюстрированных здесь, таких как δΝΟΗπί ген согласно ПОСЛ. № 1, можно получить из ряда различных микроорганизмов. Способы изоляции специфических генов и/или их фрагментов проиллюстрированы здесь.

Следуя этим способам, δΝΩΗηί гены были успешно изолированы из 61исоиоЬас!ег охубапк ΙΡΟ 3292, 61исопоЬас!ег охубапк ΙΡΘ 3287, Лсе!оЬас!ег кр. АТСС 15164 и 61исопоЬас!ег охубапк ΙΡΘ 3244. Соответственно, нуклеиновые кислоты, кодирующие другие члены семейства ΞΝΟΗηί. которые, таким образом, имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от нуклеотидной последовательности согласно ПОСЛ. № 1, находятся в области притязаний изобретения. Далее, нуклеиновые кислоты, кодирующие δΝΩΗηί белки из различных видов, которые таким образом обладают нуклеотидной последовательностью, которая отличается от нуклеотидной последовательности, приведенной в ПОСЛ. № 1, находятся в области притязаний изобретения.

Изобретение также раскрывает изолированный полинуклеотид, способный к гибридизации в жестких условиях, предпочтительно в очень жестких условиях, с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению, таким как, например, полинуклеотид согласно ПОСЛ. № 1. Преимущественно такой полинуклеотид можно получить из микроорганизма, способного превращать данный источник углерода прямо в витамин С, в частности 61исопоЬас!ег охубапк, предпочтительно 61исопоЬас!ег охубапк Ό8Μ 17078.

Как применяется здесь, термин «гибридизующие» описывает условия для гибридизации и промывки, при которых нуклеотидные последовательности, хотя бы на приблизительно 50%, хотя бы на приблизительно 70%, более предпочтительно хотя бы на приблизительно 80%, еще более предпочтительно хотя бы на приблизительно 85-90%, наиболее предпочтительно хотя бы на 95% гомологичные друг другу, остаются гибридизованными друг с другом.

В одном осуществлении нуклеиновая кислота изобретения является хотя бы на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична последовательности нуклеиновой кислоты согласно ПОСЛ. № 1 или ее комплементу.

Предпочтительным, но не ограничивающим примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6х растворе хлористого натрия/цитрата натрия (88С) при приблизительно 45°С с последующими одной или более промывками в 1х 88С, 0,1% ДСН (додецилсульфат натрия) при 50°С, предпочтительно при 55°С, более предпочтительно при 60°С и еще более предпочтительно при 65°С.

Очень жесткие условия включают, например, инкубацию от 2 ч до 4 дней при 42°С с применением дигоксигенин ЩЮ)-меченной ДНК пробы (полученной с помощью системы введения ΌΙΟ метки; Воске 0|адпок11ск СтЬН, 68298 Маппкет, Сегтапу) в таком растворе, как ЭЦЕакуНук раствор (Воске П1адпоккск СтЬН) в присутствии или в отсутствие 100 мкг/мл ДНК из спермы лосося, или в растворе, включающем 50% формамид, 5х 88С (150 мМ хлористого натрия, 15 мМ цитрата натрия трехзамещенного), 0,02% додецилсульфата натрия, 0,1% Ν-лаурилсаркозина и 2% блокирующего реагента (Воске П1адпоккск СтЬН) с последующей промывкой фильтров дважды в течение от 5 до 15 мин в 2х 88С и 0,1% ДСН при комнатной температуре и затем промывкой дважды в течение 15-30 мин в 0,5х 88С и 0,1% ДСН или 0,1х 88С и 0,1% ДСН при 65-68°С.

Предпочтительно изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая гибридизуется предпочтительно в очень жестких условиях с нуклеотидной последовательностью согласно изобретению, соответствует естественно встречающейся молекуле нуклеиновой кислоты. Как применяется здесь, «естественно встречающаяся» молекула нуклеиновой кислоты относится к молекуле ДНК или РНК, обладающей нуклеотидной последовательностью, которая встречается в природе (например, кодирует природный белок). В одном осуществлении нуклеиновая кислота кодирует природный δΝΩΗηί белок из С. охубапк.

- 15 012165

Специалист в данной области поймет, какие условия относятся к жестким и очень жестким условиям гибридизации. Дополнительная помощь в поиске таких условий легко доступна в данной области, например, у 8атЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й 8ргтд НагЬог Ргекк, N. Υ.; апй Аи8иЬе1 е! а1. (ейк.), 1995, Сштеп! РгоЮсой ίη Мо1еси1аг Вю1оду, (Йо1т \Уйеу & 8оп§, N. Υ.). Конечно, полинуклеотид, который гибридизуется только с последовательностью поли(А) (такой, как З'-терминальная поли(А) часть мРНК) или с комплементарным участком Т (или У) остатков, не был бы включен в полинуклеотид по изобретению, применяемый для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты согласно изобретению, поскольку такой полинуклеотид гибридизовался бы с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей участок поли(А) или комплементарный ему (например, практически, с любой двухцепочечной клональной кДНК).

В типичном случае, можно подвергать скринингу библиотеки геномной ДНК или кДНК, полученные из других организмов, например микроорганизмов, способных к превращению данного источника углерода, такого как Ό-сорбит, Ь-сорбоза, Ь-сорбозон, прямо в витамин С, в частности из других видов С1исопоЬас!ег.

Например, штаммы С1исопоЬас!ег можно подвергнуть скринингу на наличие гомологов полинуклеотидов с помощью блот-анализа (№г111егп Ь1о1 апа1у§18). При обнаружении транскриптов, гомологичных полинуклеотидам согласно изобретению, можно составить библиотеки ДНК на основе РНК, изолированных из соответствующего штамма, применяя стандартные техники, хорошо известные специалисту в данной области. С другой стороны, можно подвергать скринингу общую библиотеку геномной ДНК, применяя пробу, гибридизуемую с полинуклеотидом согласно изобретению.

Молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, такую, например, как молекула нуклеиновой кислоты согласно ПОСЛ. № 1 или ее фрагмент или производное, можно изолировать с применением стандартных техник молекулярной биологии и информации о последовательностях, предоставленной здесь. Например, применяя все или часть последовательности нуклеиновой кислоты согласно ПОСЛ. № 1 в качестве гибридизационной пробы, молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению можно изолировать с помощью стандартной техники гибридизации и клонирования (например, описанных у 8атЬгоок, к, ΒγιΙκΒ, Е.Е., апй Матайу Т. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1. 2пй, ей., Со1й 8рйпд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1й 8рйпд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1й 8рйпд НагЬог, ΝΥ, 1989).

Далее, олигонуклеотиды, соответствующие или гибридизуемые с нуклеотидными последовательностями согласно изобретению, можно получить с помощью стандартных техник синтеза, например применяя автоматический синтезатор ДНК.

Термины «гомология», «идентично» или «процент идентичности» применяются здесь взаимозаменяемо. Для целей настоящего изобретения здесь определено, что для выяснения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей эти последовательности сопоставляют (айдпей) с целью оптимального сравнения (например, можно вставлять разрывы в первую аминокислотную или полинуклеотидную последовательность для оптимального сопоставления со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Остатки аминокислот или нуклеотидов в соответствующих положениях затем сравнивают. Если положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, как и соответствующее положение второй последовательности, то молекулы являются идентичными по этой позиции. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных позиций, поделенного на длину последовательностей (т.е. % идентичности=число идентичных позиций/общее число позиций (т.е. перекрывающихся позиций) х 100). Предпочтительно у двух последовательностей одинаковая длина.

Специалист в данной области осведомлен о том, что доступно несколько компьютерных программ для определения гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может выполняться с помощью математического алгоритма. В предпочтительном осуществлении процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с помощью алгоритма №ей1етап апй ^ипксй (1. Мо1. Вю1. (48): 444-453 (1970)), который включен в программу САР программного пакета ССС (доступного на Ййр://^тете.ассе1гу8.сот), с применением либо матрицы В1о§8от 62, либо матрицы РАМ250 и веса участка разрыва (а дар \\όι§1ιΙ) 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса протяженности (1епд111 \\όι§1ιΙ) 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалист в данной области поймет, что различия во всех этих параметрах приведут к слегка различным результатам, но на общем проценте идентичности двух последовательностей применение разных алгоритмов не скажется значительным образом.

Еще в одном осуществлении процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определен с помощью программы САР программного пакета ССС (доступного на 1Шр:/Л\л\лг.ассе1гу5.со1п) с применением ШУБдарйпа, матрицы СМР, веса участка разрыва 40, 50, 60, 70 или 80 и веса протяженности 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом осуществлении процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с помощью алгоритма Е. Меуегк апй V. М111ег (САВΙΘ8, 4: 11-17 (1989)), включенного в программу ΛυΟΝ (версия 2.0) (доступную на 1Шр:/Л'едалд11.спг5.Гг/Ып/а1|дпдие88.сд1), применяя таблицу веса остатков (\\'е1д1И геыйие !аЬ1е) РАМ120, штраф за протяженность участка разрыва (а дар 1епд(Н репа11у) 12 и штраф за участок разрыва (а дар репаПу) 4.

- 16 012165

Последовательности нуклеиновой кислоты и белка согласно настоящему изобретению далее можно применять в качестве «последовательности запроса» для проведения поиска по общедоступным базам данных для того, чтобы, например, идентифицировать другие члены семейства или родственные последовательности. Такие поиски можно проводить с применением программ ВБ-ΛδΤΝ и ВБА8ТХ (версия 2.0) по ЛЙ8сйи1, е! а1. (1990) I. Мо1. Вю1. 215: 403-10. Поиск нуклеотидов с применением ВБА8Т можно проводить с помощью программы ΒΕΑ8ΤΝ с параметрами счет=100, длина слова=12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Поиск белков с применением ВБА8Т можно проводить с помощью программы ВБА8ТХ с параметрами счет=50, длина слова=3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белков согласно настоящему изобретению. Для получения сопоставлений с разрывами с целями сравнения можно применять Сарреб ВБА8Т, как описано у А115сйи1 е! а1. (1997) М.1с1е1с Ас1б§ Кек. 25 (17): 3389-3402. При применении программ ВБА8Т и Сарреб ВБА8Т можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ (т.е. ВБА8ТХ и ВЬАЗТЫ). См. 1Шр://\\л\лу.псЫ.ппп.ш11.доу.

В другом осуществлении изолированная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной нуклеотидной последовательности, такой как в настоящем изобретении, как, например, последовательность согласно ПОСЛ. № 1. Молекулой нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, раскрытой здесь, является такая, которая достаточно комплементарна нуклеотидной последовательности согласно ПОСЛ. № 1, так что она может гибридизоваться с упомянутой нуклеотидной последовательностью, таким образом образуя устойчивую пару (дуплекс).

В другом осуществлении нуклеиновая кислота изобретения согласно ПОСЛ. № 1 или ее комплемент содержит хотя бы одну мутацию, приводящую к продукту гена с модифицированной функцией/активностью. Хотя бы одну мутацию можно ввести способами, известными в данной области или описанными здесь. По отношению к 5>ΝΌΗ;·ιί хотя бы одна мутация приводит к 5>ΝΌΗ;·ιί белку, функция которого по сравнению с представителем дикого типа является усиленной или улучшенной. Активность 5>ΝΌΗ;·ιί белка таким образом увеличивается. Способы введения таких мутаций хорошо известны в данной области.

Клетки с увеличенной 5>ΝΌΗ;·ιί активностью являются предпочтительными, поскольку такие клетки будут продуцировать больше витамина С, в особенности, когда любой из других генов, выбранный из СМС или СДЦ генов, генетически изменен, как описано здесь.

Другой аспект относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок согласно изобретению или его функциональный эквивалент или часть. Как применяется здесь, термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, к которой она присоединена. Одним типом вектора является «плазмида», что относится к кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую можно лигировать дополнительный сегмент ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. Определенные векторы способны к независимой репликации в клетке хозяина, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное начало репликации). Другие векторы интегрируются в геном клетки хозяина после введения в клетку хозяина и вследствие этого реплицируются вместе с геномом хозяина.

Далее, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они связаны на оперативном уровне. Такие векторы называются здесь «экспрессирующими векторами». Обычно экспрессирующие векторы, применяемые в технике рекомбинантных ДНК, часто представлены в форме плазмид. Термины «плазмида» и «вектор» могут здесь применяться взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее распространенной формой вектора. Однако изобретение охватывает и такие иные формы экспресссируюших векторов, как вирусные векторы (например, ретровирусы с нарушенной репликацией, аденовирусы и аденосвязанные вирусы), которые выполняют такие же функции.

Рекомбинантные векторы изобретения включают нуклеиновую кислоту изобретения в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке хозяина, что означает, что рекомбинантный экспрессирующий вектор включает одну или более регуляторную последовательность, выбранную в соответствии к клеткой хозяина, предназначенной для экспрессии, которая связана на оперативной уровне с последовательностью нуклеиновой кислоты, которую собираются экспрессировать. Внутри рекомбинантного экспрессирующего вектора «связано на оперативной уровне» означает, что рассматриваемая нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью таким образом, который позволяет экспрессию нуклеотидной последовательности (например, как в случае системы ίη νίίτο транскрипции/трансляции или в клетке хозяина, когда вектор введен в клетку хозяина). Термин «регуляторная последовательность» включает промоторы, усилители и другие элементы контроля экспрессии (например, аттенюатор). Такие регуляторные последовательности описаны, например, у Соеббе1; Сепе Ехртекыоп Тес11по1о§у: МеШобк ш Епхуто1о§у 185, Асабетю Ргекк, 8ап О1едо, СА (1990). Регуляторные последовательности включают таковые, которые управляют конститутивной или индуцируемой экспрессией нуклеотидной последовательности у многих типов клеток хозяина, и такие, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только у определенных клеток хозяина (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Специалисту в данной области будет ясно, что конструкция экспрес

- 17 012165 сирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки хозяина, которую будут трансформировать, желаемого уровня экспрессии белка и т.д. Экспрессирующие векторы согласно изобретению можно вводить в клетки хозяина, чтобы вследствие этого продуцировать белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, как описано здесь, включая, но, не ограничиваясь этим, мутантные белки, их фрагменты, их варианты или функциональные эквиваленты и составные белки (Гикюп рго1е1ик), кодируемые нуклеиновой кислотой, как описано здесь, например δΝΌΗηί белки, мутантные формы δΝΌΗηί белков, составные белки и т.п.

Функциональные эквиваленты полипептидов, как проиллюстрировано здесь, также могут быть частью настоящего изобретения и определены на основе аминокислотных последовательностей согласно настоящему изобретению посредством добавления, вставки, делеции и/или замещения одного или более аминокислотного остатка таких последовательностей, где такие производные предпочтительно сохраняют Ь-сорбозондегидрогеназную активность, измеряемую с помощью аналитического подхода, известного в данной области или специально описанного здесь. Такие функциональные производные можно получать либо с помощью химического синтеза пептидов, известного в данной области техники, либо с помощью рекомбинантных подходов на основе последовательностей ДНК, раскрытых здесь, с помощью способов, известных на данном уровне развития техники. Аминокислотные замены в белках и пептидах, которые не изменяют значительно активность таких молекул, известны.

Рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению можно конструировать для экспрессии δΝΌΗηί белков в подходящем микроорганизме. Например, белок согласно изобретению можно экспрессировать в бактериальных клетках, таких как штаммы, относящиеся к родам С1исоиоЬас1ег, С1исоиасе1оЬас1ег или Асе1оЬас1ег. Экспрессирующие векторы, применимые в настоящем изобретении, включают векторы хромосомного, эписомного и вирусного происхождения, т. е. векторы-производные бактериальных плазмид, бактериофага и векторы-производные их сочетаний, такие как полученные из генетических элементов плазмиды и бактериофага, такие как космиды и фагемиды.

Вставка ДНК может быть связана на оперативном уровне с соответствующим промотором, который может быть как конститутивным, так и индуцируемым промотором. Специалист в данной области знает, как выбирать нужные промоторы. Экспрессирующие конструкции могут содержать участки инициации транскрипции, ее терминации и, в районе, подвергаемом транскрипции, участок связывания рибосом для осуществления трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемая конструкциями, может предпочтительно включать инициирующий кодон у начала и стоп-кодон, правильным образом расположенный на конце полипептида, предназначенного для трансляции.

ДНК векторы можно ввести в подходящие клетки хозяина с помощью общепринятых техник трансформации или трансфекции. Как применяется здесь, термины «трансформация», «трансконъюгация» и «трансфекция» относятся к разнообразию известных в данной области приемов для введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку хозяина, включая соосаждение с фосфатом кальция или хлоридом кальция, трансфекцию, опосредованную ДЭАЭ-декстраном, трансдукцию, инфекцию, липофекцию, трансфекцию, опосредованную катионным липидом, или электропорацию. Подходящие способы трансформации или трансфекции клеток хозяина можно найти у 8атЬгоок, е1 а1. (кирга), Όηνίκ е1 а1., Вак1с Мейюйк ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1986) и в других лабораторных руководствах.

Для того, чтобы идентифицировать и отобрать клетки, которые интегрировали чужеродную ДНК в свой геном, вместе с рассматриваемыми генами в клетки хозяина обычно вводят маркеры отбора (например, устойчивости к антибиотикам). Предпочтительные маркеры отбора включают те, которые придают устойчивость к лекарствам, таким как канамицин, тетрациклин, ампициллин и стрептомицин. Нуклеиновую кислоту, кодирующую маркер отбора, предпочтительно вводят в клетку хозяина в составе того же вектора, что и последовательность, кодирующую белок согласно изобретению, или вводят в составе отдельного вектора, такого как, например, суицидальный вектор, который не может реплицироваться в клетке хозяина. Клетки, устойчиво несущие введенную нуклеиновую кислоту, можно идентифицировать с помощью отбора на антибиотиках (т.е. клетки, которые включают маркер отбора, выживут, в то время как другие погибнут).

Изобретение предоставляет также изолированный полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью согласно ПОСЛ. № 2, или аминокислотной последовательностью, полученной посредством экспрессии полинуклеотида согласно настоящему изобретению, такого как, например, полинуклеотидная последовательность согласно ПОСЛ. № 1, в подходящем хозяине.

Полипептиды согласно изобретению могут содержать только консервативные замещения одной или более аминокислоты в аминокислотной последовательности согласно ПОСЛ. № 2 или замещения, вставки или делеции несущественных аминокислот. Соответственно, несущественной аминокислотой является остаток, который можно заменить в аминокислотной последовательности согласно ПОСЛ. № 2, без значительного изменения биологической функции. Например, предсказано, что аминокислотные остатки, являющиеся консервативными среди белков настоящего изобретения, в особой степени не подвержены изменению. Далее, представляется маловероятным, что аминокислоты, являющиеся консервативными среди белков настоящего изобретения и других δΝΟΗπί белков, подвержены изменению.

Термин «консервативное замещение» означает замещение, при котором аминокислотный остаток

- 18 012165 заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. В данной области техники известны семейства, которые включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин и гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Как отмечено выше, полинуклеотиды согласно настоящему изобретению можно применять для генетической модификации подходящей клетки хозяина, чтобы сделать ее лучше и более эффективной для ферментации, например процесса прямой ферментации с получением витамина С.

Поэтому изобретение также относится к одновременному (сопутствующему) применению гена, кодирующего ΞΝΌΗαί белок или его активный фрагмент или производное, и гена, кодирующего полипептид, обладающий СМС или СДЦ активностью, или активный фрагмент или его производное, для получения рекомбинантной клетки хозяина. Такая клетка хозяина затем продемонстрирует улучшенную способность прямо продуцировать витамин С.

Изменение генома микроорганизма можно получить, например, с помощью замещения посредством одинарного или двойного кроссинговера последовательности ДНК дикого типа последовательностью ДНК, содержащей изменение. Для удобного отбора трансформантов микроорганизма с изменением в геноме изменение может быть, например, последовательностью ДНК, кодирующей маркер устойчивости к антибиотикам или ген, дополняющий возможную ауксотрофность микроорганизма. Мутации включают, но не ограничиваются этим, делеции и вставки.

Изменение генома микроорганизма, приводящее к более функциональному полипептиду, можно также получить с помощью случайного мутагенеза генома микроорганизма с применением, например, химических мутагенов, радиации или транспозонов и последующего отбора или скрининга мутантов, которые лучше или более эффективно продуцируют один или более продукт ферментатации. Стандартные способы скрининга и отбора известны специалисту в данной области.

В отдельном осуществлении требуется вывести из строя (кпоскои!) или подавить репрессор ΞΝΌΗαί гена согласно настоящему изобретению, например, так что экспрессия гена репрессора искусственно подавлена, чтобы улучшить выход, выработку и/или эффективность продукции продукта ферментации при введении в подходящие клетки хозяина. Способы, осуществления нокаута, а также микроорганизмы, несущие такие подавленные гены, хорошо известны в данной области. Как применяется здесь, «подавление экспрессии гена» включает полное или частичное подавление, а также подавление в определенных условиях, а также подавление экспрессии одного или двух аллелей.

Стратегии вышеупомянутого мутагенеза для ΞΝΌΗαί белков могут приводить к повышенным выходам желаемого соединения, в частности витамина С. Этот список не должен быть ограничивающим; варианты стратегий мутагенеза очевидны специалисту в данной области. С помощью таких механизмов молекулы нуклеиновой кислоты и белка согласно настоящему изобретению можно применять для получения микроорганизмов, таких как С1исоиоЬас1ег охубапк или родственные штаммы бактерий, экспрессирующие мутантные молекулы ΞΝΌΗαί нуклеиновой кислоты и белка, так что выход, продукция и/или эффективность продукции желаемого соединения, такого как витамин С, улучшены.

Молекулы нуклеиновой кислоты, полипептиды, векторы, праймеры и рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, можно применять для одного или более следующих подходов: идентификация С1исопоЬас1ег охубапк и родственных организмов; картирование геномов организмов, родственных С1исоиоЬас1ег охубапк; идентификация и локализация рассматриваемых последовательностей С1исопоЬас1ег охубапк; эволюционные исследования; определение районов ΞΝΌΗηί белка, необходимых для его функции; изменение активности или функции δΝΌΗηί белка; изменение активности ΞΝΌΗηί пути и изменение клеточной продукции желаемого соединения, такого как витамин С.

Активность δΝΌΗηί пептида можно определять способами, известными в данной области и далее проиллюстрированными здесь.

Для того, чтобы проиллюстрировать изобретение более детально, здесь предоставлены несколько примеров, где работа с генами, выбранными из СМС или СДЦ генов, проиллюстрирована более детально. Для специалиста в данной области будет очевидно, как выбрать другие гены, кодирующие белки, выбранные из СДЦ или СМС, и работать с ними согласно пояснениям, предоставленным здесь, чтобы получить микроорганизм, продуцирующий витамин С с улучшенным выходом.

Для того, чтобы предоставить дополнительные указания по вышеописанному способу, приведена следующая таблица, где более детально показано, как манипулировать отдельными генами, выбранными из СДЦ и СМС генов. Здесь выражения «вверх» и «вниз» относятся к предпочтительной повышенной экспрессии или пониженной экспрессии белков, соответственно, как это может быть достигнуто посредством повышающей регуляции или понижающей регуляции соответствующих генов, соответственно. Такие же результаты можно получить, когда активность соответствующих белков увеличена или понижена любым другим способом, отличным от генетической манипуляции.

- 19 012165

Имя; полипеитнд/ген ПОСЛ №	Сходство с	вверх	вниз
СМС 02 ; 124/125	НАД(Ф)-зависимая Ц-сорбит дегидрогеназа		X
СМС 03; 128/129	НАД(Ф)-зависимая Ц-сорбит дегидрогеназа		X
СМС 04; 132/133	НАД(Ф)-Н-зависимая редуктаза Ьсорбозы		X
СМС 05; 44/45	НАД(Ф)-зависимая Ь-сорбозон дегидрогеназа		X
СМС 12; 136/137	Мембрано-связанная дегидрогеназа Ьсорбозы	X
СМС 13; 140/141	Мембрано-связанная ПХХ-зависимая Эсорбит-дегидрогеназа, субъединица А	X
СМС 14; 144/145	Мембрано-связанная ПХХ-зависимая □сорбит дегидрогеназа, субъединица В	X
СДЦ 21; 180/181 СДЦ 22; 184/185 СДЦ 23; 188/189 СДЦ 24; 192/193 СДЦ 25; 196/197	Белки, вовлеченные в биосинтез ПХХ	X

Специалист в данной области поймет, как усилить и/или улучшить активность белка, как, например, 8ΝΌΗ;·ιί или алкогольдегидрогеназы. Этого можно достигнуть посредством генетической модификации организма хозяина таким образом, что он продуцирует больше или более стабильные копии упомянутого белка, чем организм дикого типа. Это также может быть достигнуто посредством увеличения специфической активности белка.

В следующих абзацах описаны способы, как достигнуть этой цели, например увеличение выхода и/или продукции витамина С, который прямо производится из Ό-сорбита или Ь-сорбозы посредством увеличения (повышающей регуляции) активности специфического белка, например 8ΝΌΗ;·ιί. Эти подходы применяют ти1аШ ти1апйЦ для сходных СДЦ и СМС белков, чьи функции по сравнению с представителем дикого типа должны быть усилены или улучшены.

Модификации с целью получить организм, продуцирующий больше копий 8ΝΌΗηί гена, т.е. сверхэкспрессирующий ген и/или белок, могут включать применение сильных промоторов или мутации (например, вставки, делеции или точечной мутации) (части) 8ΝΌΗ;·ιί гена или его регуляторных элементов. Это может также включать вставку множественных копий гена в подходящий микроорганизм. Увеличения специфической активности 8ΝΌΗ;·ιί белка также можно достигнуть с помощью способов, известных в данной области. Такие способы могут включать мутацию (например, вставку, делецию или точечную мутацию) (частей) 8ΝΌΗ;·ιί гена.

Мутацией, как применяется здесь, может быть любая мутация, приводящая к более функциональному или стабильному полипептиду, например более функциональным или более стабильным продуктам 8ΝΌΗ;·ιί гена. Это может включать, например, изменение генома микроорганизма, которое улучшает синтез 8ΝΌΗ;·ιί или приводит к экспрессии 8ΝΌΗηί белка с измененной аминокислотной последовательностью, чья функция по сравнению с представителем дикого типа, не обладающим измененной аминокислотной последовательностью, улучшена или усилена.

Вмешательство может происходить на уровне транскрипции, трансляции или после транскрипции.

Также известными в данной области являются способы увеличения активности данного белка за счет приведения 8ΝΌΗ;·ιί белка в контакт со специфическим усилителем или другими веществами, которые специфически взаимодействуют с 8ΝΌΗ;·ιί белком. Для того, чтобы идентифицировать такие специфические усилители, 8ΝΌΗ;·ιί белок можно экспрессировать и тестировать на активность в присутствии соединений, предположительно усиливающих активность 8ΝΌΗ;·ιί белка. Активность 8ΝΌΗηί белка можно также увеличить посредством стабилизации мРНК, кодирующей 8ΝΌΗηί. Такие способы также известны в данной области, см., например, у 8атЬгоок е1 а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог Рге§8, Ν. Υ.; апй Аи8иЬе1 е1 а1. (ейд), 1995, Сиггеп! РгоФсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1окп Айеу & 8оп§, Ν. Υ.).

- 20 012165

Термин «увеличение активности», как применяется здесь, означает увеличение активности одного или более полипептидов в продуцирующем организме, которые, в свою очередь, кодируются соответствующими полинуклеотидами, описанными здесь. Имеется большое число способов, доступных в данной области, чтобы добиться увеличения активности данного белка, в данном случае 3ΝΌΗ;·ιί. Обычно можно увеличить специфическую активность белка или можно увеличить число копий белка. Термин «увеличение активности» или эквивалентные выражения также означают ситуацию, где активность 8ΝΌΗ;·ιί белка введена в клетку, которая не обладала такой активностью ранее, например, посредством введения гена, кодирующего 3ΝΌΗ;·ιί. в клетку, которая не содержала эквивалента этого гена ранее или которая не могла экспрессировать активную форму соответствующего белка ранее.

Для облегчения такого увеличения число копий гена, соответствующего полинуклеотидам, описанным здесь, можно увеличить. С другой стороны, можно применить сильный промотор для управления экспрессией полинуклеотида. В другом осуществлении промотор, регуляторный район и/или участок связывания рибосомы выше расположения гена можно изменить для увеличения экспрессии. Экспрессию также можно усилить или увеличить посредством увеличения относительного времени полужизни мРНК. В другом осуществлении активность самого полипептида можно увеличить посредством применения одной или более мутаций аминокислотной последовательности полипептида, что увеличивает активность. Например, изменение относительной Кт полипептида для соответствующего субстрата приведет к увеличенной активностью. Подобным образом, относительное время полужизни полипептида можно увеличить. В любом случае, как при усилении экспрессии гена, так и при увеличении специфической активности улучшения можно достигнуть посредством изменения состава клеточной культуральной среды и/или способов, применяемых для культивации.

«Усиленная экспрессия» или «улучшенная активность», как применяется здесь, означает увеличение хотя бы на 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200 или даже более чем на 500%, по сравнению с белком, полинуклеотидом, геном дикого типа или активностью и/или концентрацией белка, имеющимися до того, как полинуклеотиды или полипептиды были усилены и/или улучшены. Активность 8ΝΌΗ;·ιί белка можно также усилить посредством приведения белка в контакт со специфическим или общим усилителем его активности.

В других случаях, раскрытых здесь, активность СМС или СДЦ полипептида требуется уменьшить или устранить, чтобы выход витамина С, который прямо продуцируется из Ό-сорбита или Ь-сорбозона, дополнительно увеличился.

Следующие подходы, относящиеся к уменьшению (понижающей регуляции) активности СМС 05 белка, применяют ιηιιΐηΐίκ пнПапйЕ для СМС и СДЦ белков, в частности таковых, проиллюстрированных здесь, чьи функции по сравнению с соответствующими представителями дикого типа следует уменьшить.

Для упрощения такого уменьшения число копий генов, соответствующих полинуклеотидам, описанным здесь, можно уменьшить, например, посредством пониженной экспрессии или повреждения гена. Ген называется «экспрессируемым на низком уровне», если уровень транскрипции упомянутого гена уменьшен по сравнению с геном дикого типа. Это можно измерить, например, с помощью блот-анализа (№г111егп Ыо1) с оценкой количества мРНК в качестве индикации экспрессии гена. Как применяется здесь, ген экспрессируется на низком уровне, если количество образуемой мРНК уменьшено хотя бы на 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 или 100% относительно количества мРНК, образуемого для гена дикого типа. С другой стороны, можно применять слабый промотор для управления экспрессией полинуклеотида. В другом осуществлении промотор, регуляторный район и/или участок связывания рибосомы выше расположения гена можно изменять для достижения пониженной экспрессии. Экспрессию также можно уменьшить посредством уменьшения относительного времени полужизни ткРНК.

В другом осуществлении активность самого полипептида можно уменьшить посредством применения одной или более мутации гена, кодирующего полипептид, приводящей к одной или более мутации аминокислотной последовательности полипептида, которая уменьшает активность. Например, изменение сродства полипептида к соответствующему субстрату может приводить к уменьшенной активности. Подобным образом, можно уменьшить относительное время полужизни полипептида.

В любом случае, как при уменьшении экспрессии гена, так и при уменьшении активности уменьшение может быть достигнуто посредством изменения состава клеточной культуральной среды и/или способов, применяемых при культивировании. «Уменьшенная экспрессия» или «уменьшенная активность», как применяется здесь, означает уменьшение хотя бы на 5, 10, 25, 50, 75 или 100% по сравнению с белком, полинуклеотидом или геном дикого типа. Активность данного белка также можно уменьшить посредством приведения белка в контакт со специфическим или общим ингибитором его активности. Термины «уменьшенная активность», «уменьшенная или уничтоженная активность» применяются здесь взаимозаменяемо.

Для улучшения продукции витамина С в определенной рекомбинантной клетке хозяина экспрессию СМС 05 гена можно ингибировать в таком организме, например, выбирая нуклеотидные последовательности, комплементарные регуляторному району СМС 05 нуклеотидной последовательности (например, СМС 05 промотор и/или усилитель) для образования тройных спиральных структур, которые предотвращают транскрипцию СМС 05 гена в клетках мишени. См., в основном, Не1епе, С. (1991) ЛпЕсапсеЮгидОек.

- 21 012165 (6): 569-84; Не1епе, С. е( а1. (1992) Апп. Ν. Υ. Асаб. δα. 660: 27-36, и Макет, Ь.Е (1992) Вюаззауз 14 (12): 807-15.

Ингибирования или предотвращения экспрессии гена также можно достигнуть с помощью модификации СМС 05 гена, например, посредством введения одной или более мутации в СМС 05 ген, где упомянутая модификация приводит к СМС 05 белку с функцией, которая значительно уменьшена по сравнению с белком дикого типа.

Мутация, как применяется здесь, может быть мутацией, приводящей к менее функциональному или нестабильному полипептиду, например менее функциональным или нестабильным продуктам СМС 05 гена. Это может включать, например, изменение в геноме микроорганизма, которое мешает синтезу СМС 05 или приводит к экспрессии СМС 05 белка с измененной аминокислотной последовательностью, функция которого по сравнению с белком дикого типа, обладающим неизмененной аминокислотной последовательностью, полностью или частично нарушена. Вмешательство может происходить на уровне транскрипции, трансляции или после трансляции.

Изменение в геноме микроорганизма можно получить, например, посредством замены с помощью одинарного или двойного кроссинговера последовательности ДНК дикого типа последовательностью ДНК, содержащей изменения. Для удобного отбора трансформированных микроорганизмов с изменением в геноме это изменение может быть, например, последовательностью ДНК, кодирующей маркер устойчивости к антибиотикам или ген, дополняющий возможную ауксотрофность организма. Мутации включают, но не ограничиваются этим, делеции и вставки. Пример такого изменения включает повреждение гена, например возмущение гена таким образом, что продукт, который обычно продуцируется этим геном, не продуцируется в функциональной форме. Это может происходить из-за полной делеции, делеции или вставки маркера отбора, вставки маркера отбора, делеции со сдвигом рамки считывания, делеции в рамке считывания или точечной мутации, которая приводит к преждевременной терминации. В некоторых из этих случаев мРНК гена отсутствует целиком, в других случаях количество продуцированной мРНК варьирует. Во всех случаях полипептид, кодируемый упомянутым геном, не продуцируется в функциональной форме либо отсутствует, либо присутствует в мутированной форме, такой как, например, белок, обладающий уменьшенной активностью, как определено здесь.

Изменение в геноме микроорганизма, приводящее к менее функциональному или нефункциональному полипептиду, можно также получить с помощью случайного мутагенеза генома микроорганизма с применением, например, химических мутагенов, радиации или транспозонов и последующего отбора или скрининга мутантов, которые лучше или более эффективно продуцируют один или более продукт ферментации. Стандартные способы скрининга и отбора известны специалисту в данной области.

В отдельном осуществлении требуется вывести из строя (подвергнуть нокауту) СМС 05 ген согласно настоящему изобретению, например, когда экспрессия этого гена искусственно подавлена, чтобы улучшить выход, продуктивность и/или эффективность продукции продукта ферментации витамина С в соответствующей клетке хозяина. Способы, осуществления нокаута, а также микроорганизмы, несущие такие подавленные гены, хорошо известны в данной области. Подавление эндогенного СМС 05 гена можно индуцировать посредством удаления хотя бы части гена или его регуляторного района. Как применяется здесь, «подавление экспрессии гена» включает полное или частичное подавление, а также подавление в специфических условиях и также подавление экспрессии одного либо обоих аллелей.

Для того, чтобы создать нокаут-микроорганизм, у которого экспрессия СМС 05 гена искусственно подавлена, во-первых, СМС 05 ген можно клонировать и затем можно построить вектор для гомологичной рекомбинации с применением гена, чтобы инактивировать эндогенный СМС 05 ген у организма мишени. Вектор для гомологичной рекомбинации в таком случае содержит последовательность нуклеиновой кислоты, созданную для инактивации эндогенного СМС 05 гена у организма мишени. Такая нуклеиновая кислота может быть, например, нуклеотидной последовательностью СМС 05 гена или его регуляторного района, такого как существующий фланкирующий район гена, который следует инактивировать (ίη С15). или существующий независимо район (ίη 1гап5). содержащий хотя бы частичную делецию, или, альтернативно, это может быть последовательность нуклеиновой кислоты СМС 05 гена или его регуляторного района, содержащая другие гены. В качестве гена, который вставляют в СМС 05 ген или его регуляторный район, предпочтительно выбирают ген, который может также выступать в роли маркера. Гены для вставки, которые следует применять, включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, как определено выше. Нет никакого особого ограничения по положению, куда можно вставлять гены в СМС 05 ген, настолько, насколько вставка приводит к подавлению экспрессии эндогенного СМС 05 гена у мишени. Во избежание противоположного действия вставки, можно внести молчащие делеции, не нарушающие рамки считывания, с применением, например, засВ системы или ПЦР с протяженными фланкирующими гомологиями (1опд-£1апктд 1юто1оду РСК). Эти техники хорошо известны специалисту в данной области.

Вышеупомянутые стратегии мутагенеза для СМС 05 белков могут приводить к увеличенным выходам желаемого соединения, в частности витамина С. Этот список не является ограничивающим; варианты стратегий мутагенеза вполне очевидны для любого специалиста в данной области. С помощью этих механизмов молекулы нуклеиновых кислот и белков изобретения можно применять для получения мик

- 22 012165 роорганизмов, таких как С1исопоЬас1ег охубапк или родственные штаммы бактерий, экспрессирующих мутантные молекулы СМС 05 нуклеиновой кислоты или белка, так что выход, продуктивность и/или эффективность продукции желаемого соединения, такого как витамин С, улучшены.

В других случаях, раскрытых здесь, активность СМС или СДЦ полипептидов следует увеличить, чтобы выход витамина С, который прямо продуцируется из Ό-сорбита или Ь-сорбозы, дополнительно увеличился.

Также особенно хорошие результаты получены, когда рекомбинантный организм, усиленно экспрессирующий §N0^1, трансформировали таким способом, что эндогенный ген СМС 05 (ПОСЛ. № 44), кодирующий НАД(Ф)-зависимую сорбозондегидрогеназу (ПОСЛ. № 45), подвергается нокауту согласно примерам 15-19.

Также особенно хорошие результаты получены, когда рекомбинантный организм, усиленно экспрессирующий δΝΟΗηί. трансформировали таким способом, что ген СДЦ 21 (ПОСЛ. № 180), кодирующий белок (ПХХ А), вовлеченный в биосинтез ПХХ (ПОСЛ. № 181), усиленно экспрессируется согласно примерам 20 и 21.

Данное изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Содержание всех ссылок, патентных заявок, патентов и опубликованных патентных заявок, процитированных в настоящей заявке, таким образом включено посредством ссылки.

Примеры

Пример 1. Получение хромосомной ДНК и амплификация фрагмента ДНК с помощью ПЦР.

Хромосомную ДНК С1нсопоЬас1ег охубапк Э8М 17078 получают из клеток, выращенных при 30°С в течение 1 дня в жидком бульоне с маннитом (МБ), содержащем 25 г/л маннита, 5 г/л дрожжевого экстракта (ОгГсо) и 3 г/л бактопептона (Эбсо) по способу, описанному в 8атЬгоок е1 а1. (1989) «Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1/8есопб ЕбШоп», Со1б 8рппд ИагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк.

Фрагменты ДНК получены с помощью ПЦР с хромосомной ДНК, полученной, как описано выше, и набором праймеров РГ (ПОСЛ. № 3) и Рг (ПОСЛ. № 4). Для проведения реакции применяют набор для ПЦР с высокой надежностью Ехрапб Ηί§1ι Е1бе1йу РСК кй (Воске П1адпокйск) и 10 нг хромосомной ДНК в общем объеме 100 мкл в соответствии с приложенной к набору инструкцией, чтобы получить ПЦР продукт, содержащий δΝΩΗηί последовательность ДНК (ПОСЛ. № 1). ПЦР продукт выделяют из реакционной смеси и правильность его последовательности подтверждают.

Пример 2. Получение витамина С из Ь-сорбозона с применением покоящихся клеток, выращенных на агаризованном бульоне с маннитом.

Штаммы ΙΕΘ 3293, 3292, 3244, 3260, 3266, 3287, 3259, 13693 и 13773, а также Асе1оЬас1ег кр. АТСС 15164 и С1нсопоЬас1ег охубапк Э8М 17078, производные штамма ΙΕΘ 3293, применены для продукции витамина С из Ь-сорбозона.

Штаммы ΙΕΘ 13693 и ΙΕΘ 13773 выращивают при 27°С в течение 3 дней на среде № 350, содержащей 5 г/л бактопептона (ОгГсо), 5 г/л дрожжевого экстракта (ОгГсо), 5 г/л глюкозы, 5 г/л маннита, 1 г/л МдЗО^ЩО, 5 мл/л этанола и 15 г/л агара. Все другие штаммы Асе1оЬас1ег и все штаммы С1нсопоЬас1ег выращивают при 27°С в течение 3 дней на агаризованном бульоне с маннитом (МБ), содержащем 25 г/л маннита, 5 г/л дрожжевого экстракта (Эйсо ЬаЬогакпек, Пейой, Мюй., И8А), 3 г/л бактопептона (Эйсо) и 18 г/л агара (Эбсо).

Клетки соскребают с агаровых слоев, суспендируют в дистиллированной воде и применяют в реакциях с покоящимися клетками, проводимых при 30°С в течение 20 ч в пробирках на 5 мл на качалке при 230 об./мин. Реакционные смеси (0,5 мл) содержат 1% Ь-сорбозон, 0,3% №С1, 1% СаСО₃ и клетки при конечной концентрации 10 ед. поглощения при 600 нм (ΟΌ₆₀₀). По окончании инкубационного периода реакционные смеси анализируют с помощью жидкостной хроматографии с высоким разрешением (ЧРЬС) с применением системы Ащ1еп1 1100 ЧРЬС (Ащ1еп1 ТесЬпо1од1ек, ^йтшдоп, И8А) с колонкой Ь1СЬгокрЬег-100-ВР18 (125x4,6 мм) (Мегск, ОагткЮбк Сегтапу), соединенной с колонкой Аттех-ИРХ78Η (300x7,8 мм) (Вюгаб, Вешасй, 8\\'Нхег1апб). Подвижной фазой является 0,004М серная кислота, и скорость тока составляет 0,6 мл/мин. Два сигнала регистрируют с помощью УФ-детектора (длина волны 254 нм) в сочетании с детектором показателя преломления. Дополнительно, идентификацию витамина С проводят с применением аминоколонки (УМС-Раск Ро1уатше-П, УМС, 1пс., Куо1о, барап) с детекцией в УФ при 254 нм. Подвижной фазой служит смесь 50 мМ NΗ₄Η₂ΡΟ₄ и ацетонитрила (40:60).

Система Ащ1еп1 8епек 1100 ЭТЬС-масс-спектрометр (МС) применяется для идентификации витамина С. Масс-спектрометр применяют в режиме для положительного иона с применением электроспрея. Разделение проводят с помощью колонки ^υNА-С8(2) (100x4,6 мм) (Ркепотепех, Тоггапсе, И8А). Подвижной фазой является смесь 0,1% муравьиной кислоты с метанолом (96:4). Витамин С элюируют со временем удержания 3,1 мин. Идентичность витамина С подтверждают с помощью времени удержания и молекулярной массы соединения.

Чтобы исключить присутствие Ό-изоаскорбиновой кислоты, идентификацию витамина С дополнительно проводят по времени удержания с применением аминоколонки (УМС-Раск Ро1уатте-П, УМС, 1пс., Куо1о, барап) с детекцией в УФ при 254 нм. Подвижной фазой является смесь 50 мМ ΝΗ^+Ο/ΐ и ацетонитрила (40:60).

Штаммы С1нсопоЬас1ег и Асе1оЬас1ег продуцируют витамин С из Ь-сорбозона, как показано в табл. 1.

- 23 012165

Таблица 1

Продукция витамина С из Ь-сорбозона

Штамм	Витамин С (мг/л)
С. оху^ат 1РО 3293	1740
С. охуНат Ό8Μ 17078	570
О. охуНапз ΙΡΟ 3292	410
С. οχγάαηί ΙΡΟ 3244	1280
С. /гаТеигп ΙΡΟ 3260	50
Ст. сег'шиз ΙΡΟ 3266	140
С. охуНат ΙΡΟ 3287	60
А. асеИ тиЬзр. Ог1еапих ΙΡΟ 3259	30
А. асеН 5иЬ.5р. ХуНпит ΙΡΟ 13693	40
А. жеН хиЬхр. ХуНпит ΙΕΟ 13693	120
Асе(оЬас!ег φ. АТСС 15164	310
Контроль	Не определяется

Контроль: реакцию проводят в реакционной смеси без клеток.

Пример 3. Получение витамина С из Ь-сорбозы и Ό-сорбита при ферментации в пробирке и в колбе.

Клетки С. охуйапк Ό8Μ 17078 применяют для инокуляции 4 мл жидкой среды № 3ΒΌ и культивируют в пробирке (диаметром 18 мм) при 30°С в течение 3 дней на качалке при 220 об./мин. 20 мг/л витамина С набирается к концу периода инкубации.

Клетки штамма Ό8Μ 17078 культивируют (с тройным повтором) в 50 мл среды № 5, содержащей 100 г/л Ό-сорбита, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (ОгТсо), 2,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 15 г/л СаСО₃ в качалочной колбе с отбойниками на 500 мл при 30°С на качалке при 200 об./мин. Через 72 ч инкубации количество витамина С, измеряемое с помощью НРЬС в трех колбах, составило 400, 500 и 650 мг/л.

Пример 4. Получение витамина С из Ό-сорбита при ферментации с подпиткой.

Клетки С. охуйапк Ό8Μ 17078 выращивают в 200 мл среды № 5, содержащей 100 г/л Ό-сорбита, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (Р1ика ВюСкет1ка, Вискк, §^Й7ег1апй), 2,5 г/л Мд§О₄-и 15 г/л СаСО₃ в качалочной колбе с отбойниками на 2 л при 30°С на качалке при 180 об./мин. Через 48 ч инкубации 150 мл среды применяют для инокуляции биореактора на 10 л (В. Вгаип ΕΌ10, Ме1§ипдеп, Сегтапу), предварительно подготовленного к работе с 5,3 л среды, содержащей 20 г/л Ό-сорбита, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (Р1ика ВюСкет1ка, Вискк, 8\\Цхег1апй) и 2,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О, и снабженного сенсорами температуры, рН и растворенного кислорода и петлями контроля. Температуру поддерживают при 30°С, рН поддерживают на 6,0 с помощью добавления 28% раствора аммиака, поток воздуха составляет 4,5 л/мин, и растворенный кислород поддерживают на уровне 30% с помощью регулировки скорости перемешивания (минимум, 300 об./мин). Через 6 ч процесса подают раствор сорбита (500 г/л) со скоростью 25 г/ч в течение 44 ч. Через 96 ч процесса в супернатанте остается около 1% субстата и продуцируется 950 мг/л витамина С.

Пример 5. Получение витамина С из Ь-сорбозона и Ь-сорбозы с помощью фракции клеточных мембран.

Клетки С. охуйапк Ό8Μ 17078 культивируют в 100 мл жидкой среды № 3ВО в качалочной колбе с отбойниками при 30°С на качалке при 200 об./мин в течение 3 дней. Получившуюся культуру центрифугируют при 500 об./мин для удаления СаСОз. Супернатант, получаемый на этом этапе, центрифугируют при 5000 об./мин для осаждения клеток. Собранные клетки суспендируют в 3 мл 50 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,0) и клетки далее разрушают посредством двух пассов через ячейку пресса Френча (8ΙΜΛΜΙΝί'Ό 8ре1гошс ШкйитеШк, И8А) при давлении 900 ρκί (фунт на квадратный дюйм). Полученный гомогенат вначале центрифугируют при 5000 об./мин для удаления клеточных обломков. Затем супернатант разводят до конечной концентрации белка 3 мг/мл. Такой разведенный образец называют бесклеточным экстрактом (БКЭ). БКЭ центрифугируют при 100000 х д в течение 60 мин. Супернатант отбрасывают и осадок собирают в качестве мембранной фракции.

Реакцию (200 мкл) с мембранной фракцией (100 мкл) проводят в 50 мМ калийфосфатном буфере (рН 7,0) при перемешивании при 220 об./мин в течение 15 ч. Субстратами для тестирования являются Ьсорбозон (конечная концентрация 1%) и Ь-сорбоза (конечная концентрация 2%). Конечная концентрация белка, применяемая при реакции, составляет 1,5 мг/мл. К концу периода инкубации получено 680 мг/л и 10 мг/л витамина С из 1% Ь-сорбозона и 2% Ь-сорбозы, соответственно.

Пример 6. Получение витамина С из Ό-сорбита, Ь-сорбозы или Ь-сорбозона с применением покоящихся клеток, выращенных на агаризованной среде 3ВО.

Клетки С. охуйапк Ό8Μ 17078 выращивают при 27°С в течение 3 дней на агаризованной среде 3ВО,

- 24 012165 содержащей 70 г/л Ь-сорбозы, 0,5 г/л глицерина, 7,5 г/л дрожжевого экстракта (Ойсо), 2,5 г/л ΜдδΟ₄·7Н₂Ο, 10 г/л СаСОз и 18 г/л агара (Ь|Гсо). Реакции с покоящимися клетками (1 мл реакционной среды в пробирке на 10 мл) проводят с 2% Ό-сорбитом, 2% Ь-сорбозой или 1% Ь-сорбозоном при 30°С в течение 24 ч, как описано в примере 2. Штамм Ь5>М 17078 продуцирует 280, 400 и 1780 мг/л витамина С из Ό-сорбита, Ь-сорбозы и Ь-сорбозона, соответственно.

Другие реакции (0,5 мл реакционной смеси в пробирке на 10 мл) проводят с клетками Ь5>М 17078, выращенными на агаризованной среде 3ΡΌ, в реакционных смесях, содержащих 2% Ό-сорбит, 2% Ь-сорбозу или 1% Ь-сорбозон в течение 2 дней, как описано в примере 2. Штамм Ь8М 17078 продуцирует 1,8, 2,0 и 5,1 г/л витамина С из Ό-сорбита, Ь-сорбозы и Ь-сорбозона, соответственно.

Реакцию с применением клеток С. охубапк ΙΡΟ 3293 проводят с 2% Ь-сорбозоном, как описано выше. Штамм ΙΡΟ 3293 продуцирует 5,7 г/л витамина С за 2 дня.

Пример 7. Получение витамина С из Ό-сорбита с применением покоящихся клеток, выращенных в жидкой среде.

Клетки С. охубапк Ь8М 17078 выращивают в 200 мл среды № 5, содержащей 100 г/л Ό-сорбита, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (Р1ика ВюСйет1ка, Висйк, 8^11хег1апб), 2,5 г/л МдЕЮ^Н^ и 15 г/л СаСО₃ в качалочной колбе с отбойниками на 2 л при 30°С на качалке при 180 об./мин. Через 24 ч культуру центрифугируют при 3220 д (ЕррепбогГ 5810В, НатЬигд, Сегтапу) и клетки ресуспендируют в 0,9% растворе №С1, опять центрифугируют при 3220 д и осадок клеток применяют для инокуляции одной качалочной колбы с отбойниками на 500 мл, содержащей 50 мл полной среды роста (100 г/л Ό-сорбита, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта, 2,5 г/л Мд^^Н^ и 15 г/л СаСО₃) и другой качалочной колбы с отбойниками на 500 мл, содержащей 50 мл среды продукции (100 г/л Ό-сорбита, 3 г/л №С1, 10 г/л СаСО₃). Исходная плотность клеток, измеренная по оптической плотности при 600 нм (ΟΌ₆₀₀) в обеих колбах, составляет 10. Обе колбы инкубируют при 30°С на качалке при 180 об./мин. Через 48 ч клеточные суспензии в среде роста и в среде для продукции накапливают 1,06 и 1,18 г/л витамина С, соответственно. Никакого дополнительного роста в течение периода инкубации не наблюдается.

Пример 8. Блот-анализ по Саузерну (8ои1йетп Ь1о! апа1ук1к) бактерий, продуцирующих витамин С из Ь-сорбозона.

Хромосомную ДНК получают из клеток С1исопоЬас!ег охубапк ΙΡΟ 3293, ΙΡΟ 3292, ΙΡΟ 3244, ΙΡΟ 3287, С1исопоЬас!ег Гга1еигп ΙΡΟ 3260 и ΙΡΟ 3265, С1исопоЬас!ег сеппик ΙΡΟ 3266 и ΙΡΟ 3269, Асе!оЬас!ег асеб киЬкр. ог1еапик ΙΡΟ 3259, Асе!оЬас!ег асеб киЬкр. хубпит ΙΡΟ 13693 и ΙΡΟ 13773, Асе!оЬас!ег кр. АТСС 15164 и ЕксйепсЫа соб К-12. Штаммы ΙΡΟ 13693 и ΙΡΟ 13773 выращивают при 27°С в течение 3 дней на среде № 350, содержащей 5 г/л бактопептона (Обсо), 5 г/л дрожжевого экстракта (Обсо), 5 г/л глюкозы, 5 г/л маннита, 1 г/л Мд^^Н^, 5 мл/л этанола и 15 г/л агара. Все другие штаммы Асе!оЬас!ег и все штаммы С1исопоЬас!ег выращивают при 27°С в течение 3 дней на агаризованном бульоне с маннитом (МБ), содержащем 25 г/л маннита, 5 г/л дрожжевого экстракта (Обсо ЬаЬога1опек, Оебой, М1сй., И8А), 3 г/л бактопептона (О1£со) и 18 г/л агара (Обсо). Е. сой К-12 выращивают на агаризованной среде Луриа-бульон (ЬВ). Препараты хромосомной ДНК применяют для проведения гибридизации по Саузерну в жестких условиях. Препараты хромосомной ДНК обрабатывают рестриктазой СЫ (для анализа района Ν-домена) или ЕсоЫ (для анализа района С-домена) и 1 мкг фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза на агарозном геле (1% агарозы). Гель обрабатывают 0,25н. НС1 в течение 15 мин и затем 0,5н. NаΟН в течение 30 мин и затем подвергают блоттингу с найлоновой мембраной при помощи аппарата Уасиит В1ойет Мобе1 785 (ВЮ-ВАО ЬайогаЮпек АС, 8\\йхег1апб) согласно приложенной к аппарату инструкции. Пробы готовят с помощью набора ПЦР для внесения метки ОЮ (РСВ-ОЮ 1аЬе1тд кй (Восйе О1адпокбск)) с помощью набора праймеров, как описано в табл. 2. ПЦР продукт П1 соответствует району δΝΌ^ί, относящемуся к Ν-домену (вероятно, трансмембранный домен), в то время как ПЦР продукт П2 соответствует району δΝΌ^ί, относящемуся к С-домену (вероятно, основной район дегидрогеназы).

Таблица 2

Праймеры, применяемые при ПЦР для получения меченых проб для гибридизации по Саузерну

Набор праймеров	ПОСЛ№№ праймеров	ПЦР продукт	Ожидаемый размер ПЦР продукта (Ьр)
8ΝΟΗ1Ρ и 8ΝΟΗ420Β	5 и 6	П1	420
8ΝΌΙΙ501Γ и 8ΝΟΗ2364Β	7 и 8	П2	1864
8ΝΌΗ501Ρ и 8ΝΌΗ1530Β	7и9	пз	1030
8ΝΟΗ1391Ρ и 8ΝΟΗ2364Β	10и8	П4	974

Табл. 2 показывает результаты экспериментов по блот-гибридизации по Саузерну. При гибридизации с пробой П1 (Ν-домен) наблюдаются ясные положительные полосы для С. охубапк ΙΡΟ 3293, ΙΡΟ 3292, ΙΡΟ 3244, ΙΡΟ 3287 и А. кр. АТСС 15164. При гибридизации с пробой П2 (С-домен) наблюдаются ясные

- 25 012165 положительные полосы для штаммов ΙΡΘ 3293, ΙΡΘ 3292, ΙΡΘ 3244, ΙΡΘ 3287 и А. кр. АТСС 15164, в то время как слабые полосы наблюдаются для штаммов ΙΡΘ 3260, ΙΡΘ 3265, ΙΡΘ 3266, ΙΡΘ 3269 и ΙΡΘ 13773. Контрольный штамм, Е. сой К-12, не демонстрирует различимых сигналов ни для одного из доменов.

Таблица 3

Детекция сигналов гибридизации у различных штаммов, полученная с помощью гибридизации по Саузерну с пробами для Ν- и С-доменов δΝΏΗαί (пробы П1 и П2)

Штамм Ш Π2

С. охуНапз ΙΓΟ 3293	4-
С. охуНат ΙΡΟ 3292	+	+
б, охуНагк ΙΕΟ 3244	+	+
С. /гагеигН ΙΕΟ 3260	но	сл
(3 /га1еигИ ΙΡΟ 3265	но	сл
б. сегтиз ΙΡΟ 3266	но	сл
б. туНапх ΙΡΟ 3269	но	сл
(3. охусЗапх ΙΡΟ 3287	+	+
А. асеН хиЬхр. огЗеапих ΙΡΟ 3259	но	но
А. асеН зиЬхр. хуНпит ΙΡΟ 13693	но	но
А. асеН аиЬ$р. хуНпит ΙΡΟ13773	но	сл
Асе/оЬас1ег зр. АТСС 15164	+	+
Е. соП К-12	но	но

сл - следы; но - не обнаружено. Пробы П1 и П2 синтезированы (в виде ΌΙΟ-меченных продуктов ПЦР) с помощью наборов праймеров, приведенных в табл. 2.

Пример 9. ПЦР-амплификация и секвенирование ортологов δΝΌΗαί гена из С1нсопоЬас1ег охуйапк Ό8Μ 17078.

Препараты хромосомной ДНК (полученные, как описано в примере 8) применяют в качестве матриц для ПЦР с четырьмя наборами праймеров, приведенными в табл. 2. От 5 до 100 нг хромосомной ДНК применяет на каждую реакцию (общий объем 50 мкл). Если не оговорено обратное, применяют систему для ПЦР Ехрапй Ηί§1ι Р1йе1йу РСК (Иосйс П1адпокйск). Условия проведения ПЦР следующие: инкубация при 94°С в течение 2 мин; 30 циклов (1) этапа денатурации при 94°С в течение 15 с; (2) этапа прилегания комплементарных цепочек при 60°С в течение 30 с; (3) этапа синтеза при 72°С в течение от 45 до 120 с (время этапа синтеза для наборов праймеров П1, П2, П3 и П4 составляет 45, 120, 90 и 90 с, соответственно); завершающего этапа при 72°С в течение 7 мин.

Образцы реакций ПЦР разделяют с помощью электрофореза на агарозном геле и полосы обнаруживают при просвечивании после окраски этидий бромидом. Результаты реакций ПЦР суммированы в табл. 4.

Таблица 4

Детекция продуктов ПЦР П1, П2, П3 и П4 у различных штаммов, полученных с наборами праймеров, приведенными в табл. 2 (продукты наблюдали с помощью электрофореза на агарозном геле)

Штамм	П1	П2	ПЗ	П4
О. охуНапх ΙΡΟ 3293	+	+*	на	+
С. охусЗапв ΙΕΟ 3292		НО	но	+
С. охуНапх ΙΡΟ 3244	+	+	+	+
б. ]га1еигИ ΙΡΟ 3260	но	но	но	НО
б. ееппих ΙΡΟ 3266	но	но	но	но
б. схуНапв ΙΡΟ 3287	+	+	но	+
А. асеН хиЬхр. ог1еапих ΙΡΟ 3259	но	но	но	но
А. асеН хиЬхр. хуНпит ΙΡΟ 13693	но	но	но	но
А. асеН хиЬвр. хуНпит ΙΡΟ 13773	но	но	но	но
АееЗоЬас1ег $р. АТСС 15164	+	+	но	но
Е. СО//К-12	но	но	на	но

- 26 012165 + - присутствует; но - не обнаруживается; на - не анализировали.

* - эту ПЦР проводят с системой для ГЦ-обогащенной ПЦР (СС-псй РСК куйет, Косйе П1адпойюк) с таким же реакционным циклом, как применяется для системы ПЦР с высокой надежностью (Ехрапб Ηί§1ι Р1бе1йу РСК).

Когда на агарозном геле наблюдаются ясные полоски ПЦР продуктов (табл. 4), ПЦР продукты прямо применяются для секвенирования нуклеотидов с помощью стандартных способов. Нуклеотидные последовательности, полученные для различных ПЦР продуктов, и соответствующие аминокислотные последовательности сравнивают с последовательностью в полную длину ΞΝΟΗηί гена и белка из С. охубапк Ό8Μ 17078.

Ортолог δΝΩΗαί из С1исопоЬас!ег охубапк ΙΕΘ 3292

Продукт ПЦР (около 1 кб), полученный при амплификации с праймерами 8ΝΏΗ1391Ε (ПОСЛ. № 10) и 8ΝΌΗ2364Κ (ПОСЛ. № 8) и хромосомной ДНК из С. охубапк ΙΕΘ 3292 в качестве матрицы, применяют для секвенирования с праймером 8ΝΏΗ1391Ε (ПОСЛ. № 10). Определенная нуклеотидная последовательность из 771 пар оснований (ПОСЛ. № 11) демонстрирует 98,7% (761/771) гомологии с нуклеотидами 1431-2201 последовательности ΞΝΟΗηί из С. охубапк Ό8Μ 17078 (ПОСЛ. № 1). Выведенная из нее аминокислотная последовательность из 256 аминокислотных остатков (ПОСЛ. № 12) демонстрирует 100% идентичность с аминокислотами 478-733 аминокислотной последовательности 8ΝΏΗ из С. охубапк Ό8Μ 17078 (ПОСЛ. № 2).

Ортолог δΝΩΗαί из С1исопоЬас!ег охубапк ΙΕΘ 3287

Продукт ПЦР (около 0,4 кб), полученный при амплификации с праймерами 8ΝΏΗ1Ε (ПОСЛ. № 5) и 8ΝΏΗ420Κ (ПОСЛ. № 6) и хромосомной ДНК из С. охубапк ΙΕΘ 3287 в качестве матрицы, применяют для секвенирования с праймером 8ΝΏΗ420Κ (ПОСЛ. № 6). Определенная нуклеотидная последовательность из 350 пар оснований (ПОСЛ. № 13) демонстрирует 97,4% (341/350) гомологии с нуклеотидами 31380 последовательности ПОСЛ. № 1. Выведенная из нее аминокислотная последовательность из 116 аминокислотных остатков (ПОСЛ. № 14) демонстрирует 100% идентичность с аминокислотами 11-126 последовательности ПОСЛ. № 2.

Продукт ПЦР (около 1,9 кб), полученный при амплификации с праймерами 8ΝΌΗ501Ε (ПОСЛ. № 7) и 8ΝΏΗ2364Κ (ПОСЛ. № 8), применяют для секвенирования с праймером 8ΝΏΗ501Ε (ПОСЛ. № 7). Определенная нуклеотидная последовательность из 808 пар оснований (ПОСЛ. № 15) демонстрирует 98,0% (745/808) гомологии с нуклеотидами 578-1385 последовательности ПОСЛ. № 1. Выведенная из нее аминокислотная последовательность из 268 аминокислотных остатков (ПОСЛ. № 16) демонстрирует 100% идентичность с аминокислотами 194-461 ПОСЛ. № 2.

Продукт ПЦР (около 1 кб), полученный при амплификации с праймерами 8ΝΌΗ1391Ε (ПОСЛ. № 10) и 8ΝΌΗ2364Κ (ПОСЛ. № 8), применяют для секвенирования с праймером 8ΝΌΗ1391Ε (ПОСЛ. № 10). Определенная нуклеотидная последовательность из 800 пар оснований (ПОСЛ. № 17) демонстрирует 98,8% (790/800) гомологии с нуклеотидами 1469-2268 последовательности ПОСЛ. № 1. Выведенная из нее аминокислотная последовательность из 266 аминокислотных остатков (ПОСЛ. № 18) демонстрирует 100% идентичность с аминокислотами 491-756 ПОСЛ. № 2.

Ортолог δΝΩΗαί из Асе!оЬас!ег кр. АТСС 15164

Продукт ПЦР (около 0,4 кб), полученный при амплификации с праймерами 8ΝΏΗ1Ε (ПОСЛ. № 5) и 8ΝΌΗ420Κ (ПОСЛ. № 6) и хромосомной ДНК из А. кр. АТСС 15164 в качестве матрицы, применяют для секвенирования с праймером 8ΝΏΗ420Κ (ПОСЛ. № 6). Определенная нуклеотидная последовательность из 360 пар оснований (ПОСЛ. № 19) демонстрирует 97,8% (352/360) гомологии с нуклеотидами 31390 последовательности ПОСЛ. № 1. Выведенная из нее аминокислотная последовательность из 120 аминокислотных остатков (ПОСЛ. № 20) демонстрирует 100% идентичность с аминокислотами 11-130 ПОСЛ. № 2.

Продукт ПЦР (около 1,9 кб), полученный при амплификации с праймерами 8ΝΌΗ501Ε (ПОСЛ. № 7) и 8ΝΏΗ2364Κ (ПОСЛ. № 8), применяют для секвенирования с праймером 8ΝΏΗ501Ε (ПОСЛ. № 7). Определенная нуклеотидная последовательность из 760 пар оснований (ПОСЛ. № 21) демонстрирует 98,0% (745/760) гомологии с нуклеотидами 563-1322 ПОСЛ. № 1. Выведенная из нее аминокислотная последовательность из 252 аминокислотных остатков (ПОСЛ. № 22) демонстрирует 100% идентичность с аминокислотами 189-440 ПОСЛ. № 2.

Ортолог δΝΩΗαί из С1исопоЬас!ег охубапк ΙΕΘ 3244

Полную нуклеотидную последовательность гена ортолога δΝΏΗαί из С. охубапк ΙΕΘ 3244 определяют с применением продуктов ПЦР, полученных с хромосомной ДНК из С. охубапк ΙΕΘ 3244 в качестве матрицы и следующими наборами праймеров: 8ΝΏΗ1Ε (ПОСЛ. № 5) и 8ΝΏΗ420Κ (ПОСЛ. № 6); 8ΝΏΗ501Ε (ПОСЛ. № 7) и 8ΝΏΗ1530Κ (ПОСЛ. № 9); 8ΝΏΗ1391Ε (ПОСЛ. № 10) и 8ΝΏΗ2364Κ (ПОСЛ. № 8); 8ΝΏΗ382 (ПОСЛ. № 23) и 8ΝΏΗ1530Κ (ПОСЛ. № 9); 8ΝΏΗ1Ε (ПОСЛ. № 5) и 8ΝΌΗ689Κ (ПОСЛ. № 24). Хромосомную ДНК, обработанную рестриктазами ВдШ и ВатШ и лигированную, применяют для еще двух ПЦР со следующими наборами праймеров: 8ΝΌΗ420Κ (ПОСЛ. № 6) и 8ΝΏΗ501Ε (ПОСЛ. № 7) и 8ΝΏΗ1530Κ (ПОСЛ. № 9) и Ι8-50.3 (ПОСЛ. № 25). Полная нуклеотидная последовательность демонстрирует 98.4% гомологии с нуклеотидной последовательностью ΞΝΟΗηί из С. охубапк Ό8Μ 17078

- 27 012165 (ПОСЛ. № 1). Выведенная из нее аминокислотная последовательность (ПОСЛ. № 27) демонстрирует 100% идентичность с аминокислотной последовательностью ПОСЛ. № 2.

Пример 10. Увеличенная продукция витамина С из Ь-сорбозона с помощью увеличения дозировки δΝΟΗηί гена.

Ген ΞΝΟΗηί с фланкирующими районами до и после амплифицируют с помощью ПЦР с хромосомной ДНК из штамма Ό8Μ 17078 в качестве матрицы и набором праймеров Ν1 (ПОСЛ. № 28) и Ν2 (ПОСЛ. № 29).

ПЦР проводят с системой ГЦ-обогащенного ПЦР (СС-псй РСК 5У51ет (Косйе О1адпо8Йс8)) согласно инструкциям поставщика. Амплифицированный фрагмент ДНК вставляют в вектор рСК2.1-ТОРО (Шуйтодеп, Сат1§Ьаб, СА, И8А). Получившуюся плазмиду далее обрабатывают рестриктазами ΗίηάΙΙΙ и ХйоЬ Полученный фрагмент НшбШ-Хйоф включающий 8ΝΩΗηί ген, лигируют в вектор рУК100 (доступный в коллекции Атепсап Туре СиЙиге Со11есПоп, са1а1од по. АТСС 37156), предварительно обработанный ΗίηάΙΙΙ и ХйоЬ Смесь после лигирования применяют для трансформации Е. сой ТС1. Нужную плазмиду, названную рУК-Р-8ЫОНа1-Т, выделяют из Е. сой и вводят в С. охубапз штамм Ό8Μ 17078 посредством электропорации с помощью стандартных способов (Е1есйосе11 ташрЫаЮг ЕСМ600, ВТХ Шс., 8ап О1едо, СА, И8А).

Клетки С. охубапк штаммов Ό8Μ 17078 и Ό8Μ 17078, несущие плазмиду рУК-Р-8ИОНа1-Т, культивируют в 50 мл среды № 5, содержащей 100 г/л Ό-сорбита, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (О1£со), 2,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 15 г/л СаСО₃ в качалочной колбе с отбойниками на 500 мл при 30°С на качалке при 200 об./мин. Через 48 ч культивации количества витамина С, измеряемые в супернатанте с помощью НРЬС, в двух колбах составляют 110 и 200 мг/л, соответственно.

Пример 11. Получение витамина С из Ь-сорбозона или Ό-сорбита покоящимися клетками рекомбинантных микроорганизмов с увеличенной дозировкой гена δΝΩΗηί.

Ген 8ΝΩΗηί из С. охубапк Ό8Μ 17078 (ПОСЛ. № 1) с фланкирующими районами до и после амплифицировали с помощью ПЦР с хромосомной ДНК из штамма Ό8Μ 17078 в качестве матрицы и набором праймеров Ν1 (ПОСЛ. № 28) и Ν2 (ПОСЛ. № 29).

ПЦР проводят с системой ГЦ-обогащенного ПЦР (СС-псй РСК 5у51еш (Косйе О1адпо511с5)) согласно инструкциям поставщика. Амплифицированный фрагмент ДНК вставляют в вектор рСК2.1-ТОРО (Шуйтодеп, СатИЬаб, СА, И8А). Получившуюся плазмиду далее обрабатывают рестриктазами ΗίπάΙΙΙ и ХйоЬ Полученный фрагмент НШбШ-Хйоф включающий 8ΝΩΗηί ген, лигируют в вектор рУК100 (доступный в коллекции Атепсап Туре СиЙите Со11ес11оп, са1а1од по. АТСС 37156), предварительно обработанный НшбШ и ХйоЬ Смесь после лигирования применяют для трансформации Е. сой ТС1. Нужную плазмиду, названную рУК-Р-8ЫЭНа1-Т, выделяют из Е. сой и вводят в С. охубапз штамм Ό8Μ 17078 посредством электропорации с помощью стандартных способов (Е1ес(госе11 ташри1а1ог ЕСΜ600, ВТХ Шс., 8ап О1едо, СА, И8А).

Три независимых трансформанта, названных Ό8Μ 17078(рУК-Р-8ИОНа1-Т) клонами 1, 2 и 3, вместе в родительским штаммом С. охубапк Ό8Μ 17078 выращивают раздельно на агаризованных средах № 3ΒΌ и ΜΒ. Клетки соскребают с чашек и применяют для реакций с покоящимися клетками (1% Ь-сорбозон в качестве субстрата), как описано в примере 9. После выращивания на агаре № 3ΒΌ по результатам анализа с покоящимися клетками штамм Ό8Μ 17078 продуцирует 2,5 г/л витамина С, в то время как штаммы Ό8Μ 17078(рУК-Р-8ИОНа1-Т) клоны 1, 2 и 3 продуцируют 4,2, 4,1 и 4,2 г/л витамина С, соответственно. После выращивания на МБ агаре по результатам анализа с покоящимися клеток штамм Ό8Μ 17078 продуцирует 0,12 г/л витамина С, в то время как штаммы Ό8Μ 17078(рУК-Р-8ИОНа1-Т) клоны 1, 2 и 3 продуцируют 1,8, 2,5 и 0,94 г/л витамина С, соответственно.

Другую реакцию проводят с применением клеток С. охубапк Ό8Μ 17078 и клона 2 (см. выше), культивированных в 50 мл среды № 5 (100 г/л Ό-сорбита, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта, 2,5 г/л Μд8О₄·7Η₂О и 15 г/л СаСО₃) с двумя повторами в качалочных колбах с отбойниками на 500 мл при 30°С на качалке при 220 об./мин в течение 3 дней. Из одной колбы для каждого штамма получающийся бульон центрифугируют при 500 об./мин для удаления СаСО₃. Супернатант после этого этапа затем центрифугируют при 5000 об./мин для осаждения клеток. Собранные клетки ресуспендируют в 10 мл 0,9% раствора №1С1 и опять центрифугируют при 5000 об./мин для осаждения клеток. Собранные клетки ресуспендируют в воде и применяют для инокуляции 1 мл среды для продукции (20 г/л Ό-сорбита, 3 г/л ЫаС1, 10 г/л СаСО₃) в пробирке на 10 мл при конечной плотности покоящихся клеток, соответствующей 5 ед. оптической плотности при 600 нм. Через 20 ч реакции при 30°С и 220 об./мин супернатант, отобранный из емкости для продукции, содержит 360 и 760 мг/л витамина С, соответственно, для штаммов Ό8Μ 17078 и Ό8Μ 17078, сверхэкспрессирующего δΝΌΜπί. В противоположность этому, супернатант, отобранный через 72 ч из оставшейся среды роста, содержит 0 и 440 мг/л витамина С, соответственно.

Пример 12. Получение витамина С из Ь-сорбозона в покоящихся клетках Е. сой.

Ген 8ИОНа1 без стоп-кодона, названный 8ИОНа1-1, соответствующий нуклеотидам 1-2364 (ПОСЛ. № 1), амплифицируют на хромосомной ДНК из штамма Ό8Μ 17078 с помощью ПЦР (Косйе Н1дй Б1бе1йу 1<ίΙ), применяя пару праймеров δΝΌΜηί-Ν^ (ПОСЛ. № 30) и δΝΌΜπίΜίδ-Χ (ПОСЛ. № 31).

Амплифицированную ДНК клонируют в рСК2.1-ТОРО (Шуйтодеп, СатИЬаб, СА, И8А) для получения рСК2.1-ТОРО-8ИОНа1-1, где правильность последовательности 8ИОНа1 подтверждают с помощью

- 28 012165 секвенирования. Затем δΝΩΗαί-Ι ген вырезают с помощью ΝάθΙ и ХНо1 и лигируют между участками ΝάθΙ и ХНо1 в рЕТ-21Ь(+) (Νοναβοη. Майкоп. VI. И8А) для получения ρΕΤΣΙό-δΝΩΗαίΗίδ: 6хН18 добавлены к С-концу δΝΩΗαί. Плазмиду ρΕΤ2№-8ΝΌΗαίΗίδ вводят в Е. сой ВЬ21 (ΌΕ3).

мл ночной культуры Е. сой ВЬ21 (ΌΕ3)/ρΕΤ2№-8ΝΏΗαίΗίδ в среде ЬВ с 50 мг/мл карбенициллина инокулируют в 200 мл такой же среды. Клетки культивируют при 230 об./мин при 37°С в течение 2 ч. затем индуцируют с помощью 1 мМ 1РТС и продолжают культивировать при 230 об./мин при 25°С в течение 3 ч. Получившуюся культуру центрифугируют и промывают дважды физиологическим раствором и осадок клеток ресуспендируют в 2 мл воды. Клетки далее применяют в реакции с покоящимися клетками в реакционной смеси (500 мкл в пробирке на 5 мл). содержащей клетки при оптической плотности 10. 1% моногидрат сорбозона. 5 мкМ ПХХ. 5 мМ МдС1₂. 0.3% №С1 и 1% СаСО₃. проводимой при 30°С в течение 15 ч. Через 15 ч инкубации продуцируется 0.14 г/л витамина С. Когда реакцию с покоящимися клетками проводят с 1 мкМ ПХХ (остальные условия такие же. как описанные выше). 0.05 г/л витамина С продуцируется через 3 ч инкубации.

Пример 13. Получение витамина С из Ό-сорбита покоящимися клетками рекомбинантных микроорганизмов с увеличенной дозировкой гена 8ΝΩΗαί.

Клетки С. охуйапк Ό8Μ 17078. избыточно экспедирующие 8ΝΩΗηί. выращивают в 50 мл среды № 5. содержащей 100 г/л Ό-сорбита. 0.5 г/л глицерина. 15 г/л дрожжевого экстракта (Ийка ВюС’Неппка. Вис115. 8\\'Цхег1апй). 2.5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 15 г/л СаСО₃ в качалочной колбе с отбойниками на 500 мл при 30°С на качалке при 180 об./мин в течение 48 ч. Получившуюся суспензию клеток применяют для инокуляции биореактора на 2 л. называемого емкостью для роста (ВюЧа1-МЭ. В. Вгаип Мекшщеп. Мекшщеп. Сегтапу). содержащего 1.25 л среды. состоящей из 100 г/л Ό-сорбита. 15 г/л дрожжевого экстракта (Ийка ВюСНеппка. Вис115. 8\\'Цхег1апй). 2.5 г/л Мд8О₄-7Н₂О. 0.3 г/л КН₂РО₄ и 0.12 г/л Са8О₄. Клетки культивируют при 30°С. скорости аэрации 1 л/мин. рН поддерживаемом на уровне 5.7 с помощью раствора №ьСО₃. содержании растворенного кислорода. поддерживаемом на уровне 10% насыщения посредством изменения скорости перемешивания. Через 24 ч плотность клеток. измеряемая в единицах оптического поглощения при 600 нм. составляет 20. В этот момент в емкость роста подают подпитывающий раствор. содержащий 100 г/л Ό-сорбита. 15 г/л дрожжевого экстракта (Ийка ВюС’Неппка. ВисШ. 8\\'йхег1апй). 2.5 г/л Мд8О₄-7Н₂О. 0.3 г/л КН₂РО₄ и 0.12 г/л Са8О₄. со скоростью 125 мл/ч и бульон постоянно собирают при скорости отбора 125 мл/ч. Таким образом. объем среды в емкости для роста поддерживается постоянным и равняется 1.25 л. Другие параметры процесса поддерживаются на тех же уровнях. как описано выше.

Эту культуральную среду постоянно подают со скоростью 125 мл/ч во второй реактор. называемый емкостью для продукции. заполненный 5 л среды продукции. содержащей 100 г/л Ό-сорбита. 0.3 г/л №1С1 и 0.12 г/л Са8О₄. и температуру поддерживают при 30°С. рН при 7.0 с помощью 20% раствора №1ОН. Скорость аэрации поддерживают постоянной на 10 л/мин и содержание растворенного кислорода поддерживают на уровне 20% насыщения посредством изменения скорости перемешивания. Среду продукции такого же состава постоянно подают в емкость для продукции со скоростью подачи 375 мл/ч. Объем в емкости поддерживают постоянным на 5 л посредством постоянного отбора супернатанта со скоростью 500 мл/ч. получаемого в виде профильтрованного потока из модуля для ультрафильтрации с поперечным потоком с размером пор 500 кДа (иЕР-500-Е-9Л. Атегайат Вюкаепсек). через который прогоняют суспензию клеток. отбираемую из емкости продукции. с помощью насоса (МаЧегПех ритр) при скорости 50 л/ч. Удержанную суспензию подают с помощью насоса назад в емкость. Когда плотность клеток в емкости для продукции достигает 100 ед. оптической плотности при 600 нм. клетки начинают собирать из концентрированного потока клеток. текущего назад в емкость для продукции. со скоростью 25 мл/мин. чтобы поддерживать плотность клеток в этой емкости постоянной.

Отбираемый поток бесклеточного супернатанта содержит 4 г/л витамина С и постоянно подается со скоростью 500 мл/ч в емкость для сбора с двойной рубашкой при 30°С (Есо1ше К.е112. Ьаийа. ЬаийаКоепщШоГеп. Сегтапу). Из этой емкости постоянно подают супернатант в отсек разведения двухсекционной ячейки для электродиализа (кассета. содержащая 10 пар ячеек с катионообменными мембранами СМХ-8 и анионообменными мембранами Л8М. общая поверхность мембран 0.2 м². Еигой1а 1пйиЧпе5. Χνίδδοιίδ. Егапсе) со скоростью 180 л/ч и постоянный поток отбирают из емкости. чтобы поддерживать объем в ней постоянным на уровне 2 л. Из другой емкости с двойной рубашкой. исходно содержащей деионизованную воду при 30°С. куда постоянно подают свежую деионизованную воду со скоростью 62.5 мл/ч. постоянно отводят водный раствор в отсек с концентратом ячейки для электродиализа со скоростью 200 л/ч и откачивают из нее постоянный поток сбора. Подаваемые растворы нагнетают в кассету для электродиализа с помощью перистальтического насоса (7518-00. МаЧегПех. ϋδΆ). а рециркуляцию растворов в каждом отсеке для электродиализа производят с помощью ротационных насосов (МЭ-20. IVАК. Токуо. 1арап). Во время всего процесса к кассете для электродиализа прикладывают 14 В (источник питания ЕпМАТесН Т8001/5. 81. 1пдЬей. Сегтапу). Концентрация витамина С в потоке сбора составляет 16 г/л.

Пример 14. Очистка витамина С. продуцированного покоящимися клетками. с помощью этапов нисходящей обработки.

Поток сбора согласно примеру 13. содержащий 16 г/л витамина С. подают на связывающий носи- 29 012165 тель (хелатор) (АтЬегШе 1ВС 748, Войт апй Наак, РЫ1айе1рЫа, РА, И8А), чтобы убрать из потока двухвалентные катионы. Затем его собирают в охлажденной емкости (емкости подачи) и, когда набирается 10 л, их обрабатывают единовременно в ячейке для электродиализа с биполярной мембраной (кассета, содержащая 7 №окер!а ВР1/СМВ мембран, общая площадь мембран 0,14 м², Еигой1а 1пйик1пек,

Егапсе). Раствор пропускают со скоростью 200 л/ч через отсек подачи ячейки для электродиализа и собирают обратно в емкость подачи. Раствор из другой охлажденной емкости (емкости с концентратом), содержащей исходно 5 л раствора №1ОН (2 г/л), пропускают со скоростью 100 л/ч через отсек с концентратом электродиализной ячейки с биполярной мембраной. Прикладывая максимальное напряжение 25 В и максимальный электрический ток 20 А, переносят катионы натрия из отсека подачи в отсек с концентратом и таким образом натриевую форму витамина С, присутствующую в подаваемом потоке, переводят в соответствующую форму свободной кислоты. После достижения 90% выхода этого превращения процесс останавливают. В емкости с концентратом собирается 6 л раствора, содержащего 7,5 г/л №1ОН, в емкости для разведения 9 л раствора, содержащего 16 г/л витамина С в форме свободной кислоты и 1,6 г/л витамина С в форме натриевой соли далее пропускают через катионообменник (АтЬеййе ЕРС 21 Н, Войт апй Наак, РЫ1айе1рЫа, РА, И8А), чтобы увеличить выход превращения натриевой соли в форму свободной кислоты до приблизительно 99%. Альтернативно, 10 л раствора, содержащего 16 г/л витамина С в форме натриевой соли, поступившего с этапа электродиализа, прямо обрабатывают катионообменной смолой, превращая в свободную кислоту с выходом 99%. Поток витамина С в форме свободной кислоты, полученный по любому из способов, описанных выше, далее проводят через последовательность следующих этапов: анионообменник, обработка активированным углем, концентрирование, кристаллизация, фильтрация кристаллов и сушка. Окончательная чистота кристаллов составляет 98%, и выход достигаемый в результате всех этих этапов нисходящей обработки составляет 80%.

Пример 15. Получение хромосомной ДНК и амплификация СМС 05 фрагмента ДНК с помощью ПЦР. Хромосомную ДНК из С1исопоЬас1ег охуйапк Ό8Μ 17078 получают из клеток, культивированных при 30°С в течение 1 дня на бульоне с маннитом (МБ), состоящем из 25 г/л маннита, 5 г/л дрожжевого экстракта (Эйсо) и 3 г/л бактопептона (Ойсо) по способу, описанному в 8атЬгоок е1 а1. (1989) «Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1/8есопй Еййюп», Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк.

Фрагмент ДНК получают с помощью ПЦР с хромосомной ДНК, полученной, как описано выше, и набором праймеров Р£ (ПОСЛ. № 46) и Рг (ПОСЛ. № 47). Для проведения реакции применяют набор для ПЦР с высокой надежностью Ехрапй Нщй Е1йе1йу РСВ кй (Восйе В1адпокйск) и 10 нг хромосомной ДНК в общем объеме 100 мкл согласно инструкции поставщика, чтобы получить ПЦР продукт, содержащий последовательность ДНК СМС 05 (ПОСЛ. № 44). ПЦР продукт выделяют из реакционной смеси и правильность последовательности подтверждают.

Пример 16. Повреждение СМС 05 гена в О. охуйапк Э8М 17078.

ПЦР продукт, полученный по примеру 15, клонируют в Е. сой вектор рСВ2.1-ТОРО и трансформируют Е. со11 ТО1 для получения устойчивого к ампициллину (Ар¹) трансформанта, несущего рСВ2.1-8М8 05. Затем подвергают рСВ2.1-8М8 05 двум ПЦР реакциям: (1) ПЦР1 с набором праймеров Рктк5№ (ПОСЛ. № 78) и Рктк5№ (ПОСЛ. № 79) с получением фрагмента 8М85№-№ и (2) ПЦР2 с набором праймеров Рктк5С1 (ПОСЛ. №76) и Рктк5Со (ПОСЛ. № 77). Получившиеся два ПЦР продукта применяют для 3-й ПЦР реакции (ПЦР 3) с набором праймеров Рктк5№ и Рктк5Со с получением 8М85й№Со. Затем фрагменты обрабатывают рестриктазами РкП и НшйШ и лигируют с рК19тоЬкасВ (А. Рйй1ег е1 а1. Оепе 145, 69-73, 1994), обработанной РкП и НтйШ, и применяют для трансформации Е. сой ТО для получения устойчивых к канамицину (Кт^г) колоний, несущих рК19тоЬкасВ-й8М8 05. Плазмиду применяют для трансформации О. охуйапк Э8М 17078 с помощью электропорации.

Одну из Кт^г колоний высевают штрихом на чашках со средой МБ с канамицином, 50 мкг/мл (МК), и затем проверяют на устойчивость к канамицину и чувствительность к сахарозе на чашках с МК и МБ с 10% сахарозой (МСах), соответственно, чтобы подтвердить устойчивость к канамицину (Кт^г) и чувствительность к сахарозе (сахароза^к). Затем одну из колоний, устойчивых к канамицину и чувствительных к сахарозе, выращивают на чашке с агаром МБ и получившиеся растущие клетки соскребают, разводят нужным образом и рассевают на МБ агаре. Получившиеся 100 колоний высевают штрихом на чашках с агаром с МБ, МК и МСах, чтобы изолировать Кт^к сахароза¹ колонии. Один из получившихся штаммов называют О. охуйапк О8М 17078-й8М8 05.

Пример 17. Полученин витамина С из Ό-сорбита, Ь-сорбозы или Ь-сорбозона с применением покоящихся клеток, выращенных на агаризованной среде № 3ВО, содержащей 7% Ь-сорбозу.

Клетки О. охуйапк О8М 17078 и О. охуйапк О8М 17078- й8М8 05 выращивают при 27°С в течение 3 дней на агаризованной среде № 3ВО, содержащей 70 г/л Ь-сорбозы, 0,5 г/л глицерина, 7,5 г/л дрожжевого экстракта (О1£со), 2,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О, 10 г/л СаСО₃ и 18 г/л агара (Ойсо).

Клетки соскребают с агаровых слоев, суспендируют в дистиллированной воде и применяют в реакциях с покоящимися клетками, проводимых при 30°С на качалке при 220 об./мин. По окончании инкубационного периода реакционные смеси анализируют с помощью жидкостной хроматографии с высоким разрешением (НРЬС) по способу, описанному в примере 2.

Серию реакций с покоящимися клетками (0,5 мл реакционной среды в пробирках на 5 мл) проводят

- 30 012165 с 2% Ό-сорбитом или с 2% Ь-сорбозой, и все реакционные смеси дополнительно содержат 0,3% Ν;·ιί.Ί. 1% СаСОз и клетки в конечной концентрации 5 ед. оптического поглощения при 600 нм (ΘΌ₆₀₀). Через 20 мин инкубации С. охубапк Ό8Μ 17078 продуцируют 270 мг/л или 670 мг/л витамина С из 2% Ό-сорбита или 2% Ь-сорбозы, соответственно. Для сравнения, штамм С. охубапк Ό8Μ 17078-б8М8 05 продуцирует 1540 или 1990 мг/л витамина С, соответственно.

Пример 18. Одновременный мутагенез генов, кодирующих 5>ΝΌΗ;·ιί и СΜС 05, приводит к улучшенной продукции витамина С из Ь-сорбозона.

Плазмиду рУК-Р-8ХЭНа1-Т вводят в С. охубапк Ό8Μ 17078-68Μ8 05 с помощью электропорации. Клетки С. охубапк Ό8Μ 17078, С. охубапк Ό8Μ 17078-68Μ8 05 и С. охубапк Ό8Μ 17078-68Μ8 05/рУКР-8ХЭНа1-Т выращивают при 27°С в течение 3 дней на агаризованной среде № 3ВЭ, содержащей 70 г/л Ь-сорбозы, 0,5 г/л глицерина, 7,5 г/л дрожжевого экстракта (ОИсо), 2,5 г/л Μ§8Θ₄·7Η₂Θ, 10 г/л СаСО₃ и 18 г/л агара (ОИсо). Клетки соскребают с агаровых слоев, суспендируют в дистиллированной воде и применяют в реакциях с покоящимися клетками, проводимых при 30°С на качалке при 220 об./мин. Серию реакций с покоящимися клетками (0,5 мл реакционной среды в пробирках на 5 мл) проводят с 2% Ьсорбозоном в реакционных смесях, дополнительно содержащих 0,3% ЫаС1, 1% СаСО₃, инкубируют с клетками в конечной концентрации 5 ед. оптической плотности при 600 нм. По окончании периодов инкубации 5, 20 и 30 ч образцы реакционной смеси анализировали с помощью жидкостной хроматографии с высоким разрешением по способу, описанному в примере 2. Следующие концентрации витамина С замерены в супернатантах.

Штамм	Витамин С 1	мг/л)
	5 час	20 час	30 час
<3. охудапз О8М 17078	230	1100	1300
С. охуЗапв ОЗМ 17078-68М8 05	580	1800	3100
С. охуЖтв О8М 17078-65М8 05/ρνΚ-Ρ-8ΝΌΗ&ί-Τ	2800	6100	6800

Пример 19. Одновременный/сопутствующий мутагенез генов, кодирующих ΞΝΌΗηί и СΜС 05, приводит к улучшенной продукции витамина С из Ό-сорбита в жидких культурах.

Клетки С. охубапк Ό8Μ 17078, С. охубапк Ό8Μ 17078/рУК-Р-8ИОНа1-Т, С. охубапк Ό8Μ 1707868Μ8 05 и С. охубапк Ό8Μ 17078-68Μ8 05/рУК-Р-8ПОНа1-Т выращивают в 50 мл среды № 5, содержащей 100 г/л Ό-сорбита, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (Р1ика ВюСйет1ка, Висйк, З^И/ейапб), 2,5 г/л Μд8Ο₄·7Η₂Ο и 15 г/л СаСО₃ в качалочной колбе с отбойниками на 2 л при 30°С на качалке при 180 об./мин. Через 48 ч оптическую плотность ΘΌ₆₀₀ обеих культур замеряют и полученные величины применяют для расчета объема инокулята в двух других качалочных колбах для каждого штамма (опыт с двойным повтором), содержащих 50 мл среды № 5, чтобы получить во вторичной культуре после инокуляции стандартизованную оптическую плотность, соответствующую ΘΌ₆₀₀=0,12. Колбы инкубируют при 30°С на качалке при 180 об./мин. Через 48 и 96 ч отбирают образцы для анализа с помощью жидкостной хроматографии с высоким разрешением по способу, описанному выше. Следующие концентрации витамина С замерены в супернатантах.

Штамм	Витамин С (мг/л)
	48 час	96 час
С. пхуЗапз ОЗМ 17078	60	0
С. охуЛат ОЗМ 17078/рУК-Р-ЗМЭНаьТ	120	0
О. охусктз ОЗМ 17078-бЗМЗ 05	260	350
С. охуЗапз 1УЗМ 17078-бЗМЗ 05/ρνΚ-Ρ-8ΝΌΗαί-Τ	320	630

Пример 20. Повышенная экспрессия СДЦ 21 в С. охубапк Ό8Μ 17078 с применением интегративной системы.

Для повышенной экспрессии СДЦ 21 промотор СДЦ 21 можно заменить строгим конститутивным модифицированным промотором Ркпбй (ПОСЛ. № 204). Для достижения этого строят фрагмент ДНК с помощью ПЦР с протяженными фланкирующими гомологиями (Ьопд Иапкшд Ното1оду (ЬРН)-РСК), состоящий из участка из 500-Ьр (пар оснований) района выше СДЦ 21, кассеты генов устойчивости к канамицину, Ркпбй-промотора, добавленного к модифицированному участку связывания рибосомы, и первых 500-Ьр гена СДЦ 21. Для конструирования фрагмента ДНК вначале отдельные части амплифицируют с помощью набора для ГЦ-обогащенного ПЦР (СС-йсй РСК кй (Косйе Μο1еси1а^ ВюсйеткаП)). Район, расположенный выше СДЦ 21, амплифицируют с применением пары праймеров КС8 21 И8+1 (ПОСЛ. № 213) и Кт КС8 21 И8-1 (ПОСЛ. № 214, содержащая последовательность, комплементарную кассете устойчивости к канамицину в виде добавления на 5'-конце). Фрагмент промотора Ркпбй амплифицируют с применением пары праймеров Кт Ркпбй+1 (ПОСЛ. № 207, содержащая последовательность, комплементарную кассете устойчивости к канамицину в виде добавления на 5'-конце) и КС8 21 Ркпбй-1

- 31 012165 (ПОСЛ. № 217, содержащая последовательность, комплементарную СДЦ 01 в виде дополнения на 5'конце). Первые 500-Ьр гена СДЦ 21 амплифицируют с применением пары праймеров Ркпбй РС8 21+1 (ПОСЛ. № 215, содержащая комплементарную Ркпбй промотору дополнительную последовательность на 5'-конце) и РС8 21-1 (ПОСЛ. № 216). В этих случаях можно применять в качестве матрицы геномную ДНК из С. охубапк Ό8Μ 17078. Кассету устойчивости к канамицину амплифицируют с применением плазмиды рИС4К в качестве матрицы и пары праймеров Кт+1 (ПОСЛ. № 211) и Кт-1 (ПОСЛ. № 212). Условия ПЦР включают 35 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, прилегания комплементарных цепочек при 50°С в течение 30 с и наращивания цепочек при 72°С в течение 1 мин. Индивидуальные ПЦР фрагменты очищают на геле, смешивают и снова амплифицируют с применением пары праймеров РС8 21 и8+1/РС8 21-1, чтобы амплифицировать продукт в полную длину, где Ркпбй промотор помещается выше гена СДЦ 21. Условия ПЦР для второго круга реакции включают инкубацию при 94°С, 2 мин, затем 10 циклов (94°С, 30 с, 63°С, 30 с, 68°С, 6 мин), вслед за чем 20 циклов (94°С, 30 с, 63°С, 30 с, 68°С, 6 мин с дополнительными 20 с на цикл) и окончательное наращивание при 68°С в течение 10 мин.

ПЦР продукт прямо трансформируют в компетентные клетки С. охубапк Ό8Μ 17078 и трансформанты отбирают на агаризованном бульоне с маннитом, содержащем канамицин в конечной концентрации 50 мкг/мл. Можно наблюдать несколько возможных трансформантов, из которых несколько далее анализируют с помощью ПЦР, применяя пару праймеров РС8 21 И8+1/ЯС8 21-1, чтобы подтвердить, что фрагмент ДНК вставлен в геном посредством двойного кроссинговера. У штаммов, демонстрирующих правильный размер продукта ПЦР, этот продукт ПЦР секвенируют. Штаммы с правильной последовательностью названы О8М17078-РС8 21 ир1 и Э8М17078-РС8 21 ир2.

Пример 21. Одновременный мутагенез генов, кодирующих 8ΝΌΗηί и СДЦ 21, приводит к улучшенной продукции витамина С из Ό-сорбита.

Плазмиду рУК-Р-8МОНа1-Т вводят в С. охубапк Ό8Μ 17078 и С. охубапк Ό8Μ 17078-КС8 21 ир1 посредством электропорации. Клетки С. охубапк Ό8Μ 17078/рУК-Р-8ПВНа1-Т и С. охубапк Ό8Μ 17078РС8 21 ир1/рУК-Р-8ПВНа1-Т выращивают при 27°С в течение 3 дней на агаризованной среде 3ΒΌ, содержащей 70 г/л Ь-сорбозы, 0,5 г/л глицерина, 7,5 г/л дрожжевого экстракта (Эбсо). 2,5 г/л Μ§8Θ₄·7Η₂Θ, 10 г/л СаСО₃ и 18 г/л агара (Эбсо).

Клетки соскребают с агаровых слоев, суспендируют в дистиллированной воде и применяют в реакциях с покоящимися клетками, проводимых при 30°С на качалке при 220 об./мин. Серию реакций с покоящимися клетками (0,5 мл реакционной среды в пробирках на 5 мл) проводят с 2% Ь-сорбитом в реакционных смесях, дополнительно содержащих 0,3% ЫаС1, 1% СаСО₃, инкубируя с клетками в конечной концентрации ΘΌ₆₀₀= 5. Через 24 ч инкубации образцы из реакционных смесей анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения по способу, описаному в примере 2.

Супернатант реакционной смеси, инкубированной с клетками С. охубапк Ό8Μ 17078-РС8 21 ир1/рУК-Р-8МОНа1-Т, содержит не менее чем на 20% больше витамина С, чем супернатант из реакционной смеси, инкубированной с клетками С. охубапк Ό8Μ 17078/рУК-Р-8ПВНа1-Т.

Пример 22. Очистка 8ЫПНа1.

Клетки микроорганизма, способного продуцировать 8МОНа1, культивированные с помощью ферментации с подпиткой (условия культивации см. пример 3), суспендируют в 25 млм фосфатного буфера (20 мМ, рН 7,0), содержащего 2 мМ Μ§Ο₂, 1 мМ дитиотрейтол (ДТТ) и 2-3 таблетки свободных от ЭДТА ингибиторов протеаз (Косйе П1адпо8Йс8 СтЬН). Суспензию клеток 3 раза обрабатывают в ячейке пресса Френча. Затем к суспензии добавляют 25 мл фосфатного буфера (20 мМ, рН 7,0), содержащего 2 мМ Μ₈Ο₂ и 1М ЫаС1, и ультрацентрифугируют ее (30000 об./мин, 60 мин, 4°С). Осадок, содержащий фракцию мембран, промывают фосфатным буфером (20 мМ, рН 7,0), содержащим 2 мМ Μ₈Ο₂ и 500 мМ ЫаС1, и затем суспендируют в нужном количестве фосфатного буфера (20 мМ, рН 7,0), содержащего 2 мМ Μ₈Ο₂. Ν-Октилглюкозид (Р1ика) добавляют затем до конечной концентрации 2% (вес/объем) и суспензию инкубируют в течение 90 мин при осторожном перемешивании на льду. После центрифугирования (20000 об./мин, 60 мин, 4°С) прозрачный красноватый супернатант собирают и добавляют полиэтиленгликоль 6000 (Р1ика) до конечной концентрации 15% (вес/объем). После инкубации в течение 60 мин при 4°С при осторожном перемешивании с последующим центрифугированием (10000 об./мин, 30 мин, 4°С) осадок растворяют в Трис-буфере (20 мМ, рН 7,6), содержащем 2 мМ Μ₈Ο₂ и 0,5% (вес/объем) лаурилсульфобетаин (Р1ика). После осторожного перемешивания при 4°С в течение ночи раствор центрифугируют (20000 об./мин, 30 мин, 4°С). Супернатант собирают и далее очищают следующим образом.

Последующие этапы очистки проводят при 4°С с помощью системы АКТА Ехр1огег 10 8-5уЧет (Атегкйат Вюкаепсек) с программой υΝΙΡΘΡΝ 3.1. Обычные скорости тока для ионообменной хроматографии находятся в интервале 1-2 мл/мин. За элюцией белка следят при 280 нм и 8МОНа1-активные фракции определяют при помощи стандартного фотометрического анализа на всех стадиях очистки (см. ниже) или анализа продукта с очищенными фракциями.

Прозрачный супернатант IV обессоливают порциями по 2,5 мл на колонке для гель-фильтрации с 8ер11абех С 25 (пустой объем 2,5 мл), применяя 20 мМ Трис-НС1 буфер (рН 7,6), содержащий 2 мМ Μ§€1₂ и 0,5 % (вес/объем) лаурилсульфобетаин.

ЗМЭНаРположительные фракции объединяют и аликвоту (около 10 мл) помещают на колонку с

- 32 012165 сильным анионообменником (например, Мопо-Д НК, Атетзйат Вюзаепсез, объем колонки 8 мл), предварительно уравновешенную буфером А1 (10 мМ Трис, 10 мМ БисТрис, 10 мМ МЭС, 2 мМ МдС1₂, 0,5% лаурилсульфобетаин, рН 7,6). Несвязавшиеся белки элюируют 100% буфером А1 и после прохода 4 объемов колонки применяют линейный градиент рН в 6 объемах колонки до 100% буфера В1 (10 мМ Трис, 10 мМ БисТрис, 10 мМ МЭС, 2 мМ МдС1₂, 0,5 % лаурилсульфобетаин, рН 4,7), вслед за чем пропускают 8 объемов колонки 100% буфера В1. 5>ΝΌΗ;·ιί элюируется при рН приблизительно 6,5, что очень близко к значению р1, равному 6,52, рассчитанному по аминокислотной последовательности. Активные фракции объединяют, разводят равным объемом НЕРЕ8-буфера (50 мМ, рН 8,0), содержащего 2 мМ МдС1₂ и 0,5% лаурилсульфобетаин (конечный объем 15-20 мл), и наносят на другую колонку с сильным анионообменником (например, Мопо-Д НК, Атетзйат Вюзаепсез, объем колонки 1 мл), которая предварительно уравновешена буфером А2 (15 мМ НЕРЕ8, 2 мМ МдС1₂, 0,5% лаурилсульфобетаин, рН 7,6). Несвязавшиеся белки элюируют 100% буфером А2 и после прохода 4 объемов колонки применяют линейный солевой градиент в 20 объемах колонки до 40% буфера В2 (15 мМ НЕРЕ8, 2 мМ МдС1₂, 1М Ь1С1, 0,5% лаурилсульфобетаин, рН 7,6) и затем ступенчатый градиент до 100% буфера В2. δΝΏ^ί элюируется около 150 мМ Ь1С1. Активные фракции демонстрируют при гель-электрофорезе в присутствии ДСН одиночную полосу, соответствующую приблизительно 85 кДа.

Пример 23. Фотометрический анализ на активность 8АЬНа1.

Реакционная смесь для фотометрического измерения 8НЭНа1 активности состоит из 0,196 мМ хлорида тетразолия нитро-синего (ТНС) (АВТ), 0,137 мМ феназинметосульфата (ФМС), 20,4 мМ Ь-сорбозона и раствора фермента в конечном объеме 1,0 мл 0,1М фосфата натрия, рН 7,5. Реакцию начинают добавлением фермента и ферментативную активность измеряют в кювете с оптическим путем 1 см как начальную скорость восстановления ТНС при 570 нм (температура 25°С). 1 ед. ферментативной активности определена как количество фермента, катализирующее восстановление 1 мкМ ТНС в минуту. Коэффициент экстинкции для ТНС при рН 7,5 принят за 100 мМ^-1см^-1. Применяют два сорта кювет сравнения при определении активности: одна содержит вышеперечисленные компоненты, кроме Ь-сорбозона, и другая содержит все компоненты, кроме раствора фермента.

Пример 24. Анализ продукта на активность 8АЬНат

Чистые фракции, содержащие 8НЭНа1 (см. выше), прямо анализируют на продукцию Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона с помощью анализа следующего состава (общий объем 0,5 мл): 0,14 мг/мл очищенного и обессоленного 8АОНаВ 50 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), 8 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 100 мМ Ь-сорбозона, 1 мМ ФМС, 5 мМ СаС1₂, 50 мкМ ПХХ-К₂. Анализ проводят в подходящих пробирках при 25°С и достаточном перемешивании (900 об./мин на настольной качалке) в отсутствие света.

Образцы анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (НРЬС), применяя АД1еп1 1100 НРЬС (АД1еп( Тесйпо1оДез, УйттДоп, И8А) с колонкой ЫСНго5рНег-100-КР18 (125x4,6 мм) (Мегск, ОаттЧабк Сегтапу), соединенной с колонкой Атшех-НРХ-78Н (300x7,8 мм) (Вюгаб, КешасН, 8\\Цхег1апб). Подвижной фазой является 0,004М серная кислота, и скорость тока составляет 0,6 мл/мин. Два сигнала записывают с помощью УФ-детектора (длина волны 354 нм) в сочетании с детектором показателя преломления. Дополнительно, идентификацию Ь-аскорбиновой кислоты проводят с применением аминоколонки (ΥМС-Раск Ро1уатте-П, ΥМС, 1пс., Куо(о, 1арап) с детекцией в УФ при 254 нм. Подвижной фазой служит 50 мМ АН₄Н₂РО₄ с ацетонитрилом (40:60).

Пример 25. Наличие СМС и СДЦ генов и их эквивалентов в других организмах.

Присутствие СМС и СДЦ полинуклеотидных последовательностей и/или их эквивалентов, демонстрирующих сходство/идентичность с этими последовательностями, как описано в организмах, отличных от раскрытых здесь, можно определить посредством простого опыта по гибридизации ДНК. Геномную ДНК экстрагируют из организмов, принадлежащих, например, к С1исопоЬас(ет, Асе(оЬас(ет, Рзеиботопаз, Рагасоссиз, КНоборзеиботопаз, Рап(оеа, ЕзсйебсЫа, 8ассйаготусез, АзретДНиз или мыши, в частности, организмов, перечисленных в табл. В и С.

Штаммы АсеЮйасЮг асеб зиЬзр. хубпит 1ЕО 13693 и 1ЕО 13773 выращивают при 27°С в течение 3 дней на среде № 350, содержащей 5 г/л бактопептона (Обсо), 5 г/л дрожжевого экстракта (ОтГсо), 5 г/л глюкозы, 5 г/л маннита, 1 г/л Мд8О₄-7Н₂О, 5 мл/л этанола и 15 г/л агара. Все другие штаммы АсеЮйасЮг и все штаммы С1исопоЬас(ет выращивают при 27°С в течение 3 дней на агаризованном бульоне с маннитом (МБ), содержащем 25 г/л маннита, 5 г/л дрожжевого экстракта (ОтГсо), 3 г/л бактопептона (Ьбсо) и 18 г/л агара (Ьбсо). Е. сой К-12 выращивают на агаризованной среде Луриа-бульон (ЬВ). Другие штаммы выращивают на средах, рекомендованных поставщиками, согласно способам, известным в данной области. Геномную ДНК экстрагируют, как описано, например, в 8атЬтоок е( а1., 1989, «Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота(оту Мапиа1/8есопб ЕШНоп», Со1б 8рппд НагЬог ЬайогаЮгу Ргезз, из нужного организма, как, например, помечено в табл. В и С.

Препараты геномной ДНК обрабатывают рестриктазами, такими как ЕсоК1 или НтбШ, и 1 мкг фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза на агарозном геле (1% агарозы). Гель обрабатывают 0,25н. НС1 в течение 15 мин и затем 0,5н. №1ОН в течение 30 мин и затем подвергают блоттингу с

- 33 012165 нитроцеллюлозной или найлоновой мембраной при помощи аппарата Уасиит В1ойег Мойе1 785 (ВЮ-ЯАЭ БаЬогаЮпек АС, 8\\й/ег1апй) согласно приложенной к аппарату инструкции. Получившийся блот далее приводят в контакт/гибридизуют с раствором, содержащим пробы ДНК 8М8 (СМС), 8Т8, ЯС8 (СДЦ) или УС8, которые можно получить с помощью набора для внесения метки (РСЯ-ЭЮ 1айейпд к11 (Яосйе П1адпокйск)) и специфичного для каждого гена набора праймеров, как раскрыто в табл. А. Результаты такого блоттинга приведены в первой колонке табл. В и С, соответственно.

Таблица А

126/127

ПОСЛ. №№ для пар праймеров

СМС 02 126/127

СМС 03

130/131

СМС 04

134/135

СМС 05

46/47

СМС 12

138/139

СМС 13

142/143

СМС 14

146/147

СМС 21

182/183

СМС 22

186/187

СМС 23

190/191

СМС 24

194/195

СМС 25

198/199

Гибридизацию можно проводить в жестких или очень жестких условиях. Предпочтительным, но не ограничивающим примером таких условий является гибридизация в 6х растворе хлористого натрия/цитрата натрия (88С) при приблизительно 45°С с последующими одной или более промывками в 1х 88С, 0,1% ДСН при 50°С, предпочтительно при 55°С, более предпочтительно при 60°С и еще более предпочтительно при 65°С. Очень жесткие условия включают, например, инкубацию от 2 ч до 4 дней при 42°С в таком растворе, как П1дЕакуНуЬ раствор (Яосйе П1адпокйск СтЬН) в присутствии или в отсутствие 100 мкг/мл ДНК из спермы лосося, или в растворе, включающем 50% формамид, 5х ЗЗС (150 мМ хлористого натрия, 15 мМ цитрата натрия трехзамещенного), 0,02% додецилсульфата натрия, 0,1% Ν-лаурилсаркозина и 2% блокирующего реагента (Яосйе П1адпокйск СтЬН) с последующей промывкой фильтров дважды в течение от 5 до 15 мин в 2х ЗЗС и 0,1% ДСН при комнатной температуре и затем промывкой дважды в течение 15-30 мин в 0,5х 88С и 0,1% 8Ό8 или 0,1х 88С и 0,1% ДСН при 65-68°С. Для детектирования фрагментов ДНК с более низкой идентичностью с пробами ДНК конечные этапы промывки можно проводить при более низких температурах, таких как 50-65°С, и с более короткими временами промывки, такими как 1-15 мин.

Гены, соответствующие положительным сигналам у соответствующих организмов, показанные в табл. В и С, можно клонировать с помощью способов ПЦР, хорошо известных в данной области, применяя геномную ДНК таких организмов вместе с подходящим набором праймеров в следующих условиях: от 5 до 100 нг хромосомной ДНК применяет на каждую реакцию (общий объем 50 мкл). Можно применять систему для ПЦР Ехраий Н1дй Е1йе1йу РСЯ (Яосйе П1адпокйск) при условиях реакции, состоящих из 94°С в течение 2 мин; 30 циклов (1) этапа денатурации при 94°С в течение 15 с; (2) этапа прилегания комплементарных цепочек при 60°С в течение 30 с; (3) этапа синтеза при 72°С в течение от 0,5 до 5 мин в зависимости от длины ДНК мишени (1 мин на 1 кб); завершающего этапа наращивания цепочки при 72°С в течение 7 мин. Альтернативно, можно проводить ПЦР с вырожденными праймерами, которые можно синтезировать, основываясь на аминокислотной последовательности соответствующих СМС или СДЦ белков, раскрытых здесь, или аминокислотных последовательностей, взятых в качестве обобщающих типичных последовательностей, выбранных посредством сопоставления нескольких аминокислотных последовательностей, полученных с помощью программ поиска последовательностей, таких как ВЯА8ТР (или ВЬАЗТХ, когда в качестве «последовательности запроса» применяют нуклеотидную по

- 34 012165 следовательность), для поиска белков, обладающих сходством со специфической последовательностью белка. Для ПЦР с вырожденными праймерами температуру второго этапа прилегания комплементарных цепочек (см. выше) можно понизить до 55°С или даже до 50-45°С. Результаты таких опытов приведены в колонках 2 и 3 табл. В и С, соответственно.

Образцы после ПЦР реакций разделяют с помощью электорофореза на агарозном геле и полосы локализуют с помощью просвечивания после окрашивания, например, этидийбромидом, выделяют из геля и подтверждают правильность последовательности.

Обобщающими типичными последовательностями, упомянутыми выше, могут быть аминокислотные последовательности, относящиеся к определенным категориям определенных белковых доменов/семейств в базах данных, таких как ΡΚΌ8ΙΊΈ (база данных белковых семейств и доменов), СОСк (группы кластеров ортологов), ί,ΌΩ (база данных консервативных доменов), р£ат (большая коллекция сопоставлений множественных последовательностей и скрытых моделей Маркова, охватывающая много распространенных доменов и семейств белков). Как только обнаруживается определенный белок с идентичной/сходной функцией по отношению к белку настоящего изобретения среди белков, содержащих домен или семейства в таких базах данных, соответствующую ДНК, кодирующую белок, можно амплифицировать с помощью ПЦР, применяя последовательность белка или его нуклеотидную последовательность, когда она доступна в общественных базах данных.

Повреждение генов и их эквивалентов в других организмах для продукции витамина С

Для того, чтобы улучшить продукцию витамина С в подходящем микроорганизме, способном прямо продуцировать витамин С из данного субстрата, избранные гены и эквиваленты, как, например, ПЦР продукт, полученный, как описано в предыдущих абзацах, можно повредить согласно примерам 15-19, чтобы получить нокаут-мутант, несущий эквивалент ген::Кт. Подходящие штаммы хозяина для получения такого нокаут-мутанта можно выбрать из, например, штаммов С1исопоЬас!ег, перечисленных в табл. В, в частности С. охубапк ΙΡΟ 3293, С. охубапк ΙΡΟ 3292, С. охубапк АТСС 621Н, С. охубапк ΙΡΟ 12528, С. охубапк ΙΡΟ 3291, С. охубапк ΙΡΟ 3255, С. охубапк ΙΡΟ 3244, С. сеппик ΙΡΟ 3266, С. £га!еиги ΙΡΟ 3260, С. охубапк ΙΡΟ 3287, Асе!оЬас!ег асеб киЬкр. ог1еапик ΙΡΟ 3259, Асе!оЬас!ег асеб киЬкр. хубпит ΙΡΟ 13693, Асе!оЬас!ег асеб киЬкр. хубпит ΙΡΟ 13773 и Асе!оЬас!ег кр. АТСС 15164.

Нокаут-мутант можно получить следующим способом: ПЦР продукт, полученный, как описано выше, клонируют в вектор Е. соб рСΚ2.1-ТΟΡΟ и применяют для трансформации Е. соб ТС1 для получения устойчивого к ампициллину (Ар^г) трансформанта, несущего рСВ2.1-ген X. Затем кассету устойчивости к канамицину, изолированную из рИС-4К (Атегккат Вюкаепсе, ассеккюп №. Х06404), вставляют в один из участков рестрикции гена мишени с помощью лигазы и получившийся продукт лигирования применяют для трансформации Е. соб ТС1 для получения устойчивого к ампициллину и канамицину трансформанта, несущего рСВ2.1-депе Х::Кт. Плазмиду рСВ2.1-депе Х::Кт, полученную из трансформанта, обрабатывают двумя рестриктазами, выбранными из множественного участка клонирования вектора, чтобы изолировать фрагмент ДНК, содержащий ген Х::Кт. Получившийся фрагмент ДНК применяют для трансформации штамма хозяина, несущего эквивалентный ген, с помощью элекропорации, чтобы получить поврежденный ген.

Дальнейшие модификации, включающие δΝΟΗπί и другие гены, вовлеченные в превращение Όсорбита, Ь-сорбозы и/или Ь-сорбозона в витамин С упомянутыми штаммами, можно получать для улучшения продукции витамина С такими штаммами согласно изобретению.

В реакции с покоящимися клетками с 1% Ь-сорбозоном в качестве субстрата мутантный штамм может продуцировать не менее чем на 20% больше витамина С по сравнению со штаммом дикого типа. Продукция витамина С с применением эквивалентов генов, которые можно регулировать на повышение

Продукт ПЦР, полученный, как описано выше, можно применять в системах повышенной экспрессии 8ΝΟ№ί согласно примерам 20-21 или согласно следующей процедуре, проиллюстрированной для СДЦ 21. Эта процедура применяет ти1а1ек ти1апб1к для сходных СМС и СДЦ генов.

Для того, чтобы улучшить получение витамина С у требуемого микроорганизма, способного прямо продуцировать витамин С из данного субстрата, ген СДЦ 21 и эквиваленты, например ПЦР продукт, полученный, как описано выше, называемый здесь геном Х, можно применять в системе для повышенной экспрессии, как описано здесь, или можно клонировать в рСВ2.1-ТΟΡΟ (1пу1бодеп, Саг1кЬаб, СА, И8А) и применять для трансформации Е. соб ТС1 для получения устойчивых к ампициллину трансформантов, несущих рСВ2.1-ТΟΡΟ-деηе X, т.е. несущих ПЦР продукт. Вставку можно амплифицировать с применением набора праймеров РГ№е1 (ПОСЛ. № 182 с ЦЦЦАТ на 5'-конце) и РгНшбШ (ПОСЛ. № 183 с ЦЦААГЦТТ на 5'-конце) с помощью ПЦР. Получившийся ПЦР продукт обрабатывают рестриктазами NбеI и НшбШ и фрагмент вставляют вместе с фрагментом Рсг1Е-8Э (Шайн-Дальгарно) (νΟ 02/099095), обработанным Х1о1 и №еБ в рУК100 (АТСС 37156) между участками Хко1 и НшбШ. Е. соб ТС1 трансформируют, применяя продукт лигазной реакции, для получения трансформанта, устойчивого к тетрациклину (Тс^г), несущего плазмиду рУ1<-Рсг1Е-80-депе X, которую затем применяют для трансформации требуемого хозяина, например С. охубапк Ό8Μ 17078, с помощью электропорации для получения, например, Тс^г С. охубапк Ό8Μ 17078/рУК-Рсг1Е-8О-депеХ.

- 35 012165

Получение витамина С с применением рекомбинантных клеток, например С. охуйапк штамм Ц8М 17078 и соответствующего штамма дикого типа, можно дополнительно изменить с применением 8МОНа1, как описано здесь выше.

Дальнейшие модификации с применением 5>ΝΌΗ;·ιί и других генов, вовлеченных в превращение Όсорбита, Ь-сорбозы и/или Ь-сорбозона в витамин С упомянутыми штаммами, можно получать для улучшения получения витамина С такими штаммами согласно изобретению.

В реакции с покоящимися клетками с 1% Ь-сорбозоном в качестве субстрата мутантный штамм может продуцировать не менее чем на 20% больше витамина С по сравнению со штаммом дикого типа.

К нижеследующим табл. В и С:

Сигнал 1 - детекция ДНК на блот-мембране с геномной ДНК из различных штаммов;

Сигнал 2 - детекция ДНК различных штаммов в реакции ПЦР с применением пар праймеров;

Сигнал 3 - детекция ДНК различных штаммов в реакции ПЦР с применением вырожденных праймеров.

Таблица В

Эквиваленты СМС 02 гена у других организмов

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
С, охуШтз Ό8Μ 17078	+	+	+
С. охус1апз ΙΕΟ 3293	+	+	+
0. охупапз ΙΓΟ 3292	+	+	+
С. оху^апз АТСС 621Н	+	+	+
С. охуАапз ΙΡΟ 12528	+	+	+
О. охуАапз С 624	+	+	+
С. агуб/шм'Т-100	+	+	+
С. охус1апз ΙΓΟ 3291	+	+	+
С. охуАапз ΙΓΟ 3255	+	+	+
О. охудапз АТСС 9937	+	+	+
С. охуЛапз ΙΡΟ 3244	+	+	+
О. сеипиз ΙΡΟ 3266	+	+	+
С.уга/еигл ΙΡΟ 3260	+	+	+
С. охуАапз ΙΡΟ 3287	+	+	+
Асе(оЬас1ег асеИ зиЬзр. ог1еапиз ΙΡΟ 3259	+	+	+
Асе(оЬас(ег асеИ зиЬзр. хуПпит ΙΡΟ 13693	+	+	+
Асе(оЬас(ег асеИ зиЬзр. хуПпит ΙΡΟ 13773	+	+	+
Асе(оЬас1ег зр. АТСС 15164	+	+	+
С. (НаИапсПсиз N131«' 100600	+	+	+
С1исопасе(оЬас(ег Пдие/амепз АТСС 14835	+	+	+
С1исопасе1оЬас1ег ро1уохо%епез ΝΒΙ 1028	+	+	+
(ШисопасеюЬас1ег Шаго1горЫсиз АТСС 49037	+	+	+
Ст1исопасеК)Ьас1ег еигораеиз Э8М 6160	+	+	+
АсеюЬас1ег асеН 1023	+		+
Асе1оЬас1ег раз(еипапиз ΝΟΙ 1193	+		+
ВасШиз сегеиз АТСС 14579	-		+
ВасШиз зиЬППз 168	-		+
ВасШиз 1киипу!еиз1з зегоуаг копкиНап 97-27	-		+
ВгисеИа зигз 1330	+		+
ВгисеИа те1Иепз1з 16М	+
Аго(оЬас(ег νΐηβίαηάϋ ΑνΟΡ			+
А~о1оЬис/ег сИгоососсит МСП1			+
Е. соН			-
Васскаготусез сегеамае			-
АзрегуШиз гпуег			-
Мышь			-

- 36 012165

Эквиваленты СМС 03 гена у других организмов

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
С. охудапз ϋδΜ 17078	+	+	+
(3. охуЗапз ΙΡΟ 3293	+	+	+
О. охуАапз ЕГО 3292	+	+	+
О. охуЗапз АТСС 621Н	+	+	+
С. охуЗапз [РО 12528	+	+	+
С. охуЗапз <3 624	+	+	+
С. охуЗапз Т-100	+	+	+
(3 охудапз ΙΡΟ 3291	+	+	+
(3. οχγάαηχ ΙΡΟ 3255	+	+	+
(3. охудапз АТСС 9937	+	+	+
<3. охуЗапз ΙΡΟ 3244	+
<?. сеппиз ΙΡΟ 3266	+	+	+
<3./га(еигП 1РО 3260	+	+	+
О. охуЗапз ΙΡΟ 3287	+	+	+
АсеюЬсшег асеИ зикзр. ог1еапиз ΙΡΟ 3259	+	+	+
Асе!окас1ег асе А зиЬзр. хуНпит ΙΡΟ 13693	+	+	+
АссЧоЬааег асеН зиЬзр. хуНпит ΙΡΟ 13773	+	+	+
АсеюЬас/ег зр. АТСС 15164	+	+	+
<3. /ИаНатНсиз МВК.С 100600	+	+	+
(31исопасе1оЪа<Аег Нрие/асчепх АТСС 14835	+	+	+
(з1исопасе!оЬас!ег ро1уохоуепез ΝΒΙ 1028	+	+	+
<31исопасе1оЪас1ег сНагоНорЫсиз АТСС 49037	+	+	+
(31исонасе!оЬас!ег еигораеиз ϋ8 М 6160	+	+	+
АсеюЬас1ег асеН 1023	+		+
АсеюЪскАег раз1еиг1апиз МС1 1193	+		+
ВасШиз сегеиз АТСС 14579	-		+
ВасШиз зиЪНИз 168	-		+
ВасШиз Шипп^1епз1з зегомаг копкиШап 97-27	-
ВгисеИазшя 1330	+		+
ВгисеНа теШепз/з 16М	+		+
Аго1оЬаыег νίηβίαηάίΐ ΑνΟΡ			+
АсоюЬасгег скгоососсит МСО1			+
Е. соН			-
Засскаготусез сегеу/з/ае			-
Азрег^Шиз т%ег			-
Мышь			-

- 37 012165

Эквиваленты СΜС 04 гена у других организмов

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
а охуйдамЭБМ 17078	+	4-	4-
О. охуНапз 1РО 3293	+	4-	4-
С. охуНапх 1РО 3292	+	+	+
С. охуНапз АТСС 621Н	+	+	4-
О. охуНапз ΙΡΟ 12528	+	+	+
С. охуНапх (3 624	+	+	4-
Ст. охус!апз Т-100	+	+	+
С. охуНапз ΙΡΟ 3291	+	+	+
С. охуНапз 1РО 3255	+	+	4-
С. охус/апх АТСС 9937	+	+	+
О. охуНапх 1РО 3244	+		+
С. сеппих ΙΡΟ 3266	4-	+	4-
С. рхНеигН 1РО 3260	+	+	+
С. охуНапз 1РО 3287	4-	+	4-
АсеТоЬасгег асеН хиЬхр. ог!еапиз ΙΡΟ 3259	4-	4-	+
Асе1оЬас1ег асеН хиЬхр. хуНпит ΙΡΟ 13693	+	+	+
АсеюЬаМег асеН хиЬхр. хуНпит ΙΡΟ 13773	+	+	+
АсеЮЬасТег $р. АТСС 15164	+	+	4-
С. (ИаПапсНсиз ΝΒΚΌ 100600	+	+	4-
СНисопасеТоЬасТег Нцие/айепз АТСС 14835	+	+	+
<31исопасе1оЬас!ег ро1уохо%епе8 ΝΒΙ 1028	+		4-
С1исопасе1оЬасГег сНагоТгврМсих АТСС 49037	+		4-
С1исопасе1оЬас!ег еигораеиз Ό8Μ 6160	+		+
Асе1оЬас1ег асеН 1023	+		4-
Асе1окас1ег разТеипапиз КС11193	+		+
Аутотопах тоЫНз АТСС 31821			4-
Е. соН			-
Засскаготусез сегеушае			-
Азрег^Шиз ш%ег			-
Мышь			-

Эквиваленты СΜС 05 гена у других организмов

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
О. охуНапз Ι38Μ 17078	+	4-	4-
С. охуНапз ΙΡΟ 3293	4-	+	4-
С. охуНапз ΙΡΟ 3292	+	+	+
С. охус/апз АТСС 621Н	+	4-	4-
О, охуНапз ΙΡΟ 12528	+	4-	4-
О. охуНапз (3 624	4-	4-	4-
С. охуНапз Т-100	4-	+	+
С. охуНапз ΙΓΟ 3291	+	+	+
С. охуНапз ΙΡΟ 3255	+	+	+
О. охуНапз АТСС 9937	+	4-	4-
С. охуНапз ΙΡΟ 3244	•4»	4-	4-
О, сеппиз ΙΡΟ 3266	+	+	+
С. /гаТеигП ΙΡΟ 3260	+	4-	4-
С. охуНапз ΙΕΟ 3287	4-	+	+
Асе!оЬас1ег асеН зиЬзр. ог1еапиз ΙΡΟ 3259	4-	+	+
АсеюЬас1ег асеН хиЬхр. хуНпит ΙΡΟ 13693	+	4-	4-
Асе1оЬас1ег асеН зиЬзр. хуНпит ΙΡΟ 13773	+	4-	4-
Асе1оЬас1ег зр. АТСС 15164	+	+	+
С. {ИаНагиНсиз ЫВКС 100600	+	+	+
С!исопасе(оЬас(ег Ицие/степз АТСС 14835		+	+
ЗтогЫхоЫит те1о!оН 1021			+
ВгисеНа зшх 1330			4-
ВгисеНа теГНепых 16М
Е. соН			-
Засскаготусез сесессНае			-
АзрегдШиз т%ег			-
Мышь			-

- 38 012165

Таблица С

Эквиваленты СДЦ 21 гена у других организмов

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
О. оху^апз Э8М 17078	++++	+	+
С. охус/апз 1РО 3293	++++	+	+
С. οχγάαηζ ΙΡΟ 3292	++++	+	+
О. охукапх АТСС 621И	++++	+	+
О. οχράαηχ ΙΡΟ 12528	++++	+	+
С. оху^апх С 624	++++	+	+
С. охуАапз Т-100	++++	+
6= охус1апз ΙΡΟ 3291	++++	+	+
О. охусктз ΙΡΟ 3255	++++	+	+
0. оху^апз АТСС 9937	++++	+	+
О. охукапх [РО 3244	++++	+	+
С. сеппиз ΙΡΟ 3266	+++	+	+
(}./га1еигИ ΙΡΟ 3260	+++	+	+
О. охус1апз 1РО 3287	++++	+	+
Асе(оЬас1ег асеН зиЬзр. ог1еапих ΙΡΟ 3259	++	-	+
Асе1оЬас(ег асеН хиЬхр. хуИпит ΙΡΟ 13693	++	-	+
Асе1оЬас1ег асеН зиЬзр. хуИпит ΙΡΟ 13773	++	-	+
Асею/шаег зр. АТСС 15164	++	-	+
<3. (каНапсНсиз ΝΒΚ.0 100600	+++	+	+
<31исопасеП)Ъас(ег Ицие/аыепз АТСС 14835	++	+	+
(}1исопасе/оЬас/ег ро1уохо%епез ΝΒΙ1028	++	+	+
Сг1исопасе^Ьас(ег Ηια-οίΓορΠίχαχ АТСС 49037	++	+	+
С1исопасе1оЬас1ег еигораеиз О8М 6160	++	+	+
АсеюЬас!ег асеН 1023	++		+
Асе1оЬас1ег раз(еипапиз N01 1193	++		+
РзеиНотопаз риННа АТСС 21812	+		+
РзеиНотопаз аеги&поза РАО1	+		+
РзеиНотопаз$иогезсепз О8М 50106	+		+
РзеиНотопаз зунп^ае В728а	+		+
Рагасоссиз НепНп$сапз 51га1п Р01222	+		+
КИоНорзеиНотопаз ра!из1пз СОА009	+		+
Рап/оеа сПгеа 1056К			-
Е. соП К-12			-
Засскаготусез сегех/з1ае			-
Азрег^Шиз ш&ег			-
Мышь			-

- 39 012165

Эквиваленты СДЦ 22 гена у других организмов

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
С. охуДапх 1)8 М 17078	++++	+	+
С. охуДапх ΙΕΟ 3293	++++	+	+
С. οχγάαηχ ΙΕΟ 3292	++++	+	+
0. охуДапх АТСС 621Н	++++	+	+
С. охуДапз [ГО 12528	++++	+	+
С. охуДапх О 624	++++	+	+
С. охуДапх Т-100	++++	+	+
<7. охуДапх 1ГО 3291	++++	+	+
О. охуДапх [ГО 3255	++++	+	+
О. схуДапх АТСС 9937	++++	+	+
О. охуДапх ΙΓΟ 3244	++++	+	+
(λ сеппих ΙΕΟ 3266	+++	+	+
С./га(еигИ ΙΓΟ 3260	+++	+	+
(3. охуДапх [ГО 3287	++++	+	+
Асе(оЬас1ег асеН χιώχρ. ог1еапих ΙΓΟ 3259	++	-	+
Асе(оЬас1ег асеИ хикхр. хуНпит ΙΓΟ 13693	++	-	+
АселоЬааег асеН хикхр. хуНпит ΙΓΟ 13773	++	-	+
Асе(оЬас(ег хр. АТСС 15164	++	-	+
С. 1каНап<Нсих К'ВКС 100600	+++	+	+
(31исопасе!оЬас1ег Нцие/аХепх АТСС 14835	++	+	+
С1исопасе(оЬас1ег ро1уохо%епех ΝΒΙ 1028	++	+	+
С1исопасе(оЬас!ег (НагсАгорЫсих АТСС 49037	++	+	+
(31исопасе1оЬас(ег еигораеих Э8М 6160	++	+	+
Асе1оЬас!ег асеН 1023	++		+
АсеюЬааег рах1еиг1апих ΝΟΙ 1193	++		+
РхеиДотопах риПАа АТСС 21812	+		+
РхеиДотопах аеги&поха РАО 1	+		+
РхеиДотопах Диогехсепх О8М 50106	+		+
РхеиДотопах хупнуае В728а	ч-		+
Рагасоссих НепНгХсанх а1га1п ГМ 1222	+		+
КкоДорхеиДотопах ра1их1т ССА009	+		+
Ратоеа сИгеа 1056К	-
Е. соП К-12	-
Засскаготусех сегеАх/ае	-
Ахрег%Ших т§ег	-
Мышь	-

- 40 012165

Эквиваленты СДЦ 23 гена у других организмов

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
С. οχγάαης ОЗМ 17078	++++	+	+
С, охуЗапз ΙΡΟ 3293	++++	+	+
С. оху&тз ΙΡΟ 3292	++++	+	+
О. охуЖгпз АТСС 621Н	++++	+	+
С. охусктз 1РО 12528	++++	+	+
С. охуЛапз О 624	++++	+	+
О. охус1апз Т-100	++++	+	+
С, охусктз 1РО 3291	++++	+	+
О. оху<1апз ΙΡΟ 3255	++++	+	+
С. оху&тз АТСС 9937	++++	+	+
С, охус1апз ΙΡΟ 3244	++++	+	+
С. сеппиз ΙΡΟ 3266	+++	+	+
О./га(еигП ΙΡΟ 3260	+++	+	+
О. охуАааз ΙΡΟ 3287	++++	+	+
Асе/оЬас/ег асе!/ зиЬзр. ог1еапиз ΙΡΟ 3259	++	-	+
Асе!оЬас/е/ асе/ί зиЬзр. хуНпит ΙΡΟ 13693	++	-	+
АсеюЬас(ег асе/ί зиЬзр. хуНпит ΙΡΟ 13773	++	-	+
АсеЮЬасТег зр. АТСС 15164	++	-	+
С. (ИаИапсНсиз ΝΒΚ-С 100600	+++	+	+
(Лисопасе/оЬас/ег Ицие/асгепз АТСС 14835	++	+	+
(Лисопасе/оЬас/ег ро1уохо%епез ΝΒΙ1028	++	+	+
С1исопасе!оЬас!ег Αίαζο/горЫсиз АТСС 49037	++	+	+
<31исопасе1оЬас/ег еигораеиз ϋ8Μ 6160	++	+	+
Асе/оЬас/ез асе/ί 1023	++		+
АсеюЬааеграз(еипапиз КО 1193	++		+
РзешЬотопаз ριιί'κία АТСС 21812	+		+
Рзеи^отопаз аеги&поза РАО1	+		+
Рзеискяпопаз Диогезсепз О8М 50106	+		+
РзеиНотопах зупп§ае В728а	+		+
Рагасоссиз άεηίΐή/καηχ з1гат Р41222	+		+
КЬоНорхеиНотопах ра1из/пз СОА009	+		+
Рап/оеа сНгеа 1056К.
Е. соНК.-П
ЗассИаготуеез сегех/з1ае
Азрег§Шиз т§ег
Мышь

- 41 012165

Эквиваленты СДЦ 24 гена у других организмов

Штаммы	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
С. охуЗапз 1)8М 17078	++++	+	+
6, охуЗапз (ГО 3293	++++	+	+
О. охудапз 1РО 3292	++++	+	+
С. охуЗапз АТСС 621Н	++++	+	+
С, охудапз ΙΡΟ 12528	++++	+	+
<3, охуЗапз ΰ 624	++++	+	+
О. охуАапз Г-100	++++	+	+
О. охуЗапз ΙΡΟ 3291	++++	+	+
С. охуЗакз ΙΡΟ 3255	++++	+	+
6'. охуЗапз АТСС 9937	++++	+	+
О. охуАапх ΙΕΟ 3244	++++	+	+
О. сеппиз ΙΕΟ 3266	+++	+	+
(7. /га(еигИ ΙΕΟ 3260	+++	+	+
О. охуЗапз ΙΕΟ 3287	++++	+	+
Асе!оЬас!е> асеИ зиЪзр. ог1еапиз ΙΓΟ 3259	++	-	+
АсеюЬас!ег асеН зиЬзр. хуИпит ΙΓΟ 13693	++	-	+
Асе1оЬас1ег асеН хиЬхр. хуНпит ΙΕΟ 13773	++	-	+
Асе1оЬас1ег зр. АТСС 15164	++	-	+
С. ПгаНапсНсиз ΝΒΚ.0 100600	+++	+	+
<Э1исопасе1оЬас1ег Пцие/асгепз АТСС 14835	++	+
<31исопасе1оЬас1ег ро1уохо%епез ΝΒΙ 1028	++	+	+
<31исопасе1оЬас1ег (Иа2о1горЫсих АТСС 49037	++	+	+
<31исопасеюЬас1ег еигораеиз Э8М 6160	++	+	+
АсеГоЬас1ес асеН 1023	++		+
Асе1оЪас(ег раз(еипапиз ΝΟΙ 1193	++		+
РзеиНотопаз риННа АТСС 21812	+		+
РзеиНотопаз аеги%тоза РАО1	+		+
РзеиНотопаз риогехсспх Е)8М 50106	+		+
РзеиНотопаз зупп§ае В728а	+		+
Рагасоссиз НепНпрсапз Нга1п Ρά 1222	+		+
КИос/орзеиНотоназ ра1из!пз СОА009	+		+
РаШоеа сНгеа 1056К			-
Е. соН К-12			-
ЗассНаготусез сс'гепхше			-
Азрег§Н1из трех			-
Мышь			-

- 42 012165

Эквиваленты СДЦ 25 гена у других организмов

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
0. охусктх ОЗМ 17078	++++	+	+
С. охуАапз ΙΓΟ 3293	++++	+	+
С. охуАапз ΙΡΟ 3292	++++	+	+
О. охуАапх АТСС 621Н	++++	+	+
С. охуАапз ΙΡΟ 12528	++++	+	+
О. охуАапз 6 624	++++	+	+
С. охуАапх Т-100	++++	+	+
О. охуАапх ΙΡΟ 3291	++++	+	+
О. охуАапз ΙΡΟ 3255	++++	+	+
О. охуАапз АТСС 9937	++++	+	+
С. охуАапз ΙΡΟ 3244	++++	+	+
С. сегтиз ΙΡΟ 3266	+++	+	+
О./га1еиг11 ΙΡΟ 3260	++ +	+	+
<3. охуАапз ΙΡΟ 3287	++++	+	+
АсеюЬас1ег асеН зиЬзр. ог1еапиз ΙΡΟ 3259	++	-	+
Асе(оЬас1ег асеН зиЬзр. хуНпит ΙΡΟ 13693	++	-	4-
Асе(оЬас1ег асеП хиЪзр. хуПпит ΙΡΟ 13773	++	-	+
АсеЮЪааег хр. АТСС 15164	++	-	+
С, АгаПстсМсиз ΝΒΚ,Ο 100600	+++	+	+
<31исопасе1оЪас?ег Ицие/аыепз АТСС 14835	++	+	+
(31исопасе1оЪас1ег ро1уохо§епех ΝΒΙ1028	++	+	+
С1исопасеюЬас1ег Αΐαζο&ορίιΐαιχ АТСС 49037	++	+	+
О1исопасеюЪас1ег ей г орае их В8М 6160	++	+	+
Асе(оЬас(ег асеН 1023	++		+
Асе1оЬас(ег раз(еипапиз 14С1 1193	++		+
РхеиЗотоаах ριιΐίΑα АТСС 21812	+		+
РхеиАотопах аеги§тоха РАО1	+		+
РхеиАотопах риогезсепз ϋ8Μ 50106	+		+
РхеиАотопах хупнуае. В728а	+		+
Рагасоссиз άβηίίνίβεαηχ з1гаш 1ДП 222	+		+
ЕИоАорхеиАотопаз ра1из1г1з СОА009	+		+
Ραηίοεα сИгеа 105 6к	-		-
Е. соИ К-12	-		-
Засскаготусех εεχενίχίαε	-		-
Азрег^Шиз т§ег	-		-
Мышь	-		-

- 43 012165

Эквиваленты СΜС 12 гена у других организмов

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
С. охуАапз ЭЗМ 17078	++++	+	+
С. охудапз 1РО 3293	++++	+	+
С. охуектз [РО 3292	++++	-	+
С. охудапз АТСС 621Н	-	-	-
С. оху4апз [РО 12528	-	-	-
С. охуХап.ч О 624	+	+	+
С. охудапз Т-100	++++	+	+
С. охусЛапз 1РО 3291	+	+	+
С. охуЗапз 1РО 3255	+	+	+
С. оху&тз АТСС 9937	+	+	+
О. охудапз 1РО 3244	+	+	+
О. сеппиз ΙΡΟ 3266	+	4-	+
С. /га1еигн ΙΡΟ 3260	+	+	+
С. оху&гпз ЕГО 3287	+	+	+
Асе(оЬас(ег асеИ зиЪзр. ог1еапиз ΙΡΟ 3259	-	-	-
Асе(оЬас(ег асеН зиЪзр. хуИпит ΙΡΟ 13693	-	-	-
АсеюЬас1ег асеН зиЬзр. хуИпит ΙΡΟ 13773	-	-	-
Асе1оЬаМег зр. АТСС 15164	-	-	-
С. {каИапсИсиз К'ВКС 100600	+	+	+
С1исопасе(оЬас(ег кдие/асгепз АТСС 14835	++	+	+
С1исопасеюЬас(ег ро1уохо%епез ΝΒΙ1028	-	-	+
С1исопасе1оЬас1ег сНа~о1горЫси$ АТСС 49037			+
<31исопасе№Ъас(ег еигораеиз О8М 6160			+
Асе!оЬастг асек 1023			-
АсеюЬаае/'раз(еипапиз Ν6Ί 1193			-
Рзеидотопаз ριιΐίΧίΐ АТСС 21812			-
Рзеи^отопаз аеги^тоза РАО1			-
РзеиЗотопазДиогезсепз О8М 50106			-
РзеиЗотопаз зугт&ае В728а			-
Аго(оЬас1ег νίηβίαηάϋ ΑνΟΡ			-
Аго(оЪас1ег скгоососсит МСО1			-
Рагасоссиз ЗепИйДсапз Л πύ η Ρά 1222			-
Ркодорзеи^отопаз ра1из1пз ССА009			-
РапЮеа екгеа 1056К.			-
Е. соН К-12			-
Засскаготусез сегеХзХе			-
Азрег§Шиз туег			-
Мышь			-

- 44 012165

Эквиваленты СМС 13 гена у других организмов

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
(7. охуАапх О8М 17078	++++	+	+
С. охудат ΙΡΟ 3293	++++	+	+
С. охуАапх ΙΓΟ 3292	++++	+	+
О. оху&тх АТСС 621Н	++++	+	+
С. оху<7апх ΙΡΟ 12528	++++		+
С, охус1апх О 624	++++	+	+
С, охуАапх Т-100	++++	+	+
О. οχγάαηχ ΙΡΟ 3291	++++	+	+
О. охуАапх ΙΡΟ 3255	++++	+	+
С. охуЗапх АТСС 9937	++++	+	+
О. охуАапх ΙΡΟ 3244	++++		+
О, сеппих ΙΡΟ 3266	+++	+	+
О./га1еигИ ΙΡΟ 3260	+++	+	+
О. охуАапх ΙΡΟ 3287	+++	+	+
Асе(оЬас/ег аееп хиЪхр. ог1еапих ΙΡΟ 3259	-	-	-
Асе(оЬас1ег асе(1 хиЬхр. хуПпит ΙΡΟ 13693		-	-
Асе(оЬас/ег асе/ί хиЬхр. хуПпит ΙΡΟ 13773	-	-	-
АсеюЬас/ег хр. АТСС 15164	-	-	-
Ζ*1 Ц. ___ Τ'_ _λΐηη/Ί 1ΛΛΖΛΛ и. типапснс’их ιυυουυ		4·	+
01исопасе1оЪас/ег Пцие/аыепх АТСС 14835	++	+	+
О1исопасе1оЬас1ег ро!уохорепех ΝΒΙ 1028	-	-	+
(31исопасе(оЬас1ег сПаго/горШсих АТСС 49037			+
С1исопасе1оЬас1ег еигораеих Э8М 6160			+
АсеюЬас1ег асеИ 1023
Асе(оЬас1ег рах/еиггапих N01 1193
РхеиАотопах риПс1а АТСС 21812
Рхеи^отопах аегиутоха РАО1
РхеиЗотопах$иогехсепх ϋ8Μ 50106
Рхеи^отопах хугт^ае В728а
ΑζοίοΗααί’Γ νϊηεΐαηάϋ ΑνΟΡ
ΑζοίούααΙδΓ сИгоососсит МСП1
Рагасоссих АепПгфсапх зТтат 1’41222
КкоАор.чецАотопая ра1их(пх СОА009
РанЮеа сИгеа 1056К
е. сои
ЕассИаготусех сегеетае
АхрегуШих η /ре г
Мышь			-

- 45 012165

Эквиваленты СΜС 14 гена у других организмов

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
а οχγάαηχ ϋ8Μ 17078	++++	+	+
О. охудапх ΙΡΟ 3293	++++	+	+
О. охуЛапх ΙΡΟ 3292	++++	+	+
С. охудапх АТСС 621Н	++++	+	+
С. оху^апх ΙΓΟ 12528	++++	+	+
О. охудапх 6 624	++++	+	4-
С. οχχί/ίϊΗχϊ Т-100	++++	+	+
С. оху&гпх ΙΡΟ 3291	++++	+	4-
С. охусктх ΙΡΟ 3255	++++	+	+
(7. охусктх АТСС 9937	++++	+	+
С. охусктх ΙΡΟ 3244	++++	+	+
С. сегтих ΙΡΟ 3266	+++	+	+
С. /гсйеигН ΙΡΟ 3260	+++		+
О. охус1апх ΙΡΟ 3287	+++	+	+
АсеК>Ьас(ег ассИ хиЬхр, оНеапих ΙΡΟ 3259	-	-	-
Асе(оЬас(ег асеН хиЪхр. хуИпит ΙΡΟ 13693	-	-	-
Асе(оЬас1ег асеН хиЬхр. хуИпит ΙΡΟ 13773	-	-	-
АсеюЬааег зр. АТСС 15164	-	-	-
С. ЖаИапсИсих К В ИС 100600	+++	+	+
С1ис<тасе1оЪас1ег Идие/асгепх АТСС 14835	++	+	+
(Иисопасе№Ьас1ег ро1уохо%епех ΝΒΙ 1028	-	-	+
С1исопасе1оЪас1ег άίαζοΡορΗΐσαχ АТСС 49037			+
01исопасе1оЪааег еигораеш 1Э8М 6160			+
Асе1оЬас(ег асеН 1023
Асе1оЬас1ег рах(еиг1апих КС1 1193
РхеиЛотопах риНЗа АТСС 21812
Рхеис1отопах аеги§тоха РАО1
Рзеи^отопаз^иогехсепх О8М 50106
Рхеискяпопах хугт^ае В728а
Ахо1оЬас1ег νϊηεΐαηίϋί ΑνΟΡ
АгоюЬас(ег сИгоососсит МСВ1
Рагасоссих άεηίΐήβραηχ з!гат Ρά 1222
КИос1орхеис1отопах ραίηχίήχ СОА009
Ραηίοβα сИгеа Ι056Κ
Е. соИ
Засскаготусех сегеушае
АхрегрШих т%ег
Мышь

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (17)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ ферментативной продукции витамина С, где клетки хозяина культивируют в подходящих условиях культивации, что позволяет прямую продукцию витамина С из источника углерода, получаемую по пути метаболизма Ό-глюкозы или Ό-сорбита, и где геном упомянутой клетки хозяина является генетически измененным с помощью последовательности ДНК, включающей следующие полинуклеотиды:

   а) полинуклеотид, кодирующий Ь-сорбозондегидрогеназу согласно ПОСЛ. № 2, ее активный фраг- 46 012165 мент или производное; и

   б) хотя бы один полинуклеотид, кодирующий белок, выбранный из белков, вовлеченных в систему метаболизма сорбита/сорбозы (СМС), или белков, вовлеченных в систему дыхательной цепи (СДЦ);

   и при необходимости, выделение витамина С из таких клеток или культуральной среды.
2. 2. Способ по п.1, где экспрессия полинуклеотида по п.1а) относится к полинуклеотидной последовательности, которая в значительной степени идентична ПОСЛ. № 1 и/или которую выбирают из группы, состоящей из:

   а) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность согласно ПОСЛ. № 1;

   б) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность, полученную посредством амплификации нуклеиновой кислоты, такой как полимеразная цепная реакция, с применением геномной ДНК из микроорганизма в качестве матрицы и набора праймеров согласно ПОСЛ. № 3 и ПОСЛ. № 4;

   в) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент или производное полипептида, включающего аминокислотную последовательность согласно ПОСЛ. № 2 или кодирующую фрагмент или производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из пп. а) или б), где у упомянутого производного или фрагмента один или более аминокислотный остаток консервативно замещен по сравнению с упомянутым полипептидом и упомянутый фрагмент или производное обладают активностью полипептида, с которым их сравнивают;

   г) полинуклеотидов, комплементарные цепочки которых гибридизуются в жестких условиях с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно ПОСЛ. № 2, или полинуклеотидом, как определено по любому из пп.а)-в), которые кодируют полипептид, обладающий активностью Ь-сорбозондегидрогеназы; и

   д) полинуклеотидов, которые не менее чем на 70%, а именно на 85, 90 или 95% идентичны полинуклеотиду, кодирующему полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно ПОСЛ. № 2, или полинуклеотиду, как определено по любому из пп.а)-в), и которые кодируют полипептид, обладающий активностью Ь-сорбозондегидрогеназы;

   или комплементарная цепочка такого полинуклеотида.
3. 3. Способ по п.1 или 2, где упомянутая клетка хозяина включает полинуклеотид, кодирующий СДЦ белок, выбранный из группы, состоящей из белков, занятых в биосинтезе кофакторов и простетических групп и белков, выступающих в роли переносчиков, в частности белков, вовлеченных в биосинтез и развитие кофакторов и/или их предшественников, таких как ФАД, НАД, НАДФ, ПХХ, КоЦЮ, цитохромы а, Ь, с, б и гемы.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, где упомянутая клетка хозяина содержит полинуклеотид, кодирующий СМС белок, выбранный из группы, состоящей из оксидоредуктаз [ЕС 1]; в частности оксидоредуктаз, действующих на СН-ОН группу доноров [ЕС 1.1].
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где упомянутая клетка хозяина содержит хотя бы один полинуклеотид, выбранный из

   СМС группы, состоящей из ПОСЛ. № 136, ПОСЛ. № 140, ПОСЛ. № 144 и их функциональных эквивалентов или гомологов; и

   СДЦ группы, состоящей из ПОСЛ. № 180, ПОСЛ. № 184, ПОСЛ. № 188, ПОСЛ. № 192, ПОСЛ. № 196 и их функциональных эквивалентов или гомологов.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, где упомянутая клетка хозяина является генетически измененной с помощью хотя бы одного полинуклеотида с пониженной экспрессией или поврежденного из СМС группы, состоящей из ПОСЛ. № 124, ПОСЛ. № 128, ПОСЛ. № 132, ПОСЛ. № 44 и их функциональных эквивалентов или гомологов.
7. 7. Способ по любому из пп.1-6, где упомянутую клетку хозяина культивируют в водной питательной среде в условиях, позволяющих прямую продукцию витамина С из Ό-сорбита или Ь-сорбозы.
8. 8. Способ по любому из пп.1-7, где генетически измененная клетка хозяина является прокариорической клеткой, выбранной из группы, состоящей из Ркеиботопак, Рап!оеа, ЕксйепсЫа, СогупеЬас1епит, КеЮдЫошадепшт и уксусно-кислых бактерий, как, например, С1исопоЬас1ег, Асе1оЬас1ег или С1исопасе1оЬас!ег, предпочтительно Асе1оЬас1ег кр., Асе1оЬас1ег асеб, С1исопоЬас!ег Гга1еипк С1исопоЬас!ег сеппик, С1исопоЬас!ег Шабапбюик, С1исопоЬас!ег охубапк, предпочтительно С1исопоЬас!ег охубапк, более предпочтительно С1исопоЬас1ет охубапк О8М 17078.
9. 9. Клетка хозяина, экспрессирующая полипептид, обладающий Ь-сорбозондегидрогеназной активностью, с аминокислотной последовательностью согласно ПОСЛ. № 2, и/или содержащая полинуклеотид с ПОСЛ. № 1, или полинуклеотид, гибридизующийся в строгих условиях с ПОСЛ. № 1, причем указанная клетка хозяина генетически изменена с помощью хотя бы одного полинуклеотида, кодирующего белок, выбранный из белков, вовлеченных в систему метаболизма сорбита/сорбозы (СМС), или белков, вовлеченных в систему дыхательной цепи (СДЦ).
10. 10. Клетка хозяина по п.9, где клетка хозяина является генетически измененной с помощью хотя бы одного полинуклеотида, как определено по любому из пп.2-6.
11. 11. Клетка хозяина по п.9 или 10, где экспрессируется белок, выбранный из группы, состоящей из

    ПОСЛ. № 137, ПОСЛ. № 141, ПОСЛ. № 145;

    - 47 012165

    ПОСЛ. № 181, ПОСЛ. № 185, ПОСЛ. № 189, ПОСЛ. № 193, ПОСЛ. № 197 и их функциональных эквивалентов или гомологов.
12. 12. Клетка хозяина по любому из пп.9-11, где белок, экспрессируемый на пониженном уровне или поврежденный, выбран из группы, состоящей из ПОСЛ. № 125, ПОСЛ. № 129, ПОСЛ. № 133, ПОСЛ. № 45 и их функциональных эквивалентов или гомологов.
13. 13. Клетка хозяина по любому из пп.9-12, способная прямо продуцировать витамин С из Ό-сорбита в количествах 300 мг/л или более при измерении по способу для покоящихся клеток после периода инкубации 20 ч.
14. 14. Клетка хозяина по любому из пп.9-12, способная прямо продуцировать витамин С из Ь-сорбозы в количествах 800 мг/л или более при измерении по способу для покоящихся клеток после периода инкубации 20 ч.
15. 15. Клетка хозяина по любому из пп.9-14, которая является прокариотической клеткой, выбранной из группы, состоящей из Ркеиботопак, Рап!оеа, ЕксйепсЫа, СогупеЬас!егшт, КеЮдЫошсщепшт и уксусно-кислых бактерий, таких как, например, С1исопоЬас!ег, Асе1оЬас1ег или С1исопасе!оЬас1ег, предпочтительно Асе1оЬас1ег кр., Асе1оЬас1ег асей, С1исопоЬас!ег £га1еигп, С1исопоЬас!ег сегшик, С1исопоЬас!ег НаИапбюик, С1исопоЬас!ег охубапк, предпочтительно С1исопоЬас!ег охубапк, более предпочтительно С1исопоЬас!ег охубапк Ό8Μ 17078.
16. 16. Способ получения клеток по п.9, включающий этап генетической модификации клеток с помощью полинуклеотидов, как определено по любому из пп.2-6.
17. 17. Способ по п.16, где хотя бы одна из этих полинуклеотидных последовательностей изменена таким образом, который приводит к улучшенному выходу и/или эффективности получения витамина С у упомянутого микроорганизма.