DK170489B1 - Forbedret gelpladesamling til elektroforese - Google Patents

Description

i DK 170489 B1

Den foreliggende opfindelse angår en gelpladesamling til anvendelse i et elektroforeseapparat, og af den i krav l's indledning angivne art.

Elektroforese anvendes som standardteknik i tilknyt-5 ning til nukleinsyresekvensbestemmelse, idet teknikken anvendes til registrering af det menneskelige genom, som omtalt i Chemistry and Engineering News, 14. marts 1988, side 22-28.

Det foregår ved elektroforesebehandling af DNA fragmenter.

På grund af deres størrelse kræver de en større effekt, end 10 der er behov for ved andre anvendelser. Effektanvendelsen andrager indtil 70 watt i almindelighed. En sådan effekt frembringer en kraftig varme og kraftige varmegradienter i gelpladen, idet den højeste temperatur optræder i de midterste kanaler. Kendte vertikalplacerede elektroforeseenheder 15 synes at virke mindre tilfredsstillende ved nukleinsyresekvensbestemmelse, eftersom temperaturgradienteme, som dannes under processen, frembringer fejlprodukter, som gør oversættelsen af resultaterne vanskelig og de mærkede fragmenter danner ikke ensartede lige linier. I stedet for danner de 20 registrerbare bånd buer, som følge af, at de midterste kanaler føres hurtigere frem, end det skulle være tilfældet.

Der er således behov for følgende ved kendte apparater: 1) opbygning af et sekvensbestemmelsesapparat, hvorved tilvejebringes ensartede lige linier i autoradiogrammet.

25 Dette kræver igen en forbedret temperaturfordeling i gelpladen.

2) Hurtig registrering af, hvorvidt den pipette, hvorved prøven tilføres, er i den egnede stilling inden for gelpladesamlingen, eller ikke til dispensering af prøven.

30 Det har ofte, på grund af den krævede renholdelse, været vanskeligt at vurderer, hvorvidt det hulrum, hvori gelen skal dannes, er tilstrækkelig rent.

I US-Å-4 715 942 omtales apparater for udøvelse af elektroforese under anvendelse af en samling bestående af 35 to plader og organer til fastholdelse af en gel mellem disse to plader, hvor organerne til fastholdelse af gelen består DK 170489 B1 2 af et par lag af eh ikke-ledende organisk, polymer film.

Ifølge opfindelsen er de foranstående problemer løst med en gelpladesamling til anvendelse i et elektroforeseap- * parat, som virker ved elektroforetisk at adskille ladede 5 stoffer, idet et sådant apparat indbefatter i det mindste en understøtning til montering af i det mindste én gelpladesamling, hvilken gelpladesamling indbefatter en gennemsigtig plade med en forreste og en bageste flade, organer til fastholdelse af en gel i berøring med en forflade på pladen 10 over et strømningsfladeområde, karakteristisk ved at den bageste flade på denne plade, er dækket med en spejlbelægning, og at samlingen yderligere indbefatter temperaturstyringsorganer i berøring med spejlbelægningen for tilvejebringelse af en jævn temperaturfordeling i gennemstrøm-15 ningsområdet.

Det er et fordelagtigt træk ved den foreliggende opfindelse, at nukleinsyresekvensbestemmelsesreaktionerne hurtigt ved elektroforesebehandlingen frembringer lige far-velinier og prøvebåndlinier, under anvendelse af stor effekt, 20 som tilvejebringer en væsentlig varme i gelpladesamlingen.

Det er i tilknytning hertil et fordelagtigt træk ved opfindelsen, at en sådan gelpladesamling er frembragt, som fastholder den høje temperatur, som frembringes ved elektroforesebehandl ing med stor effekt af fragmenter med stor 25 molekylvægt, og at der samtidig sker en fjernelse af temperaturtilvejebragte fejl.

En eksempelvis udførelsesform af den foreliggende opfindelse forklares i det følgende nærmere under henvisning til tegningen, på hvilken: 30 Fig. 1 er en afbildning af et elektroforeseapparat med en gelpladesamling ifølge opfindelsen, set forfra, fig. 2 er et udsnit af en isometrisk afbildning af det indre af apparatet, hvorved delvis er anskueliggjort * apparatets evne til at dreje og blive låst, 35 fig. 3 er et udsnit af en afbildning af et snit gennem gelpladesamlingen, DK 170489 B1 3 fig. 4 er et udsnit af en isometrisk afbildning af den nederste buffertank i apparatet, fig. 5 er et udsnit af en afbildning af tanken i fig. 4 set forfra,

5 fig. 6 er en afbildning af et snit langs linien VI-VI

i fig. 5, fig. 7 er et udsnit af den del i fig. 6, som er identificeret med "VII", i stor målestok.

Den foreliggende opfindelse er forklaret i forbindelse 10 med et foretrukket, stort set vertikalt stillet elektrofo-reseapparat, hvori i det mindste den nederste buffertank anvendes til at fastklemme gelpladesamlingen i den rigtige stilling. Herudover er opfindelsen nyttig i tilknytning til andre elektroforeseapparater, hvori gelpladesamlingen er 15 monteret i vinkler, som afviger fra den foretrukne foreklarede vinkel, og/eller er fastklemt med andre organer, end en eller flere buffertanke.

Dele som heri er beskrevet som "vertikale", "horisontale", samt "opad" og "nedad" eller hvortil er henvist med 20 lignende udtryk, er alle beskrevne med reference til deres placering i den normale brugsstilling.

Et elektroforeseapparat 20, hvori anvendes en gelpladesamling ifølge den foreliggende opfindelse, indbefatter, fig. 1, en understøtning, som i almindelighed indbefatter 25 en bundplade 22, en vertikal støtte 24, to klemindretninger 26, 28, som er monteret på hver sin side af støtten 24, støtteskinner 29, 30, hvorved tilvejebringe en støtteflade for en gelpladesamling 40, som mere fuldstændigt er vist i fig. 3. Klemindretningerne 26 og 28 er således monteret, at 30 de kan rotere, fig. 2, omkring støtten 24, som følge af en bøsning 60, som hviler på spidsen af støtten 24. En låsemekanisme 170 er tilvejebragt, som virker ved at fastholde klemindretningerne 26, 28 til forhindring af yderligere rotation, men på en sådan vis, at de kan frigives igen. Et 35 par buffertanke 70 og 100 er monteret henholdsvis nedadtil og opadtil i apparatet 20, fig. 1, på kendt vis. (I fig. l DK 170489 B1 4 er kun vist én buffertank 70 nedadtil for overskuelighedens skyld, således at renden 32 kan anskueliggøres).

Skønt støttefladen kan være tilvejebragt som en hvilken som helst egnet flade, må det foretrækkes, at hver af 5 skinnerne 29, 30 er udformet som en skinnepar, f.eks. skin- i neparret 30, fig. 6, for tilvejebringelse af støttefladen for gelpladesamlingen 40. Som det er vist tydeligt i fig. 5 og 7 er bunden af hver skinne udformet som en understøtningsrende 32, med en forreste læbe 34, som hindrer, at gelplade-10 samlingen 40 falder ned fra skinnerne, se også fig. 1. Renden 32 indbefatter endvidere et skulderstøtte 36 og et fremspring 3S nedadtil i bunden. Yderligere indbefatter hver skinne en flange 39, som forløber i skinnens længde, som vist i tilknytning til skinnen 30 i fig. 4 og 7, for samarbejde med 15 klemindretningerne for buffertankene, som senere forklaret, eller med klemindretninger for gelpladesamlingen.

Hvert skinnepar 29 eller 30 er tilknyttet sin egen klemindretning. Apparatet giver mulighed for, at to elektro-foresegelpladesamlinger drives samtidigt. Alternativt kan 20 der monteres yderligere par (ikke vist) fra samme støtte,, idet understøtningen drejes omkring støtten 24, indtil den udpegede gelpladesamling vender mod operatøren.

Det må foretrækkes, at støttefladerne for gelpladesamlingen, som indbefatter skinneparrene, er monteret således 25 at de danner en vinkel a, fig. 1, således at de afviger fra det vertikale plan med en størrelse mellem ca. 5 og 10°.

Som sådan ligger bunden af gelpladesamlingen og buffertanken 70 tættere ved operatøren, når gelpladesamlingen vender mod operatøren, end den øverste del af gelpladesamlingen og 30 buffertanken 100. Fordelen er, at det i modsætning til fuldstændig vertikale pladeunderstøtninger i kendte apparater ikke er nødvendigt at holde plade fast på understøtningen, medens klemorganerne sættes på plads. I stedet indføres pladen simpelt hen i renden 32, og lænes tilbage mod skin-35 nerne 29 eller 30. Renden 32 virker ved at forhindre pladen i at falde ned, og vinklen a virker ved at forhindre pladen DK 170489 B1 5 40 i at vippe over, før buffertankene 70 og 100 er sat på plads.

Vinklen a skal helst ikke være mindre end 5°, idet vinklen ellers ikke afviger tilstrækkeligt fra det vertikale 5 plan, hvorfor en udvipning af pladen er mere sandsynlig.

. Vinklen skal fortrinsvis ikke være større end 10·, eftersom større vinkler vil have en tendens til at gøre apparatet for stort forneden.

Gelpladesamlingen 40 er hele den i fig. 3 viste sam-10 ling, som indbefatter en gennemsigtig forplade 42, en gennemsigtig bagplade 44, begge fortrinsvis tilvejebragt i glas, og afstandsorganer 46, 48, som adskiller de to plader, således at gelen (ikke vist) kan tilvejebringes mellem dem, på kendt vis. Ifølge et aspekt af opfindelsen, er bagpladen 15 44 forbedret for at sikre bedre dannelse og iagttagelse af farvelinierne i elektroforesebehandlede prøver. Pladen 44 * indbefatter en forreste flade 50 og et bageste flade 52.

Den bageste flade 52 er belagt med et spejlende materiale, såsom sølv eller aluminium, se laget 54, og et lag 56 er 20 fastgjort over belægningen 54, set stort ud over det samlede område bag strømningsoverfladeområdet på pladesamlingen 40. Fastgørelsen af laget 56 på et området "bag strømningsover-fladeområdet" på gelpladesamlingen, betyder over et område med en udstrækning, som er sammenfaldende med og placeret 25 bagved strømningsoverfladeområdet på gelen, hvori elektro-foresekanalerne ligger. Dette område er defineret ved længden "1", fig. 1, og bredden "w", fig. 3. Laget 56 er udpeget i et materiale, som effektivt fordeler eller overfører varme, f.eks. aluminium. Dette lag er tæt bundet til belægningen 30 54 over stort set hele overfladen ved anvendelse af egnede midler, f.eks. et klæbemiddel, såsom acrylklæbemiddel. Det samlede laminat, som således er tilvejebragt, dækkes herefter . fortrinsvis ved et ikke ledende, korrosionsbestandigt lag til beskyttelse.

35 Imidlertid er laget 56 ikke anvendt til at fjerne varme fra gelpladesamlingen. De bærende flader, som udgøres DK 170489 B1 6 af flangerne 39, er derimod overlagt holdt på afstand af organet 28, i en afstand, som på effektiv vis tilvejebringer en død luftspalte 58, fig. 4 og 8. Denne isolerende luftspalte sikrer, at den varme, som frembringes ved processen, 5 forbliver på stedet, hvorved den nødvendige tid til opnåelse af driftstemperaturen nedsættes.

Laget 56 virker således ved at overføre varme fra de varmere centrale områder til de perifere områder, hvorved temperaturgradienterne nedsættes. Som følge heraf er de 10 farvelinier, som dannes i gelen, tilstrækkelig retliniede, og resultatene er fri for termisk tilvejebragte fejl. Den samlede temperatur forbliver imidlertid høj, hvorved til-' vejebringes en hurtigere bevægelse af farvefronterne, end det er tilfældet med vandbaserede enheder. Dette skyldes, 15 at det tager meget længere tid at opvarme vandet til driftstemperaturen.

Farvefronternes evne til at blive behandlet stort set fejlfrit bevares, også når der tilføres så stor en effekt som 60 watt for opnåelse af temperaturer på ca. 70°C, når 20 temperaturen måles i den forreste del af pladen 42, hvorved tilvejebringes farvefronthastigheder så store, som 0,5 cm/min.

Et andet aspekt af opfindelsen er det, at en sådan gelpladesamling er tilvejebragt med en spejlende flade 54.

25 Denne flade sikrer, at brugeren lettere kan registere tilstanden på fladen 50, fig. 3. Dette skyldes, den spejlende flade gør det nemmere nøjagtigt at indføre prøveopløsning med pipette i hulrummet mellem pladerne 42 og 44. Spejlet hjælper også med til at afsløre partikler af snavs, hvis 30 der er sådanne, på fladen 50, når pladen 44 renses. Far-velinierne er også lettere at registere med spejlet på plads.

Gelpladesamlingen kan presses mod elektroforeseap-paratet med et hvilket som helst klemorgan, heri indbefattede kendte klemorganer. Det må dog foretrækkes, at gelpladesam-35 lingen fastgøres ved klemorganer, som ikke alene fastholder gelpladesamlingen i stilling, men som også fastholder en DK 170489 B1 7 eller begge buffertanke på understøtningen.

Den nederste buffertank 70, fig. 4, indbefatter fortrinsvis et hulrum 74, fig. 6 og 7, som er åben opadtil mod den øverste flade 76, fig. 5. Tanken er tilvejebragt med 5 håndtag 78 i hver ende, og to klemorganer 80, 80' er anbragt drejeligt på tappe 82 på den øverste overflade 76. Hvert klemorgan er udformet med en håndtagsdel 83. En torsionsfjeder 84 er vinklet omkring hver tap i den ene ende, fig. 6, og er fastgjort i den anden ende til en skrue 86, som er 10 fastgjort til fladen 76. Som følge heraf påvirkes klemorganerne 80 og 80' således at de trykker indad, dvs. at klemorganet 80 er påvirket til rotation mod uret, fig. 6, og 80' til rotation med uret.

Virkningen skal ikke alene være at fastklemme tanken 15 70 til understøtning ved skinnerne 29, men fortrinsvis også at fastklemme gelpladesamlingen 40 mellem buffertanken og skinnerne 29. Ved denne opbygning er det ikke nødvendigt at anvende særskilte klemorganer eller fastgørelsesorganer til fastholdelse af tanken 70 på plads, bortset fra de organer, 20 som anvendes til at fastholde gelpladesamlingen på plads.

Klemorganerne 80 og 80' betjenes ved simpelt hen at gribe klemorganet med tommelfingeren og et af håndtagene med fingrene og presse mod virkningen af torsionsfjederen til frigørelse af klemorganet fra berøring med gelpladesam-25 lingen. Herved frigøres igen buffertanken fra berøring med skinnerne 29 eller 30, således at buffertanken kan fjernes og rengøres.

På kendt vis er et bananstik 90 monteret på siden af tanken 70 for tilvejebringelse af forbindelse med strømfor-30 syningsledninger. Inden i tanken er stikket 70 forbundet med en trådelektrode 92, fig. 5, som er understøttet ved en stang eller et rør 94, som forløber langs bunden af tanken 70. Røret 94 og elektroden 92 kan på fordelagtig vis være udformet således, at de kan fjernes som en enhed.

35 Forsiden 96 på tanken 70 kan være tilvejebragt gen nemsigtig, således at betragtning af indholdet i tanken DK 170489 B1 8 fremmes.

På tilsvarende vis er tanken 100 fastklemt således, at den kan frigøres, til den anden ende af gelpladesamlingen „ 40, fig. 1. De dertil knyttede klemorganer, som ikke er 5 vist detaljeret, fastholder fortrinsvis den øvre ende af

C

gelpladesamlingen mod skinnerne 29 og 30, ved at placere samlingen mellem skinnerne og buffertanken 100.

Stellet hvormed apparatet 20 drejes, indbefatter ifølge fig. 2, trapezformede organer 172, som er monteret 10 vertikalt på to horisontale plader 174 og 176. Pladen 174 er tilvejebragt med et hul ved 178, hvorigennem den vertikale støtte 24 kan føres frit. Pladen 176 er tilvejebragt med en bøsning 60, som senere forklaret. De udadtil vendende kanter 180, 182 på hvert trapezformede organ 172 er tilvejebragt 15 som understøtning for sporparrene, hvorpå klemorganerne er monteret, hvilket organer er vist stiplede. Bøsningen 60, fig. 2 hviler på en spids (ikke vist). På denne vis kan det samlede stel, som indbefatter pladerne 174, 176, bøsningen 60, de trapez formede organer 172 og de fastgjorte klemorganer 20 og skinner, dreje om støtten 24.

Det må foretrækkes, at låsemekanismen 170 midlertidigt kan forhindre drejning af apparatet 20 ved anvendelse af en lås med to stillinger, som påvirkes ved trykning, og som er tilvejebragt som en kendt opbygning, som ikke er vist, og 25 som virker ved at bringe et organ i indgreb eller ud af indgreb med tænderne på en låseplade 186.

30 4 35

Claims (2)

1. Gelpladesamling (40,42,44,46,48,50,52,54,56) til anvendelse i et elektroforeseapparat (20,22,24,26,28,29,30), for ved elektroforese at adskille elektrisk ladede stoffer, 5 hvilket apparat (20,22,24,26,28,29,30) indbefatter i det mindste én understøtning (29,30) til montering af i det mindste én gelpladesamling (40,42,44,46,48,50,52,54,56), hvilken gelpladesamling (40,42,44,46,48,50,52,54,56) indbefatter en gennemsigtig plade (44) med en forreste flade 10 (50) og en bageste flade (52), organer (42,46,48) til at fastholde en gel i berøring med den forreste flade (50) på pladen (44) over et strømningsoverfladeområde, kendetegnet ved, at den bageste flade (52) på pladen (44) er dækket med en spejlbelægning (54), og at samlingen 15 (40,42,44,46,48,50,52,54,56) yderligere indbefatter tempera turstyringsorganer (56) i berøring med spejlbelægningen (54) for tilvejebringelse af en jævn temperaturfordeling i gennemstrømningsområdet.

2. Samling ifølge krav 1, kendetegnet 20 ved, at temperaturstyringsorganerne (56) indbefatter et aluminiumslag. 25 30 35