DK175489B1

DK175489B1 - Immunogent konjugat og fremstilling deraf samt vaccine indeholdende dette og fremgangsmåde til fremstilling af et kapselpolymerfragment

Info

Publication number: DK175489B1
Application number: DK198800025A
Authority: DK
Inventors: Porter W Anderson; Ronald John Eby
Original assignee: Univ Rochester
Priority date: 1986-05-05
Filing date: 1988-01-05
Publication date: 2004-11-08
Also published as: IE60897B1; DE10199037I1; IE871185L; DE3787995D1; EP0245045B1; DE10199036I1; DE3787995T2; JP2736248B2; NL300052I1; AU7393587A; ATE96676T1; AU601742B2; NL300051I2; DK2588A; NL300051I1; ES2059372T3; DK2588D0; CA1276109C; JPH08283282A; EP0245045A2

Description

DK 175489 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår immunogene kon-jugater som angivet i krav 1-22, krav 23-41, 42 og 43-46, en fremgangsmåde til fremstilling af et immunogent konjugat som angivet i krav 47-69, en vaccine som angivet i krav 70 5 samt en fremgangsmåde til fremstilling af et kapselpolymer-fragment som angivet i krav 71. Vaccinen kan anvendes til immunisering af unge varmblodede dyr, herunder mennesker, mod infektioner og sygdom forårsaget af bakterier, herunder eksempelvis Haemophilus influenzae type b, Escherichia coli, 10 Neisseria meningitidis serogrupperne A og C, Streptococcus pneumoniae serotyperne 3, 6, 12, 14, 19, 23 og 51 og Pseudomonas .

Det er kendt, at rensede bakterielle kapselpolymere (capsular polymers, CP) almindeligvis er immunogene hos 15 voksne mennesker og dyr og kan anvendes som vacciner mod de tilsvarende systemiske infektioner. Som udtrykket "kapsel-polymere" anvendes i denne beskrivelse, refererer det til sukkerholdige polymere, såsom polymere af sukkerarter, sukker-syrer, aminosukkerarter, polyvalente alkoholer og sukker-2 0 phosphater, og vedrører ikke aminosyreholdige polymere. Disse "kapselpolymere" omtales ofte i den medicinske litteratur som "kapselpolysaccharider", skønt de kan indeholde andre end glycosidiske bindinger og andre konstituenter end sukkerarter, såsom de, der er angivet ovenfor.

25 Kapselpolymererne af forskellige bakterier varierer meget med hensyn til immunogenicitet i menneskets første leveår. Nogle er moderat aktive, såsom Streptococcus pneumoniae serotype 3 og Neisseria meningitidis serogruppe A. Modtageligheden for systemisk infektion med indkapslede bak-30 terier er større i det første leveår. Den immunogene reaktion over for mange bakterielle kapselpolymere hos børn er afhængig af alderen, dvs. at immunfunktionen mod CP øges til voksen-niveau ved omkring 6 års alderen.

Blandt de inaktive CP er Haemophilus influenzae 35 type b, Streptococcus pheumoniae, serotyperne 6 og 12, og Neisseria meningitidis serogruppe C. Eksempler på CP'er,

I DK 175489 B1 I

B 2 I

som giver en intermediær reaktion hos børn, er Streptococcus I

I pheumoniae serotyperne 19 og 51. I

B Der er blevet isoleret og renset intakte kapselpoly- I

I mere, der kan være anvendelige i eller som vacciner. Eksem- I

B 5 pelvis er der i US-patentskrift nr. 4.220.717 beskrevet en I

I fremgangsmåde til isolering og rensning af immunologisk I

B aktivt polyribosyl-ribitol-phosphat (PRP) fra kapselpolymeren I

I af H. influenzae b. Desuden angår US-patentskrift nr. I

B 4.210.641 polysaccharidekstrakter af H. influenzae med en I

B 10 tilsyneladende molekylvægtyder er større end 200.000 dalton, I

og først og fremmest sammensat af galactose, glucose og I

I mannose, og som indeholder en lille mængde osaminer. I

Man har anvendt disse og andre intakte kapselpolymere I

I til formuleringer til opnåelse af bedre immunologiske reak- I

I 15 tioner. Eksempelvis kendes der fra US-patentskrift nr. I

I 4.196.192 en vaccine indeholdende renset intakt PRP og hele I

I Bordetella pertussis-bakterier. Denne fremgangsmåde til at I

I øge immunogeniciteten resulterer i forøgede niveauer af I

I anti-PRP og anti-pertussis-antistoffer hos unge pattedyr. I

I 20 Man har undersøgt konjugation af kapselpolymere til I

B bærerproteiner i et forsøg på at forøge antistofdannelse I

I ved hjælp af den såkaldte "bærervirkning". Eksempelvis be- I

I skriver Schneerson et al., J. Exper. Med. 152. 361-376 I

I (1980), H. influenzae b-polymer-proteinkonjugater, der er I

I 25 kendt for at tilføre immunitet mod angribende sygdomme, I

I forårsaget af H. influenzae b. I referencen dokumenteres I

I den alders-relaterede immunologiske adfærd af kapselpolymere I

I hos børn, og man forsøger at overvinde denne aldersafhæn- I

I gighed ved konjugering af den intakte kapselpolymere med I

I 30 mange forskellige proteiner, herunder serumalbuminer, Limulus I

I polyphemus hæmocyanin og difteritoxin. Fremgangsmåden til I

I konjugering indebærer anvendelsen af et bindingsmiddel, I

I såsom adipin-dihydrazid. I

Geyer et al., Med. Micorbiol. Immunol. 165. 171-288 I

35 (1979), fremstiller konjugater af visse Klebsielle pneumo- I

niae-kapselpolysaccharidfragmenter og et nitrophenylethyl- I

DK 175489 B1 3 aminbindingsmiddel ved reduktiv aminering, og det deriva-tiserede sukker blev derpå bundet til proteinerne ved anvendelse af azo-kobling.

I både WO 86/01228 og US patentskrift nr. 4.673.574 5 beskrives et immunogent konjugat, som omfatter det reduktive amineringsprodukt af et immunogent kapselpolymerfragment med en reducerende ende afledt fra den bakterielle kapselpolymer af et bakteriepatogen, og et bakterietoxin eller -toxoid. Infect & Immun (1983), 39(1). 233-238, beskriver 10 oligosaccharider fremstillet ud fra Haemophilus influenzae type b-kapselpolysaccharid og konjugeret til CRM 197 ved reduktiv aminering. I J. Clin. Invest. (1985), 76(1). 52- 59, beskrives det, at Haemophilus influenzae type b-kapselpolysaccharid hydrolyseres selektivt til reducerende oligo-15 saccharider, og fraktioner indeholdende 3-10 ribosyl-ribo-tolphosphat-gentagelsesenheder konjugeres ved reduktiv aminering til difteritoxin, dets ikke-toksiske derivat CRM 197 eller difteritoxoid.

US patentskrift nr. 4.356.170 og J. Immunol. 127(3), 20 1011-1018 (1981) angår begge det samme emne. Begge dokumenter beskriver antigene konjugater, hvori en intakt kapselpolymer med en molekylvægt over 2 000 dalton er bundet via en terminalt indført aldehydgruppe, til en aminogruppe af tetanus-toxoid gennem reduktiv aminering. Man drager omsorg for at 25 undgå fragmentering af den intakte kapselpolymer, som anvendes til fremstilling af de antigene konjugater. Fremgangsmåden til kovalent binding angives at være specifik derved, at den eneste kovalente forbindelse mellem toxoidet og kap-selpolysaccharidet finder sted ved den terminalt lokaliserede 30 aldehydgruppe i polysaccharidet (se f.eks. j. Immunol.

127 (3). 1011-1018 (1981) på side 1011, spalte 2, linie 3-6 og på side 1012, spalte 1, linie 34-44) . Det hævdes endvidere i de nævnte referencer, at det "monofunktionelle gruppe-tiltag" til kobling anvender "undgåelse af tværbinding" mellem 35 polysaccharidet og proteinerne (se f.eks. eksempel, id, linie 42).

I DK 175489 B1

I 4 I

I Den foreliggende opfindelse angår den kovalente bin- I

I ding af kapselpolymerfragmenter, afledt af bakterielle kap- I

selpolymerer, til bakterietoxiner eller -toxoider ved hjælp I

I af reduktiv aminering. Som udtrykket "toxoid" anvendes i I

I 5 den foreliggende beskrivelse, betyder det en form for toxin, I

I som har toxinets antigene virkning, men ikke dets toxiske, I

De her omhandlede immunogene konjugater fremstilles I

I ved først at danne reducerende terminale grupper på frag- I

menter af de kapselpolymere og omsætte disse med aminogrup- I

10 per i det bakterielle toxin eller toxoid ved hjælp af reduk- I

I tiv aminering. De reducerende terminale grupper kan dannes I

ved hjælp af en hvilken som helst egnet fremgangsmåde, her- I

I under selektiv hydrolyse, eksempelvis ved hjælp af syrer I

I eller enzymer, eller ved hjælp af oxidativ spaltning, eksem- I

I 15 pelvis ved hjælp af periodat eller beslægtede oxygensyrer. I

I Konjugationen opnås fortrinsvis ved hjælp af reduktiv I

I aminering i en vandig opløsning indeholdende cyanoborhydrid- I

-anioner. I

I De immunogene konjugater ifølge opfindelsen kan for- I

I 20 muleres med et farmaceutisk acceptabelt bærerstof til frem- I

I stilling af en vaccine, som frembringer virkningsfulde ni- I

I veauer af anti-kapsel-antistof-dannelse hos unge pattedyr, I

herunder mennesker. Vaccinen kan anvendes til at fremkalde I

aktiv immunisering mod systemisk infektion hos unge pattedyr, I

25 forårsaget af de respektive indkapslede bakterier, ved at I

indgive en immunogen mængde af konjugatet til pattedyret. I

De immunogene konjugater har vist sig at være mindre I

aldersafhængige end kapselpolymererne alene, og er anvende- I

lige til den aktive immunisering af særdeles unge varmblodede I

30 dyr mod systemiske infektioner af de respektive indkapslede I

bakterier. I

Endvidere indeholder de her omhandlede immunogene I

konjugater ikke potentielt toxiske bindingsmidler, såsom I

adipinsyre-dihydrazid eller p-nitro-phenyl-ethylamin, som er I

35 blevet anvendt til at konjugere carbonhydrat til protein. I

DK 175489 B1 5

Endelig indeholder de her omhandlede immunogene kon-jugater fragmenter af kapselpolymerer, ikke intakte kapselpolymerer. Den særdeles repetitive struktur af kapselpolymerer kan til dels være ansvarlig for deres svigt med hensyn 5 til at udvide kapaciteten for antistofproduktion hos børn.

Et konjugat af en intakt (højpolymeriseret) CP og protein kan kun delvis overvinde de immunologiske ulemper ved CP alene.

På den anden side kan man ved anvendelsen af kapsel-10 polymerfragmenter på en bærer omgå ulemperne ved den repetitive struktur. Endvidere er CP-determinanterne af et kon-jugat med CP-fragmenter i gennemsnit tættere på bæreren end CP-determinanterne i konjugater med intakt CP, og denne nærhed til bærerstoffet kan være nødvendig til en mere effek-15 tiv "bærervirkning".

En yderligere fordel ligger i til proteinbærerstof-fet at anvende et bakterietoxin eller -toxoid, mod hvilket børn rutinemæssigt vaccineres, eksempelvis stivkrampe eller difteri. Ønsket immunitet over for toxinet eller toxoidet 20 fremkaldes sammen med immunitet mod de patogener, der er knyttet til kapselpolymeren.

Det forstås, at henvisning i denne beskrivelse til enhver teori til forklaring af de beskrevne resultater ikke skal begrænse opfindelsens omfang. Uafhængigt af den frem-25 gangsmåde, ved hjælp af hvilken opfindelsen fungerer, kan man opnå de i den foreliggende beskrivelse beskrevne resultater og fordele ved henvisning til den følgende detaljerede beskrivelse.

De her omhandlede konjugater dannes ved at omsætte 30 reducerende terminale grupper af kapselpolymerfragmentet med primære aminogrupper af et bakterietoxin eller -toxoid, hvorved man får antigene determinanter af kapselpolymeren, kovalent bundet til bærerproteinet. De reducerende grupper kan dannes ved selektiv hydrolyse eller specifik oxidativ 35 spaltning eller kombinationer af begge fremgangsmåder.

I DK 175489 B1 I 6

I Antigene fragmenter med mindst én reducerende ende I

kan dannes ud fra kapselpolymere ved mange fremgangsmåder, I

I afhængigt af de strukturelle særpræg hos den bestemte kap- I

I selpolymere. Begrænset oxidativ spaltning ved hjælp af per- I

5 iodat (eller beslægtede reagenser, såsom paraperiodsyre, I

I natriummetaperiodat og kaliummetaperiodat) efterlader aide- I

hydiske terminaler. En sådan fremgangsmåde vil være begrænset I

I til polymere med nabostillede dihydroxygrupper. Ved hydrolyse I

I af en glycosidisk binding fås en reducerende sukkerterminal. I

I 10 En sådan hydrolyse kan mest specifikt udføres enzymatisk I

I ved hjælp af glycosidaser, men denne anvendelse vil være I

I begrænset til relativt få kapselpolymere, eksempelvis Strep- I

I tococcus pneumoniae 8, til hvilken der kendes glycosidaser. I

I Sur hydrolyse anvendes almindeligvis til hydrolyse af glyco- I

I 15 sidiske bindinger. Anvendeligheden af; denne fremgangsmåde I

I vil være begrænset, hvis den polymere indeholder syre-føl- I

I somme ikke-glycosidiske bindinger, eller hvis den polymere I

indeholder syre-følsomme forgreningsbindinger, som er vigtige I

I for den antigene specificitet. Man kan også anvendes basehy- I

I 20 drolyse, hvis polysaccharidet indeholder baselabile bindinger I

til det glycosidiske carbonatom, såsom phosphat-, sulfat- I

I eller esterbindinger. Anvendeligheden af denne fremgangsmåde I

I vil være begrænset, hvis den polymere indeholder andre base- I

I følsomme ikke-glycosidiske bindinger. I

I 25 Visse kapselpolymere kan mangle nabostillede hydroxy- I

I grupper, som er modtagelige for spaltning ved hjælp af per- I

I iodat (eller beslægtede oxygensyrer). Imidlertid kan hydro- I

I lyse på forhånd af sådanne kapselpolymere med syre, base I

eller enzym generelt frigøre nabostillede dihydroxygrupper, I

I 30 som generelt vil være modtagelige over for oxidativ spalt- I

I ning. Eksempelvis kan fjernelse af eksempelvis pyrodruesyre, I

I acetater og formiater ved hjælp af sur hydrolyse, eller fjer- I

nelse af sialsyre ved hjælp af enzymspaltning, ske forud for I

det oxidative spaltningstrin. Dette vil naturligvis være I

35 begrænset i anvendelse til de kapselpolymere, hvori de modi- I

ficerede grupper ikke er vigtige for antigen specificitet. I

DK 175489 B1 7 Når kapselpolymererne hydrolyseres til dannelse af kapselpolymerfragmenter med kun en funktionel aldehydgruppe, resulterer konjugering til et multifunktionelt protein (med mindst to frie aminogrupper) i et konjugat, hvori der til 5 et enkelt proteinmolekyle covalent er bundet et eller flere kapselpolymerfragmenter. Det fremgår, at antallet af kapselpolymerf ragmenter, bundet til proteinet, rutinemæssigt kan styres ved at ændre konjugationsreaktionsbetingelserne, herunder den relative koncentration af kapselpolymerfragmenter 10 i forhold til proteiner og den totale koncentration af reaktanterne. Naturligvis vil styring af hvilken som helst omsætningsparameter, eksempelvis tid, temperatur og pH-værdi, som påvirker reaktiviteten eller omsætningshastigheden, ændre slutsammensætningen og strukturen af konjugatet.

15 Når kapselpolymerfragmentet har mindst én funktionel aldehydgruppe anbragt på hver ende af fragmentet (eksempelvis som resultat af oxidativ spaltning af nabostillede dihydroxy-grupper af en ikke-cyclisk rest), kan konjugering til et multifunktionelt protein resultere i adskillige typer af 20 konjugat. Eksempelvis er der ved konjugering af sådanne reaktanter mulighed for at danne et gitter eller netværk, især, når der er mange frie aminer på proteinet,.og kapselfragmenterne foreligger i et lille molært overskud i forhold til protein. Graden af tværbinding og den totale størrelse 25 af netværket eller gitteret kan reguleres ved hjælp af rutinevariation af konjugeringsreaktionsbetingelserne.

Konjugeringen udføres i overensstemmelse med den reduktive amineringsfremgangsmåde ifølge Schwartz og Gray,

Arch. Biochem. Biophys. 181:542-549 (1977). I korthed inde-30 bærer fremgangsmåden, at man omsætter det reducerende kapselpolymerf ragment og bakterietoxid eller -toxoid i nærværelse af cyanoborhydridioner eller et andet reduceringsmiddel, som ikke reducerer de reducerende ender af interesse eller påvirker toxinet eller toxoidet eller kapselpolymeren skade-35 ligt.

I DK 175489 B1

1 8 I

I Cyanoborhydrationerne (eller ækvivalenterne dertil) I

I virker først og fremmest som et mildt selektivt reduktions- I

I middel af det Schiff-base-mellemprodukt, der dannes mellem I

I carbonylgrupperne i kapselpolymerfragmentet og aminogruppeme I

I 5 i proteinet. En anden virkning af sådanne ioner er den lang- I

I sommere reduktion af hvilke som helst aktive aldehydgrupper, I

I der bliver tilbage på kapselpolymerfragmenterne, efter at I

I der er sket konjugering. Eventuelt kan man efter konjugering I

I tilsætte yderligere cyanoborhydrationer (eller ækvivalenter I

I 10 dertil) til reduktion af sådanne uomsatte frie aldehydgrup- I

I per. Det er ofte ønskeligt at tilsætte det stærkere reduce- I

I rende middel, borhydridion, efter konjugering for at sikre I

I passende reduktion af de tilbageblevne carbonylgrupper. I

Til forskel fra tidligere anvendte konjugeringsfrem- I

I 15 gangsmåder, hvori de aktive molekyler er forenede ved hjælp I

I af et bindingsmiddel, som danner en del af slutproduktet, I

I er de i den foreliggende beskrivelse anvendte reducerende I

I anioner således ikke inkorporerede i slutproduktet. Det er I

I vigtigt ud fra et synspunkt med hensyn til at kontrollere I

I 20 den potentielle toxicitet, (dvs. uønsket immunogenicitet) I

I af slutproduktet. Tegn på kovalent binding påvises af det I

I faktum, at bindingen mellem eksempelvis en PRP-del og bærer- I

proteinet varer ved på trods af udsaltning af proteinet i I

I nærværelse af· 8 M urinstof-opløsning, hvilket har en stor I

25 evne til at opløse ikke-kovalente bindinger. I

I Egnede bærerproteiner er proteiner, som er ufarlige I

I til indgift til unge pattedyr og immunologisk virkningsfulde I

I som bærerstoffer. Sikkerheden omfatter fravær af primær I

toxicitet og minimal risiko for allergiske komplikationer. I

30 Difteri- og stivkrampetoxoider opfylder disse betingelser, I

dvs. at de passende tilberedt er ikke-toxiske, og forekomsten I

af allergiske reaktioner er veldokumenteret. Skønt risikoen I

for allergisk reaktion kan være relativt betydelig for vok- I

sne, er den minimal for børn. I

35 Ved "bærervirkningen" bliver et svagt antigen ved I

at blive bundet til et stærkere antigen som bær er s tof (eksem- I

DK 175489 B1 9 pelvis et heterologt protein) mere immunogent, end hvis det blev indgivet alene. Hvis et dyr tidligere er immuniseret med udelukkende bærerstoffet, kan det blive "forbehandlet" for en forstærket reaktion ikke kun mod bærerantigenet, men 5 også det tilknyttede svagere antigen. Børn immuniseres rutinemæssigt med tetanus- og difteri-toxoider. De ville således blive forbehandlet til senere indgift af et kapselpolymeran-tigen, konjugeret til et hvilket som helst af disse toxoider.

Alment kan et hvilket som helst heterologt protein 10 tjene som et bærerantigen. Visse bakterietoxiner, såsom stivkrampe og difteri, kan imidlertid have en vis fordel ved, at de er sammensat af to dele, af hvilke den ene {"bindings" -underenheden) har en stærk affinitet til binding til pattedyrcelleoverflader. Det er tænkeligt, at konjugering 15 til et sådant "bindings"-protein ville tillade det bårede antigen mere effektivt at starte reaktioner i immunsystemets celler.

Bærerproteinerne, hvortil kapselpolymeren er konjugeret, kan være nativt toxin eller detoxificeret toxin 20 (toxoid). Ved hjælp af relativt ny mutationsteknik kan man ligeledes fremstille genetisk ændrede proteiner, som antigenetisk ligner toxinet, men ikke er toxisk. De kaldes "krydsreagerende materialer" eller CRM'er. CRM197 er bemærkelsesværdigt, eftersom det har en enkelt aminosyreændring i for-25 hold til det native difteritoxin og immunologisk ikke kan skelnes fra dette.

Der er deponeret en kultur af Corynebacterium diphtheria af stammen C7 (S197), som producerer CRM^g^ protein, i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 30 USA, og som har fået tildelt accessionsnummeret ATCC 53281.

Konjugering af kapselpolymere til nativt toxin kan nedsætte toxiciteten, men der kan restere betydelig toxici-tet. Således ville der kræves yderligere detoxifikation. Ved gængs detoxifikation af proteintoxiner anvendes der formalin, 35 som reagerer med frie aminogrupper i proteinet. Resttoxicitet kan stadig give anledning til bekymring. Endvidere er spontan _____;___

I DK 175489 B1 I

I io I

I gentoxifikation mulig med hvilken som helst bestemt batch I I vaccine, og det forbliver en genstand for bekymring med I I denne fremgangsmåde. I I Alternativt kan man detoxificere nativt toxin med I

5 formalin til fremstilling af gængs toxoid før konjugering I I til kapselpolymeren. Imidlertid reducerer den forudgående I I formalinbehandling antallet af frie aminogrupper, som er I

tilgængelige til omsætning med de reducerende grupper i kap- I I selpolymerfragmentet. Der er således tydelige fordele ved I I 10 CRM'er ved, at de ikke har nogen iboende toxicitet, selv om I I ingen af deres aminogrupper er besat af formalinet. En yder- I

ligere fordel er, at der ikke findes nogle biologiske risici I I ved arbejde med CRM’er. I I I tilfældet med CRM197, som er immunologisk identisk I I 15 med nativt toxin, forstærker behandling med formalin (skønt I

der ikke er noget behov for at detoxificere) den immunologi- I I ske reaktion kraftigt. Det menes, at dette skyldes stabili- I I sering af molekylet over for nedbrydning ved hjælp af meka- I I nismer i legemet og/eller aggregering med tværbinding (im- I

20 mugenicitet af partikler stiger med størrelsen). I I Af alle de ovennævnte årsager er stivkrampe- og dif- I I teritoxiner de vigtigste kandidater til bærerstofproteiner, I I selv om der er andre, som også kan være egnede. Skønt disse I I andre muligvis ikke har den sikkerhedsforhistorie, der fore- I

2 5 kommer hos difteri og stivkrampe, kan der være andre overvæl- I I dende årsager til at anvende dem. Eksempelvis kan de være I

endog mere effektive som bærere, eller produktionsbesparel- I

serne kan være signifikante. Andre kandidater som bærere I I omfatter toxiner eller toxoider af pseudomonas, staphylococ- I I 30 cus, streptococcus, pertussis og entertoxigene bakterier, I I herunder Escherichia coli. I I Egnede bærermedier til formulering, af en vaccine I

omfatter natriumphosphatpufret saltvand (pH-værdi =7,4) I I eller 0,125 M aluminiumphosphatgel, suspenderet i natrium- I I 35 phosphatpufret saltvand med en pH-værdi, som er lig med 6, I

DK 175489 B1 11 og andre gængse medier. Andre farmaceutiske bærere, der er egnede til anvendelse i vacciner, tilhører teknikkens stade.

Almindeligvis er vacciner ifølge opfindelsen, der indeholder fra ca. 5 til ca. 100 μg, fortrinsvis fra ca. 10 5 til ca. 50 μg, egnede til at frembringe effektive antistof-niveauer mod kapselpolymeren i unge varmblodede pattedyr. Naturligvis vil den nøjagtige dosis blive bestemt ved hjælp af rutinedosis-/reaktionsforsøg. Adskillige små doser, indgivet i rækkefølge, forventes at være overlegne i forhold 10 til den samme mængde konjugat, indgivet som en enkelt injektion.

De her omhandlede vacciner kan indgives ved hjælp af injektion til varmblodede pattedyr i en hvilken som helst alder og er specielt tilpasset til at fremkalde aktiv im-15 munisering mod systemiske infektioner i unge pattedyr, forårsaget af patogenerne Haemophilus influenzae type b, Escherichia coli, Pheumococcus, Meningococcus, Streptococcus og Pseudomonas.

I det følgende er der angivet et ikke-begrænsende 20 eksempel på en fremgangsmåde til fremstilling af typiske eksempler på immunogene konjugater ifølge opfindelsen og deres anvendelse i vacciner.

Eksempel: Konjugering af PRP-fragmenter, frem-25 stillet ved oxidativ spaltning, og CRM197 I dette eksempel omfatter slutkonjugatet to komponenter: Fragmenter af PRP af rimeligt veldefineret kæde længde, covalent bundet til det ikke-toksiske, immunogene 30 difteri-toxin CRMi97. I dette eksempel styrer betingelserne ved periodatoxideringen og isoleringen ved ultrafiltrering 'kædelængden af kapselpolymer-(PRP)-fragmenterne.

Konjugatet opbygges med kapselpolymerfragmenter med en aldehydgruppe i begge ender af fragmentet. Således kan 35 hvert fragment covalent bindes til CRM ved begge ender, formodentlig ved CRM-lysingrupper. Strukturen af produktet kan derfor betragtes som værende et "gitter".

I DK 175489 B1 I

I 12 I

I Sammensætningen og formodentlig strukturen af kon- I

jugatet kan ændres ved at ændre koncentrationen af de to I

komponenter i den konjugerende kemiske reaktion. I

I PRP, der anvendes til at fremstille PRP-fragmenterne I

5 til PRP-CRM-konjugatvaccinen, har de følgende specifika- I

tioner: I

Proteinindhold <1,0% I

Nucleinsyreindhold sl,0% I

I Endotoxin (LAL) <1,0 EU//zg PRP I

I 10 Molekylstørrelse (Kd) <0,3 (Sepharose CL-48) I

<0,6 ......"--28) I

I Fremgangsmåder til fremstilling af PRP-fragmenter I

I a. En opløsning af PRP (5-7 mg/ml) afkøles til 4°C, og I

I der tilsættes 2 M phosphatpuffer med en pH-værdi på I

I 15 7,0 for at gøre slutkoncentrationen 0,2 M med hensyn I

til phosphat. I

I b. Natriummetaperiodat (0,2-0,3 mol 104/mol PRP) tilsæt- I

I tes under hurtig omrøring, og opløsningen inkuberes I

ved 4°C natten over i mørke. I

20 c. Reaktionsopløsningen ultrafiltreres under anvendelse I

I af en H1P30 hulfiber (Amicon, molvægtsafskæring- I

30.000). Det tilbageholdte materiale vaskes fire I

I gange med 250 ml saltvand. Filtraterne forenes og I

ultrafiltreres under anvendelse af en H1P10 hulfiber I

I 25 (Amicon, molvægtsafskæring 10.000). Det tilbageholdte I

I materiale vaskes fire gange med 250 ml saltvand. Det I

tilbageholdte materiale koncentreres derpå til I

I >35 mg på PRP/ml. I

d. Det tilbageholdte materiale analyseres for ribose I

I 30 ved hjælp af orcinolanalyse, og reducerende grupper I

I ved hjælp af basiske ferricyanidanalyse. En lille I

I portion af det tilbageholdte materiale analyseres på I

I en Biogel P-100 søjle (0,7 cm x 25 cm) under anven- I

I delse af en 0,15 M natriumchlorid-opløsning som elu- I

I 3 5 eringsmiddel, og idet man analyserer hver af frak- I

I- tionerne ved hjælp af orcinol og den basiske fer- I

DK 175489 B1 13 ricyanidanalyse. Analysen viser, at det tilbageholdte materiale er sammensat af oligosaccharider med en DP, der ligger mellem 15 og 30, idet den vægtgennemsnitlige DP ligger på ca. 20.

5 For kapselpolymerfragmenter, fremstillet ved oxidativ spaltning, er kædelængden (DP) defineret som (riboseenheder/-reducerende grupper) x 2.

To portioner periodat-oxideret PRP fraktioneres som i del d og karakteriseres som følger: 10

Saccharidkædelængde

Fraktion nr. _DP af fraktion_ % af det hele_

Batch nr. 2 Batch nr. 3 Batch nr. 2 Batch nr. 3 15 14 36j 5 41,0 12 j 7 5,9 15 24,1 32,5 11,0 9^4 16 25,3 24,5 13,2 11,8 17 25,4 22,8 14;4 14,3 18 23,2 20,2 13,6 14.6 20 19 20,2 19,0 11;9 14,2 20 20,4 17,7 9,3 12.4 21 16,1 16,0 6,7 10,0 22 lly 7 12,3 7,2 7.,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 35 2 CRM-PRP Koniuqerinq 3 a. CRM-protein opløses i 0,2 M natriumphosphatpuffer 4 (pH-værdi = 7,0) til en slutkoncentration på 10 mg/ml.

5 b. Lyofiliseret oligosaccharid rekonstitueres i destil- 6 leret vand, der sættes en passende mængde (gennemsnits 7 DP på 20) til CRM-proteinet, og opløsningen blandes.

8 c. Der tilsættes natriumcyanoborhydrid (0,5 g/ml) (10 9 gange molært overskud) , og opløsningen blandes og 10 inkuberes ved 37°C i 3 dage.

I DK 175489 B1 I

I 14 I

I d. Der tilsættes natriumborhydridopløsning (100 x de I

reducerende grupper), og opløsningen tillades at I

I henstå ved stuetemperatur i 2 timer. I

I e. Konjugatet destilleres 10 gange med 6 M urinstof-- I

I 5 opløsning til opløsning af hvilket som helst præci- I

I pitat, og opløsningen ultrafiltreres under anvendelse I

af en Amicon omrørt celle med en YM-30 membran (mol- I

I vægtsafskæring 30.000). I

I f. Opløsningen ultrafiltreres gentagne gange under an- I

10 vendelse af sterilt saltvand, indtil filtratet er I

negativt med hensyn til pentose og cyanidion. I

I Egenskaber af slutkoniugaterne I

I I tabel 1 er angivet forskellige egenskaber for PRP- I

I 15 CRMig7-konjugaterne fra forskellige portioner oxideret PRP I

og portioner, der er et resultat af adskillige konjugerings- I

I forsøg: I

I Tabel 1 I

I 20 Produkter af CRM-PRP konjugation I

I Forhold I

I Forhold mellem mellem I

I PRP og CRM i PRP og CRM I

I PRP reaktions- i slut- Kd I

I Vaccine saccharid-. blandingen konjugat (sepharose I

I 25 batch, nr. batch (pg/uq)_ (pq/pq) CL-4B) I

I 5 nr. 2 1,0 0,25 0,27 I

I 6 nr. 2 2,0 0,62 0,31 I

7 nr. 3 1,0 0,38 0,36 I

8 nr. 3 2,0 0,57 0,44 I

30 9 nr. 6 1,0 0,60 0,48 I

10 nr. 6 2,0 0,42 0,48 I

11 nr. 7 1,0 0,27 0,30 I

12 nr. 7 2,0 0,42 0,48 I 1

X Kd, ved hvilken 50% af materialet (protein) eluerer. I

DK 175489 B1 15 PÅfvldning i flasker.

a. CRM-PRP-konjugatet sterilfiltreres gennem et 0,8 og derpå et 0,22 μτη filter til en tareret steril beholder.

5b. En prøve fjernes aseptisk og analyseres for protein ved hjælp af Lowry-analysen.

c. Rumfanget af filtreret materiale bestemmes ved at veje beholderen, og der beregnes et slutrumfang, hvorved man får 50 protein pr. ml.

10 d. Der tilsættes en mængde 1% Thimerosal i sterilt salt vand gennem et sterilt 0,22 μπι filter, hvorved man får 0,01% Thimerosal i slutopløsningen.

e. Vaccinen bringes op på slutrumfanget med sterilt saltvand, - filtreret gennem et 0,22 μπι filter.

15 f. Opløsningen blandes, og der tilsættes portionsvis 5,5 ml til sterile, pyrogen-frie 10 ml hætteglas (Wheaton, glas af type 1), som tilproppes (gråt bu-tylgummi, Wheaton), forsegles og opbevares ved 2-8°C.

20

Slutdosis-formuleringerx

Vaccine Protein PRP

batch nr. . (ug/ml) (uq/ml) Kd** 25 .

5 .50 12,5 .0,27 6 50 31,0 0,31 7 50 19,0 0,36 8 50 28,5 0,44 30 9 50 30,0 0,48 10 50 21,0 0,48 11 50 13,5 0,30 12 ‘50 21,0 0,48 1 x Alle formuleringer er tilberedt i 0,9% NaCl og 0,01% Thirmerosal.

xx Kd, ved hvilken 50% af materialet (protein) eluerer.

I DK 175489 B1

I 16 I

I Afprøvning af in vitro-antigenicitet I

I Rækkefortyndinger af vaccine i PBS 0,05% Tween sættes I

I in duplo til fordybninger i microtiterplader, på forhånd I

overtrukket med difteri-toxoid. Et forenet polyklonalt humant I

5 difteri-antitoxin-serum med høj titer eller et humant poly- I

I klonalt anti-PRP-serum sættes derpå til fordybningerne, og I

I pladerne inkuberes ved 20°C i 24 timer. Antistofbinding I

bestemmes ved senere inkubering af fordybningerne med enzym- I

I -mærket anti-human immungiobulin, fulgt af inkubering i 60 I

I 10 minutter med enzymsubstratet og kvantificering af den optiske I

I densitet. Disse resultater er angivet i tabel 2. I

I Tabel 2 I

In vitro antiqenicitet af PRP-CRM konjugat I

I Inhibering af binding af human polyclonal I

I anti-difteri-toxoid og anti-PRP-antistoffer I

I Ækvivalent inhibitor med hensyn til binding I

I Vaccine Anti-PRP Anti-DIP toxoid I

PRP (1) - I

DY-Mass* - (1) I

nr. 5 1,5 87,0 I

nr. 6 1,1 57,0 I

25 I

nr. 7 3,3 9,3 I

nr. 8 2,9 8,0 I

x difteri-toxoid leveret af Massachusetts Public Health I

Biologic Laboratories, batch Dcp 27. I

Dataene i tabel 2 viser, at de forskellige portioner I

vaccine bibeholder in vitro-antigenicitet: De kan konkurrere I

35 med polyclonale antistoffer mod PRP og mod difteri-toxoid. I

Data viser ligeledes, at PRP-antigenet er relativt ekspone- I

DK 175489 B1 17 ret, medens difteri-toxoidepitoperne er mindre godt og ujævnt eksponerede.

Immunoaenicitet hos dvr a. Kaniner 5 I tabel 3 er opsummeret tre forsøg, hvori unge kaniner vaccineres i ugerne 0, 1 og 2 med 25 μg vaccine.

Alle vacciner er immunogene og giver anti-PRP--reaktioner, der kan forstærkes, som bestemt ved ELISA-prøven. Der ses moderate anti-PRP-reaktioner selv 10 efter en enkelt injektion på 25 μg af den konjugerede vaccine.

b. Mus

De resultater, der fås ved vaccination af unge "Swiss Webster" mus fremkalder atter en anti-PRP-reaktion, 15 der kan forstærkes (data er ikke vist).

Tabel 3

Anti-PRP-reaktioner hos kaniner, der lige er vænnet fra, overfor for forskellige batch'er 2 0 _PRP-CRM konjuqater_

Vaccine Uge 0 Uge 1 Uqe 3 batch wg/ml wg/ml ug/ml nr. (GMT) (GMT) (GMT) 25 5 0,1 0^23 7,56 6 0,1 0^,38 2,86 7 . 0,2 0, 86 9,70 8 0,1 - 0,87 7,61 30 9 0^1 0,36 3.88 10 0^,1 0,92 1,84 11 071 0,21 5,01 12 071 0,31 2,33 I 35 -—---—--

I DK 175489 B1 I

I . 18 I

I Immunogenicitet hos børn I

I Børnene er raske og er ikke tidligere blevet immuni- I

I seret med Hib-vaccine og har heller ikke tidligere reageret I

I kraftigt mod vacciner. Idet man begynder i den alder, der I

I 5 er angivet i tabel 4 (henholdsvis 18, 7 og 2 måneder), blev · I

I der udtaget blod fra dem, og de får som indgift en 25/xg I

I subcutan primær injektion af PRP-CRM-konjugat, iagttages i I

I mindst 20 minutter og sendes til deres forældre til iagt- I

I tagelse og registrering af eventuelle lokale og systemiske I

I 10 skadelige reaktioner. I

I For gruppen af de 7 måneder gamle og 2 måneder gamle I

I børn gentages processen efter forløbet af de tidsrum, der I

I er angivet i tabel XIV, til en sekundær immunisering med I

I den samme vaccine. Efter forløbet af yderligere et tidsrum, I

I 15 (jf. tabel 4), udtages der atter blod til bestemmelse af I

I den sekundære reaktion. I

I Som det fremgår af tabel 4, er enkelte injektioner I

I virkningsfulde til øgning af antistoffer i aldersgrupperne I

I 18 og 7 måneder, medens der hos 2 måneder gamle børn iagt- I

I 20 tages en moderat stigning i antistof (på trods af det for- I

I ventede fald i IgG-antistoffer fra moderen) . Hos alle disse

I børn iagttages der passende niveauer af anti-PRP-antistof I

I 1-2 måneder efter den anden immunisering. Den reaktion, I

I der iagttages hos 6 måneder gamle børn efter to immunise- I

I 25 ringer, er tilstrækkelig til at frembringe beskyttende ni-

veauer af antistoffer. I

30 I

19

Tabel 4 DK 175489 B1

Anti-PRP-antistof-reaktion mod 25 )iq vaccine_ 5

Alder (måneder) Antistof, yg/mlx ved vacci- Antal af ----λ3-- nation_børn Før_Efter 1_Efter 2 18-23 84 0,40 1 md. .-6,53 10 7-15 88 0,15 1-2 md. 4,54 1-2 md. 18,9 2-6 30 0,17 2 md. 0,25 2 md. 1,23 x Geometrisk middelværdi af titer.

15

Claims

2. Immunogent konjugat ifølge krav 1, i hvilket kap- I I selpolymeren er immunogen i voksne mennesker og mindre im- I I munogen i børn. I I 15 3. Immunogent konjugat ifølge krav 1, i hvilket den I I reduktive aminering udføres i nærværelse af cyanoborhydrid- I I anioner. I
4. Immunogent konjugat ifølge krav 1, hvor toxinet I I eller toxoidet er difteritoxin eller -toxoid. I I 20 5. Immunogent konjugat ifølge krav 4, hvor toxoidet I er I
6. Immunogent konjugat ifølge krav 1, hvor toxinet I I eller toxoidet er tetanustoxin eller -toxoid. I
7. Immunogent konjugat ifølge krav 1, hvor toxinet I I 25 eller toxoidet er et Pseudomonas-toxin eller - toxoid. I
8. Immunogent konjugat ifølge krav 1, hvor toxinet I I eller toxoidet er et Staphylococcus-toxin eller - toxoid. I
9. Immunogent konjugat ifølge krav 1, hvor toxinet I I eller toxoidet er et Streptococcus-toxin eller -toxoid. I I 30 10. Immunogent konjugat ifølge krav 1, hvor toxinet I I eller toxoidet er Pertussis-toxin eller -toxoid.
11. Immunogent konjugat ifølge krav 1, hvor toxinet I I eller toxoidet er et Escherichia coli-toxin eller -toxoid. I
12. Immunogent konjugat ifølge krav 1, hvor det bak- I I 35 terielle pathogen er Haemophilus influenzae type b. I DK 175489 B1
13. Immunogent konjugat ifølge krav l, hvor bakterie-pathogenet er Escherichia coli.
14. Immunogent konjugat ifølge krav 1, hvor bakterie-pathogenet er Neisseria meningitidis.
15. Immunogent konjugat ifølge krav l, hvor bakterie- pathogenet er Neisseria meningitidis serogruppe A.
16. Immunogent konjugat ifølge krav l, hvor bakterie-pathogenet er Neisseria meningitidis serogruppe C.
17. Immunogent konjugat ifølge krav 1, hvor bakterie-10 pathogenet er Streptococcus pneumoniae.
18. Immunogent konjugat ifølge krav 1, hvor bakterie-pathogenet er valgt fra gruppen bestående af Streptococcus pneumoniae serotyper 6, 12, 14, 19 ,23 og 51.
19. Immunogent konjugat ifølge krav 5, hvor bakterie-15 pathogenet er Haemophilus influenzae type b.
20. Immunogent konjugat ifølge krav 5, hvor bakterie-pathogenet er valgt fra gruppen bestående af Streptocococcus pneumoniae serotyper 6, 12, 14, 19, 23 og 51.
21. Immunogent konjugat ifølge krav ethvert af krav-20 ene 1-20, hvor oxidationsmidlet er periodat.
22. Immunogent konjugat ifølge ifølge ethvert af kravene 1-21, hvor fragmentet fremstilles ud fra en kapsel-polymer ved først at behandle polymeren med syre, base eller enzym og dernæst frembringelse af aldehydgrupper ved behand- 25 lingen med et oxidationsmiddel.
23. Immunogent konjugat omfattende det reduktive amineringsprodukt af et kapselpolymerfragment med en kædelængde på fra ca. 10 til ca. 30 monomerenheder og mindst to carbonylgrupper, hvilket fragment er afledt fra kapselpoly- 30 meren af et bakteriepathogen, der er Streptococcus pneu-monaie- eller Haemophilus influenzae-bakterie, idet kapsel-polymerfragmentet fås ved en fremgangsmåde, der omfatter behandling af polymeren med en syre, en base eller et enzym og dannelse af carbonylgrupper ved behandling med et oxida-35 tionsmiddel, og et bakterietoxin- eller toxoid, hvilket konjugat omfatter et tværbundet konjugat. I DK 175489 B1 I I 22 I
24. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor kapsel- I polymeren er immunogen i voksne mennesker og mindre immunogen I I i børn. I
25. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor den I I 5 reduktive aminering udføres i nærværelse af cyanoborhydrid- . I I anioner. I
26. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor toxinet I I eller toxoidet er difteri-toxoid. I
27. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor toxoidet I I 10 er CRM^97· I
28. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor toxinet I I eller toxoidet er tetanus-toxin eller-toxoid. I
29. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor toxinet I I eller toxoidet er et Pseudomonas-toxin eller -toxoid. I I 15 30. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor toxinet I I eller toxoidet er et Staphylococcus-toxin eller -toxoid. I
31. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor toxinet I I eller toxoidet er et Streptococus-toxin eller -toxoid.
32. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor toxinet I I 20 eller toxoidet er Pertussis-toxin eller -toxoid. I
33. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor toxinet I I eller toxoidet er et Escherichia coli-toxin eller -toxoid. I
34. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor bakterie- I I pathogenet er Haemophilus influezae type b. I I 25 35. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor bakterie- I I pathogenet er Streptococcus pneumoniae. I
36. Immunogent konjugat ifølge krav 23, hvor bakterie- I I pathogenet er valgt fra gruppen bestående af Streptococcus I I pneumoniae serotyper 6, 12, 14, 19, 23 og 51. I I 30 37. Immunogent konjugat ifølge krav 27, hvor bakterie- I I pathogenet er Haemophilus influenzae type b. Η
38. Immunogent konjugat ifølge krav 27, hvor bakterie- I I pathogenet er Streptococcus pneumoniae. H
39. Immunogent konjugat ifølge krav 27, hvor bakterie- I I 35 pathogenet er valgt fra gruppen bestående af Streptococcus I I pneumoniae serotyper 6, 12, 14, 19, 23 og 51. I DK 175489 B1
40. Immunogent konjugat ifølge ethvert af kravene 23-39, hvor oxidationsmidlet er periodat.
41. Immunogent konjugat ifølge ethvert af kravene 23-40, hvor fragmentet fremstilles ud fra en kapselpolymer 5 ved først at behandle polymeren med syre, base eller enzym og dernæst frembringe aldehydgrupper med et oxidationsmiddel.
42. Immunogent konjugat, der omfatter et formalinbehandlet reduktivt amineringsprodukt af et kapselpolymer-fragment med mindst to carbonylgrupper og afledt fra en 10 kapselpolymer af et bakteriepathogen, idet kapselpolymerfrag-mentet fås ved en fremgangsmåde, der omfatter behandling af polymeren med en syre, en base eller et enzym og frembringelse af carbonylgrupper ved behandling med et oxidationsmiddel, og et bakterietoxin eller -toxoid, hvilket konjugat 15 omfatter et tværbundet konjugat.
43. Immunogent konjugat omfattende et formalinbehandlet reduktivt amineringsprdukt af et kapselpolymerfragment med en kæde længde på fra ca. 10 til ca. 30 monomerenheder og mindst to carbonylgrupper, hvilket fragment er afledt 20 fra kapselpolymeren af en Streptococcus pneumoniae- eller Haemophilus influenzae-bakterie, idet kapselpolymerfragmentet fås ved en fremgangsmåde, der omfatter behandling af polymeren med en syre, en base eller et enzym og dannelse af carbonylgrupper ved behandlingen med et oxidationsmiddel, 25 og et bakterietoxin eller -toxoid, hvilket konjugat omfatter et tværbundet konjugat.
44. Immunogent konjugat ifølge krav 42 eller 43, hvor bakterietoxoidet er difteritoxoid.
45. Immunogent konjugat ifølge krav 42 eller 43, 30 hvor toxoidet er CRM197.
46. Immunogent konjugat ifølge krav 42 eller 43, hvor bakterietoxinet eller -toxoidet er tetanus-toxin eller-toxoid.
47. Fremgangsmåde til fremstilling af et immunogent 35 konjugat omfattende dannelse af det reduktive amineringsprodukt af I DK 175489 B1 I I 24 I I (i) et kapselpolymerfragment, der har mindst to carbonyl- I I grupper, og som er afledt fra kapsel pol ymeren af et bakterie- I pathogen, idet kapsel polymer fragment et fås ved en fremgangs- I I måde, der omfatter behandling af polymeren med syre, base I I 5 eller enzym og dannelse af carbonylgrupper ved behandling ' I I med et oxidationsmiddel og I I (ii) et bakterietoxin eller -toxoid, I I idet den reduktive aminering udføres i nærværelse af cyano- I I borhydrid-ioner, og konjugatet omfatter et tværbundet kon- I I 10 jugat. I
48. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor kapselpolymeren I I er immunogen i voksne mennesker og mindre immunogent i børn. I
49. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor toxinet eller I toxoidet er difteri-toxin eller -toxoid. I I 15 50. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor toxinet eller I I toxoidet er CRM197. I
51. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor toxinet eller I I toxoidet er tetanus-toxin eller -toxoid. I
52. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor toxinet eller I I 20 toxoidet er Pseudomonas-toxin eller -toxoid. I
53. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor toxinet eller I toxoidet er Staphylococcus-toxin eller -toxoid. I
54. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor toxinet eller I toxoidet er Streptococcus-toxin eller -toxoid. I
55. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor toxinet eller I toxoidet er Pertussis-toxin eller -toxoid. I
56. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor toxinet eller I toxoidet er et Escherichia coli-toxin eller -toxoid. I
57. Fremgangmåde ifølge krav 47, hvor pathogenet er I
30 Haemophilus influenzae type b. I
58. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor pathogenet er I Escherichia coli. I
59. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor pathogenet er I Neisseria meningitidis. I
60. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor pathogenet er I Steptococcus pneumoniae. I DK 175489 B1
61. Fremgangsmåde ifølge krav 47, hvor pathogenet er Pseudomonas.
62. Fremgangsmåde ifølge krav 49. hvor pathogenet er Haemophilus influenzae type b.
63. Fremgangsmåde ifølge krav 49, hvor pathogenet er , Streptococcus pneumoniae.
64. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 47-63, hvor oxidationsmidlet er periodat.
65. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 47-64, 10 hvor fragmentet fremstilles ud fra en kapselpolymer ved først behandling af polymeren med syre, base eller enzym og dernæst frembringelse af aldehydgrupper ved behandling med et oxidationsmiddel.
66. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 47-65, 15 der yderligere omfatter behandling af det reduktive amineringsprodukt med formalin.
67. Fremgangsmåde ifølge krav 66, hvor bakterietoxo-idet er difteri-toxoid.
68. Fremgangsmåde ifølge krav 66, hvor toxoidet er
20 CRM197.
69. Fremgangsmåde ifølge krav 66, hvor bakterietoxinet eller -toxoidet er tetanus-toxin eller -toxoid.
70. Vaccine, der fremkalder virksomme niveauer af antikapselpolymer-antistoffer hos mennesker, omfattende et 25 immunogent konjugat ifølge ethvert af kravene 1-46 og en farmaceutisk acceptabel bærer. * 71. Fremgangsmåde til fremstilling af et kapselpoly- merfragment, der har mindst to carbonylgrupper, og som er egnet til anvendelse ved fremstillingen af et tværbundet 30 immunogent konjugat, hvilken fremgangsmåde omfatter behandling af en kapselpolymer af et bakteriepathogen med syre, base eller enzym og frembringelse af carbonylgrupper ved behandling med et oxidationsmiddel.