DK173951B1 - Fusionsproteiner, gener der koder herfor, ekspressionsvektorer, transformeret bakterie, fremgangsmåde til oprensning af fusionsproteiner, fremgangsmåde til oprensning af et biologisk aktivt polypeptid eller protein, vacciner indeholdende fusionsprotei... - Google Patents

Description

i DK 173951 B1

Mulighederne for ved genteknologi at fremstille hybridgener åbner nye veje til fremstilling af rekombinante proteiner. Ved at forbinde den kodende gensekvens af et ønsket protein med den kodende gensekvens af et proteinfragment med høj affinitet for en ligand (affinitetspeptid) 5 er det muligt at oprense ønskede rekombinante proteiner i form af fusionsproteiner i ét trin under udnyttelse af affinitetspeptidet.

Ved styret mutagenese ("site-directed mutagenesis") er det desuden muligt at indføre specifikke kemiske eller enzymatiske skæringssteder på forbindelsespunktet mellem affinitetspeptidet og det ønskede re-10 kombinante protein, således at det ønskede rekombinante protein kan fås ved kemisk eller enzymatisk spaltning efter oprensning af fusionsproteinet ved hjælp af en egnet affinitetsharpiks. Oprensningsmetoder af denne art kendes fx fra Science 198, 1056-1063 (1977) (Itakura et al.), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 6848-6852 (1983) 15 (Germino et al.), Nucleic Acids Res, 13, 1151-1162 (1985) (Milsson et al.), Gene 32, 321-327 (1984) (Smith et al.) samt fra EP 150 126 og EP 184 355.

Ifølge opfindelsen har det nu vist sig, at affinitetspeptider med mindst to nabostillede histidinrester er særlig egnede til oprensning 20 af rekombinante proteiner ved metalchelat-affinitetschromatografi på nitrilotrieddikesyre- (NTA)-harpikser. Disse affinitetspeptider udmærker sig i forhold til de kendte peptider først og fremmest ved, at de muliggør problemfri oprensning af native og denaturerede proteiner ved hjælp af NTA-harpikser.

25 Den foreliggende opfindelse angår således fusionsproteiner, som består af ét eller to affinitetspeptider, der indeholder nabostillede histidinrester, og et til disse affinitetspeptider direkte eller indirekte bundet biologisk aktivt polypeptid eller protein, fremgangsmåder til fremstilling deraf ved rékombinant DNA-teknologi samt frem-30 gangsmåder til oprensning deraf ved metalchelat-affinitetschromato-grafi på NTA-harpikser. Den foreliggende opfindelse angår desuden gener, der koder for disse fusionsproteiner, ekspressionsvektorer, som indeholder disse gener, mikroorganismer, der er transformeret med ekspressionsvektorerne, samt fremgangsmåder til fremstilling af så-35 danne gener, ekspressionsvektorer og transformerede mikroorganismer.

2 DK 173951 B1

Affinitetspeptiderne i fusionsproteineme ifølge opfindelsen har den almene formel R1-(His)2-6'R2 hvor R* er hydrogen, en aminosyre eller en sekvens på flere amino* 5 syrer, R2 er Q, Q-Ile-Glu-Gly-Arg- eller Q*Asp-Asp-Asp-Asp-Lys*, og Q er en peptidbinding, en aminosyre eller en sekvens af flere, maksimalt 30, aminosyrer.

Særlig foretrukne affinitetspeptider i fusionsproteinerne ifølge opfindelsen har peptidsekvenser med formlerne 10 Met-Hie-His.

Met-His-His-His.

Met-His-His-His-His,

Met-His-His-His-His-His.

Met-His-His-His-His-His-Hie. Met-Hie-Hie-Ala-Gly-Ile-Glu-Gly-Arg og Me t-Hi s-Hi s -A 1 a-Gly-As p-As p-Asp-Asp-Lys.

Affinitetspeptiderne i fusionsproteinerne ifølge opfindelsen kan være bundet direkte eller indirekte til de biologisk aktive polypeptider eller proteiner. Ved anvendelse af et enkelt affinitetspeptid kan 15 dette enten være bundet til den aminoterminale eller til den carboxy-terainale aminosyre i de biologisk aktive polypeptider eller proteiner. Ved anvendelse af to affinitetspeptider er det ene bundet til den aminoterminale og det andet til den carboxyterminale aminosyre i de biologisk aktive polypeptider eller proteiner.

20 Ved indirekte binding indeholder affinitetspeptiderne et egnet, selektivt skæringssted, via hvilket de er bundet til det ønskede biologisk aktive polypeptid eller protein. Som egnede, selektive skærings s teder kan der fortrinsvis anvendes aminosyresekvenseme -(Asp)n-Lys-, hvor n er 2, 3 eller 4, eller -Ile-Glu-Gly-Arg-, som 25 genkendes specifikt af proteaserhe henholdsvis enterokinase og koagulationsfaktor Xa. Sådanne affinitetspeptider fraspaltes derefter enzymatisk på i og for sig kendt måde.

DK 173951 B1 ! 3

Ved direkte binding forbliver affinitetspeptiderne forbundet til det ønskede biologisk aktive polypeptid eller protein, dvs. affinitets-peptiderne kan ikke fraspaltes kemisk eller enzymatisk. Denne art binding er derfor foretrukket, når aktiviteten af det ønskede poly-5 peptid eller protein ikke påvirkes ugunstigt på grund af tilstedeværelsen af affinitetspeptidet. Sådanne fusionsproteiner ifølge opfindelsen kan anvendes ved en rakke immunologiske fremgangsmåder.

De kan fx anvendes som reagenser til bestemmelse af infektionssygdomme. Hvis de blandes med et fysiologisk acceptabelt bærermateriale, 10 kan de også anvendes som vacciner til forebyggelse af sygdomme.

Udtrykket "biologisk aktive polypeptider eller proteiner", som anvendes i forbindelse med fusionsproteinerne ifølge opfindelsen, betegner sådanne polypeptider eller proteiner, som selv er biologisk aktive, eller betegner polypeptider eller proteiner, der kan anvendes 15 til fremstilling af biologisk aktive polypeptider eller proteiner.

Som biologisk aktive polypeptider eller proteiner kan fx anvendes malaria-overfladeantigener, iser 5.1-overfladeantigenet, CS-proteinet og pl90-proteinet af Plasmodium falciparum, lymfokiner, interferoner, insulin og insulinprecursorer, HlV-1 og HIV-2 kappe- og strukturpro-20 teiner, væksthormoner og væksthormon-afgivende faktorer. Særlig foretrukne biologisk aktive polypeptider eller proteiner i fusionsproteinerne Ifølge opfindelsen er sådanne med aminosyresekvensen af humant immuninterferon og delsekvenser af humant immuninterferon, især sådanne med aminosyresekvenserne med formlerne 25

Gln-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr-Phe-

Asn-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala-Asp-Asn-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-

Gly-Ile-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-Glu-Glu-Ser-Aep-Arg-Lys-Ile-Met-

Gln-Ser-Gln-Ile-Val-Ser-Phe-Tyr-Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Asn-Phe-

Lys-Asp-Asp-Gln-Ser-Ile-Gln-Lye-Ser-Val-Glu-Thc-Ile-Lys-Glu-

Asp-Met-Asn-Val-Lye-Phe-Phe-Asn-Ser-Asn-Lye-Lye-Lys-Arg-Asp-

Asp-Phe-Glu-Lys-Leu-Thr-Asn-Tyr-Ser-Val-Thr-Aep-Leu-Asn-Val-

Gln-Arg-Lys-Ala-Ile-His-Glu-Leu-Ile-Gln-Val-Met-Ala-Glu-Leu-

Ser-Pro-Ala-Ala-Lys-Thr-Gly-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-

Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln, 4 DK 173951 B1

Gln-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lye-Tyr-Phe-

Asn-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala-Asp-Asn-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-

Gly-Ile-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-Glu-Glu-Ser-Asp-Arg-Lye-Ile-Met-

Gln-Ser-Gln-Ile-Val-Ser-Phe-Tyr-Phe-LyB-Leu-Phe-Lys-Asn-Phe-

Lys-Asp-Asp-Gln-Ser-Ile-Gln-Lys-Ser-Val-Glu-Thr.-lle-Lys-Glu-

Asp-Met-Asn-Val-LyB-Phe-Phe-Asn-Ser-Asn-Lys-Lys-Lye-Arg-Asp-

Asp-Phe-Glu-Lys-Leu-Thr-Asn-Tyr-Ser-Val-Thr-ABp-Leu-Asn-Val-

Gln-Arg-Lys-Ala-Ile-HiB-Glu-Leu-Ilé-Gln-Val-Met-Ala-Glu-Leu-

Ser-Pro-Ala-Ala-LyB-Thr-Gly-Lys-Acg-LyB-Arg-Ser-Gln-Met-Leu °δ

Gin—Asn-Pr o-Tyt-Val—Lys-Glu-Ala-Glu-ABn-Leu-Lys-Lys-Tyt-Phe-Aen-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala-Asp-Asn-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-Gly-ile-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-Glu-Glu-Ser-ABp-Arg-Lys-Ile-Met-Gln-ser-Gln-Ile-Val-Ser-Phe-Tyr-Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Asn-Phe-Lys-Asp-Asp-Gln-Ser-Ile-Gln-Lys-Ser-Val-Gln-Thc-Ile-Lys-Glu-Asp-Met-Asn-Val-LyB-Phe-Phe-Asn-Ser-Asn-Lys-Lye-Lys-Arg-Asp-Asp-Phe-Glu-Lys-Leu-Thr-Asn-Tyr-Ser-Val-Thr-Asp-Leu-Asn-Val-Gln-Arg-Lys-Ala-Ile-His-Glu-Leu-Ue-Gln-Val-Met-Ala-Gln-Leu-Ser-Pro-Ala-Ala-Lys-Thr-Gly-Lye-Arg-Lye-Arg-Sec-Gln-Met-Leu 5 samt sådanne roed aminosyresekvensen af dihydrofolat-reduktase fra mus.

Fremstilling af fusionsproteinerne ifølge opfindelsen kan udføres ved kendte, i litteraturen beskrevne metoder for rekombinant DNA-teknolo-10 gi. Fortrinsvis syntetiseres først de nukleotidsekvenser, der koder for de ønskede affinitetspeptider, og disse sekvenser forbindes derefter med en nukleotidsekvens, der koder for det ønskede biologisk aktive polypeptid eller protein.

Inkorporering af det således vundne hybridgen i ekspressionsvektorer, 15 fx plasmideme pDS8/RBSII ,SphI; pDS5/RBSII .3A+5A; pDS78/RBSII eller pDS56/RBSII og andre kommercielt eller almindeligt tilgxngelige plasmider, sker ligeledes på i og for sig kendt måde. Der henvises 5 DK 173951 B1 til lærebogen af Maniatis et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Fremgangsmåderne til ekspression af fusionsproteinerne ifølge opfindelsen er også i og for sig kendte og er beskrevet detaljeret i 5 ovenstående lærebog. De omfatter følgende trin: (a) tranformation af en egnet værtsorganisme, fortrinsvis E. coli, med en ekspressionsvektor, i hvilken et hybridgen som beskrevet ovenfor er operativt forbundet med en ekspressionskontrolsekvens ; 10 (b) dyrkning af den således vundne værtsorganisme under hensigts mæssige vækstbetingelser; og (c) ekstraktion og isolering af det ønskede fusionsprotein fra værtsorganismen.

Som værtsorganismer kan der anvendes gramnegative og grampositive 15 bakterier, fx E. coli- og B. subtilis-stamraer. En særlig foretrukken værtsorganisme ifølge den foreliggende opfindelse er E. coli stamme M15 (se side 15). Ud over denne E. coli-stamme kan der Imidlertid også anvendes andre almindeligt tilgængelige E. coli-stammer, fx E. coli 294 (ATCC nr. 3144), E. coli RR1 (ATCC nr. 31343) og E. coli 20 W3110 (ATCC 27325).

Ideelle metalchelatharpikser til oprensning af fusionsproteinerne ifølge opfindelsen er nitrilotrieddikesyre- (NTA)-harpikser med den almene formel bærermatrix-spacer-NH-(CH2)X-CH(C00H)-N(CH2C00‘)j Ni^+ 25 hvor x er 2, 3 eller 4.

Som bærermatrix kan der anvendes materialer, som anvendes inden for affinitets- og gelchromatografi, fx befugtede dextraner, agarose (især i den form, der er kendt under varemærket Sepharose®) eller polyacrylamider.

6 DK 173951 B1

Som spacere kan der anvendes de fra affinitetschromatografien allerede kendte spacergrupper, idet grupperne -0-CH2*CH(0H)-CH2- og -0-C0-foretr«kkes.

En særlig foretrukken NTA-harpiks til oprensning af hybridproteinerne 5 ifølge den foreliggende opfindelse har formlen [Sepharose®CL 6B]-O-CH2-CH(0H)-CH2-NH-(CH2)4-CH(C00H)-N(CH2COO')2 Ni2+ som kan fremstilles som beskrevet i eksempel 10.

Til oprensning af fus ionsproteinerne ifølge opfindelsen kan de ovenfor nævnte NTA-harpikser anvendes batch-vis eller i kontinuerligt 10 drevne søjler. NTA-harpikserne ækvilibreres hensigtsmæssigt før påfyldningen med fusionsproteinet ifølge opfindelsen med en vandig puffer, der ikke selv danner chelater med nikkel, fortrinsvis en Tris»HCl-puffer, pH 7,5. Ækvilibreringspufferen kan (ligesom elue-ringspufferen) indeholde et denatureringsmiddel eller et detergent, 15 fx guanidin*HCl, urinstof eller Triton. Tilsætning af et sådant denatureringsmiddel eller detergent gør det muligt at arbejde uden problemer, selv med fusionsproteiner ifølge opfindelsen, der er særdeles tungtopløselige i vandig opløsning. Eluering af fusionsproteinerne ifølge opfindelsen kan udføres ved konstant pH-værdi eller 20 med lineært eller diskontinuerligt faldende pH-gradienter. De optimale elueringsbetingelser afhænger af mængden og arten af de tilstedeværende urenheder, mængden af det materiale, som skal oprenses, søjledimensionerne, etc., og bestemmes hensigtsmæssigt fra tilfælde til tilfælde.

25 Følgende eksempler belyser fremstilling af fusionsproteiner ifølge opfindelsen, oprensning åf disse véd metalchelatchromatografi samt fremstilling af biologisk aktive polypeptider eller proteiner ved enzymatisk spaltning af de oprensede fusionsproteiner ifølge opfindelsen.

30 Disse eksempler kan forstås bedre, hvis de læses i forbindelse med tegningen. På tegningen optræder følgende forkortelser og symboler: 7 DK 173951 B1 B, Bg, E, Η, N, Na, Nd, P, S, Sa, Sc, X og Xb betegner skaringssteder for restriktionsenzymerne BamHI, Bglll, EcoRI, Hindlll, Nael, Narl,

Ndel, PstI, Sphl, Sall, Seal, Xhol og Xbal.

1 —m repræsenterer promotorerne for generne bla, lacl og neo; 5 != — ί repræsenterer ribosombindingsstederne fra generne bla, cat, neo og lad; mumi repræsenterer terminatoreme t0 og TI; EUS repræsenterer det regulerbare prqmotor/operator-element pN25x/0 eller N250PSN250P29; 10 (»*♦*",*»!.·) repræsenterer ribosombindingsstedeme RBSII,Sphl og RBSII,- 3A+5A; repræsenterer de kodende omrider under kontrol af disse ribosombindingssteder; I { repræsenterer de områder, der koder for affinitetspeptider- 15 ne ifølge opfindelsen og de selektive skæringssteder; V/SSA repræsenterer de områder, der koder for 2, å eller 6 histi-dinrester; ψ repræsenterer det område (repl.), der er nødvendigt for replikationen; 20 repræsenterer kodende områder for dihydrofolat-reduktase (dhfr), chloramphenicol-acetyltransferase, lac-repressor (lacl), /3-lactamase (bla), neomycinphosphotransferase (neo) og de forskellige derivater af 7-interferon.

Fig. 1 25 Skematisk diagram over plasmidet pDS8/RBSII,SphI.

Fig. 2 8 DK 173951 B1

Nukleotidsekvens af Xhol/Xbal-fragmentet fra plasmidet pDS8/RBSII,-Sphl. Dette fragment indeholder det regulerbare promotor/operator-element Pn25x/0* tibosombindingsstedet RBSII.Sphl, dhfr-genet, tenai-5 natoren tQ, cat-genet samt terminatoren Ti. De i fig. 1 viste sk*-ringssteder for restriktionsenzymer er overstreget, mens det område, der står under kontrol af RBSII.Sphl, og som koder for en variant af dihydrofolat-reduktase, er understreget. Desuden er den fra plasmidet pBR322 stammende del af plasmidet pDS8/RBSII,SphI vist skematisk, 10 idet de angivne tal angår pBR322-selcvensen (J.G. Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43, s. 77-90 [1979J).

Fig- 3

Skematisk diagram over plasmidet pDS5/RBSII,3A+5A.

Fig. 4 15 Nukleotidsekvens af plasmidet pDS5/RBSII,3A+5A. De i fig. 3 angivne skeringssteder for restriktionsenzymer er overstreget, mens det område, der står under kontrol af RBSII,3A+5A, og som koder for en variant af chloramphenicol-transferase, er understreget.

Fig. 5 20 Skematisk diagram over plasmidet pDS78/RBSII.

Fig. 6

Nukleotidsekvens af plasmidét pDS78/RBSII. De i fig. 5 viste sk*-ringssteder for restriktionsenzymer er overstreget, mens det område, der står under kontrol af RBSI1, og som koder for en variant af 25 dihydrofolat-reduktase, er understreget.

Fig. 7

Skematisk diagram over plasmidet pDS56/RBSII.

Fig. 8 9 DK 173951 B1

Nukleotidsekvens af plasmidet pDS56/RBSH. De i fig. 7 angivne skæ-ringssteder for restriktionsenzymer er overstreget, mens det område, der står under kontrol af RBSII, er understreget.

5 Fig. 9

Skematisk diagram over plasmidet pDMI.l.

Fig. 10

Nukleotidsekvens af plasmidet pDMI.l. De i fig. 9 viste skæringssteder for restriktionsenzymer er overstreget, mens de områder, der 10 koder for neomycinphosphotransferase (neo) og lac-repressor (lacl), er understreget.

Fig. 11

Nukleotidsekvenser af de oligonukleotider, der anvendes til konstruktion af de i eksemplerne benyttede plasmider. Hver gang blev to så-15 danne oligonukleotider sammenfejet og betegnet som adaptor. Skæringsstederne for restriktionsenzymer Nael, Narl og Bglll er overstreget.

Fig. 12

Skematisk diagram over konstruktionen og isoleringen af fragmentet 1.

Dette fragment blev isoleret fra plasmidet pRC23/IFI-900 og inde-20 holder genet for rekombinant humant interferon med Cys-Tyr-Cys som N-terminale aminosyrer.

Fig. 13

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet pGLS ved inkorporering af fragmentet 1 i plasmidet pDS8/RBSII,Sphl. I det skeraati-25 ske diagram over pGLS betegner (Sc) den position, i hvilken fragmen- 10 DK 173951 B1 tet 1 via skæringsstedet for restriktionsenzymet Seal blev forbundet med plasmidet pDS8/RBSII,Sphl.

Fig. 14

Skematisk diagram over konstruktionen og isoleringen af fragmentet 2.

5 Dette fragment koder for et humant interferon, som er afkortet ved C-terminalen med 8 aminosyrer og betegnes IFN-7(-8). I de viste nukleo-tidsekvenser er den tilsvarende terminationskodon understreget.

Fig. 15

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet pIFN*7(-8) ved 10 inkorporering af fragmentet 2 i plasmidet pDS8/RBSII,SphI via skæ-ringsstederne for restriktionsenzymerne EcoRI og Hindlll.

Fig. 16

Skematisk diagram over konstruktionen og isoleringen af fragmentet 3.

Dette fragment bærer det regulerbare promotor/operator-element 15 Fn25x/0» tibosombindingsstedet RBSII.Sphl og adaptoren 3, der koder for aminosyresekvensen Met-His-His-Ala-Gly-Ile-Glu-Gly-Arg-Leu-Gly-Ser.

Fig. 17

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet pDS8/RBSII,Sphl-20 His,His-Xa-BamHI ved inkorporering af fragmentet 3 i plasmidet pDS8/-RBSII.Sphl via skæringsstedeme for restriktionsenzymerne Xhol og BamHl.

Fig. 18

Skematisk diagram over konstruktionen og isoleringen af fragmentet 4, 25 som blev anvendt ved konstruktionen af plasmidet pHis.His-Xa-IFN-y.

Fig. 19 DK 173951 B1 li . _ i

Skematisk diagram over isoleringen af fragmentet 5, som blev anvendt ved konstruktionen af plasmiderne pHis.His-Xa-IFN-γ, pHis,His-Ek-IFN-7(-8) og pHis,His-Xa-IFN-7(-8)(Asn).

5 Fig. 20

Skematisk diagram over isoleringen af fragmentet 6, som blev anvendt ved konstruktionen af plasmidet pHis ,His-Xa-IFN--y.

Fig. 21

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet pHis.His-Xa-IFN-y 10 ved sammenføjning af fragmenterne 4, 5 og 6. Plasmidet pHis,His-Xa-IFN-7 koder for et IFN-γ-fusionsprotein med Met-His-His-Ala-Gly-Ile-Glu-Gly-Arg som yderligere N-terminal aminosyresekvens (His,His-Xa-IFN-7).

Fig. 22 15 Skematisk diagram over konstruktionen og isoleringen af fragmentet 7, som blev anvendt ved konstruktionen af plasmidet pHis,His-Ek-IFN-7('8).

Fig. 23

Skematisk diagram over isoleringen af fragmentet 8, som blev anvendt 20 ved konstruktionen af plasmiderne pHis,His-Ek-IFN-7(-8) og pHis.His-Xa-IFN-7(-8)(Asn).

Fig. 24

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet pHis,His-Ek-IFN-7(-8) ved sammenføjning af fragmenterne 5, 7 og 8. Plasmidet 25 pHis,His-Ek-IFN-7(-8) koder for et ved C-terminalen med 8 aminosyrer afkortet IFN-7-fusionsprotein med Met-His-His-Ala-Gly-Asp-Asp-Asp- i DK 173951 B1 12

Asp-Lys som yderligere N-terminal aminosyresekvens (HispHis-Ek- ira--r(-8)).

Fig. 25

Skematisk diagram over konstruktionen og isoleringen af fragmentet 9, 5 som blev anvendt ved konstruktionen af plasmidet pHis,His-Xa-IFN-7(-8)(Asn).

Fig. 26

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet pHis.His-Xa-lFN-7(-8)(Asn) ved sammenføjning af fragmenterne 5, 8 og 9. Dette 10 plasmid koder for et IFN-7-fusionsprotein, der er forkortet ved C- terminalen med 8 aminosyrer, og som er forlænget ved N-terminalen med aminosyresekvensen Met-His-His-Ala-Gly-Ile-Glu-Gly-Arg, og hvor aminosyren Asp yderligere i position 2 er erstattet med aminosyren Asn (His,His-Xa-IFN-7(-8)(Asn)).

15 Fig. 27

Skematisk diagram over konstruktionen og isoleringen af fragmentet 10, som blev anvendt ved konstruktionen af plasmidet p6xHis-DHFR.

Fig. 28

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet p6xHis-DHFR ved 20 sammenføjning af fragmentet 10 med Xhol/BamHX-fragmentet fra plasmidet pDS78/RBSII, hvilket fragment indeholder replikationsområdet.

Plasmidet p6xHis-DHFR koder for et DHFR-fusionsprotein med 6 histidi-ner ved N-terminalen {(HisJg-raDHFRJ.

Fig. 29 25 Skematisk diagram over konstruktionen og isoleringen af fragmentet 11, som blev anvendt ved konstruktionen af plasmidet p4xHis-DHFR.

DK 173951 B1

Fig. 30 13

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet p4xHis-DHFR ved sammenføjning af fragmentet 11 med XhoI/BamHI-fragmentet fra plasmidet pDS78/RBSII, hvilket fragment indeholder replikationsområdet.

5 Plasmidet pAxHis-DHFR koder for et DHFR-fusionsprotein med 4 histidi-ner ved N-terminalen [(HisJ^-mDHFR].

Pig. 31

Skematisk diagram over konstruktionen og isoleringen af fragmentet 12, som blev anvendt ved konstruktionen af plasmidet pRBSII-6xHis.

10 Fig. 32

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet pRBSII-6xHis ved sammenføjning af fragmentet 12 med Xbal/BamHI-fragmentet fra plasmidet pDS56/RBSII, hvilket fragment indeholder replikationsområdet.

Fig. 33 15 Skematisk diagram over konstruktionen og isoleringen af fragmentet 13, som blev anvendt ved konstruktionen af plasmidet pRBSII-4xHis.

Fig. 34

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet pRBSII-4xHis ved sammenføjning af fragmentet 13 med Xbal/BamHI-fragmentet fra plasmi-20 det pDS56/RBSII, hvilket fragment indeholder replikationsområdet.

Fig. 35

Skematisk diagram over konstruktionen og isoleringen af fragmentet 14, som blev anvendt ved konstruktionen af plasmidet pRBSII-2xHis.

14 DK 173951 B1

Fig. 36

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet pRBSII-2xHis ved sammenføjning af fragmentet 14 med Xbal/BamHI-fragmentet fra plasmidet pDS56/RBSII, hvilket fragment indeholder replikationsområdet.

5 Fig. 37

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet pDHFR-6xHis ved sammenføjning af Xbal/BgIII-fragmentet fra plasmidet pDS78/RBSII, hvilket fragment indeholder replikationsområdet, med Bglll/Xbal-fragmentet fra plasmidet pRBSII-6xHis, hvilket fragment indeholder 10 cat-genet. Plasmidet pDHFR-6xHis koder for et DHFR-fusionsprotein med 6 histidiner ved C-terminalen [Met-oDHFR-(His)g].

Fig. 38

Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet pDHFR-2xHis ved sammenføjning af Xbal/BgIII-fragmentet fra plasmidet pDS78/RBSII, 15 hvilket fragment indeholder replikationsområdet, med Bglll/Xbal- fragmentet fra plasmidet pRBSII-2xHis, hvilket fragment indeholder cat-genet. Plasmidet pDHFR-2xHis koder for et DHFR-fusionsprotein med 2 histidiner ved C-terminalen (Met-mDHFR-(His)2].

Fig. 39 20 Skematisk diagram over konstruktionen af plasmidet p4xHis-DHFR-4xHis ved sammenføjning af Xbal/BgIII-fragmentet fra plasmidet p4xHis-DHFR, hvilket fragment indeholder replikationsområdet, med Bglll/Xbal-fragraentet fra plasmidet pRBSII-4xHis, der indeholder cat-genet.

Plasmidet p4xHis-DHFR-4xHis koder for et DHFR-fusionsprotein med 4 25 histidiner ved henholdsvis N- og C-terminalen [(His)^-mDHFR-(His)^].

Fig. 40

Nukleotidsekvens af IFN-7-genet, der indkodes af plasmidet pGLS, og den deraf afledte aminosyre s elevens.

Fig. 41 15 DK 173951 B1

Nukleotidsekvens af IFN-7-fusionsgenet, der indkodes af plasmidet pHis,His-Xa-IFN-7, og den deraf afledte aminosyresekvens.

Fig. 42 5 Nukleotidsekvens af IFN-7-fusionsgenet, der indkodes af plasmidet pHis,His-Ek-IFN*7(-8), og den deraf afledte aminosyresekvens.

Fig. 43

Nukleotidsekvens af IFN-7-fusionsgenet, der indkodes af plasmidet pHis,His-Xa-IFN-7(-8)(Asn), og den deraf afledte aminosyresekvens.

10 EKSEMPEL 1

Beskrivelse af plasmider, som blev anvendt ved konstruktion af plas-miderne pGLS, pHis.His-Xa-IFN-7, pHis,His-Ek-IFN-7(-8), pHis.His-Xa-IFN-7(-8)(Asn), p6xHis-DHFR, p4xHis-DHFR-4xHis, pDHFR-2xHis og pDHFR-6xHis 15 A. Principper

Plasmiderne pDS8/RBSII,Sphl (fig. 1 og 2), pDS5/RBSII,3A+5A (fig. 3 og 4), pDS78/RBSII (fig. 5 og 6) og pDS56/RBSII (fig. 7 og 8) blev anvendt til konstruktion af de anførte plasmider. E. coli-celler, der er transformeret med disse plasmider, er deponeret i Deutsche Samm-20 lung von Mikroorganismen i GSttingen (fra 21.11.87 i Braunschweig) den 3.10.85 [£. coli M15 (pDS5/RBSII,3A+5A; pDMI.l), DSM-nr. 3517], den 6.8.86 [£. coli M15 (PDS8/RBSII,SphI; pDMI.l), DSM-nr. 3809], den 3.9.87 [£. coli M15 (pDS78/RBSII; pDMI.l), DSM-nr. 4232] og den 23.12.87 [E. coli Ml5 (pDS56/RBSII; pDMI.l), DSM-nr. 4330] i henhold 25 til Budapest-traktaten.

De ovenfor navnte vektorer indeholder det regulerbare promotor/opera-torelement Pn25x/0 (StOber et al., EMBO J. 3, 3143-3148 [1984]) eller 16 DK 173951 B1 N250PSN250P29 og ribosombindingsstederne RBSII.Sphl, RBSII.3A+5A eller RBSI1. Disse ribosombindingssteder blev afledt af ribosombin-dingsstedet fra promotoren Pg25 ^ra £· coli-fagen T5 (R. Gentz, afhandling, Heidelberg Universitet, Forbundsrepublikken Tyskland 5 [1984]) og vundet via DNA-syntese. På grund af disse ekspressions signalers store effektivitet kan de ovenfor nævnte plasmider kun bevares stabilt i E. coli-celler, hvis promotor/operatorelementet undertrykkes ved binding af en lac-repressor til operatoren, lac-Repressoren er kodet i lacl-genet. Pn25x/0 °E N250PSN250P29 kan da 10 kun undertrykkes, hvis der findes et tilstrækkeligt antal repressor-molekyler i cellerne. Derfor anvendte man lacl*!-allelen, som indeholder en promotormutant, der fører til en forhøjet ekspression af repressorgenet. Denne lacl^-allel er indeholdt i plasmidet pDMI,l (fig. 9 og 10). Dette plasmid bærer ud over lacl-genet Neo-genet, som 15 meddeler bakterierne kanamycinresistens, hvilket benyttes som selektionsmarkør. pDMI,1 er kompatibelt med de ovenfor nævnte plasmider.

E. coll-celler, der transformeres med sådanne ekspressionsvektorer, skal indeholde pDMI.l for at sikre, at ekspressionsvektoren bevares stabilt i cellerne.' Induktion af dette system opnås ved tilsætning af 20 IPTG til mediet ved den ønskede celletæthed.

B. Plasmidet pDS8/RBSII,SphI

Den del af pDS8/RBSII,SphI (fig. 1 og 2), der ligger mellem restriktionsskæringsstederne for Xbal og Xhol og indeholder replikationsom-rådet og genet for /3-lactamase, hvilket gen meddeler cellerne ampi-25 cillinresistens, stammer fra plasmidet pBR322 (Bolivar et al., Gene 2, 95-113 [1977]; Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.

43, s. 77-90 [1979]). Den resterende del af plasmidet bærer det regulerbare promotor/operatorelement Pfi25x/0 (Stuber et al., supra) efterfulgt af ribosombindingsstedet RBSII,SphI, som er en del af et 30 EcoRI/BamHI-fragment. Derefter følger genet for dihydrofolat-redukta-se (DHFR) fra musecellelinjen AT-3000 (Chang et al., Nature 275, 617-624 [1978]; Masters et al., Gene 21, 59-63 [1983]), terminatoren tQ fra E. coli-fagen lambda (Schwartz et al., Nature 272, 410-414 [1978]), det promotorfrie gen for chloramphenicol-acetyltransferase 35 (Marcoli ét al., FEBS Letters 110, 11-14 [1980]) og terminatoren TI

17 DK 173951 B1 fra E. coli rrnB-operonet (Brosius et al., J. Mol. Biol. 148, 107*127 [1981]).

C. Plasmidet pDS5/RBSII,3A+5A

Den del af pDS5/RBSII,3A+5A (fig. 3 og 4), der ligger mellem skæ-5 ringsstederne for restriktionsenzymerne Xbal og Xhol og indeholder replikationsområdet samt genet for /3-lactamase, der meddeler cellerne ampicillinresistens, stammer oprindeligt fra plasmidet pBR322 (Bolivar et al., supra; Sutcliffe, supra). Derimod er genet for ^-lactamase imidlertid modificeret på en sådan måde, at skæringsstederne 10 for restriktionsenzymerne Hindi og PstI er elimineret. Disse ændringer i DNA-sekvensen giver sig imidlertid ikke udslag I /3-lactamases aminosyresekvens. Den resterende del af plasmidet bærer det regulerbare promotor/operatorelement Pfj25x/0 (Stuber et al., supra) efterfulgt af ribosombindingsstedet RBSII.3A+5A, som er en del af et 15 EcoRI/BamHI-fragment. Derefter følger skæringssteder for restrikti onsenzymerne Sall, PstI og Hindlll, det promotorfrie gen for chlor-amphenicol-acetyltransferase (Marcoli et al., supra) og terminatoren TI fra E. coli rrnB-operonet (Brosius et al., supra).

D. Plasmidet pDS78/RBSII

20 Den del af pDS78/RBSII (fig. 5 og 6), der ligger mellem restriktions-. skæringsstederne for Xbal og Xhol og Indeholder replikationsområdet samt genet for /3-lactamase, der meddeler cellerne ampicillinresistens, stammer oprindeligt fra plasmidet pBR322 (Bolivar et al., supra; Sutcliffe, supra). Imidlertid er genet for ^-lactamase modifi-25 ceret på samme måde som beskrevet for plasmidet pDS5/RBSII,3A+5A. Den resterende del af plasmidet bærer det regulerbare promotor/operatorelement N250PSN250P29 efterfulgt af ribosombindingsstedet RBSII, som er en del af et EcoRI/BamHI-fragment. Herefter følger genet for di-hydrofolat-reduktase fra musecellelinjen AT-3000 (Chang et al., 30 supra; Masters et al., supra), som blev ændret således, at der blev indført et skæringssted for restriktionsenzymet Bglll umiddelbart før enden af strukturgenet, terminatoren tQ (Schwarz et al., supra), det promotorfrie gen fra chloramphenicol-acetyltransferase (Marcoli et al., supra) og terminatoren TI (Brosius et al., supra).

18 DK 173951 B1

E. Plasaidet pDS36/RBSII

PI a sin i det pDS56/RBSII (fig. 7 og 8) ligner meget plasmidet pDS5/-RBSII,3A+5A. I modsætning til dette plasmid indeholder plasmldet pDS56/RBSII imidlertid som ekspressionssignaler det regulerbare 5 promotor/operatorelement N250PSN250P29 og ribosombindingsstedet RBSII. Desuden indeholder pDS56/RBSIl terminatoren tQ fra E. coli-fagen lambda (Schwarz et al., supra).

F. Plasmidet pDHI,1

Plasmidet pDMI,l (fig. 9 og 10) bærer genet for neomycinphosphotrans-10 ferase fra transposonen Tn5 (Beck et al., Gene 19, 327-336 [1982]), som meddeler E. coli-celler kanamycinresistens, og lacl-génet (Fara-bough, JVature 274, 765-769 [1978]) med promotormutationen 1¾ (Calos,

Nature 274, 762-765 [1978]), soo koder for lac-repressoren. Desuden indeholder plasmidet pDMI.l et område fra plasmidet pACYCl84 (Chang 15 og Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141-1156 [1978]), der indeholder alle de informationer, som er nødvendige for replikation og stabil ned-arvning til dattercellerne.

EKSEMPEL 2

Beskrivelse af DNA-adaptorer, som blev anvendt ved konstruktion af de 20 forskellige plasmider A. Principper

Til adapterlng af ribosombindingsstedet RBSII,Sphl på genet for immunInterferon (IFN-7), til afkortning af dette gen, til sammenføjning af IFN-y og IFN-7-brudstykker såsom fx IFN-7(-8) med et 25 affinitetspeptid samt til ekspression af DHFR-fusionsproteiner med mindst to nabostillede histidinrester blev der kemisk syntetiseret oligonukleotider, som efter deres oparbejdning blev phosphoryleret. Nukleotidsekvenserne af de anvendte adaptorer er vist som dobbeltstrengede DNA-sekvenser i fig. 11.

19 DK 173951 B1 B. Syntese og oparbejdning af oligonukleotideme

Oligonukleotiderne blev fremstillet samtidigt på et multisynteseap-parat (beskrevet i EP 181, offentliggjort 21.5.85), idet glas med en defineret porestørrelse (CPG) blev anvendt som bærermateriale (Kiefer 5 et al., Immunol. Heth. 3, 69-83 [1985]; Sproat et al., Tetrahedr.

Lett. 2U, 5771-5774 [1983]; Adams et al., J. Amer. Chem. Soc. 105, 661-663 [1985]). De lyofiliserede oligonukleotider blev taget op i vand og opløst i 1 time ved 4"C. DNA-koncentrationen var 100 runol/ml.

C. Phosphorylering af oligonukleotideme 10 I adskilte portioner blev 150 pmol af oligonukleotiderne inkuberet i 20 μΐ 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, og 10 mM MgCl2 med 2 pmol γ-[32Ρ]-ΑΤΡ (Amersham, Braunschweig; 5000 Ci/mmol) og 1 enhed (E) T4-polynukleo-tidkinase (Gibco-BRL, Basel) i 20 minutter ved 37°C. Derefter blev der tilsat 5 nmol ATP, og efter yderligere 20 minutter ved 37*C blev 15 reaktionerne standset ved opvarmning til 65*C. De således vundne phosphorylerede oligonukleotider blev anvendt uden yderligere forarbejdning.

EKSEMPEL 3

Konstruktion af plasmidet pGLS 20 A. Principper

Til konstruktion af plasmidet pGLS blev IFN-y-genet først forbundet (fig. 12) med adaptoren 1 (fig. 11) og isoleret. Derefter blev det resulterende fragment 1 indsat i plasmidet pDS8/RBSII,SphI (fig- 13).

B. Fremstilling af fragmentet 1 25 4 pg af plasmidet pRC23/IFI-900 (EP 99084, offentliggjort 25.1.84) med en DNA-koncentration på 400 /jg/ml blev skåret med 10 enheder af restriktionsendonukleasen Ndel i kernepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8, 20 DK 173951 B1 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl) i 1 time ved 37”C (volumen 20 μΐ) . Derefter blev proben ekstraheret 1 gang med phenol, phenolrester blev fjernet med ether, og DNA'et blev endelig udfældet med 66¾ alkohol og 0,3 M K-acetat. Bundfaldet blev tørret i 2 minutter i en Speed-vac-kon-5 centrator og opløst i TA-ligasepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 500 μΜ ATP). 25 pmol af den phosphorylerede adaptor 1 (fig. 11) blev opløst i lx ligasepuffer og sat til denne reaktionsblanding, hvilket gav et samlet volumen på 25 μΐ. Ligeringen blev udført i 3 timer ved 22“C, idet der anvendtes 1 μΐ DNA-ligase (1 10 Weiss-enhed, Boehringer Mannheim). Ligeringen blev afsluttet ved opvarmning af proben i 7 minutter ved 65®C. DNA'et blev udfaldet med alkohol, tørret som beskrevet ovenfor og derefter opløst i 50 μΐ Ncol-skæringspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM MgC^, 50 mM NaCl, 50 mM KC1). 10 enheder Ncol blev tilsat, og proben blev inkuberet i 1 15 time ved 37eC. Enzymet blev derefter inaktiveret ved opvarmning af proben i 7 minutter ved 65"C. Efter phenolekstraktion blev DNA'et udfældet som beskrevet ovenfor, og bundfaldet blev tørret. DNA'et blev opløst i Klenow-puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM MgS04, 100 μΜ DTT) og tilsat dATP, dGTP, dCTP og dTTP (slutkoncentration 100 μΜ 20 af hver) og 1 enhed Klenow-enzym (Boehringer, Mannheim), og proben

blev holdt i 1 time ved 22°C. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 2 μΐ 0,25 M EDTA, proben blev ekstraheret med phenol, og DNA'et blev udfældet med alkohol som beskrevet og opløst i Sphl-skærings -puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 6 mM 2-mer-25 captoethanol). Efter tilsætning af 10 enheder Sphl blev proben inkuberet i 1 time ved 37°C, skæringen blev afsluttet som beskrevet ved opvarmning, der udførtes phenolekstraktion, og DNA'et blev udfældet med alkohol og tørret. DNA-bundfaldet blev opløst i 10 μΐ probepuf-fer, og DNA-fragmenterne blev adskilt på en 6¾ polyacrylamidgel 30 (elueringspuffer: 40 mM Tris-HCl, 20 mM Na-acetat, 2 mM EDTA, pH

7,8). Som molekylvægtstandard anvendtes DNA fra fagen ØX skåret med Haelll (Gibco-BRL, Basel). DNA'et blev farvet med ethidiumbromid (0,5 μg/ml), visualiseret med UV-lys (300 nm bølgelængde), og de IFN-γ-kodende bånd blev skåret ud af gelen med en skalpel. Gelstykket blev 35 overført til en AxA mm stor lomme i en agarosegel (0,7X agarosegel, elueringspuffer: 90 mM Tris-borat, 90 mM borsyre, 3 mM EDTA, pH 8,3).

Lommen blev lukket med 0,7Z flydende agarose i lxTBE for at opnå et homogent elektrisk felt. Før proben blev der anbragt et stykke af en 21 DK 173951 B1 NA45-membran (Schleicher og Schull, Dassel, BED), og DNA'et blev overfort til membranen ved hjælp af elektroforese (5 minutter, 15 V/cm). Efter vask med destilleret vand blev membranen overført til et Eppendorf-ror, som indeholdt 250 fil 1,5 M lithiumacetat, 50 mM Tris-5 HC1, pH 8, og 10 mM EDTA. DNA'et blev derefter elueret i 20 minutter ved 65®C. Membranbåndene blev fjernet fra røret, og proben blev ekstraheret 1 gang med 200 μΐ phenol (pH 8). DNA'et blev udfældet efter tilsætning af 20 μΐ 5 M lithiumacetat og 440 μΐ isopropånol, og bundfaldet blev vasket med 80X ethanol og derefter torret. Endelig 10 blev bundfaldet opløst i 10 μΐ TE-puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA). Det således vundne DNA-fragment fik betegnelsen fragment 1 (fig. 12).

C. Fremstilling af plasmidet pDS8/RBSII,SphI

2 pmol af plasmidet pDS8/RBSII,SphI blev først skåret med restrikti-15 onsenzymet SphI. Derefter blev det resulterende lineære plasmid-DNA

inkuberet med en begrænsende mængde af restriktionsenzymet Seal, hvorved DNA'et kun blev skåret i ca. 50X af de tilstedeværende Scal-skæringssteder. Proben blev derpå ekstraheret med phenol, etherbe-handlet, og DNA'et blev udfældet som beskrevet. Bundfaldet blev 20 tørret og opløst i 20 μΐ puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8), og IE CIP

(kalvetarmphosphatase, Boehringer Mannheim) blev tilsat. Proben blev inkuberet i 1 time ved 37°C, enzymet blev fjernet ved phenolekstrak-tion, og DNA'et blev udfældet. Efter at DNA'et var blevet opløst, blev Scal/Sphl-fragmentet, som indeholdt dele af cat-genet, termina-25 toren TI, replikationsområdet, bla-genet, promotoren N25x/o og ribosombindingsstedet RBSII,SphI, isoleret fra en IX agarosegel og overført elektroforetisk som beskrevet ovenfor til en NA45-membran. Élue-ring af DNA'et, alkoholudfældning og opløsning i 10 μΐ TE-puffer blev ligeledes udført soin beskrevet ovenfor. Dette gav ca. 1 pmol af 30 det ønskede vektorfragment.

D. Sammensætning af plasmidet pGLS

0,05 pmol af vektorfragmentet blev ligeret med 0,05 pmol insertions-DNA (fragment 1) i ligasepuffer (se ovenfor). En kontrolligering uden insertions-DNA blev udført parallelt. E. coli M15-celler indeholdende 22 DK 173951 B1 plasmidet pDMI.l blev forberedt for transformation ved metoden ifølge Morrison (Methods Enzyaol. 68, 326-331 [1979]). Ligeringsblandingerne blev efter opvarmning i 7 minutter ved 65*C sat til 200 pi af disse kompetente celler. Proberne blev holdt på is i 30 minutter og deref-5 ter inkuberet i 2 minutter ved 42“C, og efter tilsætning af 0,5 ml LB-medium blev de inkuberet i 90 minutter ved 37eC. Cellerne blev derefter udpladet på LB-agarplader, som indeholdt 100 pg/ml ampicil-lin og 25 pg/ml kanamycin, og inkuberet natten over i et varmeskab ved 37"C. Transformation af kontrolligeringen gav ingen transforman-10 ter. Ligering med fragment 1 gav derimod ca. 200 kolonier. Enkelte kolonier blev taget op med en steril tandstikker, overført til et rør, der indeholdt 10 ml LB-medium med 100 pg/ml ampicillin og 25 Pg/ml kanamycin, og holdt i 12 timer på en rysteinkubator. Derefter blev cellerne sedimenteret, og plasraid-DNA'et blev isoleret ved meto-15 den ifølge Birnboim og Doly (Nucleic Acids Res. 7, 1515-1523 [1979]).

1 pg af hvert af de Isolerede plasmidet blev skåret med Sphl og Xbal for at undersøge, om der i. disse plasmider er indeholdt et fragment, som indeholder IFN--y-genet og terminatoren TI. Alle de analyserede DNA-prober indeholdt det forventede DNA-fragment på ca. 1 kb. Disse 20 plasmider fik betegnelsen pGLS (fig. 13).

E. Sekvensanalyse af IFN--y-genet integreret 1 pGLS

For at påvise, at den korrekte IFN-γ-sekvens er indeholdt i plasmidet pGLS, blev det dobbeltstrengede cirkulære plasmid-DNA sekventeret, idet der blev benyttet en med [γ--^Ρ]-ΑΤΡ mærket startsekvens (pri-25 mer). Denne startsekvens indeholder nukleotiderne fra position 199-218 i plasmidet pDS8/RBSII,SphI og ender 6 nukleotider før ATG'et Ved Sphl-skæringsstedet.

0,3 pmol af det isolerede plasmid-DNA blev udfældet med alkohol, og bundfaldet blev vasket 1 gang med 80X ethanol, tørret og til slut 30 opløst i 8 pi 1/4 TE-puffer. Efter tilsætning af 2 pmol af startsekvensen blev proben inkuberet i 5 minutter ved 42eC. Derefter blev DNA'et sekventeret ved metoden ifølge Sanger et al. (Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 74, 5463-6567 [1977]). Da der blev anvendt en radioaktivt mærket "primer", blev alle reaktioner udført med umærkede deoxy- 23 DK 173951 B1 nukleotidtriphosphater. DNA-sekvensanalyse viste, at den korrekte IFN-y-sekvens var blevet integreret i plasmidet pGLS (aminosyrese-kvens se fig. 40).

EKSEMPEL 4 5 Konstruktion af plasmidet pIFN-y(-8) A. Principper

Til konstruktion af plasmidet pIFN-y(-8) blev adaptoren 2 (fig. 11) først forbundet med IFN-y-genets unikke Hinfl-skæringssted. På grund af en translationsstopkodon i denne adaptor bliver det C*terminale 10 område af IFN-y-proteinet således afkortet med 8 aminosyrer (fig.

14). Derefter blev det resulterende fragment 2 integreret i plasmidet pDS8/RBSII,Sphl (fig. 15).

B. Fremstilling af fragmentet 2 3 pmol af plasmidet pGLS blev skåret med 15E Hinfl (50 μΐ volumen, 1 15 time, 37“C). Derefter blev restriktionsenzymet inaktiveret (7 minutter ved 65“C), proben blev ekstraheret med phenol og behandlet med ether, og proben blev udfaldet med K-acetat og alkohol og tørret.

Bundfaldet blev opløst i 50 μΐ ligasepuffer. 100 pmol phosphorylerede oligonukleotider (adaptor 2) blev blandet med 10 μΐ Hinfl-skåret 20 plasmid pGLS og efter tilsætning af 25 μΐ ligasepuffer og 1E T4-DNA-ligase inkuberet i 12 timer ved 22®C. Reaktionen blev som beskrevet ovenfor afsluttet ved opvarmning af proben, og DNA’et blev udfældet. Derefter udførtes en skæring med restriktionsenzymerne EcoRI (15E) og Hindlll (20E) i 2 timer ved 37*C. Efter varnieinaktivering, phenol-25 ekstraktion, etherbehandling og alkoholudfældning blev proben opløst i 10 μΐ probepuffer, og DNA-fragmenterne blev adskilt på en 6X poly-acrylamidgel. DNA-båndene blev efter farvning med ethidiumbromid visualiseret under UV-lys (300 nm). De bånd, der indeholdt IFN-y-genet, blev skåret ud af gelen med en steril skalpel og ved elektroforese 30 overført til en NA45-membran som beskrevet ovenfor. DNA'et blev elueret som beskrevet og fik betegnelsen fragment 2 (fig. 14).

24 DK 173951 B1

C. Fremstilling af plasmidet pDSB/RBSU,SphI

2 pmol af plasmidet pDS8/RBSII,Sphl blev skåret med 10E EcoRI og 10E Hindlll i 1 time ved 37°C i et volumen på 50 μΐ. Efter varmeinakti-vering af enzymerne og alkoholudfældning blev DNA-bundfaldet opløst i 5 10 μΐ probepuffer. Efter elektroforese på en IX agarosegel blev det

EcoRI/Hindlll-fragment, som indeholder terminatoren tQ, cat-genet, terminatoren TI, replikationsområdet, bla-genet og promotoren %25x/0> støret ud af gelen og elueret som beskrevet ovenfor.

D. Samaensætning af plasmidet pIFN--f(-8) 10 10 μΐ af det isolerede EcoRI/Hindlll-vektorfragment og halvdelen af det isolerede fragment 2 blev inkuberet med 1E T4-ligase (22°C, 3 timer). En kontrolligering uden tilsætning af fragmentet 2 blev udført parallelt. Ligeringerne blev afsluttet som beskrevet ved opvarmning af proben.

15 Transformationerne blev udført ved metoden ifølge Morrison (supra), idet E. coil-stammen M15 indeholdende plasmidet pDMI.l blev anvendt.

Cellerne blev udpladet på LB-agarplader, som indeholdt 100 pg/ml ampicillin og 25 pg/ml kanamycin. Pladerne blev holdt i 15 timer ved 37®C i et varmeskab.

20 På kontrolpladerne (-kontrolligering) blev der ikke fundet transfor-manter. Den ligering, ved hvilken der blev anvendt vektor-DNA og fragment 2, gav ca. 500 kolonier. Enkelte kolonier blev taget op med en steril tandstikker, overført til 10 ml LB-medium og lodes gro som beskrevet. Plasmid-DNA'et blev isoleret ved metoden ifølge Birnboim 25 og Doly (supra). 4 μΐ hver af det isolerede og i TE-puffer opløste plasmid-DNA blev skåret med 2E af hver af EcoRI og Hindlll som beskrevet. Fra alle de testede plasmider kunne der udskæres et fragment med den forventede længde på ca. 450 bp. Disse plasmider fik betegnelsen pIFN--y(-8) (fig. 15).

E. Sekvensanalyse af plasmidet pIFN-i(-8) 25 DK 173951 B1

Sekvensanalysen blev udført som beskrevet i eksempel 3. Som startsekvens blev der Imidlertid anvendt et oligonukleotid, som indeholder nukleotideroé fra position 928-896 i plasmidet pDS8/RBSII,SphI og 5 dermed tillader sekventering af DNA-fragmenter, som blev integreret før terminatoren tQ. Sekvensanalysen bekræftede den ønskede sekvens af ΙΕΝ-γ-genet, som koder for et IFN-γ-protein, der er afkortet med 8 aminosyrer (ved carboxyenden).

EKSEMPEL 5

10 Konstruktion af plasmidet pDS8/RBSII,Sphl-His,His-Xa-BamHI

A. Principper

Til konstruktion af plasmidet pDS8/RBSIl,SphI-His.His-Xa-BamHI blev adaptoren 3 (fig. 11), der koder for et affinitetspeptid, som indeholder to nabostillede histidiner og et skæringssted for faktor Xa, 15 først forbundet med ribosombindingsstedet RBSII.SphI. Derefter blev fragment 3 (fig. 16) indeholdende promotoren ?ν25χ/0 samt ovennævnte affinitetspeptid isoleret og integreret i plasmidet pDS8/RBSII,Sphl (fig. 17).

B. Fremstilling af fragmentet 3 20 2 pmol af plasmidet pDS8/RBSII,SphI blev skåret med restriktionsen zymet Sphl. Reaktionen blev standset ved inkubation ved 65aC i 7 minutter, proben blev ekstraheret med phenol, etherbehandlet, og DNA'et udfældet med alkohol og K-acetat. Bundfaldet blev taget op i 10 μΐ ligasepuffer, tilsat 25 pmol af den phosphorylerede adaptor 3 25 (fig. 11) opløst i ligasepuffer og efter tilsætning af 1E T4-DNA-ligase inkuberet i 3 timer ved 22"C. Reaktionen blev standset ved opvarmning (7 minutter, 65®C), og DNA'et blev udfældet med alkohol og K-acetat efter phenolekstraktion og efterfølgende behandling med ether. Bundfaldet blev opløst i 30 pi puffer, 10E af hvert af re-30 striktionsenzymerne BamHI og Xhol blev tilsat, og blandingen blev 26 DK 173951 B1 inkuberet véd 37“C i 2 timer. Derefter blev der tilsat 3,5 pi 10 gange koncentreret probepuffer til polyacrylamidgeler, og blandingen blev inkuberet i 7 minutter ved 65°C. DNA'et blev adskilt på en 6X polyacrylamidgel, og det med Xhol og BamHI frigjorte fragment blev 5 skåret ud med en skalpel. DNA'et blev elueret som beskrevet og fik betegnelsen fragment 3 (fig. 16).

C. Fremstilling af plasmidet pDS8/RBSII,SphI

2 pmol af plasmidet pDS8/RBSIl, Sphl blev skåret med 10E af hvert af restriktionsenzymerne BamHI og Xhol, Efter varmeinaktivering af 10 enzymerne blev proben ekstraheret med phenol, etheret fjernet og DNA'et udfældet med alkohol og K-acetat. Bundfaldet blev resuspen-deret i 50 pi 50 mM Tris-HCl, pH 8. IE CIP (se ovenfor) blev tilsat, og proben blev inkuberet ved 37 ®C i 30 minutter. Efter varme inaktivering af enzymet blev DNA'et efter tilsætning af probepuffer adskilt 15 på en 6X polyacrylamidgel, og plasmiddelen blev elueret fra gelen som beskrevet.

D. Sammensætning af plasmidet pDS8/RBSII,SphI-His,His-Xa-BamHI

Det ovenfor beskrevne fragment 3 blev ligeret med vektordelen (22"C, 2E T4-DNA-ligase, 25 pi ligasepuffer). En kontrolligering uden til-20 sætning af fragment 3 blev udført parallelt. Ligeringsbundfaldene blev som ovenfor beskrevet transformeret i E. coli-stammen M15, som indeholdt plasmidet pDMI.l, og udpladet på LB-plader med 100 pg/ml ampicillin og 25 pg/ral kanamycin. Transformation af kontrolligeringen gav ingen transformanter. Transformation af ligeringsbundfaldet med 25 fragment 3 gav ca. 100 kolonier. Enkelte kolonier blev dyrket i 10 ml LB-medium som beskrevet ovenfor, og plasmid-DNA'et blev isoleret ved fremgangsmåden ifølge Birnboim og Doly (supra). Alle plasmider indeholdt de via adaptoren nyindførte skæringssteder for Nael og Narl (se fig. 17). Sekvensanalyse af plasmid-DNA'et blev udført som be-30 skrevet ovenfor (eksempel 3,F) og bekræftede, at adaptor 3 var blevet korrekt integreret i vektoren. Disse plasmider fik betegnelsen pDS8/-RBSII,Sphl-His,His-Xa-BamHI (fig. 17).

Konstruktion af plasmidet pHis.His-Xa-IFN-γ EKSEMPEL 6 27 DK 173951 B1 A. Principper

Til konstruktion af plasmidet pHis.His-Xa-IFN-γ blev følgende DNA-5 fragmenter isoleret og forbundet med hinanden (fig. 21): 1) det med adaptor 4 (fig. 11) forbundne IFN-y-gen fra plasmidet pGLS (fragment 4, fig. 18); 2) signalenheden fra plasmidet pDS8/RBSII,SphI-His,His-Xa-BamHI, som indeholder promotoren %25x/0· ribosombindingsstedet RBSII.Sphl og det område, der koder for de nabostillede histidiner og 10 for genkendelsesstedet for faktor Xa (fragment 6, fig. 20); og 3) replikationsområdet med /9-lactamasegenet fra plasmidet pDS5/RBSII,-3A+5A (fragment 5, fig. 19).

B. Fremstilling af fragment 4 2 pmol af plasmidet pGLS blev skåret med restriktionsenzymet Ndel.

15 Efter varmeinaktivering af enzymet blev proben ekstraheret med phenol, etherbehandlet og DNA'et udfældet som beskrevet. Bundfaldet blev opløst i 10 μΐ ligasepuffer. 50 pmol af den phosphorylerede adaptor 4 (fig. 11) opløst i ligasepuffer blev sat til det med Ndel skårne plasmid pGLS, og proben blev inkuberet med 2E ligase (22*C, 3 timer).

20 Efter varmeinaktivering af ligasen blev proben ekstraheret med phenol og etherbehandlet og DNA'et udfældet som beskrevet. Bundfaldet blev opløst, og DNA'et blev skåret med restriktionsenzymerne Narl og Xbal. Efter tilsætning af probepuffer, 7 minutters opvarmning af blandingen ved 65*C og adskillelse af DNA'et på en 6X polyacryla-25 midgel blev Narl/Xbal-fragmentet, som indeholdt IFN-y-genet, isoleret som beskrevet. Dette fragment fik betegnelsen fragment 4 (fig. 18).

C. Fremstilling af fragment 5 2 pmol af plasmidet pDS5/RBSII,3A+5A blev skåret med restriktionsenzymerne Xhol og Xbal. Blandingen blev oparbejdet som beskrevet oven-30 for, og DNA'et blev adskilt på en 6Ϊ polyacrylamidgel. Fragmentet, som indeholdt bla-genet og replikationsområdet, blev isoleret fra 28 DK 173951 B1 gelen som beskrevet. Dette fragment fik betegnelsen fragment 5 (fig.

19) .

D. Fremstilling af fragment 6 2 pmol af plasmidet pDS8/RBSII,SphI-His,His-Xa-BamHI blev skåret med 5 restriktionsenzymerne Xhol og Narl. Efter oparbejdning af proben og gelelektroforese blev fragment 6 isoleret, hvilket indeholder promotoren Pf}25x/0» ribosombindingsstedet RBSII.Sphl og det område, der koder for de nabostillede histidiner og for genkendelsesstedet for faktor Xa (fig. 20).

10 E. Sammensætning af plasmidet pHis .His-Xa-IFN-'y 0,5 pmol af hvert af fragmenterne 4 (fig. 18), 5 (fig. 19) og 6 (fig.

20) blev inkuberet i ligasepuffer med 2E T4-DNA-ligase (22eC, 5 timer). Efter varmeinaktivering af enzymet blev bundfaldet transformeret som ovenfor beskrevet i E. coli-stammen M15 indeholdende plas- 15 midet pDMI.l, og transformationsblandingen blev udpladet på LB-agar-plader, der indeholdt 100 pg/ml ampicillin og 25 /ig/ml kanamycin.

Der blev opnået ca. 100 transformanter efter inkubation ved 37eC natten over. Enkelte kolonier blev dyrket i 10 ml LB-medium som beskrevet, og plasmiderne blev isoleret ved metoden ifølge Birnboim og 20 Doly (supra). Alle plasmider blev skåret med restriktionsenzymerne

Xhol, BamHI og Xbal, og fragmenterne blev analyseret på 61 polyacryl-amidgeler. Restriktionsenzymanalyse viste, at plasmiderne indeholdt de 3 ønskede fragmenter. Sekvensanalyserne blev udført som beskrevet (eksempel 3,F) og viste, at adaptor 4 var blevet fusioneret korrekt 25 med IFN-y-genet. Disse plasmider fik betegnelsen pHis.His-Xa-IFN-y (fig. 21). Det af disse plasmider indkodede IFN-y-fusionsprotein (aminosyresekvens se figj 41) fik betegnelsen His,His-Xa-IFN-y.

Konstruktion af plasmidet pHis,His-Ek-IFN-7(-8) EKSEMPEL 7 29 DK 173951 B1 A. Principper

Til konstruktion af plasmidet pHis,His-Ek-IFN-7(-8) blev følgende 3 5 DNA-fragmenter forbundet med hinanden (fig. 24): 1) et fragment fra plasmidet pDS8/RBSII,SphI-His,His-Xa-BamHI indeholdende promotoren %25x/0* ribosombindingsstedet RBSII.Sphl og det område, der koder for de nabostillede histidiner, hvilket fragment ved hjælp af adaptor 5 (fig. 11) blev forlænget med et område, der koder for genkendelses -10 stedet for enterokinase (EK) (fragment 7, fig. 22); 2) et fragment fra plasmidet pIFN-7(-8), som indeholder genet for IFN-7(-8) (fragment 8, fig. 23); og 3) et fragment fra plasmidet pDS5/RBSII,3A+5A med replikationsområdet og /9-lactamasegenet (fragment 5, fig. 19). Fremstilling af sidstnævnte fragment er beskrevet i eksempel 6.

15 B. Fremstilling af fragment 7 4 pmol af plasmidet pDS8/RBSII,SphI-His,His-Xa-BamHI blev skåret med restriktionsenzymet Nael. Derefter blev enzymet varmeinaktiveret, proben blev ekstraheret med phenol og etherbehandlet og DNA'et udfaldet som beskrevet. Bundfaldet blev taget op i 50 μΐ TE-puffer. 1,5 20 pmol af det skårne DNA blev inkuberet i et volumen på 200 μ! med 30 pmol af den phosphorylerede adaptor 5 (fig. 11) og 7E T4-DNA-ligase i 14 timer i ligasepuffer. Efter varmeinaktivering af enzymet blev DNA'et skåret med restriktionsenzymerne Ndel og Xhol. Dernæst blev enzymerne varmeinaktiveret, proben ekstraheret med phenol og etherbe-25 handlet og DNA'et udfældet som beskrevet. Bundfaldet blev optaget i probepuffer, og blandingen blev inkuberet i 7 minutter ved 65eC.

Derefter blev DNA'et adskilt på en 6X polyacrylamidgel. 0,2 pmol af Xhol/Ndel-fragmentet indeholdende promotoren Pn25x/0· ribosombindingsstedet RBSII.Sphl og det område, der koder for de nabostillede 30 histidiner og for genkendelsesstedet for enterokinase, blev Isoleret fra gelen som beskrevet. Dette DNA-fragment fik betegnelsen fragment 7 (fig. 22).

30 DK 173951 B1 C. Fremstilling af fragment 8 0,5 pmol af plasmidet pIFN-7(-8) blev skåret med restriktionsenzymerne Ndel og Xbal. Derefter blev enzymerne varmeinaktiveret, proben ekstraheret med phenol og etherbehandlet og DNA'et udfældet som be-5 skrevet. Bundfaldet blev optaget i probepuffer, og blandingen blev inkuberet i 7 minutter ved 65eC. Derefter blev DNA'et adskilt på en 6X polyacrylamidgel. 0,05 pmol af Ndel/Xbal-fragmentet, der indeholdt IFN-7(-8)-genet, terminatoren tQ, cat-genet samt terminatoren TI, blev isoleret fra gelen som beskrevet. Dette DNA-fragment fik be-10 tegneisen fragment 8 (fig. 23).

D. Sammensætning af plasmidet pHis,His-Ek-IFN-y(-8) 0,006 pmol af fragment 5 (fig. 19), 0,02 pmol af fragment 7 (fig. 22) og 0,005 pmol af fragment 8 (fig. 23) blev inkuberet i ligasepuffer i et volumen på 30 fil med 0,5 E T4-DNA-ligase i 3 timer ved 15*C. Efter 15 varmeinaktivering af enzymet blev bundfaldet transformeret som be skrevet ovenfor i E. coli-stammen M15, der indeholdt plasmidet pDHl,l, og transformationsblandingen blev udpladet på LB-plader indeholdende 100 pg/ml ampicillin, 25 jig/ml kanamycin og 5 pg/ml chloramphenicol. Efter 24 timers inkubation af pladerne ved 37*C blev 20 2 af de vundne transformanter dyrket i 10 ml LB-medium indeholdende 100 pg/ml ampicillin, 25 pg/ml kanamycin og 5 pg/ml chloramphenicol, og plasmiderne blev isoleret ved metoden ifølge Birnboim og Doly (supra). Plasmiderne blev i henseende til størrelse analyseret på 0,7X agarosegeler og i henseende til sammensætning ved hjælp af 25 restriktionsenzymeime Hindlll, Hinfl, Ndel, Sphl, Xbal og Xhol på 6X polyacrylamidgeler. Begge plasmider indeholdt de ønskede 3 DNA-frag-menter i den korrekte orientering i forhold til hinanden. Sekvensanalyser, der blev udført som beskrevet i eksempel 3,F, viste, af ribosombindingsstedet RBSIl.Sphl med de efterfølgende elementer var 30 blevet korrekt forbundet med IFN-7(-8)-genet. Disse plasmider fik betegnelsen pHis,His-Ek-IFN-7(-8) (fig. 24). Det af disse plasmider indkodede IFN-y-fusionsprotein (aminosyresekvens, fig. 42) fik betegnelsen His,His-Ek-lFN-7(-8).

EKSEMPEL 8

Konstruktion af plasmidet pHis,His-Xa-IFN-7(-8)(Asn) 31 DK 173951 B1 A. Principper

Til konstruktion af plasmidet pHis,His-Xa-IFN-7(-8)(Asn) blev følgen-5 de 3 DNA-fragmenter forbundet med hinanden (fig. 26): 1) et fragment fra plasmidet pIFN-7(-8), som indeholdt IFN-7(-8)-genet (fragment 8, fig. 23, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 7); 2) et fragment fra plasmidet pDS8/RBSII,SphI-His .His-Xa-BamHI indeholdende promotoren Pn25x/0· ribosombindingsstedet RBSII,SphI og det område, der 10 koder for de nabostillede histidiner og for genkendelsesstedet for faktor Xa, hvilket fragment blev forlænget ved hjælp af adaptor 6 (fig. 11), således at IFN-7(-8)-derivatet IFN-7(-8)(Asn) indkodes ved sammenkobling med det under 1) beskrevne fragment (fragment 9, fig.

25); og 3) et fragment fra plasmidet pDS5/RBSII,3A+5A med replika-15 tionsområdet og genet for /J-lactaraase (fragment 5, fig. 19, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 6).

B. Fremstilling af fragment 9 2 pmol af plasmidet pDS8/RBSII,SphI-His,His-Xa-BamHI blev skåret med restriktionsenzymet Narl. Derefter blev enzymet varmeinaktiveret, 20 proben ekstraheret med phenol og etherbehandlet og DNA'et udfældet som beskrevet. Bundfaldet blev taget op i 50 μΐ TE-puffer. 1 pmol af det skårne DNA blev inkuberet i et volumen på 150 μΐ med 30 pmol af den phosphorylerede adaptor 6 (fig. 11) og 5 E T4-DNA-ligase i 14 timer ved 20°C i ligasepuffer. Efter varmeinaktivering af enzymet 25 blev DNA'et skåret med restriktionsenzymerne Ndel og Xhol. Derefter blev enzymerne varmeinaktiveret, proben ekstraheret med phenol og etherbehandlet og DNA'et udfældet som beskrevet. Bundfaldet blev taget op i probepuffer, og blandingen blev inkuberet i 7 minutter ved 65*C. Den resulterende DNA-blanding blev derpå adskilt på en 6X 30 polyacrylamidgel. 0,25 pmol af Xhol/Ndel-fragmentet med promotoren ^N25x/0» ribosombindingsstedet RBSII.Sphl og det område, der koder for de nabostillede histidiner, for genkendelsesstedet for faktor Xa 32 DK 173951 B1 og for aminosyren Asn, blev isoleret fra gelen som beskrevet. Dette DNA-fragment fik betegnelsen fragment 9 (fig. 25).

C. Salmensætning af plasmidet pHis,His-Xa-IFJi--y(-8) (Asn) 0,006 pmol af fragment 5 (fig. 19), 0,005 pmol af fragment 8 (fig.

5 23) og 0,02 pmol af fragment 9 (fig. 25) blev inkuberet i 30 μΐ ligasepuffer og 0,5 E T4-DNA-ligase i 3 timer ved 15eC. Efter varme-inaktivering af enzymet blev remanensen transformeret som beskrevet ovenfor i E. coli-stammen M15, der indeholdt plasmidet pDMl.l, og transformationsblandingen blev udpladet på LB-plader indeholdende 100 10 μg/ml ampicillin og 25 pg/ml kanamycin. Efter inkubation af pladerne ved 37°C natten over blev 2 kolonier dyrket som beskrevet i 10 ml LB-raedium indeholdende 100 pg/ml ampicillin og 25 pg/ml kanamycin, og plasmiderne blev isoleret ved metoden ifølge Birnboim og Doly (supra) . Plasmiderne blev i henseende til størrelse analyseret på 0,7X 15 agarosegeler og i henseende til sammensætning ved hjælp af restriktionsenzymerne Hindlll, HinfI, Ndel, Sphl, Xbal og Xhol på 6X poly-acrylamidgeler. Ét af de to plasmider indeholdt de ønskede 3 DNA-fragmenter i den korrekte orientering i forhold til hinanden. Sekvensanalyse af dette plasmid blev udført som beskrevet (eksempel 20 3,F) og viste, at ribosombindingsstedet RBSII.Sphl med de efterføl gende elementer var blevet forbundet korrekt med det område, der koder for IFN-y(-8)(Asn). Dette plasmid fik betegnelsen pHis,His-Xa-IFN-7(-8)(Asn) (fig. 26). Det af dette plasmid indkodede IFN-y-fu-sionsprotein (aminosyresekvens se fig. 43) fik betegnelsen His,His-25 Xa-IFN-7(-8)(Asn).

EKSEMPEL 9

Konstruktion af plasmidet p6xHis-DHFR A. Principper

Til konstruktion af plasmidet p6xHis-DHFR blev følgende DNA-fragmen-30 ter isoleret og forbundet med hinanden (fig. 28): 1) den med adaptor 7 (fig. 11) forbundne signalenhed fra plasmidet pDS78/RBSII med pro- 33 DK 173951 B1 motoren N250PSN250P29 samt ribosombindingsstedet RBSII (fragment 10, fig. 27); og 2) det største af de to Xhol/BamHI-fragmenter fra plas-midet pDS78/RBSII (fig. 28).

B. Fremstilling af fragment 10 5 2 pmol af plasmidet pDS78/RBSII blev skåret med restriktionsenzymet

BamHI. Efter varmeinaktivering af enzymet blev proben ekstraheret med phenol og etherbehandlet og DNA'et udfældet som beskrevet. Bundfaldet blev opløst i 10 μΐ ligasepuffer. 50 pmol af den phosphorylerede adaptor 7 (fig. 27) opløst i ligasepuffer blev sat til det skårne 10 plasmid, og proben blev inkuberet med 2E ligase (22”C, 3 timer).

Efter varmeinaktivering af ligasen blev proben ekstraheret med phenol og etherbehandlet og DNA'et udfældet som beskrevet. Bundfaldet blev opløst, og DNA'et blev skåret med restriktionsenzymerne Xhol og BamHI. Efter tilsætning af probepuffer, 7 minutters opvarmning af 15 blandingen ved 65“C og adskillelse af DNA'et på en 6X polyacrylamid-gel blev Xhol/BamHI-fragmentet med promotoren N250PSN250P29, ribosom-bindingsstedet RBSII og det område, der koder for 6 histidiner, isoleret som beskrevet. Dette fragment fik betegnelsen fragment 10 (fig. 27).

20 C. Fremstilling af BamHI/Xhol - fragmentet fra plasmidet pDS78/RBSII

2 pmol af plasmidet pDS78/RBSII blev skåret med restriktionsenzymerne Xhol og BamHI. Efter oparbejdning af proben og gelelektroforese blev fragmentet indeholdende replikationsområdet isoleret (fig. 28).

D. Sammensætning af plasmidet p6xHis-DHFR

25 0,1 pmol af hvert af de omtalte fragmenter blev Inkuberet i ligase puffer med 2 E T4-DNA-ligase (22®C, 3 timer). Efter varmeInaktivering af enzymet blev blandingen transformeret som beskrevet ovenfor i E. coli-stammen M15, der indeholdt plasmidet pDMI.l, transformations-blandingen blev udpladet på LB-agarplader indeholdende 100 pg/ml 30 ampicillin og 25 pg/ml kanamycin, og pladerne blev inkuberet natten over ved 37®C. Enkelte kolonier blev dyrket i 10 ml LB-medium som beskrevet, og plasmiderne blev isoleret ved metoden ifølge Birnboim 34 DK 173951 B1 og Doly (supra). En restriktionsanalyse med enzymerne Xhol og BamHI • viste, at plasmiderne indeholdt de 2 ønskede fragmenter. Sekvensana lyse blev udført som beskrevet (eksempel 3,E) og viste, at adaptor 7 var blevet forbundet korrekt med ribosombindingsstedet. Disse plasmi-5 der, der koder for DHFR-fusionsproteinet (His)g-mDHFR, fik betegnelsen p6xHis-DHFR (fig. 28).

EKSEMPEL 10

Konstruktion af plasmidet p4xHis-DHFR

Konstruktionen af plasmidet p4xHis-DHFR blev udført analogt med 10 konstruktionen af plasmidet p6xHis-DHFR (eksempel 9), idet følgende DNA-fragmenter blev isoleret og forbundet med hinanden (fig. 30): 1) den med adaptor 8 (fig. 11) forbundne signalenhed fra plasmidet pDS78/RBSII med promotoren N250PSN25OP29 og ribosombindingsstedet RBSII (fragment 11, fig. 29); og 2) det største af de to XhoI/BamHI-15 fragmenter fra plasmidet pDS78/RBSII (fig. 30). Det resulterende plasmid p4xHis-DHFR koder for DHFR-fusionsproteinet (His)^-mDHFR.

EKSEMPEL 11

Konstruktion af plasmidet pRBSII-6xHis A. Principper 20 Til konstruktion af plasmidet pRBSII-6xHis blev følgende DNA-fragmen-ter isoleret og forbundet med hinanden (fig. 32): 1) det med adaptor 9 (som koder for 6 histidiner) forlængede område fra plasmidet pDS56/RBSIl med terminatoren t0, cat-genet og terminatoren TI (fragment 12, fig. 31); og 2) Xbal/BamHI-fragmentet fra plasmidet pDS56/-25 RBSII med replikationsområdet, bla-genet, promotoren N250PSN250P29 og ribosombindingsstedet RBSII (fig. 32).

35 DK 173951 B1 B. Fremstilling af fragment 12 2 pmol af plasmidet pDS56/RBSII blev skåret med restriktionsenzymet Hindlll. Efter oparbejdning af proben blev der til det skårne plasmid sat 50 pmol af den phosphorylerede adaptor 9, og proben blev inkube-5 ret med T4-DNA-ligase som beskrevet. Efter oparbejdning af ligeringsblandingen blev DNA'et skåret med restriktionsenzymerne BamHI og Xbal, og BamHI/Xbal-fragmentet med det område, der koder for 6 histi -diner, terminatoren t0, cat-genet og terminatoren TI blev isoleret som beskrevet. Dette fragment fik betegnelsen fragment 12 (fig. 31).

10 C. Fremstilling af Xbal/BamHI-fragmentet fra plasmidet pDS56/RBSII

2 pmol af plasmidet pDS56/RBSIl blev skåret med restriktionsenzymerne Xbal og BamHI, og fragmentet med replikationsområdet, bla-genet, promotoren N250PSN250P29 og ribosombindingsstedet RBSII blev isoleret som beskrevet (fig. 32).

15 D. Sammensætning af plasmidet pRBSII-6xHis 0,1 pmol af hvert af de isolerede fragmenter blev ligeret som beskrevet (eksempel 9,D) og derefter transformeret i E. coli-stammen M15 (pDMI.l). Efter udpladning og inkubation (eksempel 9,D) blev enkelte kolonier dyrket i 10 ml medium som beskrevet, og plasmiderne 20 blev isoleret ved metoden ifelge Birnboim og Doly (supra). En restriktionsanalyse med enzymerne BamHI og Xbal viste, at plasmiderne indeholdt de 2 ønskede fragmenter. Sekvensanalyse (eksempel 3,E) bekræftede, at adaptor 9 var blevet korrekt indført I plasmid-DNA'et.

Disse plasmider fik betegnelsen pRBSII-6xHis.

25 EKSEMPEL 12

Konstruktion af plasmidet pRBSII-4xHls

Konstruktionen af plasmidet pRBSII-4xHis blev udført analogt med konstruktionen af plasmidet pRBSII-6xHIs (eksempel 11), idet følgende DNA-fragmenter blev isoleret og forbundet med hinanden (fig. 34): 1) 36 DK 173951 B1 det med adaptor 10 (der koder for 4 histidiner) forlængede område fra plasmidet pDS56/RBSII med terainatoren tc, cat-genet og termlnatoren TI (fragment 13, fig. 33); og 2) Xbal/BamHl-fragmentet fra plasmidet pDS56/RBSII med replikationsområdet, bla-genet, promotoren 5 N250PSN250P29 og ribosombindingsstedet RBSII (fig. 34).

EKSEMPEL 13

Konstruktion af plasmidet pRBSII-2xHis

Konstruktionen af plasmidet pRBSII-2xHis blev udført analogt med konstruktionen af plasmidet pRBSII-6xHis (eksempel 11), idet følgende 10 DNA-fragmenter blev isoleret og forbundet med hinanden (fig. 36); 1) det med adaptor 11 (der koder for 2 histidiner) forlængede område fra plasmidet pDS56/RBSII med termlnatoren t0, cat-genet og terminatoren TI (fragment 14, fig. 35); og 2) Xbal/BamHl-fragmentet fra plasmidet pDS56/RBSII med replikationsområdet, bla-genet, promotoren 15 N250PSN250P29 og ribosombindingsstedet RBSII (fig. 36).

EKSEMPEL 14

Konstruktion af plasmidet pDHFR-6xHis A. Principper

Til konstruktion af plasmidet pDHFR-6xHis blev følgende DNA-fragmen-20 ter isoleret og forbundet med hinanden (fig. 37): 1) Xbal/Bglll-fragmentet fra plasmidet pDS78/RBSII med replikationsområdet, bla-genet, promotoren N250PSN250P29, ribosombindingsstedet RBSII og dhfr-genet; og 2) Bglll/Xbal-fragmentet fra plasmidet pRBSII-6xHis med det område, der koder for 6 histidiner, terminatoren tD, cat-genet og 25 terainatoren TI. Det resulterende plasmid pDHFR-6xHIs koder for DHFR-fusionsproteinet Met-mDHFR-(His)g.

37 DK 173951 B1

5. Fremstilling af Xbal/BgIII-fragmentet fra plasmidet pDS78/RBSII

2 pmol af plasmidet pDS78/R£SII blev skåret med restriktionsenzymerne Xbal og Bglll. Efter oparbejdning af proben blev Xbal/BgIII-fragmentet med replikationsområdet, bla-genet, promotoren N250PSN250P29, 5 ribosombindingsstedet RBSI1 og dhfr-genet isoleret som beskrevet.

C. Fremstilling af Bglll/Xbal-fragmentet fra plasmidet pRBSII~6xHis 2 pmol af plasmidet pRBSII-6xHis blev skåret med restriktionsenzymerne Bglll og Xbal. Efter oparbejdning af proben blev BglIΙ/Xbal-fragmentet med det område, der koder for 6 histidiner, terminatoren t0, 10 cat-genet og terminatoren TI isoleret som beskrevet.

D. Sammensætning af plasmidet pDHFR-6xHis 0,1 pmol af hvert af de isolerede fragmenter blev ligeret som beskrevet (eksempel 9,D) og transformeret i E. coli-stammen M15 (pDMI,l). Efter udpladning og inkubation (eksempel 9,D) blev enkelte 15 kolonier dyrket i 10 ml medium som beskrevet, og plasmiderne blev isoleret ved metoden ifølge Birnboim og Doly (supra). En restriktionsanalyse med enzymerne Xbal og Bglll viste, at de to fragmenter var blevet forbundet med hinanden på den ønskede måde. Disse plasmi-der fik betegnelsen pDHFR-6xHis.

20 EKSEMPEL 15

Konstruktion af plasmidet pDHFR-2xHis

Konstruktionen af plasmidet pDHFR-2xHis, som koder for DHFR-fusions-proteinet Met-mDHFR-(His>2, blev udført analogt med konstruktionen af plasmidet pDHFR-6xHis (eksempel lå), idet følgende DNA-fragmenter 25 blev isoleret og forbundet méd hinanden (fig. 38): 1) Xbal/Bglll-fragmentet fra plasmidet pDS78/RBSII med replikationsområdet, bla-genet, promotoren N250PSN250P29, ribosombindingsstedet RBSI1 og dhfr-genet; og 2) Bglll/Xbal-fragmentet fra plasmidet pRBSII-2xHis med det 38 DK 173951 B1 område, der koder for 2 histidiner, terminatoren t0, cat-genet og terminatoren TI.

EKSEMPEL 16

Konstruktion af plasmidet p4xHis-DHFR-4xHis 5 Konstruktionen af plasmidet p4xHis-DHFR-4xHis, som koder for DHFR-fusionsproteinet (His)^-mDHFR-(His)4, blev udført analogt med konstruktionen af plasmidet pDHFR-6xHis (eksempel 14), idet følgende DNA-fragmenter blev isoleret og forbundet med hinanden (fig. 39): 1) Xbal/Bglll-fragmentet fra plasmidet p4xHis-DHFR med replikationsom-10 rådet, bla-genet, promotoren N250PSN250P29, ribosombindingsstedet RBSlI,4xHis og dhfr-genet; og 2) Bglll/Xbal-fragmentet fra plasmidet pRBSH-4xHis med det område, der koder for 4 histidiner, terminatoren t0, cat-genet og terminatoren Ti.

EKSEMPEL 17 15 Fremstilling af NTA-harpiksen 41,7 g bromeddikesyre blev opløst i 150 ml 2N natriumhydroxid og afkølet til 0°C. Hertil dryppedes langsomt ved 0eC og under omrøring en opløsning af 42 g Ne-Z-L-lysin i 225 ml 2N natriumhydroxid. Efter 2 timer blev afkølingen indstillet, og der omrørtes videre natten 20 over. Derefter blev reaktionsblandingen holdt i 2 timer ved 50*C, hvorefter der tilsattes 450 ml IN saltsyre. Efter at blandingen var blevet afkølet, blev de udskilte krystaller frafiltreret. Produktet blev opløst i IN natriumhydroxid og på ny udfældet med den samme mængde IN saltsyre og frafiltreret. Dette gav 40 g N-[5-benzyloxycar-25 bonylamino-l-carboxypentyl]-iminodieddikesyre i form af hvide krystaller, smeltepunkt 172-174*0 (sønderdeling), (cr]jj * +9,9“ (c - 1; 0,1 N NaOH).

7,9 g af det vundne lysinderivat blev opløst i 49 ml IN natriumhydroxid og blev efter tilsætning af en spatelspids 5X Pd/C hydroge 39 DK 173951 B1 neret ved stuetemperatur og normaltryk. Katalysatoren blev frafiltreret og filtratet inddampet. Dette gav 6,2 g N-[5-amino-l-carboxy-pentyl]-imlnodieddikesyre, hvis struktur, NH2-(CH2)4)-CH(COOH)-N(CH2COOH)2i blev bekræftet ved NMR-spektrum.

5 100 ml Sepharose® CL-6B (Pharmacia) blev vasket to gange med ca. 500 ml vand på et glassugefilter og derefter omsat i en 500 ml rundbundet kolbe med 16 ml 4N natriumhydroxid og 8,22 ml epibromhydrin i 4 timer ved 30*C. Reaktionsblandingens samlede volumen var 200 ml. Derefter blev det aktiverede Sepharose frafiltreret, vasket neutralt med vand 10 og ført tilbage til reaktionsbeholderen. 6,5 g N-[5*amino-l-carboxy-pentyl]-imlnodieddikesyre blev opløst i 50 ml vand og sammen med 10,6 g fast soda sat til det aktiverede Sepharose. Blandingen blev langsomt omrørt natten over ved 60*C. Den resulterende chelatharpiks med formlen [Sepharose® CL-6BJ-0-CH2-CH(0H)-CH2-NH-(CH2>4-CH(COOH)-15 N(CH2C00H)2 (NTA-harpiks) blev derefter vasket i en chromatografisøj - le successivt med 500 ml vand, 100 ml vandig NiS04*6H20 (2 vægtprocent), 200 ml vand, 200 ml 0,2 M eddikesyre (indeholdende 0,2 M NaCl og 0,1 vægt/volumenprocent Tween 20) og 200 ml vand. Nikkelion-kon-centrationen af den resulterende chelatharpiks med formlen [Sepharo-20 se® CL-6B]-0-CH2-CH(0H) -CH2-NH- (CH2)4-CH(C00H) -N(CH2COO‘)2Ni2+ var ca. 7,1 pmol/ml.

EKSEMPEL 18

Metalchelat-affinitetschromatografi med oprenset IFN-7

En søjle (diameter 1,6 cm, længde 7,0 cm) blev fyldt med en metalfri 25 chelatharpiks med formlen [Sepharose® CL-6B]-0-CH2-CH(0H)-CH2-NH-(CH2>4-CH(C00H)-N(CH2C00M)2 (NTA-harpiks), og harpiksen blev bragt på nikkelform ved skylning med 3 gange søjlevolumenet af 0,1 M NiS0^»5H20 og efterfølgende vask med 3 gange søjlevolumenet af 0,2 M eddikesyre. Derefter blev der ækvilibreret med 0,1 H Tris»HCl-puffer 30 (pH 7,5) og 0,5 M NaCl (gennemstrømning hver gang 60 ml/time).

1 mg oprenset IFN-7 (eksempel 3, aminosyresekvens se fig. 40) blev taget op i 3 ml ækvilibreringspuffer og anbragt på søjlen. Ved et 40 DK 173951 B1 enzymimmunoassay [H. Gallati, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 20, 907-914 (1982)] kunne det påvises, at der på trods af de to indre pro-teinstrukturelementer Gly-His-Ser og Ile-His-Glu ikke fandt nogen binding sted til NTA-søjlen.

5 EKSEMPEL 19

Oprensning af His.His-Xa-IFN-γ ved hjælp af NTA-harpiks E. coli M15-celler, der indeholdt plasmiderne pDMI.l og pHis,His-Xa-IFN-7 (eksempel 6), blev dyrket i 1 liter LB-medium indeholdende 100 Pg/ml ampicillin og 25 pg/ml kanaraycin ved 37“C til en optisk tæthed 10 på OD^oO “0.6· Derefter blev der tilsat IPTG (slutkoncentration 0,5 mM), og cellerne blev inkuberet i yderligere 4 timer. Derefter blev cellerne skilt fra dyrkningsmediet ved centrifugering (4000 x g, 10 minutter, 4eC) (5 g vådvægt) og åbnet med 15 ml 7 M guanidin»HCl og 0,01 M natriumborat (pH 8) (1 time, 4eC, magnetomrører). Den således 15 vundne råekstrakt blev centrifugeret (10.000 x g, 15 minutter, 4“C), supernatanten fortyndet 10 gange med 0,1 M Tris-HCl-puffer (pH 7,5) og 0,5 M NaCl, på ny centrifugeret (10.000 x g, 15 minutter, 4°C) og pumpet op på den samme NTA-søjle som beskrevet i eksempel 18. Dernæst blev søjlen vasket med ækvilibreringspuffer i så lang tid, at UV-20 detektoren (280 nm) igen viste basisværdien. Eluering af His,His-Xa-IFN-γ udførtes ved sænkning af pH-værdien til 5,5. Ved et enzymimmu-noassay (H. Gallati, supra) kunne det påvises, at dette protein blev absorberet kvantitativt fra NTA-søjlen og først blev elueret ved sænkning af pH-værdien. Ved SDS-polyacrylamid-gelelektroforese og 25 RP-18 HPLC kunne det påvises, at det vundne protein var rent His.His-

Xa-IFN-y (renhed > 902). Den forventede aminoterminale sekvens Met-His-His-Ala-Gly-lle-Glu-Gly-Arg-Gln... blev bekræftet ved Edman-nedbrydning.

41 DK 173951 B1 EKSEMPEL 20

Oprensning af His,His-Ek-IFN-7(-8) ved hjælp af NTA-harpiks

His,His-Ek-IFN--y(-8) (eksempel 7) blev udtrykt i E. coli på analog måde med eksempel 19, ekstraheret og oprenset på NTA-søjlen. Dette 5 fusionsprotein blev også bundet til NTA-søjlen ved pH 7,5 og elueret i ren form (renhed > 902) ved sænkning af pH-værdien til 5,5. Den forventede sekvens Met-His-His-Ala-Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gln... blev bekræftet ved Edman-nedbrydning.

EKSEMPEL 21 10 Oprensning af His,His-Xa-IFN*7(-8)(Asn) ved hjælp af NTA-harpiks

His,His-Xa-IFN-7(-8)(Asn) (eksempel 8) blev udtrykt i E. coli på analog måde med eksempel 19, ekstraheret og oprenset på NTA-søjlen.

Dette protein blev også bundet til NTA-søjlen ved pH 7,5 og elueret i ren form (renhed > 902) ved sænkning af pH-værdien til 5,5.

15 1 mg af det således vundne His ,His-Xa-IFN-7(-8) (Asn) blev dialyseret mod 0,1 M Tris»HCl (pH 7,5), 0,5 M NaCl og 1 mM CaCl2· Dialysatet (5 ml) blev tilsat 100 μΐ (- 1U) koagulationsfaktor Xa (Boehringer Mannheim) og inkuberet i 16 timer ved 22eC. Enzymatisk nedbrydning af His,His-affinitetspeptidet blev påvist ved SDS-polyacrylamid-gelelek-20 troforese.

For at fraskille salte, bovint serumalbumin (bestanddel af det kommercielt tilgængelige faktor Xa-præparat) og faktor Xa blev inkubationsblandingen først dialyseret mod vand, derefter lyofiliseret og endelig chromatograferet på en RP-18 HPLC-søjle (Nucleosil 5C18-søjle 25 fra Brownlee Labs, elueringsmiddel 0,12 trifluoreddikesyre, gradient med acetonitril, gennemstrømning 1 ml/min). Det resulterende oprense-de protein blev derefter befriet for opløsningsmiddel og underkastet en Edman-nedbrydning. Ved denne metode kunne den forventede aminoter-minale sekvens Gln-Asn-Pro-Tyr... bekræftes.

42 DK 173951 B1

Dette forsøg viser, at affinitetssekvensen ved NH2-terminalen af His,His-Xa-IFN-y(-8) (Asn) kan fraspaltes i ren form efter metalche-lat-affinitetschromatografi.

EKSEMPEL 22 5 Oprensning af (His)g-mDHFR ved hjalp af NTA-harpiks i 6 M guani-din-HCl (His)g-mDHFR (eksempel 9) blev udtrykt i E. coli på analog måde med eksempel 19. Cellerne blev åbnet med 6 M guanidin-HCl i 0,1 M natri-umphosphatpuffer (pH 8,0) (5 ml pufferopløsning pr. 1 g celler, 1 10 time, 22eC, magnetomrører). Den således vundne råekstrakt blev derefter centrifugeret, og supernatanten blev pumpet op på den samme NTA-søjle som beskrevet i eksempel 18. Med undtagelse af de anvendte pufferopløsninger blev chromatografien udført analogt med eksempel 19. De anvendte puffere indeholdt hver 6 M guanidimHCl i 0,1 M 15 natriumphosphatpuffer med følgende pH-værdier: pH 8,0 til påføring af proteinerne, pH 6,0 til udvaskning af de ubundne E. coli-proteiner og pH 4,5 til eluering af (His)g-mDHFR. Det vundne eluat blev dialyseret mod vand og derpå lyofiliseret. Ved SDS-polyacrylamid-gelelektrofore-se kunne det påvises, at det vundne protein var rent (His)g-mDHFR 20 (renhed >90X). Den forventede sekvens Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser-lle-Met... blev bekræftet ved Edman-nedbrydning.

EKSEMPEL 23

Oprensning af (HisJ^-mDHFR-(His)/^ ved hjælp af NTA-harpiks i 6 M guanidin*HCl 25 (His)4-mDHFR-(His)4 (eksempel 16) blev udtrykt i E. coli på analog måde med eksempel 19, ekstraheret og oprenset på NTA-søjlen. I stedet for den i eksempel 22 anvendte tringradient blev der anvendt en lineær pH-gradient (pH 8,0 til pH 4,0, 2 timer) til elueringen.

(His)4-mDHFR-(His>4-fusionsprotein blev elueret ved pH 4,9 og havde 30 en renhed på mindst 90%.

43 DK 173951 B1

EKSEMPEL 2A

Oprensning af Met-mDHFR-(His)g ved hjælp af NTA-harpiks 1 6 M urinstof

Met-mDHFR-(His)g (eksempel 14) blev udtrykt i E. coli på analog måde 5 med eksempel 19. De fracentrifugerede celler blev ekstraheret med 6 M urinstof i 0,05 M natriumphosphatpuffer (pH 7,5) (1 g celler pr.

10 ml pufferopløsning) og ultralyd (10 minutter). Efter fracentrifu-gering af cellerester blev supernatanten anbragt på en med ekstraktionspuffer ækvilibreret NTA-søjle (4,5 cm x 2,6 cm). Efter vask af 10 søjlen med ekstraktionspuffer blev Met-mDHFR-(His)g-fusionsproteinet elueret med en lineær pH-gradient fra pH 7,5 (ekstraktionspuffer) til pH 4,8 (0,05 M natriumphosphatpuffer indeholdende 6 M urinstof) i 5 timer og en pumpehastighed på 18 ml i timen. De fraktioner, der indeholdt protein, blev analyseret ved SDS-polyacrylamid-gelelektro-15 forese. Dette gav 9 mg Met-mDHFR-(His)g-fusionsprotein med en renhed på >90X.

EKSEMPEL 25

Oprensning af Met-mDHFR-(His)2 ved hjælp af NTA-harpiks

Met-mDHFR-(His)2 (eksempel 15) blev udtrykt i E. coli på analog måde 20 med eksempel 19. De fracentrifugerede celler blev behandlet i 0,05 M kaliumphosphatpuffer (pH 8,0), der indeholdt 0,1 M kaliumchlorid og 0,1X Tween 20, 1 15 minutter i et isbad med ultralyd (1 g celler pr.

10 ml pufferopløsning). Derefter blev celleresteme fracentrifugeret, og den klare supernatant påført en med ekstraktionspuffer ækvilibre-25 ret NTA-søjle (4,6 cm x 2,6 cm). Søjlen blev vasket med ekstraktions-puffer, og Met-mDHFR-(His)2-fusionsproteinet blev elueret med en lineær pH-gradient fra pH 8,0 (ekstraktionspuffer) til pH 5,0 (0,05 M kaliumphosphatpuffer indeholdende 0,1 M kaliumchlorid og 0,1X Tween 20) i 10 timer og en pumpehastighed på 50 ml i timen. Topfraktionerne 30 i eluatet blev analyseret ved SDS-polyacrylamid-gelelektroforese.

Dette gav 7 mg Met-mDHFR-(His)2"fusionsprotein med en renhed på >85X.

DK 173951 B1

AA

3 mg af det således vundne Met-mDHFR-(His)2~fusionsprotein blev dialyseret mod 0,05 M Tris*HCl (pH 6,0) ved 6°C. Proteinopløsningen blev derefter indstillet til pH 9,0 med 0,5 M NaOH og inkuberet ved 37"C i nærværelse af 8,5 enheder carboxypeptidase A fra bovin pan-5 crease (Serva Feinbiochemica, Heidelberg, BRD). Efter 0, 15, 30, 90 og 180 minutter blev der udtaget prøver, der blev analyseret ved HPLC for deres histidin-indhold. Efter 480 minutter blev pH-værdien sænket til 8,0, og reaktionsblandingen blev pumpet over på en NTA-søjle, der var ækvilibreret med 0,05 M kaliumphosphatpuffer (pH 8). Det i reak-10 tionsblandingen indeholdte protein blev påvist ved SDS-polyacrylamid-gelelektroforese i gennemstrømningen. Desuden blev der i de prøver, der var udtaget efter 15, 30, 90 og 180 minutter fra proteinopløsningen, påvist en med tiden tiltagende mængde histidinrester.

Dette forsøg viser, at affinitetssekvensen ved carboxyterminalen kan 15 fjernes i ren form efter oprensning på NTA-harpiksen.

Claims (17)

1. Fusionsproteiner, kendetegnet ved, at de består af ét eller to affinitets -peptider, son indeholder nabostillede histidinrester, og et til disse 5 affinitetspeptider direkte eller indirekte bundet biologisk aktivt polypeptid eller protein.

2. Fusionsproteiner ifølge krav 1, kendetegnet ved, at affinitetspeptiderne har formlen R1-(His)2-4*R2. 10 hvor er hydrogen, en aminosyre eller en sekvens på flere aminosyrer, R^ er Q, Q-Ile-Gln-Gly-Arg- eller Q-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-, og Q er en peptidbinding, en aminosyre eller en sekvens af flere, maksimalt 30, aminosyrer, idet affinitetspeptideme isar har en peptidsekvens med formlerne

3. Fusionsproteiner ifølge krav 1 eller 2, kende tegnet ved, at et affinitetspeptid er bundet direkte eller indirekte til den aminoterminale eller carboxyterminale amino-20 syre i det biologisk aktive polypeptid eller protein, eller at et affinitetspeptid er bundet direkte eller indirekte til den aminoterminale aminosyre og et yderligere til den carboxyterminale aminosyre i det biologisk aktive polypeptid eller protein.

4. Fusionsproteiner ifølge et hvilket som helst af kravene '1-3, 25 kendetegnet ved, at affinitetspeptiderne danner complex med immobiliserede nikkelioner. DK 173951 B1

5. Fus1onsproteiner ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det biologisk aktive polypeptid eller protein har en aminosyresekvens af et humant immuninterferon eller delsekvenser deraf eller en aminosyresekvens af dihydrofolat-redukta- 5 se fra mus.

6. Bakterielt, fx i E. coli, fremstillet fusionsprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5.

7. Fusionsprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6 i homogen form. 10

8 . Gener, kendetegnet ved, at de koder for et fusionsprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6.

9. Ekspressionsvektorer, kendetegnet ved, at de indeholder et gen ifølge krav 8, 15 der er operativt forbundet med en ekspressionskontrolsekvens.

10. Ekspressionsvektorer ifølge krav 9, kendetegnet ved, at de kan replikere i en gramnegativ bakterie, fx E. coli.

11. Transformeret bakterie, fx en E. coli-stamme, især en E. coli

20 M15-stamme, kendetegnet ved, at den er transformeret med en ekspressionsvektor ifølge krav 9 eller 10.

12. Fremgangsmåde til oprensning af et fusionsprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, 25 kendetegnet ved, at en opløsning indeholdende, fusionsproteinet bringes i kontakt med en metalchelatharpiks med følgende struktur bærerroatrix-spacer-NH-(CH2)x-CH(COOH)-N(CH2COO*)2 Ni^+ DK 173951 B1 hvor x er 2, 3 eller h, og fusionsproteinet elueres ved behandling af den ladede harpiks med en vaskevæske.

13. Fremgangsmåde til oprensning af et biologisk aktivt polypeptid eller protein, 5 kendetegnet ved, at det oprenses som et fusionsprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6 ved en fremgangsmåde ifølge krav 12, hvorefter affinitetspeptidet fjernes ved selektiv fraspaltning.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, 10 kendetegnet ved, at der anvendes en protease, fx faktor Xa, til fraspaltning af affinitetspeptidet.

15. Vacciner, kendetegnet ved, at de indeholder et fusionsprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7 og et fysiologisk acceptabelt 15 bærermateriale.

15 Met-His-His, Met-His-Hie-His, Met-His-His-His-His, Met-His-Hie-His-His-His, Met-His-Hie-His-His-His-Hie, Met-Hie-Hie-Ala-Gly-Ile-Glu-Gly-Arg Met-His-His-Ala-Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-LyE

16. Reagenser til bestemmelse af infektionssygdomme, kendetegnet ved, at de indeholder et fusionsprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7.

17. Anvendelse af et fusionsprotein ifølge et hvilket som helst af 20 kravene 1-6 til oprensning af et biologisk aktivt polypeptid ved en fremgangsmåde ifølge krav 13 eller 14.