DK171421B1 - Polysaccharidforbindelse og fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Description

DK 171421 B1

Den foreliggende opfindelse angår covalent modificerede neutrale bakterielle polysacchander, specielt pneumococ 14 og lignende polysacchander, og covalente konjugater af sådanne polysacchander knyttet med en bigenerisk 5 spacer, som muliggør bevis for covalens og som Jetter oprensning og koncentrering af biologisk ønskede enheder, med immunogen bakteriel membran eller andre proteiner, hvilke konjugater er nyttige komponenter af bakterie-vacciner. Den foreliggende opfindelse angår også frem-10 gangsmåder til fremstilling af sådanne polysacchander og konjugater.

Rensede kapsulære polysacchander fra bakterier er blevet anvendt til at fremstille vacciner mod beslægtede bakterier, men de resulterende immunrespons har ofte været 15 mindre tilfredsstillende end ønsket, specielt i meget små børn eller individer med umodne eller utilstrækkelige immunologiske systemer. F.eks. fremprovokerer Streptococcus pneumoniae type 14 kapsulært polysacchand ikke noget immunrespons i småbørn, hvilket gør dette 20 polysacchand ueffektivt i sig selv ved tilvejebringelse af beskyttelse mod de alvorlige pediatnske medicinske problemer, der forårsages af Streptococcus pneumoniae type 14 bakterier, se f.eks. Douglas et al., J. Infect. Diseases, 148, 131 - 137 (1983) and Laurence et al., 25 Am. J. Diseases of Children, 137, 846 - 850 (1983).

Forbedringen af lmmunogeniciteten af disse polysacchari-der kan ofte opnås ved at kombinere dem med proteiner, Schneerson et al., Infection and Immunity, 4_5, nr. 3, 582 - 591 (1984) (der diskuterer konjugation af Strepto-30 coccus pneumoniae type 6A).

Der må imidlertid udvises omhu ved udvælgelsen af det protein, som skal kombineres med disse polysacchander.

Visse proteiner (f.eks. pertussinogen) er ikke-specifikke stimulatorer for immunsystemet i småbørn. Disse pro- DK 171421 B1 2 teiner kan tn en vis grad forbedre immunresponset mod polysacchandantigener, men uheldigvis fører sådan i kke-specifik aktivering til uønskede biologiske virkninger (f.eks. reaktogenicitet) . Det meget foretrukne specifikt 5 forøgede immunrespons mod disse polysacchandantigener kan opnås i småbørn ved at "konjugere" disse polysaccha-nder til passende proteiner som først rapporteret af W. F. Goebel og 0. T. Avery i 1929 (J. Exptl. Medicine 50, 521 - 531 (1929)).

10 Kombinering af polysacchandet og protein må også betrag tes omhyggeligt. Hvis den immunologiske forbedring, som det menes, skyldes den molekylære lighed mellem polysacchar iddeterminanterne og proteinbærerdeterminanterne, må disse dele ikke let adskilles i det biologiske 15 system. Ikke-covalente komplekser, der dannes ud fra den polyanioniske egenskab af mange polysaccharider og den po1yka11 on i ske egenskab af bærerproteiner, kan stimulerer immunrespons, men disse komplekser er kemisk labile, og de resulterende immunrespons synes at udvi-20 se T-ce11euafhæng ighed. Modsætningsvis ville covalente konjugater af polysaccharider og protein udvise maget større kemisk stabilitet og kunne udvise T-celleafhængige immunrespons.

Govalente polysaccharid-proteinkonjugater kendes fra 25 litteraturen, men den eksakte natur af den covalente binding er ikke blevet påvist eller bestemt kvantitativt, da den eneste prøve for covalens har været aktivitet in vivo. Desuden har de i litteraturen omhandlede processer ringe reproducerbarhed. Haemophilus influenzae 30 type b og Streptococcus pneumoniae type 6A polysacchan- der blev omsat med cyanogenbromid, derpå med adipin-syre-dihydrazid efterfulgt af kobling med tetanustoxoid eller dolkhale-hæmocyaninproteiner i Schneerson et al.

J . Exptl. Med., 152, 361 (1980) og Infection and Immunity, DK 171421 B1 3 40, 245 ( 19B3). Pneumococcal type 19F polysaccharid blev/ koblet med bovint serumalbumin direkte \/ed dannelse af immer (Schiffske baser) ud fra de reducerende ender 5 af polysacchari derne og de modsvarende amingrupper (dvs.

lysiner) af proteinet, efterfulgt af reduktion af disse immer med natriumcy anborhy dnd (Lin et al., Immunology, 46, 333 (1982).

Yderligere blev polysacchander knyttet til diazoterede 10 aromatiske ammer koblet til proteinets ty rosiner i K. K. Nixdorff et al., Immunology ^9, 87 (1975), og polysacchander knyttet til aromatiske ammer blev konverteret til isothiocyanater, som derpå blev knyttet til de modsvarende aminogrupper i proteinets ly sin i 15 S. B. Svenson og A. A. Lindberg, J. Immunolog. Methods 25, 323 (1979). I hvert tilfælde blev det resulterende konjugat imidlertid kun karakteriseret ved sin opførsel i ge1permeermgschromatografi . I endnu et eksempel (5.

Nutani et al., Infection and Immunity 971 ( 1982)) 20 blev polysaccharidet pullulan aktiveret med cyanurchlo- rid, derpå omsat med tetanustoxoid. 1 dette tilfælde blev konjugaterne karakteriseret ved elektroforese og kun påvist at være forskellige fra udgangsmaterialerne.

I ingen af disse tilfælde blev der påvist covalens bort-25 set fra indblandingerne fra en aggregeret molekylvægt, hvorved man sammenblander covalens med den naturlige interaktion af makromolekylære arter med og uden ladninger i molekylære komplekser, da disse komplekser også vil give en aggregatmolekylvægt. 1 I DK patentansøgning nr. 2055/85 er der beskrevet co valent modificerede polyanioniske polysacchander og proteiner, sammen med covalente konjugater af sådanne polysacchander sammenknyttet med en bigenensk spacer med immunogen bakteriel membran eller andre prote- DK 171421 B1 4 iner og metoder til fremstilling af disse og bekræftelse af covalensen for bindingen mellem polysacchander og proteiner. Under anvendelse af den nævnte references 5 metodologi er det nu muligt at fremstille kemisk stabile polysacchand/protein-konjugater, som udviser T-celleafhængighed, og som ville være nyttige som vaccinekomponenter til at fremkalde beskyttende serumantistoffer mod, især, de beslægtede bakterier for de polysaccha-10 rider, der anvendes. Denne metodologi er imidlertid kun nyttig til covalent modificering af polyanioniske polysacchander og har ikke været nyttig med vanskelige polysacchander, som er uopløselige eller kun halvopløselige i organiske opløsningsmidler eller saltopløsninger.

15 Det har derfor været et ønske at udvikle en metode til solubilisenng af neutrale polysacchander og covalent modificering af disse neutrale polysacchander ved præpa-renng til fremstilling af kemisk stabile polysaccha-nd/protei n-konjugater. Det har endvidere været ønsket 20 at knytte neutrale polysacchanddeterminanter til pro teinbære rdete rminante r , i kemisk stabile konjugater, så at den molekylære lighed mellem disse dele kunne bibeholdes i biologiske systemer for at disse konjugater kunne være nyttige som komponenter i en mono- eller 25 polyvalent vaccine til at fremkalde beskyttende seruman tistoffer mod visse bakterier, især de beslægtede bakterier for de anvendte polysacchander. Det har yderligere været ønsket at udvikle metoder til behandling under anvendelse af disse konjugater i immunologisk effektive 30 vacciner til anvendelse mod f.eks. meningitis og otitis media.

Den foreliggende opfindelse angår covalent modificerede neutrale bakteriepolysacchander og kemisk stabile konjugater af sådanne neutrale polysacchander med covalent DK 171421 B1 5 modificerede immunogene membranproteiner, virale prote-munderenheder, syntetiske polypeptider, bakterielle toxoider og andre egnede immunogene proteiner, hvilke konjugater er nyttige komponenter af immunogene bakterie-5 vacciner. Polysacchand/protein-konjugaterne ifølge opfindelsen kobles via bigenenske spacere indeholdende en covalent thioethergruppe, hvori de bigenenske spacere er atomkæder, der binder makromolekyler (såsom neutrale poJysaccharider og proteiner), hvor en del af 10 spacerne stammer fra et modificeret molekyle (f.eks.

det covalent modificerede neutrale polysacchand), og den anden del stammer fra det andet modificerede makro-molekyle (f.eks. det funktionaliserede protein).

I fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det neutrale 15 polysacchand covalent funktionaliseret i et eller flere trin til fremstilling af et polysacchand med tilsvarende elektrophile centre eller tilsvarende thiolgrup-per. Det neutrale polysacchand fragmenteres foretruk-kent først ved opvarmning i vand med eller uden vandig 20 hydrazin, vandet fjernes, og det fragmenterede poly sacchand derivatiseres med et bifunk11 one 11 aktiverings-middel, før det omsættes med en bis-nucleophi1 . Det nucleophil-funktionaliserede neutrale polysacchand omsættes derpå enten med et reagens til dannelse af 25 tilsvarende elektrophile steder eller omsættes med et reagens til dannelse af tilsvarende thiolgrupper. Ved passende udvælgelse af bis-nucleoph11 en, dvs. en sådan, som reagerer med det aktiverede neutrale polysacchand og resulterer i et covalent modificeret polysacchand 30 med tilsvarende elektrophile steder eller thiolgrupper, eller udvælgelse af den passende nucleophil, kan yderligere funk11ona11 sering af det nuc1eophi1-funktlona11-serede neutrale polysacchand undgås.

Uafhængigt af den covalente modifikation af det neutrale DK 171421 B1 6 polysacchand omsættes det passende bakterie]le bærerprotein med reagenser, der danner tilsvarende thiolgrup-per, eller med reagenser, der danner tilsvarende elektro-phile centre, i en proces med et eller to trin. De passen-5 de covalent modificerede neutrale polysacchander og proteiner omsættes derpå til dannelse af covalente poly saccharid/protei n-kon jugater og renses til fjernelse af ukonjugerede makromolekyler og overskud af reagenser for at tillade, at den immunogene dosis bliver baseret 10 på mængden af covalent bundet poJysacchand på konjugat- f orm.

Immunogene monovalente eller polyval ente vacciner indeholdende immunologisk effektive mængder af polysaccha-rid/protein-konjugaterne ifølge opfindelsen eller blan-15 dinger af polysacchand/protein-konjugaterne ifølge opfindelsen med andre covalente polysaccharid/protein-konjugater, såsom de, der er beskrevet i U.S.S.N. 608 738, indleveret 10. maj 1984, eller med andre immunologe materialer eller derivater deraf, kan fremstilles.

20 De covalent modificerede polysacchander ifølge opfin delsen kan være modificerede versioner af vilkårlige neutrale (dvs. ikke am om ske/ikke sure) polysacchander, og er ikke tænkt begrænset til nogle særlige typer.

Eksempler på sådanne neutrale bakterielle kapsulære 25 polysacchander er Streptococcus pneumoniae (pneumococ cal) type 14, 7F og 37 polysacchander, beskrevet af L. Kenne og B. Lindberg i The Polysaccharides, bind II, pp. 287 - 363, Academic Press (1983) og A. S. Chaudn et al., Carbohydrate Research, J25,161-172(1972). 1

Proteinerne ifølge opfindelsen er sådanne, der har udvist sikkerhed og påviselig immunogeni s 11et, men er ikke begrænset til nogen særlig type. Egnede proteiner omfatter bakterielle membranproteiner; vilkårlige af forskellige DK 171421 B1 7 planteproteiner, såsom edestin eller sojabønnetrypsin-mhibitor; \/irale proteinunderenheder, såsom hepatitis A eller B, herpes gD eller gC, Epstein-Barr eller varicella zoster underenheder; syntetiske polypeptider; diphthe-5 na toxoid; eller tetanus toxoid, men er foretrukkent

Neisseria meningitidis (meningococcal) B serotype ydre membranproteiner, som er T-cellestimulatorer. Et eksempel på disse serotypeproteiner er blevet beskrevet i Helting et al., "Serotype Determinant Proteins of Neisseria 10 Meningitidis", Actapath. Microbiol. Scand. Sect. C, 89, 69 - 78, 1981, og Frasch et al., J. Bact., 127, 973 - 981 ( 1976 ) .

Konjugaterne ifølge opfindelsen kan være vilkårlige stabile polysaccharid/protein-konjugater, koblet via 15 bigeneriske spacere indeholdende en thioethergruppe og alkylamid, som danner hydrolytisk labile covalente bindinger med det neutrale poJysacchand og proteinet. Foretrukne konjugater ifølge opfindelsen er imidlertid de, som kan repræsenteres ved formlen Ps-A-E-S-B-Pro 20 eller Ps-A'-S-E'-B'-Pro, hvori Ps repræsenterer et lkke- anionisk po1ysaccharid; Pro repræsenterer et immunogent protein; og A-E-S-B og A'-S-E'-B' udgør bigenenske spacere, som indeholder hydrolytisk stabile covalente th ioetherbindinger, og som danner covalente bindinger 25 (såsom hydrolytisk labile ester- eller amidbindinger) med makromolekyl erne, Pro og Ps. I spaceren, A-E-S-B er S svovl, E er transformationsproduktet af en thiophil gruppe, som er blevet omsat med en thiolgruppe, og som

O

li 9 or

. _ . ! / I III

har formlen -C(CH_) N J eller -CCH-, hvor R er H

2 P \ /

V

o WH

, , III

30 eller CH,, og p er 1 - 3; A er -CN(CH-) Y(CH_) -NH-, •/u j i m L n ’ DK 171421 B1 8 hvor W er 0 eller NH, m er 0 - 4, n er 0 - 3, og Y er CH2, 0, S, NR' eller CHCOOH, hvor R' er H eller alkyl med 1 eller 2 carbonatomer, så at hvis Y er CH2, så kan m og n ikke begge være nul, og hvis Y er 0 eller 5 S, så er m større end 1 og n er større end 1; og B er Z 0

l U

-(CH2 )pCH(CH2)^D-, hvor q er 0 - 2, Z er NH2, NHCR', COOH eller H, hvor R' og p er som defineret i det fore- 0 H 0 0 II 1 II tt gående, og D er C, NR', N-C(CH2)2C. I spaceren A’-S-E’-B’,

W

II

er S svovl; A' er -CNH(CH„) R"-, hvor a er 1 - 4, L· 3

HO

IH

10 oq R" er CH_ eller NCCH(CH0) , hvor Y' er NH„ eller y 2 l 2 p 2 Y ' NHCOR', og W, p og R' er som defineret i det foregående, og E' er transformationsproduktet af en thiophil gruppe, som er blevet omsat med en thiolgruppe, og som har formlen

R

-CH-, hvor R er som defineret i det foregående, og B'

O

I) 0 r-"\ o

11 Γ \ , , H

15 er -C-, eller E' er j N- > og B' er -(CH„ ) C- , /\y a o hvori p er 1 til 3. Endvidere er komponenterne E-S-B og A'-S-E' i de bigeneriske spacerc A-E-S-B og A'-S-E '— B’ til at fastlægge og kvantificere ved denne identificering, der afspejler covalensen af den konjugatbm-20 ding, der knytter den side af thioethersvovJ et, som stammer fra det covalent modificerede ikke-aniomske polysaccharid, med siden af spaceren, som stammer fra det funktionaliserede protein. 1 fremgangsmåden ifølge opfindelsen modificeres poly-25 saccharidet covalent ved (a) fragmentering deraf ved DK 171421 B1 9 opvarmning af polysacchandet i vand med eller uden vandig hydrazin, idet vandet fjernes ved lyophilisering og tørring med P2O,- 1 vakuum, hvorpå (b) det aktiveres med et bifunktionelt reagens i et ikke-vandigt, polært, 5 aprotisk opløsningsmiddel, (c) omsætning af dette aktive rede polysacchand med en bis-nucleophil, og endelig, om nødvendigt, yderligere (d) funktionalisenng af dette modificerede polysaccharid ved enten omsætning (i) med et reagens dannende elektrophile (f.eks. thiolphile) 10 steder eller (il) med et reagens dannende thiolgrupper.

Omvendt omsættes proteinet enten (i) med et reagens dannende thiolgrupper eller (n) med et reagens dannende thiolphile steder, hvorpå det covalent modificerede polysacchand og den funktionaliserede protein omsættes 15 til dannelse af et stabilt covalent bundet konjugat, og den endelige blanding renses til fjernelse af uomsatte polysacchander og proteiner.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter også udvælgelse af en nucleophil eller bis-nucleophil, som vil reagere 20 med det aktiverede polysaccharid til dannelse af et covalent modificeret polysacchand med tilsvarende elektrophile steder eller tilsvarende thiolgrupper, hvilket således gør behovet for yderligere funktionalisenng af det bis-nucleophilt modificerede polysacchand mdly-25 sende før omsætning af det covalent modificerede poly sacchand med det covalent modificerede protein. Også funktiona11 seringen af proteinet til hver delform kan udføres i mere end et trin efter udvælgelsen af reaktanter i disse trin.

30 A. Fremstilling af polysacchandet I første tnn mod covalent modificering af polysacchandet må det faste stof, det stort set uopløselige polysacchand, solubiliseres.

DK 171421 B1 10

Da de neutrale polysacchander ifølge opfindelsen er uopløselige i organiske opløsningsmidler eller saltopløsninger og kun marginalt opløselige i vand, og da nucleophile alkoholiske hydroxylgrupper i polysacchandet 5 ikke kemisk kan konkurrere med de elektrophile reagenser med hydroxy lerne i vand i en vandig opløsning, må pol y-saccharidet modificeres til en mere opløselig form, hvorpå det må opløses i ikke-vandige (ikke-hydroxyliske) opløsningsmidler. Egnede opløsningsmidler omfatter 10 dimethy1 formamid, dimethy1 sulfox id , dimethylacetamid, formamid, Ν,Ν'-dimethylimidazolidinon og andre lignende polære, aprotiske opløsningsmidler, foretrukkent dimethy1 -formamid.

I DK 2055/85 blev bakterielle polysacchander med syre-15 grupper solubiliseret i ikke-hydroxyliske organiske opløsningsmidler ved først at overføre dem i en passende saltform. Modsætningsvis udfører ansøgerne solu-bilisenngen af et intakt, ellers stort set uopløseligt neutralt po1ysaccharid ved opvarmning af disse lkke-20 polyanioniske, neutrale polysacchander i 30 sekunder til 10 minutter ved 70 - 100 °C i destilleret vand, som eventuelt kan indeholde 5 - 15% vandig hydrazin, hvorved polysacchariderne fragmenteres, men under bevarelse af de neutrale polysacchanders levedygtighed 25 til immunogen vaccineanvendelse, idet polysacchandet bringes på en anvendelig form.

Efterfølgende trin er rettet mod at overskride de øvrige væsentlige fysisk-kemiske begrænsninger ved fremstilling af covalente bindinger til polysacchander, nemlig manglen 30 på funktionelle grupper i pol ysacchanderne, udover hydroxylgrupper, som er reaktive nok med reagenser, der er almene eller praktisk anvendte til funktionali-senng af enheder, med hvilke der ønskes binding. Det resterende vand (og hydroxylgrupper) fjernes ved lyo- DK 171421 B1 11 philisenng og tørring med 1 vakuum. Derpå er ak tivering af polysaccharidet til dannelse af et aktiveret polysaccharid, omsætning med bis-nucleophiler til dannelse af et nucleophil-funktionaliseret poly sacchand og funktionalisering med reagenser, der danner enten elek-5 trophile steder eller thiolgrupper, a]le rettet mod covalent modificering af polysaccharidet og udvikling af funktionelle grupper i polysaccharidet ved forberedelse til konjuktion.

I det næste trin aktiveres det depolymeriserede polysac-10 charid ved omsætning med et bifunktloneJt reagens ved ca. 0 - 50 °C under omrøring i 10 minutter til 1 time, med det afgørende vægtforhoJ.d mejlem aktiverende middel og polysaccharid i området 1:5 til 1:12. Aktivering med cyanogenbromid er mulig ifølge den foreliggende 15 opfindelse, men dette reagens anvendes ikke med særligt heldt ved aktivering af polysacchander og er ikke fore-trukkent. I stedet foretrækkes bifunk11 one 11e reagenser til aktivering af polysaccharidet, nemlig kulsyrederivater , 0 2 II 3 2 3 20 R -C-R , hvor R og R uafhængigt kan være azolyl, såsom lmidazolyl; halogenider; eller phenyjestere, såsom p-nitrophenyl eller polyhalogenpheny1.

Carbonyldnmidazol, et særligt foretrukkent reagens, vil reagere med hydroxylgrupperne til dannelse af imida-25 zolylurethaner af polysaccharidet, og arylchlorformia- ter, herunder f.eks. nitrophenylchlorformiat, vil give blandede carbonater af polysaccharidet. I hvert tilfælde er det resulterende aktiverede polysaccharid meget tilgængeligt for for nucleophile reagenser, såsom aminer, 30 og transformeres derved til de respektive urethaner.

I det næste trin omsættes det aktiverede polysaccharid med et nucleophilt reagens, såsom en amin, især diaminer, DK 171421 B1 12

Η H

I I

f.eks. HN(CH_) Y(CH„) -NH, hvori m er 0 - 4, n er 0 -L m 2 n 3, og Y er CH2, 0, S, NR’, CHCDOH, hvor R' er H eller alkyl med 1 eller 2 carbonatomer, så at hvis Y er CH2, så kan ikke både m og n være nul, og hvis Y er 0 e 1 -3 Jer S, så er m større end 1, og n er større end 1, i et stort aminoverskud (dvs. f.eks. et 30 - 100 gange molært overskud af amin over for anvendt aktiverende middel). Reaktionen holdes i et isbad i 13 minutter til 1 time og holdes derpå i 15 minutter ti] 1 time 10 ved ca. 17 - 40 °C.

Et aktiveret po1ysaccharid, ville, når det omsættes med en diamin, f.eks. 1,4-butandiamin, resultere i en urethanform af et polysaccharid med tilsvarende aminer, som derpå yderligere kan funktionaliseres ved acylering.

15 Blandede carbonater vil også let reagere med diaminer resulterende i tilsvarende ammgrupper.

Alternativt kan det aktiverede polysaccharid omsættes med en nucleophil, såsom et monohalogenacetamid af en diammoalkan, f.eks. 4-bromacetamidobutylamin (se W.

20 B. Lawson et al., Hoppe Seyler's Z. Physiol Chem., 349, 251 (1968)), til dannelse af et covalent modificeret polysaccharid med tilsvarende elektrophile steder. Eller det aktiverede polysaccharid kan omsættes med en amino-thiol, såsom cysteamm (aminoethanthiol) eller cystein, 25 hvilke eksempler på derivater er velkendte i peptid sy nteseteknikken , til fremstilling af et polysaccharid med tilhørende thiolgrupper. 1 begge tilfælde er ingen yderligere funktionalisering nødvendig før kobling af det covalent modificerede polysaccharid til det mod i -30 ficerede bakterielle bærerprotein. 1 sidste trin ved fremstilling af polysaccharidet kan yderligere funktionalisering, om nødvendigt, af poly-saccharidet finde sted ved enten at omsætte det nucleo- DK 171421 B1 13 phi 1funktiona11 se rede polysaccharid med et reagens til dannelse af elektrophile (dvs. thiophile) steder eller med et reagens til dannelse af thiolgrupper.

Reagenser egnede til anvendelse ved dannelse af elektro- 5 phile steder omfatter f.eks. de til acylering til a-ha- logenacetyl- eller ct-halogenpropiony lderivat, såsom

OR Il I

XCCHX (hvori R er H eller CH^; X er Cl, Br eller I; og X1 er nitrophenoxy, dinitrophenoxy, pentachlorphenoxy, pentafluorphenoxy, halogenid, 0-(N-hydroxysuccinimidy 1) 10 eller azido), især chloreddikesyre eller a-brompropion- syre, idet reaktionen udføres ved et pH på 8 - 11 (holdt i dette område ved tilsætning af base, om nødvendigt) og ved en temperatur på ca. 0 - 35 °C i 10 minutter til 1 time. Et amino-deri vat i seret polysaccharid kan 15 acyleres med aktiverede maleimidoaminosyrer (se 0. Keller et al, Helv. Chim. Acta., 5^8, 531 ( 1975)) til fremstilling

O

II

» Λ af maleimidogrupper -CiCi^JpN U , hvor p er 1 - ti

O

3; med et 2-halogenacetylenngsmiddel, såsom p-nitrophe-ny]bromacet at; ejjer med el α-haIogrnkpt onnarboxy1s\rr-

0O

-CCH2Br (Ber., 6J, 1204, 19 34)) for at. fremstille passende funktionaliserede polysacchander, som er genstand for thiosubstituenng.

Reagenser egnede til anvendelse ved dannelse af thiolgrupper omfatter f.eks. acylenngsmidler, såsom thiolacto-25 ner, f.eks.

DK 171421 B1 14 R4CNH—,-(CH-) ° λ-/ <y "S 4

hvor R er alkyl med 1-4 carbonatomer eller monoeller bicyclisk aryl, såsom C^H^ eller °9 P

NHCOR5 I 5 er 1 - 3; 03SSCH2(CH2)mCH-C0X', hvor m er 0 - 4, R er alkyl med 1-4 carbonatomer eller CzHc, og X’ er

O J

som defineret i det foregående, efterfulgt af behandling S NHCOR5 l med HSCH_CH„0H; eller med C„H.-S-S-CH„(CH„) CHCOX', 2^2 2d 22 m hvor m, R og X' er som defineret umiddelbart i det foregående, efterfulgt af behandling med dithiothreitoJ.

Sådanne reaktioner udføres i en nitrogenatmosfære ved 0 - 33 °C og ved et pH på 8 - 11 (med base tilsat, om nødvendigt, for at holde pH i dette område), i 1 - 24 timer. F.eks. kan et aminoder ivati seret polysaccharid omsættes NHCOCH-

Vo med «Λ/ til fremstilling af et passende funk tions! iseret polysaccharid.

15 Ued disse trin fremstilles covalent modificerede neutrale polysaccharider af formerne Ps-A-Ef- eller

O

!! 0 /\ u /il

Ps-A'-SH-, hvori Ey er - C (C H _ ) n *1 , og A , A' p \/

II

o R, X og p er som defineret i det foregående.

B. fremstilling af proteinet 2 g Separat funktional ise ring af proteinet, der skal kobles DK 171421 B1 15 til polysaccharidet, involverer omsætning af proteinet med et eller flere reagenser til dannelse af en thiolgrup-pe, eller omsætning af proteinet med et eller flere reagenser til dannelse af et eJektrophilt (dvs. thiophilt) 5 center, som vist i U.S.S.N. 608 738.

Til konjugation med et elektrophilt funktionaliseret polysaccharid omsættes proteinet i et eller to trin med et eller flere reagenser til dannelse af thiolgrup-per, såsom med et af de acyleringsmidler, der anvendes 10 til dannelse af thiolgrupper på polysaccharider, som nævnt i det foregående. Thiolerede proteiner kan også fremstilles ved at animere carboxyaktiverede proteiner, som vist i Atassi et al., Biochem et Biophys. Acta, 670, 300, (1981), med aminothioler, til dannelse af 15 det thiolerede protein. En foretrukken udføreIsesform for denne proces involverer direkte acylering af de vedhængende aminogrupper (dvs. lysylgrupper) af proteinet med N-acetylhomocysteinthiolacton ved ca. 0 - 35 °C og pH 8 - 11, i 5 minutter til 2 timer under anvendelse 20 af ækvivalente vægtmængder reagenser.

0 /\ li Når E ' B ' = Jj F , er betingelserne og metoden

V

II

O

for fremstilling af funktionaliseret protein som nævnt i det foregående til fremstilling af polysaccharid-mod-parten ved omsætning med aktiverede ma1eimodosyrer . 1

Ved udførelsen af konjugation med et covalent modifi ceret bakterielt polysaccharid med vedhængende thiolgrupper acyleres proteinet med et reagens, der danner DK 171421 B1 16 et elektrophilt center, såsom acylenngsmidler omfatten- 0 CH, 0

Il I 3 U

de f.eks. Χ0Η2Ε-Χ' og XCH - CX' , hvori X og X' er som

^CO. O

\ ii defineret i det foregående; og il N(CH0) C-X',

V / Z C

hvori X' er som defineret 1 det foregående. Egnede pro-5 teiner med elektrophile centre omfatter f.eks. også de, der fremstilles ved acylering af de vedhængende lysylaminogrupper med et reagens, såsom aktiverede ma 1 e -lmidosyrer, f.eks.

J! X

/\ o / \ V^OC(CH2)nN^i '

H II

O O

eller ved omsætning af det carboxyak11 verede protein 10 med monoha logenacetyl derivater af diaminer. I begge fremstillingsreaktioner er temperaturen 0 - 35 °C 1 5 minutter til 1 time og pH er 8 - 11.

C. Dannelse af konjugatet

Dannelse af konjugatet er derefter blot et spørgsmål 15 om omsætning af vilkårlige af de covalent modificerede polysaccharider med vedhængende elektrophile centre med vilkårlige af proteinerne med vedhængende thiolgrup-per ved pH 7 - 9, 1 passende vægtforhold, 1 en nitrogenatmosfære, 1 6 - 2A timer ved ca. 17 - AO °C til 20 opnåelse af et covalent konjugat. Eksempler på sådanne reaktioner er DK 171421 B1 17 OH O NHCOCH-.

f| I il i -3

Ps-CNCH2CH2CH2CH2NHCCH2Br + HSCH2CH2CHCO-Pro _v OH O NHCOCH- li I il I 3

PsCNCH2CH2CH2CH2NHCCH2SCH2CH2CHCOPro,

hvori et aktiveret polysaccharid, som er bJevet omsat med 4-bromacetamidobutylamin, omsættes med et protein, som er blevet omsat med N-acetylhomocysteinthi o 1acton, til dannelse af et konjugat, og O

il OH HO /\ o q C i i N / I li l«

PsCNY"-NCCH^N i + HSCH„CH„NHCCH„CH„CPr O

Z \ / z z z z -^

V

H

o o li o o o o !i li / I ii il

PsCNHY"NHCCH„-N 1 CH0CH0NHCCH0CH0CPrO 2 \ /\ / 2 2 2 2

y V

o 5 hvor V” er en alkylgruppe med 2-8 carbonatomer, hvori et aminodenvatiseret polysaccharid, som er blevet omsat med aktiverede majeimidosyrer, omsættes med et carboxy-aktiveret protein, som er blevet amineret med en amino-thiol, til dannelse af et konjugat.

10 Tilsvarende kan vilkårlige af de covalent modificerede polysacchander med vedhængende thiolgrupper omsættes med vilkårlige af de proteiner, der har vedhængende elektrophile centre, til opnåelse af et covalent konjugat. Et. eksempel på en sådan reaktion er:

O O Ο H

l\ il !l I

PSCNHCH2CH2SH + ProCCH2CH2C-N(CH2)4NHCOCH2Br _.

OH OH O O

li I li . II il

PsCNCH2CH2SCH2CN(CH2)4NHCCH2CH2CPro, DK 171421 B1 18 hvori et aktiveret polysacchand, som er blevet omsat med en aminothio), omsættes med et carboxyaktiveret protein, som er blevet omsat med monoha1ogenacetyIderi vater af en diamin, til dannelse af en konjugat.

5 Disse konjugater centrifugeres derpå ved ca. 100 000 gange G under anvendelse af en rotor med fast vinkel i ca. 2 timer ved ca. 1-20 °C, eller underkastes vilkårlige af en række andre rensningsprocedurer, herunder gelpermeering, lodeksk1 usionschromatografi, gradient-10 centrifugering eller anden differentierende adsorptions- chromatografi, til fjernelse af ikke-covalent konjugerede polysacchander og proteiner, under anvendelse af covalensprøven for den bigeneriske spacer (se det følgende) som metode for at følge den ønskede biologiske 15 aktivitet.

D. Analyse for at bekræfte covalens

Analyse af konjugatet til at bekræfte covalensen og dermed konjugatets stabilitet udføres af ansøgerne ved at hydrolysere (foretrukkent med 6 N HC1 ved 110 °C 20 i 20 timer) konjugatet, dernæst kvantitativt analysere for aminosyren fra den hydro)ytisk stabile spacer indeholdende thioetherbindingen og aminosyrebestanddele fra proteinet. Aminosyrernes bidrag til proteinet kan fjernes, om nødvendigt, ved sammenligning med den passen-25 de aminosyrestandard for det involverede protein, med den tilbageblevne aminosyreværdi afspejlende covalensen for konjugatet, eller aminosyren i spaceren kan konstrueres til at forekomme uden for aminosyrestandarden for proteinet i analysen. Covalensprøven er også 30 nyttig til at vise rensningsprocedurer for at markere forbedringen af koncentration af biologisk aktive komponenter. I ovennævnte eksempler resulterer hydrolyse af DK 171421 B1 19 i frigørelse af S-carboxymethylhomocystein, NH9 I 2 HC^CCf^SCK^Ch^CHCC^H; hydrolyse af

O

I! o o /\ o o

1/ II / I II II

PsCNHY"NHCCH^N ' CH0CH0NHCCH0CH0CPro 2 \A / 2 2 2 2

II

o resulterer i frigørelse af aminodicarboxylsyren

H0_C

2I

HC^CCh^CHSCH^CI^Nt^; og hydrolyse af OH OH 0 0 in nr π 11 5 PSCNCH2CH2SCH2CN(CH2)^NHCCH2CH2CPro resulterer i frigørel se af S-carboxymethylcysteamin, H2NCH2CH2SCH2CO2H ved spaltning af Ps-A-E-S-B-Pro-molekylet ved peptidbindingerne eller andre hydrolytisk-ustabile bindinger. Chro-matografiske metoder, såsom metoderne af Spackman, Moore 10 og Stein, kan hensigtsmæssigt anvendes, og forholdet mellem aminosyrebestanddele bestemmes.

E . Anvendelser

Et eller flere af konjugaterne ifølge opfindelsen kan anvendes i pattedyrarter til enten aktiv eller passiv 15 beskyttelse, prophylaktisk eller terapeutisk, mod bacte remia forårsaget af den tilsvarende organisme. I foretrukne udførelsesformer for opfindelsen kan konjugaterne anvendes i mono- eller polyvalente vacciner, enten alene, med andre konjugater indeholdende andre neutrale poly-20 saccharider, såsom Streptococcus pneumoniae 7Γ, 14 og

37, med andre konjugater indeholdende polyanioniske polysacchari der, såsom Haemophilus influenzae type b eller Streptococcus pneumoniae type 6B, 19Γ eller 23F

DK 171421 B1 20 organismer, eller med ukonjugerede polysaccharider, såsom Streptococcus pneumoniae type 3 polysaccharid.

Aktiv beskyttelse kan udføres ved at injicere en effektiv mængde (en mængde i stand til at give målelige mængder 3 antistoffer, f.eks. 2-30 ^ug) polysaccharid på konju- gatform af hvert af konjugaterne, der administreres pr. dosis, eller af ukonjugerede polysaccharider, der administreres pr. dosis, hel antiserum opnået fra dyr tidligere doseret med konjugatet eller konjugaterne, 10 eller globulin eller andre antistofhol dige fraktioner af nævnte antisera, med eller uden en farmaceutisk acceptabel bærer, såsom aseptisk saltvandsopløsmng. Sådan globulin opnås fra hel antiserum ved chromatografi, salt- eller a 1koho1frak11 onering eller e1ektroforese.

13 Passiv beskyttelse kan opnås ved standardiserede monoklo- nale antistofprocedurer eller ved immunisering af egnede pattedyrsværter. Anvendelsen af et adjuvans (f.eks. alun) betragtes også som værende inden for opfindelsens ramme.

20 I en foretrukken udføre 1 se sform for opfindelsen anven des monovalente eller polyvalente præparater omfattende blandt andet konjugaterne ifølge opfindelsen, til aktiv immunogen vaccination af mennesker, specielt neonater og småbørn. Til yderligere stabilitet kan disse konju-25 gater også 1yophiliseres i nærværelse af lactose (f.eks.

ved 50 ^ug/ml pneumococ polysaccharid/10 mg/ml lactose) før anvendelse .

En foretrukken dosis er en mængde af hver af konjugaterne eller derivat deraf administreret svarende til 25 y.ug 30 polysaccharid på konjugatform for konjugater af pneumo coc polysaccharider, 25 ^ u g ukonjugerede polysaccharider og doser af konjugater eller derivater deraf af konjugater indeholdende polyamoniske polysaccharider ifølge DK 171421 B1 21 U.S.S.N. 608 738, i en enkelt administrering. Om nødvendigt kan der også administreres yderligere en eller to doser konjugat eller derivat deraf af H. influenzae type b polysaccharid 1 en mængde svarende til 10 ^,ug 3 af polysaccharidet på konjugatform.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling af streptococ pneumoniae type 14 kapsulært 10 polysaccharid_

Inoculum og podestofudviklmg

Trin A: Udarbejdninq af podepræparat

Et lyophiliseret rør med Streptococcus pneumonia type 14 bakterier inoculum podemedium (modtaget fra Dr. Robert 13 Austrian, University of Pennsylvania) blev suspenderet i 1 ml steril oksehjerteinfusionsbou111 on (25 g hjerte-mfusionbouillon (Difco) i 0,9 liter vand), og denne suspension blev spredt på 5 kaninblodsagarplader (20 g renset agar, 25 g hjerteinfus ionsbou111 on, 100 ml 20 defibrineret kaninblod, 0,9 liter destilleret vand) med ca. 0,2 ml kultur på hver. Efter ca. 18 timers mku-bering ved 37 °C blev væksten på pladerne gensuspenderet på hver kaninblodagarplade (med 5 ml oksehjerteinfusionsbouillon hver) og samlet. 1/2 ml af denne gensus-25 penderede vækst blev anvendt til at inoculere hver af 6 kolber med væskeformigt blodmedium (90 ml oksehjerte-lnfusionboui11 on og 10 ml defibrineret kaninblod), som derpå blev inkuberet uden omrøring ved 37 °C i ca. 18 timer.

DK 171421 B1 22

Trin B: 2-Liters Erlenmeyer-kolber uden ledeplader

To af kolberne med Streptococcus pneumoniae type 14 baktenepodemedium fra trin A blev kombineret, og 20 ml af dette podemedium blev inoculeret i hver af fem 5 2-liters Erlenmeyer-kolber uden ledeplader indeholdende 900 ml strilt pneumococcus inoculum medium (se det følgende) og 100 ml 2 5 ?ό ' s dextroseopløsning. pH af kolberne blev holdt ved pH 6,0 - 7,0 ved tilsætning af 12 ?ό' s natriumbicarbonat op løsn ing, og efter 7 timers inkubering 10 ved 37 °C (på hvilket tidspunkt der typisk var en 0 D , , n værdi på 2,90) blev væksten fra fire af kolberne samlet (den samlede portion havde en OD^g på 2,80 og et pH på 6,8).

Pneumococcus inoculum mediumy 15 Sojapepton 20 g Gærekstraktultrafiltrat (1) 100 ml

NaCl-reagens 5 g Κ2ΗΡ0ή 2,5 g 2% phenolrødt 0,5 ml 20 Destilleret vand 1 liter γ Opløsningen blev steriliseret ved autoklavering ved 121 °C i 25 minutter.

Saltene og sojapeptonen blev opløst i små volumen varmt, pyrogenfnt vand og bragt til korrekt slutvolumen ved 25 tilsætning af varmt, pyrogenfnt vand. Fermentorerne eller kolberne blev derpå steriliseret i ca. 25 minutter ved 121 °C, og efter afkøling blev gærekstraktultraflltra-tet (1) sat aseptisk til kolberne eller fermentorerne før inoculering. 1 (1) Gærekstraktultrafiltrat: 100 g bryggerigærekstrakt DK 171421 B1 23 (Amber) blev opløst i 1 liter destilleret vand og u1trafi1treret i en Amicon DC-30 hulfiber med H10X50-patroner til fjernelse af molekyler med molekylvægt 30000. Filtratet blev samlet og passeret gennem 3 en 0,22 ^,u membran som et sterilt produkt.

Trin C : 70-Liters podefermentor

Det samlede produkt fra trin B blev anvendt til at mocu-lere en 70-liters fermentor indeholdende Pneumococcus podemediet (fremstillet som beskrevet i det følgende) 10 med et udgangs-pH på 6,8.

fermenteringen blev opretholdt ved 37 °C med en omrøring på 100 omdr./min. og kontrolleret ved optisk densitet (O.D.), glucosetest og pH-bestemmelser, indtil der var nået en O.D. på 3,25 (efter ca. 4 timers forløb).

15 Komplet pneumococcus podemedium

Sojapepton 800 g Gærekstrakultrafiltrat (1) 4 liter K^HPO^-reagens 100 g

NaCl-reagens 200 g 20 25?0dextroseopløsning(2) 4 liter "Ucon B625 Antifoam" 14 ml

Destilleret vand 31,8 liter (2) Dextrose blev fremstillet som en 25¾1s opløsning i glasdestilleret vand og sat til den 70-liters 25 fermentator med gærekstrakultrafi 11rat et.

Trin D: 800-Liters produktionsfermentator

Ca. 40 liter af produktet fra trin C blev anvendt til at inoculere en 800-liters fermentor indeholdende DK 171421 B1 24 530 liter Pneumococcus produktionsmedium (fremstillet som beskrevet i det følgende).

Fermenteringen blev opretholdt ved 37 °C med en omrøring på 100 omdr./min, med O.D., glucose og pH kontrolleret 5 for ca. hver 2 timers forløb, indtil O.D. var af samme størrelsesorden i en 2-timers periode, på hvilket tidspunkt fermenteringen blev afsluttet (en typisk endelig O.D.-værdi var 5,2 efter 6 timers forløb).

Pneumococcus produktionsmedium 10 Sojapepton 10,5 kg Gærekstraktultrafiltrat (1) 52,5 liter t^HPO^-reagens 1,313 kg

NaCl-reagens 2,625 kg 25% dextroseopløsning (2) 58 liter 15 Ucon B625 Antifoam 95 ml

Destilleret vand 418,5 liter Høst og inaktivering

Portionen blev inaktiveret ved høstning i en dræber-tank indeholdende 8,2 liter væskeformigt phenol.

20 34 og 58?0's ethanoludfældning

Til 640 liter af den dræbte kultur blev der sat 213,3 liter 95Vs ethanol med en hastighed på 3,6 liter/min. under omrøring ved 20 - 26 °C efterfulgt af 117 liter 95?0's ethanol ved en hastighed på 2 liter/min., til 25 et totalt slutvolumen på 950 liter og en endelig koncen tration på 35 volumen-% ethanol. Blandingen blev omrørt yderligere 4 timer ved 22 °C for at sikre fuldstændig fraktionering, og den overliggende væske blev samlet via en bank med fem 4-inch "Sharples"-centrifuger ved DK 171421 B1 25 15000 omdr./min. (strømningshastighed på ca. 4 liter/min.).

Den uopløselige pellet blev bortkastet, og den rensede væske blev bragt til 58%'s ethanol ved tilsætning af 559 liter yderligere 95%'s ethano] ved en hastighed 5 på 7,6 liter/min. Blandingen blev omrørt ved 21 °C i endnu 5 timer for at sikre fuldstændig udfæJdning.

Udvinding af den anden pellet

Det resulterende 34%'s ethanolopløselige 58%'s ethano 1-uopløse lige bundfald blev samlet ved centrifugering 10 i 4-inch Sharples-centrifugen ved 15000 omdr./min. (strøm ningshastighed på ca. 4 liter/min. ), og den 58%'s ethanol-overliggende væske blev bortkastet. Det rå produktudbytte var 2,435 kg våd pasta.

24%'s isopropanoludfældninq 15 De 2,435 kg 58%'s ethanoluopløselige materiale blev kombineret med 1,626 kg materiale produceret fra en anden fermentering på lignende måde, og det resulterende 4,061 kg materiale blev blandet i en Daymax-dispersions-beholder ved 15 - 29 °C med 30 liter giasdest11le ret 20 vand i 12 minutter, indtil suspensionen var homogen.

Ca. 66 yderligere liter destilleret vand blev sat til suspensionen, og denne blanding blev omrørt i 4 timer.

24 Liter 5%'s natriumacetatopløsning blev sat til blandingen, og pH blev indstillet til 6,5 ved tilsætning 25 af iseddikesyre.

De 120 liter opløsning blev bragt til 24%'s lsopropanol-koncentration ved tilsætning af 37,9 liter lsopropanol ved 0,3 liter/min. efter omrøring ved 15 - 29 °C. Efter yderligere omrøring i 4 timer blev blandingen centri-30 fugeret gennem en 4-inch Sharples-centnfuge ved 15000 omdr./min. (strømningshastighed = 0,35 liter/min.) DK 171421 B1 26 i 5,75 timer, og gennem en Electronucleonics K3-ultra-centrifuge (28000 omdr./min.) ved 200 - 400 ml/min., indtil effluentet syntes klart, og den uopløselige pellet blev bortkastet.

5 39%'s isopropanoludfældning og samling af rå produkt- pasta_

Den 24%'s isopropanolopløselige overliggende væske fra det foregående trin blev bragt til 33%'s isopropanol ved tilsætning af 38,8 liter isopropanol med en hastighed 10 på 0,3 Jiter/min. under omrøring. Blandingen (194 liter) fik derpå lov at henstå under omrøring i 3,25 timer, hvorpå der blev centrifugeret i ca. 18 timer i en 4-inch Shaples-enhed ved 15000 omdr./min. (strømningshastighed = 0,5 liter/min.) for at samle det pelletterede rå poly-15 saccharid (2,006 kg).

Diafiltrenng

Pellet fra centrifugeringen blev overført til Daymax-blandere indeholdende 20 liter destilleret vand og blandet i 30 minutter, indtil suspensionen var homogen.

20 Denne suspension blev derpå fortyndet med 300 liter koldt, glasdesti1 leret vand og diafiltreret til en konstant ledningsevne ved ca. 23 °C på et Romicon-ultra-flltreringsapparat under anvendelse af HF 26,5-45-XM50-patroner. Retentatet blev koncentreret til et minimum-2 5 volumen, Romicon-enheden blev skyllet, og sky Ile væsken blev sat til retentatet, så at det endelige volumen var 86 liter. Ultrafiltratet blev bortkastet.

Cetavlonudfældmng 1,84 kg cetavlon (N,N,N-trimethyl-l-hexadecanaminium-30 bromid) blev opløst i 6 liter destilleret vand, og denne DK 171421 B1 27 opløsning blev under omrøring i løbet af ca. 1 time sat til de 86 liter retentat fra det foregående trin.

Efter henstand i ca. 4 timer blev de udfældede urenheder (1,925 kg) samlet ved centrifugering i K3-ultracentri-5 fugen (28000 omdr./min.) ved 5 °C i 8 timer, og den overliggende væske blev samlet.

Isopropanolfraktionering 28.55 kg natriumacetat-trihydrat blev i løbet af 10 minutter sat til de 86 liter overliggende væske fra 10 det foregående under omrøring, og pH for opløsningen blev indstillet til 6,6 med iseddikesyre. Opløsningen blev bragt til 28%'s isopropanol med 45,1 liter isopropanol ved 0,38 liter/min. under omrøring, og efter yderligere 4 timers omrøring ført ind i K3-ultracent ri fugen 15 (28000 omdr./min.), hvorfra 12 g bundfald blev samlet og bortkastet. 38,9 Liter isopropanol (slutkoncentra-tion = 4 2%) blev tilsat med en hastighed på 0,3 liter/min. til de 116 liter overliggende væske, under omrøring, og efter yderligere 4 timers omrøring blev opløsningen 20 cirkuleret til to 4-inch Sharples-centrifuger ved 15 - 29 °C med 15000 omdr./min. (1,3 liter/min. strømningshastighed i hver), og effluentet blev bortkastet.

Triturerinq og opsamling af slutprodukt

Den resulterende polysaccharidpellet blev tritureret 25 i en 1-gallon Waring-blender under anvendelse af metoden med 30 sekunder tilsluttet og 30 sekunder slukket med 3 liter absolut ethanol, indtil pastaen blev et hårdt hvidt pulver. Dette pulver blev samlet på en Buchner-tragt udstyret med en teflonfilterskive og vasket in 30 situ med fire 1-liters portioner absolut ethanol og med to 2-liters portioner acetone. Produktet blev fjernet fra tragten og overført til tarerede skåle til tørring DK 171421 B1 28 i vakuum ved 20 - 25 °C (i ca. 18 timer). Det endelige udbytte af produktet var 315,2 g tørvægt, og dets egenskaber var som følger: TABEL 1-1 5 Pneumococ type 14 polysaccharid

Kemiske prøvedata

Prøve Resultat

Fugt (1G) 6,3 %

Protein 4,8¾ 10 Nucleinsyre 0,6¾

Hexosamin 28,6¾

Nitrogen 1,6¾

Phosphor 0,2¾

Molekylstørrelse 0,19-0,21 15 (KD på Sepharose® 4B) Følgende procedurer blev anvendt ved udførelse af ovennævnte prøver.

1. Fugt - Standardtermogravimetri (vægttab til 100 °C) under anvendelse af en Perkin-Elmer termobalance 20 TSG-1.

2. Protein - Lovry-metoden; Lou/ry et al., J. Biol. Chem., 193: 265 (1951).

3. Nucleinsyre - U. V. metoden; Warburg og Christian,

Biochem Z., 310: 384 (1942).

25 4. Hexosamin - Elson og Morgan, Biochem. J., 7J_: 1824 (1933).

5. Nitrogen - Forbrændingsmetoden under anvendelse af DK 171421 Bl 29

Perkm-Elmer 240-CHN e 1 ementar ana 1yseapparat.

6. Phosphor - Molybdatmetoden; Chen et al., Anal. Chem.

28: 1756 (1956).

EKSEMPEL 2 5 Fremstilling af Neisseria meningitidis Bil serotype 2 membranprotein_ A. F ermentering 1. Neisseria meningitidis gruppe Bil

Et rør indeholdende den Jyophiliserede kultur af Neisse-10 ria meningitidis (opnået fra Dr. M. Artenstein, Walter

Reed Army Institute of Research (WRAIR), Washington, D.C.) blev åbnet, og Eugonbroth (BBL) blev tilsat. Kulturen blev udstreget på choko1adeagarp1ader (BBL) og inkuberet ved 37 °C med 5 ?ό1 s CO^ i 36 timer, efter hvil-15 ket tidsrum væksten blev høstet i 10¾ ’ s skummetmælks- medium (Difco), delt i lige store dele og frosset ved -70 °C. Organismen blev positivt identificeret ved agglutinering med specifikt antiserum leveret af WRAIR og typeserum leveret af Difco.

20 Denne første passageskultur blev udstreget på chokola- deagarplader og inkuberet ved 37 °C med 5 % CO2 1 18 timer, efter hvilket tidsrum væksten blev høstet 1 10%'s skummetmælksmedium, delt 1 lige store mængder på 1 ml og frosset ved -70 °C. Organismen blev igen positivt 25 identificeret ved agglutinering med specifikt antise rum leveret af WRAIR og typeserum leveret af Difco.

Et glas af kulturen fra den anden passage blev optøet og udstreget på 10 Columbia fårebiodagarplader (CBAB-BBL).

30 DK 171421 B1

Pladerne blev inkuberet ved 37 °C med 5% CO^ i 18 timer, hvorefter væksten blev høstet i 100 ml 10?ό' s skummetmælksmedium, delt i mængder på 0,3 ml og frosset ved -70 °C. Organismen blev positivt identificeret ved aggJu-3 tinering med specifikt antiserum, sukkerfermentering og gramfarvning .

Et glas af kulturen fra denne passage blev optøet, fortyndet med Mueller-Hinton bouillon og udstreget på 40 Mue11er-Hinton agarplader. Pladerne blev inkuberet ved 10 37 °C med 6?ό CO2 i 18 timer, hvorefter væksten blev høstet 1 17 ml 10Vs skumme t mæl k sme d 1 um , delt 1 0,3 ml portioner og frosset ved -70 °C. Organismen blev positivt identificeret ved gramfarvning, agglutinering med specifikt antiserum og oxidase testen.

15 2 . Fermentering og opsamling af cellepasta a. Inoculumudvikling

Inoculum blev dyrket fra to 0,5 ml frosne glas med Neisseria meningitidis gruppe B, B-ll fra det foregående (passage 4). Fire Mueller-Hinton agar Blake-beholdere 20 blev inoculeret, høstet ca. 18 timer senere og anvendt som inoculum for 5 liter Gotschlich's gærdialysatmedium ved pH 7,29. O.D. blev indstillet til 0,065 ved 660 nm (Perkin-Elmer). Organismen blev dyrket 1 5 to-liters Erlenmeyer-kolber (hvert indeholdende 1 liter medium, 25 se det følgende) ved 37 °C 1 en ryster. O.D. blev vist ved intervaller på 45, 75 og 120 minutter. Der dannedes ca. 4 liter bouillonkultur ved en OD^^ på 0,81 (Spec-tronic 20).

En 3 ml prøve blev udtaget til gramfarvning, lsolationsud-30 stregninger på CBAB, Mueller, Hinton og gærekstrakdextro- seplader og agglutineringskontrol. Alle reaktioner var DK 171421 B1 31 tilfredsstillende, b . 70-Liters podeferment or

Ca 3600 ml podekultur blev anvendt til at inoculere 5 en steril 70-liters fermentor indeholdende 42,6 liter komplet produktt ionsmedium (se i det følgende).

Betingelserne for den 70-liters fermentering var 37 °C, 185 omdr./min. med 10 liter luft/min. igennem og konstant pH-kontrol ved pH 7,0 i 5,5 timer.

10 Kulturen blev spredt på Mueller-Hinton-agarplader, gærekstraktdextrose og kaninb1odsagarp]ader (Merck) ved 37 °C og afprøvet for agglutinering for N. meningitidis gruppe B ant iserum, Væksten på MuelJer-Hinton-agarplader, gærekstraktdextroseplader og kaninblods-15 agarplader var normal, og agglutineringsreaktionen var positiv, for denne portion blev den endelige O.D.-værdi 0,840 ved 660 micron efter 5,5 timers forløb.

c . 800-Liters produk11 onsfermentor

Ca, 46,2 liter podekultur blev anvendt til at inoculere 20 en steril 800 liters fermentor indeholdende 568,2 liter komplet produktionsmedium (se i det følgende). Portionen blev inkuberet ved 37 °C, 100 omdr./min. med 60 liter/min. lufttilførsel og konstant pH-kontrol ved pH 7,0.

Før portionen blev inaktiveret blev kulturen spredt 25 på Mueller-Ηίnton-agarplader, gærekstraktdextrosepla der og kaninblodagarplader ved 37 °C og afprøvet for agglutinering med N. meningitidis gruppe B antiserum.

Væksten på Mueller-Hinton-agarplader, gæragardextrose og kaninblodsagarplader var normal, og agglutinerings- DK 171421 B1 32 reaktionen var positiv. For denne portion var den endeJige O.D. 2,24 13 timer efter inocuJering.

3. Komplet medium for nephe1 orneter-ko 1 ber og 70- og 800-liters fermentorer_

5 Fraktion A

L-glutaminsyre 1,5 g/liter

NaCl 6,0 g/liter

Na2HP0^, vandfrit 2,5 g/liter NH4C1 1,25 g/liter 10 KC1 0,09 g/liter L-cystem-HCJ 0,02 g/liter

Fraktion B (Gotschlich's gærdialysat) 1280 g Difeo-gærekstrakt blev opløst i 6,4 liter destilleret vand. Opløsningen blev dialyseret i en 2 Amicon 15 DC-30 hulfiberdialyseenhed med tre HlOSM-patroner. Dia- 1 > s a t e t og 384 g MgSO^.T^O og 3200 g dextrose blev opløst i dialysatet, og det totale volumen blev bragt op på 15 liter med destilleret vand. pH blev indstillet til 7,4 med NaOH og steriliseret ved filtrering gennem 20 Millipore (0,22 ju) og sat til fermentoren indeholden de fraktion A.

For neph1eorneterko 1berne: 1 liter fraktion A og 25 ml fraktion B blev tilsat, og pH blev indstillet til 7,0 til 7,2 med NaOH.

25 For 70-liters fermentoren: 41,8 liter fraktion A og 900 ml fraktion B blev tilsat, og pH blev indstillet til 7,0 - 7,2 med NaOH.

For 800-liters fermentoren: 553 liter fraktion A og DK 171421 B1 33 15,0 liter fraktion B bleu tilsat, og pH bleu indstillet til 7,0 - 7,2 med NaOH.

d. Høst og inaktiuerinq

Efter fuldendt fermentering bleu der til en separat 5 beholder sat phenol (0,5 uol.-%'s slutkoncentration), huortil cellebouillonen derpå bleu ouerført. Materialet bleu holdt ued stuetemperatur med forsigtig omrøring, indtil kulturen ikke længere uar leuedygtig (ca. 24 timer).

10 e. Centri fuqerinq

Efter 24 timers forløb ued 4 °C bleu 614,4 liter inak-tiueret kulturuæske centrifugeret gennem Sharples-centri-fuger. Vægten af cellepastaen efter phenoltilsætning uar 3,875 kg.

15 B. Isolation

Trin 1; Vask af bakterieceller

For huer isolering bleu en aliquot på 200 g af ouennæunte 0,2% phenol-inaktiuerede pasta suspenderet i en 800 ml portion sterilt destilleret uand og omrørt magnetisk 20 til granulære suspensioner. De suspenderede celler bleu pelleteret ued 20000 x g i 60 minutter ued 5 °C (Beckman 19 Ti rotor, 14500 omdr./min.).

Trin 2: Ekstraktion

De uaskede celler bleu suspenderet i 2000 ml 0,1 M Tris/ 25 0,01 M EDTA-puffer pH 8,5 med 0,5% natriumdeoxycholat (TED-puffer) med en Soruall 2 quart omnimixer ued indstilling 3 i 60 sekunder.

DK 171421 B1 34

Den homogene suspension blev overført tiJ 16 500 ml Erlenmeyer-kolber tiJ ekstraktion ved 56 °C i et ryste-vandbad i 15 minutter (ved temperaturen).

Ekstrakten blev centrifugeret ved 20000 x g i 60 minutter 5 ved 5 °C (Beckman 19 Ti rotor, 14500 omdr./min.). De viskøse overliggende væsker blev derpå dekanteret (totalvolumen = 1980 ml) og opbevaret ved 4 °C.

De ekstraherede ceJlepeJlet blev gensuspenderet i 2000 ml TED-puffer som beskrevet umiddelbart i det foregående.

10 Suspensionen blev ekstraheret i 15 minutter ved 56 °C

og centrifugeret som i det foregående. De overliggende væsker blev dekanteret (volumen = 2100 ml) og opbevaret ved 4 °C.

Trin 3 : Koncentration ved u11raf111rering 15 Ekstraktlonssupernatanterne fra trin 2 blev samlet (to talvolumen = 4005 ml). 2 Liter af den samlede mængde blev sat til en 2 liter New Brunswick-fermentenngsbe-holder tilknyttet et Millipore Pellicon-flltrenngsap- parat udstyret med to 0,45 micron Durapore-membraner 2 20 (overfladeareal 1/2 ft. ). Ekstraktsupernatanten blev holdt ved 25 °C i fermenteringsbeholderen under den 90 minutters koncentrationsproces. Prøven blev koncentreret 10 gange ved et gennemsnitstransmembrantryk på 27,5 psi.

25 Trin 4: Opsamling og vask af serotypeproteinet

Retentatet fra trin 3 (205 ml) blev centrifugeret til en pellet af serotypeproteinet ved 160000 x g i 2 timer ved 5 °C (Beckman 45 Ti rotor, 37000 omdr./min.). Super-natanterne blev dekanteret og bortkastet.

DK 171421 B1 35

Proteinpellets blev vejet (8,12 g) og derpå suspenderet i TED-puffer (190 ml puffer, 20 ml/g pellet) manuelt med en glasstang og en Dounce-homogenlsator. Suspensionen blev ekstraheret ved 56 °C i 15 minutter (ved temperatu-5 ren) i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe under omrystning.

Suspensionen blev centrifugeret ved 160000 x g i 2 timer ved 5 °C (Beckman 45 Ti rotor, 37000 omdr./min.). Den overliggende væske blev dekanteret og bortkastet (volumen = 190 ml). Pellets blev vasket den anden gang i 10 190 ml TED-puffer som i det foregående.

T rin 5: Udvinding af produkt

De vaskede proteinpellet fra trin 4 blev suspenderet i 100 ml destilleret vand med en glasstang og en Dounce-homogenisator for at sikre fuldstændig suspension. En 15 Lowry-proteinværdi på 17,0 mg/ml blev opnået fra denne suspension. På dette tidspunkt blev 200 mg af suspensionen reserveret til eksperimentel anvendelse. Den resterende massesuspension (91 ml) blev fortyndet til 8,0 mg/ml med 102,4 ml glasdestilleret vand. Den vandige 20 suspension blev centrifuge ret ved 12000 x g i 15 minutter til klaring deraf fra aggregater (Beckman 45 Ti rotor, 10000 omdr./min.).

Supernatantproduktet blev fjernet omhyggeligt med pipette for at undgå den bløde aggregatpellet. Produktet blev 25 mærket (volumen = 182,5 ml), og aliquoter blev afprøvet for sterilitet og pyrogen (sterilt produkt; ingen pyrogener). Produktet blev opbevaret ved 4 °C som en steril masse indtil anvendelse ved konjugation, på hvilket tidsrum det blev analytisk karakteriseret. Udbytte var 30 9,5 mg Lowry-protein/g oprindelig cellepasta.

DK 171421 B1 36 TABEL 2-1

Meningococ B serotype 2 proteinopløsning Kemiske prøvedata

Prøve Resultat 3 Protein

Lowry 4,1 mg/ml

Nucleinsyre* RNA (Bial) 1,88 D N A (diphenylamin) 0,6¾ 10 Neutrale sukkerarter*

Anthron 1,05

Sialsyre* 3,0¾

Molekylvægt SDS-PAGE 40000d 13 *Beregnet som λ af Lowry-protein.

Følgende procedurer blev anvendt ved udøvelse af prøverne: 1. Protein - som i eksempel 1.

2. Nucleinsyre - farveudvikling blev observeret med orcinolreaktionen (Bial), som svarer til 1,8¾ RNA

20 beregnet som en procentdel af proteinkoncentrationen.

Diphenylamintesten for DNA indikerede et DNA-henhold på 0,6¾ beregnet som en procentdel af proteinet i masseopløsningen.

3. Neutrale sukkerarter - indholdet af neutralt sukker 25 beregnet som en procentdel af protein blev fundet under anvendelse af den anthron-kolorimetriske test.

(Scott and Melvin, Anal. Chem. 2b_, 1656, 1953 ).

4. Sialsyre - sialsyreindholdet blev fundet under an- DK 171421 B1 37 vendelse af resorcinol-HCl-metode (Svennerholm, Biochem. Biophys., Acta 2Λ, 604, 1937).

5. Molekylvægt - molekylvægten for det mercaptoethanolde-naturerede protein som bestemt ved SDS-polyacrylamid-3 gelelektroforese (Nature 227:680 (1970), LKB Applica tion Note 306).

EKSEMPEL 3

Fremstilling af S. pneumoniae type 14 polysaccharid-N. -meningitidis B serotype ydre membranproteinkonjugat 10 under anvendelse af centrifugering i kon.juqationstrinnet I. Fragmentering af pneumococ type 14 polysaccharid med vandig hydrazin_

En 100 ml rundbundet kolbe blev forsynet med 24 ml h^O og 1,92 ml 97Vs hydrazin og derpå behandlet i et bad 15 med kogende vand, indtil temperaturen var 100 °C (ca.

3 minutter). Dertil blev der på én gang sat 240 mg S. pneumoniae type 14 polysaccharid (Pn 14), og den resulterende opløsning blev hurtigt omrørt i 1,0 minut. Kolben blev derpå afkølet hurtigt i et isbad, og dens indhold 20 blev dialyseret i Spectropor 2 rør (molvægtsafskæring 12000 - 14000) mod 32 liter l-^O i 5 timer. Derpå blev dialysen gentaget med endnu 32 liter h^O i 16 timer. Dialysatet blev overført til et 50 ml centrifugerør og centrifugeret i en klinisk centrifuge til fjernelse 25 af et slam. Supernatanten blev lyophiliseret, hvilket gav 163 mg fragmenteret Pn 14.

II. Dannelse af butandiaminderivatet af depolymeriseret

Pn 14__ 1 mg fragmenteret Pn 14 blev anbragt i en tør 50 ml DK 171421 B1 38 rundbundet kolbe og dækket med 9 ml dimethy1 sulfoxid (DMSO) og lukket under Blandingen blev omrørt i 5,0 minutter ved 54 °C og derpå 5 minutter ved stuetemperatur. Næsten alt fragmenteret Pn 14 var i opløsning 5 på dette tidspunkt. 36 ml carbonyldiimidazol blev derpå tilsat, og opløsningen blev omrørt i 40 minutter. I løbet af denne tid blev der fremstillet en 1,4-butandi-amin-dihydrochloridopløsning (300 mg/6 ml t^O; pH indstillet til 9,45 med 2,5 N NaOH) og afkølet i isbad. Efter 10 de 40 minutters omrøring blev DMSO-opløsningen sat til den afkølede butandiaminopløsning og omrørt ved stuetemperatur i 4,5 timer. Den blev derpå dialyseret med 30 liter H2O i 17,25 timer og derpå endnu 4 liter H2O i 4 timer. Det resulterende dialysat blev frysetørret, 15 hvilket gav 152 mg af but and i aminder 1 vatet af Pn 14,

Pn-BuA^. Kp = 0,70 gradnephe1 ornetrienheder (153¾ basispol ysaccharid); Fluorescamintiter = 150 nm NH^/mg.

III. Bromacetylering af 1,4-butandiaminderivatet af Pn 14 (Pn ^-BuA^)_ 20 140 mg Pn-14-BuA2 blev opløst i 10 ml pH 9,15 puffer, og til denne opløsning blev der sat 140 mg p-n11ropheny 1-bromacetat opløst i 1 ml acetonitril. Denne opløsning blev tilproppet og omrørt ved 4 °C 1 22,5 timer. Den blev derpå dialyseret mod 4 liter H2O 1 6 timer, ny 25 portion 4 liter H2O i 16 timer og yderligere 4 liter H2O i 7 timer. Dialysatet blev derpå lysophiliseret, hvilket gav 139 mg af bromacetylderivatet af Pn I4-BUA2 Pn 14-BuA2~BrAc ) . Kp = 0,79 gradnephe1 ornetr1enheder = 120¾ basispolysaccharid. 1

Flurescamintiter = 6 nanomol/mg ifølge forskel (Δ= 150-6) indikerer 144 nanomol bromacetylgrupper/mg.

DK 171421 B1 39 IV. Konjugation af Pn 14-BuA2~BrAc til funktionaliseret N-meninqitidis-protein (NMP)_

Alle centrifugeringer blev foretaget i polycarbonatrør, med mindre andet er angivet, ved 43000 omdr./min. i 5 2 timer ved 4 °C i en Beckman Ti 73 rotor.

Det ufunktionaliserede protein (10 ml, 5,5 mg/ml) blev centrifugeret, og pellet blev gensuspenderet under anvendelse af en Dounce-homogenisator i 7 ml af en thiole-ringsblanding indeholdende 59 mg ethylendiamintetra-10 eddikesyre, 11,2 mg dithiothreitol og pH 11,3 natrium- boratpuffer. Efter gensuspendering af blandingen overføres den til et centrifugerør, der lukkes med en serumprop, og luften erstattes med N^. Dette blev overført til en nitrogenboks, og dertil blev der sat 54 mg N-acetyl-15 homocysteinthiolacton. Der blev tilproppet og derpå lagret i N^-boksen i 22 timer, hvorpå pH blev indstillet til 8,0 ved tilsætning af 1 M KH2P0^. Den resulterende blanding blev centrifugeret, og pellet blev derpå gensuspenderet i 10 ml 0,1 Μ Ρ0ή pH 8,0 puffer. Der blev derpå 20 gencentrifugeret til fjernelse af de tilbageblevne små molekyler. Den anden pellet blev gensuspenderet under anvendelse af Dounce-homogenisator i 8,5 ml pH 8,0 puffer. Ellman-prøven indikerer ialt 6,4 yumol thiol.

Til det gensuspenderede thiolerede protein blev der 25 sat 50 mg Pn 14-BuA2BrAc, og den resulterende opløsning henstod i 17 timer ved stuetemperatur i nitrogenboksen.

Det blev derpå dialyseret mod 4 liter H2O i 6 timer. Halvdelen af opløsningen (5 ml) blev overført til et centrifugerør, og 4,0 g CsCl blev opløst deri. Røret 30 blev fyldt til toppen (10 ml) med H2O og centrifugeret i 20 timer ved 43000 omdr./min. ved 4 °C i en Ti 75 rotor. Det resulterende CsCl-gradientmassefyldecentrifugat blev fraktioneret under anvendelse af et Haake Buchler DK 171421 B1 40 auto Densi Flow 2C apparat, i 1,3 ml fraktioner. Ni fraktioner blev samlet og fraktion nr. 5, 6 og 7 blev kombineret, anbragt i et centrifugerør, 3,5 g CsCl blev tilsat, blandingen blev påfyldt K^O og centrifugeret 5 i 24 timer som i det foregående. Centrifugatet blev fraktioneret som i det foregående, passende fraktioner blev detekteret ved hastighedsnephelometri, og fraktionerne 3 og 4 blev dialyseret mod 4 liter 0,1 M P0^ puffer (pH 7) i 16 timer og derpå mod 4 liter H^O i 4 timer.

10 Det resulterende dialysat blev fortyndet til 10 ml med h2o.

Fundet: polysaccharid 0,205 mg/ml protein 0,550 mg/ml

Spinco: S-carboxymethylhomocystein: 0,020 ^umol 15 lysin 0,156 yinol forhold 0,128 EKSEMPEL 4

Fremstilling af S. pneumoniae type 14 polysaccharid-N-meningitidis B serotype ydre membranproteinkonjugat 2 0 under anvendelse af en søjle i kon.juqationstrinnet_

Bromacetyleret 1,4-butandiaminderivat af pneumococ type 14 polysaccharid, fremstillet efter trin I, II og III i eksempel 3 blev derpå konjugeret til proteinet fremstillet efter eksempel 2 i en variation af trin IV i eksempel 25 3.

Konjugation af Pn 14-BuA2~BrAc til det ydre membranpro-tein af Neisseria meningitidis (NMP)_ 1,2 ml af en opløsning af NMP (12,4 mg/ml) blev anbragt i et centrifugerør sammen med 0,4 ml af en pufferopløs- DK 171421 B1 41 ning indeholdende mættet NaBO^ (pH 11,00) og 42 mg/ml ethylendiamintetraeddikesyre og 8 mg/ml dithiothreitol.

Røret blev lukket med en serumprop, afgasset, og luften blev erstattet med nitrogen. I en nitrogenboks blev 5 der derpå tilsat 10 mg N-acetylhomocysteinthiolacton.

Opløsningen henstod i 17 timer ved stuetemperatur. To "Sephadex"® G25 søjler (PD/10) blev derpå bragt i ligevægt med pH 8,0 phosphat (0,1 M) puffer. Til reaktions-blandingen blev der sat 0,9 ml af pH 8 pufferen, og 10 derpå blev hele mængden påført den første søjle. Denne blev elueret med 3,5 ml pH puffer. 2,5 ml af eluatet blev sat til en anden G-25 søjle, og denne blev elueret med 3,5 ml pH 8 puffer. Dette eluat havde 525 nanomol thiol (ialt) ifølge Ellman's prøve. Dertil blev der 15 sat 13 mg Pn 14-BuA2~BrAc, og blandingen fik lov at henstå i 7 timer under N2· Den blev derpå dialyseret 2 gange mod separate portioner på 4 liter vand (1 5 timer og 16 timer). En lille prøve blev lyophiliseret til aminosyreanalysen. Der blev fundet 0,0073 ^umol 20 S-carboxymethy 1homocystein og 0,104 yUmol. Produktet blev centrifugeret ved 100000 x g, og pellet blev resus-penderet i 10 ml H2O og recentr1fugeret. Resuspension i 10 ml gav opløsning af Ps-14-BuA2~BrAc NMP konjugat. Polysaccharidrprotein = 0,25.

25 S-carboxymethylhomocystein:1ysin = 0,07.

EKSEMPEL 5

Antistofresponstest i mus med S. pneumoniae type 14 polysaccharid - N. meningitidis B serotype ydre membran-proteinkonjuqat_______________ 1

En S. pneumoniae type 14 polysaccharid-N. meningitidis B serotype ydre membranproteinkonjugaropløsning fremstillet ifølge eksempel 4 blev afprøvet for immunogent respons i mus, og resultaterne er angivet i tabelform DK 171421 B1 42 i det følgende.

Serumantistofrespons for mus

Dosis, RIA titer (GMT)

Prøve meg polys. Art ng ab N/ml 5 Konjugat 0,1 Spæd ICR/Ha mus 18046γγ (7 dage gammel) 22256

Konjugat 0,11 ICR/Ha mus 19024 " 0,51 " " " 74664

Konjugat 0,51 CBA/N mus 7066 10 Polysac- charid kontrol 0,5 spæd ICR/Ha mus 49 Måde: injiceret i.p. på dag nr. 0, 7 og 28; tappet for blod på dag 34 - 35.

15 2 Resultater repræsenterer serologi fra to forskellige 2 kuld

Claims (9)

1. Stabilt, covalent koblet polysaccharid/protein-kon-jugat, kendetegnet ved, at det omfatter et neutralt bakteriepolysaccharid og et immunogent pro-5 tein koblet via en bigenerisk spacer, der indeholder thioetherbindinger, og som har formlen O II i? /\ OR II / I f| I A-E-S-B, hvori E er -CCHjN' lelier -CCH-, II O WH ill hvor R er H eller CH,; A er -CN(CH_) Y(CH-) NH-, hvor 3. m L n m er 0 - 4, n er 0 - 3, W er 0 eller NH, og Y er CH^, 10 0, S, NR' eller CHC00H, hvor R' er H eller alkyl med 1-2 carbonatomer, så at n og n ikke begge er lig med nul, hvis Y er CH2, og m er større end 1, og n er større end 1 hvis Y er 0 eller S; og B er Z -(CH2)pCH(CH^) D-, hvor p er 1 - 3, q er 0 - 2, Z er

0. H 0 0 II i! I II II

15 NH2, NHCR', C00H eller H, og D er C, NR', N-C(CH2)2C, hvor R' er som defineret i det foregående.

2. Konjugat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den bigeneriske spacer har formlen OH 0 NHCOCH, II I II i 3 CNCH2CH2CH2CH2NHCCH2SCH2CH2CHC0. 1

3. Konjugat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det neutrale bakterielle kapsulære polysaccharid er valgt blandt Streptococcus pneumoniae type 7F, 14 DK 171421 B1 og 37 polysaccharider.

4. Konjugat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det immunogene protein er et meningococ B serotype ydre membranprotein eller edestinprotein.

3. Konjugat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det neutrale bakterielle kapsulære polysaccharid er Streptococcus pneumoniae type 14 polysaccharid, det immunogene protein er et meningococ B serotype ydre membranprotein, og den bigeneriske spacer har formlen: OH O NHC0CHo II I »I I 3 cnch2ch2ch2ch2nhcch2sch2ch2chco. ^ 6. fremgangsmåde til fremstilling af polysaccharid/pro- tein-konjugater ifølge krav 1-5, k e n d e t e g -net ved, at den omfatter: (a) fragmentering af polysaccharidet og sol ubi 1 isering 2 0 af det depoJ ymeriserede polysaccharid i et ikke-van-digt, polært, aprotisk opløsningsmiddel, (b) aktivering af polysaccharidet med et bi funktionelt reagens, (c) omsætning af dette aktiverede polysaccharid med 2-* en bis-nucleophil, (d) omsætning af dette aktiverede polysaccharid, som er blevet omsat med en bis-nuc1eophi1, med et reagens, der danner elektrophile steder, hvorved der dannes et polysaccharid med modsvarende elektrophile s t e -der, (e) uafhængig omsætning af det immunogene protein med et reagens, der danner thiolgrupper, til dannelse af et protein med modsvarende thiolgrupper, og der- o pa 55 (f) omsætning af po1ysaccharidet med modsvarende elektro phile steder med proteinet med modsvarende thiolgrupper til dannelse af et polysaccharid/protein-konju- DK 171421 B1 gat, som er koblet via en covalent thioetherbinding, efterfulgt af (g) centrifugering af den resulterende blanding til fjernelse af ikke-covalent bundne polysaccharider 5 og proteiner.

7. Præparat omfattende en immunologisk effektiv mængde, til enten aktiv eller passiv beskyttelse af en pattedyrart mod bacteremia forårsaget af den tilsvarende 10 organisme, af stabile, covalent koblede polysaccharid/- protein-konjugater ifølge krav 1, antisera afledt fra nævnte konjugater eller γ'-globulin eller andre antistof-holdige fraktioner af nævnte antisera og en farmaceutisk acceptabel bærer. 15

8. Præparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et adjuvans. 1 Præparat ifølge krav 7, k e n d e t e g n e t 20 ved, at polysaccharid/protein-konjugaterne omfatter et pneumococ type 14 polysaccharid koblet via en bigene- 0H 0 NHCOCH, »I II I ^ risk spacer med formlen CNCH2CH2CH2CH2NHCCH25CH2CH2CHC0, til et meningococ B serotype ydre membranprotein, idet 25 en immunologisk effektiv mængde er en mængde af hvert af konjugaterne i præparatet, så at hvert konjugat indeholder 2 - 50 yug af polysaccharidet på konjugatform, og pattedyrarten er mennesker.