DK175125B1 - Middel til bekæmpelse af skadelige organismer og til behandling af planter samt fremgangsmåde og anvendelse af mikroorganismer til midlets fremstilling - Google Patents

Description

i DK 175125 B1

Opfindelsen angår et hidtil ukendt middel til bekæmpelse af skadelige organismer og til behandling af planter, der består af bærestoffrie cellegranulater af mikroorganismer eller i det mindste indeholder et bærestoffrit cellegranulat 5 af mikroorganismer, en fremgangsmåde til dets fremstilling . samt anvendelsen af hidtil ukendte stammer af mikroorganis mer til midlets fremstilling.

Det er allerede kendt, at visse mikroorganismer (bakterier, svampe og vira) kan være pathogene over for skadelige 10 organismer, såsom insekter eller nematoder, og kan anvendes inden for skadedyrsbekæmpelsen. Tilvejebringelsen af egnede mikroorganismepræparater med en standardiseret virkning støder dog i mange tilfælde på store vanskeligheder, da formuleringen af mikroorganismerne ofte påvirker deres virk-15 ning og lagerbestandighed ufordelagtigt.

Det hidtil ukendte middel ifølge opfindelsen til bekæmpelse af skadelige organismer og til behandling af planter er ejendommeligt ved, at det består af bærestoffrie cellegranulater af mikroorganismer, der er egnede til be-20 kæmpelse af skadelige organismer eller til behandling af planter, eller i det mindste indeholder et bærestoffrit cellegranulat af sådanne organismer, hvorhos cellegranulaterne fortrinsvis er dannet af svampe eller bakterier, der er i stand til myceliedannelse, og hvorhos cellegranu-25 laterne er i det væsentlige kugleformige og har en diameter fra 0,05 til 2,0 mm.

, Ved midler til bekæmpelse af skadelige organismer 1 skal forstås alle midler ifølge opfindelsen, der kan anvendes til bekæmpelse af uønskede, skadelige og besværlige dyre-30 og planteorganismer, såsom skadelige arthropoder og nematoder, ukrudtsarter og ugræsser, skadelige bakterier og svampe. Generelt beror virkningen af disse midler til bekæmpelse af skadelige organismer på de anvendte mikroorganismers antagonistiske evne (parasitisering, toxindannelse, konkurren-35 ceforhold) over for de skadelige organismer, der fører til, at de bliver holdt inden for visse grænser eller dræbt.

am i a w MW mm a 2

Midlerne til bekæmpelse af skadelige organismer anvendes fortrinsvis på områderne landbrug, skovbrug, havebrug, husholdning og hygiejne, forrådsbeskyttelse og materialebeskyttelse, især til beskyttelse af planter eller høstprodukter.

5 Foretrukne midler ifølge opfindelsen til bekæmpelse af skadelige organismer er sådanne, der kan anvendes til bekæmpelse af skadelige organismer, der kan forekomme i jordbunden.

Ved plantebehandlingsmidler skal forstås alle midler ifølge opfindelsen, der er egnede til at påvirke eller regu-10 lere planters vækst, f.eks. ved udskillelse af plantehor-moner, tilvejebringelse af næringsstoffer osv. De kan især anvendes på områderne landbrug, skovbrug og havebrug.

Foretrukne midler ifølge opfindelsen er midlerne til bekæmpelse af skadelige organismer, fortrinsvis til bekæm-15 pelse af dyriske skadelige organismer (fortrinsvis arthropo-der og nematoder, især insekter og nema toder, ganske særligt foretrukket insekter) og af mikrobielle skadelige organismer (såsom skadelige bakterier og svampe), især af dyriske skadelige organismer.

20 De bærestoffrie cellegranulater af mikroorganismer, der anvendes ifølge opfindelsen, er i det væsentlige kugle-formige dannelser, der er sammensat af vævagtigt forvoksede mikroorganismeceller og ikke indeholder nogen bærematerialer. De er mekanisk så stabile, at de ikke forandres på 25 uønsket måde ved fremstillingen, oparbejdningen, påfyldningen og anvendelsen, f.eks. ved slid. Cellegranulaterne har diametre fra 0,05 til 2,0 mm, fortrinsvis fra 0,1 til 1,5 mm og særlig foretrukket fra 0,5 til 1,0 mm.

Opfindelsen angår desuden anvendelsen af mikroor-30 ganismer, der er egnede til bekæmpelse af skadelige organismer eller til behandling af planter, og som er i stand til myceliedannelse, til fremstilling af det her omhandlede middel.

I betragtning som mikroorganismer, der kan anvendes 35 ifølge opfindelsen i form af cellegranulater, kommer alle mikroorganismer (bakterier og svampe), som er i stand til 3 DK 175125 B1 myceliedannelse. De må endvidere (under vakuumbetingelserne ifølge opfindelsen) kunne danne celleaggregater og cellegranulater. Når cellegranulaterne ifølge opfindelsen er beregnet til bekæmpelse af skadelige organismer, må mikro-5 organismerne være i stand til at påvirke de skadelige organismer, der skal bekæmpes, således i deres livskraft eller deres formeringsevne, at de på grund af indvirkningen af midlerne til bekæmpelse af skadelige organismer kontrolleres i tilstrækkelig grad. Hertil må de mikroorganismer, der 10 anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, være i stand til at afgive stoffer til omgivelserne, der påvirker de skadelige organismer på tilsvarende måde, eller være i stand til at parasitere de skadelige organismer tilstrækkeligt.

Når de ifølge opfindelsen anvendte cellegranulater 15 skal anvendes som plantebehandlingsmidler, må mikroorganismerne være i stand til at afgive stoffer til omgivelserne, der påvirker planterne, f.eks. phytohormoner eller næringsstoffer, eller som uskadeliggør stoffer, der påvirker planterne negativt.

20 De i cellegranulateme anvendte mikroorganismer bør ikke have nogen pathogene egenskaber over for varmblodede dyr og desuden ikke skade nogen nyttige organismer, såsom regnorme og bier.

Et stort antal mikroorganismer, især svampearter af 25 de taxonomiske klasser phycomyceter, ascomyceter, f.eks. Chaetomium, basidiomyceter og deuteromyceter er i stand til at danne cellegranulater, især repræsentanter for Fungi imperfecti, f.eks. forskellige arter af Aspergillus, Alter-naria, Aphanocladium, Beauveria, Coniothyrium, Colletotri-30 chum, Meria (Drechmeria), Penicillium, Fusarium, Gliocladium, Pseudocercosporella, Trichoderma, Verticillium og Paecilo-myces, og især af Metarhizium og Gliocladium, særlige foretrukket af Metarhizium. Talrige stammer af disse svampe udviser en antagonistisk aktivitet mod plantepathogene svampe 35 i jorden, f.eks. Trichoderma hamatum og Gliocladium roseum, mod ukrudtsarter, f.eks. Altemaria cassiae, Fusarium late-

Ul\ Ί /012b ΒΊ 4 ritum, Fusarium solani, og mod skadelige insekter, f.eks. Verticillium lecanii, Aspergillus parasiticus og især Meta-rhizium anisopliae.

Blandt mikroorganismerne foretrækkes fungicide, nema-5 topathogene og entomopathogene mikroorganismer, især svampe af klassen deuteromycetes. Især foretrækkes nematopathogene og entomopathogene mikroorganismer*

Ganske særligt foretrækkes svampe af slægten Meta-rhizium, især af arten Metarhizium anisopliae og ganske 10 særligt stammerne Metarhizium anisopliae P 0001 og P 0003, især stammen P 0001. Disse hidtil ukendte stammer, der ifølge opfindelsen er særlig gunstigt anvendelige, og som tillige er genstand for den foreliggende opfindelse, blev den 24. oktober 1986 deponeret i Deutsche Sammlung von Mikroorganis-15 men (DSM), Grisebachstrasse 8, 3400 Gottingen, DB, i overensstemmelse med bestemmelserne i Budapestertraktaten om international anerkendelse af deponering af mikroorganismer og har deponeringsnumrene DSM 3884 (P 0001) og 20 DSM 3885 (P 0003).

Den foreliggende opfindelse omfatter også de mutanter og varianter af disse stammer, der frembyder de for udøvelsen af opfindelsen væsentlige kendetegn og egenskaber. Disse 25 Metarhizium-stammer giver ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen cellegranulater med meget gunstige fysiske og biologiske egenskaber, der muliggør anvendelsen af disse cellegranulater som midler til bekæmpelse af skadelige organismer, fortrinsvis til bekæmpelse af arthropoder og nematoder, 30 især af insekter og nematoder (specielt insekter) og ganske særligt foretrukket af jordinsekter, dvs. insekter, der forekommer i jorden, på jorden eller på plantemateriale i nærheden af jorden.

De hidtil ukendte, bærestoffri cellegranulater kan 35 indeholde næringsstoffer, f.eks. sådanne, der anvendes ved fermenteringen ved fremstillingsfremgangsmåden ifølge opfin- DK 175125 B1 I 5 I delsen. Disse næringsstoffer kan begunstige en hurtig vækst I af mikroorganismerne efter anvendelse af de nye midler.

I De kan desuden indeholde beskyttende stoffer, der I forhindrer en for stærk udtørring af mikroorganismecellerne, I 5 f.eks. polyalkoholer, såsom sukkerarter eller glycerol.

I Til forbedring af lagerbestandigheden kan de omhand- I lede cellegranulaterne indeholde ikke-toksiske, antioxi- I danten, f.eks. ascorbinsyre, 2,3-tert.butyl-4-hydroxyanisol, I 2,6-di-tert.butyl-p-cresol, propylgallater eller nordihydro- I 10 guaiaretsyre.

I En hurtig rehydratisering efter anvendelsen kan opnås I ved, at de nye cellegranulater indeholder hydroskopisk virk- I somme stoffer, såsom egnede polyalkoholer, f.eks. glycerol, I sukkerarter, oligo- og polysaccharider og deres derivater.

I 15 1 en speciel udførelsesform frembyder cellegranula- I terne især på overfladen en forhøjet mængde af permanente I stadier af mikroorganismer, f.eks, hvilende eller sovende I stadier, såsom sporer eller konidier. Alment resulterer I dette i en særlig langvarig lagerbestandighed, men en hurtig I 20 formering og udbredelse af de i form af cellegranulater I påførte mikroorganismer.

I I en særlig foretrukken udførelsesform indeholder I cellegranulaterne ifølge opfindelsen dog ingen af ovennævnte I additiver. Fortrinsvis anvendes cellegranulater ifølge op- I 25 findel sen, der ikke indeholder en forhøjet mængde permanente I stadier.

I Midlerne ifølge opfindelsen kan foruden de bærestof- I frie cellegranulater indeholde yderligere midler til bekæm- I pelse af skadelige organismer, f.eks. fungicider, insek- I 30 ticider eller herbicider, eller plantebehandlingsmidler, I f.eks. gødningsstoffer, som tilblandinger.

I Fortrinsvis anvendes midler ifølge opfindelsen, der I består af bærestoffrie cellegranulater uden yderligere til- I blanding.

I 35 I forhold til traditionelle mikroorganismepræparater, I der er foreslået eller anvendt som midler til bekæmpelse af 6 UK 175125 Bl skadelige organismer eller til behandling af planter, frembyder de hidtil ukendte cellegranulater ifølge opfindelsen på grund af deres fysiske og biologiske egenskaber væsentlige fordele.

5 Cellegranulateme kan let fremstilles ved fremgangs- S’ måden ifølge opfindelsen. Ved produktionsfremgangsmåden kan de særlig let skilles fra. Deres håndterbarhed ved bearbejdningen (fraskillelse, tørring, påfyldning og lagring) og anvendelsen er god, da de ikke støver, har en defineret 10 kornstørrelse og meget gode bulkegenskaber og meget let kan doseres og påføres på enkel måde. Foruden en god mekanisk stabilitet frembyder de hidtil ukendte cellegranulater en høj lagerstabilitet, således at de også efter længere tids lagring kan udfolde deres fulde biologiske virkning, og den 15 ved fremstillingen forudgivne virkningsstandard bibeholdes, hvilket er af særlig betydning for praksis ved midler til bekæmpelse af skadelige organismer med biologiske materialer.

Den her omhandlede fremgangsmåde til fremstilling af det her omhandlede middel til bekæmpelse af skadelige or-20 ganismer og til behandling af planter er ejendommelig ved, at man A) til initiering af celleaggregationen a) hvor der er tale om mikroorganismeceller med en 25 i det væsentlige hydrofob celleoverflade, efter tilsætning af et eller flere detergenser til en vandig opslæmning af de i en forkultur fremkomne mikroorganismer, der er egnede til bekæmpelse af skadelige organismer eller behandling af plan-30 ter, suspenderer cellerne og indfører cellesus pensionen i vand eller et vandigt næringsmedium, således at der sker en celleaggregation, b) hvor der er tale om mikroorganismeceller uden en 35 i det væsentlige hydrofob celleoverflade, indstil ler pH-værdien i vand eller et vandigt nærings-

I DK 175125 B1 I

I 7 I

I medium ved tilsætning af syrer eller baser til I

I en opslæmning af i de en forkultur fremkomne I

I mikroorganismer, der er egnede til bekæmpelse af I

I skadelige organismer eller behandling af planter, I

I 5 således at der sker en celleaggregation, eller I

I c) til en opslæmning eller suspension af i de en for- I

I kultur fremkomne mikroorganismer, der er egnede I

I til bekæmpelse af skadelige organismer eller til I

I 10 behandling af planter, i vand eller et nærings- I

I medium sætter flokkulanser, således at der sker I

I en celleaggregation, I

hvorefter man I

I 15 I

B) til dannelse af cellegranulaterne underkaster de I

I opnåede celleaggregater en fermentering under aerobe I

I betingelser i et næringsmedium, der eventuelt in- I

I deholder kompleksdannende stoffer, og skiller de I

20 dannede cellegranulater fra, og I

I C) eventuelt til dannelse af en i det væsentlige på I

I overfladen af cellegranulaterne forhøjet mængde af I

permanente mikroorganismestadier underkaster de fra- I

I 25 skilte cellegranulater en inkubation under betingel- I

serne for en overfladekultur, og I

D) tørrer de opnåede cellegranulater, eventuelt efter I tilsætning af eller behandling med næringsstoffer, I 30 beskyttelsesstoffer, antioxidanter og/eller stoffer, der understøtter rehydratiseringen, og eventuelt I blander med yderligere midler til bekæmpelse af ska- delige organismer eller til behandling af planter.

I Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling

I 35 af cellegranulaterne består i det væsentlige af to faser. I

I den første fase initieres en celleaggregation, hvorved de DK 175125 B1 8 enkelte mikroorganismecellers særlige biokemiske egenskaber udnyttes, og i den anden fase dannes de egentlige cellegranulater i en fermenteringsproces.

Først fremstilles en forkultur (inoculum) af mikroor-5 ganismerne ved gængse metoder ved overfladekulturer eller væskekulturer, f.eks. som skrårør, på næringsagarplader, på som næringsstof udnyttelige bærematerialer eller i rystekolber med flydende medier. Herved kan f.eks. de ved fermenteringen nedenfor beskrevne næringsmedier anvendes.

10 Initieringen af celleaggregationen kan ske ved for skellige metoder. Den i hvert tilfælde egnede metode kan let bestemmes ved hjælp af enkle serieforsøg.

Der kan således til en opslæmning af mikroorganismerne i vand eller en vandig næringsopløsning sættes uorganiske 15 eller organiske flokkulanser, f.eks. opsvulmende lerarter, såsom bentonit, montmorillonit og attapulgit eller stivelse, lim, polyacrylamid, carboxymethylcellulose og polyethylenoxid for at opnå en celleaggregation.

I tilfælde af mikroorganismeceller med en i det væ-20 sentlige hydrofob celleoverflade, fortrinsvis ved hvilestadier af mikroorganismerne (sporer eller konidier) sættes der til en opslæmning af cellerne i vand eller en næringsstofopløsning et detergens (eller en blanding af detergen-ser) , f.eks. polyoxyethylenderivater af sorbitolanhydrider 25 (såsom Tween 80), og cellerne suspenderes. Fortrinsvis tilvejebringes en detergenskoncentration fra 0,01 til 5,0% (vægt/vol umen), især fra 0,1 til 1,0% (vægt/volumen). Suspensionen indeholder fortrinsvis 103 til 109 celler/ml, især 105 til 107 celler/ml. Cellesuspensionen indføres i et 30 vandigt flydende næringsmedium, fortrinsvis ved tilsprøjt-ning. Fortrinsvis udgør forholdet mellem rumfanget af cellesuspension og næringsmedium mindst 1:5, især fra 1:50 til 1:100. Ved fortyndingen af detergenset sker den ønskede aggregation af mikroorganismecellerne.

35 I tilfælde af mikroorganismer uden en i det væsentlige hydrofob celleoverflade, fortrinsvis ved vegetative celler, 9 DK 175125 B1 kan der fås en aggregation af cellerne, når man ved en passende indstilling af pH-værdien neutraliserer de positivt og negativt ladede molekylegrupper på celleoverfladen i en opslæmning eller suspension af cellerne i vand eller et 5 vandigt næringsmedium, indtil den ønskede celleaggregation optræder. pH-Værdi-indstillingen kan opnås ved tilsætning af organiske eller uorganiske syrer eller baser, f.eks. svovlsyre, saltsyre, phosphorsyre, eddikesyre, natriumhydroxid eller triethylamin. Den i hvert tilfælde gunstigste 10 pH-værdi kan let bestemmes ved enkle serieforsøg.

De i denne første fase udvundne celleaggregater anvendes i den anden fase ved fremstilling af cellegranulaterne.

Fremgangsmådens anden fase, dannelsen af cellegranu-15 laterne, er kendetegnet ved den intensive tilvækst af biomasse i et celleaggregat under forløbet af en fermentering.

Til udvinding af stabile cellegranulater gennemføres denne fermentering hensigtsmæssigt på en sådan måde, at der sker udvikling af en intensivt forgrenet cellevækst, hvorved 20 dannelsen af en vævagtig cellesammenslutning fremmes.

Dyrkningen af mikroorganismerne sker herved under aerobe betingelser og kan udføres ved almindelige, gængse metoder under anvendelse af rystekulturer, f.eks. som rystekolber eller ved submers kultivering i udluftede fer-25 menteringsbeholdere, f.eks. i sædvanlige submerse fermenteringstanke. Fermenteringen sker diskontinuerligt eller kontinuerligt, men fortrinsvis i diskontinuerlig drift.

Fremstillingen af cellegranulaterne kan udføres ved en ettrins- eller to- eller flertrinsfremgangsmåde, men for-30 trinsvis ved en ettrinsfremgangsmåde.

Udvindingen af forkulturen (inoculum) sker ved de gængse metoder i overfladekulturer, f.eks. som skrårør, på næringsagarplader eller på bærematerialer, der kan udnyttes som næringssubstrat, eller i væskekultur, f.eks. i ry-35 stekolber.

10 DK 175125 B1

Fermenterings fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres i flydende næringsmedium, fortrinsvis i vandige flydende nsringsmedier. Hertil egner sig nsringsmedier, der ved deres sammensætning dækker de specifikke næringsbehov hos den til-* 5 svarende mikroorganisme, f.eks. Metarhizium anisopliae. Næringsmediet må indeholde en eller flere assimilerbare carbon- og nitrogenkilder samt mineralsalte, idet disse produkter anvendes i form af definerede enkeltbestanddele eller i form af komplekse blandinger, især som biologiske 10 produkter af vegetabilske eller animalsk oprindelse. Som carbonkilder kan alle gængse carbonkilder anvendes. Som eksempel skal nævnes kulhydrater, især polysaccharider, såsom stivelse eller dextriner, disaccharider, f.eks. maltose eller rørsukker, monosaccharider, f.eks. glycose eller xy-15 lose, sukkeralkoholer, såsom mannitol eller glycerin, samt naturligt forekommende blandinger såsom maltekstrakt, melasse eller valle. Som nitrogenkilder kan alle gængse organiske og uorganiske nitrogenkilder anvendes. Som eksempler skal nævnes aminosyrer, proteiner, proteinhydrolysater, nucleosid-20 baser samt sojabønnemel, bomuldsfrømel, linsemel, ærtemel, opløselige og uopløselige vegetabilske proteiner, majsstøbevæske, gærekstrakt, peptoner og kødekstrakt samt ammoniumsalte og nitrater, f.eks. ammoniumchlorid, ammoniumsulfat, natriumnitrat og kaliumnitrat. De mineralsalte, der bør 25 indeholdes næringsmediet, giver f.eks. følgende ioner:

Mg++, Na+, K+, Ca++, NH4+, Cl”, S04 , P04 og N03" samt ioner af de sædvanlige sporelementer, såsom kobber, 30 jern, mangan, molybdæn, zink, cobolt og nikkel. Når carbon-eller nitrogenkilderne eller det anvendte vand ikke indeholder tilstrækkeligt af disse salte eller sporelementer, er det hensigtsmæssigt at supplere næringsmediet tilsvarende. Sammensætningen af næringsmedierne kan varieres inden for store 35 områder. Næringsmediernes art og sammensætning er generelt afhængige af, hvilke bestanddele, der særlig gunstigt står 11 DK 175125 B1 til rådighed. Sædvanligvis indeholder næringsopløsningerne fortrinsvis ca. 0,5 til 8%, især 0,6 til 6% carbonkilder, fortrinsvis 0,5 til 4%, især 0,5 til 2% nitrogenkilder og fortrinsvis 0,001 til 0,5%, især 0,003 til 0,3% mineralsalte.

5 Ved udførelsen af fremgangsmåden kan det være for delagtigt kun at anvende relative ringe koncentrationer af de opløselige næringsopløsningsbestanddele ved begyndelsen af dyrkningen og derpå i løbet af den første dyrkningsfase at tilfodre fermenteringsblandingen fraktioneret ved hyp-10 pigere tilsætninger af disse bestanddele i form af sterile, relativt koncentrerede opløsninger.

Til forøgelse af granulaternes stabilitet kan det vise sig fordelagtigt, når der tilsættes næringsmediet kompleksdannende stoffer. Som kompleksdannende stoffer egner 15 sig uorganiske og organiske chelatdannende forbindelser, f.eks. ethylendiamintetraacetat, diaminocyclohexan-N,N-te-traacetat, diethylentriaminpentaacetat, cyanider, citrater med og uden kompleksbundne metalioner. De kompleksdannende stoffer anvendes fortrinsvis i en koncentration fra 0,5 til 20 10 mM, især fra 1,0 til 5,0 mM.

pH-værdien i den voksende kultur bør holdes inden for et bestemt område, der ved maksimal cellevækst sikrer initieringen af celleaggregationen og dannelsen af granulater med tilstrækkelig stabilitet. Fagmanden kan ved sædvanlige 25 metoder (serieforsøg) på enkel måde bestemme det for celleaggregationen og granulatfremstillingen optimale pH-værdi--område. Ved udførelsen af fermenteringsfremgangsmåden kan det være fordelagtigt at forandre pH-værdien afhængigt af fermenteringsfasen for at fremme en maksimalproduktion af 30 biomasse. En for stærk nedgang af pH-værdien i det sure område kan udlignes ved tilsætning af baser, f.eks. natriumhydroxid eller calciumcarbonat. Som sædvanligt inden for fermenteringsteknologien kan der også udføres en automatisk pH-regulering, ved hvilken sterile organiske eller uorganiske 35 syrer eller baser med mellemrum sprøjtes ind i kulturen.

12 DK 175125 B1

Den voksende kulturs oxygenforsyning bør hensigtsmæssigt sikres på den måde, at oxygenet ikke bliver mikroorganismernes vækstbegrænsende faktor. Kulturernes oxygenforsyning sker sædvanligvis ved rystning, f.eks. i rystekolber, 5 eller ved beluftning i forbindelse med omrøring i fermenteringstankene .

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen sker kontrollen af granulatdiameteren og granulatstabiliteten ved valget af kulturkolbernes ryste- eller rotationshastighed, idet amdrej-10 ningstallet afhængigt af granulatdiameter og granulatstabilitet fortrinsvis holdes i et område fra 50 opm til 250 opm, især i et område fra 100 til 200 opm. Ved dyrkningen af mikroorganismer i fermenteringstanke holdes omrøringshastigheden fortrinsvis i et område fra 30 til 800, især fra 15 50 til 500 opm (opm betyder omdrejninger pr. minut). Fag manden kan ved enkle serieforsøg let bestemme den i hvert tilfælde fordelagtigste ryste- eller omrøringshastighed, der fører til dannelse af cellegranulater med den ønskede diameter og stabilitet.

20 Ved udførelsen af fremgangsmåden kan det være for delagtigt ved begyndelsen af dyrkningen at holde rysteeller omrøringshastigheden i et meget lavt område og efter tydeligt begyndt tilvækst af biomasse at koble om til et område med højere ryste- eller omrøringshastighed.

25 Temperaturen til initiering af celleaggregationen eller til fremstilling af cellegranulaterne holdes hensigtsmæssigt i et område, der tillader en maksimal cellevækst, roen fortrinsvis i et område fra 10 til 30*C.

Som sædvanligt ved mikrobiologiske fremgangsmåder 30 bør fremmedinfektioner i kulturmedierne undgås. Her træffes de gængse forholdsregler, såsom sterilisering af næringsmedierne, dyrkningsbeholderne og den til luftningen nødvendige luft. Til sterilisering af apparaturet kan der f.eks. anvendes damp- og tørsterilisering, hvorved temperaturerne for-35 trinsvis ligger ved 100-140*0, især ved 120-130*0.

13 DK 175125 B1 Når der ved dyrkningen opstår en uønsket mængde skum, kan de sædvanlige kemiske skumdæmpningsmidler, f.eks. flydende fedtstoffer og olie, olie/vand-emulsioner, paraffiner, højere alkoholer, såsom octadecanol, siliconeolier, polyoxy-5 ethylen- og polyoxypropylenforbindelser (f.eks. i mængder indtil ca. 1%) tilsættes. Skum kan også dæmpes eller fjernes ved hjælp af de sædvanlige mekaniske indretninger (som f.eks. benytter centrifugalkræfter).

Fermenteringens afslutning bestemmes ved produktionen 10 af biomasse. Dyrkningen afbrydes fordelagtigt før eller på tidspunktet for den maksimale biomasseproduktion på grund af granulaternes stabilitet eller bevaringen af cellernes levedygtighed i granulaterne. Fastlæggelsen af tidspunktet for afslutning af produktionen kan let foretages af fagmanden 15 ved gængse metoder til biomassebestemmelse. Ved fermenteringsspecifikke data, der kan bestemmes på enkel måde, såsom pH-værdi, oxygenpartialtryk, carbondioxidpartialtryk eller koncentration af assimilerbare næringsstofbestanddele kan den tekniske produktionsfremgangsmåde styres.

20 Fraskillelsen af cellegranulaterne fra næringsmediet kan ske på sædvanlig måde, f.eks. ved filtrering på en si eller siagtige væv med passende porevidde, ved filtrering, centrifugering eller separation. For at undgå kontamination af cellegranulaterne med uønskede mikroorganismer, der ved 25 deres stofskifteaktiviteter kan forårsage en formindskelse af kvaliteten eller én ødelæggelse af produktet, gennemføres koncentreringen af cellegranulaterne (og eventuelt også den videre forarbejdning) hensigtsmæssigt under sterile betingelser, f.eks. i steriliserede separatorer.

30 Til lettelse af den videre forarbejdning af celle granulaterne kan det være hensigtsmæssigt at tilsætte den biomasse, der skal koncentreres, sædvanligt anvendte materialer, der forhindrer en klumpning af cellegranulaterne under koncentreringsprocessen. Hertil egner sig overflade-35 neutraliserende materialer, f.eks. de leragtige materialer bentonit, talkum, pyrophylit, celit, kalk, kaolin, attapulgit UK 175125 Bl 14 eller andre syntetiske silicater.

Terringen af cellegranualterne sker ved dehydratise-ring af mikroorganismerne. Herved kan de gængse metoder til tørring af biomasse ved hjælp af varmeoverføring ved konvek-5 tion, f.eks. fremgangsmåderne ved forstøvnings-, strøm- og fluidiseret leje-tørring eller ved hjælp af varmeoverøring ved kontakt, f.eks. fremgangsmåderne tallerken-, skål-, hvirvel-, bånd-, valse-, vakuum-, og vakuumfrysetørring. Tørringsprocessen kan også bestå af en kombination af to 10 eller flere af disse fremgangsmåder. Dehydratiseringen af cellegranulaterne udføres diskontinuerligt eller kontinuerligt, men fortrinsvis diskontinuerligt. Fremgangsmåderne skal i detaljer udformes således, at cellernes levedygtighed i granulaterne er sikret over et så langt tidsrum som muligt.

15 Endvidere skal der ved tørringen af cellegranulaterne sørges for, at cellegranulaternes mekaniske belastning holdes så ringe som muligt.

Det tørrede produkt bør have et vandindhold fra 0 til 30 vægtprocent, fortrinsvis fra 2,5 til 15 vægtprocent.

20 Vandindholdet (beregnet på et i 12 timer ved 100*C tørret produkt) bestemmes ved gængse metoder.

Til beskyttelse af cellerne i granulaterne mod beskadigelser, således som de kan opstå under tørringsprocessen som følge af en temperaturnedgang eller temperaturforhøjelse 25 eller en for intensiv dehydratisering, kan det være hensigtsmæssigt før tørringen at forbehandle granulaterne med passende beskyttelsesstoffer. Hertil egner sig organiske eller uorganiske stoffer, der er kendte til dette anvendelsesformål, og som på defineret form eller som kompleks blan-30 ding giver en beskyttende virkning, f.eks. polyalkoholer såsom sukker eller glycerin. Behandlingen af cellerne sker ved sædvanlige metoder, såsom dypning, vaskning, påsprøjtning eller blanding af cellegranulaterne med beskyttelsesmidlerne.

En beskyttelse af cellerne i granulaterne mod ukon-35 trolierede oxidationsreaktioner kan opnås ved en behandling af de endnu ikke tørrede cellegranulater med ikke-toksiske 15 DK 175125 B1 antioxiderende stoffer, f.eks. ascorbinsyre, 2,3-tert.butyl--4-hydroxyanisol, 2,6-di-tert.butyl-p-cresol, propylgallater eller nordihydroguaiaretsyre. Behandlingen sker ved hjælp af de sædvanlige metoder ved dypning, vaskning, besprøjtning 5 eller blanding af granulaterne med beskyttelsesmidlerne.

Til fremkaldelse af den biologiske virkning ved bekæmpelsen af skadelige organismer kan cellegranulaterne før tørringen også behandles med materialer, der understøtter cellernes rehydratisering. Hertil egner sig alle ikke-tok-10 siske hygroskopisk virkende materialer, især polyalkoholer såsom glycerin, sukker, sukkerpolymere eller derivater af sukkerpolymere.

Til aktivering og intensivering af den biologiske virkning især inden for bekæmpelsen af skadelige organismer 15 kan det være hensigtsmæssigt, at cellegranulateme før tørringen behandles med næringsstoffer, der understøtter en hurtig formering af mikroorganismer og dermed en tættere kolonisering af virkestedet. Som næringsstofagtige stoffer egner sig alle assimilerbare carbon- og nitrogenkilder, som 20 også kan anvendes til opdrætning af eller ved fermenteringen af den tilsvarende mikroorganisme.

Til bevarelse af en lang levedygtighed af mikroorganismerne og til opnåelse af en særlig god lagerbestandighed af cellegranulaterne kan det være hensigtsmæssigt før tør-25 ringen af cellegranulaterne at inducere dannelsen af hvilestadier, f.eks. konidier på overfladen af cellegranulaterne, især af svampe med trådaktig cellevækst, f.eks. Metarhizium anisopliae. Dannelsen af hvilestadier sker ved yderligere inkubering af de fermentativt udvundne cellegranulater under 30 betingelserne for overfladekulturer, f.eks. på flade skåle, kar eller baljer. Luftfugtigheden holdes herunder ved gængse metoder i et område for 100% til 40% relativ luftfugtighed, fortrinsvis i et område fra 100% til 80% relativ luftfugtighed. Inkuberingen bør ikke udføres ved temperaturer under 35 io*C eller over 30ec, fortrinsvis i et område fra 20 til 27 *C. Dannelsen af hvilestadier følges enklest ved pigmen- 16 DK 175125 B1 teringen af cellegranulaterne eller ved gængse mikroskopi-metoder.

For en ensartet dannelse af hvilestadier på cellegranulaternes overflade kan det vise sig fordelagtigt, at cel-5 legranulaterne bevæges mekanisk i bestemte tidsintervaller, f.eks. ved rystning.

Til intensivering af dannelsen af hvilestadier kan det vise sig hensigtsmæssigt før inkubationen i overfladekulturer at behandle cellegranulateme med carbon- eller 10 især nitrogenholdige næringsstoffer, såsom sukker, aminosyrer, f.eks. tryptophan, glutamat, histidin, aspartat eller proteinholdige materialer. Disse næringsstoffer anvendes på defineret form eller som komplekse blandinger, hvorved de optimale koncentrationer bestemmes ved gængse metoder. Be-15 handling med de gængse metoder ved dypning, vaskning eller besprøjtning af de endnu ikke tørrede cellegranualter.

Inkuberingen af cellegranulaterne til dannelse af hvilestadierne sker hensigtsmæssigt under sterile betingelser, f.eks. i steriliserede beholdere, for at undgå kon-20 taminationer med uønskede mikroorganismer.

Konserveringen af således med hvilestadier behæftede cellegranulater sker som angivet ovenfor ved dehydratisering af mikroorganismerne. Herved er det hensigtsmæssigt at være opmærksom på, at den mekaniske· påvirkning af cellegranulat-25 erne holdes så lav som muligt for at undgå en fraskillelse af hvilestadierne. Under disse forudsætninger kan der til tørringen i første række være tale om varmeoverføring ved kontakt, f.eks. bånd-, valse-, vakuumkammer- eller vakuumfrysetørring.

30 Lagringen af cellegranulaterne ifølge opfindelsen sker i lukkede beholdere under tørre betingelser, fortrinsvis ved temperaturer mellem 0 og 25*C. Til bevarelse af levedygtigheden af cellerne i granulaterne kan det være hensigtsmæssigt at lagre granulaterne under udelukkelse af oxygen, 35 f.eks. ved lagring under en atmosfære af nitrogen, carbondioxid eller andre indifferente gasser eller af gasblandinger 17 DK 175125 B1 af de nævnte gasser? endvidere kan udelukkelsen af oxygenet opnås ved emballering af cellegranulaterne under undertryk.

Midlerne ifølge opfindelsen til bekæmpelse af skadelige organismer kan ved anvendelse af passende mikroorganis-5 mer anvendes til bekæmpelse af dyriske skadelige organismer, fortrinsvis arthropoder og nematoder, især insekter og spindlere, der forekommer i landbruget, i skovbruget, i havebruget, i forråds- og materialebeskyttelsen samt på hygiejneområdet .

10 De er virksomme mod normalt følsomme og resistente arter og mod alle eller enkelte udviklingsstadier. Til de ovennævnte skadelige organismer hører:

Af ordenen Isopoda f.eks. Oniscus asellus, Armadillidium vulgare og Porcellio scaber.

15 Af ordenen Diplopoda f.eks. Blaniulus guttulatus.

Af ordenen Chilopoda f.eks. Geophilus carpophagus og Scuti-gera spec.

Af ordenen Symphyla f.eks. Scutigerella immaculata.

Af ordenen Thysanura f.eks. Lepisma saccharina.

20 Af ordenen Collembola f.eks. Onychiurus armatus.

Af ordenen Orthoptera f.eks. Blatta orientalis, Periplaneta americana, Leucophaea maderae, Blattella germanica, Acheta domesticus, Gryllotalpa spp., Locusta migratoria migratori-oides, Melanoplus differentialis og Schistocerca gregaria.

25 Af ordenen Dermaptera f.eks. Forficula auricularia.

Af ordenen Isoptera f.eks. Keticulitermes spp.,

Af ordenen Anoplura f.eks. Phylloxera vastatrix, Pemphigus spp., Pediculus humanus corporis, Haematopinus spp. og Lino-gnathus spp.

30 Af ordenen Mallophaga f.eks. Trichodectes spp., Damalinea spp.

Af ordene Thysanoptera f.eks. Hercinothrips femoralis og Thrips tabaci.

Af ordenen Heteroptera f.eks. Eurygaster spp., Dysdercus 35 intermedius, Piesma quadrata, Cimes lectularius, Rhodnius prolixus og Triatoma spp.

18

urv I ΙΌΙίΟ D I

Af ordenen Homoptera f.eks. Aleurodes brassicae, Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Aphis gossypii, Brevico-ryne brassicae, Cryptomyzus ribis, Aphis fabae, Doralis pomi, Eriosoma lanigerum, Hyalopterus arundinis, Macrosiphum 5 avenae, Myzus spp., Phorodon humuli, Rhopalosiphum padi, Empoasca spp., Euscelis bilobatus, Nephotettix cincticeps, Lecanium comi, Saissetia oleae, Laodelphax striatellus, Nilaparvata lugens, Aonidiella aurantii, Aspidiotus hederae, Pseudococcus spp. og Psylla spp.

10 Af ordenen Lepidoptera f.eks. Pectinophora gossypiella, Bupalus piniearius, Cheimatobia bruma ta, Lithocolletis bian-cardella, Hyponomeuta padella, Plutella maculipennis, Mala-cosoma neustria, Euproctis chrysorrhoea, Lymantria spp., Bucculatrix thurberiella, Phyllocnistis citrella, Agrotis 15 spp., Euxoa spp., Feltia spp., Earias insulana, Heliothis spp., Spodoptera exigua, Mamestra brassicae, Panolis flammea, Prodenia litura, Spodoptera spp., Trichoplusia ni, Carpocapsa pomonella, Pieris spp., Chilo spp., Pyrausta nubilalis, Ephestia kuehniella, Galleria mellonella, Tineola bisselli-20 ella, Tinea pellionella, Hofmannophila pseudospretella, Cacoecia podana, Capua reticulana, Choristoneura fumiferana, Clysia ambiguella, Homona magnanima og Tortrix viridana.

Af ordenen Coleoptera f.eks. Anobiun punctatum, Rhizopertha dominica, Acanthoscelides obtectus, Acanthoscelides obtectus, 25 Hylotrupes bajulus, Agelastica alni, Leptinotarsa decem-lineata, Phaedon cochleariae, Diabrotica spp., Psylliodes chrysocephala, Epilachna varivestis, Atomaria spp., Oryzae-philus surinamensis, Anthonomus spp., Sitophilus spp., Oti-orrhynchus sulcatus, Cosmopolites sordidus, Ceuthorrhynchus 30 assimilis, Hypera postica, Dermestes spp., Trogoderma spp., Anthrenus spp., Attagenus spp., Lyctus spp., Meligethes aeneus, Ptinus spp., Niptus hololeucus, Gibbium psylloides, Tribolium spp., Tenebrio molitor, Agriotes spp., Conoderus spp., Melolontha melolontha, Amphimallon solstitialis og 35 Costelytra zealandica.

19 DK 175125 B1

Af ordenen Hymenoptera f.eks. Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis og Vespa spp.

Af ordenen Diptera f.eks. Aedes spp., Anopheles spp., Culex spp., Drosophila melanogaster, Musca spp., Fannia spp., 5 Calliphora erythrocephala, Lucilia spp., Chrysomyia spp., Cuterebra spp., Gastrophilus spp., Hyppobosca spp., Stomoxys spp., Oestrus spp., Hypoderma spp., Tabanus spp., Tannia spp., Bibio hortulanus, Oscinella frit, Phorbia spp., Pego-myia hyoscyami, Ceratitis capitata, Dacus oleae og Tipula 10 paludosa.

Af ordenen Siphonaptera f.eks. Xenopsylla cheopis og Cera-tophyllus spp..

Af ordenen Arachnida f.eks. Scorpio maurus og Latrodectus mactans.

15 Af ordenen Acarina f.eks. Acarus siro, Argas spp., Ornitho-doros spp., Dermanyssus gallinae, Eriophyes ribis, Phyl-locoptruta oleivora, Boophilus spp., Rhipicephalus spp., Amblyomma spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Psoroptes spp., Chorioptes spp., Sarcoptes spp., Tarsonemus spp., Bryobia 20 praetiosa, Panonychus spp. og Tetranychus spp..

Til de planteparasitære nematoder hører Pratylenchus spp., Radopholus similis, Ditylenchus dipsaci, Tylenchulus semipenetrans, Heterodera spp., Globodera spp., Meloidogyne spp., Aphelenchoides spp., Longidorus spp., Xiphinema spp.

25 og Trichodorus spp..

De hidtil ukendte midler til bekæmpelse af skadelige organismer anvendes fortrinsvis til bekæmpelse af insekter og nematoder, især insekter, der forekommer i eller på jorden eller i nærheden af jorden (jordinsekter).

30 Midlerne til bekæmpelse af skadelige organismer kan også anvendes i fælder, eventuelt efter tilblanding af lokkemidler eller lakstoffer.

Midlerne ifølge opfindelsen til bekæmpelse af skadelige organismer kan ved anvendelse af passende mikroorganis-35 mer anvendes til bekæmpelse af skadelige mikrober (svampe og bakterier).

LSW I I v) I C.O D I

20

Fungicide midler anvendes i plantebeskyttelsen til bekæmpelse af Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomy-cetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes og Deutero-mycetes.

5 Baktericide midler anvendes i plantebeskyttelsen til bekæmpelse af Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Enterobac-teriaceae, Corynebacteriaceae og Streptomycetaceae.

Som ikke-begrænsende eksempler skal nogle fremkaldere af svampe- og bakteriesygdomme, der falder inden for de 10 ovenfor opregnede overbegreber, nævnes:

Pseudomonas-arter, f.eks. Pseudomonas solanacearum;

Pythium-arter, f.eks. Pythium ultimum;

Phytophthora-arter, f.eks. Phytophthora cactorum;

Fusarium-arter, f.eks. Fusarium oxysporum; 15 Botrytis-arter, f.eks. Botrytis cinerea;

Pseudocercosporella-arter, f.eks. Pseudocercosporella her-potrichoides;

Rhizoctonia-arter, f.eks. Rhizoctonia solani;

Sclerotium-arter, f.eks. Sclerotium rolfsii; 20 Sclerotinia-arter, f.eks. Sclerotinia sclerotiorum; Verticillium-arter, f.eks. Verticillium alboatrum; Phialophora-arter, f.eks. Phialophora cinerescens;

Phomopsis-arter, f.eks. Phomopsis sclerotioides.

Midlerne til bekæmpelse af skadelige organismer (eller 25 plantebehandlingsmidlerne) ifølge opfindelsen kan ved anvendelse af egnede mikroorganismer også anvendes som defolian-ter, desiccanter, plantebekæmpelsesmidler og især som ukrudtsudryddelsesmidler. Ved ukrudt skal i bredeste forstand forstås alle planter, der vokser på steder, hvor de er uøn-30 skede. Herbicidernes selektivitet afhænger især af den i hvert tilfælde anvendte mængde.

Midlerne ifølge opfindelsen kan f.eks. anvendes ved følgende planter:

Dikotyle ukrudtsarter af slægterne: Sinapis, Lepidium, Ga-35 lium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopo-dium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, 21 DK 175125 B1

Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, La-mium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver og Centaurea.

5

Dikotyle kulturplanter af slægterne: Gossypium, Glycine,

Beta, Daucus, Phaseolus, Pisum, Solanum, Linum, Ipomoea,

Vicia, Nicotiana, Lycopersicon, Arachis, Brassica, Lactuca, Cucumis og Cucurbita.

10

Monokotyle ukrudtsplanter af slægterne: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachi-aria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristylis, Sagittaria, Eleocharis, 15 Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus og Apera.

Monokotyle kulturplanter af slægterne: Oryza, Zea, Triticum, Hordeum, Avena, Secale, Sorghum, Panicum, Saccharum, Ananas, 20 Asparagus og Allium.

Anvendelsen af midlerne ifølge opfindelsen er dog på ingen måde begrænset til disse slægter, men strækker sig på samme måde også til andre planter.

25 Midlerne er afhængigt af koncentrationen egnede til ukrudtsbekæmpelse, f.eks. i industri- og sporområder og på veje og pladser med og uden træbevoksning, og ligeledes til ukrudtsbetæmpelse i vedvarende kulturer, f.eks. skovbrug, prydplante-, vin-, citrusfrugt-, nødde-, banan-, kaffe-, 30 te-, gummi-, oliepalme-, kakao-, bærfrugt- og humleplantninger og til selektiv ukrudtsbekæmpelse i enårige kulturer.

Midlerne ifølge opfindelsen kan i sig selv eller i deres præparater (fortrinsvis som sådanne) også finde anvendelse i blanding med andre kendte pesticider, såsom insek-35 ticider, acaricider, nematodicider, beskyttelsesstoffer mod fuglebid, plantenæringsstoffer, herbicider og jordstruktur- DK 175125 B1 22 forbedringsmidler.

Anvendelsen af midlerne ifølge opfindelsen sker på sædvanlig måde, fortrinsvis ved strøning. Det foretrækkes især at anvende midlerne ifølge opfindelsen uden yderligere 5 præparering, idet anvendelsen fortrinsvis sker ved udstrø-ning.

Den anvendte mængde af midlerne kan variere inden for et stort område. Den afhænger især af arten af den ønskede virkning og arten af de anvendte mikroorganismer.

10 Sædvanligvis ligger de påførte mængder inden for områderne landbrug, skovbrug og havebrug mellem 0,1 og 50 kg middel pr. ha jordareal, fortrinsvis mellem 1 og 25 kg pr. ha.

Fortrinsvis tjener pesticiderne ifølge opfindelsen til jordbehandling. Herved bekæmpes fortrinsvis skadelige 15 organismer, der kan forekomme i jordområdet.

Opfindelsen skal forklares nærmere ved de følgende eksempler.

De med et "CBS nr.” markerede stammer fås fra samlingen i Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Ooster-20 straat 1, NL-3740 AG Baarn, Holland.

Eksempel ΑΪ

Fremstilling af cellegranulater af eksempelvis Metarhizium anisopliae P 0001 (DSM 3S84) 25 _ 1. 10,0 liters fermentering til fremstilling af cellegranulater.

Metarhizium anisopliae P 0001 (DSM 3884) holdes som 30 stamkultur hos skrårør med raaltekstrakt-glucose-pepton-næ-ringsagar (maltekstrakt 20,0 g, glucose 20,0 g, pepton 1,0 g, agar 15,0 g, vand til 1000 ml, pH 7,5). Skrårørene lagres i køleskab ved 4*C.

Udvindingen af konidier af stammen af Metarhizium 35 anisopliae som inokulum til fermenteringskulturerne sker på maltekstrakt-glucose-pepton-agarplader, der podet med en konidiesuspension fra skrårør inkuberes i 15-16 dage ved en

I DK 175125 B1 I

I 23 I

I temperatur på 25°C. I

I Forkulturerne til fermenteringen dyrkes i 1,0 liters I

I Erlenmeyerkolber, der er fyldt med 100 ml næringsopløsning. I

I Næringsopløsningen er sammensat således: I

I 5 Glucose 10,0 g I

I Gærautolysat (Ohly) 10,0 g I

I KH2P04 1,74 g I

I Fe-III-citrat 0,28 g I

I MnS04 x H20 0,031 g I

I 10 ZnS04 x 7 H20 0,009 g I

I CuS04 x 5 H20 0,0057 g I

I MgCl2 x 6 H20 0,406 g I

I H20 til 1000 ml I

I 15 For at undgå skumdannelse tilsættes der næringsmediet I

I en siliconeolie (Baysilone E, varemærke for Bayer AG, Lever- I

kusen, Tyskland) (30 rumfangsprocent; 0,5 ml pr. liter næ- I

I ringsopløsning) . Næringsopløsningen podes med en konidiesus- I

I pension, der er udvundet ved skylning af maltekstrakt-glu- I

I 20 cose-pepton-agarpladerne med en 1,0 rumfangsprocents vandig I

I opløsning af et ikke-ionisk overfladeaktivt middel (polyoxy- I

I ethylenderivat af sorbitolanhydrid, Tween 20, varemærke for I

I ICI America Inc., USA). Forkulturernes konidietiter udgør 10^ I

I konidier pr. ml næringsopløsning. Efter podningen inkuberes I

I 25 kulturerne i 24 timer ved en temperatur på 25°C på et rund- I

I rysteapparat ved 100 omdrejninger pr. minut. I

I Fremstillingen af cellegranulaterne udføres i en I fermenteringsbeholder på 15,0 liter, der indeholder 10,0 I liter af den ovennævnte næringsopløsning. Næringsmediet I 30 steriliseres i 45 minutter ved 121"C.

I Fermenteringsbeholderen podes med 3,0 rumfangspro- I cent forkultur. Under fermenteringen holdes følgende dyrk- I ningsbetingelser:

I Temperatur 25*C

I 35 Omrøringshastighed 400 omdrejninger pr.

I minut I Luftning 5 liter luft pr. minut.

24 DK 175125 B1

Fermenteringen er afsluttet efter 60-80 timer.

2. Tørring af cellegranulaterne.

5 De ved den ovenfor beskrevne fermentering opnåede cellegranulater af Metarhizium anisopliae skilles fra fermenteringsmediet ved sigtning på et kunststofvæv med en porediameter på 0,1 mm. Ved frasugning af cellegranulaterne på en filtertragt, der er forbundet med en membranpumpe 10 skilles en yderligere mængde ubunden fermenteringsvæske fra.

Tørringen af cellegranulateme foretages i en hvirvel-lagsgranulator med et fylderumfang på 16,5 liter. Cellegranulateme fyldes i hvirvellagsgranulatoren i portioner på hver 200 g og tørres i luftstrømmen ved en strømhastighed på 15 1300 liter pr. minut. Den tilførte lufttemperatur udgør 40*C. Tørringsprocessen følges ved regelmæssig bestemmelse af vandindholdet i cellegranulaterne. Ved et vandindhold i cellegranulaterne på 10 vægtprocent (beregnet i forhold til et i 12 timer ved 100*c tørret produkt) afsluttes tørrings-20 processen.

Cellegranulaterne lagres ved stuetemperatur under tørre betingelser.

Eksempel B) 25 Fremstilling af cellegranulater med konidiedannelse på granulatoverfladen af f.eks. Metarhizium anisopliae P 0001 (D5M 3884)

Fremstillingen og oparbejdningen af cellegranulateme 30 sker som beskrevet under eksempel A). Efter fraskillelsen af fermenteringsmediet vaskes cellegranulaterne med en koncentreret glucoseopløsning (10% (vægt/volumen), 100 ml glu-coseopløsning til 50 g fugtige cellegranualter). Derefter frasuges den ikke bundne glucoseopløsning på en filtertragt.

35 De således behandlede cellegranulater inkuberes i 60-70 timer i et fugtigt kammer med en relativ luftfugtighed på 100% og en temperatur på 25*C. Dannelsen af konidier på 25 DK 175125 B1 granulatoverfladen kan følges ved intensiteten af den grønne pigmentering.

Eksempel C) 5 10,0 liters fermentering til fremstilling af cellegranulater af f.eks. Gliocladium roseum (CBS 595.75)

Stamkulturen og udvindingen af konidier som inokulum til forkulturerne sker ved Gliocladium roseum (CBS 595.75) 10 ved den i eksempel A.l for Metarhizium anisopliae P 0001 beskrevne fremgangsmåde.

Forkulturerne til fermenteringskulturerne dyrkes i 1,0 liters Erlenmeyerkolber, der er fyldt med 100 ml næringsopløsning. Næringsopløsningen er sammensat således: 15 Glucose 10,0 g Gærekstrakt 10,0 g H20 til 1000 ml

Forkulturerne podes med en konidiesuspension, der er udvundet ved skylning af agarpladekulturer (maltekstrakt-20 -glucose-pepton-agar). Forkulturernes konidietiter udgør 106 konidier pr. ml næringsopløsning. Efter podningen inkuberes kulturerne i 24 timer på en rundrysteapparat ved 150 omdrejninger pr. minut og en temperatur på 25°C.

Fremstillingen af cellegranulaterne udføres i en 25 15,0 liters fermenteringsbeholder, der er fyldt med 10,0 liter næringsopløsning med følgende sammensætning:

Stivelse 10,0 g

Caseinhydrolysat 10,0 g H20 til 1000 ml 30 pH 6,0 Næringsmediet steriliseres i 45 minutter ved 121*C. Fermenteringsbeholderen podes med 1,5 rumfangsprocent forkultur. Under fermenteringen overholdes følgende parametre: 35 26 DK 175125 B1

Temperatur 2 5 * C

Luftning 5,0 1 luft pr. minut

Omrøringshastighed 100 opm i 24 timer efter inokuleringen 5 200 opm fra 24. time til fermenteringens afslutning.

Fermenteringerne er afsluttet efter 60-80 timer.

10

Eksempel

Udvinding af cellegranulater af forskellige mikroorganismer i rystekulturer 15 Dannelsen af cellegranulater kan ske i rystekulturer ved indstilling af bestemte rammebetingelser, der er bestemt i serieforsøg. Som eksempler er mikroorganismer, især repræsentanter for deuteromyceter valgt, om hvilke en biologisk virkning ved bekæmpelse af skadelige organismer er kendt.

20 Stamkulturerne og udvindingen af konidier til inokulum af rystekulturerne sker efter den for Metarhizium anisopliae P 0001 (eksempel A.l) beskrevne fremgangsmåde.

Dannelsen af cellegranulater sker i Erlenmeyerkolber med et samlet rumfang på 1,0 liter, der hver er fyldt med 25 100 ml af den angivne næringsopløsning. Kulturblandingen autoklaveres i 20 minutter ved 121*C.

Kulturblandingeme podes med en konidiesuspension, der er udvundet ved skylning af agarpladekulturer. Konidie-titeren udgør efter podningen 106 konidier pr. ml næringsop-30 løsning. Efter podningen sker inkuberingen på et rundryste-apparat med en amplitude på 5,0 cm; rystehastigheden (omdrejninger pr. minut) er angivet i tabellen. Temperaturen holdes konstant på 25*C.

I tabel I er eksempelvis de betingelser sammenfattet, 35 under hvilke de forskellige mikroorganismer bringes til dannelse af cellegranulater.

27 DK 175125 B1 o U Ό g <2 s ς r r r z rsrrr = . -g, o. o* a a a a a a a a a “ i* o o o o o o o o o o o S ti« O O O O O O ΙΛ o o o o

S, 5. irt O ΙΛ Ift O O O NOOOO

5 μ KX ^ ^ ~ ~ ~ ~ 6 o o μ

M

•H H

ε ό e μ g Q) ffi .3 ^ ^ 1ΛΟΙΛΙΛΙΛΙΛ ΟΐΟίΛ ΐηΟ ^ 5 tv vO Cv tv tv tv tv tv tv ^ io <d μ

* C C

to <11 Φ ir, u ε ε μ <u 0 3 3 <d s Ή HH r1 , o o u-ι μ

4-1 > > OHO

to -p ε »μ +j 4j μ μ (Ti tn . fO O ι-Η

ις -P > > 5 o cC

15 « .5 o>h

Η H > H

3 e # O O o H <U

C 5 * * «» æo-HDi

frt m-j rt H r< N N N H 1H H r* f\I fitf) (N 4-) G

μ «η -H o Q) tn m Τ3Τ3Τ3Τ3ΌΤ3 - Ό T3 Ό ^ u 4-ΙΠ3«

ø c ULL.ULU c - u u u » 3 (dCM

rH 5 nnoatton ·* c to æ to <0 >-« tao

H tn TJOOTJOU U-^-0OO«O C > H

tu c CCCCCC *><l)CCC O <U o u -η nnjtonjn« κ n d o o ^ »t -h ^ tn o 20 i. .*> p p p p p a> ro p p p ω c> o «μ 3 tOWWVJWW Q CJ CO 10 tø *-i «-t 3 tn itJ 5 4-t o C Cu

Λ C - -H

<D -H O C 0) in _ Η 04 -P (tf

rH C _ ^ (U « H

<11 O 'Γ: _ _ _ m iwturoH

d . TJ Ό T3 T3 T3 *H ϋ Ό Ό Ό ιμ 01 c Qi

S Ti -ι-l -H -rt -W rr-t u -Η .n -Π -ιΗ ·Η n O dl O

S M ooouo-r- p υ o υ o SnPM

« « -μ -H -r. .* p * - - - - μ 3 I -H

„ ^ ~ o> cn » σ> σ> ro aicnoioija 2 T 5 r· 25 ^ £ c c c c c ε tocccu μ ’O 33333 0) C 3 3 3 0) »cnwro (2 a. £ b. u. ti. z ·-< a u. u. i ,, rH Γ4 ω « ’ B · 6 01 2 c: 3 3

H OH Η H

<D «22 Ό Ό

0r> 2m-2e 0) <D

j* C tn -η o E ep .5 B ro o ^ 3 -a-a 30 M (OD-rHW^j.r-Cr-itnE μμ

W £ T3JQCC--« C β *h C 3 5«J

2 -n ro <D C (DO UXI (0 -rrt irt-rt •y UfO — U-r<UU0>r-tar-.W X c p tu -η o -H g o - 3 X ffl E <U 5 § 1 g >e«n> am o ja o> x 3^ 3 p 5 rn Λ 3 ^ ~ tn -H E 'V r~0 ^vC'H'^ w (Λ (5 J E<n--«tv EO EN 30 0 L fM DO £co En* NU Orsi OT 03 K '2 3NOS3t034'-rt®.H®O.HN3N3coE vtrH-Htv τ3 »H · Λ · Ή · ·Η * U · C Ε * Η · Η · ·Η « J3 Μ · Jj y f? OSHOONO41 X τη Οί'Λ^βΗΗΗΗΗ 0*Ρ 0<3 Λ Ε r1 so os ®Ν ¢^£41 u u^-Hw.rtNrteOH ^OQ® M tj rtrt ODhNhDUo HI®U(i)UIO'H1'.h ^-P Wtv 35 Jj uCUUOlOU*r«"4Ut>Q>£> μ T; y o»u»otociw-rtto-rtOWHio-)»-w- al 2 M -r< on £ a ή en -r< cq c m u cQt-eQucneeoe a-·0® rj H 5 hU aUrnU-HU OU <D " U 0)U 0)CJ 0) u φ uorU „ ™ ^ 13v<w(5w|3vuwj;ww>w>w0ivii, vU04 g 28

Ul\ Ί /9125 bl

Den biologiske virkning af cellegranulaterne ifølge opfindelsen skal illustreres ved følgende eksempler:

Eksempel 1 5 Forsøgsinsekt: Agrotis segetum, larver 3. stadium.

Forsøgscellegranulat: Cellegranulat af Metarhizium anisopliae ifølge eksempel Ά med en kornstørrelse på 0,5 til 1,0 mm (diameter) 10

Cellegranulatet blandes intimt med markjord (vandindhold: 15 vægtprocent). Koncentrationen af cellegranulatet i jorden angives derved i granulatvægt pr. rumfangsenhed jord (ppm = mg/1)· 15 Den med cellegranulat behandlede jord fyldes i paraf finerede pappotter, forsøgsdyrene anbringes ufortøvet i jorden, og forsøgspotterne lukkes og anbringes under forsøget ved en temperatur på 20*C. Under udførelsen af forsøget tilbydes der forsøgsinsekterne gulerodsskiver ad libitum.

20 Efter 10-20 dage bestemmes cellegranulatets virkningsgrad ved optælling af de døde og levende forsøgsinsekter i procent (Abbott). Virkningsgraden er 100%, når alle forsøgsinsekter er blevet dræbt, og er 0%, når der endnu lever lige så mange forsøgsinsekter som i kontrollen.

25 Resultat:

Koncentration af cellegranulatet Virkningsgrad i ppm i % 10.000 100 30

Eksempel 2

Forsøgsinsekt: Diabrotica balteata, larver 2. stadium

Forsøgscellegranulat: Cellegranulat af Metarhizium anisopliae 35 P 0001 med en kornstørrelse på 1,0 mm (diameter)

Cellegranulatet blandes intimt med markjord (vandindhold 15 rumfangsprocent). Koncentrationen af cellegranu- 29 DK 175125 B1 latet i jorden angives derved som granulatvægt pr. rumfangsenhed jord (ppm = mg/1).

Den med cellegranulat behandlede jord fyldes i paraffinerede pappotter, og forsøgsdyrene anbringes ufortøvet i 5 jorden. Som foderkilde for forsøgs insekterne udsås forspirede majskorn i den behandlede jord. Forsøgspotterne lukkes og opstilles under forsøget ved en temperatur på 20“C. Efter 10-20 dage bestemmes cellegranulatets virkningsgrad ved optælling af de døde og levende forsøgsinsekter i procent 10 (Abbott). Virkningsgraden er 100%, når alle forsøgsinsekter er blevet dræbt, og er 0%, når der endnu lever lige så mange forsøgsinsekter som i kontrollen.

Resultat 15 Koncentration af cellegranulaterne Virkningsgrad i ppm i % 10.000 100 20 Eksempel 3

Forsøgsinsekt: Tenebrio molitor, larver 3. stadium

Forsøgscellegranulat: Cellegranulat af Metarhizium anisopliae ifølge eksempel A med en kornstørrelse på 0,5 til 25 1,0 mm (diameter)

Cellegranulatet blandes intimt med markjord (vandindhold: 12 rumfangsprocent). Koncentrationen af cellegranulatet i jorden angives som granulatvægt pr. rumfangsenhed 30 jord (ppm = mg/1).

Den med cellegranulat behandlede jord fyldes i paraffinerede pappotter, forsøgsdyrene anbringes ufortøvet i jorden, og forsøgspotterne lukkes og opstilles under forsøget ved en temperatur på 20*C. Efter 10 dage bestemmes cellegra-35 nulatets virkningsgrad ved optælling af døde og levende forsøgsinsekter i procent (Abbott). Virkningsgraden er 100%, når alle forsøgsinsekter er blevet dræbt, og er 0%, når der endnu lever lige så mange forsøgsinsekter som i kontrollen.

DK 175125 B1 30

Resultat:

Koncentration af cellegranulaterne Virkningsgrad i ppm i % 5 5000 100

Eksempel 4

Forsøgpathogen: Fusarium culmorum

Forsøgsplante: Triticum aestivum cv. Vulka 10 Forsøgscellegranulat: Forsøgsgranulat af Aphanocladium album CBS 276.77 eller

Verticillium bulbillosum CBS 571.78 ifølge eksempel D roed en kornstørrelse på 15 0,5-1,0 mm Væksthus-enhedsjord (Fa. Balster, D-5758 Frondenberg, Tyskland) fyldes i plastikskåle og inficeres med pathogenet ved sprøjtning med en sporesuspension af Fusarium culmorum.

20 På denne jord udsås hvedefrøene. Med udsåningen fordeles cellegranulaterne på jorden ved bredsåning, og skålene tildækkes derefter med jord og vandes. Under forsøget holdes skålene i drivhus ved 20-22*C og vandes efter behov.

Efter 2-4 uger bestemmes virkningsgraden i procent 25 (Abbott) ved optælling af de sunde og de syge planter. Virkningsgraden er 100%, når alle planterne er sunde, og er 0%, når det samme antal planter som i kontrollen er syge.

Resultat: 30 Påført mængde cellegranulat virkningsgrad (Abbott) i g/m2 A. Album V. bulbillosum 1 35 83 73 31 DK 175125 B1

Eksempel 5

Forsøgspathogen: Rhizoctonia solani

Forsøgsplante: Pisum sativum cv. Wunder von Kelvedon

Forsøgscelle- 5 granulat: Cellegranulat af Aphanocladium album CBS 376.77 ifølge eksempel D med en kornstørrelse på 0,5 til 1,0 mm På væksthus-enhedsjord (Fa. Balster, D-5758 Fronden-10 berg, Tyskland), der er fyldt i plastikskåle, udsås ærtefrø.

Med udsåningen fordeles cellegranulaterne på jorden ved bredsåning. Skålene tildækkes derpå med jord, der er inficeret med pathogenet. Efter vanding holdes forsøget ved 20-22*C i drivhus og vandes efter behov.

15 Efter 2-4 uger bedømmes virkningsgraden i % (Abbott) ved optælling af de døde og de syge planter. Virkningsgraden er 100, når alle planter er sunde, og er 0, når planterne er lige så syge som i kontrollen.

20 Resultat Påført mængde cellegranulat Virkningsgrad (% Abbott) i g/m2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 59 25

Eksempel 6 2

Forsøgspathogen: Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici 3

Forsøgsplante: Lycopersicon esculentum cv. Fremdgens 4

Rheinlands Ruhm 30

Forsøgscellegranulat: Cellegranulat af Gliocladium roseum 5 CBS 595.75 ifølge eksempel C med en kornstørrelse fra 0,5 til 1,0 mm 6 7 Væksthus-enhedsjord (Fa. Balster, D-5758 Frondenberg, 8

Tyskland) fyldes i plastikpotter, og med en omplantningsstav 9 formes der et plantehul. Før plantningen tilsættes konidier 10 af pathogenet i vandig suspension til jorden. I plantehul- 11 lerne fordeles cellegranulater af G. roseum, og derefter

VIX I I V I fcW w I

I 32 I plantes ufortøvet 3-4 uger gamle tomatfrøplanter og vandes.

I Under forsøget holdes planterne i drivhus ved 20-22*0 og I forsynes efter behov med vand.

I Efter 3-4 uger sker bedømmelsen af forsøget ved I 5a) bestemmelse af plantevæksten i forhold til angrebs- I frie kontroller I b) bedømmelse af plantens fremtoning med et skema fra I 0-5 (0 = ingen symptomer, 5 = planten død) I c) bestemmelse af det brunede stsngeltværsnit i procent.

I 10 Den sidstnævnte værdi anvendes til bestemmelse af I virkningsgraden i % (Abbott). Virkningsgraden er I 100%, når der ikke kan fastslås nogen bruninger, og I er 0%, når antallet af bruninger svarer til den ikke I behandlede kontrol.

I 15 I Resultat I Koncentration af % Plantevækst Bedømmelse Virkningsgrad I cellegranulat i forhold til (0-5) (% Abbott) I i ppm den angrebs- I 20 (mg/1 jord) frie kontrol I 1.500 112 0 100 I Beskrivelse af stammerne Metarhizium anisopliae P 0001 I 25 fDMS 3884) oa P 0003 fDSM 38851_ I Stammerne Metarhizium anisopliae P 0001 og P 0003 I vokser i form af septerede, forgrenede hyfestrenge. Ved I vækst på agaroverflader danner svampene et hvidt floragtigt I luftmycelium.

I 30 Efter dannelse af luftmyceliet begynder dannelsen af I hvilestadierne, såkaldte konidier, hvis længde udgør 9,0 I til 12,0 μια, og hvis diameter udgør 2,0 μη, Konidierne er I ordnet i ensartede kæder, idet flere kædestrenge som regel I ligger ved siden af hinanden. Konidiernes pigmentering giver

I 35 kolonierne af Metarhizium anisopliae stamme P 0001 (DSM

I 3884) ved vækst på havremelagar en brun-grøn, og dem af

Metarhizium anisopliae stamme P 0001 (DSM 3885) en gul-brun farvning.

DK 175125 B1 I

Ved vækst i væskekulturer danner svampene foruden I

den trådagtige celleform (hyfer) også gæragtige enkelcelle- I

stadier, såkaldte biastosporer. Biastosporernes længde udgør I

22,0 til 25,0 μm, og deres diameter 6,0 til 8,0 μπι. I

Claims (11)

1. Middel til bekæmpelse af skadelige organismer og til behandling af planter, kendetegnet ved, at det består af bærestoffrie 5 cellegranulater af mikroorganismer, der er egnede til bekæmpelse af skadelige organismer eller behandling af planter, eller i det mindste indeholder et bærestoffrit cellegranulat af sådanne mikroorganismer, hvorhos cellegranulateme fortrinsvis er dannet af svampe eller bakterier, der er i stand 10 til myceliedannelse, og hvorhos cellegranulaterne er i det væsentlige kugleformige og har en diameter fra ca. 0,05 til ca. 2 mm.

2. Middel ifølge krav l, kendetegnet ved, at cellegranulaterne indeholder næringsstoffer, protektivt 15 virkende stoffer, antioxidativt virkende stoffer og/eller stoffer, der understøtter rehydratiseringen.

3. Middel ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at cellegranulaterne især på overfladen frem-byder en forhøjet mængde af permanente stadier af mikro- 20 organismer.

4. Middel ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at cellegranulateme er dannet af svampe af klassen Deuteromycetes.

5. Middel til bekæmpelse af skadelige organismer 25 ifølge krav 1-4, der er egnet til bekæmpelse af arthropoder og nematoder, fortrinsvis af insekter, kendetegnet ved, at cellegranulaterne er dannet af svampe af ♦ slægten Metarhizium, fortrinsvis arten Metarhizium anis-opliae.

6. Middel til bekæmpelse af skadelige organismer ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at cellegranulateme er dannet af Metarhizium anisopliae stamme P 0001, svarende til DSM 3884, eller P 0003, svarende til DSM 3885, eller deres mutanter og varianter.

7. Fremgangsmåde til bekæmpelse af skadelige organis mer, fortrinsvis arthropoder og nematoder, især insekter, I DK 175125 B1 I i 35 I I kendetegnet ved, at et middel til bekæmpelse af I I skadelige organismer ifølge krav 1-6 udbringes på de skade- I I lige organismer eller deres levested. I

8. Fremgangsmåde til fremstilling af midlet ifølge I I 5 krav 1 til bekæmpelse af skadelige organismer og til behan- I I dling af planter, kendetegnet ved, at man I I A) til initiering af celleaggregationen I I a) hvor der er tale om mikroorganismeceller med en I I 10 i det væsentlige hydrofob celleoverflade, efter I I tilsætning af et eller flere detergenser til en I vandig opslæmning af de i en forkultur fremkomne I I mikroorganismer, der er egnede til bekæmpelse I I af skadelige organismer eller behandling af plan- I I 15 ter, suspenderer cellerne og indfører cellesus- I I pensionen i vand eller et vandigt næringsmedium, I I således at der sker en celleaggregation, I I b) hvor der er tale om mikroorganismeceller uden en I I 20 i det væsentlige hydrofob celleoverflade, indstil- I I ler pH-værdien i vand eller et vandigt nærings- I I medium ved tilsætning af syrer eller baser til I I en opslæmning af i de en forkultur fremkomne I I mikroorganismer, der er egnede til bekæmpelse af I I 25 skadelige organismer eller behandling af planter, I I således at der sker en celleaggregation, eller I I c) til en opslæmning eller suspension af i de en for- I I kultur fremkomne mikroorganismer, der er egnede I I 30 til bekæmpelse af skadelige organismer eller til I I behandling af planter, i vand eller et nærings- I I medium sætter flokkulanser, således at der sker I I en celleaggregation, I I 35 hvorefter man DK 175125 B1 B) til dannelse af cellegranulaterne underkaster de opnåede celleaggregater en fermentering under aerobe betingelser i et næringsmedium, der eventuelt indeholder kompleksdannende stoffer, og skiller de 5 dannede cellegranulater fra, og C) eventuelt til dannelse af en i det væsentlige på overfladen af cellegranulaterne forhøjet mængde af permanente mikroorganismestadier underkaster de fra- 10 skilte cellegranulater en inkubation under betingel serne for en overfladekultur, og D) tørrer de opnåede cellegranulater, eventuelt efter tilsætning af eller behandling med næringsstoffer, 15 beskyttelsesstoffer, antioxidanter og/eller stoffer, der understøtter rehydratiseringen, og eventuelt blander med yderligere midler til bekæmpelse af skadelige organismer eller til behandling af planter.

9. Anvendelse af mikroorganismer, der er egnede til 20 bekæmpelse af skadelige organismer eller til behandling af planter, og som er i stand til myceliedannelse, til fremstilling af midlet ifølge krav 1-6.

10. Anvendelse af Metarhizium anisopliae stammerne P 0001, svarende til DSM 3884, og P 0003, svarende til DSM 25 3885, samt deres mutanter og varianter til fremstilling af midlet ifølge krav 1-6.

11. Til fremstilling af midlet ifølge krav 1-6 egnede Metarhizium anisopliae stammer P 0001 (DSM 3884) og P 0003 (DSM 3885) samt deres mutanter og varianter.