DK175198B1 - Antibioticum, betegnet gallidermin, og syreadditionssalte deraf, farmaceutiske og kosmetiske præparater indeholdende forbindelserne og fremgangsmåde til forbindelsernes fremstilling samt deres anvendelse til fremstilling af et farmaceutisk præparat - Google Patents

Description

i DK 175198 B1

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt antibioticum, betegnet gallidermin, salte der-- af, farmaceutiske kompositioner indeholdende forbin delserne og fremgangsmåder til forbindelsernes frem-5 stilling samt deres anvendelse til fremstilling af et farmaceutisk præparat.

Der kendes en række polycycliske peptid-antibiotica. Nogle af disse antibiotica indeholder en lanthionin-struktur, for eksempel nisin, subtilin, 10 duramycin, cinnamycin, ancovenin, Ro 09-0198, pep5 og epidermin.

Typisk har disse antibiotica et højt indhold af umættede aminosyrer {dehydroalanin, dehydrobutyrin) og thioetheraminosyrer {meso-lanthionin, (2S,3S,6R)-15 3-methyllanthionin). Lysinolanin, 3-hydroxyasparagin-syre og S-(2-aminovinyl)-D-cystein er også fundet i nogle af dem.

Bortset fra strukturelle ligheder mellem duramycin og cinnamycin synes der kun at foreligge lille 20 sekvenshomologi mellem disse forskellige kendte pep-tid-antibiotica. Dette fremgår klart af fig. 1,· der viser propeptidsekvenserne for nævnte antibiotica. Af denne figur fremgår for eksempel tydeligt, at epidermin ikke viser nogen signifikant sekvenshomologi med 25 de andre antibiotica.

Det skal endvidere bemærkes, at epidermins op- i j rindelse afviger fra oprindelsen af de andre antibiotica (bortset fra pep5), idet epidermin opnås ved at dyrke en stamme af mikroorganismen Staphylococcus 30 epidermis, mens de andre antibiotica er opnået ved dyrkning af stammer af Streptococcus lactis (nisin),

Bacillus subtilis (subtilin), Streptomyces cinnamo-neus og Streptomyces sp. (cinnamycin, duramycin og

I DK 175198 B1 I

i 2 I

I ancovenin) og Streptoverticillum griseoverticillum

I (Ro 09-0198) . I

I Epidermin er særligt aktivt over for mikroorga- I

I nismen Propionibacterium aenes og har følgelig været I

I 5 undersøgt som et muligt terapeutisk aktivt stof til I

I anvendelse ved behandlingen af acne. I

I Det har imidlertid nu vist sig, at et peptid, I

I der strukturelt er nært beslægtet med epidermin, har I

I en overraskende større aktivitet over for Propioni- I

I 10 bacterium aenes sammenlignet med epidermin. Da de I

I kendte peptid-antibiotica generelt afviger betydeligt I

I fra hinanden i strukturel henseende, var det uventet,

I at der eksisterer et yderligere sådant antibiotieum, I

I der kun afviger fra et af nævnte antibiotica ved ud- I

I 15 skiftning af én aminosyre, og det var yderligere I

I overraskende og uforudsigeligt, at en sådan udskift- I

I ning af en enkelt aminosyre i epidermin ville føre I

I til en signifikant aktivitetsstigning over for mikro- I

I organismen Propionibacterium aenes. I

I 20 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer så- I

I ledes en forbindelse, betegnet gallidermin, med I

I strukturen I

I CH?-S-CHo I

I i 1 I

I H-Ile-Ala-NH-CH-CO-Lys-Phe-Leu-NH'CH-CO-NH- I

I -D- -L- I

I 25 ‘I

f1 I

I -CH-s-ch2 I

I i I I

I CH-CO-Pro-Gly-NH-CH-CO-Ala-Lys-Dhb-Gly- I

I -0- -L- I

I 30 I

I cm2- s-CH2 I

I -NH-CH-CO-Phe-Asn-NH-CH-CO-Tyr-NH-CH-CO-NH-CH I

I t 11 I

I I1 I

ch2-s--ch I

3 DK 175198 B1 og farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

Gallidertnin kan fremstilles ved at dyrke mikroorganismen Staphylococcus gallinarum (F1S/P57) Tu 5 3928, der i henhold til Budapest-traktaten er deponeret hos Deutsche Sammlung von Microorganismen den 18. maj 1988 og har fået løbenummer DSM 4616, eller mutanter deraf.

Staphylococcus gallinarum (F16/P57) Tu 3928 10 (DSM 4616) tilhører en nyligt opdaget Staphylococcus-art, der er beskrevet af Devriese et al. (Int. J.

Syst. Bacteriol. 33^ 480-486 (1983)). Stammerne kan isoleres fra kyllingekamme.

Stammen S. gallinarum (F16/P57) Τϋ3928 (DSM

15 4616) er beskrevet detaljeret i artiklen af Devriese et al. omtalt ovenfor.

Det skal bemærkes, at DNA/DNA-homologien mellem S. gallinarum og S. epidermis kun er på mellem 10 og 25%, hvilket viser, at gallidermin- og epiderminpro-20 ducerende stammer hører til klart separate arter. Det skal også bemærkes, at de to arter adskiller sig fra hinanden ved flere andre markører, såsom novobiocin-resistensen og det vide område af positive carbon-hydra treakt ioner (cellobiose, mannitol, melezitose, 25 trehalose, arabinose, ribose og xylitol) af S. gallinarum (Arch. Microbiol. 92_, 65-85 (1973), J. Clin.

Microbiol. I, 82-88, (1975), og "The Procaryotes",

Springer Verlag, Heidelberg, 1548-1569 (1981)).

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer der-30 for yderligere en fremgangsmåde til fremstilling af gallidermin og farmaceutisk acceptable salte deraf, hvilken fremgangsmåde indebærer dyrkning af en mikroorganisme, der kan eksprimere gallidermin, fortrins-

I DK 175198 B1 I

I 4 I

I vis S. gallidermin (F16/P57) Tu 3928 (DSM 4616), un- I

I der betingelser, ved hvilke gallidermin eksprimeres I

I og sekreteres i kulturmediet, og, om ønsket, omdan- I

I nelse af det isolerede stof til et farmaceutisk ac- I

I 5 ceptabelt salt deraf. I

I Dyrkningen af gallidermin-producerende mikroor- I

I ganismer, såsom S. gallidermin (F16/P57) Tu 3928 (DSM I

I 4616), kan foregå ved standardmetoder under anvendel- I

I se af konventionelt dyrkningsmedium. For eksempel kan I

I 10 S. gallidermin (F16/P57) Τύ 3928 (DSM 4616) dyrkes i I

I et medium indeholdende en passende nitrogenkilde, en I

I passende carbonkilde og et hydroxid af et jordalkali- I

I metal, for eksempel et medium indeholdende kød- I

I ekstrakt, maltekstrakt og Ca(OH)2 i en passende bio- I

I 15 reaktor. Dyrkning skal foregå under luftning og inden I

I for et pH-område på f.eks. 5,4-8,5, idet dyrkning I

I fortrinsvis startes ved et pH i området 6-7. I

I Gallidermin kan isoleres fra fermentationsvæ- I

I sken på en hvilken som helst konventionel måde, der I

20 anvendes til at isolere proteiner med lille molekyl- I

I vægt fra sådanne medier. I

I Det har navnlig vist sig, at gallidermin let I

I kan isoleres ved simpelthen at behandle dyrkningsme- I

I diet med et adsorptionsmiddel efterfulgt af en pro- I

I 25 ces, der omfatter adsorption på en svag kationbytter- I

I harpiks, afsaltning og eventuelt et yderligere chro- I

I matografisk rensningstrin, f.eks. reversfase-HPLC el- I

I ler chromatografi på Gel Sephadex LH20 under anven- I

I delse af f.eks. methanol/0,01 N HC1 (9:1) som elue- I

I 30 ringsmiddel. I

I Da forbindelsen gallidermin er stærkt basisk, I

I vil den let danne syreadditionssalte med egnede, far- I

I maceutisk acceptable syrer ved konventionelle frem- I

5 DK 175198 B1 gangsmåder. Fysiologisk acceptable organiske eller uorganiske syrer, der kan anvendes til dette formål, er for eksempel saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovlsyre, benzosulfonsyre, methansulfonsyre, p-toluen-5 sulfonsyre og cyclohexylsulfaminsyre.

Antibakteriel aktivitet

Inhibitoriske minimum-koncentrationer (MIC, ta-10 bel I) blev bestemt i flydende BF-medium med følgende sammensætning: natriumlactat 0,5%, natriumsulfat 0,5%, kaliumdihydrophosphat 0,05%, dikaliumhydrophos-phat 0,15%, magnesiumchlorid 0,02%, ammonium-chlorid 0,05%, glucose 1%, suppleret (pr. ml) med Ca-15 pantothenat 50 /xg, folinsyre 0,25 μ9, niacin 50 /xg, p-aminobenzoesyre 25 μg, pyridoxal-hydrochlorid 50 μ<3 og riboflavin 25 μg.

I DK 175198 B1 I

I 6 I

I Resultaterne er vist i nedenstående tabel I. I

I Tabel I I

I 5 Mikroorganismer MIC (ptg/ml) I

I St.aureus SG 511 4 I

I St.aureus E 88 8 I

I St.epidermidis ATCC 12228 4 I

I 10 St.pneumoniae ATCC 6302 4 I

I Sc.pyogenes ATCC 8668 1 I

I Sc.faecalis ATCC 29212 64 I

I Cb.xerosis ATCC 9755 1 I

I E.coli ATCC 11775 128 I

I 15 Ps. aeruginosa BC 19 128 I

I Mc.luteus ATCC 9341 0,25 I

I Mc.luteus 15957 0,5 I

I Bac.fragilis (Bonn) 128 I

I Bac.fragilis (Koln) 128 I

I 20 Peptostreptococcus anaerobicus 0,5 I

I Ved en sammenlignings-undersøgelse med epider- I

I min på Propionibacterium aenes blev der opnået føl- I

I gende MIC-værdier: I

I 25 MIC (^g/ml) I

I Gallidermin 0,125 I

Epidermin 0,25 I

I På grund af den bredspektrede antibakterielle I

I 30 aktivitet er gallidermin og dets syreadditionssalte I

I anvendelige til bekæmpelse af bakterier og til be- I

I handling af bakterieinfektioner. Navnlig er gallider- I

I min og dets syreadditionssalte, på grund af deres ak- I

7 DK 175198 B1 tivitet over for vigtige stammer af Propionibacterium aenes, særligt anvendelige til bekæmpelse af hudinfektion, såsom aene, eksem, impetigo og cellulitis.

Ifølge en yderligere udførelsesform for opfin-5 delsen er der således tilvejebragt farmaceutiske kompositioner indeholdende som aktiv bestanddel galli-dermin eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf i kombination med ét eller flere inerte farmaceutiske bærestoffer og/eller excipienser.

10 Til farmaceutisk anvendelse kan nævnte polypep- tid inkorporeres i præparater i enten flydende eller faste former under anvendelse af bærestoffer og excipienser, der konventionelt anvendes inden for farmacien, eventuelt i kombination med yderligere aktive 15 bestanddele. Præparatet kan for eksempel anvendes oralt, parenteralt, enteralt eller fortrinsvis topisk. Foretrukne former omfatter for eksempel opløsninger, emulsioner, geler, sprayprodukter, lotioner, salver, cremer eller pulvere.

20 Kompositionerne kan med fordel foreligge som dosisenheder, idet hver enhed er beregnet til at tilføre en fastsat dosis af aktiv bestanddel. Den totale daglige dosis kan varieres alt efter recipienten og den behandlede sygdom.

25 Ifølge en yderligere udførelsesform angår op findelsen anvendelse af en forbindelse ifølge opfindelsen til fremstilling af et farmaceutisk præparat, fortrinsvis til ' topisk brug, til behandling af en bakterieinfektion, navnlig hudinfektioner, såsom ek- 30 sem, impetigo, cellulitis og acne.

Gallidermin og dets syreadditionssalte kan også anvendes som additiv i kosmetiske præparater, navnlig sådanne, der indeholder collagen, i hvilke de vil - -— i_. - —

I DK 175198 B1 I

I I

I fungere som stabilisator. I

I Et kosmetisk præparat ifølge den foreliggende I

I opfindelse vil indeholde gallidermin eller et syread- I

ditionssalt deraf i kombination med et egnet bærestof I

I 5 og/eller excipiens, fortrinsvis collagen, og eventu- I

I elt andre additiver, der er egnede for kosmetiske I

I præparater, såsom parfumer og farvestoffer. I

I Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende I

I eksempler. I

I 10 I

I Eksempel 1 I

I Fermentation I

Dybfrosne kulturer af S. gallinarum anvendtes I

15 til at inokulere agarplader indeholdende GA-medium. I

Efter at de inokulerede plader var holdt 12 timer ved I

37°C, blev de overført til Erlenmeyer-kolber indehol- I

dende 100 ml af et dyrkningsmedium bestående af 3,3% I

I kødekstrakt, 3,0% maltekstrakt og 0,38% Ca(OH)2 ved pH I

I 20 6,5. I

I De inokulerede kolber holdtes på en roterryster I

(type RC106, Infors AG Basel) ved en hastighed på 160 I

rpm og en temperatur på 36°C i 8 timer. Af den resul- I

terede prækultur anvendtes 200 ml til at inokulere en I

I 25 20 liters bioreaktor-fermentationsbeholder (Giovanola I

Freres, Monthey) udstyret med et intensorsystem. Det I

anvendte medium var det samme som det i det foregåen- I

I de afsnit beskrevne, men indeholdende yderligere 6% I

NaCl. Luftnings- og omrørings-hastighederne blev ind- I

30 stillet på 0,4 vol/vol/min. og 900 rpm. p02 af tog hur- I

I tigt til mindre end 10% i løbet af de første 5 timer. I

I Efter 10 timer steg det til 80% i løbet af den reste- I

I rende fermentationstid. pH-Værdien faldt fra 6,5 til I

9 DK 175198 B1 5.4 i løbet af de første 8 timer og steg derefter til 8.5 i løbet af den resterende fermentationstid. Den maksimale celletæthed blev nået efter 24 timer med 8-9 x 109 celler pr. ml. Udviklingen af skum blev for- 5 mindsket ved gentagne tilsætninger af Polyurax Polyol PPG2025 (BP Chemicals).

Isolering

Efter 34 timers fermentation blev adsorptions-10 harpiks Amberlite XAD-1180 tilsat direkte til fermentationsbeholderen. Tre charger af adsorptionsmiddel (i mængder på 2%, 1% og 1% i forhold til voluminet af fermentationsvæsken) blev tilsat med mellemrum på 45 minutter. Harpiksen blev frafiltreret og vasket med 15 30 liter vand og methanol/0,01 N HC1 (9:1), og det aktive elueringsmiddel (1,4 liter) blev koncentreret ved reduceret tryk, hvorved der blev opnået en tørvægt på 2,7 g.

Produktet blev derefter genopløst i metha-20 nol/0,01 N HC1 (9:1) og overført til Amberlite IRC-50 (H+-form) ved pH 5,5. Harpiksen blev derefter vasket med vand og elueret med 0,1 N HC1.

Eluatet indeholdende gallidermin blev derefter bragt i kontakt med Amberlite XAD-1180 med henblik på 25 afsaltning, og opløsningen blev skilt fra Amberliten og underkastet lyofilisering.

Det lyofiliserede produkt blev derefter opløst i vand og chromatograferet ved reversfase-HPLC. Dette trin gennemførtes på Waters-systemet med to pumper 30 501, en autoinjektor WISP 712 og en gradient-programmer M6B0. Som stationære faser anvendtes Nucleosil 10C18 eller 5C18 (kolonner 4,6x250 mm og 8x250 mm) og HD-Gel-RP-7s-300 (kolonne 4x150 mm) .

I DK 175198 B1 I

I I

I Eluering gennemførtes ved anvendelse af forskellige I

I gradienter af acetonitril/O,1% trifluoreddikesyre i I

I vand. Det resulterende eluat indeholdende gallidermin I

I blev opsamlet og kunne koncentreres ved inddampning I

I 5 og, om ønsket, optages i vand og lyofiliseres flere

I gange. I

I Det lyofiliserede produkt stammende fra afsalt- I

I ningstrinnet kan renses ved gelchromatografi som et

I alternativ til RP-HPLC. Ved en sådan operation oplø- I

I 10 ses lyofilisatet i methanol/0,01 N HC1 (9:1) og ledes I

I gennem en søjle under anvendelse af Sephadex LH 20 I

I som stationær fase. Det resulterende eluat indehol- I

I dende gallidermin behandles, som ovenfor beskrevet. I

I 15 Fremstillingen af gallidermin ved fermentation, I

I som for eksempel beskrevet ovenfor, kan følges, idet I

I der anvendes standardteststammen Micrococcus luteus I

I ATCC 9341 på agarplader indeholdende 10 ml GA agar I

I be-stående af peptin 10 g, lab lemco-pulver (Oxoid) 8 I

I 20 g, NaCl 3 g, Na2HP04 2 g, glucose 10 g (steriliseret I

I separat), agar 20 g, H20 1 liter, pH 7,2-7,4. I

I Stammen S. gallinarum kan lagres ved -18 C i I

I rør i følgende medium: lab lemco-pulver (Oxoid) 33 g, 1 I

I malt-ekstrakt (Frånkel + Ech) 30 g, Ca(0H)2 3,7 g, I

I 25 glycerol 400 g, H20 1 liter ved pH 6,0. I

Eksempel 2 I

I Tinktur

I 100 g Tinktur indeholder H

I 30 Gallidermin 1,0 g H

I Ethanol (94,5 vol%) 56,0 g

I 1,2-Propylenglycol 40,0 g I

I Demineraliseret vand 3,0 g I

11 DK 175198 B1

Fremstilling

Gallidermin opløses i en blanding af ethanol /1 , 2 -propylenglycol /vand, og opløsningen steril-5 filtreres derefter.

Eksempel 3

Lotion 10 100 g Lotion indeholder

Gallidermin 1,00 g l,2-Propylenglycol 7,00 g

Alkyldimethy1benzylammo-niumchlorid (Benzalkon A®) 0,15 g 15 Sorbitan-monopalmitat (Span 40®) 0,40 g

Sorbimacrogol-palmitat (Tween 40®) 1,20 g

Decyl-oleat (Cetiol V®) 2,40 g 20 Blanding af cetyl- og stearylalkoholer (Lanette 0®) 1,60 g

Cetyl-palmitat 0,80 g

Demineraliseret vand til 100 g 25

Fremstilling

Ovennævnte mængder af alkyldimethylbenzylammo-niumchlorid, sorbitan-monopalmitat, sorbimacrogolpal-mitat, decyl-oleat, cetyl- og stearylalkoholer og ce-30 tyl-palmitat omrøres i 75 ml vand, den filtrerede opløsning af gallidermin i 1,2-propylenglycol og det resterende vand røres i, og blandingen homogeniseres.

I DK 175198 B1 I

I 12 1

I Eksempel 4 I

I Gel I

I 100 g Gel indeholder I

I 5 Gallidermin 1,0 g I

I Polyethylenglycolether af I

I lauryl-al kohol (Brij 35 ®) 1,0 g I

I 1,2-Propylenglycol 5,0 g I

I Acrylsyre-polymer (Carbopol I

I 10 934®) 1,2 g I

I Methyl-p-hydroxybenzoat 1,6 g

I Propyl-p-hydroxybenzoat 0,4 g I

I Parfume g.s. I

I Natriumhydroxidopløsning til pH 6,5 I

I 15 Demineraliseret vand til 100 g I

I Fremstilling

I De anførte mængder af excipiens omrøres i 75 ml I

I vand. Gallidermin opløses i en blanding af 1,2- I

I 20 propylenglycol og det resterende vand, og denne op- I

I løsning røres i. Den færdige gel homogeniseres igen. I

I Referenceeksempel 1 I

I 25 Ved tyndtlagschromatografi på silicagelplader I

I 60F254 (Merck Darmstadt) fandtes følgende Rf-værdier I

I for gallidermin: I

I Rf (chloroform/methanol/17 % NH3 2:2:1) = 0,73 I

I Rf (chloroform/methanol/17 % NH3 70:35:10) = 0,30 I

I 30 Rf (1-butanol/eddikesyre/vand 4:1:1) = 0,05. I

13 DK 175198 B1

Referenceeksempel 2

Total hydrolyse af peptidet {100 nmol) gennemførtes i 6 N HC1 (200 μΐ) indeholdende thioglycolsyre 5 (5 μΐ) under nitrogen ved 110"C i 18 timer i forseglede medicinflasker. Efter inddampning blev det resterende hydrolysat opløst i natriumcitratpuffer pH 2,2 og analyseret ved anvendelse af standardprogrammet for aminosyreanalyseapparatet LKS 4150. Følgende 10 værdier blev fundet (beregnet):

Ala 1,98 (2), Asp 0,98 (l),Gly2,10 (2), Ile 0,92 (1), Leu 0,98 (1), Lan 2,0 (2), Lys 1,91 (2), MeLan 1,0 (1), Phe 1,86 (2), Pro 0,91 (1), Tyr 0,87 (1).

15 Referenceeksempel 3

Bestemmelse af aminosyrernes konfiguration

Konfigurationen af protein-aminosyrerne og ! navnlig af lanthionin og 3-methyllantionin blev be-20 stemt ifølge en nyligt udviklet gas-chromatografisk metode (Kusters E. et al., Chromatographia _18, 287- 293 (1984)), der adskiller trifluoracetylerede amino- syre-n-propylestre på glaskapillarer (25-33 m) belagt med Chirasil-Val (Frank H. et al, J. Chromatographia, 25 146, 197-206 (1978)) under anvendelse af en gaschro- matograf Sichromat Autoderivat 100 (Siemens). Prøver indeholdende ca. 100 nmol af aminosyrer blev deriva-tiseret på følgende måde: esterificering med 4 N HC1/1 -propanol (1 ml) ved 110 °C i 30 minutter i en 30 forseglet medicinflaske. Efter tørring i en strøm af nitrogen blev der tilsat trifluoreddikesyreanhydrid (50 μΐ) og opvarmet i den forseglede medicinflaske ved 140°C i 10 minutter. Opløsningen blev igen ind-

I DK 175198 B1 I

I I

I dampet i en nitrogenstrøm. Til analyse blev prøver I

I anbragt i dichlormethan. Bærergassen var nitrogen, og I

I der anvendtes en flammeioniseringsdetektor. Med hen- I

I syn til temperaturprogrammet, se ovennævnte referen- I

I 5 cer. Der blev opnået følgende værdier: I

I L-Ala (2), L-Asp (1), L-Gly (2), L-Ile (1), me^ I

I so-Lan (2> , L-Leu (1), L-Lys (2), (2S, 3S, 6R)-3- I

I MeLan (1), L-Phe (2), L-Pro (1). I

I 10 Referenceeksempel 4 I

I Tryptisk kløvning I

I Gallidermin blev opløst i en pufferopløsning (1 I

I mg/ml) bestående af 0,05 M N-ethylmorpholinacetat, I

I 15 0,01 M CaCl2,6H20, pH 7,8 og trypsin (50 pg Calbio- I

I chem) . Efter 24 timer ved 37eC blev den enzymatiske I

I kløvning stoppet ved tilsætning af eddikesyre til pH I

I 4, og opløsningen blev afkølet til 0°C for at udfælde I

I det C-terminale fragment 14-21. Efter centrifugering I

I 20 blev supematanten lyofiliseret, og de opløselige I

I komponenter blev renset ved RP-HPLC, hvorved der blev I

I opnået det N-terminale fragment 1-13. '

I Referenceeksempel 5 I

I 25 I

I Massespektrometri I

I Positive FAB-massespektre (fig. 3) blev regi- I

I streret med et spektrometer VG 70/250/SEQ udstyret I

I med en caesiumionkilde. Prøver blev anbragt i 3- I

I 30 nitrobenzylalkohol/methanol-matriks. I

I Værdien {M+H]+: 2166 M.U. bekræftede den bereg- I

I nede molekylmasse. Spektret af datterioneme (fig. I

I 3b) viser fragmenterne Bu, B13, B14 og B15. Disse frag- I

DK 175198 él 15 menter er typiske for det tryptiske kløvningssted, og denne overlapning kombinerer resultaterne opnået for de separat analyserede N- og C-terminale fragmenter.

Termospray-ioniserings-massespektre blev opnået 5 ved anvendelse af termospraysysternet HP 5988 (Hewlett Packard). Prøver af det tryptiske fragment 14-21 af gallidermin blev injiceret. Positiv ionisering med yderligere elektronindvirkning anvendtes, og ionerne blev påvist i scanregionen 350-950 masseenheder. I 10 den signifikante region 350-550 masseenheder blev påvisning af adskillige fragmenter opnået efter bag-grundssubstraktion og bekræftet via coeluering af masser.

Spektret er vist i scan-regionen 350-550 dalton 15 i fig. 2. Stabiliteten af Cys(Avi), der udgør den amiderede C-terminus, er bemærkelsesværdig, fordi den danner hbvedspidsen. En karakteristisk firefold fragmentation hver med tofold bindingskløvning er karakteristisk for begge C-terminale fragmenter gallider-20 min 14-21 og epidermin 14-21. Coeluering af masserne bekræfter dette særlige fragmentationsmønster.

Referenceeksempel 6 25 Peptid-sekvensbestemmelse

Gallidermin og dets N-terminale fragment blev sekvensbestemt ved automatiseret Edman-nedbrydning under anvendelse af en "pulsed-liquid gas phase sequencer 477A" med on-line PTH-analyseapparat (Applied 30 Biosystems). Prøver af RP-HPLC-separationer opløst i HPLC-elueringsmidlet blev anbragt direkte på filterpladen i reaktionskammeret.

Sekvensbestemmelse og PTH-analyse gennemførtes

I DK 175198 B1 I

I 16 I

I med standard-programmer. I

I Denne analyse viste den N-terminale sekvens I

I Ile1-Ala2-x3-Lys4-Phes-Leui-x7-xe-Pro9-Gly10-xu-Ala12- I

I 5 Lys13. I

I Det ved position 3, 7, 8 og 11 viste x angiver I

I de positioner, ved hvilke der ikke blev påvist noget I

I aminosyrederivat. Disse positioner svarer til én Lan- I

I 10 og én MeLan-rest ifølge aminosyresammensætningen af I

I det N-terminale fragment. I

I På grund af sulfidbroerne og de særlige egen- I

I skaber af bis-PTH-Lan kan automatisk nedbrydning ikke I

I vurderes ved disse positioner, men nedbrydning går I

15 imidlertid videre. Nedbrydnings-udbytterne for galli- I

dermin er vist i fig. 4. I

I Aminosyren Leu blev påvist utvetydigt i positi- I

I on 6. I

I Der er et karakteristisk enzymatisk kløvnings- I

I 2 0 sted Lys13-Dhb14 i den centrale del af gallidermin. Un- I

I der tryptisk digerering blev der observeret udfæld- I

I ning af det resulterende C-terminale, ikke-ladede og I

I hydrofobe fragment 14-21, mens det N-terminale fire- I

I fold ladede og hydrofile fragment 1-13 forbliver i I

25 opløsning. I

Kløvningshastigheden for Lys-Dhb-bindingen er I

meget langsom sammenlignet med andre bindinger af Lys I

I med en hvilken som helst protein-aminosyre. Ligesom I

I det er tilfældet ved epidermin, fører tryptisk kløv- I

I 30 ning til omdannelse af Dhb til 2-oxobutyryl-rest, I

I hvilket hindrer strukturoplysning ved Edman- I

I nedbrydning af det C-terminale fragment. I

17 DK 175198 B1

Referenceeksempel 7

Ultraviolet analyse UV-Spektret for gallidermin bekræfter den viny-liske dobbeltbinding ved 267 nm, der udviser den me-5 get høje ekstinktionskoefficient på 11000 M^cm*1 (vand, 0,1 mg/ml, d=l cm, 21°C) sammenlignet med den lave værdi for tyros in-absorptionen (1400 M‘1cm'1) . 2 2

Claims (8)

1. 3. Farmaceutisk komposition ifølge krav 2, k e I 25ndetegnet ved, at den er til topisk anvendel- I I se. I
2. 4. Anvendelse af en forbindelse ifølge krav 1 I I til fremstilling af et farmaceutisk præparat, for- I I trinsvis til topisk brug, til behandling af en bakte- I I 30 rieinfektion, navnlig hudinfektioner, såsom eksem, I impetigo, cellulitis og acne. I
3. 5. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbin- I I delse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en I DK 175198 B1 19 gallidermin-producerende stamme af Staphylococcus gallinarum dyrkes under betingelser, ved hvilke gal-lidermin eksprimeres og sekreteres ind i dyrkningsmediet, hvorefter galliderminet isoleres fra dyrknings-5 mediet og, om ønsket, omdannes til et syreadditions-salt deraf.
4. 6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at nævnte isoleringsproces omfatter behandling af dyrkningsmediet med et adsorptionsmid- 10 del, og derefter adsorption på en svag kationbytter-harpiks, afsaltning og eventuelt et yderligere chro-matografisk rensningstrin.
5. 7. Fremgangsmåde til fremstilling af en farmaceutisk komposition ifølge krav 2, kendeteg- 15. e t ved, at en forbindelse ifølge krav 1 bringes i grundig kontakt med et farmaceutisk acceptabelt bærestof og/eller excipiens.
6. 8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at der fremstilles en farmaceutisk 20 komposition til topisk anvendelse.
7. 9. Kosmetisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en forbindelse ifølge krav 1 i kombination med et passende bærestof og/eller excipiens og fortrinsvis omfattende collagen.
8. 10. Antibiotisk forbindelse, kendeteg net ved, at den er en forbindelse, der kan fremstilles af mikroorganismer af stammen Staphylococcus gallinarum DSM 4616 eller mutantstammer deraf, eller er et fysiologisk acceptabelt salt af en sådan for- 30 bindelse.