DK174978B1 - Anvendelse af human koagulationsfaktor XIII til fremstilling af et lægemiddel til hindring af intraventrikulær blødning hos for tidligt fødte børn - Google Patents

Description

i DK 174978 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af human koagulationsfaktor XIII til fremstilling af et lægemiddel til hindring af intraventrikulær blødning hos for tidligt fødte børn.

< 5 Intraventrikulær blødning hos nyfødte børn er en af de sygdomme, som resulterer i en særdeles høj dødelighed.

Det siges, at hyppigheden af perifer ventrikulær blødning eller intraventrikulær blødning hos for tidligt fødte børn eller børn med alvorlig asfyksi ligger fra ca. 40 til ca.

10 60%, hvorimod traumatisk blødning hos børn er blevet kraftigt reduceret med det bemærkelsesværdige fremskridt indenfor neonatologi i de senere år.

Skønt årsagen til intraventrikulær blødning ikke er blevet fuldstændigt klarlagt, mener man, at det stammer fra 15 præmaturiteten af kapillærkarsysternet og dets omgivende væv af den ventrikulære subependyme vækstmatrix, der er tilbage i barnehjernen, samt fra andre udløsende årsager, såsom et traumatisk sår, anoxæmi og et højt CO2-indhold i blodet, som kan have indtrådt på fødselstidspunktet. Arch. Gynecol., 20 228. 1979, s. 626-627, viser, at der er mangel på faktor XIII i asfyktiske for tidligt fødte børn.

Der eksisterer ikke nogle virkningsfulde behandlinger, som kan hindre denne type blødning. Den senere forstørrelse af ventrikularis og andre virkninger bliver en signifikant 25 hindring for babyernes vækst. Det er derfor særdeles vigtigt at hindre blødning.

For nylig har man indgivet adskillige stoffer, såsom phenobarbital, ethamsylat, E-vitamin, indomethacin og frossen frisk plasma som forsøg til hindring af perifer ventrikulær 30 og intraventrikulær blødning, men deres virkning er stadig uklar, selv om infusion af frisk frosset plasma i Archives of Diseases in Childhood, 60, 1985, s. 710-713 anbefales for at hindre intraventrikulær blødning hos for tidligt fødte børn. Det blev sagt, at de slet ikke ændrer hyppigheden af 35 alvorlig blødning.

Ingen af de foreliggende terapeutiske fremgangsmåder DK 174978 B1 2 er i stand til at hindre sygdommen effektivt, og derfor har sygdommens hyppighed været næsten konstant i 10 år. Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et lægemiddel til hindring af sygdommen, især i tilfælde med høj 5 hyppighed.

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af human koagulationsfaktor XIII til fremstilling af et farmaceutisk præparat til hindring af intraventrikulær blødning hos for tidligt fødte børn, og dette præparat indeholder human blod-10 koagulationsfaktor XIII (herefter omtalt som faktor XIII) som den aktive ingrediens.

Faktor XIII-præparationer er hovedsageligt blevet anvendt til behandling af sårhelingsforstyrrelser. Det har vist sig, at faktor XIII hindrer intraventrikulær blødning 15 hos for tidligt fødte børn. Robbins var den første, som i 1944 foreslog eksistensen af faktor XIII. Til at begynde med blev det ligeledes kaldt fibrin-stabiliserende faktor, fibrinase eller plasma-transglutaminase, men efter undersøgelser af Laki og Lorand et al. blev faktor XIII antaget 20 som dets officielle benævnelse ved Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis i 1963. Den forekommer sædvanligvis i eksempelvis plasma og moderkage.

Den virker som en transaminase, som aktiveres af thrombin og Ca^+ og danner tværbindinger mellem fibrinmolekyler.

25 Disse tværbindinger vokser til et stærkt fibrinnetværk, som er stabilt overfor fysiske rystelser og kemiske stimuli.

Foruden denne fibrinstabiliserende virkning har det ligeledes vist sig, at faktor XIII spiller en vigtig rolle i sårhe- ’> lingsprocessen: Dvs., at den danner tværbindinger mellem 30 fibrin- og fibronektinmolekyler og fremmer fibroblast-formeringen og dannelsen af overhud.

Faktor XIII-præparationer er allerede blevet meget anvendt som et lægemiddel til sårhelingsforstyrrelser osv. Antallet af patienter, behandlet med dem, har overskredet 35 10.000. Denne akkumulering af klinisk erfaring sikrer, at de er helt fri for bivirkninger og toksicitet, så længe de DK 174978 B1 3 anvendes i en sædvanlig dosis fra 20 til 50 enheder pr. kg legemsvægt.

Fransk offentliggørelsesskrift nr. 2.229.009 angiver, at faktor XIII kan være nyttig som erstatning for humant / 5 plasma til hindring af blødningskomplikationer hos nyfødte børn, men der angives ingen præference for en bestemt form for blødning.

I det følgende er angivet resultaterne af de kliniske forsøg i enkeltheder, hvilke resultater klart påviser effek-10 tiviteten af faktor XIII til hindring af intraventrikulær blødning hos for tidligt fødte børn:

Patienter 24 ud af 48 nyfødte børn, som blev født fra januar 15 1986 til oktober 1987, og som faldt i en af de to kategorier 1) og 2), vælges tilfældigt på et hospital og behandles med faktor XIII koncentrationer.

1) Børn, som fik kunstigt åndedræt, og hvis gestations-alder eller fødselsvægt er mindre end 37 uger eller 20 2000 g.

2) Børn, som ikke fik kunstigt åndedræt og hvis gesta-tionsalder eller fødselsvægt er mindre end 33 uger eller 1500 g.

25 Behandlinosmetode

Der indgives 70-100 enheder pr. patient pr. dag af faktor XIII ved intravenøs injektion i 3 dage indenfor for-^ løbet af 6 timer efter fødslen.

30 Resultater

Der er ikke nogen signifikant forskel med hensyn til baggrunden mellem de to grupper, den behandlede gruppe og kontrolgruppen, hvilket beviser en god randomisering.

Risikofaktorer for intraventrikulær blødning, vist i 35 tabel I, er der taget hensyn til.

DK 174978 B1 4

TABEL I

Pointsystem for risikofaktorer for intraventrikulær blødning hos nyfødte børn 5 ——--

Punkt 01 2 ___ * gestationsalder (uger) *34 *29, <34 <29 10 fødselsvægt (gram) *1000 *600,<1000 <600 apgar score 15 (5 min.) *7 *4, s6 s3 max inspiratorisk tryk (torr) slO >10, s25 >25 20 pH af arteriegas *7,25 <7,25, *7,10 <7,10

PaC02 (torr) s55 >55, s80 >80 luftsvind ikke til til stede 25 stede ductus arteriosus ikke til til stede patens stede 30 Blødning i lunge ikke til til stede og/eller i stede brystkasse intestinal og/eller ikke til til stede 35 intraabdominal stede blødning blodpladeantal (X10 v/il) *15 *10, <15 <10 40 , plasma fibrinogen (mg/dl) *150 *100, <150 <100 serum fibrin ned-45 brydningsprodukter (/xg/ml) <10 *10, <40 *40

Idet man tager hensyn til antallet af point, som er 50 tildelt disse punkter i tabel I, deles tilfældene op i tre grupper, dvs. en højrisiko-, en middelrisiko- og en lav- DK 174978 B1 5 risikogruppe, og hyppigheden af forekomsten af intraventri-kulær blødning sammenlignes mellem hver gruppe med hensyn til behandling.

I sammenligningen af forekomsten af alvorlig intraven-i’ 5 trikulær blødning i højrisikogruppen er der en signifikant forskel, nemlig to forekomster på 10 behandlede tilfælde (20%) og 5 forekomster på 6 kontroltilfælde (83,3%). Resultaterne er vist i tabel II.

10 TABEL II

Hyppigheden af forekomsten af intraventrikulær blødning hos nyfødte børn, behandlet med eller uden faktor XIII-koncen-trater 15 Behandlet gruppe Kontrolgruppe højrisikogruppe 3/10 (2/10) 5/ 6 (5/ 6) middelrisikogruppe 0/ 5 (0/ 5) 1/ 8 (1/ 8) lavrisikogruppe 0/ 9 (0/9) 1/10 (0/10) 20 - ialt 3/24 (2/24) 7/24 (6/24) ( ): forekomst af alvorlig intraventrikulær blødning 25 Der er ikke nogen forekomst hos 14 behandlede tilfælde i middelrisiko- og lavrisikogrupperne.

Det er således bevist, at indgiften af faktor XIII er virkningsfuld til hindring af intraventrikulær blødning hos for tidligt fødte børn, herunder højrisikotilfælde, der 30 kræver øjeblikkelig behandling.

Fremgangsmåde til fremstilling af faktor XIII-koncentrat

Faktor XIII-præparationer fremstilles ud fra moderkagen eller plasma fra mennesker fra velkendte fremgangs-35 måder. Et eksempel på fremstillingsmetoderne under anvendelse af moderkage fra mennesker som råmateriale er som følger:

Nedfrys og findel moderkagerne. Sæt en natriumchlorid--opløsning til de små stykker moderkage, omrør og centrifuger DK 174978 B1 6 til opsamling af supernatant I. Tilsæt efter ved enzymimmun-bestemmelse at have sikret, at denne supernatant I er fri for HBs antigen, en "Rivanol"-opløsning, og opsaml udfældningen II, som indeholder faktor XIII. Efter vask af udfældnin-5 gen tilsættes en natriumchlorid-opløsning indeholdende EDTA, og der omrøres. Fjern uopløste stoffer (udfældning III), hvorved der fås supernatant III. Derefter sættes en N-cetyl--pyridiniumchlorid-opløsning til supernatant III for at udfælde kontaminerende proteiner og muco-polysaccharider.

10 Der sættes en "Rivanol”-opløsning til den således tilvejebragte supernatant IV, og udfældningen V dannes, hvilken udfældning indeholder faktor XIII. Derefter sættes en natriumchlorid-opløsning indeholdende EDTA til denne udfældning V, der omrøres, og uopløste stoffer (udfældning VI) fjernes, 15 hvorved man får supernatant VI. Sæt ammoniumsulfat til super-natanten VI, hvorved man får udfældningen VII, som indeholder faktor XIII. Derefter sættes en EDTA-opløsning til udfældningen VII, og der dialyseres mod en tris-HCl-puffer indeholdende EDTA og natriumacid. Efter indstilling af pH-værdien 20 fjernes udfældningen VIII, og supernatanten VIII gennemgår en gelfiltrering til opsamling af aktive fraktioner. Der sættes ammoniumsulfat til fraktionerne, og udfældningen IX indeholdende faktor XIII opsamles. Denne udfældning IX opløses i en tris-HCl-puffer indeholdende EDTA, der dialyseres 25 mod den samme puffer, og pH-værdien indstilles til opsamling af en udfældning, som indeholder faktor XIII i form af euglo-bulin. Euglobulin-udfældningen opløses i en natriumchlorid-opløsning indeholdende EDTA, og der tilsættes aminoeddikesyre og saccharose. Derefter tilsættes ammoniumsulfat, hvorved 30 man får en udfældning X indeholdende faktor XIII, og denne udfældning X opløses i en natriumchlorid-opløsning indeholdende EDTA, og der dialyseres mod den samme opløsning. Tite-ren af faktor XIII indstilles ved anvendelse af en natriumchlorid-opløsning indeholdende glucose og human-serumalbumin.

35 Denne opløsning gennemgår steril filtrering, fyldes i hætteglas af glas og lyophiliseres.

DK 174978 B1 7

Foruden den ovennævnte fraktioneringsmetode kan man ligeledes fremstille faktor XIII ved anvendelse af gensplejsning. Faktor XIII-præparationer i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse omfatter alle faktor XIII-præpara-,· 5 tioner, fremstillet ved hvilken som helst mulig fremgangs måde, herunder fraktioneringsmetoder og gensplejsningsmeto-’ der. Eftersom faktor XIII-præparationer, fremstillet ved fraktionsmetoder, muligvis kan indeholde eksempelvis hepatitisvirus og AIDS-virus, er det ønskeligt at inaktivere disse 10 vira ved varmebehandling eller på anden måde. Varmebehandlingen udføres som følger: Opløs udfældningen indeholdende faktor XIII i form af euglobulin i en natriumchlorid-opløs-ning indeholdende EDTA, og lad opløsningen henstå ved ca.

60°C i ca. 10 timer. Man kan anvende aminosyrer (eksempelvis 15 glycin), hydrocarbonater osv. som stabilisatorer under denne inkubation.

Man kan direkte anvende en lyophiliseret faktor XIII--præparation som en injektion ved blot at opløse det i destilleret vand til injektion (JP) før anvendelse. Koncentra-20 tionen af faktor XIII i opløsningen til injektion bør ligge på ca. 250 enheder pr. 4 ml. Injektionen kan indgives enten intravenøst eller intramuskulært.

Der er ikke rapporteret nogen ændring i faktor XIII--opløsningen, som skulle være fremkaldt ved blanding med 25 andre midler. Man anser imidlertid almindeligvis, at indgift af faktor XIII, blandet med andre midler, bør undgås. Mest ønskeligt er faktor XIII indgives ved injektion, men mulige dosisformer omfatter parenterale dosisformer, såsom mikro-kapsler og implanttabletter, orale dosisformer, såsom væsker, 30 tabletter og kapsler, og suppositorier.

Dosis og behandlingens varighed

Den daglige dosis, der er nødvendig til hindring af intraventrikulær blødning hos for tidligt fødte børn, ligger 35 fra ca. 50 til ca. 100 enheder. Man bør fortsætte indgiften, indtil risici faktisk forsvinder, dvs. i 3 dage i sædvanlige DK 174978 B1 8 tilfælde. I tilfælde, hvor risici øges, kan man genoptage indgift på hvilket som helst tidspunkt.

Eksempel 5 Faktor XIII, hældt i hætteglas, der hver indeholder 250 enheder, og lyophiliserede, opløses i 4 ml destilleret vand til injektion (JP) for at udgøre en faktor XIII injektion.

«

Claims (1)

1. DK 174978 B1 PATENTKRAV. Anvendelse af human koagulationsfaktor XIII til fremstilling af et lægemiddel til hindring af intraventrikulær blødning hos for tidligt fødte børn. « 4