EA002180B1 - Молекулы днк межгенных участков вируса верхушки грозди бананов, способ экспрессии гена в растительной клетке с помощью указанных молекул днк и линия трансформированных растительных клеток, содержащая такие молекулы днк - Google Patents
Молекулы днк межгенных участков вируса верхушки грозди бананов, способ экспрессии гена в растительной клетке с помощью указанных молекул днк и линия трансформированных растительных клеток, содержащая такие молекулы днк Download PDFInfo
- Publication number
- EA002180B1 EA002180B1 EA199700438A EA199700438A EA002180B1 EA 002180 B1 EA002180 B1 EA 002180B1 EA 199700438 A EA199700438 A EA 199700438A EA 199700438 A EA199700438 A EA 199700438A EA 002180 B1 EA002180 B1 EA 002180B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- sequence
- gene
- dna molecule
- component
- promoter
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 title description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 102
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 93
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 88
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 46
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 claims description 13
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 claims 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 18
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 18
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 abstract description 2
- 241000725138 Banana bunchy top virus Species 0.000 abstract 20
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 54
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 244000291473 Musa acuminata Species 0.000 description 29
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 26
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 235000021015 bananas Nutrition 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 15
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 13
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 13
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 12
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 12
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 11
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 11
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 11
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 11
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 11
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 11
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 241000219130 Cucurbita pepo subsp. pepo Species 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 235000003954 Cucurbita pepo var melopepo Nutrition 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 4
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 4
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 4
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 3
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940027257 timentin Drugs 0.000 description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101710081048 Endonuclease III Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000825469 Haemulon vittatum Species 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 101100049052 Homo sapiens VASH1 gene Chemical group 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 102100021163 Tubulinyl-Tyr carboxypeptidase 1 Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGOMELGTKOLYEZ-UHFFFAOYSA-K 2-[4-[[4,6-bis[4-[2-(trimethylazaniumyl)ethoxycarbonyl]phenoxy]-1,3,5-triazin-2-yl]oxy]benzoyl]oxyethyl-trimethylazanium triiodide Chemical compound [I-].[I-].[I-].C[N+](C)(C)CCOC(=O)c1ccc(Oc2nc(Oc3ccc(cc3)C(=O)OCC[N+](C)(C)C)nc(Oc3ccc(cc3)C(=O)OCC[N+](C)(C)C)n2)cc1 SGOMELGTKOLYEZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 240000001829 Catharanthus roseus Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000702463 Geminiviridae Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000709757 Luteovirus Species 0.000 description 1
- 241000724202 Maize stripe tenuivirus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 241001482576 Saiga Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- OWOXNHSVILPOPC-UHFFFAOYSA-N TCA 1b Natural products CC(CO)CCCC(C)C1=CCC2(C)OC3=C(CC12)C(=O)C(O)CC3 OWOXNHSVILPOPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000019011 Tasa Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 101150064974 ass1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000011436 cob Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052602 gypsum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010440 gypsum Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 1
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 108010062982 histone DNA binding protein-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 238000004900 laundering Methods 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000051 modifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- XBGNERSKEKDZDS-UHFFFAOYSA-N n-[2-(dimethylamino)ethyl]acridine-4-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2N=C3C(C(=O)NCCN(C)C)=CC=CC3=CC2=C1 XBGNERSKEKDZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 229940048730 senega Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Storage Of Fruits Or Vegetables (AREA)
- Preparation Of Fruits And Vegetables (AREA)
Abstract
Описаны молекулы ДНК, способные к осуществлению транскрипции гена вируса верхушки грозди бананов не (BBTV).
Description
Изобретение относится к последовательностям ДНК вируса верхушки грозди бананов (ВВТУ) и, в частности, к межгенным участкам компонентов 1-6.
Предшествующий уровень техники
Заболевание верхушки грозди бананов (ВВТУ) является наиболее важным вирусным заболеванием бананов (Оа1с. 1987, Абуапсек ίη νίπ.15 Кекеагсй 33 301-325). Оно широко распространено в Азии и странах Южной части Тихого океана и имеет ограниченное распространение в Австралии и Африке. Не сообщалось о случаях заболевания в Америке. Первоначально считалось, что заболевание вызывается лютеовирусом и передаётся тлями, но не механическим путём, причём вирус инфицирует растения с повреждённой флоэмой и вызывает их пожелтение. Однако недавно из ткани инфицированных растений были выделены и очищены изометрические вирусоподобные частицы (УЪРк) размером 18-20 нм и было показано, что они ассоциированы с заболеванием (Нагбшд е1 а1., 1991, 1оигпа1 о! Оепега1 Упо1оду 72 225-230; Тйошак & О|е1хдеп. 1991, 1оигпа1 о! Оепега1 Упо1оду 72 217-224; \Уи апб 8и, 1990 1оигпа1 о! Рйу!ора1йо1оду 128 153-160). Нагбшд е1 а1 (Нагбшд е1 а1., 1991, 1оигпа1 о! Оепега1 Упо1оду 72 225-230; Нагбшд е1 а1, 1993 1оигпа1 о! Оепега1 У1го1оду 74 323-328), изолировали кольцевую одноцепочечную ДНК (55 ДНК) размером около 1 кЬ из указанных частиц, а затем клонировали и секвенировали её. Указанная 55ДНК, называемая ДНКкомпонентом 1 ВВТУ, имеет одну большую открытую рамку считывания (ОКЕ) в смысловой цепи и предпочтительно кодирует репликазу. Указанный компонент передаётся тлями переносчиками заболевания.
В работе Вшге е1 а1., 194 Агсй У1го1. 137 371-380, сообщается о клонировании и секвенировании второго компонента ВВТУ. Исследователи обнаружили, что между двумя геномными компонентами 55ДНК ВВТУ находится строго консервативная последовательность из 93 нуклеотидов. На основе указанной последовательности были сконструированы два внешних удлиняющих вырожденных праймера, которые использовались в полимеразной цепной реакции (РСК) с ДНК, экстрагированной из очищенных варионов ВВТУ. Продукты РСК-амплификации соответствовали, по крайней мере, семи отдельным полосам размером около 1 кЬ каждая и возможно подтверждали выделение полноразмерной 65ДНК ВВТУ. Продукты РСКамплификации клонировали и полученные клоны исследовали с помощью анализа рестрикционными ферментами. В результате по характеру рестрикции было идентифицировано четыре отдельные группы клонов. В указанной работе утверждается, что геном ВВТУ содержит, по крайней мере, четыре компонента и ВВТУ принадлежит к ранее неописанной группе вирусов растений, которая может также включать вирус скрытой низкорослости гвоздики.
В работе Кагап е1 а1., 1994 1оигпа1 о! Оепега1 У1го1оду 75 3541-3546, приведены результаты клонирования и последующего сравнения упорядоченных последовательностей компонента 1 ВВТУ, выделенного из вирусных изолятов, полученных в 10 различных странах. В результате было идентифицировано две группы: группа стран Южной части Тихого океана (изоляты из Австралии, Бурунди, Египта, Фиджи, Индии, Тонга и Западного Самоа), и Азиатская группа (изоляты из Филиппин, Тайваня и Вьетнама). Средняя величина различия последовательностей в пределах каждой группы составляет 1,93,0%, а между изолятами двух групп около 10%, однако, некоторые участки последовательностей различались в большей степени, чем другие. Тем не менее белки, кодируемые большими открытыми рамками считывания, различались примерно на 5%. Участок от начала стержневой петлевой последовательности до возможного ТАТА-бокса был идентичным у всех изолятов, за исключением двух нуклеотидных замен в изоляте Западного Самоа и одной нуклеотидной замены в изоляте N8^. Приведённые результаты вместе с другими свидетельствами позволяют предположить, что ВВТУ заражает бананы после того, как они начинают поступать из Азиатско-Тихоокеанского региона в Африку и Америку.
В работе Х1е е1 а1., 1995, РЬу!ора1йо1оду 85 339-347, описано получение очищенного Гавайского изолята ВВТУ из инфицированной культуры бананов Вильямса. Были секвенированы и клонированы три одноцепочечных компонента ДНК (55ДНК), обозначенные 1, 3 и 4 соответственно. Компонент 1 имеет 1110 нуклеотидов в длину и обнаруживает 96% идентичности нуклеотидной последовательности с ДНКкомпонентом 1 ВВТУ Австралийского изолята, описанного Нагбшд е1 а1. (1993), см. выше. Указанный компонент содержит две открытых рамки считывания (ОКЕ), кодирующих белок мол. массы около 33,5 кДа, который может функционировать как репликаза, и белок с мол. массой около 15,2 кДа с неизвестными функциями. Компонент 3 имеет 1057 нуклеотидов в длину и не содержит каких-либо открытых рамок считывания, кодирующих продукт мол. массой более чем 10 кДа. Компонент 4 имеет 1017 нуклеотидов в длину и возможно кодирует белок с мол. массой 18,9 кДа. Все три компонента 55ДНК имеют одинаковую стержневую последовательность и консервативную некодирующую область. Последовательность каждого изо всех трёх указанных компонентов отличается от таковой ДНК-компонентов ВВТУ двух Тайваньских изолятов. ВВТУ-специфические клоны используют для дот-блот-гибридизации с целью выявления ВВТУ в тканях растений с помощью радиоактивно-меченных и немеченных проб.
Для выявления ВВТУ в образцах бананов и отдельных тлях используют полимеразную цепную реакцию (РСВ). Дот-блот-гибридизация чувствительна в той же степени, что и твёрдофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А), в то время, как РСВ в 1000 раз чувствительнее, чем дот-блот-анализ и ЕЬ18А, при выявлении ВВТУ в бананах.
Так называемые межгенные участки геномных компонентов 1, 3 и 4 описаны Натбтд е! а1., 1993, см. выше, и Х1е апб Ни, 1995, см. выше. Однако известна только одна особенность таких межгенных участков, а именно наличие стержневой петлевой структуры в компоненте 1, описанной Натбшд е! а1., 1993, см. выше.
В ранее поданной заявке (РСТ/Аи 95/00311) имеется ссылка на компоненты 3, 4 и 6 ВВТУ, которые заявлены в формуле рег зе. Участки за пределами ОВЕ (так называемые межгенные участки) также описаны в указанной более ранней заявке. Геномные компоненты 1, 3 и 4, охарактеризованные Х1е апб Ни, 1995, см. выше, соответствуют компонентам 1, 2 и 5, описанным в указанной более ранней заявке РСТ/АИ 95/00311.
Краткое описание изобретения
Неожиданно было обнаружено, что межгенные участки геномных компонентов 1-6 ВВТУ или их фрагменты содержат последовательности, способные промотировать, усиливать, регулировать или модифицировать транскрипцию генов не ВВТУ.
Под межгенным участком в настоящем описании подразумеваются некодирующий участок компонента ВВТУ или участок, находящийся за пределами ОВЕ компонента ВВТУ.
Изобретение, таким образом, относится к указанным выше последовательностям, которые используются для промотирования, усиления, регуляции или модификации транскрипции генов не ВВТУ.
Последовательность ДНК-молекулы может быть по существу идентичной или комплементарной частичному фрагменту межгенного участка компонентов 1-6 ВВТУ. Понятие по существу комплементарная или идентичная относится к последовательностям, различающимся на величину до 20% (то есть комплементарная, по меньшей мере, на 80%). Степень различия может быть определена стандартными методами гибридизации или сравнением последовательностей. Величина вариабельности, составляющая 20%, показана для участков, находящихся за пределами ОВЕ компонента 1 у двух различных географических изолятов (Кагап е! а1., 1994, 1оитпа1 οί Оепета1 У1то1о§у, 75, 5341-3546; заявка на патент США №08/202 1986). Оба источника информации приведены здесь в качестве ссылки для подтверждения заявленных данных о 20%ной вариабельности всех компонентов ВВТУ. Вариабельность, установленная для компонента различных географических изолятов, соответствует вариабельности между отдельными компонентами различных географических изолятов. Таким образом, величина вариабельности, достигающая 20%, относится к последовательностям компонентов 2-6, как указано ниже.
Понятие происходящая относится к любой последовательности, которая получена в результате замещений, изменений или модификаций фрагмента межгенного участка ВВТУкомпонента каким-либо методом, в том числе мутагенезом.
В частности, последовательность ДНКмолекулы может представлять собой вставку рВТ6.1 межгенного участка ВВТУ-компонента 6 (фрагмент размером около 623 пар оснований), вставку рВТ6. 2 (фрагмент размером около 351 пары оснований), вставку рВТ6.3 (фрагмент размером около 239 пар оснований) и вставку рВТ6.4 (фрагмент размером около 172 пары оснований) компонента 6; вставку рВТ1.1 (фрагмент размером около 214 пар оснований) и рВТЕГЫТ (фрагмент размером около 980 пар оснований) компонента 1; вставку рВТ2.1 (фрагмент размером около 855 пар оснований) компонента 2; вставку рВТ3.1 (фрагмент размером около 526 пар оснований) компонента 3; вставку рВТ4.1 (фрагмент размером около 659 пар оснований) компонента 4 и вставку рВТ5.1 (фрагмент размером около 454 пар оснований) компонента 5. ДНК-молекула может представлять собой участок размером 275 пар оснований, включающий СВ-М, содержащийся во вставке рВТ6.1, но не во вставке рВТ6.2. Участок размером 275 пар оснований может быть регуляторной областью. ДНК-молекула может содержать участок, включающий область СВ8Ь и кодон АТС открытой рамки считывания, или участок, расположенный между областью СВ8Ь и кодоном АТС открытой рамки считывания какого-либо из компонентов 1-6 ВВТУ. Вставки рВТ1.1, рВТ2.1, рВТ3.1, рВТ4.1, рВТ5.1, рВТ6.1 показаны на рис. 11. На рис. 12 приведена последовательность вставки рВТ1.ЮТ. На рис. 13 приведена ДНК-последовательность вставок (а) рВТ6. 1; (Ь) рВТ6. 2; (с) рВТ6. 3 и (б) рВТ6. 4.
Ген не ВВТУ может быть любым подходящим геном, таким как ОИ8, ИРТП, геном устойчивости к инсектициду, гербициду или геном, усиливающим рост.
ДНК-молекула может транскрибировать ген в каком-либо подходящем прокариотическом или эукариотическом хозяине. Предпочтительно, чтобы ДНК-молекула транскрибировала ген в клетке однодольного растения, например, клетке Миза зрр (банан) и пшеницы. ДНКмолекула способна транскрибировать ген в однодольных растениях, таких как банан и пшеница. Предпочтительно, чтобы ДНК-молекула транскрибировала ген в клетке двудольного растения, например клетке табака и цуккини. ДНК-молекула способна транскрибировать ген в двудольных растениях, таких как табак и цуккини. ДНК-молекула предпочтительно транскрибирует ген в клетках недифференцированной ткани двудольного растения.
Кроме того, изобретение относится к способу экспрессии гена не ВВТУ в клетке растения при использовании ДНК-молекулы, описанной выше.
Изобретение также относится к клетке растения, содержащей описанную выше ДНКмолекулу.
Изобретение иллюстрируется приведёнными ниже примерами, характеризующими предпочтительные варианты его осуществления. Однако примеры не ограничивают объёма изобретения. В примере 1 описывается, каким образом были обнаружены и идентифицированы три новых компонента ВВТУ, и основываясь на методике, изложенной в данном примере, специалист сможет выделить указанные компоненты ВВТУ. Соответствующая информация опубликована Витиз е! а1 в 1оитпа1 о! Сеиета1 Уйо1оду, 76, 1471-1482, 1995.
Экспериментальная часть
Пример 1. Компоненты ВВТУ.
Методы
Синтез и клонирование кДНК
Собирают бананы с характерными симптомами заболевания верхушки грозди бананов из района Намбур Юго-восточного Квинсленда. Частицы ВВТУ выделяют и очищают, как описано Аи аиб 8и, 1990, 1оитиа1 о! Рйу!ора!йо1оду, 128, 153-160, и Тйотаз аиб П1е!/деи, 1991, 1оитиа1 о! Сеиета1 Уйо1оду, 72, 217-224. Нуклеиновую кислоту экстрагируют из вирионов, как описано Ртаискт аиб Ваиб1е8, 1973, У1го1оду, 54, 359-368. Двуцепочечную ДНК синтезируют, как описано СиЫет аиб Но!!таи, 1983, Сеие, 25, 263-269, при использовании выборочных гексамеров (Вгеза!ес) для праймирования синтеза первой цепи. ЭзДНК обрабатывают нуклеазой золотистой фасоли (Рготеда) и лигируют в расщеплённый 8та I плазмидный вектор рИС18 (Ирстой аиб Неа1еу, 1987, Сеие, 51, 69-75). Затем плазмиду используют для трансформации штамма ЕзсйепсЫа сой 1М 109 (Наиайаи, 1983, 1оита1 о! Мо1еси1аг Вю1оду, 166, 557-580) и осуществляют отбор возможных рекомбинантных клонов на субстрате с Х-да1 (У1епа аиб Меззтд, 1982, Сеие, 19, 259-268).
Плазмиды выделяют методом щелочного лизиса (8атЬтоок е! а1., 1989, Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. №\\Уотк: Со1б 8рпид НагЬог ЬаЬога!оту). Вставки изолируют путём расщепления плазмид Есой 1/Н1иб III, электрофорезом в агарозных гелях и капиллярным блоттингом на мембране НуЬоиб Ν+ (Атегзйат) при использовании 0,4 М ЫаОН (8атЬгоок е! а1., 1989, Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. №\\-Уогк: Со1б 8рпид НагЬог ЬаЬога!оту). Вставки для использования в качестве ДНК-проб очищают из агарозных гелей с помощью набора Сеие-С1еаи (Вгеза!ес). ДНК-пробы метят при использовании специального набора йеабу-То-Со (Рйаттаыа), согласно рекомендациям производителя. Прегибридизацию и гибридизацию осуществляют, как описано Вигпз е! а1., 1994, Агсйщез о! У1го1оду, 137, 371-380.
Секвенирование и анализ последовательностей
Мини-препараты ожидаемых клонов ВВТУ получают методом щелочного лизиса клонов с последующей преципитацией полиэтиленгликолем (Найоп аиб 8акак1, 1986, Аналитическая биохимия, 152, 232-238). Секвенирование осуществляют с помощью 358бАТР и набора Секвеназа (И8 ВюсйетюаП), как рекомендовано производителем. Продукт реакции подвергают электрофорезу в 8%-ном (вес на объём) полиакриламидном геле, содержащем 7М мочевину. Гели фиксируют, высушивают и экспонируют на рентгеновскую плёнку. Праймеры, используемые для секвенирования, представляют собой универсальные секвенирующие праймеры или праймеры из 17-30 нуклеотидов, комплементарные соответствующим участкам клонированной вирусной ДНК, синтезированные с помощью набора Аррйеб ВюзуЧетз (АШ) РСй Ма!е и используемые согласно рекомендациям производителя.
РСй-продукты для секвенирования очищают из агарозных гелей при использовании набора Сеие-С1еаи (Вгеза!ес). ДНК секвенируют с помощью набора Секвеназа (И8В), согласно рекомендациям производителя. Денатурацию ДНК-матрицы (500 нг) осуществляют при кипячении с последующим добавлением ЭМ8О и 3 пкМ праймера для секвенирования.
Нуклеотидные последовательности анализируют при использовании обеспечения ССС версии 8, полученного из компьютерного центра АNСI8 в Университете г. Сидней, Австралия. Нуклеотидную и аминокислотную последовательности упорядочивают при использовании программного обеспечения С1из!а1 У на мягких дисках (Шддшз е! а1., 1991, САВЮ8, 8, 189191). Четыре базы данных для ДНК (СеиВаик, СеиВаик Аеек1у ирба!ез, ЕМВЬ аиб ЕМВЬ \\еек1у ирба!ез) и пять баз данных для белковых последовательностей (ЗМззРто!, 8\\'15зРго1 Аеек1у ирба!ез, Р[й, СеиРерйбе Рто!еш8 аиб СеиРерйбез Аеек1у ирба!ез) анализируют для поиска последовательностей, гомологичных нуклеотидной и выведенной на её основе аминокислотной последовательности ВВТУ с помощью двух систем аналитического программного обеспечения РА8ТА (Реагзои аиб Ыртаи, 1988, Ртосеебшд о! 1йе №йоиа1 Асабету о! δοΐеисез, И8А, 85, 2444-2448) и ВЙА8Т (Айзсйи1 е! а1., 1990, 1оита1 о! Мо1еси1аг Вю1оду, 215, 403410).
РСй: Анализ и клонирование
При использовании соответствующих нуклеотидных последовательностей клонов (I) рВТКР-11, 20, 80 и 88 и (II) рВТКР-Р1 и Р2 и нуклеотидных последовательностей ВВТУ компонентов 1 (Натбшд е! а1., 1993, 1оитиа1 οί Сенега! У1то1оду 74 323-328) и 2 синтезируют три набора непосредственно прилегающих внешних удлиняющих праймеров, а именно набор (I): праймер А структуры
5' ССАТССААССССССАТА 3'; праймер В структуры
5' СТССАТСССАССАТССА 3'; набор (II): праймер С:
5' ТАТТАСТААСАССААСА 3'; праймер Ό:
5' СТААСТТССАТСТСТСТ 3'; набор (III) праймер Е структуры
5' ССССаЛТа/еТСАТТСЕСд! 3'; праймер Е структуры
5' ТАСа/!ТТТСТСАТАСс/!СТ 3'.
Указанные праймеры используют при осуществлении РСК с ДНК ВВТУ в качестве матрицы, как описано Витта е! а1., 1994, АтсЫуез οί У1то1оду 137, 371-380. Амплифицированные продукты клонируют при использовании набора для клонирования ТА НпуЦгодеп) в плазмидные векторы рСРП или рСК2000, как рекомендовано производителем, или в плазмиду рУС19 с Тучастком и В1ие5епр1 (Матсйак е! а1., 1990. Νυс1е1с Ас16§ Кезеатсй, 19, 1154). Рекомбинантные клоны отбирают при использовании субстрата с Х-да1 на агаре Луриа-Бертани (ЬВ), содержащем подходящий антибиотик, и плазмиды выделяют методом щелочного лизиса (8ашЬтоок е! а1., 1989, Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. Νον Уогк: Со16 8рппд НагЬог ЬаЬота!огу). Клоны с явными вставками полной длины (размером около 1 кЬ) отбирают для секвенирования.
Полярность 88ДНК вириона
8δДНК ВВТУ экстрагируют, подвергают электрофорезу в агарозе и капиллярному блоттингу на двойных найлоновых мембранах (Натбшд е! а1., 1993, 1оитиа1 οί Сепега1 У1го1оду, 74, 323-328). В случае компонента 2 используют набор для мочения 3'-концевого участка ДНК (Воейпидет Маппйеип) с целью получения меченных 32Р специфических олигонуклеотидных проб для гибридизации (праймер ВТ2Е5.30 (С): 5' ССТССССТТТААСАТТССТТТСТТССТССС 3';
праймер ВТ2К5.30 (Н):
5' СССААААТСААТААСТАТСАССТСАААСАС 3).
Мембраны прегибридизуют и гибридизуют в течение 12 и 20 ч соответственно в реактиве Кар16-йуЬ (Атетайат) при 600°С. Фильтры однократно отмывают 1%-ным 8Ό8, 2х88С (0,3 М №С1, 0,03 М цитрат натрия, рН 7,0) при комнатной температуре и затем 2х88С при 650°С. Высушенные мембраны экспонируют на рентгеновскую плёнку при -800°С с помощью усиливающих экранов.
Для компонентов 3, 4, 5 и 6 используют специфичные к цепи РНК пробы. РНКтранскрипты полной длины полноразмерных
ВВТУ-клонов каждого из четырёх компонентов синтезируют при использовании набора для транскрипции рибопробы ш уйто (Рготеда), как рекомендовано изготовителем.
Результаты
Клонирование и секвенирование пяти геномных компонентов
Пять новых геномных компонентов ВВТУ клонируют и секвенируют при использовании двух библиотек: (I) выборочно праймированной библиотеки (II) и РСК-библиотеки.
(I) Выборочно праймированная библиотека.
Выборочно праймированную библиотеку получают на основе 88ДНК ВВТУ, экстрагированной из очищенных варионов. Выделенную 68ДНК обрабатывают нуклеазой золотистой фасоли, лигируют по тупым концам в расщеплённую 8та I плазмиду рИС18 и клонируют в Е. сой 1М 109. Указанную библиотеку скринируют 32Р-меченной ДНК из вирионов ВВТУ, незараженных бананов и вставки рВТ338, которая является частью клона ДНК-компонента 1 ВВТУ (Натбшд е! а1., 1991, 1оитиа1 οί Сепега1 У1го1оду, 72, 225-230; Нагбшд е! а1., 1993, 1оитпа1 οί Сепега1 У1го1оду, 74, 323-328).
ДНК-компонент 2 ВВТУ
Четыре клона, рВТКР-11, 20, 80 и 88, гибридизуют с ДНК вирионов ВВТУ и друг с другом, но не с ДНК незаражённых бананов и рВТ338. Вставки указанных клонов секвенируют. РВТКР-20 и 80, содержащие вставки размером 220 п. о., имеют идентичные последовательности; рВТКР-80 имеет вставку размером 188 п. о. и последовательность размером 148 п. о., идентичную рВТКР-20 и 88, и последовательность размером 40 п. о. на одном конце, которая является уникальной. Последовательность размером 115 п. о. вставки рВТКР-11 идентична эквивалентному участку рВТКР-20 и 88. Два непосредственно примыкающих внешних удлиняющих праймера, а именно А и В, конструируют на основе перекрывающейся последовательности четырёх клонов таким образом, что указанные праймеры служат затравками для амплификации полноразмерных копий 68ДНК кольцевой молекулы 88ДНК (НагФпд е! а1., 1993, 1оитпа1 οί Сепега1 У1го1оду, 74, 323328). 88ДНК вириона ВВТУ амплифицируют с помощью РСК при использовании указанных праймеров и ДНК-полимеразы РГи и полученные продукты клонируют в плазмиду рСК2000. Четыре из полученных клонов секвенируют в обоих направлениях при использовании универсальных прямых и обратных праймеров и специфических праймеров для последовательностей. Три из указанных клонов содержат вставки размером 1060 п. о. и один клон содержит вставку размером 1059 п. о. Четыре клона имеют идентичные последовательности, за исключением девяти единичных нуклеотидных замен, включая одну делецию. Более того, последова тельности исходных четырёх кДНК-клонов обнаруживаются в составе четырёх РСК-клонов. Консенсусную последовательность данного компонента, называемую ДНК-компонентом 2 ВВТУ, определяют и сравнивают с последовательностью ДНК-компонента 1 ВВТУ (Натйшд е! а1., 1993, 1оитпа1 о! Оеиега1 У1то1оду, 74, 323328); две последовательности значительно отличаются от двух существенных участков гомологии.
ДНК-компонент 6 ВВТУ
Два клона из той же самой библиотеки, рВТКР-Р1 и Р2, гибридизуют с меченной ДНК вирионов ВВТУ, но не с ДНК незаражённых бананов и рВТ 338. Однако вставки указанных клонов, обе размером около 1 кЬ, расщепляют ЕсоКУ, в то время как ни компонент 1, ни компонент 2, не имеют ЕсоКУ-сайтов. Два клона частично секвенируют при использовании универсальных прямых и обратных праймеров. Последовательности обоих клонов идентичны, но явным образом отличаются от таковых компонентов 1 и 2. Как и в предыдущем эксперименте, конструируют два непосредственно прилегающих внешних удлиняющих праймера, а именно праймеров С и Ό. §8ДНК вирионов ВВТУ используют в качестве матрицы совместно с указанными праймерами в РСК и полученные продукты клонируют в вектор В1не8сг1р1 с Т-вставкой. Один полноразмерный клон рВТР2А1 отбирают и секвенируют в обоих направлениях из субклонов, генерированных при расщеплении экзонуклеазой III и применении универсальных прямых и обратных и специфичных по отношению к последовательности праймеров. Последовательность компонента 6 размером 1089 п. о. приведена на фиг.1е.
(II) РСК-библиотека.
При сравнении последовательностей компонентов 1 и 2 идентифицируют два гомологичных участка. Первый участок, позднее названный общим участком стержневой петли (СК8Ь), содержит возможную стержневую/петлевую последовательность, идентифицированную в компоненте 1 (Натйшд е! а1., 1993, 1оигиа1 о! Оеиега1 У1то1оду, 74, 323-328); второй участок, входящий в состав области, позднее обозначаемый как основной общий участок (СК-М), представляет собой последовательность размером около 66 нуклеотидов, расположенную с 5конца стержневой петлевой последовательности. Предполагается, что все геномные компоненты ВВТУ должны содержать СК-М, и в соответствии с указанным конструируют и синтезируют два непосредственно прилегающих внешних удлиняющих вырожденных праймера, а именно Е и Е, на основе указанного участка и проводят реакцию РСК при использовании 88 ДНК ВВТУ в качестве матрицы (Витте е! а1., 1994, АтсЫуее о! Упо1оду, 137, 371-380). Семь РСК-продуктов, каждый размером около 1 кЬ, выявляют с помощью электрофореза в полиак риламидном геле. Продукты клонируют в РСК11. Полученные клоны подразделяют на три группы В, С и Ό, на основе их способности гибридизоваться с вирионной ДНК ВВТУ, но не с ДНК незараженных бананов. Каждая группа также характеризуется определённой картой рестрикции, отличной от двух других групп и компонентов 1,2 и 6 (Витте е! а1., 1994, АтсЫуее о! У1го1оду, 137, 371-380). Одна группа, группа А, характеризуется картой рестрикции, неотличимой от таковой компонента 2, и позднее путём секвенирования подтверждается, что клоны группы А соответствуют клонам компонента 2.
Каждая группа клонов предположительно соответствует новому и универсальному ДНКкомпоненту ВВТУ. Из каждой группы клонов три клона (компонент 3) или четыре клона (компоненты 4 и 5) частично секвенируют с помощью универсальных прямых и обратных праймеров. В каждом случае все клоны в пределах группы имеют идентичные последовательности, которые перекрываются за исключением одной иди двух определённых нуклеотидных замен. Более того, последовательности из каждой группы отличаются от последовательностей каждой другой группы и от последовательностей компонентов 1, 2 и 6. Один клон из каждой группы или компонент отбирают и полностью секвенируют в обоих направлениях. Важно отметить, что каждую из указанных групп клонов получают при использовании вырожденных праймеров, перекрывающих последовательность из консервативного участка СК-М компонентов 1 и 2. СК-М из компонентов 1 и 2 консервативен не в полной степени и поэтому ожидается, что гипотетическая СК-М-последовательность у других компонентов иная. Таким образом, конструируют конвергирующие праймеры, уникальные для каждого компонента, и используют их для амплификации последовательности, содержащей СК-М каждого компонента 88ДНК вирионов ВВТУ. Полученные РСК-продукты секвенируют непосредственным образом при использовании двух компонентных специфических конвергирующих праймеров.
ДНК-компонент 3 ВВТУ
Компонент 3 (Группа С клона рВТР-64) секвенируют в обоих направлениях (первоначальный клон и субклон, полученные при расщеплении эндонуклеазой III, или рестрикционные фрагменты) при использовании универсальных прямых и обратных праймеров и трёх специфичных к последовательности праймеров. Конструируют два дополнительных конвергирующих праймера на основе указанной последовательности для амплификации продукта размером 380 п. о., содержащего СК-М. Последовательность указанного продукта идентична таковой рВТР-64, за исключением пяти одиночных нуклеотидных замен, четыре из которых затрагивают последовательность, перекрывающуюся первоначальными вырожденными прай мерами, и одна находится за пределами указанной последовательности и затрагивает нуклеотид 947. Окончательная последовательность компонента 3 размером 1075 п. о. приведена на фиг. 1Ь.
ДНК-компонент 4 ΒΒΤν
Компонент 4 (Группа Ό клона рВТР-62) секвенируют в обоих направлениях (первоначальный клон и субклоны, полученные при расщеплении эндонуклеазой III) с помощью универсальных прямых и обратных праймеров и трёх специфичных по отношению к последовательности праймеров. Конструируют два дополнительных конвергирующих праймера на основе указанной последовательности для амплификации продукта размером 350 п. о., содержащего СВ-М. Последовательность указанного продукта идентична таковой рВТР-62, за исключением двух одиночных нуклеотидных замен в последовательности, перекрывающейся первоначальными вырожденными праймерами. Окончательная последовательность компонента 4 размером 1043 п. о. приведена на фиг. 1с.
ДНК-компонент 5 ΒΒΤν
Компонент 5 (Группа В клона рВТР-129) секвенируют в обоих направлениях (первоначальный клон и субклоны, полученные при расщеплении экзонуклеазой III) с помощью универсальных прямых и обратных праймеров и трёх специфичных к последовательности праймеров. Конструируют два дополнительных конвергирующих праймера на основе указанной последовательности для амплификации продукта размером 290 п. о., содержащего СВ-М. Последовательность указанного продукта идентичны таковой рВТР-129, за исключением четырёх одиночных нуклеотидных замен в последовательности, перекрывающейся первоначальными вырожденными праймерами. Окончательная последовательность компонента 5 размером 1018 п. о. приведена на фиг. 16.
Ориентация геномных компонентов и взаимосвязь с заболеванием верхушки грозди бананов Авторы изобретения предварительно показали, что геном ΒΒΤν представлен одноцепочечной ДНК (Нагбшд е! а1., 1991, 1оитпа1 о! Оепега1 νίΓοΙοβν, 72, 225-230; Нагбшд е! а1., 1993, 1оита1 о! Оепега1 νίΓθ1ο§ν. 74, 323-328). С целью определения ориентации каждого компонента в вирионах, синтезируют специфичные к цепи ДНК или РНК пробы для каждого компонента и гибридизируют с вирионной ДНК ΒΒΤν. Специфичные пробы для компонента 2 представляют собой два 3'-меченных олигонуклеотида (размером 30 нуклеотидов каждый) в то время, как пробы, специфичные для компонентов 3, 4, 5 и 6, были получены на основе РНКтранскриптов, меченных 32Р. В случае каждого компонента пробы с последовательностями, комплементарными последовательностям компонентов, приведённых на фиг. 1, строго гибридизуются с ДНК вирионов ΒΒΤν, в то время, как пробы с последовательностями, идентичными приведённым на фиг. 1, не гибридизуются с ними (фиг. 2). Это свидетельствует о том, что каждый компонент представлен одноцепочечной ДНК только в одной ориентации, как показано на фиг. 1.
Более того, специфичные к цепи ДНК и компоненту ΒΒΤν пробы, которые гибридизуются с 55ДНК вирионов ΒΒΤν, используются в качестве зондов для подтверждения того, что каждый компонент ассоциирован с заболеванием верхушки грозди бананов. Экстракты ДНК из трёх (для компонента 2) или четырёх (для компонентов 3-6) различных изолятов ΒΒΤν и ДНК из четырёх здоровых бананов подвергают Саузерн-блоттингу и гибридизуют с каждой пробой. Каждая компонент-специфическая проба гибридизуется с низкомолекулярной ДНК ожидаемого размера во всех экстрактах из ΒΒΤνинфицированных бананов, но не гибридизуется с экстрактами здоровых бананов (результаты не приведены). Это свидетельствует о том, что каждый компонент явным образом ассоциирован с заболеванием и вирусом.
Анализ геномных компонентов ΒΒΤν
Последовательности пяти полученных геномных компонентов ΒΒΤν и последовательность компонента 1 (Нагбтд е!. а1., 1993, 2) упорядочивают и сравнивают. Каждая из шести последовательностей отлична от другой, за исключением двух существенных участков, которые обладают различной степенью гомологии у всех шести компонентов.
Общий участок стержневой петли
Авторы изобретения предварительно идентифицировали возможную структуру стержневой петли компонента 1 ΒΒΤν (Нагбтд е! а1., 1993, 1оита1 о! Оепега1 ^го1оду, 74, 323-328), который имеет петлевую последовательность, практически идентичную инвариантной петлевой последовательности геминивирусов (Ьа7ато^Й7, 1992, СгШса1 Веу1е\\'5 ίη Р1ап! 8οίепсе5, 11, 327-349). Эквивалентная стержневая петлевая структура также обнаружена в компонентах 2-6 (фиг. 3). Каждый компонент имеет петлевую структуру из 11 нуклеотидов, из которых 9 последовательных нуклеотидов консервативны у всех компонентов. Каждый компонент имеет также стержневую последовательность размером 10 п. о., из которых 14 нуклеотидов высококонсервативны. Однако при сравнении всех шести компонентов, участок гомологии соответствует 25 нуклеотидам с 5-конца стержневой петлевой структуры и 13 нуклеотидам с 3'-конца стержневой петлевой структуры. 5'концевые 25 нуклеотидов высококонсервативны у компонентов 1, 3, 4 и 5. Обнаружены две явные делеции в обоих компонентах 2 и 6. В компоненте 2 восемь нуклеотидов высококонсервативны по отношению к компонентам 1, 3, 4 и 5, в то время как в компоненте 6 16 нуклеотидов консервативны по отношению к таковым других компонентов. 13 нуклеотидов З'-конца стержневой петли высококонсервативны у всех шести компонентов, за исключением явной одиночной нуклеотидной делеции в компоненте 2. Последовательность из 69 нуклеотидов, включающая стержневую петлевую последовательность, обозначена как стержневой петлевой консервативный участок или СВ-8Ь.
Основной общий участок
Второй общий участок локализуется на различных расстояниях с 5-конца СВ-8Ь и его называют основным общим участком или СВМ. Указанный участок варьирует в размерах и состоит из 65 нуклеотидов в компоненте 1 и из 92 нуклеотидов в компоненте 5 (фиг. 4). У компонента 1 явным образом первые 26 нуклеотидов СВ-М делетированы и, кроме того, обнаруживается ещё одна нуклеотидная делеция. У компонентов 2, 3 и 4 обнаружены две одиночные нуклеотидные делеции и у компонента 6 одна одиночная нуклеотидная делеция. У всех компонентов 45 нуклеотидов консервативны и 23 из первых 26 делетированных у компонента 1 нуклеотидов консервативны у компонентов 2-6. Кроме того, у компонентов обнаружен практически полный 16-нуклеотидный прямой повтор (АТАСААс/ дАСа/дСТАТОА) в пределах нуклеотидов 4-20 и 21-36. Далее, 15-нуклеотидная, обогащённая основаниями ОС последовательность (около 86% ОС), локализована в пределах нуклеотидов 78-92 и на 93% консервативна у всех компонентов.
Последовательность между последним нуклеотидом СВ-М и первым нуклеотидом СВ8Ь варьирует по длине и содержит от 22 нуклеотидов у компонента 1 и 233 нуклеотида у компонента 2 (фиг. 1 и 5). Интересно, что последовательность из 175 нуклеотидов у компонентов 3 и 4 на 97% консервативна.
Возможные ТАТА-боксы. Возможный ТАТА-бокс идентифицирован в компоненте 1 ВВТУ и он расположен на расстоянии 20 нуклеотидов от 3'-конца последнего нуклеотида стержневой петли и 43 нуклеотидов от 5-конца стартового кодона возможного гена репликазы (Натбшд е! а1., 1993, 1оитпа1 οί Оеиега1 У1го1оду, 74, 323-328). Сходные возможные ТАТА-боксы также идентифицированы в компонентах 2-6. В каждом из указанных компонентов возможный ТАТА-бокс представляет собой последовательность из 9 нуклеотидов, СТАТа/!а/!А!/аА, и локализован в положении йо\\п51геат (ниже) по отношению к петлевой стержневой последовательности (фиг. 1). Однако последовательность между последним 3'-нуклеотидом стержневой петлевой последовательности и возможным ТАТА-боксом значительно больше по длине у компонентов 2-6, чем у компонента 1, и варьирует от 157 нуклеотидов у компонентов 5 до 227 нуклеотидов у компонента 4 (фиг. 1 и 5).
Анализ возможных сигналов полиаденилирования
Идентифицируют шесть возможных сигналов полиаденилирования, которые ассоциированы с 3'-концом основных ОВЕк компонентов 3-6. Обогащённый основаниями ОТ участок размером 10-17 нуклеотидов локализован между нуклеотидами 0 и 23 с 3'-конца каждого из указанных сигналов полиаденилирования и каждый обогащённый ОТ участок содержит тринуклеотидную последовательность ТТО (фиг. 4). Только один возможный сигнал полиаденилирования, идентифицированный в компоненте 2, имеет соответствующий обогащённый ОТ участок с тринуклеотидной последовательностью ТТО и он локализован на расстоянии 233 нуклеотидов от 3'-конца девятинуклеотидного возможного ТАТА-бокса в смысловой цепи вирионной ДНК.
Выводы
Все шесть компонентов имеют два общих участка, СВ-8Ь и СВ-М, в возможной межгенной или нетранслируемой области и пять из шести компонентов имеют одну большую ОВЕ в смысловой цепи вирионной ДНК, с которой ассоциированы возможные ТАТА-боксы и сигналы полиаденилирования (фиг. 5). СВ-8Ь включён в консервативную стержневую петлевую структуру. Петлевая последовательность из 11 нуклеотидов консервативна у всех компонентов ВВТУ, за исключением двух нуклеотидов, и сходна с таковой, обнаруживаемой у девяти геминивирусов (ЬахагслуЦ/. 1992, Се1шш\згикек: депоте к1тис!иге апб депе Гипс!юп. 2), СЕЭУ (Войбе е! а1., 1990, У1го1оду, 176, 648-651) и другого компонента ВВТУ (Уе11 е! а1, 1994, У1го1оду, 198, 645-652). Модель участия петлевой последовательности в репликации посредством механизма катящегося кольца была описана у геминивирусов (Заипбегк е! а1., 1993, ΩΝΛ Гогтк оГ !йе де1шш\згик -АГпсап саккауа токаю уйик сопк1к!еп! νίΐΐι !йе гоШпд сйс1е тесйашкт оГ герИсайоп. IX Международный конгресс по вирусологии, О1акдоте, Аидик!, 1993. Реферат Р6018). Возможно, что петлевая последовательность у ВВТУ имеет сходную функцию. Стержневые петлевые последовательности также высококонсервативны у всех компонентов ВВТУ и содержат пентануклеотидную последовательность ТАССС, которая, как обнаружено, представляет собой сайт инициации синтеза вирусной цепи ДНК у геминивируса карликовости пшеницы (Неугаиб е! а1., 1993, ЕМВО 1оита1, 12, 4445-4452).
Основной общий участок (СВ-М) идентифицирован у всех компонентов и локализован на 3'-конце основной ОВЕ (за исключением компонента 2, где не идентифицирована основная ОВЕ) и 5'-конце СВ-8Ь (фиг. 5). Гексануклеотидные повторы были идентифицированы в пределах СВ-М у всех компонентов, за исключением компонента 1. Однако не установлена непосредственная функция указанных повторов, хотя они могут быть связаны с промоторными последовательностями или их частью. СВ-М также содержит 15-нуклеотидную обогащённую СС последовательность, локализованную на 3'конце, и, возможно, образующую небольшую стержневую петлевую структуру. Указанная обогащённая СС последовательность также включает два прямых СС повтора, которые соответствуют 8р1 связывающим сайтам, обнаруженным в промоторах генов клеток млекопитающих и вирусов (Еепо11 с1 а1., 1990, Р1аи1 Мо1еси1аг Вю1оду, 15, 865-877). Показано, что сходный промотор, обнаруженный у геминивируса, инфицирующего однодольную кукурузу (геминивирус полосатости кукурузы), необходим для максимально более правильной транскрипции, а также, по-видимому, связывает ядерные факторы кукурузы некооперативным образом (Реио11 е1 а1., 1990, Р1аи1 Мо1еси1аг Вю1оду, 15, 865-877).
Кагап е! а1., (1994, 1оигпа1 о! Сепега1 Уйо1оду, 75, 3541-3546) сообщили, что СК-М последовательность компонента 1 высококонсервативна у ВВТУ-изолятов группы ЮжноТихоокеанского региона (96,5% гомологии) и у изолятов Азиатской группы (98,0% гомологии), но сильно варьирует между двумя группами изолятов (68,0% гомологии). Отмечается 76%ная гомология между СК-М последовательностями шести различных компонентов Австралийского изолята. Таким образом, важно определить уровень гомологии между СК-М последовательностями индивидуальных компонентов различных групп изолятов, чтобы установить, высококонсервативны ли указанные последовательности в группах изолятов, но вириабельны ли в группах и различных компонентах, и имеет ли это какое-либо биологическое значение.
Длина и состав последовательности СК-М и СК-8Ь несхожи у четырёх из шести компонентов. Однако у компонентов 3 и 4 указанный участок из 175 нуклеотидов гомологичен на 97% и 334 нуклеотида с 5-конца СК-М до 3'конца СК-8Ь гомологичны на 98%. Сходный большой общий участок из 300 нуклеотидов обнаружен у геминивирусов и он идентичен у А и В компонентов индивидуальных геминивирусов, существующих в форме двух вирионов (Ъахаго\\йх. 1992, Сетйиуйизез: депоте з!гис!иге апб депе ГипсДоп. 2). У геминивирусов этот участок содержит стержневую область. Участок гомологии также обнаружен у пяти из семи компонентов 8С8У, включающих стержневую петлевую область (8игт е! а1., 1993. Тйе зиЬ!егапеап с1оуег з!ип! упиз депоте сопз1з!з о! тюгосйготозотез епсобтд зтд1е ОКЕз. IX Международный конгресс вирусологии, С1аздом, Аидиз!, 1993, Реферат Р62-1), которая сходна с таковой геминивирусов, но отличается у четырёх из шести ВВТУ-компонентов.
Компоненты 3, 4, 5 и 6 имеют одну протяжённую ОРЯ в смысловой цепи ДНК вириона на 3'-конце СК-8Ь. Каждая из ОКЕз содержит возможные консервативные ТАТА-боксы и ас социированные с ними сигналы полиаденилирования (фиг. 8). Возможные ТАТА-боксы высококонсервативны и представляют собой девятинуклеотидную последовательность СТАТа/!а/ !Аа/!А, которая в полной мере сходна с описанной Висйег е! а1. (1990, 1оигпа1 о! Мо1еси1аг Вю1оду, 212, 563-578). Расстояние между возможным ТАТА-боксом и кодоном инициации трансляции варьирует у каждого компонента от 13 нуклеотидов у компонент 3 до 102 нуклеотидов у компонента 1. Кодон инициации трансляции АТСС идентифицирован у пяти компонентов, кодирующих протяжённые ОКЕз. Однако два возможных кодона инициации трансляции идентифицированы у компонента 3, первый в положении нуклеотида 213 (АТСТ) и второй в положении нуклеотида 227 (АТСС); второй кодон инициации находится в пределах одной рамки считывания с первой. Указанное позволяет предположить, что второй кодон инициации функционирует должным образом, как это подтверждается путём 5'-КАСЕ или Ν-концевого секвенирования продукта трансляции ОКЕ. Обогащение СТ участки были идентифицированы в положении от 0 до 24 нуклеотида на 3'конце каждого сигнала полиаденилирования у компонентов 1, 3, 4, 5 и 6. Каждый из указанных обогащённых СТ участков содержит нуклеотидную последовательность ТТС. Сигналы полиаденилирования компонентов 3 и 6 содержат указанные последовательности. Комбинация консенсусного сигнала полиаденилирования (Аа/!ТААа/!) и З'-проксимального обогащённого СТ участка, содержащего тринуклеотидную последовательность ТТС, ассоциирована только с одной ОКЕ в смысловой цепи ДНК вирионов компонентов 1, 3, 4, 5 и 6 и не идентифицирована где-нибудь ещё в указанных последовательностях. Это позволяет предположить, что каждый из указанных компонентов кодирует определённый ген. Сходные последовательности ассоциированы с различными сигналами полиаденилирования и могут быть необходимы для эффективной терминации (С11 апб РгоибГоо!,
1984, МШие, 312, 473-474; Сонму апб ^юкепз,
1985, Ргосеебшдз о! Нэе Ыа!юпа1 Асабету о! 8с1епсез И8А, 82, 3949-3953).
Пример 2. Модификация экспрессии при использовании межгенных участков ВВТУ.
Материалы и методы Плазмиды Опосредованная агробактериями трансформация
Все возможные промоторные последовательности ВВТУ лигируют в бинарный вектор на основе агробактерий рВ1101.3 (С1оп!есй). Указанная плазмида содержит кассету устойчивости к антибиотику, включающую конструкцию промотор нопалинсинтазы/ген ИРТП (ген устойчивости к канамицину)/ терминатор нопалинсинтазы (N08) и безпромоторный ген глюкуронидазы (СИ8) с терминатором ЫО8.
Последовательности, происходящие из ВВТУ, лигируют по отдельности в универсальный ВатН1-сайт на 5'-конце безпромоторного гена ОИ8. Плазмиду рВ1121 (С1оп!есй) используют в качестве контрольной. Эта плазмида идентична рВ1101.3, за исключением того, что содержит промотор СаМУ 358 на 5'-конце гена ОИ8, что обеспечивает экспрессию гена ОИ8.
Бомбардировка микрочастицами
Для транзисторного анализа промоторной активности ВВТУ посредством бомбардировки микрочастицами, кассету промотор ВВТУ/ 6И8/ПО8 субклонируют в рСЕМ3/Г+ (Рготеда). В качестве позитивного контроля для большинства экспериментов кассету промотор СаМУ 358/Си8/по5 сходным образом субклонируют из рВ1121 в ρ6ΕΜ3ζΓ+ (р6ЕМ358-6И8). Большие количества указанных плазмид в высокоочищенной форме получают для бомбардировки при использовании набора О|адеп Р1а§т1б Мах1 (О|адеп) согласно инструкциям изготовителя.
Трансформация
Плазмиды рВ1121, рВ1101.3 или рВ1101.3 с последовательностями ВВТУ на 5'-конце гена ОИ8 вводят в различные виды растений и тканевые культуры как методом бомбардировки микрочастицами, так и электропорацией или трансформацией, опосредованной агробактериями (Ногксй е! а1., 1989, Ιη: Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду Мапиа1, ОеМп е! а1. (ебк) ЭогбгесЫ К1и\уег Асабетю РиЫщйега, рр. А8/1-А5/9; Наир!тапп е! а1., 1987, Р1ап! Се11 РерогК 6, 265270; Баз! е! а1., 1991, Тйеогебса1 апб АррНеб Оепебск, 81, 581-588).
Анализ ОИ8-экспрессии осуществляют практически тем же самым методом, как описано 1еПсг5оп. 1987, Р1ап! Мо1еси1аг Керойег 5 (4): 387-405.
Получение промоторных конструкций ВВТУ
Праймеры:
ВТ6.1 (25 нукл.) 5' дсс!дсадад!!д!дс!д1аа!дй 3' ВТ6.2 (24 нукл.) дсддаа!ссдс!!с!дссИссдс!
ВТ6.3 (25 нукл.) дссс!дсадса!ддасд!садсаадд ВТ3.1 (24 нукл.) дсс!дсадас!а!!д!а!ддаа!д ВТ3.2 (23 нукл.) дсдда!ссс!а!с!адасас!дд ВТ4.1 (23 нукл.) дс!с!адаа!ддд1а!1да!д!а ВТ4.2 (25 нукл.) дсдда!сс!!адс!дсд!сс!а!!! ВТ5.2 (23 нукл.) дсдда1ссдасдад1даИ1сдд ВТ129У3.17 (17 нукл.) §!1а!са!ддса!сдас ВТ1К.1.17 (17 нукл.) даасаад!аа!дас!!!
ВТ1.Е4.30 (30 нукл.) ддыдаадсНПсаКфсисадададс ВТ1.ЮТ.В28 дда!сс!аса!дасаа!!1ааа!даасс ВТ1.1ЫТ.Е25 аадс!1а!аааасдааддсда!даа
Условия РИС
Последовательные стадии:
1. 94°С х 5 мин
2. 94°С х 1 мин)
42°С х 1 мин) х 40
72°С х 1 мин)
3. 72°С х 10 мин
1. Клонирование межгенных участков ВВТУ
Компонент 6 ВВТУ
Компонент 6 полной длины (1089 п. о.)
1. Межгенный участок из ВВТУ6 клона Р2А1 амплифицируют с помощью РСИ при использовании праймеров ВТ6.1 (+746) и ВТ6.2 (+280).
2. Межгенный участок размером 623 п. о. субклонируют как Ркб и ВатН1 фрагмент в рИС19 (рИС6.1).
3. Межгенный участок клонируют из рИС6.1 как НшбШ и ВатН1 фрагмент в рВ1101.2 (рВТ6.1).
4. Фрагмент промотор ВВУУ6/Ои8/по§ из рВТ6.1 субклонируют в ρ6ΕΜ3ζГ + как Нш6ΙΙΙ и ЕсоИ1 фрагмент (р6ЕМ6.1-6И8).
Конструирование рВТ6.2 с 5'-делециями межгенного участка ВВТУ6
Конструирование рВТ6.2.
1. 5'-Делецию размером 272 п. о. в межгенном участке ВВТУ6 генерируют путём расщепления рИС6.1 эндонуклеазой Асс1, сайт рестрикции которой локализован в положении +1018 в кольцевой ДНК компонента 6. Сайт рестрикции Рк!1 локализован в 5'-области сайта множественного клонирования рИС19.
2. Концы заполняют с помощью фрагмента Клёнова и снова лигируют с получением рИС6.2.
3. Фрагмент размером 351 п. о. клонируют из рИС6.2 в рВ1101.3 (рВТ6.2) как НшбШ и ВатН1 фрагмент.
4. Кассету промотор ВВТУ6 (351 п. о.)/Ои8/по§ субклонируют из рВТ6.2 как Нш6ΙΙΙ и ЕсоИ1 фрагмент в ρ6ΕΜ3ζГ+ (рОЕМ6.2ои8).
Конструирование рВТ6.3.
1. 5'-делецию размером 384 п. о. межгенного участка ВВТУ6 генерируют путём РСИамплификации из клона Р2А1 ВВТУ6 при использовании праймеров ВТ6.3 (+41) и ВТ6.2 (+280).
2. Межгенный участок размером 239 п. о. клонируют как РШ и ВатШ фрагмент в рИС19 (рИС6.3).
3. Межгенный участок клонируют из рИС6.3 как НшбШ и ВатШ фрагмент в рВН01.3 (рВТ6.3).
4. Кассету промотор ВВТУ6 (239 п. о.)/Ои8/по§ субклонируют из рВТ6.3 как НшбШ и ЕсоШ фрагмент в ρ6ΕΜ3ζГ+ (рОЕМ6.3ои8).
Конструирование рВТ6.4.
1. 5'-делецию размером 451 п. о. в межгенном участке ВВТУ6 генерируют расщеплением рИС6.3 ВатШ и Нае111 (сайг рестрикции локализован в положении +108 в кольцевой ДНК ВВТУ6).
2. Концы заполняют с помощью фрагмент Клёнова и фрагмент с тупыми концами размером 172 п. о. клонируют в 8ша1-сайт рВН01.3 (рВТ6.4).
3. Кассету промотор ВВТУб (172 п. о.)/би§/по8 субклонируют из рВТ6.4 как ΗίηάΙΙΙ и ЕсоШ фрагмент в ρ6ΕΜ3ζί+ (рОЕМб.4ουδ).
Компонент 1 ВВТУ
Компонент 1 полной длины (1111 п. о.)
1. Фрагмент размером 225 п. о., содержащий межгенный участок ВВТУ1, амплифицируют с помощью РСК из клона полной длины при использовании праймеров ВТ1К1.17 (+98б) и ВТ1Е4.30 (+129).
2. Полученный РСК-продукг расщепляют Тас.|1 (сайт рестрикции локализован в положении +118 в кольцевой ДНК ВВТУ1).
3. Полученный фрагмент размером 214 п. о. достраивают до тупых концов с помощью фрагмента Клёнова и клонируют в 8таI-сайт рВ1101.3 (рВТ1.1).
4. Кассету промотор ВВТУ1 (214 п. ο.)/θυδ/ηοδ клонируют из рВТ1.1 как ΗίηάΙΙΙ и ЕсоШ фрагмент в ρ0ΕΜ3ζί+(ρ0ΕΜ1.1-0υδ).
Обратите внимание: малопротяжённую ОКЕ в ВВТУ-1 идентифицируют методом 3' КАСЕ. Указанная ОКЕ локализована в положении +430 +555. На основе локализации данной ОЕК выделяют другой межгенный промотор ВВТУ-1.
1. Протяжённый межгенный участок, основанный на идентифицированной в ВВТУ-1 меньшего размера ОЕК, амплифицируют с помощью РСК из полноразмерного клона ВВТУ-1 при использовании праймеров ВТ1.ГЫТ.К28 (+429) и ВТ1.ЮТ.Е25 (+5б0).
2. Полученный межгенный участок размером 980 п. о. клонируют в положении ирйгет (выше) по отношению к репортерному гену в рВН01.3 как ВатШ и ΗίηάΙΙΙ фрагмент (рВТ1.ЮТ).
Компонент 2 ВВТУ Полноразмерный компонент 2 (1059 п. о.) Двухцепочечную репликативную форму ВВТУ2 полной длины, клонированную в риС19 как ХЬа! фрагмент в положении +3б1 (риСВТ2), получают от фирмы Какйат ^апйсйакогг.
1. Межгенный участок размером 855 п. о. генерируют из риС-ВТ2 расщеплением ХЬа! и Асс1 (сайт рестрикции локализован в положении +5б5 в кольцевой ДНК компонента 2). АссЕ конец затупляют с помощью фрагмента Клёнова, а ХЬа1-сайт остаётся липким.
2. Полноразмерный межгенный участок непосредственно клонируют в сходным образом полученный ρΟΕΜ3ζί+(ρΟΕΜ2.1).
3. Межгенный участок клонируют из рОЕМ2.1 как ΗίηάΙΙΙ и ВатШ фрагмент в рВН01.3 (рВТ2.1).
4. Кассету промотор ВВТУ2 (8бб п. оЖЕ^/поч субклонируют из рВТ2.1 как ΗίηάΙΙΙ и ЕсоШ фрагмент в ρΟΕΜ3ζί+(ρΟΕΜ2.1-Ουδ).
Компонент 3 ВВТУ
Полноразмерный компонент 3 (1075 п. о.)
1. Полноразмерный межгенный участок компонента 3 амплифицируют с помощью РСК из экстракта нуклеиновой кислоты инфицированных ВВТУ бананов ЮИ) при использовании праймеров ВТ3.1 (+7б1) и ВТ3.2 (+212).
2. Межгенный участок размером 526 п. о. субклонируют как РШ-ВатШ фрагмент в ρΟΕΜ3ζί+(ρΟΕΜ3.1).
3. Межгенный участок клонируют из рОЕМ3.1 как ΗίηάΙΙΙ и ВатШ фрагмент в рВН01.3 (рОЕМ3.1).
Кассету промотор ВВТУ3 (52б п. о.УОЖпоч субклонируют из рВТ3.1 как ΗίηάΙΙΙ и ЕсоШ фрагмент в ρΟΕΜ3ζί+(ρΟΕΜ3.1-Ουδ).
Компонент 4 ВВТУ
Полноразмерный компонент 4 (1043 п. о.)
1. Полноразмерный межгенный участок компонента 4 амплифицируют с помощью РСК из экстракта нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоты инфицировании ВВТУ бананов ЮИ) при использовании праймеров ВТ4.1 (+278).
2. Межгенный участок размером 659 п. о. субклонируют как XЬаI и ВатШ фрагмент в ρΟΕΜ3ζί+(ρΟΕΜ4.1).
3. Межгенный участок клонируют из рОЕМ4.1 как ХЬа[ и ВатШ фрагмент в рВ1101.3 (рВТ4.1).
4. Кассету промотор ВВТУ4 (б59 п. о.УОЖпоч субклонируют из рВТ4.1 как ХЬа1 и ЕсоШ фрагмент в ρΟΕΜ3ζί+(ρΟΕΜ4.1-Ουδ).
Компонент 5 ВВТУ
Полноразмерный компонент 5 (1018 п. о.)
1. Межгенный участок компонента 5 амплифицируют с помощью РСК из экстракта нуклеиновой кислоты больных бананов (ΟΙά) при использовании праймеров ВТ129У3.17 (+б39) и ВТ5.2 (+230).
2. Полученный РСК-продукг расщепляют ВатШ и АсО (сайт рестрикции локализован в положении +794 в кольцевой ДНК комплекта 5). Асс1-сайт достраивают до тупых концов с помощью фрагмента Клёнова, а ВатН1-конец остаётся липким.
3. Полученный межгенный участок размером 454 п. о. непосредственным образом субклонируют в сходным образом сконструированный ρΟΕΜ3ζί+(ρΟΕΜ5.1).
4. Межгенный участок клонируют из рОЕМ5.1 как ΗίηάΙΙΙ и ВатШ фрагмент в рВН01.3 (рВТ5.1).
5. Кассету промотор ВВТУ5 (454 п. о.УОЖпоч субклонируют из рВТ5.1 как ΗίηάΙΙΙ и ЕсоШ фрагмент в ρΟΕΜ3ζί+(ρΟΕΜ5.1ουδ).
2. Транзиторный анализ промоторной активности ВВТУ посредством бомбордировки микрочастицами клеточной линии ΝϊοοΙϊαηα 1аЬаеиш (ΝΤ)
Получение суспензии клеток ΝΤ
1. 25 мл суспензии клеток ΝΤ субкультивируют в 75 мл свежей среды ΝΤ и перемешивают при 280°С и умеренном освещении.
2. Через два дня после субкультивирования 50 мл активно растущей культуры ΝΤ переносят в фальконовскую пробирку объёмом 50 мл и оставляют для осаждения на 5-10 мин.
3. Полученные в результате осаждения клетки ΝΤ ресуспендируют в эквивалентном количестве жидкой среды ΝΤ.
4. 200-мкл аликвоты клеточной смеси ΝΤ наносят пятнами на твёрдую среду ΝΤ и оставляют для высыхания на воздухе в течение 3-4 ч.
5. ΝΤ-пятна инкубируют при 280°С при умеренном освещении в течение 2 дней.
6. ΝΤ-пятна подвергают бомбардировке микрочастицами, как описано ниже, из расчёта пять пятен ΝΤ на промоторную конструкцию.
7. После бомбардировки ΝΤ-пятна инкубируют при 280°С и умеренном освещении в течение 3 дней.
8. Промоторную активность анализируют путём Си 8-окрашивания одного ΝΤ-пятна на промоторную конструкцию с помощью субстрата Х-глюкуронида. Оставшиеся четыре ΝΤпятна подвергают количественному ОИ8флуорометрическому анализу при использовании субстрата МПО. Указанные методики осуществляют, в основном, как описано 1ейет8ои, 1987, Р1аи1 Мо1еси1аг КероПег 5(4): 387-405.
Получение суспензии меченной золотом ДНК для бомбардировки микрочастицами
1. Суспензию частиц золота быстро перемешивают и обрабатывают ультразвуком в ледяной воде в течение 30 с.
2. Суспензию меченной золотом ДНК получают на льду добавлением 2 мкг ДНК, 25 мкл СаС12х2Н2О (2,5 М) и 5 мкл спермидина, свободного от оснований (0,1 М), к 25 мкл суспензии частиц золота (100 мг/мл).
3. Суспензию меченной золотом ДНК перемешивают с перерывами в течение 5 мин, а затем оставляют для осаждения на льду в течение 10 мин.
4. Супернатант в количестве 22 мкл собирают и выливают. Оставшуюся суспензию перемешивают и для бомбардировки микрочастицами используют 5-мл аликвоту.
5. Один препарат золота используют в расчёте на промоторную конструкцию. Этой суспензии меченной золотом ДНК достаточно для бомбардировки пяти ΝΤ-пятен.
Условия бомбардировки проточными частицами при использовании генного ружья
Вакуум при 25 мм ртутного столба. Давление гелия около 550 КПа. Высота платформы 10 см. Сетка для защиты мишени.
Используемые конструкции
Тестируемые конструкции: р6ЕМ6.1-Ои8, р6ЕМ6.2-6И8, р6ЕМ6.3-6И8, р6ЕМ6.4-6И8, Р6ЕМ1.1-ОИ8, р6ЕМ2.1-6И8, р6ЕМ3.1-6И8, р6ЕМ4.1-6И8, р6ЕМ5.1-6И8.
Контроли: рОЕМ358-Ои8
Результаты: результаты приведены на чертежах.
Сравнение промоторной активности ΒΒΤΥ6
1. Межгенный участок полной длины компонента 6 ΒΒΤν обладает промоторной активностью, сравнимой с таковой промотора ΟαΜν358 размером 800 п. о. из рВ1121.
2. 5'-Делеция размером 272 п. о. (рОЕМ6.2ОИ8) вызывает существенное увеличение промоторной активности, которая поддерживается другой 5'-делецией размером 112 п. о. (р6ЕМ6.3-6И8).
3. Промоторная активность существенным образом редуцирована другой 5'-делецией размером 75 п. о. (р6ЕМ6.4-6И8).
Значение результатов
Увеличение промоторной активности, наблюдаемое у плазмид рОЕМ6.1-Ои8 и р6ЕМ6.2-6И8 обеспечивается участком размером 272 п. о., окружающим СК-М, который может содержать возможную последовательность снижающей регуляции, ответственную за уменьшение промоторной активности. Уровни промоторной активности, наблюдаемые у плазмид р6ЕМ6.2-6И8, р6ЕМ6.3-6И8 и рОЕМ6.4ОИ8, указывают на то, что большая часть сильной промоторной активности, ассоциированной с межгенным участком ΒΒΤν6, связана с участком размером 112 п. о., расположенным на 3'конце СК-8/Ь. Важно, что этот участок содержит возможную промоторную структуру ΤΟΆ1Ь (положение +44), включающую коровую последовательность ΤΟΛί'ΌΤ. аналогично другим промоторным структурам и связывающим доменам транскрипционного фактора.
Сравнение промоторов ΒΒΤν1-6
1. Промотор ΒΒΤν-1 не обладает активностью при транзиторной трансформации суспензии ΝΤ-клеток.
2. Промотор ΒΒΤν-2 обладает наивысшей промоторной активностью среди шести ΒΒΤνкомпонентов. Уровень его активности в 2-3 раза превышает таковой промотора СаМV 358 размером 800 п. о., полученного из рВ1121.
3. Промоторы ΒΒΤν-3, -4 и -5 относительно слабоактивны. Уровень активности примерно на 50% ниже по сравнению с промотором СаМV 358.
4. Межгенный участок полной длины ΒΒΤν-6 обладает сходным уровнем промоторной активности, что и промотор СаМV 358.
Значение результатов
Отсутствие промоторной активности, ассоциированной с межгенным участком ΒΒΤν-1 может указывать на то, что данный промотор обладает в значительной степени тканеспеци23 фическим характером экспрессии или нуждается в транскрипционных факторах, отсутствующих в ядре клеток табака. Идентификация возможной структуры промотора (элемент типа 1 гена гистона Н3 пшеницы), ассоциированного с клеточной экспрессией, специфичной для 8фазы, может показать, что активность промотора ограничена интенсивно делящимися меристематическими тканями.
Значительные уровни промоторной активности, ассоциированные с межгенным участком ВВТУ-2, могут обусловить использование указанной последовательности в качестве возможного промотора для обеспечения высокого уровня экспрессии. Несмотря на тот факт, что ВВТУ инфицирует однодольные растения, результаты приведённых исследований позволяют предположить, что промоторы ВВТУ2-6 в различной степени активны в клетках двудольных растений.
3. Транзиторный анализ промоторной активности ВВТУ в растениях других видов
Бомбардировка микрочастицами клеток огурца
1. Пре-эмбриогенный каллус огурца субкультивируют на среде 8ОМ2ЕУ в течение двух недель до трансформации с помощью бомбардировки микрочастицами.
2. Каллус переносят на небольшие чашки со средой 8ОМ2ЕУ за 4 дня до трансформации с помощью бомбардировки микрочастицами.
3. Бомбардировку микрочастицами осуществляют, как описано выше.
4. Ουδ-активность выявляют в трансформированном каллусе с помощью ОИ8окрашивания при использовании Хглюкуронидного субстрата (через 2 дня после бомбардировки).
Используемые конструкции рВТ6.1, рВТ6.3, рВТ1.1, рВТ1121.
Результаты
1. Плазмиды рВТ6.1 и рВТ6.3 обнаруживают небольшое число синих фокусов (явление трансформации), как и рВ1121 после ОИ8окрашивания.
2. Плазмида рВТ1.1 не обнаруживает промоторной активности в каллусе огурца (т.е. не обнаруживается синих фокусов трансформации).
Электропорация протопластов цуккини Выделение протопластов цуккини.
1. Суспензию эмбриогенного каллуса цуккини объёмом 1,5 мл смешивают с 20 мл смеси фермента (Е3) и инкубируют при 250°С в темноте на медленном шейкере (30-50 об/мин) в течение 5-6 ч.
2. Протопласты выделяют путём фильтрования через сито с диаметром ячеек 450 мкм, 105 мкм и 51 мкм и центрифугирования при 4050 д в течение 5 мин.
3. Протопласты один раз отмывают раствором РА8 и ресуспендируют в известном объёме ТВ8.
4. Число клеток оценивают с помощью откалиброванного счётного стекла и доводят объём до содержания протопластов, равного 1106 клеток/мл.
5. 10 мкг плазмидной ДНК добавляют к 1 мл протопластов и инкубируют на льду в течение 10 мин.
Электропорация протопластов цуккини.
1. Протопласты: смесь ДНК подвергают электропорации в кювете ВюКаб (электродный просвет 0,4 см) с 10 мкг плазмидной ДНК с помощью прибора для электропорации Оеие РиИаг (ВюКаб) (3 импульса при 300 Вольт, продолжительность импульса 10 миллисекунд, интервал между импульсами 100 миллисекунд).
2. Протопласты инкубируют в течение 10 мин на льду и осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в микроцентрифуге.
3. Протопласты отмывают один раз в культуральной среде 415 А и ресуспендируют в 1 мл 415 А.
4. Протопласты переносят в 1 2-луночный планшет для микротитрования и инкубируют в течение 48 ч на медленном шейкере в темноте.
5. После инкубирования протопласты собирают центрифугированием и исследуют на Ουδ-активность.
Флуорометрический ОИ8-анализ.
1. 5 мкг экстрагированного из протопластов белка используют для стандартного флуорометрического анализа (реагент исследования белка ВюРеб).
2. Объём доводят до 100 мкл буфером для экстрации белка и инкубируют при добавлении 100 мкл Μυθ-субстрата (2 мМ) при 370°С в течение 30 мин.
3. Реакции останавливают добавлением 1 мл Иа2СО3.
4. Энзиматическую активность оценивают против 4-МИ стандартной кривой (0-500 нМ) при использовании флуорометрического спектрофотометра (возбуждение - 365 нм; эмиссия 455 нм; время интеграции - 10).
Ουδ-активность выявляют с помощью флуорометрического анализа, описанного 1еДет8ои, 1987, Раи! Мо1еси1аг Керопег 5(4): 387-405. Используемые конструкции: рВТ6.1, рВТ1.1, рВ1121.
Результаты
Конструкция Ουδ-активность (рто1
Μυ/мин/мл белка) рВ1101.3 0 рВ1121 10,000 рВТ1.1 <1000 рВТ6.3 22,000
Не обнаруживают Ουδ-активности в лишенном Ουδ-промотора бинарном векторе (рВ1101.3).
Уровни СИ8-активности, обусловленные фрагментом межгенного участка ВВТУ6 (рВТ6.3) размером 239 п. о., в 2 раза выше по сравнению с уровнем активности промотора 358 СаМУ (рВ1121), имеющего размер 800 п. о.
Не обнаруживается СИ8-активность или она обнаруживается на небольшом уровне у промотора ВВТУ1 (рВТ1.1).
Бомбардировка микрочастицами клеточной суспензии пшеницы
1. Суспензию клеток пшеницы субкультивируют в 50 мл среды \УТЫ в течение 4 дней перед бомбардировкой микрочастицами.
2. Клетки пшеницы осаждают низкоскоростным центрифугированием и ресуспендируют в 10 мл среды \УТБ1.
3. Клетки переносят на стерильную фильтрованную бумагу непосредственно перед бомбардировкой.
4. Бомбардировку микрочастицами осуществляют, как описано ранее.
5. Через 2 дня после бомбардировки трансформированную суспензию клеток пшеницы подвергают Οϋδ-окрашиванию при использовании Х-глюкуронидного субстрата.
Используемые конструкции: рВТ1.1, рВТ2.1, рВТ3.1, рВТ4.1, рВТ5.1, рВТ6.1, рВ1121, ΌΜ8052 (актин риса усиливает экспрессию, направляемую СИ8-промотором).
Результаты
1. Актин риса усиливает промоторную активность; >5000 синих фокусов на процедуру трансформации.
2. РВ1121 образует в среднем примерно 70 синих фокусов на процедуру трансформации.
3. Изо всех тестированных промоторных конструкций ВВТУ только рВТ2.1 обнаруживает активность, генерируя примерно 100 синих фокусов на процедуру трансформации.
Бомбардировка микрочастицами эмбриогенного каллуса мужского цветка банана
1. Эмбриогенную культуру банана Кавендиша культивара Вильямс получают при использовании мужских цветков, как описано Е§са1ап! с1 а1., 1994, 1иУйго Се11и1аг апб Эсус1оршеп1а1 Вю1оду 30Р: 181-186. Культуру поддерживают в иммерсионной системе в жидкой среде МР (Е8са1ап1 е1 а1., 1994, 1пУйго Се11и1аг апб Пеуе1оршеп1а1 Вю1оду 30Р: 181-186).
2. За пять дней до бомбардировки микрочастицами эмбриогенный каллус переносят на твёрдую среду МР.
3. Ткань подвергают бомбардировке микрочастицами, как описано ранее.
4. Транзисторную СИ8-активность визуализируют Οϋδ-окрашиванием при использовании Х-глюкуронидного субстрата через 2 дня после бомбардировки.
Используемые конструкции:
РСЕМ2.1-СИ8, рСЕМ3.1-СИ8,
РСЕМ4.1-СИ8, рСЕМ5.1-СИ8, рСЕМ-ИЫ, (убиквитиновый промотор кукурузы обеспечивает СИ8-экспрессию).
Результаты
1. Убиквитиновый промотор кукурузы обеспечивает высокий уровень экспрессии СИ8 в указанном типе ткани с интенсивным синим окрашиванием фокусов трансформации (точное количество фокусов определить не удаётся из-за их большого числа и интенсивности окраски).
2. Среди тестированных промоторных конструкций все промоторы обнаруживают низкий уровень активности (<10 синих фокусов на процедуру трансформации). В зависимости от проявляемой активности, определяемой по числу фокусов трансформации, плазмиды располагают в следующем порядке: СЕМ2.1-СИ8 (наивысший уровень активности), рСЕМ4.1-СИ8, рСЕМ3.1-СИ8 и рСЕМ5.1-СИ8 (наиболее низкий уровень активности).
Значение результатов
Результаты исследования транзиторной промоторной активности ВВТУ у альтернативных видов растений показывают, что промотор ВВТУ6 (в особенности фрагмент размером 239 п. о., рВТ6.3) по-видимому, активен в недифференцированных тканях тыквенных (двудольных).
Результаты бомбардировки суспензии клеток пшеницы показывают, что только промотор ВВТУ2 обладает значительной активностью. Это свидетельствует о том, что, по крайней мере, один из ВВТУ-промоторов в определённой степени активен в однодольных растениях, семейства злаковых.
Исследования транзиторной экспрессии при использовании эмбриогенной культуры банана обнаруживают, что промоторы ВВТУ, тестируемые на сегодняшний момент времени, обладают некоторым уровнем активности в растениях-хозяевах. И опять же, самым сильным из тестируемых промоторов ВВТУ является компонент 2 ВВТУ, что позволяет рассматривать его как важный промотор, который будет использоваться в дальнейшем.
4. Стабильная трансформация суспензии клеток ΝΤ путем инфицирования агробактериями
1. За два-три дня трансформации 5 мл культуры ЬВ, содержащей 100 мкг/мл канамицина, инокулируют необходимым трансформированным штаммам агробактерий из 40%-ного глицеринового исходного концентрата.
2. Клетки ИТ используют на 5-7-ой день после субкультивирования (4 мл культуры используют для одной трансформации, 4 мл культуры без бактерий служат контролем). Примечание: для каждой конструкции используют два эксперимента по трансформации.
3. В расчёте на 1 мл клеток ИТ добавляют 1 мкл ацетосирингона (20 мМ в этаноле).
4. С помощью 5 мл-пипетки клетки ΝΤ перемешивают около 20 раз для индукции повреждений и усиления трансформации.
5. 100 мкл культуры агробактерий (плотность роста) добавляют в планшет для микротитрования, содержащий 4 мл обработанных клеток ΝΤ, и интенсивно перемешивают.
6. Планшеты инкубируют в течение 3 дней при 280°С при умеренном освещении.
7. После инкубирования 10 мл жидкой среды ΝΤ, содержащей 500 мкг/мл карбенициллина (ΝΤΟ) добавляют в каждую лунку.
8. Клетки центрифугируют при 1000 об/мин в течении 4 мин в 50-мл фальконовских пробирках с доведением объёма с помощью ΝΤΟ.
9. Отмывание повторяют два раза.
10. Клетки ресуспендируют в 5 мл ΝΤΟ и 2 мл помещают на твёрдую среду ΝΤΚΟ двух видов (100 мкг/мл канамицина, 500 мкг/мл карбенициллина). Планшеты инкубируют при 280°С при умеренном освещении.
11. Через 3-4 недели после инфицирования трансформанты субкультивируют по отдельности и поддерживают в селективных условиях в течение двух недель.
12. Промоторную активность определяют путём Ουδ-окрашивания при использовании Хглюкуронидного субстрата.
Используемые конструкции: рВТ6.1 (3 линии ΝΤ), рВТ6.2 (3 линии ΝΤ), рВТ6.3 (2 линии ΝΤ), рВТ2.1 (25 линий ΝΤ).
Результаты
1. Определяют сильную активность в стабильно трансформированном каллусе ΝΤ с промоторными конструкциями ΒΒΤν.
2. Некоторые различия в экспрессии между различными линиями трансформированных ВТ2.1 клеток ΝΤ скорее всего обусловлены позиционным эффектом (локализацией интегрированной ДНК в геноме хозяина) и количеством интегрированных копий.
Значение результатов
Указанные эксперименты показывают, что промоторы ΒΒΤν6 и ΒΒΤν2 высоко активны в стабильно трансформированных недифференцированных клетках табака. Эти результаты согласуются с таковыми, полученными при бомбардировке микрочастицами, когда промоторы обнаруживают сильную транзиторную активность. Более того, приведённые результаты подтверждают, что активность указанных промоторов не определяется в значительной степени стабильной интеграцией в геном хозяина.
5. Стабильная трансформация табака путем опосредованного агробактериями инфицирования листовых дисков
1. Путём электропорации в штамм агробактерий ЬВА4404 вводят промоторные бинарные конструкции.
2. Трансформированные агробакгерий выращивают на селективной среде с канамицином (100 мкг/мл) и подтверждают наличие в них промоторной конструкции посредством модифицированной процедуры щелочного лизиса.
3. За два-три дня до трансформации 5 мл культуры трансформированных агробакгерий в среде ЬВ инициируют из единичной колонии или 40%-ного глицеринового исходного концентрата и перемешивают при 280°С.
4. Культуру разводят в соотношении 1:20 средой ЬВ и переносят в стерильный флакон объёмом 10 мл.
5. Удаляют листья у 3-6 недельного растения табака (ΝίοοΙίαηα хап(НН) и разрезают на кусочки размером 1 см х 1 см.
6. Нарезанные кусочки переносят в разбавленную культуру агробактерий и оставляют погружёнными на 10-15 мин.
7. Затем кусочки высушивают на стерильной фильтрованной бумаге, помещают верхней (адаксиальной) стороной на среду М8 104 и инкубируют при 280°С до тех пор, пока не будет виден слабый рост бактерий (2-3 дня).
8. Кусочки листьев переносят на селективную среду М8 104 (100 мкг/мл канамицина, 200 мкг/мл тиментина) и инкубируют при умеренном освещении при 280°С.
9. Примерно через 2 недели на инфицированной стороне становится виден каллус корончатых галлов. Ещё через 2-5 недель появляются ростки.
10. Когда стебли становятся хорошо видимыми, ростки отрезают и помещают на среду ускорения М8 (100 мкг/мл канамицина и 200 мкг/мл тиментина).
11. Активно развивающиеся растеньица (с корневой системой) поддерживают в культуре в условиях селекции и возможные трансформанты подвергают Οϋδ-окрашиванию при использовании Х-глюкуронидного субстрата.
12. В целом, для каждой промоторной конструкции получают 6-12 возможных трансформантов.
Используемые конструкции
Тестируемые конструкции: рВТ6.1 , рВТ6.2, рВТ6.3, рВТ6.4, рВТ2.1, рВТ2.2, рВТ2.3, рВТ2.4, ρΒΤ1.1, рВТ3.1, рВТ4.1, рВТ5.1. Контроли: рВТ121.
Результаты
1. Выявляют сильную конститутивную Ουδ-экспрессию в листьях, стеблях и корнях растений, трансформированных рВ1121.
2. Выявляют слабую, ограниченную флоэмой Ουδ-экспрессию в срезах листьев и корней примерно 10% растеньиц табака, трансформированных промоторными конструкциями ΒΒΤν. У оставшихся 90% трансформантов не выявляется Ουδ-экспрессия в листьях и корнях.
Значение результатов
Результаты, полученные при Ουδокрашивании тканей большинства растений та29 бака (90%), стабильно трансформированных промоторными конструкциями ВВТУ, показывают, что указанные промоторы обладают слабой активностью в целых растениях или дифференцированных тканях. То обстоятельство, что некоторые межгенные участки ВВТУ (компоненты 2 и 6) обнаруживают высокие уровни экспрессии в транзиторных системах (бомбардировка клеточной линии МсоЕапа 1аЬасит микрочастицами), указывает на то, что активность указанных промоторов может быть ограничена недифференцированными типами клеток, или на молчание таких промоторов при переходе от недифференцированного каллуса к дифференцированным типам клеток. Это предположение поддерживается дальнейшими экспериментами, в которых каллус регенерированный из листьев стабильно трансформированных растений табака (не обнаруживающих СИ8активности) при окрашивании обнаруживает различные уровни СИ8-экспрессии.
Преимущество такого уникального характера экспрессии может заключаться в обеспечении селективной устойчивости, поскольку большинство трансформационных систем на основе растений базируется на строгой селекции трансформированной ткани во время стадии недифференцированных клеток. Таким образом, кассета трансформации, содержащая ВВТУпромотор (компонент 2 и 6), направляющая экспрессию №ТП, должна обеспечивать сильную устойчивость к канамицину в трансформированной ткани во время ранних стадий трансформации растения (фаза каллуса), но когда клетки становятся дифференцированными (т.е. образуются ростки, листья и т. д.) промотор должен выключаться. Поскольку экспрессия генов селективной устойчивости к антибиотику и гербицидам в трансгенных растениях составляет основную проблему в некоторых странах, использование такого промотора может иметь большие преимущества.
6. Анализ промотора ВВТУ, направляющего экспрессию ΝΡΤΙΙ, обусловленную конструкцией ВВТУб-ΝΡΤΙΙ
1. Фрагмент размером 239 п. о. межгенного участка компонента 6 ВВТУ из рИС6.3 клонируют в положении црйгеаш (выше) по отношению к гену №ТП размером 800 п. о. с терминатором СаМУ 358 как ВатН1 и РкИ фрагмент.
2. Полученную кассету промотор ВВТУ6 (239 п. о.)/ЯРТП/терминатор СаМУ 358 субклонируют как 8ас1 и ХЬа1 фрагмент между левой и правой границами Т-ДНК агробактерий в бинарный вектор рТАВ5.
3. Кассету промотор СаМУ 358/(530 п. о.)/СИ8/СаМУ 358 терминатор (200 п. о.) из рСИ82 клонируют в положении бо^пйгеат (ниже) как ЕсоК1-фрагмент (см. фиг. 14).
4. Полученный вектор рВТб.З-ΝΡΤ, детально описанный ниже, впоследствии исполь зуют для опосредованной агробактериями трансформации табака (как описано ранее).
Анализ трансформантов
1. Восемь, возможных трансформантов получают после опосредованной агробактериями трансформации табака (№соИапа хап1Ьл) конструкцией рВТ6.3-№Т. Указанные восемь растений отбирают на среде, содержащей канамицин в концентрации 100 мкг/мл.
2. Уровни ΝΡΤΙΙ-экспрессии у указанных растений оценивают с помощью количественного теста №ТР11-ЕЬ18А (5 праймирование 3 праймирование), согласно рекомендациям изготовителя. Сравнение проводят между тканями различных типов (листья и корни) и между промоторами (СаМУ 358 промотор и промотор нопалинсинтазы).
Результаты
Результаты экспериментов приведены на чертежах.
Высокие уровни экспрессии №ТП обнаруживают в листьях и корнях растений, содержащих промотор СаМУ 358, направляющей экспрессию №ТП.
В целом, уровни №ТП у восьми растений, экспрессирующих №Т под контролем промотора ВВТУ6, значительно ниже по сравнению с таковыми при использовании промотора СаМУ 358. Уровни экспрессии №ТП в листьях не превышают 6 нг ΝΡΤΙΙ/мг белка. Уровни экспрессии в корнях немного выше, но не превышают 12 нг ΝΡΤΙΙ/мг белка. Указанные величины экспрессии сравнимы с таковыми, обеспечиваемыми промотором пок.
Значение результатов
Указанные эксперименты показывают, что фрагмент межгенного участка ВВТУ6 размером 239 п. о. способен обеспечивать селективную устойчивость стабильно трансформированных растений табака. Как предсказано, уровни экспрессии №ТП у стабильно трансформированных растений (листья и корни) были очень низкими, но сравнимыми с таковыми, обеспечиваемыми промотором нопалинсинтазы.
7. Регуляторные элементы межгенных участков ВВТУ (I) ТАТА-бокс
- обнаружен в ВВТУ-компонентах и локализован в положении ир81геат (выше) по отношению к стартовому кодону транскрипции,
- содержит консервативную последовательность из 9 нуклеотидов СТАТаЛаЛАаЛА,
- отвечает за правильную инициацию транскрипции.
(II) ТСА1-а структура
- содержит консенсусную последовательность ТСАССТАА,
- ак-1-связывающая структура, вовлечённая в регуляцию транскрипции.
(III) ТСА1-Ь структура гексамерная связывающая структура с консенсусной последовательностью ТСАССТ.
(IV) Промоторный элемент типа 1 гена гистона Н3 пшеницы (гексамерная структура)
- консенсусная последовательность АССТАА,
- расположен сразу же в положении 3' по отношению к СВ-8/Б во всех компонентах ВВТУ,
- гексамерная структура, связывающая родственные ТАЕ-1 и НВР-1 белки,
- связан с экспрессией, специфичной для 8фазы клеточного цикла. Предполагается (Ыакауата е! а1., 1992, ЕЕВ8 Бейегз, 300: 167-170), что промоторная активность ограничена недифференцированными активно делящимися клетками.
(V) АбЫ И81
- консенсусная последовательность ССАСС,
- связывающий фактор неизвестен,
- обнаружен во всех межгенных участках ВВТУ (в вирионах или смысловой цепи).
(VI) АбМ-И83
- консенсусная последовательность ССТСС,
- связывающий фактор неизвестен,
- обнаружен во всех межгенных участках ВВТУ (в вирионах или смысловой цепи).
8. Среды и растворы для культивирования тканей растений
Среда М80
М8 соли мио-инозитол, 100 мкг/мл тиамин-НС1, 10 мкг/мл никотиновая кислота, 1 мкг/мл пиридоксин-НС1, 1 мкг/мл сахароза, 3%
ТС-агар, 0,7% рН 5,7
Твёрдая среда ЫТ
ЫТ жидкая среда
ТС-агар, 0,7%
Среда М8 104
М8О бензиладенин, 1 мкг/мл нафталинуксусная кислота, 0,1 мкг/мл рН 5,7
Среда ЫТС
ЫТ жидкая среда карбенициллин, 500 мкг/мл
Среда для селекции М8
М8 104 канамицин, 100 мкг/мл тиментин, 200 мкг/мл
Среда ЫТКС
ЫТ твёрдая среда канамицин, 100 мкг/мл карбенициллин,
500 мкг/мл
Среда для укоренения М8
М8О+0,6% ТС-агар канамицин, 100 мкг/мл тиментин, 200 мкг/мл
Среда 8ОМ2ЕУ
Соли М8
Мио-инозитол, 1 мг/мл сахароза, 3% ТС-агар, 0,7%
2,4-Ό, 10 мкМ ВАР 1,5 мкМ Жидкая среда ЫТ
Соли М8 сахароза, 3% МЕ8 0,5 мкг/мл В1 -инозитол, 1 мкг/мл КН2РО4, 180 мкг/мл
2,4-Ό, 0,222 мкг/мл
РН5,7
Среда \УТБ1
Соли М8
САВ А органические вещества Б-аспарагин, 5 мкг/мл
Б-глицин, 10 мкг/мл жидкость кокосового ореха С1Ьсо, 2% ΝΖ амин, 50 мкг/мл глюкоза, 10 мг/мл сахароза, 20 мг/мл маннитол, 20 мг/мл
2,4-Ό, 2 мкг/мл кинетик, 0,2 мкг/мл рН 5,8
Раствор РУ8 (1 литр) хлорид кальция 735 мг МЕ8 639,6 мг маннитол 109,3 г рН 5,6
Смесь ферментов (Е3) 2,0% целлюлаза (В-10) 0,5% мацерозим (В-10) 0,5% гемицеллюлаза 1,0% пектолаза (Υ23) 0,5% В8А
Объём доводят с помощью РУ8 (рН 5.6)
Раствор ТВ8 (200 мл) тризма-основание 0,73 г хлорид натрия 1,75 г хлорид кальция 0,18 г маннитол 9,2 г рН 9,0
9. Значение СК-М
Получают упорядоченные последовательности СВ-М компонентов 1-6 ВВТУ. Повидимому, данный участок действует как возможный сайт связывания праймера и принимает участие в репликации ВВТУ. Несмотря на то, что СВ-М ВВТУ содержит два прямых ССповтора, которые напоминает 8р1-связывающей сайты, обнаруженные в промоторах генов животных и вирусов (например вируса полосатости кукурузы), по-видимому, данный участок не обладает способностью усиливать активность промотора. Указанная гипотеза поддерживается 5'-делеционным анализом межгенного участка ВВТУ6, который показывает, что удаление области размером 272 п. о., включающей СВ-М, приводит к значительному увеличению промоторной активности. Более того, предваритель33 ные исследования при использовании межгенного участка ΒΒΤν2 показывают, что не происходит уменьшения промоторной активности при удалении СВ-М.
10. Заключение
Авторы изобретения показали, что межгенные участки ДНК-последовательностей компонентов 1-6 ΒΒΤν обладают промоторной активностью и данная активность варьирует от одного межгенного участка к другому. При использовании транзиторных и стабильных систем экспрессии авторы продемонстрировали, что промоторы ΒΒΤν, по-видимому, обнаруживают тканеспецифичный характер экспрессии, который может быть аналогичен способу репликации и аккумуляции ΒΒΤν в его природном хозяине.
Более того, авторы идентифицировали возможные регуляторные элементы, по крайней мере, в одном из промоторов ΒΒΤν (компонент 6), которые, по-видимому, влияют на экспрессию репортёрного гена.
ΒΒΤν - это вирус, который инфицирует однодольные растения рода Ми5а. Поэтому можно ожидать, что промоторы ΒΒΤν обнаруживают наиболее сильную активность при заражении банановых деревьев и других однодольных растений. Исследования транзиторной экспрессии при использовании суспензий клеток пшеницы и эмбриогенного каллуса бананов показали, что некоторые промоторы ΒΒΤν в определённой степени активны в таких системах. Важно, что два из промоторов ΒΒΤν (ΒΒΤν 2 и 6) обеспечивают высокий уровень транзиторной экспрессии в недифференцированных тканях двудольных растений (табак, огурец и цуккини).
Описание иллюстраций
На фиг. 1(а), (Ь), (с), (б) и (е) приведены соответственно нуклеотидные последовательности ДНК-компонентов 2, 3, 4, 5 и 6 и выведенные аминокислотные последовательности главной ОВЕ указанных компонентов. Возможные ТАТА-боксы набраны жирным шрифтом и подчёркнуты двойной линией, стержневые петлевые структуры набраны курсивом и подчёркнуты, при этом стержневые последовательности отмечены стрелками; возможные сигналы полиаденилирования набраны жирным шрифтом и подчёркнуты; СВ-8Ь подчёркнуты; СВ-М набраны жирным курсивом; ОВЕ набраны жирным шрифтом.
На фиг. 2 приведены результаты определения ориентации смысловой цепи ДНКкомпонентов 2-6 в вирионах ΒΒΤν. Каждый блот по отдельной обрабатывают пробой, представляющей собой 32Р-меченный олигонуклеотид (в случае компонента 2) или полноразмерный РНК-транскрипт (в случае компонентов 36), специфичный по отношению к смысловой или комплементарной цепям каждого компонента вирионов ΒΒΤν. Панель (а): блоты гиб ридизуют с пробами, комплементарными к последовательностям компонентов, приведённых на фиг. 1. Панель (Ь): блоты гибридизуют с пробами, имеющими последовательности, приведённые на фиг. 1. Линия 1: полноразмерный клон каждого соответствующего компонента; линия 2: нуклеиновая кислота здорового банана; линия 3: ДНК, экстрагированная из очищенных вирионов ΒΒΤν.
На фиг. 3. приведены упорядоченные стержневые-петлевые общие участки (СВ-8Ь) ДНК-компонентов 1-6 ΒΒΤν. Стержневаяпетлевая структура в каждом компоненте подчеркнута, а петлевая последовательность набрана курсивом. Звёздочками отмечены консервативные нуклеотиды в составе всех компонентов. Точки включены в некоторые последовательности, чтобы максимально упорядочить их и облегчить сравнение.
На фиг. 4 приведены упорядоченные последовательности общих участков (СВ-М) ДНКкомпонентов 1-6 ΒΒΤν. 15-нуклеотидная обогащённая ОС последовательность подчёркнута. Звёздочками отмечены консервативные нуклеотиды в составе всех компонентов, а чёрными треугольниками обозначены консервативные нуклеотиды в пределах первых 26 нуклеотидов компонентов 2-6, перекрывающих делецию в компоненте 1. Точки включены в некоторые последовательности, чтобы максимально упорядочить их и повторяющиеся неполные последовательности набраны курсивом.
На фиг. 5 приведена диаграмма возможной организации генома ΒΒΤν. (I). Общая организация генома всех компонентов. (II). Линейная структура генома каждого компонента.
На фиг. 6 приведены различные конструкции межгенного участка компонента 1.
На фиг. 7 приведены различные конструкции межгенного участка компонента 2.
На фиг. 8 приведены различные конструкции межгенного участка компонентов 3 и 4.
На фиг. 9 приведены различные конструкции межгенного участка компонента 5.
На фиг. 10 приведены различные конструкции межгенного участка компонента 6.
На фиг. 11 приведены упорядоченные последовательности межгенных участков компонентов 1-6 ΒΒΤν. ЬЬ!урго1 - вставка ρΒΤ1.1; ЬЬ!урго2 - вставка рВТ2.1; ЬЫурго3 - вставка рВТ3.1; ЬЬ!урго4 - вставка рВТ4.1; ЬЬ1урго5 вставка ρΒΤ5.1; ЬЬ1урго6 - вставка рВТ6.1. Обратите внимание: в ЬЬ!урго1 Абй1 И81 локализован в положении 1004. В ЬЬ!урго2 Τ0Α-1Ε локализована в положениях 952 и 1053, Абй1 И83 локализован в положении 137, Ο-ΒΟΧ локализован в положении 225. В ЬЫурго3 Абй1 И81 локализован в положении 1069. В ЬЬ!урго4 Τ0Λ-1Ε локализована в положении 182; АбН1 И81 локализована в положении 1037, Ο-ΒΟΧ локализован в положениях 45, 63, 128 и 148. В ЬЬ!урго5 Τ6А-1Ь локализована в положении 96,
А4111 И81 локализован в положении 1012, СВОХ локализован в положениях 45 и 64. В ЬЬ!урго6 ТСА-1а локализована в положении 1083, ТСА-1Ь локализована в положении 44, А411Ш81 локализован в положении 173, С-ВОХ локализована в положении 46. Также обратите внимание, что С-ВОХ представляет собой растительный промотор, ассоциированный с транскрипционной коровой последовательностью САССТС.
На фиг. 12 приведена последовательность вставки рВТ1.ГЫТ (982 п. о.). Обратите внимание, что последовательность межгенного участка компонента 1 ВВТУ основана на небольшой открытой рамке считывания.
На фиг. 13 приведена последовательность вставки рВТ6.1 (а) (622 п. о.); рВТ6.2 (Ь) (351 п. о.); рВТ6.3 (с) (238 п. о.) и рВТ6.4 (4) (182 п. о.). Обратите внимание, что выделенный участок в рВТ6.3 представляет собой последовательность, ассоциированную с большей частью промоторной активности межгенного участки компонента
6. Указанный участок удалён в рВТ6.4.
На фиг. 14 приведена схема конструкции ВВТУ6-ЫРТП.
Claims (14)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента1 вируса верхушки грозди бананов (ВВТУ), показанной на фиг. 11 как последовательность ЬЬ!урго 1 (рВТ1.1), по меньшей мере на 80%, и кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ.
- 2. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента2 ВВТУ, показанной на фиг. 11 как последовательность ЬЫурго 2 (рВТ2.1), по меньшей мере на 80%, и кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ.
- 3. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента3 ВВТУ, показанной на фиг. 11 как последовательность ЬЫурго 3 (рВТ3.1), по меньшей мере на 80%, и кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ.
- 4. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента4 ВВТУ, показанной на фиг. 11 как последовательность ЬЫурго 4 (рВТ4.1), по меньшей мере на 80%, и кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ.
- 5. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента5 ВВТУ, показанной на фиг. 11 как последовательность ЬЫурго 5 (рВТ5.1), по меньшей мере на 80%, и кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ.
- 6. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента 6 ВВТУ, показанной на фиг. 11 или 13 (а) как последовательность ЬЫурго 6 (рВТ6.1), по меньшей мере на 80%, и кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ.
- 7. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности рВТ6.2, показанной на фиг. 13 (в), по меньшей мере на 80%, кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ.
- 8. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности рВТ6.3, показанной на фиг. 13 (с), по меньшей мере на 80%, кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ.
- 9. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности рВТ6.4, показанной на фиг. 13 (4), по меньшей мере на 80%, кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ.
- 10. Молекула ДНК по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что способна к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ в клетках однодольного растения или в таком растении.
- 11. Молекула ДНК по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что способна к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ в клетках двудольного растения или в таком растении.
- 12. Молекула ДНК по любому из пп.1-9, способная к осуществлению транскрипции гена не ВВТУ в недифференцированной ткани двудольного растения.
- 13. Способ экспрессии гена не ВВТУ в растительной клетке, включающий получение образца, содержащего выделенную молекулу ДНК по любому из пп. 1-9;получение препарата растительной клетки в таких условиях, которые делают возможным введение молекулы ДНК в растительную клетку и индукцию экспрессии гена не ВВТУ в растительной клетке, содержащей указанную молекулу ДНК.
- 14. Линия трансформированных растительных клеток, содержащих молекулу ДНК по любому из пп.1-9.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPN3285A AUPN328595A0 (en) | 1995-05-31 | 1995-05-31 | Intergenic regions of banana bunchy top virus |
| PCT/AU1996/000335 WO1996038554A1 (en) | 1995-05-31 | 1996-05-31 | Intergenic regions of banana bunchy top virus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA199700438A1 EA199700438A1 (ru) | 1998-10-29 |
| EA002180B1 true EA002180B1 (ru) | 2002-02-28 |
Family
ID=3787627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA199700438A EA002180B1 (ru) | 1995-05-31 | 1996-05-31 | Молекулы днк межгенных участков вируса верхушки грозди бананов, способ экспрессии гена в растительной клетке с помощью указанных молекул днк и линия трансформированных растительных клеток, содержащая такие молекулы днк |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6127604A (ru) |
| EP (1) | EP0832212A4 (ru) |
| JP (1) | JPH11506322A (ru) |
| KR (1) | KR19990022205A (ru) |
| CN (1) | CN1190436A (ru) |
| AU (1) | AUPN328595A0 (ru) |
| BR (1) | BR9608701A (ru) |
| CA (1) | CA2222727A1 (ru) |
| EA (1) | EA002180B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ308415A (ru) |
| WO (1) | WO1996038554A1 (ru) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996006932A1 (en) * | 1994-08-30 | 1996-03-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Plant transcription regulators from circovirus |
| GB9804293D0 (en) * | 1998-02-27 | 1998-04-22 | Innes John Centre Innov Ltd | Plant virus promoter and detection |
| JP4797141B2 (ja) * | 2000-03-28 | 2011-10-19 | ファーマキュール バイオインダストリーズ ピーティーワイ リミテッド | 選択された遺伝子配列の部位特異的発現および／または発生上調節される発現を可能にする、より大きいヌクレオチド配列から閉環状で放出することができる構築物 |
| AU2005268917B2 (en) | 2004-08-02 | 2010-05-20 | Basf Plant Science Gmbh | Method for isolation of transcription termination sequences |
| US8901372B2 (en) * | 2009-02-25 | 2014-12-02 | University Of Hawaii | Plant resistance to banana bunchy top virus |
| CN102146411B (zh) * | 2011-01-06 | 2013-01-02 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 新型双功能抗瘢痕和组织纤维化寡聚核苷酸药物 |
| CN103911351B (zh) * | 2014-03-21 | 2015-12-30 | 浙江大学 | 分泌抗香蕉束顶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
| CN108795839B (zh) * | 2018-07-02 | 2022-02-11 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种石斛单细胞悬浮培养的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4306832C1 (de) * | 1993-03-04 | 1994-02-24 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung einer Virus-DNA als Promotor zur gewebespezifischen Expression von Genen in transgenen Pflanzen |
| WO1996006932A1 (en) * | 1994-08-30 | 1996-03-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Plant transcription regulators from circovirus |
| WO1996038564A1 (en) * | 1995-05-30 | 1996-12-05 | Queensland University Of Technology | Dna sequences of banana bunchy top virus |
-
1995
- 1995-05-31 AU AUPN3285A patent/AUPN328595A0/en not_active Abandoned
-
1996
- 1996-05-31 CA CA002222727A patent/CA2222727A1/en not_active Abandoned
- 1996-05-31 JP JP8536041A patent/JPH11506322A/ja active Pending
- 1996-05-31 EP EP96919486A patent/EP0832212A4/en not_active Withdrawn
- 1996-05-31 NZ NZ308415A patent/NZ308415A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-05-31 US US08/973,068 patent/US6127604A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-31 KR KR1019970708684A patent/KR19990022205A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-05-31 BR BR9608701-3A patent/BR9608701A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-05-31 EA EA199700438A patent/EA002180B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-05-31 CN CN96195418A patent/CN1190436A/zh active Pending
- 1996-05-31 WO PCT/AU1996/000335 patent/WO1996038554A1/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ308415A (en) | 1999-04-29 |
| KR19990022205A (ko) | 1999-03-25 |
| CN1190436A (zh) | 1998-08-12 |
| AUPN328595A0 (en) | 1995-06-22 |
| BR9608701A (pt) | 1999-12-07 |
| MX9709221A (es) | 1998-03-31 |
| CA2222727A1 (en) | 1996-12-05 |
| EP0832212A1 (en) | 1998-04-01 |
| EP0832212A4 (en) | 2002-06-12 |
| US6127604A (en) | 2000-10-03 |
| JPH11506322A (ja) | 1999-06-08 |
| WO1996038554A1 (en) | 1996-12-05 |
| EA199700438A1 (ru) | 1998-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU737966B2 (en) | Sugarcane bacilliform virus promoter | |
| JP5655947B2 (ja) | 成葉特異的プロモーター | |
| CN118256519B (zh) | 抗病相关蛋白TaMYB22在调控植物条锈病抗性中的应用 | |
| CN110857316B (zh) | 花青素合成相关蛋白及其在调控植物花青素含量中的应用 | |
| US9447421B2 (en) | Methods for Agrobacterium-mediated transformation of sugar cane | |
| JP3538428B2 (ja) | 植物プロモーターおよび該プロモーターを用いた遺伝子発現方法 | |
| EA002180B1 (ru) | Молекулы днк межгенных участков вируса верхушки грозди бананов, способ экспрессии гена в растительной клетке с помощью указанных молекул днк и линия трансформированных растительных клеток, содержащая такие молекулы днк | |
| CN113621644B (zh) | 筛选转基因植物的组合物和方法 | |
| EP1190039B1 (en) | Gene encoding short integuments and uses thereof | |
| US5824872A (en) | A constitutive promoter from tobacco | |
| KR100440369B1 (ko) | 식물 번역 조절 종양 단백질 유전자의 프로모터 시스템 | |
| JP2002539779A (ja) | 植物における導入遺伝子の発現のためのバナナプロモーターおよびメロンプロモーター | |
| US7557264B2 (en) | Gossypium hirsutum tissue-specific promoters and their use | |
| CN110317826B (zh) | 调控PvGRF9含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的应用 | |
| JP2001501804A (ja) | タバコ由来プロモーター | |
| KR20230107724A (ko) | 변형된 식물 배유체 특이 프로모터 및 이의 용도 | |
| JP5472089B2 (ja) | 光合成組織における遺伝子発現制御に関わるｄｎａ | |
| US6664384B1 (en) | Duplicated cassava vein mosaic virus enhancers and uses thereof | |
| US6930182B1 (en) | Composition and methods of using the Mirabilis mosaic caulimovirus sub-genomic transcript (Sgt) promoter for plant genetic engineering | |
| CN100432101C (zh) | 一种培育抗病毒番茄的方法 | |
| KR102714089B1 (ko) | 이종 바이러스의 RNA 침묵억제 단백질을 포함하는 Potato virus X 기반 재조합 식물 발현 벡터 및 이의 용도 | |
| AU697307B2 (en) | Intergenic regions of banana bunchy top virus | |
| KR100410738B1 (ko) | 식물 번역 조절 종양 단백질 유전자의 프로모터 시스템 | |
| JPH0589A (ja) | 遺伝子発現の誘導方法 | |
| JP2004357568A (ja) | アビジンをコードする人工合成遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |