EA004568B1 - Полипептиды монооксигеназы со смешанными функциями, способные катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, кодирующие их нуклеиновые кислоты, способы применения полипептидов и нуклеиновых кислот и трансгенные растения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение касается новых последовательностей нуклеиновых кислот, которые происходят из растений, выбранных из группы, состоящей из Crepis spp., в том числе Crepis palaestina, и Vernonia galamensis, и кодируют полипептиды монооксигеназ со смешанными функциями, способные катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты. Изобретение также относится к полипептидам, кодируемым последовательностями нуклеиновых кислот настоящего изобретения, и к способам применения полипептидов и нуклеиновых кислот настоящего изобретения. В частности, с помощью нуклеиновых кислот по настоящему изобретению можно изменить внутриклеточное содержание эпоксигенизированной жирной кислоты в клетке таких организмов, как дрожжи, плесневые грибы, бактерии, насекомые, птицы, млекопитающие и растения. Настоящее изобретение распространяется на трансформированные молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения растения, в частности растения с масличными семенами. Получаемые из таких растений масла являются средством получения экономически выгодного сырья для эффективного производства, среди прочего, покрытий, смол, клеев, пластмасс, поверхностно-активных веществ и смазочных веществ.

Description

Настоящее изобретение касается, главным образом, новых последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды эпоксигеназ жирных кислот, а более предпочтительно полипептиды монооксигеназ со смешанными функциями, способные катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты. Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения происходят из растений, выбранных из группы, состоящей из Стерщ §рр., в том числе Сгер18 ра1ае81ша, ЕирйотЫа 1ада§сае и Уетиоша да1ашеп8щ. Последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению представляют собой средство, с помощью которого можно изменить метаболизм жирных кислот или манипулировать этим метаболизмом в таких организмах, как дрожжи, плесневые грибы, бактерии, насекомые, птицы, млекопитающие и растения. Настоящее изобретение распространяется на генетически модифицированные растения с масличными семенами, трансформированные молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Получаемые из таких растений масла являются средством получения экономически выгодного сырья для эффективного производства, среди прочего, покрытий, смол, клеев, пластмасс, поверхностно-активных веществ и смазочных веществ.

В настоящем описании и в формуле изобретения, если по контексту не требуется иное, слово «включают» или его вариации, такие как «включает» или «включающий», следует понимать, как означающие включение указанной составляющей или группы составляющих, но не исключение никакой иной составляющей или группы составляющих.

Подробности библиографического описания публикаций, на которые авторы делают ссылки в настоящем описании, приведены в конце описания. Идентификационные номера последовательностей (последов. №№) для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, упоминаемые в настоящем описании, определены на основе библиографии.

Уровень техники

Во всем мире существует значительный интерес к производству химических пищевых веществ, таких как жирные кислоты, для целей промышленного использования, при этом предпочтительно из возобновляемых растительных источников, а не из невозобновляемых продуктов нефтехимии. Эта концепция широко распространена среди изготовителей и потребителей, поскольку она основана на сохранении ресурсов и обеспечивает значительные возможности выведения новых видов технических культур для сельского хозяйства.

В природе существует широкое разнообразие необычных жирных кислот, и они хорошо охарактеризованы (Вабаш & РаИ1, 1981; διηίΐΐι, 1970). Многие из этих необычных жирных ки слот обладают потенциалом промышленного использования, что вызвало интерес к окультуриванию видов растений, которые могли бы обеспечить сельскохозяйственное производство определенных жирных кислот.

Одним из классов жирных кислот, которые вызывают особый интерес, являются эпоксижирные кислоты, состоящие из ацильной цепи, в которой две соседние углеродные связи соединены эпоксидным мостиком. Благодаря их высокой реактивности они находят значительное применение в производстве покрытий, смол, клеев, пластмасс, поверхностно-активных и смазочных веществ. Эти жирные кислоты в настоящее время производят путем химического эпоксидирования из растительных масел, главным образом, из соевого и льняного масел, однако, этот процесс приводит к получению смесей кратных и изомерных форм, а кроме того, он требует значительных производственных затрат.

Другие авторы предпринимают попытки в качестве коммерческих источников эпоксижирных масел вывести сорта некоторых диких растений, содержащих такие масла (например, ЕирйотЫа 1ада§сае, Уетпоша да1ашеп515). Однако трудности, связанные с агрономической пригодностью и низкой урожайностью, резко ограничивают возможности коммерческого использования традиционных подходов к селекции и возделыванию этих видов растений.

Быстро развивающиеся познания в области технологии рекомбинантной ДНК значительно повышают эффективность коммерчески важных производственных процессов за счет экспрессии генов, выделенных из одного организма или вида, в другом организме или виде, что определяет его новый фенотип. Более конкретно, обычные производственные процессы можно сделать более эффективными или экономически более выгодными за счет того, что использование методов рекомбинантной ДНК ведет к получению большего выхода на единицу затрат.

Кроме того, выбор подходящего организма-хозяина для экспрессии представляющей интерес генетической последовательности обеспечивает получение соединений, которые в норме не продуцируются или не синтезируются этим хозяином, с высоким выходом и высокой чистотой получаемого продукта.

Однако, несмотря на общую эффективность технологии рекомбинантной ДНК, выделение генетических последовательностей, кодирующих важные для метаболизма жирных кислот ферменты, в частности генов, кодирующих Д12-эпоксигеназные ферменты жирных кислот, ответственных за выработку 12,13-эпокси-9октадеценовой кислоты (верноловой кислоты) и 12,13-эпокси-9,15-октадекадиеновой кислоты, среди прочих, остается главным препятствием для получения с помощью методов генетической инженерии организмов, вырабатывающих эти жирные кислоты.

До настоящего изобретения имелось лишь ограниченное количество биохимических данных, указывающих на природу эпоксигеназных ферментов жирных кислот, в частности Δ12эпоксигеназ. Однако известно, что у ЕирйогЫа 1ада§сае образование 12,13-эпокси-9-октадеценовой кислоты (верноловой кислоты) из линолевой кислоты катализируется цитохром-Р450зависимой Δ12-эпоксигеназой (ВаГог е1 а1., 1993; В1ее е1 а1., 1994). Кроме того, развивающиеся семена растений льна обыкновенного могут преобразовывать добавляемую верноловую кислоту в 12,13-эпокси-9,15-октадекадиеновую кислоту с помощью эндогенной Δ 15-десатуразы (ЕидекеШ апб 81угопе. 1996). Эпоксижирные кислоты могут также вырабатываться в тканях растений с помощью пероксидзависимой пероксигеназы (В1ее апб 8сйиЬег, 1990).

В своих работах, которые привели к настоящему изобретению, его авторы пытались выделить последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют гены, важные для продуцирования эпоксижирных кислот, таких как 12,13-эпокси-9-октадеценовая кислота (верноловая кислота) или 12,13-эпокси-9,15-октадекадиеновая кислота, и перенести эти генетические последовательности в высокопродуктивные коммерческие сорта растений с масличными семенами и/или в другие накапливающие масла организмы.

Краткое изложение сущности изобретения

Новые последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды эпоксигеназ жирных кислот, а более предпочтительно полипептиды монооксигеназ со смешанными функциями, способные катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, представляют собой один из основных объектов настоящего изобретения. Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения происходят из растений, выбранных из Сгерк §р., в том числе Сгерк ра1ае8бпа, ЕирйогЫа 1ада§сае и Уегпоша да1атеп§к.

В соответствии с вышесказанным один аспект настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Сгерк ра1аеМта со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Ыо: 2;

(б) нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Ыо: 1 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и (в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б).

Второй аспект настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Сгерк §р., за исключением Сгерк ра1ае§бпа, со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Ыо: 4;

(б) нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Ыо: 3 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и (в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б).

Следующий аспект настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Уетоша да1атеп§к со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Ыо: 6;

(б) нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Ыо: 5 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и (в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б).

Авторы настоящего изобретения также выделили нуклеотидные последовательности, представленные в последов. №№ 19 и 20, которые происходят из ЕирйогЫа 1ада§сае и кодируют предполагаемую последовательность цитохром-Р-450-зависимой монооксигеназы, либо последовательность, подобную последовательности цитохром-Р-450-зависимой монооксигеназы.

Следующий аспект касается генетической конструкции, которая включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующую полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, или ее часть, которая кодирует ферментативно активную часть указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскри бирована в смысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции ίη νίνο существующего в природе гена монооксигеназы.

Еще один аспект касается генетической конструкции, которая включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующую полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, или ее часть, которая способна модифицировать экспрессию указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в антисмысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции ίη νίνο существующего в природе гена монооксигеназы.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, в клетке или в микроорганизме, включающий введение генетической конструкции по настоящему изобретению в клетку или в микроорганизм и инкубацию указанной клетки или микроорганизма в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для осуществления экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы, в данной генетической конструкции.

Другой аспект настоящего изобретения касается способа получения рекомбинантного ферментативно активного полипептида монооксигеназы со смешанными функциями в клетке, причем указанный способ включает культивирование клетки, содержащей генетическую конструкцию по настоящему изобретению, в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы, в указанной генетической конструкции.

Еще один аспект настоящего изобретения касается способа получения рекомбинатного ферментативно активного полипептида монооксигеназы со смешанными функциями в трансгенном растении, включающий следующие стадии:

(а) введение генетической конструкции по настоящему изобретению в клетку или ткань растения;

(б) регенерацию трансформированного растения из указанной клетки или ткани; и (в) отбор трансформированного растения с высоким уровнем экспрессии в семенах ферментативно активного полипептида монооксигеназы, кодируемого указанной генетической конструкцией.

Следующий аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы Сгер18 ра1ае51ша со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы, состоящей из (а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο: 2; и (б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8 ЕС ΙΌ Νο: 1 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода.

Другой аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы Сгерб 5р.. за исключением Сгер18 ра1ае51та. со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы, состоящей из (а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο: 4; и (б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8 ЕС ΙΌ Νο: 3 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода.

Следующий аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы Уепюша да1атеп515 со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы, состоящей из (а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο: 6; и (б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8 ЕС ΙΌ Νο: 5 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода.

Еще один аспект настоящего изобретения касается способа изменения внутриклеточного содержания эпоксигенизированной жирной кислоты, включающий культивирование клетки, содержащей генетическую конструкцию по настоящему изобретению, в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, в указанной генетической конструкции, и последующее инкубирование указанной клетки с жирнокислотным субстратом в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для того, чтобы по меньшей мере одна углеродная связь указанного субстрата была преобразована в эпоксигруппу.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 изображает линейную схему экспрессирующей плазмиды, содержащей структурный ген эпоксигеназы, расположенный под контролем укороченного напинового промотора (ЕР1; правый заштрихованный прямоугольник) и расположенный перед последовательностью NΟ8-терминатора (правый прямоугольник с точками). Генетическая последовательность эпоксигеназы обозначена правым незакрашенным прямоугольником. Конструкция также со

Ί держит ΝΘδ-προΜΟτορ (левый заштрихованный прямоугольник), обеспечивающий экспрессию гена ΝΡΊΕΙ (левый незакрашенный прямоугольник) и также расположенный перед Ν08терминатором (левый прямоугольник с точками). Также указаны последовательности, расположенные на левой и правой границах Τίплазмиды АдтоЬас!егшт 1итеГас1епк.

Фиг. 2 показывает сопоставление аминокислотных последовательностей полипептида эпоксигеназы Стер18 ра1ае8Йиа (Сра12; последов. № 2); другой эпоксигеназы, происходящей из вида СгерЦ, иного, чем Стерщ ра1ае8Йпа, продуцирующего верноловую кислоту с высоким уровнем (СгерХ; последов. № 4); части аминокислотной последовательности полипептида эпоксигеназы из Уетпоша да1атеи818 (Уда11; последов. № 6); аминокислотной последовательности Д12-ацетиленазы Стер18 а1рта (Сгер1; последов. № 8); Д12-десатураз А. Шакала (Ь26296; последов. № 9); Вгаккюа щпсеа (Х91139; последов. № 10), 61усше тах (Ь43921; последов. №

11) , 8о1апит соттегкопп (Х92847; последов. №

12) и 61усте тах (Ь43920; последов. № 13), а также Д12-гидроксилазы Кюкшк соттишк (И22378; последов. № 14). Подчеркнуты три богатые гистидином области, консервативные для несодержащих гем многофункциональных монооксигеназ.

Фиг. 3 показывает фотографию нозернблот-гибридизации, показывающую семяспецифическую экспрессию гена эпоксигеназы Стерщ раЫекйпа, на примере последов. № 1. Анализ методом нозерн-блоттинга тотальной РНК из листьев (дорожка 1) и из развивающихся семян (дорожка 2) Стерщ ракаеккпа. 15 мкг тотальной РНК разделяли в геле и переносили на мембрану НуЬопб Ν+ (Атегккат) в соответствии с инструкциями изготовителя. Блот гиоридизовали при 60°С зондом, полученным из 3'нетранслируемой области последов. № 1. Блот дважды промыли в 2х88С (№1С1-натрийцитратный буфер) при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем 0,1х88С при 60°С в течение 20 мин.

Фиг. 4 показывает схему нуклеотидной последовательности вырожденного ПЦР-праймера (направление от 5' до 3'), использованного для выделения описываемых здесь генов эпоксигеназы ЕиркотЫа 1адаксае.

Фиг. 5 показывает на примере последовательности № 3 фотографию дот-блотгибридизации РНК, подтверждающей экспрессию гена эпоксигеназы в растениях, синтезирующих верноловую кислоту, по сравнению с растениями, которые не синтезируют верноловую кислоту. 1 мкг тотальной РНК выделяли из определенной ткани и наносили на мембрану НуЬопб Ν+ (Атегккат) в соответствии с инструкциями изготовителя. Блот гибридизовали при температуре 42°С в 50%-ном формамиде с меченым ³²Р зондом, полученным из последовательности № 3, в течение 16 ч. Блоты дважды промыли 2х88С (№С1-натрий-цитрат-ный буфер) при комнатной температуре, затем 0,5х88С при 55°С в течение 20 мин. Авторадиограммы экспонировали в течение ночи. Панель А показывает тотальную РНК из развивающихся семян ЕиркотЫа 1адаксае (1), ЕиркотЫа сурапккик (2), Уетпоша дакипеп515 (3) и льна (Ыпит иккакк5Йпит) (4). Панель В показывает тотальную РНК из различных тканей ЕиркотЫа 1адаксае, включая развивающееся семя (1), корень (2) и лист (3).

Фиг. 6 приводит схему метода вычленяющей гибридизации, использованного для выделения генов эпоксигеназы ЕиркотЫа 1адаксае. Пул +6кДНК состоял преимущественно из последовательностей, подобных последовательностям запасных белков семян. Пул из 15 таких последовательностей биотинилировали, а затем вычленили из +6кДНК. ЕН=длительная гибридизация - 20 ч; 8Н=короткая гибридизация - 3 ч.

Фиг. 7 показывает фотографию дот-блотгибридизации РНК, демонстрирующей на примере последовательности № 20 экспрессию гена эпоксигеназы в растениях, синтезирующих верноловую кислоту, по сравнению с растениями, не синтезирующими верноловую кислоту. 1 мкг тотальной РНК выделяли из указанной ткани и наносили на мембрану НуЬопб Ν+ (Атегккат) (в соответствии с инструкциями изготовителя). Блот гибридизовали при 42°С в 50%-ном формамиде меченым ³²Р зондом, полученным из последовательности № 20, в течение 16 ч. Блоты дважды промывали 2х88С (№1С.’1-натрийцитратный буфер) при комнатной температуре, 0,5х88С при 55°С в течение 20 мин. Авторадиограммы экспонировали в течение ночи. Панель А показывает тотальную РНК из развивающихся семян ЕиркотЫа 1адаксае (1), ЕиркотЫа сурапккик (2), Уетпоша да1ашеп818 (3) и льна (Ь1пит и8ЙаЙ881тит) (4). Панель В показывает тотальную РНК из различных тканей ЕиркотЫа 1адаксае, включая развивающееся семя (1), корень (2) и лист (3).

Фиг. 8 показывает схему бинарного плазмидного вектора, содержащего кассету экспрессии, содержащую укороченный напиновый семя-специфичный промотор (Харш) и терминатор нопалинсинтазы (ΝΤ), с находящимся между ними сайтом клонирования ВатН1, а также ген устойчивости к канамицину ΝΡΤΙΙ, под контролем промотора нопалинсинтазы (ΝΡ) и терминатора нопалинсинтазы (ΝΤ). Кассета экспрессии фланкирована левой (ЬВ) и правой (КВ) последовательностями Т-ДНК.

Фиг. 9 показывает схему бинарного плазмидного вектора, содержащего кассету экспрессии, которая включает последовательность № 1 под контролем укороченного напинового семяспецифичного промотора (№рт) и перед терминатором нопалинсинтазы (ΝΤ), а также ген устойчивости к канамицину ΝΡΤΙΙ, под контролем промотора нопалинсинтазы (ΝΡ) и терминатора нопалинсинтазы (ΝΤ). Кассета экспрессии фланкирована левой (ЬВ) и правой (КВ) последовательностями Т-ДНК. Чтобы получить эту конструкцию, последовательность № 1 встраивали в сайт ВатН1 бинарного вектора, показанного на фиг. 8.

Фиг. 10 показывает графическое изображение газово-хроматографического анализа остатков сложных эфиров жирных кислот и метила, полученных из маслосодержащих семян нетрансформированных растений АгаЫборык 111айапа [панель (а)], или растений А. Файапа (трансгенной линии Сра1-17), трансформированных последовательностью № 1 с использованием генетической конструкции, показанной на фиг. 9 [панели (Ь) и (с)]. В панелях (а) и (Ь) сложные эфиры жирных кислот и метила разделяли с помощью разделения на упакованных колонках. В панели (с) сложные эфиры жирных кислот и метила разделяли с помощью разделения на капиллярных колонках. Указаны позиции элюирования верноловой кислоты.

Фиг. 11 показывает определенное с помощью газовой хроматографии совместное распределение эпоксижирных кислот в полученных от самоопыления семенах растений Τ₁ от Сра12трансформированных растений АгаЫборык 111айапа. Были определены уровни как верноловой кислоты (ось х), так и 12,13-эпокси-9,15октадекадиеновой кислоты (ось у), и указаны на графике друг относительно друга. Данные показывают наличие положительной корреляции между уровнями этих жирных кислот в трансгенных растениях.

Фиг. 12 показывает включение метки ¹⁴С в хлороформную фазу, полученную путем экстракции липидов из семядоль льна. Использованные символы: ♦ - [¹⁴С] олеиновая кислота;

- [¹⁴С] верноловая кислота.

Фиг. 13 показывает включение метки ¹⁴С в фосфатидилхолин семядоль льна. Использованные символы: ♦ - [¹⁴С] олеиновая кислота;

- [¹⁴С] верноловая кислота.

Фиг. 14 показывает включение метки ¹⁴С в триацилглицеролы семядоль льна. Использованные символы: ♦ - [¹⁴С] олеиновая кислота;

- [¹⁴С] верноловая кислота.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Одним из объектов настоящего изобретения является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид эпоксигеназы жирной кислоты, а более предпочтительно полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты.

Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению происходит из источни ка, представляющего собой растение, в частности растение, выбранное из перечня, включающего Сгер18 ЫеппА Сгер18 аигеа, Сгер18 сопухаеГойа, Сгер18 1п1егтеФа. Сгерщ осс1беп1а118, Сгерщ ра1ае811па, СгерЦ уе^сапа, Сгерщ хасйпйа, ЕирйогЫа 1ада8сае и Уетоша да1атеп515. Не исключаются и дополнительные виды.

В настоящем описании термин «происходящий из» используется для указания на то, что определенная составляющая или группа составляющих происходит из указанного биологического вида, но не обязательно была получена непосредственно из указанного источника.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растениеисточник представляет собой вид СгерЦ который содержит высокие уровни верноловой кислоты, такой как Сгерщ ра1ае8Йпа, среди прочих, или, в качестве альтернативы, Уетоша да1атеп818 или ЕирйогЫа 1ада8сае.

Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может представлять собой ДНК, такую как ген, молекулу кДНК, молекулу РНК или молекулу синтетического олигонуклеотида, имеющую либо одинарную, либо двойную цепь, и независимо от любых вторичных структурных характеристик, кроме особо оговоренных случаев.

В настоящем описании термин «ген» используется в его наиболее широком контексте и включает

1) классический геномный ген, включающий транскрипционные и/или трансляционные регуляторные последовательности, и/или кодирующую область и/или нетранслируемые последовательности (т.е. интроны, 5'-и 3'нетранслируемые последовательности); или

2) мРНК или кДНК, соответствующие кодирующим областям (т.е. экзоны) и 5'- и 3'нетранслируемые последовательности гена.

Термин «ген» также используется для описания синтетических или составных молекул, кодирующих весь функциональный продукт или его часть. Предпочтительными генами эпоксигеназ по настоящему изобретению могут быть гены, полученные из встречающегося в природе гена эпоксигеназы с помощью стандартных методов генной инженерии.

Настоящее изобретение, безусловно, распространяется на выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, когда она включена в геном клетки в качестве добавки к эндогенному клеточному набору эпоксигеназных генов. В качестве альтернативы, в случае, если клетка-хозяин в норме не кодирует ферменты, требующиеся для биосинтеза эпоксижирных кислот, настоящее изобретение распространяется на выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, когда она включена в геном указанной клетки в качестве добавки к эндогенному клеточному геному.

В контексте настоящего изобретения термин «эпоксигеназа жирной кислоты» означает фермент, который катализирует биосинтез эпоксигенизированной жирной кислоты, путем преобразования углеродной связи жирной кислоты в эпоксильную группу, и предпочтительно путем преобразования углеродной двойной связи ненасыщенной жирной кислоты в эпоксильную группу. Хотя настоящее изобретение этим не ограничивается, эпоксигеназа жирной кислоты может катализировать биосинтез эпоксижирной кислоты, выбранной из перечня, включающего 12,13-эпокси-9-октадеценовую кислоту (зерноловую кислоту), 12,13-эпокси9,15-октадекадиеновую кислоту, 15,16-эпокси9,12-октадекадиеновую кислоту, 9,10-эпокси12-октадеценовую кислоту и 9,10-эпоксиоктадекановую кислоту, среди прочих.

Термины «эпокси», «эпоксильная группа», «эпоксильный остаток» известны специалистам в данной области техники, как обозначающие трехчленное кольцо, включающее два атома углерода и атом кислорода, соединенные одинарными связями следующим образом:

\ / О

Соответственно, термин «эпоксид» относится к соединениям, которые включают, по меньшей мере, одну эпоксильную группу, определенную здесь выше.

Специалистам в данной области техники известно, что номенклатура жирных кислот основана на длине углеводородной цепи и позиции ненасыщенных атомов углерода в пределах этой углеродной цепи. Исходя из этого, жирные кислоты обозначают с использованием краткого обозначения

Углерод _в=его : двойная связь _воего ^п03иц“^{я двойной} “^{язи |Δ|} в котором двойные связи являются цис-связями, кроме особо оговоренных случаев. Например, пальмитиновая кислота (η-гексадекановая кислота) представляет собой насыщенную 16углеродную жирную кислоту (т.е. 16:0), олеиновая кислота (октадеценовая кислота) представляет собой ненасыщенную 18-углеродную жирную кислоту с одной двойной связью между С-9 и С-10 (т.е. 18:1^Δ9), и линолевая кислота (октадекадиеновая кислота) представляет собой ненасыщенную 18-углеродную жирную кислоту с двумя двойными связями между С-9 и С-10 и между С-12 и С-13 (т.е. 18:2^Δ9,12).

Однако в настоящем контексте фермент эпоксигеназа может катализирозать преобразование любой углеродной связи в эпоксильную группу или, в качестве альтернативы, преобразование любого дубля в субстрате, представляющем собой ненасыщенную жирную кислоту, в эпоксильную группу. Что касается этого, специалистам в данной области техники хорошо известно, что большинство мононенасыщенных жирных кислот высших организмов представляют собой 18-углеродные ненасыщенные жирные кислоты (т.е. 18:1^Δ9), в то время как большинство полиненасыщенных жирных кислот, происходящих из высших организмов, представляют собой 18-углеродные жирные кислоты, по меньшей мере, с одной из двойных связей, расположенных между С-9 и С-10. Кроме того, в бактериях также имеются С16мононенасыщенные жирные кислоты. Кроме того, эпоксигеназа по настоящему изобретению может действовать на более чем одну молекулу субстрата, представляющего собой жирную кислоту, и, вследствие этого, настоящее изобретение не ограничивается природой молекулы субстрата, на которую воздействует эпоксигеназный фермент по настоящему изобретению.

Предпочтительно, чтобы молекула субстрата для эпоксигеназы по настоящему изобретению представляла собой ненасыщеную жирную кислоту, содержащую, по меньшей мере, одну двойную связь.

Кроме того, эпоксигеназные ферменты могут действовать на любое количество атомов углерода в любой из молекул субстрата. Например, они могут быть охарактеризованы, среди прочих, как ферменты Δ6-эпоксигеназа, Δ9эпоксигеназа, Δ12-эпоксигеназа или Δ15эпоксигеназа. В соответствии с этим настоящее изобретение не ограничено позицией атома углерода в субстрате, на который может воздействовать эпоксигеназный фермент.

Термин «А6-эпоксигеназа» в настоящем описании используется для обозначения эпоксигеназного фермента, который катализирует преобразование Δ6-углеродной связи субстрата, представляющего собой жирную кислоту, в Δ6эпоксильную группу и предпочтительно катализирует преобразование Δ6-двойной связи, по меньшей мере, одной ненасыщенной жирной кислоты в Δ6-эпоксильную группу.

Термин «А9-эпоксигеназа» в настоящем описании используется для обозначения эпоксигеназного фермента, который катализирует преобразование Δ9-углеродной связи субстрата, представляющего собой жирную кислоту, в Δ9эпоксильную группу и предпочтительно катализирует преобразование Δ9-двойной связи, по меньшей мере, одной ненасыщенной жирной кислоты в Δ9-эпоксильную группу.

Термин «А12-эпоксигеназа» в настоящем описании используется для обозначения эпоксигеназного фермента, который катализирует преобразование Δ12-углеродной связи субстрата, представляющего собой жирную кислоту, в Δ12-эпоксильную группу и предпочтительно катализирует преобразование Δ12-двойной связи, по меньшей мере, одной ненасыщенной жирной кислоты в Δ12-эпоксильную группу.

Термин «Д15-эпоксигеназа» в настоящем описании используется для обозначения эпоксигеназного фермента, который катализирует преобразование Д15-углеродной связи субстрата, представляющего собой жирную кислоту, в Д15-эпоксильную группу и предпочтительно катализирует преобразование Д15-двойной связи, по меньшей мере, одной ненасыщенной жирной кислоты в Д15-эпоксильную группу.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения эпоксигеназа жирной кислоты по настоящему изобретению представляет собой Д12-эпоксигеназу, Д15-эпоксигеназу или Д9-эпоксигеназу, как они определены выше в настоящем описании.

Более предпочтительно, чтобы эпоксигеназа жирной кислоты по настоящему изобретению представляла собой Д12-эпоксигеназу, как она определена выше в настоящем описании.

В особо предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует линолеат-Д12-эпоксигеназу, фермент, который, по меньшей мере, преобразовывает Д12-двойную связь линолевой кислоты в Д12-эпоксильную группу, тем самым продуцируя 12,13-эпокси-9-октадеценовую кислоту (верноловую кислоту).

Хотя это не ограничивает настоящего изобретения, предпочтительным источником Δ12эпоксигеназы по настоящему изобретению является растение, в частности СгерБ ра1аейта, и другие виды Стерщ, которые отличаются от С. ра1ае8Йиа, но содержат высокие уровни верноловой кислоты, а также Уетпоша да1атеп818 или ЕирйотЫа 1ада5сае.

В соответствии с этим вариантом осуществления изобретения Δ12-эпоксигеназа может катализировать преобразование пальмитолеиновой кислоты в 9,10-эпоксипальмитиновую кислоту, и/или преобразование олеиновой кислоты в 9,10-эпоксистеариновую кислоту, и/или преобразование линолевой кислоты в любую одну или более одной из 9,10-эпокси-12-октадеценовой кислоты, или 12,13-эпокси-9-октадеценовой кислоты, или 9,10,12,13-диэпоксистеариновой кислоты, и/или преобразование линоленовой кислоты в любую одну или более одной из 9,10эпокси-12,15-октадекадиеновой кислоты, или

12.13- эпокси-9,15-октадекадиеновой кислоты, или 15,16-эпоксиоктадекадиеновой кислоты, или

9.10.12.13- диэпокси-15-октадеценовой кислоты, или 9,10,15,16-диэпокси-12-октадеценовой кислоты, или 12,13,15,16-диэпокси-9-октадеценовой кислоты, или 9,10,12,13,15,16-триэпоксистеариновой кислоты, и/или преобразование арахидоновой кислоты в любую одну или более одной из 5,6-эпокси-8,11,14-тетракозатриеновой кислоты, или 8,9-эпокси-5,11,14-тетракозатриеновой кислоты, или 11,12-эпокси-5,8,14тетракозатриеновой кислоты, или 14,15-эпокси

5,8,11-тетракозатриеновой кислоты, или 5,6,8,9диэпокси-11,14-тетракозадиеновой кислоты, или 5,6,11,12-диэпокси-8,14-тетракозадиеновой кислоты, или 5,6,14,15-диэпокси-8,11-тетракозадиеновой кислоты, или 8,9,11,12-диэпокси-5,14тетракозадиеновой кислоты, или 8,9,14,15-диэпокси-5,11-тетракозадиеновой кислоты, или

11.12.14.15- диэпокси-5,8-тетракозадиеновой кислоты, или 5,6,8,9,11,12-триэпокси-14-тетракозеновой кислоты, или 5,6,8,9,14,15-триэпокси11-тетракозеновой кислоты, или 5,6,11,12,14,15триэпокси-8-тетракозеновой кислоты, или 8,9,

11.12.14.15- триэпокси-5-тетракозеновой кислоты, среди прочих.

Специалистам в данной области может быть известно, что не все перечисленные выше субстраты могут происходить из природных источников, но, несмотря на это, их можно получить с помощью химического синтеза. Преобразование как встречающихся в природе, так и химически синтезированных ненасыщенных жирных кислот в эпоксижирные кислоты находится в пределах объема настоящего изобретения, причем единственное требование состоит в том, чтобы описанная здесь молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодировала фермент или его функциональную часть, способные катализировать указанное преобразование.

В соответствии с вышеобсуждавшимся специалистам в данной области техники известно, что эпоксигеназа жирной кислоты может представлять собой фермент цитохром-Р-450зависимую монооксигеназу или монооксигеназный фермент со смешанными функциями, или, в качестве альтернативы, фермент пероксидзависимую пероксигеназу, или подобный фермент, среди прочих. Однако настоящее изобретение особо направлено на те эпоксигеназные ферменты, которые представляют собой монооксигеназные ферменты со смешанными функциями, а также на кодирующее их молекулы нуклеиновой кислоты и на их использование. В соответствии с этим особо предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодировала полипептид монооксигеназного фермента со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты.

В контексте настоящего изобретения термин «монооксигеназный фермент со смешанными функциями» обозначает любой фермент, который катализирует эпоксигенизирование углеродной связи или углеродной двойной связи в молекуле жирной кислоты, причем указанный фермент включает также последовательность аминокислот, которая содержит три обогащенные гистидином области, как указанные ниже:

1) Н18-(Хаа)3-4-Н18;

2) Нщ-(Хаа)_2-з-Н18-Нщ; и

3) Ηί8-(ΧΗΗ)₂.3-Ηί8-Ηί8, где Ηΐ5 обозначает гистидин, Хаа обозначает остаток встречающейся в природе аминокислоты, такой как показан в таблице настоящего списания, составляющая (Хаа)_3-4 обозначает последовательность аминокислот, включающую три или четыре повтора Хаа, а составляющая (Хаа)2-3 обозначает последовательность аминокислот, включающую два или три повтора Хаа.

Термин «фермент, подобный монооксигеназе со смешанными функциями» означает любой фермент, который включает три богатые гистидином области, перечисленные выше.

Таблица 1

Аминокислота	Трехбуквенная аббревиатура	Однобуквенный символ
Аланин	А1а	А
Аргигин	Агд	К
Аспарагин	Азп	N
Аспарагиновая кислота	Азр	Б
Цистеин	Суз	С
Глютамин	С1п	Ω
Глютаминовая кислота	С1и	Е
Глицин	С1у	с-
Гистидин	Η13	Η
Изолейцин	11е	I
Лейцин	Ьеи	ь
Лизин	Ьуз	К
Метионин	Ме!	М
Фенилаланин	РЬе	г
Пролин	Рго	Р
Серин	8ег	8
Треонин	ТЬг	Т
Триптофан	Тгр	Ж
Тирозин	Туг	Υ
Валин	ν^	V
Любая аминокислота из указанных выше	Хаа	X

В описанном здесь примере осуществления данного изобретения его авторы продемонстрировали, что описываемая здесь аминокислотная последовательность Сгерщ ра1аезйпа включает фермент Д12-эпоксигеназу, который включает характерные мотивы аминокислотной последовательности монооксигеназного фермента со смешанными функциями, определенного выше в настоящем описании. Близкая идентичность аминокислотных последовательностей между ферментом Д12-эпоксиге-назой С. ра1ае8Йпа (последов. № 2) и аминокислотными последовательностями полипептидов, происходящих из неидентифицированного вида Стерщ и из Уетпоша да1атеп51з, приведенных в настоящем описании (последов. №№ 4 и 6), по сравнению с аминокислотными последовательностями других монооксигеназ со смешанными функциями, таких как десатуразы и гидроксилазы, позволяет предположить, что указанные аминокислотные последовательности Стерщ зр. и V. да1атепз1з также представляют собой эпоксигеназные ферменты жирных кислот и могут представлять собой Д12-эпоксигеназные ферменты.

В этом отношении, аминокислотная последовательность Vе^ηоη^а да1атепз1з, приведенная в настоящем описании, представляет собой часть последовательности, которая включает только одну полную обогащенную гистидином область (т.е. 415^1^^50-415-415) и часть последовательности первой обогащенной гистидином области (т.е. два последних остатка гистидина области 4^5-^1и-Су5-^1у-4^5-4^5). потому что кодирующая ее соответствующая нуклеотидная последовательность была амплифицирована посредством полимеразной цепной реакции в качестве частичной последовательности кДНК, с помощью первого праймера для этой первой обогащенной гистидином области и второго амплификационного праймера, предназначенного для области, расположенной выше третьей обогащенной гистидином области (т.е. Шз-УаТ МеЬ-Ихз-Ихз). Кроме того, тот факт, что последовательность V. да1атепз15 была амплифицирована с помощью праймера, специфичного для первой обогащенной гистидином области, указывает на то, что соответствующая полноразмерная последовательность также включает эту область.

В соответствии с этим в особо предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодирует монооксигеназный фермент эпоксигеназу со смешанными функциями или подобный ему фермент, происходящий из видов Сгер15, включая Стер1з ра1аез1ша, или, в качестве альтернативы, происходящий из Vе^поша да1атепз15. В соответствии с этим вариантом осуществления изобретения даже более предпочтительно, чтобы эпоксигеназа по данному изобретению включала, по меньшей мере, аминокислотную последовательность, которая содержит три или более обогащенные гистидином области, указанные ниже:

1) Жз-СЫ-Суз-Су-Шз-Жз (последов. № 15);

2) Η^5-Α^д-Α5п-Η^5-Η^5 (последов. № 16); и

3) Η^5-Vа1-Μеΐ-Η^5-Η^5 (последов. № 17), в которых Η15 обозначает гистидин, С1и обозначает глютамат, Су5 обозначает цистеин, С1у обозначает глицин, Агд обозначает аргинин, А5п обозначает аспарагин, Vа1 обозначает валин, Ме1 обозначает метионин.

В соответствии с вышесказанным один из аспектов настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Сгер15 ра1аезИпа со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имею17 щий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Νο: 2;

(б) нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο: 1 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и (в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б).

Аминокислотная последовательность, представленная в последов. № 2, обладает Δ12эпоксигеназной активностью.

Другой аспект настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы СгсрЕ 5р.. за исключением Сгер15 ра1ае5Епа. со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Νο: 4;

(б) нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο: 3 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и (в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б).

Нуклеотидная последовательность, представленная в последов. № 3, соответствует кДНК, происходящей из вида Сгер15, иного, чем Сгер15 ра1ае5Йпа, который содержит высокие уровни верноловой кислоты.

Еще один аспект настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Уептоша да1атеп515 со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Νο: 6;

(б) нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο: 5 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и (в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б).

Нуклеотидная последовательность, представленная в последов. № 5, соответствует амплифицированной ДНК, полученной из Уептоша да1ашеп515 с помощью амплификационных праймеров, выведенных на основе консенсусной (общей) последовательности монооксигеназ со смешанными функциями, включая последовательность гена эпоксигеназы Сгер15 5рр. по настоящему изобретению. Амплифицированная ДНК включает частичную последовательность гена эпоксигеназы, включающую нуклеотидные последовательности, способные кодировать обогащенную гистидином область Н15-Агд-А5пΗΪ5-ΗΪ5, которая характерна для монооксигеназных ферментов со смешанными функциями.

Авторы настоящего изобретения также выделили посредством амплификации нуклеотидные последовательности, представленные в последов. №№ 19 и 20, которые происходят из ΕυρΕοτΕίΒ 1ада5сае и кодируют предполагаемую последовательность цитохром-Р-450-зависимой монооксигеназы, либо последовательность, подобную последовательности цитохром-Р-450зависимой монооксигеназы. С этой целью использовали нуклеотидную последовательность, представленную в последов. № 18, которая соответствует вырожденному амплификационному праймеру. В связи с этим, нуклеотидные остатки, показанные в последов. № 18, обозначены в соответствии с рекомендациями Комиссии по Биохимической Номенклатуре ШРАС-ШВ, а именно, А представляет собой аденин, С представляет собой цитозин, С представляет собой гуанин, Т представляет собой тимин, Υ представляет собой остаток пиримидина, К. представляет собой остаток пурина, М представляет собой аденин или цитозин, К представляет собой гуанин или тимин, 8 представляет собой гуанин или цитозин, представляет собой аденин или тимин, Н представляет собой нуклеотид, не являющийся гуанином, В представляет собой нуклеотид, не являющийся аденином, V представляет собой нуклеотид, не являющийся тимином, Ό представляет собой нуклеотид, не являющийся цитозином, и Ν представляет собой остаток любого нуклеотида.

Описываемые здесь выделенные молекулы нуклеиновой кислоты можно использовать для выделения или идентификации их гомологов, аналогов или производных, происходящих из других клеток, тканей или другого типа органов, либо из клеток, тканей или органов других биологических видов, с помощью любого из множества способов, известных специалистам в данной области техники.

Например, геномную ДНК, или мРНК, или кДНК можно привести в контакт, по меньшей мере, в мягких условиях гибридизации или в эквивалентных условиях, с эффективным для гибридизации количеством выделенных молекул нуклеиновой кислоты, включающих нуклеотидную последовательность, представленную в любой из последов. №№ 1, 3, 5, 19 или 20, либо комплементарную по отношению к ним последовательность, либо ее функциональную часть, и факт гибридизации устанавливают с помощью средств ее обнаружения.

Средства обнаружения могут представлять собой репортерную молекулу, способную пода19 вать идентифицируемый сигнал (например, радиоизотоп, такой как ³²Р или ³⁵δ, или обработанная биотином молекула), ковалентно связанную с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

В качестве альтернативного способа средства обнаружения представляют собой любой известный формат полимеразной цепной реакции (ПЦР). В соответствии с этим способом конструируют вырожденные пулы «праймерных молекул» нуклеиновой кислоты длиной около 15-50 нуклеотидов, на основе нуклеотидных последовательностей, описанных в последов. №№ 1, 3, 5, 19 или 20 или комплементарных по отношению к ним последовательностей. Гомологи, аналоги и производные (т.е. «матричные молекулы») гибридизируют с двумя из указанных праймерных молекул так, чтобы первый праймер гибридизировался с областью на одной цепи матричной молекулы, а второй праймер гибридизировался с комплементарной по отношению к ней последовательностью, причем первый и второй праймеры не должны гибридизироваться в пределах одной и той же области или перекрывающих друг друга областей матричной молекулы, и при этом каждый праймер должен иметь ориентацию от 5' до 3', по отношению к позиции, в которой другой праймер гибридизируется на противоположной цепи. Конкретные молекулы нуклеиновой кислоты, представляющие собой копии матричной молекулы, амплифицируются с помощью ферментов в процессе полимеразной цепной реакции, методика которой хорошо известна специалистам в данной области техники.

Праймерные молекулы могут включать любые встречающиеся в природе нуклеотидные остатки (т.е. аденин, цитидин, гуанин, тимидин) и/или могут включать инозин либо его функциональные аналоги или производные, способные включаться в молекулу полинуклеотида. Праймерные молекулы нуклеиновой кислоты могут также содержаться в водной смеси других праймерных молекул нуклеиновой кислоты, либо они могут находиться по существу в чистом виде.

Обнаруженная последовательность может находиться в рекомбинантной форме, в вирусной частице, в частице бактериофага, в клетке дрожжей, в клетке животного или в клетке растения. Предпочтительно, чтобы родственные генетические последовательности происходили из другого вида растений.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению полезна для создания включающих ее генетических конструкций, которые предназначены для экспрессии в клетке, которая в норме не экспрессирует указанную молекулу нуклеиновой кислоты, либо для сверхэкспрессии указанной молекулы нуклеиновой кислоты в клетке, которая нормально экспрессирует указанную молекулу нуклеино вой кислоты, чтобы получить рекомбинантный полипептид монооксигеназы, т.е. для создания генетических конструкций, включающих «смысловую» молекулу.

В соответствии с этим следующий аспект настоящего изобретения касается генетической конструкции, которая включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующую полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, или ее часть, которая кодирует ферментативно активную часть указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в смысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции ίη νίνο существующего в природе гена монооксигеназы.

В настоящем описании термин «ферментативно активный» используется для обозначения способности молекулы полипептида катализировать ферментативную реакцию, в частности ферментативную реакцию, включающую эпоксигенизирование углеродной связи в молекуле субстрата, представляющего собой жирную кислоту. Более конкретно, однако, не ограничивая этим данное изобретение, термин «ферментативно активный» также может обозначать способность молекулы полипептида катализировать эпоксигенизирование Δ-9 или Δ-12 в молекуле субстрата, представляющего собой жирную кислоту, такую как линолевая кислота или верноловая кислота.

Специалистам в данной области техники известно, что генетическую конструкцию можно использовать для того, чтобы «трансфецировать» клетку, и в этом случае она вводится в указанную клетку без интеграции ее в клеточный геном. В качестве альтернативы, генетическая конструкция может использоваться для того, чтобы «трансформировать» клетку, и в этом случае она стабильно включается в геном указанной клетки.

«Смысловая» молекула, которая соответствует последовательности гена монооксигеназы по настоящему изобретению или его части, может быть введена в клетку с помощью любого известного способа трансфекции или трансформации указанной клетки. В случае, если клетку трансформируют с помощью генетической конструкции по настоящему изобретению, то из одной трансформированной клетки можно регенерировать целый организм с помощью способов, известных специалистам в данной области техники.

Таким образом, описанные здесь гены монооксиненаз со смешанными функциями могут использоваться для получения отдельных клеток или целых организмов, синтезирующих эпоксижирные кислоты, которые в норме не продуцируются дикими или существующими в природе организмами, принадлежащим к тем же самым родам и видам, что и те роды или виды, из которых получены трансфецированные или трансформированные клетки, или для увеличения уровня содержания таких жирных кислот по сравнению с уровнями, нормально присутствующими в таких диких или существующих в природе организмах.

Следующий аспект настоящего изобретения касается генетической конструкции, которая включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующую полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, или ее часть, которая способна модифицировать экспрессию указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в антисмысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции ίη νίνο существующего в природе гена монооксигеназы.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению или ее часть способна уменьшить экспрессию монооксигеназы по настоящему изобретению, если она экспрессируется под контролем последовательности соответствующего промотора в антисмысловой ориентации или в виде рибозимной молекулы.

В контексте настоящего изобретения «антисмысловая» молекула представляет собой молекулу РНК, которая транскрибирована из комплементарной цепи ядерного гена в такой, который в норме транскрибируется для продуцирования «смысловой» молекулы мРНК, способной быть транслированной в полипептид. Поэтому антисмысловая молекула является комплементарной по отношению к смысловой мРНК или к ее части. Хотя это и не ограничивает режим действия настоящего изобретения никаким специфическим механизмом, молекула антисмысловой РНК обладает способностью образовывать мРНК с двойной цепью путем спаривания оснований со смысловой мРНК, что может предотвратить трансляцию смысловой мРНК и последующий синтез продукта гена полипептида.

Рибозимы представляют собой синтетические молекулы РНК, которые включают область гибридизации, комплементарную по отношению к двум областям, каждая из которых содержит, по меньшей мере, по 5 сцепленных оснований нуклеотидов в являющейся мишенью смысловой мРНК. Кроме того, рибозимы обладают высокоспецифичной эндорибонуклеазной активностью, которая автокаталитически расщепляет являющуюся мишенью смысловую мРНК. Полное описание функций рибозимов представлено в работе На5с1оГГ апб Сег1аей (1988) и содержится в международной заявке АО 89/05852. Настоящее изобретение распространяется на рибозимы, мишенью которых яв ляется смысловая РНК, кодирующая описанный здесь полипептид монооксигеназы, тем самым гибридизируя указанную смысловую РНК и расщепляя ее, в результате чего она теряет способность быть транслированной и синтезировать продукт функционального полипептида.

В соответствии с этим вариантом его осуществления настоящее изобретение касается рибозимной или антисмысловой молекулы, включающей последовательность сцепленных оснований нуклеотидов, которые способны образовать связанный водородом комплекс со смысловой мРНК, кодирующей описываемую здесь монооксигеназу, тем самым уменьшая трансляцию указанной мРНК. Хотя предпочтительные антисмысловые и/или рибозимные молекулы гибридизируются по меньшей мере до от около 10 до 20 нуклеотидов молекулымишени, настоящее изобретение распространяется на молекулы, способные к гибридизации, по меньшей мере, до длины около 50-100 оснований нуклеотидов, или на молекулу, способную к гибридизации с мРНК монооксигеназы, имеющей полную длину или по существу полную длину.

Для ингибирования экспрессии гена монооксигеназы, описанного в настоящем описании изобретения, настоящее изобретение распространяется на использование соподавления. Соподавление представляет собой уменьшение экспрессии эндогенного гена, которое происходит в случае, когда одна или более копий указанного гена, или одна или более копий существенно подобного гена введены в клетку.

Для целей настоящего изобретения выбор промотора может варьироваться в зависимости от требуемого уровня экспрессии смысловой молекулы, и/или от биологического вида, из которого происходит клетка-хозяин, и/или от специфики экспрессии требующейся смысловой молекулы, связанной с видом ткани или со стадией развития.

Термин «промотор» в настоящем описании используется в его наиболее широком смысле и включает транскрипционные регуляторные последовательности классического эукариотного геномного гена, включая блок ТАТА, который требуется для точной инициации транскрипции, с блоком последовательности ССААТ или без него, а также дополнительные регуляторные элементы (т.е. вышерасположенные активирующие последовательности, энхансеры и сайленсеры), которые изменяют экспрессию гена в ответ на стимулы, связанные со стадией развития, и/или внешние стимулы, или тканевоспецифическим образом. В контексте настоящего изобретения термин «промотор» также включает транскрипционные регуляторные последовательности классического прокариотного гена, и в этом случае он может включать последовательность блока -35 и/или транскрипционные регуляторные последовательности блока -10.

В настоящем контексте термин «промотор» также используется для описания синтетической или составной молекулы или их производного, которые определяют, активируют или усиливают экспрессию указанной смысловой молекулы в клетке. Предпочтительные промоторы могут содержать дополнительные копии одного или более особых регуляторных элементов для еще большего усиления экспрессии смысловой молекулы и/или для изменения экспрессии указанной смысловой молекулы в пространстве и/или во времени. Например, чувствительные к меди регуляторные элементы можно разместить рядом с последовательностью гетерологичного промотора, управляющего экспрессией смысловой молекулы, чтобы придать ей свойство индуцируемой медью экспрессии.

Помещение смысловой, антисмысловой, рибозимной или соподавляющей молекулы под регуляторный контроль последовательности промотора означает, что указанную молекулу располагают таким образом, чтобы экспрессия контролировалась последовательностью промотора. Промотор обычно, но не обязательно, расположен выше или в положении 5' по отношению к молекуле нуклеиновой кислоты, которую он регулирует. Кроме того, регуляторные элементы, включающие промотор, обычно расположены в пределах 2 т.п.н. сайта запуска транскрипции смысловой, антисмысловой, рибозимной или соподавляющей молекулы. В конструкции комбинаций гетерологичного промотора/структурного гена, как правило, предпочтительно располагать промотор на расстоянии от сайта запуска транскрипции гена, которое примерно равно расстоянию между промотором и контролируемым им геном в его естественном хромосомном наборе, т.е. в гене, из которого происходит данный промотор. Как известно в данной области техники, допустимы некоторые вариации в величине этого расстояния, без потери функции промотора. Подобным образом, предпочтительное расположение элемента регуляторной последовательности по отношению к гетерологичному гену, который помещают под его контроль, определяется расположением этого элемента в его естественном хромосомном наборе, т. е. в генах, из которых получен этот элемент. Опять-таки, в данной области техники известно, что также могут иметь место некоторые вариации по длине этого расстояния.

Примеры промоторов, пригодных для использования в генетических конструкциях по настоящему изобретению, включают промоторы, полученные из генов вирусов, дрожжей, плесневых грибов, бактерий, насекомых, птиц, млекопитающих и растений, способных к функционированию в изолированных клетках или в регенерировавших из них целых организмах. Промотор может регулировать экспрессию смысловой, антисмысловой, рибозимной или соподавляющей молекулы конститутивно или дифференциально, в зависимости от ткани, в которой имеет место экспрессия, в зависимости от стадии развития, в которой происходит экспрессия, или в зависимости от внешних воздействий, таких как физиологические стрессы, патогены или ионы металлов, среди прочего.

Примеры промоторов включают промотор СаМУ 358, промотор N08, промотор октопинсинтазы (0С8), промотор гена 88И АгаЫборШ ШаПаиа, напиновый семя-специфичный промотор, промотор Р₃₂, ВК5-Т 1шт-промотор, 1аспромотор, 1ас-промотор, промоторы фага лямбда λ,, или λ₈, промотор СМУ (патент США № 5168062), промотор Т7, промотор 1асИУ5, ранний промотор 8У40 (патент США № 5118627), поздний промотор 8У40 (патент США № 5118627), промотор аденовируса, промотор бакуловируса Р10 или полиэдриновый промотор (патенты США №№ 5243041, 5242687, 5266317, 4745051 и 5169784) и им подобные. Кроме специфических указанных здесь промоторов, пригодны также клеточные промоторы для так называемых конститутивных генов.

Предпочтительными промоторами в соответствии с этим вариантом осуществления изобретения являются промоторы, способные к функционированию в клетках дрожжей, плесневых грибов или растений. Более предпочтительно, чтобы промоторы, пригодные для использования в соответствии с этим вариантом осуществления изобретения, были способными к функционированию в клетках, происходящих из жиросодержащих дрожжей, жиросодержащих плесневых грибов или культурных растений с масличными семенами, таких как лен, в том числе лен обыкновенный, лен, поступающий в продажу под торговой маркой Ыио1а® (далее здесь именуемый «лен Ыио1а®)», а также подсолнечник, сафлор, соя, кунжут, семена хлопчатника, арахис, маслина или масличная пальма, среди прочего.

Ьто1а® является зарегистрированной торговой маркой Организации научных и промышленных исследований Содружества (С81Р0). Австралия.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения промотор может происходить из геномных генов, кодирующих полипептид монооксигеназы по настоящему изобретению.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения промотор может происходить из высокоэкспрессируемого в семенах гена, такого как напиновый ген, среди прочих.

Генетическая конструкция по настоящему изобретению может также включать последовательность терминатора и может быть встроена в подходящую клетку-хозяин, в которой она способна экспрессироваться, вырабатывая продукт гена рекомбинантного полипептида, или, в качестве альтернативы, в рибозимную или в антисмысловую молекулу.

Термин «терминатор» обозначает последовательность ДНК в конце единицы транскрипции, которая сигнализирует об окончании транскрипции. Терминаторы представляют собой З'-нетранслируемые последовательности ДНК, содержащие сигнал полиаденилирования, который стимулирует добавление полиаденилированных последовательностей к 3'-концу первичного транскрипта. Терминаторы, активные в клетках, происходящих из вирусов, дрожжей, плесневых грибов, бактерий, насекомых, птиц, млекопитающих и растений, известны и описаны в литературе. Их можно выделить из бактерий, грибов, вирусов, животных и/или растений.

Примеры терминаторов, особенно пригодных для использования в генетических конструкциях по настоящему изобретению, включают терминатор гена нопалинсинтазы (N08) АдтоЬас!етшт ШтеГааепк, терминатор гена вируса мозаики цветной капусты (СаМУ) 358, терминатор гена хеш из кукурузы 2еа таук, последовательности терминатора гена малой субъединицы (88И) Рубиско, терминаторы последовательности гена вируса карликовости подземного клевера (8С8У), любой тйо-независимый терминатор Е. сой, среди прочих.

Специалистам в данной области техники известны и другие промоторные и терминаторные последовательности, которые могут быть пригодными для осуществления данного изобретения. Такие последовательности вполне можно использовать без проведения каких-либо дополнительных экспериментов.

Генетические конструкции по настоящему изобретению могут также включать область начала репликации, которая требуется для репликации определенного типа клеток, например бактериальной клетки, в случае, когда требуется, чтобы указанная генетическая конструкция поддерживалась в эписомном генетическом элементе (например, в плазмиде или в молекуле космиды) в указанной клетке.

Предпочтительные области начала репликации включают, не ограничиваясь ими, области начала репликации -Г-ой и со1Е1.

Генетическая конструкция может также включать ген или гены селектируемого маркера, которые являются функциональными в клетке, в которую вводится указанная генетическая конструкция.

Термин «ген селектируемого маркера», как он используется в настоящем описании, включает любой ген, определяющий фенотип клетки, в которой он экспрессируется, и который используют, чтобы облегчить идентификацию и/или отбор клеток, трансфецированных или трансформированных с помощью генетической конструкции по настоящему изобретению.

Подходящие гены селектируемых маркеров, рассматриваемые в настоящем описании, включают ген устойчивости к ампициллину (Атрг), ген устойчивости к тетрациклину (Тсг), ген устойчивости к бактериальному канамицину (Капг), ген устойчивости к фосфинотрицину, ген неомицинфосфотрансферазы (прШ), ген устойчивости к гигромицину, ген β-глюкуронидазы (СИ8), ген хлорафениколацетилтрансферазы (САТ) и ген люциферазы, среди прочих.

Предпочтительно, чтобы выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержалась внутри описанной здесь генетической конструкции. Генетическая конструкция по настоящему изобретению может быть введена в клетку с помощью различных методов, известных специалистам в данной области техники. Используемые методы могут быть различными, в зависимости от того, какие методы известны и успешно применяются для данного конкретного организма.

Способы введения рекомбинантной ДНК в бактериальные клетки, клетки дрожжей, или растений, грибов (включая плесневые грибы), в ткани или клетки птиц или млекопитающих включают, не ограничиваясь этим, трансформацию с использованием СаС1₂ и ее вариации, в частности способ, описанный Напапап (1983), прямое введение ДНК в протопласты (Кгепк е! а1., 1982; Ра8хко\\ък| е! а1., 1984), опосредованное ПЭГ введение в протопласты (АпШгопд е! а1., 1990), бомбардировку микрочастицами, электропорацию (Етотт е! а1., 1985), микроинъекцию ДНК (Сгокктау е! а1., 1986), бомбардировку микрочастицами тканевых эксплантатов или клеток (Сйп8!ои е! а1., 1988; 8аиГотб, 1988), вакуум-инфильтрацию тканей нуклеиновой кислотой, или, в случае растений, опосредованный Т-ДНК перенос из АдтоЬас!етшт в ткань растения, как подробно описано Ап е! а1. (1985), Негтега-Е8(те11а е! а1. (1983а, 1983Ь, 1985).

При бомбардировке клеток микрочастицами, микрочастицы внедряются в клетку, в результате чего получают трансформированную клетку. При осуществлении настоящего изобретения можно использовать любую подходящую методологию баллистической трансформации клеток и любое подходящее для этого устройство. Примеры таких устройств и методов описали 8!отр е! а1. (патент США № 5122466), а также 8апГогб апб \Уо1Г (патент США № 4945050). При использовании методов баллистической трансформации генетическую конструкцию можно внедрить в плазмиду, способную к репликации в клетке, подлежащей трансформации.

Примеры микрочастиц, пригодных для использования в таких системах, включают золотые шарики размером от 1 до 5 мкм. Конструкция ДНК может быть нанесена на микрочастицы с помощью любого подходящего способа, такого как осаждение.

В особо предпочтительном варианте осуществления изобретения, в котором генетическая конструкция включает «смысловую» молекулу, особо предпочтительно, чтобы полипептид рекомбинантной монооксигеназы, продуцированный из нее, был ферментативно активным.

В качестве альтернативы, в случае, если клетка происходит из многоклеточного организма, а также, когда существует подходящая технология, из трансформированной клетки может быть регенерирован целый организм в соответствии с методами, известными в данной области техники.

Специалистам в данной области техники известны также методы трансформации, регенерации и размножения других типов клеток, таких как клетки грибов.

В случае растений, растительные ткани, способные к последующему клональному размножению, с помощью органогенеза или эмбриогенеза, можно трансформировать с помощью генетической конструкции по настоящему изобретению и регенерировать из них целое растение. Выбор конкретной ткани зависит от систем размножения, имеющихся и наиболее подходящих для конкретных биологических видов, подвергаемых трансформации. Примеры таких тканей включают листовые диски, пыльцу, зародыши, семядоли, гипокотили, мегагаметофиты, каллусные ткани, существующие меристематические ткани (например, верхушечную меристему, пазушные почки и корневую меристему), а также индуцированную меристематическую ткань (например, меристему, полученную из семядоль или гипокотиля).

Термин «органогенез», как он используется здесь, означает процесс, с помощью которого из меристематических центров последовательно развиваются побеги и корни.

Термин «эмбриогенез», как он используется здесь, означает процесс, с помощью которого побеги и корни развиваются вместе, одновременно (а не последовательно), из соматических тканей или из гамет.

Регенерированные трансформированные растения можно размножить с помощью различных способов, таких как клональное размножение или классические селекционные способы. Например, первое поколение трансформированных растений (Т1) можно подвергнуть самоопылению, чтобы получить гомозиготное второе поколение трансформантов (Т2), а далее растения Т2 размножить с помощью классических селекционных способов.

Рассматриваемые в настоящем описании регенерировавшие трансформированные организмы могут представлять собой ряд различных форм. Например, это могут быть химеры, состоящие из трансформированных клеток и нетрансформированных клеток; клональные трансформанты (т.е. все клетки которых трансформированы таким образом, что они содержат кассеты экспрессии); прививки трансформированных и нетрансформированных тканей (например, для растений на трансформированный корневой подвой привит нетрансформированный привой).

В соответствии с вышесказанным настоящее изобретение распространяется на растение, трансформированное молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, а также на семя и потомство такого растения, которые содержат указанную молекулу нуклеиновой кислоты.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, в клетке или в микроорганизме, включающего введение генетической конструкции настоящего изобретения в клетку или в микроорганизм и инкубацию указанной клетки или микроорганизма в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для осуществления экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы, в данной генетической конструкции.

В предпочтительном варианте осуществления стадия введения генетической конструкции включает стабильную трансформацию клетки или микроорганизма генетической конструкцией.

В соответствии с этим вариантом осуществления изобретения клетка может происходить из дрожжей, грибов (включая плесневые грибы), насекомого, растения, птицы или млекопитающего. Также в соответствии с данным способом клетка может являться частью ткани, органа или целого растения.

Поскольку рекомбинантный полипептид монооксигеназы может экспрессироваться в регенерировавшем трансформанте, а также и ех νίνο, то один из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения касается способа получения рекомбинантного ферментативно активного полипептида монооксигеназы со смешанными функциями в клетке, причем указанный способ включает культивирование клетки, содержащей генетическую конструкцию настоящего изобретения, в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы, в указанной генетической конструкции.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный способ включает стадию введения генетической конструкции в клетку перед культивированием клетки.

Особо предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения касается способа получения рекомбинатного ферментативно активного полипептида монооксигеназы со смешанными функциями в трансгенном растении, включающий следующие стадии:

(а) введение генетической конструкции по настоящему изобретению в клетку или ткань растения;

(б) регенерацию трансформированного растения из указанной клетки или ткани; и (в) отбор трансформированного растения с высоким уровнем экспрессии в семенах ферментативно активного полипептида монооксигеназы, кодируемого указанной генетической конструкцией.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения растение представляет собой вид растения с масличными семенами с высоким уровнем продуцирования линолевой кислоты, например лен, в том числе лен Ьшо1а®, лен обыкновенный, масличный рапс, подсолнечник, сафлор, соя, кунжут, семена хлопчатника, арахис, маслина европейская или масличная пальма, среди прочих.

В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения растение представляет собой вид с масличными семенами с высоким уровнем продуцирования линолевой кислоты, например лен Ьшо1а®, подсолнечник или сафлор, среди прочих.

Следующий аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы СгерБ ра1ае81ша со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы, состоящей из (а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο: 2; и (б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ Νο: 1 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода.

Другой аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы Сгерщ §р., за исключением Сгерщ ра1ае81ша, со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы, состоящей из (а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο: 4; и (б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ Νο: 3 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода.

Следующий аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы Уегиоша да1атеи818 со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы, состоящей из (а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο: 6; и (б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ Νο: 5 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода.

Описываемые здесь рекомбинатные ферментативно активные полипептида монооксигеназ со смешанными функциями особенно полезны для изменения внутриклеточного содержания эпоксигенизированной жирной кислоты.

В соответствии с этим следующим аспектом настоящего изобретения является способ изменения внутриклеточного содержания эпоксигенизированной жирной кислоты, включающий культивирование клетки, содержащей генетическую конструкцию по настоящему изобретению, в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, в указанной генетической конструкции, и последующее инкубирование указанной клетки с жирнокислотным субстратом в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для того, чтобы по меньшей мере одна углеродная связь указанного субстрата была преобразована в эпоксигруппу.

В соответствии с этим способом клетка происходит из бактерий, дрожжей, грибов (включая плесневые грибы), насекомого, растения, птицы или млекопитающего. Более предпочтительно, чтобы клетка происходила из дрожжей, растения или гриба, а еще более предпочтительно - из жиросодержащих дрожжей или растения или гриба, или из растения с масличными семенами, которое в норме не экспрессирует полипептид монооксигеназы по настоящему изобретению на высоком уровне. В соответствии с настоящим способом клетка может являться составной частью ткани, органа или целого организма.

Среди основных хозяйственно-ценных растений с масличными семенами, рассматриваемых в настоящем описании, предпочтительными являются генотипы льна с высоким содержанием линолевой кислоты, подсолнечник, кукуруза и сафлор. В качестве альтернативы также могут использоваться соя и выращиваемый на семена рапс, однако, они менее подходят с точки зрения максимального синтеза эпоксижирных кислот из-за того, что они содержит более низкие уровни субстрата, представляющего собой линолевую кислоту, а также из-за присутствия активной Д15-десатуразы, которая конкурирует с эпоксигеназой за используемую в качестве субстрата линолевую кислоту.

Альтернативный вариант осуществления изобретения представляет собой трансформацию льна ΕίηοΕι® (=лен с низким содержанием линоленовой кислоты) с помощью монооксигеназы по настоящему изобретению. Лен Είηο1η® обычно содержит около 70% линолевой кислоты, причем лишь очень малая ее доля (<2%) превращается впоследствии в линоленовую кислоту с помощью Д15-десатуразы (Сгееп, 1986).

В предпочтительном варианте способа жирнокислотный субстрат представляет собой ненасыщенную жирную кислоту, а углеродная связь указанного субстрата, которая преобразуется в эпоксигруппу, представляет собой углеродную двойную связь.

Рассматриваемые здесь предпочтительные ненасыщенные жирные кислоты, используемые в качестве субстратов, включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, пальмитолеиновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, 9,15-октадекадиеновую кислоту и арахидоновую кислоту, среди прочих.

В видах растений, естественно содержащих высокие уровни верноловой кислоты, содержащаяся в них Д12-эпоксигеназа может быть очень эффективной для эпоксидизирования линолевой кислоты. Вследствие этого, настоящее изобретение, в частности, касается экспрессии рекомбинантной Д12-эпоксигеназы, происходящей из Уетоша §рр. и Сгер15 §рр., с высокими уровнями в трансгенных масличных семенах во время синтеза масел, в результате чего в них продуцируются высокие уровни верноловой кислоты.

В соответствии с этим линолевая кислота является особо предпочтительным субстратом для этого варианта осуществления изобретения. Дополнительные виды субстратов не исключаются.

Продукты молекул субстратов, перечисленных выше, легко могут определить специалисты в данной области техники без проведения дополнительных экспериментов. Особо предпочтительные эпоксижирные кислоты, продуцируемые в соответствии с настоящим изобретением, включают 12,13-эпокси-9-октадеценовую кислоту (верноловую кислоту) и 12,13эпокси-9,15-октадекадиеновую кислоту, среди прочих.

Условия для инкубации клеток, экспрессирующих рекомбинантную монооксигеназу, в присутствии молекулы субстрата варьируют в зависимости, по меньшей мере, от поглощения субстрата клеткой и от сродства монооксигеназы по отношению к молекуле субстрата в конкретных выбранных условиях окружающей среды. Оптимальные условия могут легко определить специалисты в соответствующей области техники.

Авторы настоящего изобретения также показали, что монооксигеназы со смешанными функциями (ММО), которые осуществляют каталитические функции, такие как десатурирование, ацетиленирование, гидроксилирование и/или эпоксигенирование, образуют семейство генов, имеющих в значительной степени сходные нуклеотидные и аминокислотные последо вательности. Например, ферменты десатураза, ацетиленаза, гидроксилаза и/или эпоксигеназа, которые действуют на молекулы субстрата, имеющие схожие характеристики длины цепи и положения любой углеродной двойной связи (или связей) (если таковые присутствуют), более близко родственны друг с другом, чем с ферментами, действующими на другие субстраты, и их можно рассматривать как «семейство».

Не будучи связанным какой-либо теорией или режимом действия, сходство последовательностей между членами любого семейства генов имеет в своей основе идентичность используемого субстрата и биохимическое сходство реакционных событий, происходящих в являющейся их мишенью углеродной связи во время реакции модификации, что делает возможным предположение, что дивергентные последовательности в пределах семейства могут включать каталитические детерминанты или, по меньшей мере, их функциональную часть, которая вносит вклад в специфические каталитические свойства членов семейства.

Одним из примеров семейства являются ферменты десатураза, ацетиленаза, гидроксилаза и/или эпоксигеназа, которые катализируют соответственно десатурирование, ацетиленирование, гидроксилирование и/или эпоксигенирование позиции Δ12 линолевой кислоты (далее здесь называемое «семейство С18 ΔΠ-ММО»). Авторы настоящего изобретения произвели сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей членов семейства С18 Δ12-ММО, чтобы определить их дивергентные области, которые потенциально включают детерминанты альтернативных каталитических функций в позиции Δ12 (предполагаемые каталитические детерминанты).

Кроме того, наличие таких семейств ММО, модифицирующих жирные кислоты, рассматривается в отношении жирных кислот с другой длиной цепи и другими позициями двойных связей. Например, С18 Δ 15-десатураза рассматривается как принадлежащая к семейству родственных ферментов, способных к десатурированию, ацетиленированию, гидроксилированию и/или эпоксигенированию позиции Δ15 жирнокислотных субстратов, а именно к семейству С18 Δ^-ΙΜΗΘ.

Настоящее изобретение ниже описывается со ссылками на примеры, которыми оно не ограничивается.

Пример 1. Характеристика эпоксижирных кислот в ЕирйогЫа 1ада§сае и Сгер15 §рр.

Семена, полученные от дикого вида

ЕирйогЫа 1ада§сае и от различных видов Сгер® подвергли скринингу с помощью газожидкостной хроматографии на присутствие эпоксижирных кислот.

Как показано в табл. 3, масло, полученное из семян ЕирйогЫа 1ада§сае, содержит очень высокие уровни относящейся к эпоксижирным кислотам верноловой кислоты. Показано также, что семена С герб ра1ае811па содержат 61,4% по массе верноловой кислоты и 0,17% по массе относящейся к ацетиленовым жирным кислотам крепениновой (сгерепушс) кислоты, от общей массы жирных кислот (табл. 3).

Таблица 3 Жирно-кислотный состав липидов, происходящих из семян Сгер18 а1рта, Сгер18 ра1ае81та и

ВирНргЫа 1ада8сае

	Относительное распределение (% по массе)*
Жирная кислота	Сгер18 а1рта	Сгер18 ра1ае8Йпа	Впр^гНа 1ада8сае
Пальмитиновая	3,9	5,1	4,3
Стеариновая	1,3	2,3	1,8
Олеиновая	1,8	6,3	22,0
Линолевая	14,0	23,0	10,0
Крепининовая	75,0	0,7	0
Верноловая	0	61,4	58,0
Прочие	4,0	1,2	3,9

* Рассчитано на основе % площади от общих интегрированных площадей пика при определении методом газожидкостной хроматографии метиловоэфирных производных липидов семян.

Пример 2. Биохимическая характеристика линолеат-Д12-эпоксигеназ в Еир1югЫа 1ада8сае и Сгер18 ра1ае8бпа.

Фермент линолеат-Д12-эпоксигеназа синтезирует верноловую кислоту из линолевой кислоты. Линолеат-Д12-эпоксигеназы, происходящие из Еир1югЫа 1ада8сае и Сгер18 ра1ае81ша, локализованы в микросомах. Ферменты из этих видов растений способны по меньшей мере оставаться активными в мембранных (микросомных) фракциях, полученных из развивающихся семян.

Препараты мембран из Еир1тогЫа [ада8сае получали и анализы их эпоксигеназной активности проводили, как описано в публикации Байт е! а1. (1993), причем инкубацию осуществляли с ΝΆΌΡΗ (никотинамид-аденин-динуклеотидфосфат, восстановленный), кроме особо оговоренных случаев, указанных в табл. 4. Экстракцию липидов, разделение и метилирование, а также разделение с помощью газожидкостной хроматографии и радио-газожидкостной хроматографии осуществляли по существу так, как описано в публикациях Κοίη е! а1. (1994) и Байт е1 а1. (1993).

Препараты мембран Сгер18 а1рша и Сгер18 ра1ае8Рпа получали следующим образом. Растения Сгер18 а1рша и Сгер18 ра1ае8бпа выращивали в теплицах, семена собирали в средней стадии их развития (через 17-20 дней после цветения). Семядоли выдавливали из семенных оболочек, растирали до гомогенного состояния с помощью ступки и пестика, в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,2, содержащем 0,33М сахарозы, 4 мМ ΝΆΌΗ (никотинамид-аденин-динуклеотидфосфата), 2 мМ ^Ά8Η, 1 мг/мл альбумина из бычьей сыворотки и 4000 единиц каталазы на мл. Гомогенат центрифугировали в течение 10 мин при 18000 х д, а полученную надосадочную жидкость центрифугировали 60 мин при 150000 хд, чтобы получить микросомный осадок.

Стандартные анализы на десатуразу, ацетиленазу и эпоксигеназу с микросомными мембранами из видов Сгер18 осуществляли при 25°С с микросомными препаратами, эквивалентными 0,2 мг микросомного белка, ресуспендированными в свежем буфере для гомогенизации и в 10 ммоль либо [1-¹⁴С]18:1-СоА, либо [1-¹⁴С] 18:2-СоА (удельная активность 85000 распадов в минуту/ммоль), в общем объеме 360 мкл. Если в качестве совосстановителя использовали ΝΑΌΡΗ, мембраны ресуспендировали в буфере для гомогенизации, в котором ΝΑΌΗ был заменен на ΝΑΌΡΗ.

Были получены биохимические характеристики микросомной линолеат-Д12-эпоксиназы, происходящей из Еир1югЫа 1ада8сае и Сгер18 ра1ае8бпа, и полученные данные сравнили с биохимическими характеристиками ферментов олеат-Д12-десатуразы и линолеат-Д12-ацетиленазы, полученных из микросомных препаратов Сгер18 а1рта (табл. 4).

Как показано в табл. 4, линолеат-Д12эпоксигеназа из Сгер18 ра1ае81ша проявляет биохимические свойства, подобные свойствам линолеат-Д12-ацетиленазы и олеат-Δ 12-десатуразы из Сгер18 а1рша, и поскольку все эти три фермента требуют О₂, то они работают одинаково хорошо как с ΝΑΌΗ, так и с ΝΑΌΡΗ, используемыми в качестве совосстановителей, и ингибируются цианидом, а не моноокисью углерода. Кроме того, ни один из этих ферментов не ингибируется моноклональными антителами, эффективными против цитохром-Р-450-редуктазы.

Данные табл. 4 позволяют сделать вывод, что линолеат^12-эпоксигеназа Сгер18 ра1ае81та принадлежит к тому же самому классу ферментов, что и микросомальная олеат-Δ 12-десатураза Сгер18 а1рта и линолеат-Δ 12-ацетиленаза.

В противоположность этому, линолеатΔ12-эпоксигеназа Еир1югЫа 1ада8сае требует в качестве совосстановителя ΝΑΌΡΗ, не ингибируется цианидом, но ингибируется моноокисью углерода (табл. 4). Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что линолеатΔ12-эпоксигеназа Еир1югЫа 1ада8сае ингибируется моноклональными антителами, эффективными против фермента цитохром-Р-450редуктазы. Эти данные позволяют сделать вывод, что линолеат-Δ 12-эпоксигеназа Еир1югЫа 1ада8сае принадлежит к классу белков цитохром Р450, и поэтому не является биохимически родственной линолеат-Δ 12-эпоксигеназе Сгер18 ра1ае81ша.

Таблица 4

Сравнение биохимических характеристик эпоксигеназ, ацетиленаз и десатураз, происходящих из Сгер18 8рр. и ЕирЬогЫа 1а%аасае

	Активность ферментов (% от контроля)
Вариант	С. а1рша олеатΔΟ-десатураза	С. а1р1па линолеат- Δ12-аце- тиленаза	С. ра1ае8Йпа линолеатΔ^^^κсигеназа	Е. 1ада8сае линолеатΔ^^^κсигеназа
Моноокись углерода	85	84	88	3
Антитела против Р450 редуктазы (С5А5)	96	91	94	33
КСЫ	16	0	35	92
минус ЫАЭН плюс ЫАЭРН	95	73	94	100 (контроль)
минус ЫАЭРН плюс ЫАЭН	100 (контроль)	100 (контроль)	100 (контроль)	11

Пример 3. Стратегия клонирования эпоксигеназных генов Сгерк ракеЛта.

Клонирование эпоксигеназных генов Сгерк ракеШпа основано на характеристиках ферментов С. РакеЛта и Сгерк а1рша, описанных в предыдущих примерах.

В частности, поли (А)+ РНК выделили из развивающихся семян Сгерк ракеШпа с помощью набора для очистки мРНК ЦшскРгер Мкго (Ркагтааа Вю1ес1то1оду) и использовали для синтеза двухцепочечной кДНК с использованием в качестве затравки олиго б(Т). Двухцепочечную кДНК лигировали с адапторами ЕсоШ/ЫоИ (РНагтаск ВюксЬпо1оду) и сконструировали библиотеку кДНК с помощью набора для клонирования кДНК 2ЛР-сБЫЛ Сщараск (81га1адепе).

Одноцепочечную кДНК получили на основе РНК, выделенной из развивающихся семян Сгерк а1р1па с помощью стандартных методов. ПЦР-фрагмент, обозначенный как Б12У (последов. № 7), получили путем амплификации одноцепочечной кДНК с помощью праймеров, выведенных из аминокислотных последовательностей растительных монооксигеназ со смешанными функциями.

Затем фрагмент Б12У был рандомизированно помечен и использован для скрининга библиотеки кДНК Сгерк ракеШпа, описанной выше, на мембранных фильтрах НуЬопб Ы+ (Атегзкат) в соответствии с инструкциями изготовителя, с использованием стандартных условий гибридизации. Этот подход привел к выделению рекомбинантного бактериофага, обозначенного Сра12.

Определили нуклеотидную последовательность кДНК Сра12 и представили ее в последов. № 1.

Клон кДНК Сра12 оказался полноразмерным. Схема вектора экспрессии, содержащего кДНК Сра12, показана на фиг. 1. Представленная на ней генетическая конструкция была получена для введения в растительный материал с целью получения трансгенного растения, экспрессирующего эпоксигеназу по настоящему изобретению. Специалисты в данной области техники согласятся с тем, что подобные векторы экспрессии можно сконструировать без проведения дополнительных экспериментов и использовать их для получения трансгенных растений, экспрессирующих любые генетические последовательности по настоящему изобретению, заменив кДНК Сра12 последовательностью другого структурного гена.

Как показано на фиг. 2, нуклеотидная последовательность кДНК Сгер1 кодирует полипептид, близко родственный на аминокислотном уровне, по меньшей мере по отношению к ацетиленазному ферменту С. а1р1па (ВаГог е! а1. 1997; заявка на международный патент № РСТ/8Е 97/00247).

Вставку в 1,4 т.п.н. из рСра12 секвенировали (последов. № 1) и показали, что она содержит открытую рамку считывания, которая кодирует полипептид длиной в 374 аминокислоты. Выведенная аминокислотная последовательность Сра12 обладает 81% идентичностью и 92% сходством с Δ12-ацетиленазой из Сгерк а1рта и примерно 60% идентичностью и 80% сходством с белками растительной микросомальной Δ12десатуразы (фиг. 2). Однако аминокислотная последовательность полипептида, кодируемого Сра12, значительно отличается от аминокислотных последовательностей неэпоксигеназных ферментов. В частности, Сра12 имеет делецию шести прилегающих друг к другу аминокислот в 5'-концевой области по сравнению со всеми микросомальными Δ12-десатуразами, а также делецию двух соседних аминокислот в 3'концевой области по сравнению с Δ12ацетиленазой Сгер1 (фиг. 2).

Хотя связанные с мембранами гены десатураз жирных кислот обладают низкой гомологией последовательностей, все они содержат три обогащенные гистидином области, приведенные ниже:

(1) Нк-(Хаа)₃-4-Нк;

(ίί) Нк-(Хаа)_2-3-Нк-Нк; и (ш) Нк-(Хаа)_2-3-Нк-Нк, где Н18 обозначает гистидин, Хаа обозначает остаток любой встречающейся в природе аминокислоты, приведенный в табл. 1 настоящего описания, составляющая (Хаа)_3-4 обозначает последовательность аминокислот, содержащую три или четыре повтора Хаа, а составляющая (Хаа)2-3 обозначает последовательность аминокислот, содержащую два или три повтора Хаа. Предполагают, что эти обогащенные гистидином области являются частью активного центра фермента (8капк1ш е! а1., 1994).

Аминокислотная последовательность, кодируемая кДНК Сра12, содержит три обогащенные гистидином области, схожие, но не идентичные с обогащенными гистидином областями

Д12-десатуразных ферментов. Эти данные позволяют сделать вывод, что кДНК Сра12 кодирует фермент, принадлежащий к классу ферментов, представляющих собой монооксигеназы со смешанными функциями.

Анализ жирных кислот, представленный выше, в примере 1, показывает, что верноловая кислота присутствовала по меньшей мере в семенах Сгер18 ра1ае§6па. Это фермент фактически может присутствовать исключительно в семенах С. ра1ае81ша. Экспрессию гена Сра12 изучали с использованием в качестве гибридизационного зонда З'-нетранслируемой области клона кДНК Сра12, на нозерн-блотах мРНК, выделенной из развивающихся семян и листьев С. раИейша. Как показано на фиг. 3, высокие уровни экспрессии гена Сра12 были обнаружены в развивающихся семенах, однако, в листьях экспрессия этого гена вообще не была обнаружена. Эти данные согласуются с профилем ферментативной активности линолеат-Д12-эпоксигеназы С. ра1ае8Йпа в этих тканях.

Пример 4. Стратегия клонирования эпоксигеназных генов ЕирйогЫа 1ада§сае.

Клонирование эпоксигеназных генов ЕирЕогЫа 1ада§сае было основано на характеристиках ферментов Е. 1ада§сае, описанных в предшествующих примерах.

В одном из подходов, предпринятых для клонирования эпоксигеназных генов ЕирЕогЫа 1ада§сае, РНК выделяли из незрелых зародышей ЕирЕогЫа 1ада§сае, взятых в стадии активного синтеза верноловой кислоты, и использовали ее для конструирования библиотеки кДНК. Библиотеку кДНК конструировали в векторе ЬатЬба ΖΑΡ II (§1га!адепе), как описано в предыдущем примере, за исключением того, что вставки кДНК клонировали направленным образом в сайты ЕсоЕ1-Х1ю1 плазмидного вектора, встроенного в вектор лямбда.

Синтезировали вырожденный ПЦРпраймер, представленный на фиг. 4 (последов. № 18), и использовали его для амплифицирования нуклеотидных последовательностей, кодирующих последовательности фермента Р450 из библиотеки кДНК ЕирБогЫа 1ада§сае. Для реакций ПЦР амплификации аликвоту в 100 мкл из библиотеки кДНК экстрагировали с помощью смеси фенол:хлороформ (1:1, по объему), осаждали ДНК путем добавления 2 объемов этанола и ресуспендировали в 100 мкл воды. Аликвоту (1 мкл) ресуспендированной ДНК использовали в качестве матрицы в реакции амплификации ПЦР. Реакции ПЦР проводили в 10 мкл полимеразного буфера Тас.|Е содержащего по 200 мкМ каждого 6ΝΤΡ (дезоксинуклеозидтрифосфата), 10 пмоль вырожденного праймера, 1 пмоль праймера полимеразного промотора Т7 и 0,4 единицы полимеразы Тас.|1.

Условия амплификации были следующими: 2 мин при 94°С и 5 циклов, каждый из которых включал 1 мин при 48°С, затем 2 мин при 72°С, затем 30 с при 93°С, после чего следовали 28 циклов, каждый из которых включал 30 с при 55°С, затем 90 с при 72°С, затем 30 с при 93°С, и, наконец, 1 цикл, включающий 30 с при 55°С, затем 10 мин при 72°С и затем 1 мин при 25°С.

Продукты ПЦР очищали и расщепляли с помощью ЕсоК1 и Х1ю1. а затем субклонировали в вектор В1ие5спр1 для характеризации последовательностей. Было обнаружено, что один из ПЦР-клонов кодирует последовательность Р450, который и был использован в качестве зонда для выделения полноразмерного клона кДНК. Эта нуклеотидная последовательность представлена в последов. № 19. последов. № 19 имела сходство с другими членами семейства 2С генов Р450. В частности, с использованием программы ВБА8Т было показано, что последов. № 19 в среднем имеет 40%-ную идентичность с последовательностями арахидоновых эпоксигеназ человека и крысы.

Кроме того, было показано, что транскрипт последов. № 19 экспрессировался в семенах ЕирБогЫа 1ада§сае, но не экспрессировался в корнях и в листьях (фиг. 5В). Транскрипт последов. № 19 был обнаружен в развивающихся семенах Уегпоша да1атеп818, но не был обнаружен в семенах Е. сурагщкщ или льна - двух видов, которые не продуцируют эпоксижирные кислоты (фиг. 5А и 5В).

В альтернативном подходе, применявшемся при клонировании эпоксигеназных генов ЕирНоГЫа 1ада§сае, использовали стратегию «вычленяющей» (щЬМгасЩ'е) гибридизации, чтобы выделить гены, экспрессия которых характерна для организма, продуцирующего высокие уровни эпоксижирных кислот.

В частности, способ вычленяющей гибридизации, представленный на фиг. 6, применяли для выделения эпоксигеназных генов, экспрессия которых характерна для ЕцрБогЫа 1ада§сае, продуцирующего высокие уровни эпоксижирной кислоты, а именно верноловой кислоты (пример 1), и которые не экспрессируются в близкородственном виде ЕцрБогЫа сурап^щ, не вырабатывающем верноловой кислоты.

В соответствии с этим мРНК выделяли из развивающихся зародышей ЕцрБогЫа 1ада§сае в стадии, когда они активно синтезировали верноловую кислоту, и использовали для получения так называемой «тестерной» кДНК. Кроме того, мРНК выделяли из развивающихся зародышей Е. сурап55И5 (в такой же стадии развития, что и для Е. 1ада§сае) и использовали для получения так называемой «драйверной» кДНК.

В результате вычленяющей гибридизации получили библиотеку, которая была обогащена последовательностями, экспрессируемыми исключительно в ЕцрБогЫа 1ада§сае. Клоны из этой библиотеки секвенировали, и по меньшей мере две последовательности идентифицировали как кодирующие белки Р450 на основе сход39 ства с другими последовательностями Р450 из базы данных. Эти два клона Р450 ПЦР использовали в качестве зондов для выделения полноразмерных клонов кДНК из библиотеки кДНК, о которой говорилось ранее.

Было обнаружено, что одна из выделенных Р450 кДНК, содержащая последовательность нуклеотидов, представленную в последов. № 20, экспрессируется в тканях ЕирйотЫа 1адазсае (фиг. 7В), и при этом ни одного гомологичного транскрипта не было обнаружено в ткани из семян Е. сурапззиз или льна - двух видов, не продуцирующих эпоксижирные кислоты. Выведенная аминокислотная последовательность последов № 20 указывает на то, что клон кДНК имеет полную длину и кодирует фермент Р450. Эти данные подтверждают, что кДНК, представленная в качестве примера в последов. № 20, может кодировать эпоксигеназу, например линолеат^12-эпоксигеназу, которая преобразовывает линолевую кислоту в верноловую кислоту.

Пример 5. Демонстрация эпоксигеназной активности.

Подтверждение того, что клоны кДНК, иллюстрирующие в качестве примеров настоящее изобретение, кодируют эпоксигеназную активность, было получено посредством трансформации ЛгаЫборз15 !йа11апа, который не продуцирует эпоксижирные кислоты, в частности верноловую кислоту, с помощью каждого отдельного изучаемого клона, и исследования трансформированных тканей на присутствие эпоксигенизированных жирных кислот, которые они в норме не продуцируют, или на присутствие гидроксижирных кислот, которые могли образоваться в процессе метаболизма из эпоксигенизированных жирных кислот под воздействием эндогенных эпоксидгидролаз (В1ее апб ЗсйиЬег, 1990).

Эпоксигеназную кДНК, включающую последовательность № 1, клонировали в конструкцию бинарного вектора, показанную на фиг. 8. Вкратце, последовательность кДНК субклонировали из плазмиды рСра12 (фиг. 1) в бинарную плазмиду, посредством расщепления рСра12 ЕсоК! и достраивания концов рестрикционного фрагмента с помощью фермента Т4 ДНКполимеразы. Бинарный вектор (фиг. 8) расщепляли ВатН1, и также достраивали липкие концы с помощью Т4 ДНК-полимеразы. Для реакций достраивания концов 1 мкг вставки кДНК или ДНК линейного бинарного вектора ресуспендировали в 50 мкл буфера Т4-ДНК-полимеразы, 33 мМ Трис-ацетата с рН 7,9, 66 мМ ацетата калия, 10 мМ ацетата магния и 5 мМ ДДТ, с добавкой по 100 мМ каждого 6ΝΤΡ и 0,1 мг/л ВЗА, а также 3 единиц Т4 ДНК-полимеразы, и инкубировали в течение 6 мин при 37°С. Реакцию останавливали путем нагревания при 75°С в течение 10 мин ДНК с тупыми концами, и ДНК бинарного вектора лигировали с помощью Т4 ДНКлигазы, в стандартных условиях для лигирова ния, рекомендуемых фирмой Рготеда. Отобрали клоны, в которых последовательность № 1 была проклонирована после напинового промотора, в смысловой ориентации, что позволяло экспрессировать полипептид эпоксигеназы. Бинарная плазмида, содержащая последовательность № 1 в смысловой ориентации, расположенную под контролем укороченного напинового промотора, представлена на фиг. 9.

Бинарной плазмидой, представленной на фиг. 9, трансформировали с помощью электропорации штамм ЛдгоЬас!егшт Л6Ь1 и использовали для трансформации ЛгаЬ1борз15 1йайапа. Трансгенные растения А. Шайапа получили в соответствии со способом, описанным УаНекепз е! а1. (1988) и ЭоЦетиз е! а1. (1994).

Трансгенные и нетрансформированные (т. е. контрольные) растения выращивали до созревания. Зрелые семена с каждого растения анализировали на жирно-кислотный состав с помощью стандартных методов. Установили растения, являющиеся первичными трансформантами (Т0), и с каждого растения собрали семена Т₁ и анализировали их на жирнокислотный состав с помощью газовой хроматографии. Было показано, что двенадцать растений Т0 содержали верноловую кислоту в липидах своих семян Т1, в концентрациях от 0,9 до 15,8% от общего количества жирных кислот, в то время как нетрансформированные контрольные растения не содержали верноловой кислоты (табл. 5). Наиболее высокоэкспрессирующей линией была линия Сра1-17, для которой на фиг. 10 представлены профили элюирования, полученные при газожидкостной хроматографии (из анализов для упакованной и капиллярной колонок). На фиг. 10 также показан профиль элюирования, полученный при газожидкостной хроматографии (из анализов для упакованной колонки) для нетрансформированных контрольных растений.

Таблица 5 Уровни верноловой кислоты в трансгенных линиях А. ШаНапа, экспрессирующих последовательность № 1

№ растения Т0	Верноловая кислота (мас.% от общего содержания жирных кислот в семенах)
Сра1-4	1,4
Сра1-5	1,1
Сра1-8	2,7
Сра1-9	0,9
Сра1-13	0,9
Сра1-15	1,1
Сра1-17	15,8
Сра1-21	1,3
Сра1-23	1,4
Сра1-24	1,0
Сра1-25	1,2
Сра1-26	1,1
Нетрансформированная контрольная линия	0,0

В качестве альтернативы или в дополнение, каждую из описанных здесь предполагаемых последовательностей эпоксигеназы жирных кислот, находящуюся под контролем напинового семя-специфического промотора, трансформировали в Ьтит щйаЩЦншт (лен) и в ЛгаЫйоркЕ Шакапа. Трансгенные растения льна и ЛгаЬИоркЕ ШаПапа исследовали на присутствие эпоксижирных кислот в маслах развивающихся семян. Предыдущие исследования показали, что если эпоксижирные кислоты присутствуют при развитии семян, то они включаются в триглицериды (пример 10).

В качестве альтернативы, дрожжи также трансформировали клонами эпоксигеназы по настоящему изобретению и анализировали на продуцирование эпоксижирных кислот.

Пример 6. Подтверждение с помощью масс-спектрометрии наличия эпоксижирных кислот в семенах ЛгаЬИоркЕ Τι, образовавшихся на первичных трансгенных растениях Т0.

Газовая хроматография метиловых сложных эфиров, полученных из липидов семян Т₁ растений ЛгаЬИоркЕ 1какапа, трансформированных с помощью Сра1-12 (пример 5), показала присутствие двух дополнительных жирных кислот по сравнению с семенами нетрансформированных контрольных растений. Первое из этих соединений имело время удерживания, эквивалентное этому показателю стандарта верноловой кислоты. Второе соединение имело более длительное время удерживания и было предположительно идентифицировано как 12,13-эпокси-9,15-октадекадиеновая кислота, ожидаемое производное верноловой кислоты, получающееся в результате десатурирования в позиции Δ15 с помощью эндогенной Δ15десатуразы ЛгаЫйоркЕ 1какапа.

Подтверждение точной идентичности двух пиков получили с помощью массспектрометрии диодов, полученных из фракции эпоксижирных кислот, происходящих от Сра12трансформированных растений. Далее диолы преобразовали в триметилсилиловые эфиры и проанализировали с помощью метода массспектрометрии СС-М8 ΌΒ23 на капиллярной колонке из кварцевого стекла (Неъ1е11-Раскагк 5890 II ОС, соединенной с Не\\'1е11-Раскагк 5989А М8, работающих в электронном ударе при 70 еУ15). Общая ионная хроматограмма показала наличие двух пиков, указанных ниже:

(ί) Первый пик элюирования имел отчетливо выраженные ионы массой 73, 172, 275 и 299, что указывает на то, что эпоксильная группа была расположена на позиции С-12 С18жирной кислоты и что имелась двойная связь между эпоксильной группой и карбоксильным концом. Эти масс-спектры были идентичными со спектрами триметилсилилэфирных производных диолов, полученных из чистой верноловой кислоты (12,13-эпокси-9-октадеценовой кислоты); и (ίί) Второй пик элюирования имел отчетливо выраженные ионы массой 73, 171, 273 и 299, что указывает на присутствие двойных связей, а также на то, что эпоксильная группа расположена в позиции С12 С18-жирной кислоты, что согласуется с масс-спектром для 12,13эпокси-9,15-октадекадиеновой кислоты.

Пример 7. Анализ жирных кислот Сра12трансгенных растений АгаЬИоркЕ.

Семена Т_ь полученные от трансформированных растений АгаЫйоркЕ 1какапа, экспрессирующих клон кДНК Сра12 под контролем напинового промотора, проращивали и получали растения Т₁ от пяти линий Т₀ (№№ 4, 8, 13, 17 и 21, показанных в табл. 5). С каждого растения Т1 собирали семена Т2 и анализировали их на жирно-кислотный состав. Как и ожидалось, потомство трансформантов №№ 4, 8, 13 и 21 (табл. 5) расщеплялось по наличию верноловой кислоты, причем в растениях, содержащих верноловую кислоту, ее содержание достигало 3,1% (табл. 6).

Все растения Т1, содержащие верноловую кислоту (т.е. эпокси 18:1 в табл. 6), также содержали 12,13-эпокси-9,15-октадекадиеновую кислоту (т.е. эпокси 18:2 в табл. 6; см. также фиг. 11), что указывает на то, что некоторое количество верноловой кислоты, синтезированное Сра12-эпоксигеназой, было впоследствии десатурировано эндогенной Δ 15-десатуразой.

Таблица 6

Жирно-кислотный состав самоопыленных семян, полученных от растений Т₁, происходящих от пяти первичных Сра12-трансформантов АгаЬ1йор818 111а11апа

	ЖИРНЫЕ кислоты
» растения	Неэпокси-жирные кислоты		Эпоксижирные кислоты
	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3	20:0	20:1	22:0	22:1	18 :1	18:2
4-1	8,3	3,9	15,5	23,9	20,6	2,8	16,5	1,7	1,6	*	-
4-2	7,6	4,1	20,3	17,8	18,0	3,4	19,7	1,8	2,0	0,82	0,63
4-3	6,4	4,3	26,0	13,5	16,1	2, В	19,0	1,8	1,6	2,03	0,72
4-4	7,6	4,0	25,2	14,3	16,0	2,8	19,а	2,1	1,7	1,99	0,92
4-5	7,2	3,6	15,6	23,1	19,9	3,1	19,7	1,6	2,1	-	-
4-6	7,0	3,7	19,2	17,8	18,4	3,2	20,3	1,9	2,1	0,97	о,33
4-8	7,4	3,9	16,0	23,6	20,1	3,1	19,7	1,6	1,8		-
4-9	7,6	*,0	24,8	13,4	15,9	2, 8	20,4	2,3	1.8	2,30	1,07
4-10	7,6	4,2	24,0	13,5	16,2	3, 1	20,4	1,9	1,8	1,97	0,83
4-11	7,4	3,9	15,0	23,2	20,4	3,3	19,8	1,7	2,0
4-12	6,7	*,0	20,7	17,0	17,5	2,6	17,2	1,7	1,5	1,38	0,74
4-13	7,2	4,1	21,9	16,4	17,7	3,2	21,0	1,7	1,9	1,14	0,45
9-1	8,1	3,9	26,1	15,0	16,0	2, 6	19,5	2,0	1,6	1,79	0,82
8-3	8,7	4,2	31,6	11,5	14,0	2,2	18,5	1,9	1,4	2,38	1,13
9-4	8,5	4,1	27,2	15,1	16,1	2,5	18,9	1,8	1,4	1,70	0,84
8-5	9,1	*,2	27,7	14,7	16,2	2,4	18,3	1,7	1,5	1,70	0,82
8-6	9,8	4,0	26,0	17,2	17,2	2,3	16,9	1,6	1,2	1,36	0,71
8-7	10,0	3,5	15,2	25,3	22,3	2,3	14,4	1,7	1,7	-
9-8	8,4	4,3	32,2	10,7	13,3	2,5	20,3	1,6	1,5	1,92	0,82
8-9	9,8	3,6	15,9	25,3	22,0	2,4	14,5	1,6	1,3		-
8-10	7,5	3,9	24,4	15,9	15,8	2,8	20,2	2,2	1,8	1,70	0,82
9-11	7,6	3,8	15,4	23,6	19,9	2,9	19,4	1,5	1.8	-	-
8-12	9,4	3,7	24,2	16,7	16,7	2,2	17,6	0,9	1,2	1,46	0,65
8-13	10,3	4,3	25,3	17,1	17,9	2,2	16,0	1,8	1.3	1,48	0,73
13-1	7,0	4,3	33,3	8,1	11,1	2,7	23,1	1,7	1,6	2,42	1,26
13-2	7,2	4,3	30,4	9,6	12,7	2,8	22,0	1,8	1,6	2,48	1,37
13-3	7,6	3,9	15,6	23,6	19,7	3,0	19,1	1,7	1,8
13-4	7,7	4,0	15,2	22,5	19,3	з,1	18,0	1,6	1,7	-

13-5	8,0		16,3	22,2	17,5	4,4	19,4	2,0	2,0	-
13-6	7,9	4,4	25,7	14,7	15,8	2,9	21,2	1,6	1,7	1,56	0,63
13-7	7,9	4,0	16,0	23,3	19,6	3,0	19,1	1,6	1,8		-
13-9	8,0	4,0	16,1	23,6	20,0	2,9	18,7	1,6	1,6		-
13-10	8,7	«,2	34,6	9,6	12,5	2,2	19,1	1,5	1,2	2,21	1,01
13-11	8,7	4,0	17,6	24,3	10,9	2,0	17,1	1,6	1,4		-
13-12	8,9	4,2	26,4	14,6	16,0	2,5	17,5	1,6	1,2	1,62	0,74
13-13	9,0	4,4	27,9	14,4	15,3	2,5	18,9	1,5	1,4	1,30	0,77
13-14	9,2	4,2	17,2	23,8	10,8	2,7	17,9	1,7	1,5		-
13-15	8,4	4,2	19,7	20,9	10,6	2,7	17,7	1,4	1,5	0,40	0,16
13-16	8,2	4,3	23,0	17,1	17,3	2,8	19,3	1,5	1,5	0,97	0,42
13-17	8,3	4,1	15,7	23,9	19,9	2,8	17,6	1,6	1,9
17-1	7,6	4,1	15,8	23,7	19,6	2,6	20,3	1,7	1,7		-
17-2	8,3	4,1	16,4	24,4	20,1	2,3	16,0	1,5	1,4		-
17-3	8,1	4,1	16,4	24,3	20,0	2,5	17,6	1,6	1,4		-
21-1	8,1	4,3	26,9	14,5	15,0	2,9	19,9	1,5	1,5	1,64	0,63
21-2	8,2	4,0	27,9	11,8	13,2	2,5	19,8	1,7	1,5	2,18	0,91
21-3	8,8	3,7	16,4	24,4	20,6	2,5	17,3	1,7	1,4		-
21-4	7,9	3,9	19,6	19,8	17,8	2,7	18,7	1,7	1,7	0,66	0,46
21-5	7,2	4,2	26,5	12,9	14,4	3,0	21,5	0,9	1,8	1,78	0,04
21-6	8,3	4,2	27,4	13,9	15,4	2,6	19,9	1,7	1,5	1,66	0,65
21-7	7,2	4,2	26,8	13,5	13,4	3,0	21,9	1,7	1,8	1,74	0,00
21-в	7,4	3,8	16,3	23,6	19,4	3,2	19,2	1,7	1,9		-
21-9	7,2	4,0	28,1	11,8	13,5	3,0	22,5	1,9	1,9	2,15	1,05
21-10	7,2	4,2	26,1	13,8	14,6	3,0	22,3	1,7	1,8	1,64	0,81
21-11	7,1	4,2	29,2	11,5	12,7	3,0	22,5	1,6	1,8	2,20	1,09
21-12	7,2	4,1	26,2	13,6	14,2	3,1	22,4	1,8	1,9	1,71	0,60
21-13	7,1	4,3	33,7	7,1	10,0	2,7	24,1	2,0	1,8	3,05	1,47
21-14	7,4	3,7	16,9	21,9	19,6	3,1	19,2	1,8	2,0	0,29	следы
21-15	7,7	3,6	15,6	24,3	20,2	2,9	18,1	1,8	1,8	-	-

Пример 8. Анализ жирных кислот Сра12трансгенных растений льна Ь1ио1а.

Вышеописанную конструкцию бинарной плазмиды, содержащей клон кДНК Сра12 (фиг. 9), трансформировали в АдгоЬас1егшт 1итеГаС1СП5. штамм АСЫ, с помощью электропорации. Трансформированный А. 1итсГас1СП5 использовали для инфецирования эксплантатов льна Ь1пит иШаШмтит сорта Эйр, как описано в публикации Ьа^геисе с1 а1. (1989), за исключением того, что в качестве основной среды для индукции корнеобразования из регенерировавших побегов использовали среду М8.

Для двух первичных трансформантов льна Ь1ио1а (растений Т₀), обозначенных АР20 и АР21, была подтверждена их трансгенная природа с помощью ПЦР, с использованием праймеров, направленных против гена Сра12, а также путем демонстрации устойчивости этих растений к канамицину. По десять семян Т₁ с каждого растения индивидуально анализировали на жирно-кислотный состав с помощью стандартных методов .

Как показано в табл. 7, семена, полученные от АР20, расщеплялись на 3 класса, при этом три семени не содержали верноловой кислоты, в двух семенах содержание верноловой кислоты было выше 0,7%, а пять семян содержали промежуточные уровни (0,13-0,47%) верноловой кислоты.

Подобным же образом, семена, полученные от АР21, расщеплялись на 3 класса, при этом пять семян не содержали верноловой кислоты, в двух семенах содержание верноловой кислоты было выше 0,25%, а три семени содержали промежуточные уровни (0,09-0,14%) верноловой кислоты (табл. 8).

Таким образом, всего было получено двенадцать семян, содержащих верноловую кислоту. Восемь из этих двенадцати семян, происхо дящих от АР20 и АР21 и содержащих верноловую кислоту, содержали также 12,13-эпокси9,15-октадекадиеновую кислоту.

Таблица 7

Жирно-кислотный состав десяти индивидуальных семян Т_ь полученных от первичных Сра12-трансформантов АР20 льна Ьто1а

Семена Τι	Неэпокси-жирные кислоты			Эпоксижирные кислоты
	16:0	10:0	10:1	10:2	10:3	20:0	20:1	22:0	22	1	10:1	18:2
1	6,4	3,6	17,0	60,1	г,о	0,2	-	0,6				-
2	6,0	3,5	25,4	60,8	1,4	0,2	0,2	-			0,70	0,23
3	6,0	3,9	20,4	64,6	2,1	0,3	0,6	-			-	-
4	6,3	3,5	28,3	57,3	1,3	0,2	0,2	1,4			0,34	0,2В
5	5,2	4,8	24,9	61,2	1,6	0,3	0,2	о,1			0,37	-
6	5,0	4,1	23,3	63,1	1,9	0,2	0,2	0,2			0,47
7	5,9	4,3	21,7	64,1	2,2	0,2	0,2	0,2			0,13	0,12
8	5,9	3,3	22,3	65,2	2,0	0,2	0,2	0, 1	0	2	-
9	5,6	4,0	25,2	61,4	1,7	0,2	0,2	0,1			0,84	-
10	6,2	4,4	27,4	57,9	1,7	0,2	0,2	0,2			0,54	-

Таблица 8

Жирно-кислотный состав десяти индивидуальных семян Т1, полученных от первичных Сра12-трансформантов АР21 льна Ьто1а

Се- Τι	Неэпок	си-жирные кис	поты					Эпокс» жирные кисло1:	- ы
	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3	20:0	20:1	22:0	22:1	18:1	18:2
1	6,1	4,2	35,2	50,8	1,3	-	-	-	2,0	-	-
2	5,7	5,0	32,9	53,3	1,4	0,2	0,2	0,2		0,14	0,21
3	5,9	4,0	35,1	50,8	1,3	0,2	0,2	о,1	1	5	-	-
4	7,5	4,1	38,8	45,5	1,2	0,2	0,3		1	7	-
5	5,8	5,0	28,8	57,3	1,3	0,2	0,2	0,1			0,37	0,06
6	5,8	5,0	44,1	41,4	1,4	0,2	0,2	0,2				-
7	6,5	4,5	27,9	58,6	1,3	0,2	0.1	0,1				-
8	6,9	4,6	37,6	48,1	1,2	-		-			0,10	0,19
9	6,2	4,7	33,7	52,1	1,3	0,2	0,2	0,2			0,09	0,07
10	6,1	4,8	29,7	56,6	1,3	0,2	0,2	0,1			0,25	0,04

Из устойчивых к канамицину проростков растения АР20 получили четыре растения Т1. Впоследствии было показано, что все эти четыре растения содержали верноловую кислоту в своих семенах Т₂ (табл. 9). Уровни содержания эпоксижирных кислот 18:2 в этих семенах Т2 не анализировали.

Таблица 9

Жирно-кислотный состав семян Т₂, полученных от потомства Сра12-трансформантов Τι АР20 льна Ьто1а

Семена Тг		Неэпок	си-жир»	1ые кислоты					Эпокси- жирные кислоты
	16:0	18:0	18:1	18:2	10:3	20:0	20:1	22:0	22:1	18:1
А	3,4	3,0	27,4	65,5	0,6					0, Об
В	3,5	3,1	30,2	62,6	0,6	н.а.	н.а.	н.а.	н.а.	0,07
С	3,6	2,7	33,3	59,8	0,6	н.а.	н.а.	н.а.	н.а.	0, 07
ϋ	3,4	3,1	28,2	64,6	0,6	н.а.	н.а.	н.а.	н.а.	0,11

н.а. - «не анализировали».

Пример 9. Продуцирование эпоксижирных кислот в трансгенных организмах.

Продуцирование богатого верноловой кислотой масла было достигнуто посредством трансформации описанным здесь геном эпоксигеназы, в частности последов. № 1, АтаЫборкк Шайаиа, как описано в предыдущих примерах. Как показано в табл. 5, трансгенные линии А. Шайаиа, экспрессирующие последов. № 1, продуцируют в своих семенах высокие уровни верноловой кислоты по отношению к другим жирным кислотам. В частности, в одной трансгенной линии, (Сра1-17), количество продуцируе мой верноловой кислоты достигало 15,2% (по массе) от общего содержания жирных кислот в семенах.

Продуцирование богатого верноловой кислотой масла было также достигнуто путем трансформации описанным здесь геном эпоксигеназы, представленным в любой из последов. №№ 1, 3, 5, 19 или 20 и предпочтительно в любой из последов. №№ 1, 3 или 5, любого накапливающего масло организма, который в норме имеет очень высокие уровни линолевой кислоты и минимальную активность других конкурирующих ферментов, способных использовать линолевую кислоту в качестве субстрата. Генетические последовательности по настоящему изобретению расположены под контролем промотора, который обеспечивает высокий уровень экспрессии в масличных семенах, например напинового семя-специфичного промотора.

В одном из альтернативных подходов к трансформации А. ШаНапа высоколинолевые генотипы льна, подсолнечника, кукурузы или сафлора трансформируют геном эпоксигеназы по настоящему изобретению. Трансгенные растения продуцируют высокие уровни верноловой кислоты во время синтеза масла в семенах, в случае, если ген эпоксигеназы экспрессируется на высоких уровнях.

При альтернативном подходе, лен Είποί;·!® (=лен с низким содержанием линоленовой кислоты) трансформируют геном эпоксигеназы по настоящему изобретению. Трансгенные растения льна Είηοΐη® продуцируют высокие уровни верноловой кислоты во время синтеза масла в семенах, в случае высоких уровней экспрессии гена эпоксигеназы.

Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что меченая верноловая кислота, подаваемая к развивающимся семенам льна, не разлагалась, а включалась в запасные липиды во всех трех позициях молекулы триглицерида (см. пример 10). В соответствии с этими данными высокие уровни верноловой кислоты, синтезированные с помощью интродуцированной эпоксигеназы, легко откладываются в триглицеридах масла семян этого вида растений.

Пример 10. Включение олеиновой кислоты и верноловой кислоты в липиды семядоль развивающихся семян льна.

Отделенные от развивающихся семян льна семядоли (по шесть пар на каждую инкубацию, по две инкубации), взятые в средней стадии развития семян (20 суток после цветения), инкубировали с 10 нмоль аммониевых солей, либо [1-¹⁴С] верноловой кислоты (удельная активность 3000 распадов в минуту/нмоль), либо [1¹⁴С] олеиновой кислоты (удельная активность 5000 распадов в минуту/нмоль), в 0,2 мл фосфатного буфера с рН 7,2, в течение 30 мин при 30°С. Затем семядоли трижды промывали 1 мл дистиллированной воды и либо немедленно подвергали экстрагированию с помощью ИЙта

Тиггах согласно Β1ί§1ι апб Эуег (1959), либо дополнительно инкубировали перед экстрагированием в 0,5м. 0,1М фосфатного буфера с рН 7,2 еще от 90 до 270 мин. Аликвоту липидов в хлороформной фазе метилировали и разделяли на силикагелевых пластинах для тонкослойной хроматографии в смеси п-гексана, диэтилэфира и уксусной кислоты (85:15:1). Остальные липиды в хлороформной фазе каждого образца наносили на две отдельные силикагелевые пластины для тонкослойной хроматографии, и липиды разделяли в смеси хлороформа, метанола, уксусной кислоты и воды (85:15:10:3,5 по объему) для разделения полярных липидов, и в смеси пгексана, диэтилэфира и уксусной кислоты (60:40:1,5), для разделения нейтральных липидов. Области, соответствующие миграции аутентичных липидам стандартов, удаляли, и для каждого липида количественно определяли радиоактивность путем жидкостной сцинтилляции.

Выход метки ¹⁴С в хлороформной фазе изображен на фиг. 12. Несколько более половины добавочной радиоактивности как из [¹⁴С]олеиновой кислоты, так и из [¹⁴С]верноловой кислоты было поглощено семядолями, а затем было извлечено в виде липофильных веществ после 30 мин импульсного введения метки. Это количество оставалось фактически неизменным в течение дальнейших 270 мин инкубации для обоих субстратов. Разделение радиоактивных метиловых сложных эфиров показало, что большая часть радиоактивности (92%) в экспериментах с введением [¹⁴С]верноловой кислоты присутствовала в соединениях с такой же самой миграцией, как у метилвернолеата, что указывает на то, что эпоксильная группа оставалась интактной в семядолях семян льна в течение 270 мин инкубации.

После 30 мин инкубации около 28% активности, полученной в результате введения [¹⁴С]верноловой кислоты, которая присутствовала в хлороформной фазе, приходилось на фосфалидинхолин, и радиоактивность уменьшилась всего лишь на 5% после 300 мин инкубации (фиг. 13).

После 30 мин инкубации около 22% активности, полученной в результате введения [¹⁴С]олеиновой кислоты, которая присутствовала в хлороформной фазе, приходилось на фосфалидинхолин, и радиоактивность уменьшилась на 11% после 300 мин инкубации (фиг. 13).

После 30 мин инкубации около 32% активности, полученной в результате введения [¹⁴С]верноловой кислоты, которая присутствовала в хлороформной фазе, приходилось на триацилглицеролы, и радиоактивность увеличилась до свыше 60% после 300 мин инкубации (фиг. 14). Диацилглицеролы содержали около 24% активности в экспериментах с введением [¹⁴С]верноловой кислоты, и это количество оставалось достаточно постоянным в течение периода инкубации.

После 30 мин инкубации около 5% активности, полученной в результате введения [¹⁴С] олеиновой кислоты, которая присутствовала в хлороформной фазе, приходилось на триацилглицеролы, и радиоактивность увеличилась до 18% после 300 мин инкубации (фиг. 14). Диацилглицеролы содержали около 19% активности через 30 мин в экспериментах с введением [¹⁴С] олеиновой кислоты, и это количество оставалось достаточно постоянным в течение периода инкубации.

Вышеописанный эксперимент показывает, что семядоли льна не метаболизируют эпоксильную группу верноловой кислоты в скольконибудь значительной степени. Кроме того, эксперимент показал, что семядоли льна обладают механизмами, которые эффективно удаляют верноловую кислоту из липидов мембран и включают ее в триацилглицеролы.

Пример 11. Клонирование генов Δ12эпоксигеназы из других биологических видов, содержащих эпоксикислоты.

Гомологи гена Сра12 Δ12-эпоксигеназы получили из других биологических видов, богатых эпоксижирными кислотами, путем клонирования членов семейства генов монооксигеназ Δ12 со смешанными функциями, которые на высоком уровне экспрессируются в развивающихся семенах, сопоставляли их аминокислотные последовательности с последовательностями, известными для Δ12-десаΊуразы и Δ12эпоксигеназы. Такие гены клонировали либо посредством скрининга библиотек кДНК развивающихся семян с помощью генетических зондов, основанных на гене Сра12 (последов. № 1) или на фрагменте Э12У (последов. № 7), либо посредством амплификации ПЦР-фрагментов с помощью праймеров, сконструированных для консервативных последовательностей Δ12монооксигеназ растений со смешанными функциями, как описано в настоящем описании. Предполагаемые последовательности Δ12эпоксигеназ демонстрируют более высокую общую идентичность последовательностей по отношению к описанным здесь последовательностям Δ12-эпоксигеназ, чем по отношению к известным последовательностям Δ12-десаΊураз.

В одном из примеров такого подхода из неидентифицированного вида Сгерщ, не являющегося Сгерщ ра1аеШпа и содержащего в масле своих семян высокие уровни верноловой кислоты, получили полноразмерную последовательность, подобную последовательности Δ12эпоксигеназы. Из развивающихся семян этого вида Сгерщ выделяли поли(А)+ РНК с помощью набора для выделения мРНК ОшскРгер Мюго (Ркагтааа Вю!ескпо1о§у) и использовали ее для синтеза двухцепочечной кДНК, с использованием в качестве затравки олигосахарида б(Т). Полученную таким образом двухцепочечную ДНК затем лигировали с адаптерами ЕсоР1/№11 (РНагтааа Вю!есйпо1оду) и получали библиотеку кДНК с помощью набора для клонирования кДНК ΖΑΡ<ΌΝΑ Сщараск (8!га!адепе). Эту библиотеку кДНК на мембранных фильтрах НуЬопб Ν+ (ЛтегШат) подвергали скринингу с помощью рандомизированно меченого фрагмента Э12У (последов. № 7) из Сгерщ а1рша в соответствии с инструкциями изготовителя, используя стандартные условия гибридизации. Это привело к выделению рекомбинатного бактериофага, обозначенного СгерХ.

Определили нуклеотидную последовательность кДНК СгерХ, и представили ее в последов. № 3. Выведенная для СгерХ аминокислотная последовательность (последов. № 4) представляет собой белок, состоящий из 374 аминокислот, имеющий 97%-ную идентичность с последовательностью гена Сра12 Δ12эпоксигеназы, но только 57%-ную идентичность с последовательностью Ь26296 Δ12-десатуразы АгаЫборШ ШаИапа. Это явно указывает на присутствие гена в другом виде Сгерй, имеющего высокое содержание верноловой кислоты, причем этот ген высоко гомологичен по отношению к гену Сра12 Δ12-эпоксигеназы и безусловно не является геном десатуразы.

Во втором примере этого подхода удалось выделить частичную последовательность, подобную последовательности Δ12-эпоксигеназы, из содержащего верноловую кислоту вида Уегпоша да1атеп818. Матрицы первой цепи кДНК получили из тотальной РНК, выделенной из развивающихся семян У. да1атепШ, с помощью стандартных методов.

ПЦР-фрагмент (длиной в 550 нуклеотидов), обозначенный как Уда11, получали путем амплификации одноцепочечной кДНК с помощью праймеров, разработанных на основе выведенной аминокислотной последовательности монооксигеназ растений со смешанными функциями. Нуклеотидную последовательность амплифицированной ДНК определяли с помощью стандартных методов, и она представлена в ПОСЛЕДОВ. № 5.

Сопоставление установленной аминокислотной последовательности ПЦР-фрагмента Уда11 (последов. № 6) с полной последовательностью гена Сра12 Δ12-эпоксигеназы и с последовательностью Ь26296 Δ 12-десатуразы ЛгаЬ1борШ ШаНапа (фиг. 2) показывает, что последовательность амплифицированного Уда11 кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую области, включающей аминокислотные остатки 103-285 полипептида Сра12. В пределах этой области последовательность Уда11 проявила более высокую идентичность аминокислот с последовательностью Сра12 Δ12эпоксигеназы (67%), чем с последовательностью Δ12-десатуразы А. ШаНапа (60%), что позволяет сделать вывод, что амплифицированная ДНК скорее соответствует последовательности эпоксигеназы, чем последовательности десатуразы.

Специалистам в данной области техники понятно, что для настоящего изобретения возможны также вариации и модификации, иные, чем конкретно описанные здесь. Следует понимать, что данное изобретение включает все такие вариации и модификации. Настоящее изобретение также включает все те стадии, свойства, композиции и соединения, на которые ссылаются или которые указаны в настоящем описании, по отдельности или совместно, в любой и во всех комбинациях любых двух или более указанных стадий или свойств.

Перечень публикаций, на которые имеются ссылки в настоящем описании

1. Ап е! а1. (1985) ЕМВО 1. 4:277-284.

2. АикиЬе1, Е.М., Вгеп!, К., Ктдк!оп, К.Е., Мооге, Ό.Ό., 8е1бтап, БС., 8тйй, БА. апб 81γιι1ι1, К. (1987). 1п: Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вт1оду. У11еу 1п!егкаепсе (Ι8ΒΝ 047150338).

3. Вабат1, К.С. апб Раб1, К.В. (1981) Ргодгекк ш Ыр1б Кекеагсй, 19, 119-53.

4. ВаГог, М., 8тйЬ, М.А., 1опккоп, Б., 8!оЬаг1, К. апб 81утпе, 8. (1993) Лгсй Втсйет. Втрйук. 303, 145-151.

5. ВаГог, М., Вапак, А., У1Ьегд, Е., Бептап, М., 8!аЬ1, и. апб 81утпе, 8. (1997) 1п: У1Шатк, БР., МоЬакйег, К.и., Бет, Ν.^. (ебк) РЬук1о1оду, ЫосНетБиу апб то1еси1аг Ьт1оду оГ р1ай Нр1бь. К1ц^ег Асабетю РиЬНкйег, БогбгесЫ. 1п-ргекк.

6. В1ее апб 8сйиЬег (1990) 1. Вю1. Сйет. 265, 12887-12894.

7. В1ее, Е., У11сох, А.Б., Матей, БМ., 8сйиЬег, Е. (1993) 1. Вю1. Сйет. 268, 1798-1715.

8. В1ее, Е., 8!аБ1, 8., 8сйиЬег, Е. апб 81утпе,

8. (1994) Втсйет. Втрйук. Кек. Сотт. 197, 778-784.

9. ВПдЬ, Е.6. апб Пуег, У.Б (1959) Сап. 1. Втсйет. РЬукюБ 230, 379-288.

10. Вохак, К.К., Уи, Н., 81геуад, К. апб СЬпк!оГГегкеп, К.Е. (1990) Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 87, 3904-3908.

11. СЬпйои, Р., МсСаЬе, О.Е., 8\\'ат У.Е. (1988) Р1ап! РЬукю1 87, 671-674.

12. Сгокк^ау е! а1. (1986) Мо1. Сеп. Сепе!. 202, 179-185.

13. Беуегеих, 1., НаеЬегй, Р. апб 8тййек, О. (1984) №с1. Аабк Кек. 12, 387-395.

14. Бойегик е! а1. Р1ай Рйукю1. (1994) 105, 1075-1087.

15. ЕпдекеШ, Ν. & 81утпе. 8. (1996) Р1айа 198, 238-245.

16. Еготт е! а1. (1985) Ргос. №!Б Асаб 8сЕ (И8А) 82, 5824-5828.

17. Наке1оГГ, 1. апб СебасН, У.Б. (1988) №Шге 334, 586-594.

18. Неггега-Ек!ге11а е! а1. (1983а) №11иге 303, 209-213.

19. Неггега-ЕйгеИа е1 а1. (1983Ь) ЕМВО 1. 2, 987-995.

20. Неггега-Ек!ге11а е! а1. (1985) 1п: Р1ап! Сепебс Епдтееппд, СатЬпбде Ип1уегкйу Ргекк, ΝΥ, рр 63-93.

21. КоБп, С., Найтапп, Е., 81утпе. 8. & Веи!е1тапп, Р. (1994) 1. Р1ап! РЬукю! 144, 265271.

22. Кгепк, Е.А., Мо1епбук, Б., Уи11етк. С.1. апб 8сй1регооп, К.А. (1982) №11иге 296, 72-74.

23. Ба\\тепсе, С.Б, ЕШк, ЕС., Етпедап, Е.Е, Бептк, Е.8. апб Реасоск, У.Е (1989) 1п: Вгеебтд Кекеагсй: ТНе Кеу !о 8шУ1уа1 оГ !йе Еаг111 (1уата, 8. апб Такеба, С. ебк) 6111 1п!ета!юпа1 Сопдгекк оГ 8АВКАО, рр 535-538.

24. Бахо, С.К., 8!ет, Р.А. апб Биб\\'|д, К.А. (1991) Вю!есйпо1оду 9, 963-967.

25. №еб1етап апб УипксН (1970) 1. Мо1. Вю1. 48, 443-453.

26. Рахко\\кк1 е! а1. (1984) ЕМВО 1. 3, 27172722.

27. Р1е1гхак, М., 8ЫШ!о, К.Б., Нойп, Т. апб Ро!гукик, I. (1986) №с1. Ас1бк Кек. 14, 58575868.

28. 8апдег, Е., №ск1т, 8. апб Сои1коп, А.К. (1977) Ргос. Асаб. 8ск (И8А) 72, 5463-5467.

29. 811апк1т 1., УЫй1е, Е. апб Еох, В.С. (1994) Вюсйетййу 33, 12787-12794.

30. УаБекепк е! а1. (1988) Ргос. №!1. Асаб. 8с1. (И8А) 85, 5536-5540.

Перечень последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ (1) ЗАЯВИТЕЛЬ: Организация научных и промышленных исследований Содружества И Стен Стимн.

(ϋ) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

ГЕНЫ ЭПОКСИГВНАЗ ЖИРНЫХ КИСЛОТ РАСТЕНИЙ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ (ίϋ) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 20 (XV) АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ:

(A) АДРЕСАТ: ДЭВИС КОЛЛИСОН КЕЙВ (Б) УЛИЦА: 1 Литтл Коллинс Стрит (B) ГОРОД: Мельбурн (Г) ШТАТ: Виктория (Д) СТРАНА: Австралия (Е) ПОЧТОВЫЙ ИНДЕКС: 3000 (ν) ВОЗМОЖНОСТЬ СЧИТЫВАНИЯ ИНФОРМАЦИИ КОМПЬЮТЕРОМ (A) ТИП НОСИТЕЛЯ: Дискета (Б) КОМПЬЮТЕР: Совместимый с ΙΒΜ РС (B) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА : РС-П03/М5-ГХ>3 (Г) ПРОГРАММА : РаБепЪ1п, выпуск * 1, версия 91.25 (νί) ДАННЫЕ НАСТОЯЩЕЙ ЗАЯВКИ :

(А) НОМЕР ЗАЯВКИ:

(Б) ДАТА ПОДАЧИ:

(νϋ) ДАННЫЕ ПРВДЬЩУЩВЙ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР ЗАЯВКИ: АН РО6223 (B) ДАТА ПОДАЧИ: 15 апреля 1997 (νϋ) ДАННЫЕ ПРЕДЫДУЩЕЙ ЗАЯВКИ:

(А) НОМЕР ЗАЯВКИ: Αϋ РО6226 (Б) ДАТА ПОДАЧИ: 15 апреля 1997 (νϋ) ДАННЫЕ ПРЕДЫДУЩЕЙ ЗАЯВКИ:

(А) НОМЕР ЗАЯВКИ: Ц£ 60/043706 (Б) ДАТА ПОДАЧИ: 16 апреля 1997 (νϋ) ДАННЫЕ ПРЕДЫДУЩЕЙ ЗАЯВКИ:

(А) НОМЕР ЗАЯВКИ: Ц5 60/050403 (Б) ДАТА ПОДАЧИ: 20 июня 1997 (νίϋ)

ИНФОРМАЦИЯ О ПОВЕРЕННОМ (A) ФАМИЛИЯ, ИМЯ: ХЬЮС , (B) » НОМЕР ДЛЯ ССЫЛКИ/» / АГЕНТЕ: Д-р Э.ДЖОН Л. ДОКЕТА: МЯО/ЕбН/ЛМС (ίχ)

ИНФОРМАЦИЯ ПО ТЕЛЕКОММУНИКАЦИИ:

(А)

ТЕЛЕФОН:

+61 3 9254 2777 (В) (В)

ТЕЛЕФАКС:

ТЕЛЕКС:

+61 3 9254 2770

АА 31787 (2) ИНФОРМАЦИЯ

ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ » I:

(Ϊ)

ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) (B) (В) (Г)

ДЛИНА: 1 ТИП: * КОЛИЧЕСТВО ТОПОЛОГИЯ:

1358 пар оснований нуклеиновая кислота > ЦЕПЕЙ: одна : линейная (ϋ)

ТИП

МОЛЕКУЛЫ :

ДНК (ίχ)

СВОЙСТВА:

(A) НАИМЕНОВАНИЕ/КЛЮЧ:

(B) МЕСТОРАСПОЛОЖЕНИЕ:

СОЗ

30.. 1151 (χΐ)

ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

ПОСЛЕДОВ. » 1:

САСААСТТСА ССАТАААТСА ТТТАТСААС АТС СОТ ССС ССС СОТ СОТ ОСТ ССС

АСА ТСС САА

ТЬг 5е:

Мес С1у А1а С1у С1у Агд С1у Агд

ААА ТСС СТС АТС САА СОТ СТС ТСА СТТ САТ :СА СТА АСС

С1и

Ьуз Вес Ча1 Мес С1и Агд Ча1 Зе:

Ча 1 Азр Рго

ТТС ТСА СТС

149

Су:

Ьуз А1а

IIМеС

Тгр

Агд

Ье<

355

360

350

345

Туг Не С1и

ССТ САТ АСС ААС

Рго Азр Зе:

ТСЛТСАТАТС

ААТАААСССС

СССТАТСАТС

СТССТТСТСС

СТС

ААА

ССТ

СТТ ТАТ ТСС

Ьуз

С1у

365

СААААТССЛС

Мес

ТАТ САТ

Уа1 Туг Тгр

АТССАТТТТ

170

АЛА

ТТС

1151

Туг Н:

Ьуз

Ье>

ААЛСССТСТА

СТТСАСТАТС

ТСТААТСААА

СТЛТСТССТТ

СТСАААЛААА

АЛААААА

ПТТАГСТТТЗ

ТТСТАТСТАТ

ТгчЛАТААТАТ

АЛСАААСТЛТ

12'

13' (2)ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ » 2:

(Ϊ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 374 аминокислоты (Б) ТИП: аминокислота <В) ТОПОЛОГИЯ: линейная (И) ТИП

МОЛЕКУЛЫ белок (Χΐ)

Агд Уа1 Зе:

А1.

11ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

ПОСЛЕДОВ. Я» 2:

Ьуз Зе;

Уа1 Азр Рго Уа1 Тп:

РЬе Зег Ьеи 5βι

С1и

ЬеЬуз С11

Ηί:

Су

РЬе С11

Агд Зег Уа1 Не Агд •ег Зе:

Туг

А1.

Туг Ϊ1· Рг

Τ';

’Ье Ьеи А1.

Аап 65

ТЬг Туг

Не

Рго

ТЬг Беи Рго ТЬг 5ег Беи АБа Туг Беи А1а Тгр

70

75

80

Рго

Уа1

Туг

тгр

РЬе

Суз

С1п

А1а

5ег

УаБ

Беи

ТЬг

С1у

Беи

Тгр

11е

85

90

95

Беи

СБу

Нгз

С1и

Суз

СБу

Н13

Нгз

А1а

РЬе

5ег

Азп

Туг

ТЬг

Тгр

РЬе

100

105

110

Азр

Азр

ТЬг

Уа1

СБу

РЬе

Не

Беи

Ηί8

5ег

РЬе

Беи

Беи

ТЬг

Рго

Туг

115

120

125

РЬе

Зег

Тгр

Буз

РЬе

Зег

Нгз

Агд

АзП

Нгз

Ню

5ег

Азп

ТЫ

г

8е г

1 10

115

14 0

Не

Азр

Азп

Азр

СБи

УаБ

Туг

Пе

Рго

Буз

5ег

Буз

Зег

Буз

Беи

АБа

145

150

155

160

Агд

Не

Туг

Буз

Беи

Беи

Азп

Авп

Рго

Рго

СБу

Агд

Беи

Беи

УаБ

Беи

165

170

175

Не

Не

МеС

РЬе

ТЬг

Беи

С1у

РЬе

Рго

Беи

Туг

Беи

Беи

ТЬг

Азп

Не

180

185

190

Зег

С1у

Буз

Буз

Туг

Азр

Агд

РЬе

АБа

Азп

НГЗ

РЬе

Азр

Рго

Мес

Зег

195

200

205

Рго

Пе

РЬе

Буз

СБи

Агд

СБи

Агд

РЬе

СБп

УаБ

РЬе

Беи

5ег

Азр

Беи

210

215

220

<31у

Беи

Беи

АБа

Уа1

РЬе

Туг

СБу

Не

Буз

УаБ

А1а

УаБ

А1а

Азп

Буз

225 230 235 240 <31у АБа А1а Тгр Уа1 А1а Суз Мес. Туг С1у Уа1 Рго Уа1 Беи С1у Уа1

245 250 255

РЬе ТЬг РЬе РЬе Азр Уа1 Не ТЬг РЬе Беи Нгз Нгз ТЬг Ню С1п 5е:

260

265

27

3

ЗеГ

Рго

Н13

Туг

Азр

Зег

ТЬг

СБи

Тгр

АЗП

Тгр

Пе

Агд

С1у

АБа

Беи

275

280

285

Зег

АБа

Не

Азр

Агд

Азр

РЬе

СБу

РЬе

Беи

Авп

Зег

УаБ

РЬе

Ню

Азр

290

295

300

Уа1

ТЬг

Н:з

ТЫ

НгЗ

УаБ

Мег

Ню

Н13

Беи

РЬе

Зег

Туг

Г1е

Рго

Нгз

305

310

315

32С

Туг

Н15

А1а

Буз

С1и

АБа

Л,,

Αϋρ

А1л

Нс

Буз

Рго

Не

Бей

С1у

Азр

325

330

335

РЬе

Туг

Мес

11 е

Азр

Агд

ТЫ

Рго

Не

Беи

Буз

АБа

Мес

Тгр

Лгп

си

140

34 5

350

СБу

СБи

Суз

Мес

туг

Не

С1и

Рго

Л::р

Зег

Буз

Беи

Буз

СБу

ν.11

355

360

365

Туг Тгр Туг НгЗ Буз Беи

370 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ Ж 3:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 1312 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (В) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИП МОЛЕКУЛЫ : кДНК (νί) ИСТОЧНИК ПРОИСХОЖДЕНИЯ:

(А) ОРГАНИЗМ: Сгер13 эр.

(1х) СВОЙСТВА:

(А) НАИМЕНОВАНИЕ/КПЮЧ: СОУ (С) МЕСТОРАСПОЛОЖЕНИЕ: .'.61147 ιί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. Ж 3:

ТСТТСАССАТ АААТСАТСТА ТСААС

АТС

ССТ

ССС

ссс

ССС

ССТ

ССТ

ССС

АСА

52

Мес 1

СБу

АБа

С1у

С1у 5

Аг’

С1у

Агд

ТЬг

ТСС

САА

ААС

ТСС

СТС

АТС

САА

ССТ

СТС

ТСА

СТТ

САТ

ССА

СТА

АСС

ЮС

Зег

СБи

Буз

Зег

УаБ

Мес

С1и

Агд

ν.< 1

Зег

να!

Аар

Рго

УаБ

ТЬг

РЬе

10

15

20

ТСА

СТС

лет

САТ

ТТС

ААС

САА

ССА

атс

ССТ

ССА

САТ

ТСС

ТТС

САС

ССА

14 9

Зег

Беи

Зег

Азр

Беи

БуЗ

СБп

АБа

I 1<»

Рт

Рго

Ηι.3

Суз

РЬе

СБп

Агд

30

35

40

ТСТ

СТС

АТС

ССТ

ТСА

ТСТ

ТАТ

ТАС

СТТ

СТТ

САС

слт

СТС

АТЛ

АТТ

ССС

Ю.

Зег

УаБ

Пе

Агд

Зег

Зег

Туг

Туг

УаБ

Уа1

С1п

Азр

Беи

11е

Г1.:

АБа

45

50

55

ТАС

АТС

ТТС

ТАС

ТТС

СТТ

ССС

ААС

АСА

ΤΛΤ

АТС

ССТ

ААТ

СТС

ССТ

САТ

244

Туг

Не

РЬе

Туг

РЬе

Беи

АБа

Азп

ТЫ

Туг

Не

Рго

Азп

Беи

РГО

НБз

60

65

70

ССТ

СТА

ССС

ТАС

ТТА

ССТ

тсс

ССС

СТТ

ТАС

ТСС

ТТС

ТСТ

САА

ССТ

АСС

292

Рго

Беи

АБа

Туг

Беи

А1а

Тгр

Рго

Беи

Туг

Тгр

РЬе

Суз

С1п

АБа

Зег

75

80

85

СТС

СТС

АСТ

ССС

ТТА

ТСС

АТС

СТС

ОСС

САТ

САА

ТСТ

СОТ

САС

САТ

ССС

340

УаБ

Беи

ТЬг

СБу

Беи

Тгр

11е

Беи

С1у

ни

СБи

Суз

СБу

НБз

НБз

АБа

90

95

100

105

ТАТ АСС ААС ТАС АСА ТСС ОТТ САС САС АСТ СТС ССС ТТС АТС АТС САТ399

Тут Зег Азп Туг ТЬг Тгр Уа1 Азр Азр ТЬг Уа1 О1у РЬе Не НеНгз

НО 115120

ТСА ТТГ СТС СТС АСС ССС ТАТ ТТС ТСТ ТСС ААА ТАС АСТ САС ССС ААТ4 36

Зег РЬе Беи Беи ТЬг Рго Туг РЬе Зег Тгр Буз Туг 5ег Нгз АгдАзп

125 130135

САС САТ ТСС ААС АСА АСТ ТСС АТТ САТ ААС САТ САА СТТ ТАС АТТ ССС484

Ηίβ ΗΪ3 Зег Азп ТЬг Зег Зег Не Азр Азп Азр С1и Уа1 Туг Ис Рго

140 145150

ААА АСС ААС ТСС ААА СТС ААС ССТ АТС ТАТ ААЛ СТТ СТТ ААС ААС ССА532

Буз Зег Буз Зег Буз Беи Буз Агд Не Туг Буз Беи Беи Азп АзпРго

155 · 160165

ССТ ССТ ССА СТС ТТС СТТ ТТС СТТ АТС АТС ТТС АСС СТА ССА ТТТ ССТ5вС

Рго С1у Агд Беи Беи Уа1 Беи Уа1 Не Мег РЬе ТЬг Беи С1у РЬеРго

170 175 1901Θ5

ТТЛ ТАС СТС ТТС АСА ААТ АТТ ТСС ССС ААС ААА ТАС САТ АСС ТТТ ССС628

Беи Туг Беи Беи ТЬг Азп Г1е Зег С1у Буз Бу.: Гуг Лар Агд РЬеΑΙ.ι

190 195200

ААС САС ТТС САС ССС АТС ЛОТ ССА АТТ ТТС АЛА САА ССТ САС ССС ТТТ676

Азп Нгз РЬе Азр Рго Мес Зег Рго Не РЬе Буз С1и Агд С1и АгдРЬе

205 210215

САС СТС ТТС СТТ ТСС САТ СТТ ССТ СТТ СТТ ССТ СТС ТТТ ТАТ ССА АТТ724

С1п Уа1 РЬе Беи Зег Азр Беи С1у Беи Беи АБа УаБ РЬе Туг С1уНе

220 225230

ААА СТТ ССТ СТА ССА ААТ ААА ССА ССТ ССТ ТСС СТС ССС ТСС АТС ТАТ772

Буз УаБ АБа Уа1 АБа Азп Буз С1у А1а АБа Тгр УаБ АБа Суз МегТуг

235 240245

ССА СТТ ССС СТС СТА ССС ОТА ТТТ АСС ТТТ ТТС САТ СТС АТС АСС ТТС820

С1у УаБ Рго Уа1 Беи С1у УаБ РЬе ТЬг РЬе РЬе Азр УаБ Не ТЬг РЬе

250 255 260265

ТТЛ САС САС АСС САТ САС ТСС ТСС ССТ САТ ТАТ САТ ТСА АСТ САА ТСС868

Беи Н13 НБз ТЬг Нгз С1п Зег Зег Рго Нгз Т/г Азр Зег ТЬг С1и Тгр

270 273290

ААС ТСС АТС АСА ССС ССТ ТТС ТСА ССА АТС САТ АСМ САС ТТТ ССС ТТС916

Азп Тгр Не Агч 1.у А1а Беи Зег А1а Не Лар Агд Азр РЬе С1у РЬе

295 290295

СТС ААТ АСТ Ьеи Азп Зег

СТТ Уа1

ТТС САТ

САТ ста АСА САС

АСТ САС СТС

АТС Мес

САТ Нхз

САТ Н13

964

РНе

Нхз

Азр

ν*ι 305

ТНг Н13

ТНг

Низ Уа1 3 10

300

ТТС

ТТТ

ТСА

ТАС

АТТ

ССА

САС

ТАТ

САТ

ССА

ААС

САА

ССА

АСС

САТ

ССА

1012

Ьеи

РНе

Зег

Туг

Не

Рго

1115

Туг

Нхз

А1а

Ьуз

С1и

А1а

Агд

Азр

А1а

315

320

325

АТС

ААА

ССС

АТС

ТТС

ССС

САС

ТТТ

ТАТ

АТС

АТС

САТ

АСС

АСТ

ССА

АТТ

1(360

Не

Ьуз

Рго

Не

Ьеи

С1у

Азр

РНе

Туг

Мес

ί 1е

Азр

Агд

ТНг

Рго

[ 1е

330

3)5

3-10

345

ТТА

ААА

ССА

АТС

ТСС

АСА

САС

ССС

ДСС

САА

ТСС

АТС

ТАС

АТС

САС

ССТ

1108

Ьеи

Ьуз

А1а

МеС

Тгр

Агд

С1и

С1у

Агд

С1и

Сул

Мес

Туг

Не

С1и

Рго

150

355

360

САТ

АСС

ААС

СТС

ААА

ССТ

СТТ

ТАТ

ТСС

ТАТ

САТ

ААА

ТТС

ТСАТСАТАТС

1157

Азр

Зег

Ьуз

Ьеи

Ьуз

С1у

ναΐ

Туг

Тгр

туг

ΗΪ3

Ьуз

Ьеи

365

370

СААААТОСАС АТССАТТТТС АААСССТСТА СТТАССТТГС ТТСТАТСТАТ ААТААСАССС 1217

ССССТССТАТ ССТТТТСТАТ СССТААСССА ССССАААТАС ТТАААТААТА ТСССТАТСАТ 1277

СТААТСАААС ТАТСТССТТС ТСГААААААА ААААА 1312 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ № 4:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 374 аминокислоты (Б) ТИП: аминокислота (B) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ТИП МОЛЕКУЛЫ : белок (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. № 4:

Мес С: / А1а С1у С1у А.-} С1у Аг ι Т.-.г Зег ·;ι_υ Суз 5»г ν,ιΐ М‘

1 5

10 РНе 25

Зег Ьеи Зег

15 Азр Ьеи 30

Ьуз

С1п

Агд Уа1 5ег Уа1 Азр Рго

Уа1

ТНг

20

А1а

Не

Рго

Рго

Нхз

Суз

РНе

01 п

Агд

Зег

ν3ι

Не

Агд

Зег

Зег

Туг

35

40

45

Туг

Уа1

Уа1

С1п

Азр

Ьеи

Не

Не

А1а

Туг

Не

РНе

Туг

РНе

Ьеи

А1а

50

55

60

Азп

ТНг

Туг

Не

Рго

Азп

Ьеи

Рго

Нхз

РГО

Ьеи

А1а

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

65

?0

75

90

Рго

Ьеи

Туг

Тгр

РНе

Суз

С1п

А1а

Зег

Уа1

Ьеи

ТНг

С1у

Ьеи

Тгр

Не

85

90

Ьеи

С1у

Н15

С1и

Суз

С1у

Нхз

Н13

А1а

Туг

Зег

Азп

Туг

ТНг

Тгр

Уа1

100

105

НО

Азр

Азр

ТНг

Уа1

С1у

РНе

Не

Пе

Нхз

Зег

РНе

Ьеи

Ьеи

ТНг

Рго

Туг

115

120

125

РНе

5ег

Тгр

Ьуз

Туг

Зег

Н13

Агд

АЗП

НХЗ

Нхз

Зег

Азп

ТНг

Зег

Зег

130

135

140

Не

Азр

Азп

Азр

<31и

Уа1

Туг

Не

Рго

Ьуз

Зег

Ьуз

Зег

Ьуз

Ьеи

Ьуз

145

150

155

160

Агд

Не

Туг

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

Рго

Рго

С1у

Агд

Ьеи

Ьеи

Ча1

Ьеи

165 · 170 175

Уа1 Не Мес РНе ТНг Ьеи С1у РЬе Рго Ьеи Туг Ьеи Ьеи ТНг Азп 11е

180 185 190

Зег С1у Ьув Ьуз Туг Азр Агд РЬе А1а Азп Нхз РЬе Азр Рго Мес Зе:

195 200 205

С1у

Ьеи

Ьеи

А1а

Ча1

РНе

Туг

С1у

Не

Ьуз

Уа1

А1а

Уа1

А1а

Азп

Ьуз

225

230

235

240

С1у

А1а

А1а

Тгр

νβΐ

А1а

Суз

Мес

Туг

С1у

Ца1

Рго

Уа1

Ьеи

С1.у

Уа1

245

250

255

РЬе

ТНг

РНе

РНе

АЗр

Не

ТНг

РНе

Ьеи

Нхз

Нхз

ТНг

Нхз

С1Н

Зе г

260

265

2 7 0

Зег

Рго

Нхз

Туг

Азр

Зег

ТНг

αΐ·

Тгр

Азп

Тгр

(1е

Агд

С1у

А1а

Ьеи

275

280

285

И··. с

Л1а

ί 1е

Азр

Агд

Азр

СК-

<;ι·/

[’Ке

Ьеи

А::п

Зег

V.» ί

РН··

н1а

А;;р

2 90

24-,

300

Уа1

ТНг

Нхэ

ТНг

Нхз

Уа1

Мес

Нхз

Нхз

Ьеи

РНе

Зег

Туг

Не

Рго

Нха

305

310

315

320

туг

Нхз

А1а

Ьуз

С1и

А1а

Агд

Азр

А1а

Не

Ьуз

Рго

Не

Ьеи

С1у

Азр

325

330

335

РНе

Туг

МеС

Не

Азр

Агд

ТНг

Рго

Не

Ьеи

Ьуз

А1а

МеС

Тгр

Агд

С1и

340

345

3 3 0

С1у

Агд

С1и

Суз

Мес

Туг

Пе

С1и

Рго

Азр

Зег

Ьуз

Ьеи

Ьуз

С1у

Уа1

355

360

365

Туг Тгр Туг Нхз Ьуз Ьеи

370 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ » 5:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 550 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИП МОЛЕКУЛЫ : кДНК (νί) ИСТОЧНИК ПРОИСХОЖДЕНИЯ:

(А) ОРГАНИЗМ: УегпопЬа да1атепз1з (ίχ) СВОЙСТВА:

(A) НАИМЕНОВАНИЕ/КЛЮЧ: СОЗ (B) МЕСТОРАСПОЛОЖЕНИЕ: 1.-549 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. * 5:

САТ САС ССС ТТС АСТ САС ТАТ САА ТСС

Ηΐ3 Н13 А1а РНе Зег Азр Туг С1п Тгр

I5

АТС СТТ САС ТТТ ССА СТС ТТС АССССТ

11ч Ьеи Нхз РЬе А1а Ьеи РЪ·: ТЬгРго

2025

САС ССТ ААТ САС САТ ССС ААС АСАААС

Н1з Агд Азп Н1з Нхз А1а Азп ТЬгАзп

3540

ТАС АТС ССТ ААА СТТ ААА ТСС ААССТС

Туг Не Рго Ьуз Уа1 Ьуз Зег ЬузУа1

5055

ААС ААС ССТ ССТ ССТ ССС СТТ ТТСАСС

Азп Азп Рго Рго С1у Агд Уа1 РНеТНг

6570

ССТ ТТТ ССТ ТТА ТАС СТТ ТТС АСС ААТ

С1у РНе Рго Ьеи Туг Ьеи Рпе ТНг Азп

ССТ ТТТ ССС ААС САТ ТТТ САТ ССС АТС

Агд РНе А1а Азп Нхз Рг.е Азр Рго Мес

100 105

АТА САС САС АСТ СТС ССС ТТС4 Я

Не Азр Азр ТНг νο 1 С1у РНе

1015

ТАТ ТТС ТСТ ТСС ААА ТАС АСТ’м

Туг РНе Зег Тгр Ьуз Туг Зег )0

ТСТ СТТ СТА АСС САТ САА СТА144

Зег Ьеи Уа1 ТНг Ацр С1и νοί

ААС АТТ ТАТ ТСС ААА АТС СТТ192

Ьуз Не Туг Зег Ьуз 11е Ьеи

ТТС ССТ ТТС АСА ТТС АТС СТС240

Ьеи А1а РНе Агд Ьеи Не \Га1

75ВС

СТТ ТСА ССС ААС ААА ТАС САА283

Уа1 Зег С1у Ьуз Ьуз Тут С1и

9095

АСТ ССС АТТ ТТС АСС САС ССТ336

Зег Рго Не РНе ТНг С'.и Агд

НО

Рго 11е РЬе Ьуз 01и Агд С1и Агд РЬе 31п Уа1 РЬе Ьеи Зег Азр Ьеи

210 215 220

САС САТ СТА САА СТС ТТС

СТТ

Ни

Уа1 С11

Уа1 Ьеи

ΤΑί т_у1

115

СТС СТТ ССТ САА ССТ

СТА

Уа! Уа1 Агд С1п А1а

Уа1

130

135

ГСС АТТ ТАС ССА СТТ ССТ

Су:

II- Ту:

150

АТС АСТ ТАТ СТТ САС САС г_у1

165

5Ί

5ч:

120

СТС

Азр РЬе С1у

СТС ССТ ААЛ ССЛ

А1.

Ье:

АТА ССА

ССТ

Ьуз С1у

11<

А1125

СТТ ССТ

ССТ ТСС

С1у

140

38СТС АТС

СТС ССС СТЛ ААС

АСС

САТ

ΤΗι

ТСА САА ТСС САС ТСС СТА

ССЛ

155

Тгр Авр Тгр Ьеи

180

А1.

Тгр

ССА

А1.

С ГС ТСА СТС

ССС

170 (2)ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ * 6:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 183 аминокислот:

(Б) (B) ТОПОЛОГИЯ:

ТИП;

ТТС ТТТ

САС ТЛТ

ПЛ Г

15.'<

5:

55С (ϋ) ТИП

МОЛЕКУЛЫ белок (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

ПОСЛЕДОВ.

№ 6:

Нхз Ηΐ3 Αΐί

РЬе 5ег Азр Туг С1п Тгр Не Азр Авр ТЫ Уа1 С1у

Н-.з Агд Ась

Н,

Нг:

Азп

РЬе Зег Тгр Ьу

3, ты

Азр ей

Туг

Рго

Ьуз

Уа1

Ьуз Зег

Ьуз Уа1

Ьуз Не

Туг Зег Ьу:

Не

Ьв1

Азп

Авп

Рго

Рго

С1у

Агд Уа1

РЬе ТЬг

Ьеи А1а

РЬе Агд Ьеи

ΙΗ

Уа1

С1у РЬе

Рго

Ье<

Туг

Ьеи РЬе

ТЬ:

Азп

Уа1

Зе:

С1у Ьу:

Ьу:

Туч

Агд РЬе

Азп

РЬе Азр Рго Мес Зег Рг<

Аг<

СН

М13 Уа!

Туг Уа1 Уа!

130

100

105

110

145

С1п Уа1

Агд С1п

Λ1.

150

Ьеи Зег Лир РЬе О1у Ьеи Не А1а Уа1 АН:

120

125

Уа1 Ьеи АН

135

Ьу:

С1у С1у А1а Тгр Уа1 Мес

140

155

160

11е ТЫ Туг Ьеи Ηϊβ Ηίδ ТЬг Н£з Ьеи Зег Ьеи Рго Нг

Туг Азр Зег

165

170

Зег С1и Тгр Азр Тгр Ьеи Агд (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ Ж 7:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 177 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИП МОЛЕКУЛЫ : кДНК (νί) ИСТОЧНИК ПРОИСХОЖДЕНИЯ:

(Λ) ОРГАНИЗМ: Сгерх» а1рз.па

САА

СТС

Уа!

(ίχ) (χί)

ТСС

Суз

ССС

С1у

ААА

СВОЙСТВА:

(А) НАИМЕНОВАНИЕ/КЛЮЧ: СОЗ (Б) МЕСТОРАСПОЛОЖЕНИЕ: 1--177

1··

ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

ССТ

САС

САТ

ССС

АСС

САС

ГАС

САС

ПОСЛЕДОВ.

ТСС

СТТ сдс » 7:

САС

ААТ

С1у

ТТС

ТАС

Ьуз Ту:

САТ САА

Н1;

Нгз

А1,

РЬе

5е:

Ту:

С11

Тгр

Уа 1

Азр

Аз:

.5

РЬе

АСС

СТТ

Уа1

АТС

СТС

САС

ТСС

СТС

АТС

АСС

ССС

ТАТ

ТТС

ТСС тсс

II:

САС

НХ!

ССС

ТАС

АТС

Туг

11<

Зе:

РЬе

М>:1

ТЬ:

Ргс

Туг

РЬе

Тгр

ААС

ССС

САС

САТ

ССС

ААС

АСА

ААТ

ТСС

САС

ААС

14Нхз

А1.

ты

Аз:

Зе:

Азр

4¹

ААА

Рго

Ьуз

АСС

ААС

Зег

ССС

ААА

177

А1.

(2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ;

(A) ДЛИНА: 59 аминокислот (B) ТИП: аминокислота (В) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИП (χί)

С1и Суз

Ьуз

МОЛЕКУЛЫ : белок

ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

Рпе Зег Азр Τγι

Зег

РЬе Ьеи Ме:

ПОСЛЕДОВ.

С1п Тгр Уа1

Азр Азп

РЬе

Зег Тгр

Туг

Азр

С1и

Зег Н1з Агд

Азп

Ηϊβ

Н15

А1а Азп ТЬг Азп Зег Ьеи Азр

Аз:

ι5

Уа1 Туг 11е

Рго

Ьуз

Зег Ьуз А1а Ьуз (2)ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ » 9:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) (Б) (B) (Г)

ДЛИНА: 383 аминокислоты

ТИП: аминокислота

КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна ТОПОЛОГИЯ: линейная (11) ТИП МОЛЕКУЛЫ : белок (νΐ) ИСТОЧНИК ПРОИСХОЖДЕНИЯ:

(А) ОРГАНИЗМ: АгаЫс1орз13

ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

Мес

СН

ЪЪаНапл

ПОСЛЕДОВ.

№ 9:

С1у А1а С1у С1у Агд

ТЬг Азр ТЬ:

ТЬг Ьуз

Ьуз Ьуз

Мес

Агд

А1а

Рго Уа1

Уа1 Рго

Рго ТЬ:

Зе:

Ьуз

Ьуз Зег

Суз С1:

Рго

Рго

Суз РЬе

Ьуз

РЬе Зег

Агд Зег

11е Рго Агд Зег РЬе Зег Туг Ьеи 11е Зег Азр Не Не 11е А1;

Зег

Суз РЬе Туг Туг Уа’ АН

ТЬ:

Аз г. Туг РЬе Зе:

Ьеи

Рг<

σΐι

Ьеи Зег Туг Ьеи АН

Τγι ;1|

Ьеи

ТЬг

С1у 11е Тгр 100

Уа1

Не А1а Нхз 105

С1и Суз С1у Нхз

НхЗ НО

А1а

РЬе

5ег

Азр

Туг

С1п

Тгр

Ьеи

Азр

Азр

ТЫ

Уа1

С1у

Ьеи

Не

РЬе

Нхз

Зег

115

120

125

РЬе

Ьеи

Ьеи

Уа1

Рго

Туг

РЬ<1

Зег

Тгр

Ьуз

Т/г

Зег

Нхз

Агд

Агд

Нхз

130

115

1 4 0

Нхз

Зег

Азп

ТЬг

О1у

Зег

Ьеи

ОЬх

Агд

Азр

С1ч

V.! I

РЬе

ν.ιΐ

Рго

Ьуз

145

150

155

160

С1п

Ьуз

5ег

А1а

Не

Ьуз

Тгр

Туг

С1у

Ьуз

Т/г

—

Азл

Азп

Рго

Ьеи

С1у

Агд

Не

Мес

МсГ.

Ьеи

ТЬг

Уа1

С1п

РЬе

У11

Г_^,|

С1у

Тгр

Рго

Ели

180

105

190

Туг

Ьеи

А1а

РЬе

Азп

Уа1

Зег

С1у

Агд

Рго

Туг

Азр

О1у

РЬе

А1а

Суз

195

200

205

Нхз

РЬе

РЬе

Рго

АЗП

А1а

Рго

Не

Туг

Азп

Азр

Агд

С1и

Агд

Ьеи

С1п

210

215

220

Не

Туг

Ьеи

Зег

Азр

А1а

С1у

Не

Ьеи

А1а

Уа1

Суз

РЬе

С1у

Ьеи

Туг

225

230

235

240

Агд

Туг

А1а

А1а

А1а

С1п

□ 1у

Мес

А1а

Зег

Мет

Не

Суз

Ьеи

Туг

С1у

245

250

255

Не

Рго

Агд

Зег

РЬе

Зег

Туг

Ьеи

Пе

Тгр

Азр

Не

Не

Уа1

А1а

Зег

50

55

60

Суз

РЬе

Туг

Туг

Уа1

А1а

ТЫ

ТЬг

Туг

РЬе

Рго

Ьеи

Ьеи

Рго

Нхз

Рго

65

70

75

80

Ьеи

Зег

Т/г

Уа1

А1а

Тгп

Рго

Ьеи

Т/г

Тгр

А1.1

Суз

С, 1г.

Н1у

Уа1

Уа1.

05

90

9 5

Ьеи

ТЬг

<Пу

Уа1

Тгр

ν.»ι

1Ь>

А1.»

Нхз

С1и

Суп

С1у

•и

Нхз

Д1а

РЬе

100

105

1 10

Зег

АЗр

туг 115

С 1г.

Тгр

Ьеи

Азр

АЗО

ТЬг

Уа1

С1у

Ьеи

Не

РЬе

Нхз

Зег

РЬе

Ьеи

Ьеи

Уа1

Рго

Туг

РЬе

Зег

Тгр

Ьуз

Т/г

.*>·'

Нх:;

Агд

Агд

Нхз

130

1 35

140

НХ9

Зег

Азп

ТЬг

С1у

Зег

Ьеи

С1и

Агд

Азр

С1и

Уа1

РЬе

Уа1

Рго

Ьуз

145

150

155

160

Ьуз

Ьуз

Зег

Азр

Не

Ьуз

Тгр

Туг

О1у

Ьуз

Туг

Ьеи

Азп

Азп

Рго

Ьеи

165

170

1 75

С1у

Агд

ТЬг

Уа1

Мес

Ьеи

ТЬг

Уа1

С1п

РЬе

ТЬг

Ьеи

С1у

Тгр

Рго

Ьеи

100

105

190

туг

Тгр

А1а

РЬе

Азп

Уа1

Зег

□ 1·/

Агд

Рго

Туг

Рго

О1и

С1у

РЬе

А1а

195

200

205

Уа1 Рго Ьеи Ьеи 11е Уа1 Азп А1а РЬе Ьеи 7а1 Ьеи Не ТЬг Туг Ьеи

260 265270

01η Ихв ТЬг Нхз Рго Зег Ьеи Рго Нхз Туг Азр Зег Зег С1и Тгр Азр 275 200205

Тгр Ьеи Агд С1у А1а Ьеи А1а .ТЬг Уа1 Азр Агд Азр Тут 01·/ 1« Ь₽и

290 295109

Лап Ьуз Уа1 РЬе Н19 Азл Не ТЬг Азр ТЬг Нхз Уа1 А1а Нхз ΗίβЬеи

305 310 315320

РЬе Зег ТЫ Меб Рго Нхз Туг Азп АЬа МеС С1и А1а ТЬг Ьуз А1аНе

325 330335

Ьуз Рго Не Ьеи С1у Азр Тус Туг С1п РЬе Азр С1у ТЫ Рго Тгр Туг

340 345350

Уа1 А1а МеС Туг Агд С1и Л1.1 Ьуз С1и Суз Не Туг ναι С1и Рго Азр

355 360365

Агд С1и С1у Азр Ьуз Ьуз С1у Уа1 Туг Тгр Туг Азп Азп Ьуз Ьеи

370 375180 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ * 10:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 384 аминокислоты (B) ТИП: дм.инокислота (В) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИП МОЛЕКУЛЫ : белок 'νϊ) ИСТОЧНИК ПРОИСХОЖДЕНИЯ:

(А) ОРГАНИЗМ: Вгазз1са дипсеа (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. * 10:

Суз	Нхз	РЬе	Нхз	Рго	Азп А1а ?гэ	Не Туг	А5П	Азр	Агд 01ц	Агд	Ьеи
	210				215			220
С1п	11е	Туг	Уа1	Зег	Азр А1а С1у	Не Ьеи	А1а	Уа 1	Суз Туг	С1у	Ьеи
225					23С		235				240
Туг	Ага	Туг	А1а	А1а	А1а 1.г. С1у	7,»: А 1а	Зег	Мет	·/□·. -уз	Ьеи
				245		25С

С1у Уа! Рго Ьеи Ьеи Не Уа! Азп А1а РЬе Ьеи Уа1 Ьеи Не ТЬг Туг

260 265 270

Ьеи С1п Нхз ТЬг Н1з Рго 5ег Ьеи Рго Нхз Туг Азр 5ег 5ег С1и Тгр

275 200285

Азр ТГр Ьеи Агд 01у А1л Ьеи Αΐ.ι ТЬг Уа1 Азр Агд А:;о Гут ;1у ц_е

290 29',300

Ьеи Азп Ьуз Уа1 РЬе Низ А:;п Не ТЬг Азр ТЫ Нхз ν.ιΐ ,.χ.ι НизНхз

305 310 315320

Ьеи РЬе 5ег ТЬг Мес Рго Нх·.; Туг Нхз А1а Мес С1и ν.ι I ГЬгА1а

325 3 30> ( ,

Не Ьуз Рго Не Ьеи С1у Азр Туг Туг С1п РЬе Азр С1у ТЬг Рго Тгр

340 345350

Уа1

Ьуз

А1а

МеС

тгр

Агд

С1и

А1а

Ьуз

01и Суз

Не

Туг Уа1

С1и Рго

355

360

365

Азр

Агд

С1п

01у

01и

Ьуз

Ьуз

С1у

Уа1

РЬе Тгр

Туг

Азп Азп

Ьуз Ьеи

370

375

Мес

О1у

А1а

О1у

С1у

Агд

Мес С1п

Уа1

Зег

Рго

Зег Рго

Ьуз

Ьуз

Зег

1

5

10

15

С1и

ТЬг

Азр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Агд Уа1

Рго

Суз

01и

ТЬг Ргт

Рго

Рг.е

ТЬг

20

25

30

Уа1

О1у

С1и

Ьеи

Ьуз

Ьуз

А1а Не

Рго

Рго

Нхз

Сух, Рпе

Ьуз

Агд

Зег

35

40

45

(2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ » 11:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: Λ83 аминокислоты (Б) ТИП: аминокислота (B) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИП МОЛЕКУЛЫ ί белок (νί) ИСТОЧНИК ПРОИСХОЖДЕНИЯ:

(А) ОРГАНИЗМ: С1ус1пе тах

Нхз

Туг Азр

Туг

11е

Туг 5е·

Азр Аге

Агд

011

210

215 :20 (ϋ> ТИЛ МОЛВКУЛЫ : белок (νί) ИСТОЧНИК ПРОИСХОЖДЕНИЯ:

(А) ОРГАНИЗМ: 5о1апшп соштегзопН (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. » 12:

Пе

Ту.

11е

225 ди

/.<1

С1п

Ηί:;

ТЬ.

75

Тгр

[.<•4

290

Ьу;

305

РЬе

Ьуз

Ьуз

РГО

Зег

Азр

А1а С1у

Уа!

Ьеи А1.

Уа1

Уа1 ‘Гус С1у

РЬе

А1.

245

Ьеи

260

Ни

А гд С1 у

Уа1 РЬе

Зег ТН.

мес

Рго I1е Ьеи

340

Уа1

А1а

Ηί:

Рго

32'

210

235

240

Ьу:

У..1

Аз.

310

С1у

Λ Ι.ι

29'

Не

Нхз Туг

С1у

С1и Туг

А1а мес Тгр

А1<

СЬь

355

Ьеи

Уа1

Уа1

Суг. У.»1

Τγι

С1у

250

25'

С. у РЬ·»

ТЬг

Уа1

ТЬ.

Рг.г

270

То;

Аир

300 аг С1и

Л;;р

ТЬг Азр ТЬг Ηί;

Уа1

Ηί:

А1а Мес

Туг Агд РЬе

345

Агд 01.

360

315

С1и

А1а

Туг

Σ1-:

А1.

Н.

320

Суз Не

Зег ТЬг С1и Зег Ьуз О1у Уа1 РЬе Тгр Туг

370

375

ТЬг Ьуз А1.

ть.

II·

Рго РЬе Уах

350

Уа1 ОН Р:

365

Азп Азг. Ьуз

38С (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ » 12:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) (Б) (B) < Г>

ДЛИНА: 383 аминокислоты

ТИП: аминокислота

КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна

ТОПОЛОГИЯ: линейная

Аз:

мес 1

С1у А1.»

С’.·/ С1у Агд Мес Зег $

Λ 1.1

Рго 10

Азп

с!у си

.Ь-

С1и Уа1

Ьуз

Агд

Азп

Рго

Ьеи

С1п

Ь/-.

У.Г.

Рго

ТЬг

5сг

Ьуз

Рго

Рго

РЫ ТЬг

20

10

У.11-

С1у

Азр

11е

Ьуз

Ьуз

А1а

Не

Рго

Рго

н.а

Суз

РЬе

С1п

АГ) У.Т

35

40

45

Ьеи

Не

Агд

Зег

РЬе

Зег

Туг

Уа1

Уа!

Туг

Азр

Ьеи

Не

Ьеи

Уа! Зег

50

55

60

Не

Мес

Туг

Туг

Уа1

А1а

АЗП

ТЫ

Туг

РЬе

Нхз

Ьеи

Ьеи

Рго

Зег Рго

65

70

75

00

Туг

Суз

Туг

Не

А1а

Тгр

Рго

Не

Туг

Тгр

11е

Суз

С1п

С1у

Суз Уа!

05

90

95

Суз

ТЬг

С1у

Не

Тгр

Уа1

Азп

А1а

Н15

С1и

Суз

С1у

Нхз

Нхэ

АЬа РЬе

100

105

НО

Зег

Азр

Туг

С1п

Тгр

Уа1

Азр

Азр

ТЬг

Уа!

С1у

Ьеи

Не

Ьеи

Нхз Зег

115

120

125

А1а

Ьеи

Ьеи

Уа1

Рго

Туг

РЬе

Зег

Тгр

ЪУ,

Туг

Зег

Нхз

Агд

Агд Нхз

130

135

140

Н1з

Зег

Азп

ТЫ

С1у

Зег

Ьеи

С1и

Агд

С1и

Уа!

РЬе

Уа1

Рго Ьуз

145

150

155

160

Ргэ

Ьук

Зег

С1п

Ьеи

С1у

Т-Р

-Г.

3»г

Ьуз

Туг

Ьеи

Азг.

АЗП

Рго Рго

165

170

1 7 ,

С1у

Агд Уа1

Ьеи Зег 180

Ьеи ТЫ

Не ТЬг Ьеи ТЬг 185

Ьеи

С1у Тгр 190

Рго Ьеи

Туг

Ьеи

А1а

РЬе

Азп

Уа1

Зег

С1у

Агд

Рго

Туг

Азр

Агд

РЬе

А1а

Суз

195

200

205

Нхз

Туг

Азр

Рго

Туг

С1у

Рго

Не

Туг

Азп

Азп

Агд

С1и

Агд

Ьеи

С1п

210

215

220

Не

РЬе

Не

Зег

Азр

А1а

С1у

УиХ

Ьеи

(Му

Уа!

Суз

Туг

Ьеи

Ьеи

Туг

225

230

2 >5

240

Агд

Не

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С!у

Ьеи

А1и

Тгр

Ьеи

7.1 ί

Суз

Уа1

Туг

С!у

245

250

255

Уа1

Рго

Ьеи

Ьеи

Уи1

Уа1

Азп

(Пу

РЬе

Ьеи

V.. 1

Ьеи

Пе

ТЬг

туг

Ьеи

260

265

270

С1п

Нхз

ТЫ

Нхз

Рго

Зег

Ьеи

Рго

Нхз

Тут

Азр

Зег

ТЬг

С1и

Тгр

Азр

275

280

285

Тгр

Ьеи

Агд

С1у

А1а

Ьеи

А1а

ТЫ

Суз

Азр

Агд

Азр

Туг

С1у

Уа1

Ьеи

290

295

300

Азп

Ьуз

Уа1

РЬе

Нхз

Азп

Не

ТЬг

Азр

ТЫ

Ηί-8

Уа!

Уа1

Нхз

Нхз

Ьеи

305

310

315

320

РЬе

5ег

ТЬг

МеС

Рго

Нхз

Туг

Азп

А!а

Мес

С1и

А1а

ТЬг

Ьуз

А1а

Уа·

325

330

335

Ьуз

Рго

Ьеи

Ьеи

С1у

Азр

Туг

Тус

С1п

РЬе

Азр

С1у

ТЬг

Рго

Пе

Туг

340

345

350

Ьуз

С1и

Мес

Тгр

Агд

С1и

А!а

Ьуз

С1и

Суз

Ьеи

Туг

Уа!

С1и

. Ьуз

Азо

355

360

365

С1и

Зег

Зег

С1п

С1у

С1у

Уа!

РЬе

: ТГС

ΐ Туг

• —71

; Азг

1 Ьуз Ьес

370

375

3 8'

(2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ » 13:

ТЬг

Азп

А1а

Не

Ьуз

Рго

Не

Ьеи

О1у

С1и

Туг

Т'/₁

РЬе

Азр

Азр

340

345

350 (1)

ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) (B) (В) (Г)

ДЛИНА: 3Θ7 аминокислот

ТИП: аминокислота

КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ТЬг

Рго

РЬе

355

Туг

Ьуз

А1а

Ьеи

Тгр

Агд

А1.

Агд

С1,

Су:

Ье<

Туг

360

365 (И)

ТИП МОЛЕКУЛЫ : белок

Уа1 σι,

Рго

Авр

ТБ,

Зе

СЬ

Ьуз

С1у

Туг

Тгр

Τνι

Ага (νΐ)

ИСТОЧНИК ПРОИСХОЖДЕНИЯ:

(А) ОРГАНИЗМ: О1ус1пе шах

370 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

ПОСЛЕДОВ. * 13:

Ьуз

Туг

385

Меч

С1у Ьеи А1а Ьуз

С1>

ΤΗι

ТЬ:

МеС

С1у С1у

С1у

Агд ναΐ

А1.

(2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 1ЮСЛШК-ВАТМП,МОСТИ !Г 11:

(л)

Уа1

011

С1у

Ьуз

Ьуз

Рго

Зег

Агд

Уа1

Р1

ТЬ1

ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) (B) (В) (Г)

ДЛИНА: 387 аминокислот

ТИП: аминокислота

КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна

ТОПОЛОГИЯ: линейная

Ьуз

Рго Рго РЬе

ТЬг

Уа1

С1у

С1п

Ьуз

Ьуз

А1а

Не

Рго

Рго (И)

ТИП МОЛЕКУЛЫ белок (νί)

Суз

РЬе С1п Агд

Зег

Ьеи

Ье>

ТЬг

Зег

РЬе

Зег

Тут

Уа1

Уа1

Туг

Азр

ИСТОЧНИК ПРОИСХОЖДЕНИЯ:

(А) ОРГАНИЗМ: К1с1пия сопипипхз (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. * 14:

Ьеи

Зег РЬе А1а РЬе 11е РЬе

Туг 11е А1а ТЬг

ТЬг

Туг

РЬе

Нхз

Ье<

Мес

С1у О1у <31у С1у

Агд

Мес

Зег ТЬг Уа1

Не ТЬг Зе:

Азп Азп Зег

Ьеи

Рго <31п Рго РЬе 3βι

Ьеи 11е А1а Тгр Рго 11е Туг

Тгр Уа1

С1<

С1п

С1у Суз Ьеи Ьеи ТЬг С1у Уа1 Тгр Уа1 11е А1а Нхз

Ьуз Ьуз С1у С1у

Зег

Зег

Нх:

Ье1

100

105

110

Суз С1у

Ьуз

ТЬг Ьуз

Рго

Рго РЬе ТЬг Ьеи (Ну

Ьеи Суз Агд

С·/:

Нхз А1.

РЬе Зег Ьуз Туг С11

115

12:

РЬе

ν.4 1

Агд 5ег РЕ,

Асд '/а'.

Туг А;

Зег Рпе Зег

Не

ТЬг

туг

Ьеи

С1п

Н13

ТЬг

Нхз

Рго

А1а

Нс

Рго

Агд

Туг

С1у

Зег

275

280

285

Зег

С1и

Тгр

Азр

Тгр

Ьеи

Агд

С1у

А!а

Мес

Ча!

ТЬг

Ча1

Азр

Дгд

Азр

290

295

300

Туг

С1у

Ча!

Ьеи

Азп

Ьуз

Ча1

РЬе

Н13

Азп

Не

А!а

Азр

ТЬг

Ни

4.11

305

310

3 '.5

330

А1а

Н15

Нт

Ьеи

РЬе

А1а

ТЬг

Ча!

Рго

Н.и

Туг

Нгз

А!а

Мес

С1и

А.а

325

1 10

1 35

ТЫ

Ьуз

А1 а

Не

Ьуз

Рго

Не

Мес

С1у

С,!и

Туг

Туг

Лг,

Туг

Лар

С!·/

340

345

350

ТЬг

Рго

РЬе

Τ'/г

Ьуз

А1а

Ьеи

Тгр

Лгд

С1и

л;.1

Ьуз

С1и

Суз

Ьеи

РН.··

355

360

365

Ча1

С1и

Рго

Азр

С1и

С1у

А1а

Рго

ТЬг

С!п

С!у

Ча1

РЬе

Тгр

Туг

Агд

370

375

380

(Б) ТИП: нуклеиновая кислота (В) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИЛ МОЛЕКУЛЫ : олигонуклеотид (х!) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. * 18:

ТОСААТГССУ ΤΒΜΟΝΝΝΝΥΤ ЕСОЫКГВСС (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ Ж 19:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 1610 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота (B) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ТИП МОЛЕКУЛЫ : кДНК (νί) ИСТОЧНИК ПРОИСХОЖДЕНИЯ:

(А) ОРГАНИЗМ: БирЬогЫа 1адазсае

Аап Ьуз Туг

395 (хх) СВОЙСТВА:

(А) НАИМЕНОВАНИЕ/КЛЮЧ: СОЗ (Б) МЕСТОРАСПОЛОЖЕНИЕ: 8..1546 (х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. * 19:

(2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ * 15:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 6 аминокислот (Б) ТИП: аминокислота (B) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ТИП МОЛЕКУЛЫ : пептид (ν) ТИП ФРАГМЕНТА: внутренний (χι) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. № 15

Ηίδ (Ии Суз СМу Нй Нй

5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ » 16:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 5 аминокислот (Б) ТИП: аминокислота (B) количество ЦЕПЕЙ: одна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная

АСТААСА АТС ААС АСТ ААС САС ААС ААС ААС ААС ААС АСС СТТ ТСТ ААС

Мес Азп ТЬг Ьуз С1и Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Азп Агд Ча! Зег Азп

5 10

АТС ТСТ АТТ СТТ СТТ ТСС ТТС СТТ ТСС СТТ СТТ ССА СТТ ТТС СТТ СТТ

Мес Зег Не Ьеи Ьеи Суз РЬе Ьеи Суз Ьеи Ьеи Ргз Ча! РЬе Ьеи Ча!

9' (11) ТИП МОЛЕКУЛЫ : пептид (ν) ТИП ФРАГМЕНТА: внутренний (χι) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. » 16;

Нй Аг% Азп Нй Нй

5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ * 17 (1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 5 аминокислот (B) ТИП: аминокислота (В) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (И) ТИП МОЛЕКУЛЫ : пептид (V) ТИП ФРАГМЕНТА: внутренний (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. » 17

Нй Уа1 МеС Нй Ηίβ

5

25 30

ТСТ СТТ ТСТ АТТ

СТТ ТСТ ААС АСС СТТ ААС ССА ТСТ ААС ТСС ААС СТТ

Зег

Ьеи

Зег Не

Ьеи 35

Зег

Ьуз

Агд

Ьеи Ьуз Рго Зег Ьуз Тгр Ьуз Ьеи

40

45

ССА

ССА

ССА

ССА

ААС

АСТ

СТТ

ССА

АТТ

АТТ

ССА

ААС

СТТ

САА

САТ

САС

Рго

Рго

С!у

Рго

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Рго

Не

Не

С!у

Азп

Ьеи

С!п

Азр

С1и

50

55

60

лее

САА

САТ

ССА

САС

ССТ

ТСТ

СТТ

ТСТ

САА

ССА

СЛТ

лтт

ССТ

АСС

ССА

Агд

С!п

Азр

Рго

С1и

А1а

Зег

Ьеи

Зег

С!п

С1у

Не

А1л

Агд

С1у

65

70

75

ССА

СТТ

СТТ

САТ

ТСС

САС

ААС

СТТ

САС

ТСТ

ТТС

ССА

АСТ

САЛ

ССА

АСТ

ί'ΓΟ

4.11

Ча!

Суз

С. 1ч

Су-.

Ьггч

С1ч

Зег

РН·'

ТЫ

Ып

Рго

ТНг

90

95

90

АТТ

ААС

СТТ

ССА

САТ

ТАТ

САТ

ААС

ААС

ТСС

ССТ

СТТ

СТТ

СЛТ

ССА

ССТ

Не

Ьуз

Ча1

С1у

Ηίβ

Туг

Азр

Ьуз

АЗП

Суз

А1а

Ьеи

Ьеи

Н13

С1у

А1а

95

100

105

110

ОСА

САТ

САС

СТТ

СТТ

ССА

ААС

ССА

ТСТ

ССА

ССА

ААС

СЛТ

ССТ

ТСС

САТ

С1у

Азр

С1и

Ьеи

Ьеи

С1у

Ьуз

Рго

Зег

Рго

Рго

Азп

Азр

А1а

Тгр

А5р

115

120

125

АСТ

ССА

ССА

ТАТ

ССА

СТТ

САС

АСС

ТСТ

ААС

ААС

САС

АСС

тсс

ААС

САС

ТЬг

С!у

С1у

Туг

С1у

Ьеи

С1и

Агд

Зег

Ьуз

Азп

С1и

Агд

Тгр

Ьуз

С1и

130

135

140

ААС

САС

АСТ

ТСС

ТСТ

ССТ

ТТС

АСС

САА

ТАТ

АСС

АСТ

СТТ

АСС

ССТ

ТТС

Ьуз

С1и

ТЬг

Тгр

Зе г

А1а

РЬе

Агд

С1п

Туг

Агд

ТЫ

Ьеи

Агд

А1а

РЬе

145

150

155

ССА

АТС

ССА

ССА

АСС

ТСТ

ТТС

САС

СТТ

АТС

АСС

ТСС

САА

СЛС

ССТ

САТ

С1у

Мес

С1у

С1у

Агд

Зег

РЬе

С!и

Ьеи

Мес

Агд

Тгр

С1п

С1и

А1а

ΗΪ3

160

165

1Т-.

ТСС

СТТ

СТТ

СЛТ

ССА

СТТ

ТСТ

АСС

ААС

; ост

ТСТ

• ССР

. АС!

' САТ ССА

Суп

Ьеи

Ча!

Азр

С! у

Туг

7а 1

Зег

Агд

; А!а

. Зе:

С1/ ГН:

' А.ж

: Рго

-.7 г

130

195

190

145

395

433 еь (2)ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ » 18:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 29 пар оснований

529

АСТ ТЬг

ААС Ьуз

САТ Азр

СТТ

САС С1и 195

САТ Азр

ТСТ Зег

АСС Агд

ТТС РЬе

ААС Азп 200

АТТ Не

АТТ Не

АТС МеС

ССА С1у

ОСТ А1а 205

АСТ ТЫ

625

ТТС

ААС

САА

ССА

СТТ

САТ

ТАТ

ААС

АТТ

ААС

АСТ

ТТС

СТТ

СЛТ

АСС

САТ

673

РЬе

Азп

С1п

С1у

Ьеи

Азр

туг

Ьуз

Не

Ьуз

ТЬг

РЬе

Ьеи

Азр

Агд

Нхз

210

215

220

СЛС

АСС

АСС

ААС

ТТС

САА

ТТС

ААС

ААС

СТТ

САТ

ССТ

СТТ

ТАТ

СЛТ

СЛА

7 2;

СХи

Агд

Агд

Азп

РЬе

С1п

РЬе

Азп

Азп

УаХ

Азр

АХа

7Н

Туг

Низ

С1п

225

230

235

АТС

ААС

САТ

ССТ

САС

АСС

ССА

ТТС

СТТ

САТ

ТСТ

АСС

ССА

ТС..

СЛЛ

САТ

!->

Мес

Ьуз

Акр

А.1а

С1и

Агд

С1у

РЬе

ν,Η

лзр

Еег

Агд

си·

Аир

2 4 0

245

250

САС

ТТС

ССА

АТТ

ССТ

СТТ

САА

САА

ОТТ

СТТ

ССТ

САА

АТТ

СТТ

САТ

ААС

81’

С1и

РЬе

С1у

Не

А1а

Ьеи

С1п

С1П

Уа1

Уа1

А1а

С1п

Не

Ьеи

Азр

Ьуз

255

260

265

270

ССА

СТТ

САТ

САТ

САА

ААС

ССТ

СТТ

САС

АСС

ТСС

САА

ССА

АСС

САТ

ТСТ

865

РГО

Ьеи

Азр

Н1Э

С1п

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

Агд

Тгр

С1п

Рго

Агд

Азр

Зег

275

2Θ0

285

СТТ

ААС

САТ

ТТС

АТТ

ССА

ССТ

АСС

САТ

САТ

САС

АТС

СТТ

САА

АТТ

ААС

913

Ьеи

Азп

Нхз

РЬе

Не

С1у

А1а

Агд

Азр

Азр

С1и

Мес

Уа1

С1п

Не

Ьуз

290

295

300

ТАТ

САТ

ТТС

ТСС

ААС

-САТ

ССТ

СТТ

АСС

АТС

ТТС

САТ

АСТ

ССА

АТТ

СТТ

96 1

Туг

Азр

РЬе

Суз

Ьуз

Аар

А1а

Ьеи

Агд

Мес

РЬе

Азр

ТЬг

С1у

Не

Ьеи

305

310

315

ССТ

ССТ

САТ

СТТ

САА

ТСТ

ТСТ

АСТ

ТСТ

ТСТ

1 АТТ

АСС

, ТСС

; сас

; ССА

. АТТ

1009

А1а

А1а

Анр

• Ьеи

С1п

Зег

Зег

ТЬг

• Зег

Зег

• Не

Агд

> 01'.

: Ргс

> Не

320

325

3 3 С

СТТ

СТТ

’ АТС

СТТ САА

. ЗС1

' САС

; ст:

• ААС ССД

ι САС

; ат:

- тс-

3 САС

; ст?

105'

Уи 1

7и1

мес

Ьеи

ι С1Г

ι А1а С1л

> ν,»:

. Ьуз С1',

зи

ι 11-

2 Ь'2'1

335

340

345

НО

СТТ ОСТ АСС ТАСССАССТТ ТАССОТТТСТ СТСАСССТСТ СААТССТТСС 150й

Ьеи А1а Агд

ААТССССТТТ ТААТААТАГГ АТТА 1510 (2)ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ Я» 20:

(Ϊ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(A) ДЛИНА: 1698 пар оснований (Б) ТИП: нухлеиновая кислота (B) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: одна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная (И> ТИП МОЛЕКУЛЫ : ДНК (ίχ) СВОЙСТВА:

(A) НАИМЕНОВАНИЕ/КЛСЧ: С05 (B) МЕСТОРАСПОЛОЖЕНИЕ: 8..1504 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕДОВ. И> 20:

САСААСА АТС ССА

Мес А1а

СТС ТТТ СТА АТА

Ьеи РЬе Ьеи Не

САА ААС СТС ССС

С1п Азп Ьеи Рго

САА ТТС ССС АСС

С1п РЬе С1у ТЬг

СТА АТА ААС ТТС

Ьеи Не Ьуз РЬе

ССА ТСА ССА ССА

Рго Зег Рго Рго

АСС САА АТТ СТА

Агд С1и Не Ьеи

АСА ТТТ ТТА ААА

ТЬг РЬе Ьеи Ьуз

ТСТ ТТТ ССА АТС

Зег РЬе Рго Не

СТС ТСА СТС ТТТ

Уа1 Зег Ьеи РЬе

СТС ААА АСС ССС

Ьеи Ьуз ТЬг Рго

АСС ССС САТ СТС

ТЬг С1у Н13 Ьеи

9' ,5

САТ

АСС

СТТ

АТТ

ОСТ

АСС

САТ САЛ

АСС

ССА

ТСТ

АТС

ААО САТ

ААС АТС

1105

Азр

Агд

Уа1

Не

А1а

Агд

Нхз С1п

Агд

Рго

Зег

Мес

Ьуз Азр

Ьуз Мес

355

360

365

СТТ

ААС

АСС

ТАТ

АСТ

ССТ

ССТ СТТ

СТТ

ТСС

ОАО

СТТ

САТ АСС

ТАТ ССТ

1153

7а1

Ьуз

Агд

Туг

ТЬг

А1а

А1а Уа1

ν,Η

Суз

С1и

Ьеи

Азр Агд

Туг А1а

370

375

3 80

ААС

СТТ

СТТ

ССА

ТСТ

ТСТ

СТТ АСС

ТСС

СТТ

ССТ

ССТ

САТ САС

ТСС ААС

120 1

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Рго

Зег

Зег

Ьеи Лгд

Суз

Уа1

Л1а

А1а

Лир (Ии

Тгр Ьуз

3 В5

190

3 95

ТТС

АСС

САС

ТАТ

СТТ

АТТ

сел СТТ

ССЛ

АТС

лет

СТТ

ССА ААС

СТТ АЛО

1249

РЬ-

Агд

С1и

Туг

Ьеи

РГ.> 7.1

М'.Г

ТЬг

V.·!

:иу л..;.

ι,·.·.

4 00

405

4 1С

АСТ

АСТ

СТТ

АТС

СТТ

СЛТ

САЛ ЛАС.

САТ

ССЛ

СТТ

САТ

ССА САС

СТТ ТТС

1297

ТЫ

ТЫ

Уа1

Мес

Ьеи

Азр

С1п Ьуз

Азр

Рго

Уа1

Азр

Рго С1и

Ьеи РЬе

415

420

425

430

САТ

ССА

АТС

ТАТ

ССА

СТТ

САТ ОСТ

ело

СТТ

САТ

ТТС

САТ ААС

АСТ САТ

1345

Азр

С1у

Мес

Туг

С1у

Ьеи

Азр А1а

С1и

Уа1

Н15

РЬе

Азр Ьуз

ТЬг Азр

435

440

445

АСС

ТТС

АТС

ССА

ССА

ТТС

ТСТ ССТ

СОО

дос

АТТ

ССС

ТСС ССТ

ССЛ САА

1393

Агд

РЬе

Мес

Рго

Рго

РЬе

Зег А1а

С1у

Агд

11е

А1а

Суз АХа

С1у С1п

450

455

460

СТТ

СТТ

ОСТ

ССТ

ТАТ

ОАО

СТТ ТТС

СТТ

ТТС

ТТС

ТСС

АСТ АТТ

ССТ САТ

1441

Ьеи

Ьеи

А1а

А1а

Туг

О1и

Ьеи РЬе

Ьеи

РЬе

РЬе

Тгр

ТЫ Не

А1а Азр

465

470

475

СТТ

ТТС

САА

АТТ

ТТС

ТСТ

СТТ ССТ

САА

ТТС

ААС

САС

ССА САТ

ТСС АСТ

1489

7а1

РЬе

О1п

. Не

РЬе

Зег

Ьеи Л1а

О1п

РЬе

Ьуз

О1и

С1у Нхз

С-/3 ТЬг

400

495

490

ССТ

СТТ

АСТ

СТТ

' АТТ

АТТ

' СЛТ ТСС

' СТТ

• ССТ

СТТ

1 АСС

1 ТАТ САТ

' СТТ тсс

'53 7

ли

7а1

ТЬг

Ьеи

. Не

Азе Су::

. ь-щ

. А1а

, Уа1

Агг

1 ~7Г Азр

САТ СТС Нхз Ьеи

ААС ТАС

Ьуз Туг

СТС АТС

Уа1 Не

ВО

АТС АТТ

Не Не

ТАС ААТ

Туг АЗП

САТ СТС

ΗΪ5 Ьеи

ССС АТС

А1а Мес

СТА ААА

ССС САС

01у Азр

ТСС ТСТ

Зег Зег

ТТС ССТ

РЬе А1а

АСА СТТ

ТЬг 7а1

160

ТСС ААА

Зег Ьуз

175

ТСС АСС

Зег ТЬг

ССА ССА

130

ТТТ тсс

РЬе Зег

145

СТТ ССА

Уа1 Рго

СТС АТС

САА ССА

О1п Рго

АТС ТТА Не Ьеи

СТС ССС

Ьеи Рго

ААС ССС

Азп Агд

100

АСС АТС

ТЬг Мее

1X5

СТС АСА Ьеи ТЬг

АТС САС

Не Н1з

ТТС СТС

РЬе Ьеи

ССС СТА

А1а Уа1

АСА АСТ

Агд ТЬг

ССА ТТС

Агд РЬе

САА САА

С1п С1и

ССА АСА

Рго ТЬг

ССА ТТС

С1у РЬе

АСА АТТ

ТЬг Не

ССС ТТС

С1у РЬе

ССА ААТ

С1у Азп

САС СТТ

01и Ьеи гео

АТТ СТС

Не Ьеи

ССС ССС

Агд А1а

150

ССС САТ

Агд Азр

165

АСА СТС

ТЬг Ьеи

ССС ТСС

А1а Зег

120

САС СТС

С1и Ьеи

135

САТ САА

Азр С1и

ТСС ССА

Зег С1у

ААТ ААС

Азп Азп

СТС САС

Ьеи Нкз ССА АСА

С1у ТЬг

ТСТ ТТС

Суз РЬе

ССС ССС

А1.1 С1у

105

ТАТ ССС

Туг С1у

ТТС ТСТ

РЬе Зег

АСТ АСА

Зег ТЬг

ААС АТА

Ьуз Не

170

АТА АТС

Не мег

185

САА АТС

01п Не

ССА ААА

АСТ АТА

ТЬг Не

ААС САС

Ьу:: Нхз

ССС АСС

А1а ТЬг

СТС СТА

1/а1 Ьеи

ААС САС

Лап Азр

СТС АЛТ

Ьеи Л.;;>

САТ САС Азр Нхз

ОСА ААТ

А1а Азп

110

ССТ ТТТ

А1а РЬе

155

СТА АСТ

7а1 ТЬг

АСА АТС

Агд Мес

ТСС ССТ

Тгр Агд

125

СОТ СТТ

Агд Уа1

ТАТ САА

Туг С1п

ТТС АСА

Ьеи ТЬг

ССТ ссс

А1а А1а

ССД. ААА ССС ТТТ ТАС ССС ААА САА СТ ААС САТ ОДА САА ССТ ЗА ТТС

С1у Ьуз Агд РЬе Туг О1у Ьуз С1и 7.11 Ь/з Азр С1и Схи С1у С1и П-.

193 :99 ,33

52’

577

4Т 500 508 51

ТТС САС САТ СТТ АТС ААС ААА АТС САС ССС СТС ССС ССС ДАТ ТСА АСС673

Ьеи С1п Азр Ьеи МеС Ьуз Ьуз Мес С1и А1а Ьеи Агд С1у Азп 5ег ТЬг

210 215220

СТС ААА ССА САТ ТАТ ТТТ ССА СТА ТТС САС ТСС АТТ САТ ТАТ САС ССА721

Уа1 Ьуз Агд

Лар

Туг РЬе Рго Уа1 Ьеи С1п Тгр 11е Азр Туг С1п С1у

225

230

235

СТА

ААС

ААС

ААС

АТС

АСС

ААС

СТС

АТС

ААС

ААА

АТС

САС

ССС

ТТС

ТТС

767

Уа1

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Мес

Агд

Азп

Ьеи

МеЬ

Ьуз

Ьуз

Мес

Азр

С1у

РЬе

Ьеи

240

245

250

САА

ДАТ

СТС

А.'Т

САГ

САС

ССА

АаС

АСС

АСС

ТТС

ТСС

АТС

ААТ

САА

817

С1п

Азп

Ьеи

Не

Аир

С1и

Нги

Агд

Аоп

ТЬг

ТЬг

Ьеи

Тгр

Не

Азп

С1п

255

2оО

2Ь5

270

СТТ

ССА

ССА

АСТ

ССС

АСА

ААА

АСА

ССА

АСТ

ТСС

АСА

СТС

СТА

САТ

СТТ

Θ65

Уа1

Агд

А1а

ТЬг

Агд

ТЬг

Ьуз

Агд

С1у

ТЬг

Тгр

ТЬг

Ьеи

Уа1

Азр

ν*ι

275

280

285

АТС

ТТС

ААТ

СТТ

ААА

ААС

АСА

САА

ССТ

САС

ТТС

ТАС

АСТ

САТ

СТА

АСТ

913

ес

Ьеи

Азп

Ьеи

Ьуз

Ьуз

ТЬг

С1п

Рго

Азр

РЬе

Туг

ТЬг

Азр

Ьеи

ТЬг

290

295

эоо

АТС

ААА

ССТ

СТС

АТТ

САС

АСА

АСА

СТС

АСТ

ССА

ССА

ТСТ

САА

АСС

ТСА

961

Не

Ьуз

С1у

Уа1

Не

С1п

ТЬг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

А1а

С1у

Зег

С1п

ТЬг

Зег

305

310

315

ССА СТТ АСА СТА САА ТСС ССС СТС ТСА СТТ СТТ СТС ААС САТ ССТ САА1009

А1а Уа1 ТЬг Ьеи С1и Тгр А1а Ьеи Зег Ьеи Ьеи Ьеи Азп Н13 Рго С1п

320 325330

СТА АТС САС ААА ССТ ТАТ ССС САА АТА САС ССС АТТ СТС ССС АСС ААС1057 νβί Ме-. Н1з Ьуз А1а Туг А1а С1и Не С1и А1а 1л Уа1 С1у ТЬгАзп

335 340 34535С

ССС ТТА ТТЛ ААС САА ССС САС ТТА ССА САТ СТА АСС ТАТ ТТЛ САА ААС1105

Агд Ьеи Ьеи Азг. С1и А1а Азр Ьеи Рго Нхз Ьеи Зег Тус Ьеи С1пАзг.

355 360 353

АТА Не

АТС Не

АСС ТЬг

САС АСА ТТГ ССА СТС

ТТС ССА ССА СТА ССА СТТ ТТА СТА

1153

С1и 370

ТЬг

РЬе

Агд Ьеи

375

Рго Уа1

Рго

380

Ьеи Ьеи

ССС

САТ

ААА

ТСА

ТСА

ССА

САТ

ТСС

АТА

СТТ

ТСС

ССС

ТТГ

САС

АТА

ССА

1201

Рго

Н13

Ьуз

Зег

Зег

А1а

Азр

Суз

Не

Уа1

Зег

С1у

РЬе

И13

Не

Рго

385

390

395

ССС

ССС

АСА

АТС

ТТС

СТА

СТС

ААС

АСА

ТСС

АСС

АТС

ААТ

АСА

АЛТ

ССА

12·

Агд

С1у

ТЬг

Мес

Ьеи

Ьеи

να!

Азп

ТЬг

Тгр

Зег

Ме-

Азп

Агд

Азп

Рго

400

405

4 Ю

АСА ТТА

ТСС ААС САЛ ССА САС

АЛА ТТС

АТА ССА САА

АСЛ ТТТ САА

ССА 1297 С1у 430

415

Ьеи

Тгр

Ьуз С1и

Рго 420

С1и

Ьуз

РЬе

Не

Рго 425

С1и

Агд

РЬе

С1и

ССА

САА

ААТ

АСТ

САА

ССС

ТСТ

ААС

ТАТ

ААА

ТТС

СТТ

ССТ

ТТС

ССТ

ССА

1)4 5

С1у

С1и

АЗП

ТЬг

С14

С1у

Суз

Азп

Туг

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Рго

РЬе

С1у

А1а

435

440

445

ССА

АСС

ССС

ССТ

ТСТ

ССС

ССС

ССС

ССТ

СТС

ССС

ААА

ССА

АТС

СТА

ОСА

1393

С1у

Агд

Агд

А1а

Суз

Рго

С1у

А1а

С1у

Уа1

А1а

Ьуз

Агд

Γ·ζ

Уа1

С1у

450

455

460

СТС

АСТ

ТТА

ССТ

ССА

ТТС

АТТ

САС

ТСТ

ТТТ

САС

ТСС

САА

АСА

АТТ

ССС

1441

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1у

А1а

Ьеи

Не

С1п

Суз

РЬе

С1и

Тгр

С1и

Агд

Не

С1у

465

470

4 5

САА

САА

САА

АТА

САТ

ТТС

АСТ

САА

ССА

АСА

ССТ

СТТ

АСТ

АТС

ССА

ААА

1489

С1и

С1и

С1и

Не

Азр

Ьеи

Зег

С1и

С1у

ТЬг

С1у

Ьеи

ТЬг

МеС

Рго

Ьуз

480

485

. 490

САТ ТТС СТТ ТСС ААС ТААТАТССАА АССТССССАА ААСАТСАТТА АСТТТСТТТС1544

Азр РЬе Ьеи Тгр Ьуз

495

ТАСАТТСТТА ТААААССТСС СТТТСТТТСС АССТСССААС ССТААТТСАА АТАТСССАТТ1604

ТТТТСССТСС ААСССАССТС СТААССАААТ АТСАСТСТТТ СТСАТТАТТС СТТЛТАТААА1664

АССТТАААОС АСТАТТТССС ТССТАААААА ААЛА1698

Claims (53)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Сгерк ра1аейта со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо: 2;

   (б) нуклеотидной последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо: 1 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и (в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б).
2. 2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Сгерк §р., за исключением Сгерк ра1ае§бпа, со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо: 4;

   (б) нуклеотидной последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо: 3 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и (в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б).
3. 3. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Уетоша да1атеп§к со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ Ыо: 6;

   (б) нуклеотидной последовательности БЕЦ ΙΌ Ыо: 5 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и (в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б).
4. 4. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3, где углеродная связь представляет собой двойную связь в молекуле ненасыщенной жирной кислоты.
5. 5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-4, где полипептид монооксигеназы представляет собой Δ6эпоксигеназный фермент, Δ9-эпоксигеназный фермент, Δ12-эпоксигеназный фермент или Δ15-эпоксигеназный фермент.
6. 6. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.5, где полипептид монооксигеназы представляет собой Δ12-эпоксигеназный фермент.
7. 7. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где Сгерй §р. является растением, продуцирующим высокие уровни верноловой кислоты.
8. 8. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где Сгерй §р. выбрано из группы, состоящей из СгерЦ Ыеппй, Сгерй аигеа, Сгерй сопухаеГоНа, Сгерй ш1егтеб1а, Сгерй осабеп!а118, С’герй уеысапа и Сгерй хасйиНа.
9. 9. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, имеющая нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ №: 1 или комплементарную ей последовательность.
10. 10. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, имеющая нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ №: 3 или комплементарную ей последовательность.
11. 11. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.3, имеющая нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ №: 5 или комплементарную ей последовательность.
12. 12. Генетическая конструкция, включающая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.1, которая кодирует полипептид монооксигеназы Сгерй ра1аеШпа со смешанными функциями, или ее часть, которая кодирует ферментативно активную часть указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в смысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции ш у1уо существующего в природе гена монооксигеназы.
13. 13. Генетическая конструкция, включающая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.2, которая кодирует полипептид монооксигеназы Сгерй §р., за исключением Сгерй ра1аеШпа, со смешанными функциями, или ее часть, которая кодирует ферментативно активную часть указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в смысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции ίπ у1уо существующего в природе гена монооксигеназы.
14. 14. Генетическая конструкция, включающая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.3, которая кодирует полипептид монооксигеназы Уетоша да1атепШ со смешанными функциями, или ее часть, которая кодирует ферментативно активную часть указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в смысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции ш у1уо существующего в природе гена монооксигеназы.
15. 15. Генетическая конструкция, включающая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.1, которая кодирует полипептид монооксигеназы Сгерй ра1аеШпа со смешанными функциями, или ее часть, которая способна модифицировать экспрессию указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в антисмысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции 1п у1уо существующего в природе гена монооксигеназы.
16. 16. Генетическая конструкция, включающая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.2, которая кодирует полипептид монооксигеназы Сгерй §р., за исключением Сгерй ра1аеШпа, со смешанными функциями, или ее часть, которая способна модифицировать экспрессию указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в антисмысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции 1п у1уо существующего в природе гена монооксигеназы.
17. 17. Генетическая конструкция, включающая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.3, которая кодирует полипептид монооксигеназы Уетоша да1атепШ со смешанными функциями, или ее часть, которая способна модифицировать экспрессию указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в антисмысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции 1п у1уо существующего в природе гена монооксигеназы.
18. 18. Способ уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, в клетке или в микроорганизме, включающий введение генетической конструкции по любому из пп.12-17 в клетку или в микроорганизм и инкубацию указанной клетки или микроорганизма в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для осуществления экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы, в указанной генетической конструкции.
19. 19. Способ по п.18, в котором стадия введения генетической конструкции включает стабильную трансформацию клетки или микроорганизма генетической конструкцией.
20. 20. Способ получения рекомбинатного ферментативно активного полипептида монооксигеназы со смешанными функциями в клетке, включающий культивирование клетки, содержащей генетическую конструкцию по любому из пп.12-17, в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы, в указанной генетической конструкции.
21. 21. Способ по п.20, включающий стадию введения генетической конструкции в клетку перед культивированием клетки.
22. 22. Способ получения рекомбинатного ферментативно активного полипептида монооксигеназы со смешанными функциями в трансгенном растении, включающий следующие стадии:

    (а) введение генетической конструкции по любому из пп.12-17 в клетку или ткань растения;

    (б) регенерацию трансформированного растения из указанной клетки или ткани; и (в) отбор трансформированного растения с высоким уровнем экспрессии в семенах ферментативно активного полипептида монооксигеназы, кодируемого указанной генетической конструкцией.
23. 23. Способ по п.22, где растение представляет собой растение с масличными семенами с высоким уровнем продуцирования линолевой кислоты.
24. 24. Способ по п.22 или 23, где растение выбирают из группы, состоящей из льна, в том числе льна обыкновенного, масличного рапса, подсолнечника, сафлоры, сои, кунжута, семян хлопчатника, арахиса, маслины европейской и масличной пальмы.
25. 25. Способ по п.24, где растение льна имеет низкое содержание линоленовой кислоты.
26. 26. Рекомбинантный полипептид монооксигеназы Сгер18 ра1ае81ша со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранный из группы, состоящей из (а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ Νο: 2; и (б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8 Ер ΙΌ Νο: 1 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода.
27. 27. Рекомбинантный полипептид монооксигеназы Сгер18 8р., за исключением Сгер18 ра1ае8бпа, со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранный из группы, состоящей из (а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ Νο: 4; и (б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8Ер ΙΌ Νο: 3 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода.
28. 28. Рекомбинантный полипептид монооксигеназы Уептоша да1атеп818 со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранный из группы, состоящей из (а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность 8Ер ΙΌ Νο: 6; и (б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8Ер ΙΌ Νο: 5 или или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода.
29. 29. Рекомбинантный полипептид по п.26, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ Νο: 2.
30. 30. Рекомбинантный полипептид по п.27, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ Νο: 4.
31. 31. Рекомбинантный полипептид по п.28, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ Νο: 6.
32. 32. Способ изменения внутриклеточного содержания эпоксигенизированной жирной кислоты, включающий культивирование клетки, содержащей генетическую конструкцию по любому из пп.12-17, в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, в указанной генетической конструкции, и последующее инкубирование указанной клетки с жирно-кислотным субстратом в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для того, чтобы по меньшей мере одна углеродная связь указанного субстрата была преобразована в эпоксигруппу.
33. 33. Способ по п.32, где жирно-кислотный субстрат представляет собой ненасыщенную жирную кислоту, а углеродная связь указанного субстрата, которая преобразуется в эпоксигруппу, представляет собой углеродную двойную связь.
34. 34. Способ по п.32 или 33, где жирнокислотный субстрат выбран из группы, состоящей из пальмитолеиновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, линоленовой кислоты, 9,15-октадекадиеновой кислоты и арахидоновой кислоты.
35. 35. Способ по любому из пп.32-34, где углеродная связь, которая преобразуется в эпоксигруппу, представляет собой Δ6-углеродную связь, или Δ9-углеродную связь, или Δ12углеродную связь, или Δ 15-углеродную связь.
36. 36. Способ по п.35, где указанная углеродная связь представляет собой Δ^-углеродную связь.
37. 37. Способ по любому из пп.32-36, согласно которому изменяют внутриклеточное содержание верноловой кислоты.
38. 38. Способ по любому из пп.32-37, где указанная клетка относится к клетке бактерий, дрожжей, грибов, плесневых грибов, насекомых, растений, птиц или млекопитающих.
39. 39. Способ по п.38, где указанная клетка относится к клетке дрожжей, растений, грибов или плесневых грибов.
40. 40. Способ по п.39, где дрожжи, растения, грибы или плесневые грибы представляют собой жирообразующие дрожжи, растения, грибы или плесневые грибы.
41. 41. Способ по п.38, где указанная клетка относится к клетке растения с масличными семенами, в норме не экспрессирующего полипептид монооксигеназы на высоком уровне.
42. 42. Способ по п.41, где растение с масличными семенами выбирают из группы, состоящей из льна, в том числе льна обыкновенного, масличного рапса, подсолнечника, сафлоры, сои, кунжута, семян хлопчатника, арахиса, маслины европейской и масличной пальмы.
43. 43. Способ по п.42, где растение льна имеет низкое содержание линоленовой кислоты.
44. 44. Растение, трансформированное выделенной молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-11.
45. 45. Семя, происходящее из растения по п.44, где указанное семя содержит указанную молекулу нуклеиновой кислоты.
46. 46. Потомство растения по п.44, где указанное потомство содержит указанную молекулу нуклеиновой кислоты.
47. 47. Растение, имеющее измененное содержание эпоксигенизированных жирных кислот, обусловленное введенной в его геном генетической конструкции по любому из пп.12-17.
48. 48. Семя, происходящее от растения по п.47, где указанное семя содержит указанную генетическую конструкцию.
49. 49. Потомство растения по п.47, где указанное потомство содержит указанную генетическую конструкцию.
50. 50. Растение по п.44 или 47, являющееся растением с масличными семенами, выбранным из группы, состоящей из льна, в том числе льна обыкновенного, масличного рапса, подсолнечника, сафлоры, сои, кунжута, семян хлопчатника, арахиса, маслины европейской и масличной пальмы.
51. 51. Растение по п.50, где растение льна имеет низкое содержание линоленовой кислоты.
52. 52. Растение по п.44 или 47, являющееся АгаЫборДк НаПапа.
53. 53. Растение по п.44 или 47, являющееся Ьтит икйаШытит.