DK168302B1

DK168302B1 - Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale i planteceller

Info

Publication number: DK168302B1
Application number: DK325189A
Authority: DK
Inventors: Rsboe Morten J
Original assignee: Danisco
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1994-03-07
Also published as: AU6043290A; EP0480971A1; AU645260B2; WO1991000358A1; JPH05500304A; DK325189A; DK325189D0

Description

DK 168302 Bl i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale, i intakte planteceller.

5 Der kendes forskellige metoder til indføring af molekyler, såsom genetisk materiale, f.eks. plasmid-DNA, RNA, virus eller fragmenter deraf, i dyreceller og protoplaster.

Disse kendte metoder omfatter bl.a. kemiske metoder, elektro-10 poration og mikroinjektion. Disse kendte metoder har vist sig at være anvendelige til både transient og stabil transformation. Alle de beskrevne metoder til opnåelse af transient ekspression har også vist sig at være anvendelige til frembringelse af stabile transformationer.

15 I forbindelse med indføring af genetisk materiale er der et vigtigt lighedspunkt mellem planteprotoplaster og dyreceller, idet begge udelukkende er afgrænset fra omgivelserne af en plasmamembran. I modsætning hertil omfatter intakte plantecel-20 ler udover en plasmamembran også en for højmolekylære forbindelser ugennemtrængelig cellevæg, der består af et tæt netværk af cel 1ulosefibri1 ler, pectin og ofte også lignin.

Ligheden mellem planteprotoplaster og dyreceller underbygges 25 af, at de metoder, som kendes til indføring af genetisk materiale i planteprotoplaster, sædvanligvis også kan anvendes på dyreceller.

Sådanne metoder omfatter: 30

Calciumphosphatudfældning af plasmid-DNA under dannelse af et krystallinsk produkt. Dette produkt kan optages af dyreceller (Graham og van der Eb, Virology, 52, 456-457, 1973) og af planteprotoplaster (Hain et al., Mol. Gen.

35 Genet. 199, 161-168, 1985).

Indkapsling af plasmid-DNA med liposom med efterfølgende polyethylenglycolinduceret fusion med planteprotoplaster 2 DK 168302 B1 (Deshayes et al., EMBO 4, 2731-2737, 1985), eller med dyreceller (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413, 1987).

5 Anvendelse af polyethylenglycol (PEG). Ved denne metode sættes der til pianteprotoplaster og genetisk materiale polyethylenglycol, sædvanligvis 40% polyethylenglycol 6000 (Krens et al., Nature, 296, 72-74, 1982). På tilsvarende måde kan man anvende polyethylenimin eller poly-L-10 ornithin.

Elektroporation. Her udsættes en suspension af dyrecel ler eller planteprotoplaster for en kortvarig elektrisk impuls med høj feltstyrke i nærværelse af genetisk mate-15 riale (Neuman et al., EMBO J., 1, 841-845, 1982; Fromm et al.. Nature, 319, 791-793, 1986).

Mikroinjektion. Her indføres genetisk materiale i planteprotoplaster (Crossway et al., Mol. Gen. Genet., 20, 179, 20 1986) eller i dyreceller (Cappechi, Cell, 22, 479-488, 1980) ved hjælp af en ultratynd mikropipette.

Fra W0 offentiiggørelsesskrift nr. 89/02464 er det kendt at transformere dyreceller med DNA-fragmenter ved at give cel-25 lerne en ultralydsbehandling, der er tilstrækkelig til at traumatisere cellerne uden at slå cellerne ihjel. På grund af de tidligere nævnte ligheder mellem dyreceller og planteprotoplaster, må det anses for nærliggende, at denne metode også vil kunne anvendes til indføring af DNA-fragmenter i plante-30 protoplaster. Da imidlertid ingen af de tidligere nævnte metoder har vist sig at være egnede til indførelse af plasmid-DNA i intakte planteceller, vil fagmanden, der læser W0 offentliggørelsesskriftet, drage den konklusion, at denne metode formentlig også vil kunne anvendes på protoplaster, men han vil 35 næppe komme på den tanke, at metoden vil kunne anvendes på intakte, vanskeligt gennemtrængelige planteceller. Det er således almindeligt accepteret blandt fagfolk, at plantecellers 3 DK 168302 B1 vægge generelt er uigennemtrængelige for store molekyler såsom DNA og proteiner.

For at løse dette problem har man derfor været nødt til først 5 at fjerne plantecellernes cellevægge, sædvanligvis ved enzymatisk hydrolyse, for derefter at kunne indføre genetisk materiale i de derved dannede protoplaster. Dette giver sædvanligvis vanskeligheder, da det normalt er endnu vanskeligere at få protoplaster regenereret til hele planter sammenlignet med 10 anvendelse af intakte planteceller. Der er således et stort behov for at finde en metode, hvormed man kan indføre genetisk materiale direkte ind i intakte planteceller, således at man undgår problemerne med fremstilling af protoplaster og problemerne med regenerering ud fra protoplaster.

15

For nyligt er der udviklet en metode til indføring af plasmid-DNA i intakte planteceller. Denne er baseret på, at små partikler beklædt med plasmid-DNA skydes med en høj hastighed ind i de intakte planteceller (Klein et al., Nature, 327, 70-73, 20 1987). Denne metode kræver dog et meget kostbart udstyr, som endvidere kræver betydelig ekspertise for at kunne anvende det på rette måde.

Der er således et behov for en mere enkel og billig metode til 25 indføring af molekyler, især genetisk materiale, i intakte planteceller.

Det har nu vist sig, at indføring af molekyler, især genetisk materiale, i intakte panteceller kan gennemføres ved mild ul-30 tralydbehandling ved en metode, der kun kræver forholdsvis billigt og let tilgængeligt udstyr og under opnåelse af en god effektivi tet.

Det er således formålet med den foreliggende opfindelse at an-35 vise en fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale, i intakte planteceller på en billig og effektiv måde.

DK 168302 B1 4

Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen der er ejendommelig ved at et medium, der indeholder plantecellerne og molekylerne, udsættes for ultralydbehandling med en frekvens fra 5 kHz til 10 MHz, en udgangseffekt på op til 300 watt i et tidsrum på op til 10.000 ms.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er et nyttigt alternativ til ® de tidligere kendte indføringsmetoder. Med fremgangsmåden er der opnået en ny metode, der kun kræver beskedne omkostninger, og som kan gennemføres på en hurtig og simpel måde. På basis af de allerede gennemførte indføringsforsøg kan man forudse, at fremgangsmåden også vil vise sin overlegenhed ved anvendel-se på mange andre biologiske materialer, hvor de kendte metoder er utilstrækkelige.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen underkastes plantecellerne en ultralydbehandling, der er betydeligt mildere end den ultralydbehandling, der benyttes til homogenisering eller lysis af celler. Det er således vigtigt at behandlingen er passende mild, således at en tilstrækkelig andel af plantecellerne bevarer levedygtigheden. For at sikre dette udsætter man plantecellesuspensionen for ultralydbølger i 20 frekvensområdet fra 5 kHz til 10 MHz, især fra 10 til 100 kHz, med en udgangseffekt (dvs. den til det lydgivende organ tilførte elektriske effekt) på op til 300 watt, såsom 5-300 watt, fortrinsvis 30-70 watt, i et tidsrum på op til 10.000 ms, såsom 100-3000 ms, fortrinsvis 400-1000 ms.

25

Som eksempler på molekyler, der kan indføres i planteceller ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan nævnes DNA, plas-mid-DNA, RNA, virus, proteiner, lipider, lægemidler, små molekyler, organeller eller fragmenter af sådanne materialer.

30

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen har med fordel været anvendt til indføring af molekyler i planteceller fra sukkerroe og tobak.

35 Et fordelagtigt medium, hvori plantecellerne og molekylerne er indeholdt under ultralydbehandlingen, er en vandig saltopløsning (CPW), som er nærmere beskrevet nedenfor i forbindelse med eksemplerne, indeholdende 21-28% saccharose.

5 DK 168302 B1

Ved indføring af plasmid-DNA ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås sarligt gode resultater, hvis mediet indeholder plasmid-DNA i en koncentration på mindst 10 pg/ml.

5 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan man med fordel gennemføre den milde ultralydbehandling under anvendelse af et spidst lydgivende organ, som kun neddyppes i den øvre del af mediet.

10 Ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er der påvist indføring af molekyler i tokimbladede planteceller, såsom sukkerroe og tobak. Det må dog formodes, at fremgangsmåden er lige så velegnet til indførelse af molekyler i enkimbladede planteceller.

15

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan med fordel gennemføres ved anvendelse af et apparat, der omfatter et lydgivende organ, der i et medium kan udsende ultralyd i et tidsrum på op til 10.000 ms. Et sådant apparat kan med fordel være udformet 20 til at udsende ultralydbølger med en frekvens i området fra 10 til 100 kHz.

Til løsning af forskelligartede opgaver kan apparatet være udformet således, at den til det lydgivende 25 organ tilførte effekt kan indstilles på en hvilken som helst værdi i området fra 5 til 300 watt og således, at lydbehandlingens varighed er indstillelig i området fra 100 ms til 10.000 ms.

30 Apparatets lydkilde er med fordel udformet således, at den kan neddyppes i et medium, der er placeret i en passende beholder, såsom et Eppendorfrør. En sådan udformning, hvor det lydafgivende organ sidder for enden af en tynd stav, er kendt fra konventionelle ultralydapparater beregnet til nedbrydning el-35 ler lysis af cellemateriale.

Det har ved forsøg vist sig at sådanne konventionelle ultralydapparater kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfinde!- 6 DK 168302 B1 sen. Den foreliggende opfindelse er udviklet under anvendelse af et i handelen tilgængeligt apparat med betegnelsen Sonifier B 15, der leveres af Branson, Eagle Road, Danbury, Connecticut, USA, beregnet til lysis af celler. Apparatet kan udsen-5 de ultralyd med en frekvens på 20 kHz. De i nærværende beskri velse og krav angivne effekter i watt er udgangseffekten, sådan som den aflæses på udgangskontrolskalaen (output control). Ved forsøgene var det ultralydgivende organ neddyppet ca. 2-3 mm fra overfladen. Ved orienterende forsøg under anvendelse af 10 et kalorimeter har det vist sig, at der ved den benyttede for søgsopstilling opnås en afsat effekt til væsken, som er på ca.

5 til 10% af den angivne udgangseffekt. Ved anvendelse af andre apparater vil fagmanden på samme måde som beskrevet i de efterfølgende eksempler kunne bestemme en passende indstil-15 ling, som giver en mild ultralydbehandling med effektiv indføring af molekyler, under opretholdelse af en tilstrækkelig levedygtighed, det vil sige en indstilling, som giver en ultralydbehandlingseffekt svarende til den, der er anvendt i de ifølge eksemplerne foretagne forsøg. Det kan til sammenligning 20 oplyses, at når det nævnte apparat Sonifier B 15 anvendes til lysis eller homogenisering af celler under i øvrigt samme betingelser, indstiller man det sædvanligvis på en udgangseffekt på 80-100 watt og en behandlingstid på 30.000 til 250.000 ns ved behandling af intakte celler.

25

Som tidligere nævnt kendes der flere metoder til indføring af genetisk materiale i planteceller, hvor disse først omdannes til planteprotoplaster, idet der opnås en højere grad af indføring af det genetiske materiale i protoplasterne, da disse 30 ikke har den spærrende cellevæg. Til gengæld er det for proto-plaster af en række plantearter, især enkimbladede planter, vanskeligt at regenerere protoplaster til intakte planter. Selv om der er opnået gunstige resultater med protoplaster af visse plantearter er der andre plantearter, hvor det vil være 35 mere fordelatigt at benytte intakte planteceller, plantekim eller andet morforgent materiale i stedet for protoplaster. Det er ved forsøg påvist, at direkte indføring af genetisk 7 DK 168302 B1 materiale i intakte celler ved mild ultralydbehandling ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er mulig og attraktiv, da der her er tale om en mindre kompliceret metode, der giver mulighed for en drastisk forøgelse af det antal af plantear-5 ter, hvor der med succes kan gennemføres genetisk manipulation.

Som genetisk materiale kommer navnlig DNA eller fragmenter deraf, såsom plasmid-DNA, på tale. Det må imidlertid antages, 10 at fremgangsmåden også er velegnet til indføring af RNA eller fragmenter deraf samt til indføring af virus, f.eks. til patologiske undersøgelser. Ligeledes vil fremgangsmåden ifølge opfindelsen formentlig også kunne anvendes til indføring af proteiner, lipider, lægemidler, små molekyler samt organeller 15 og viruspartikler i celler.

Som medium kan der anvendes et hvilket som helst passende konventionelt medium for celler eller protoplaster.

20 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen benytter en teknik, hvor der antageligt sker en midlertidig, moderat svækkelse af såvel cellemembran som cellevæg, hvilket i de efterfølgende eksempler er påvist hos intakte planteceller. Således påvises det i eksemplerne, at plasmid-DNA kan trænge ind i ultralydbehand-25 lede planteceller.

Omfanget af opfindelsens anvendelighed vil fremgå af den efterfølgende detaljerede beskrivelse.

30 « 35 8 DK 168302 B1

Eksempler

Generelle forsøgsbetingelser: 5 Cellesuspensionskultur

En cellesuspensionskultur af sukkerroe (Beta vulgaris L.) af genotypen Ml (fra DANISCO A/S, København, Danmark) fremstilles ud fra callus opnået fra kim (embryo). Cellesuspensionen dyr-10 kes i mørke ved 25eC på et roterende rysteapparat. Cellerne opretholdes ved subdyrkning i et medium ifølge Murashige og Skoog (Physiol. Plant. 15, 473-497, 1962) suppleret med 5,7 μΜ indoleddikesyre og 4,4 μΜ benzyladenin.

15 CPW

CPW er en vandig opløsning af en blanding af uorganiske salte omfattende blandt andet ca. 10 mM Ca++ beskrevet af Frearson et al., (Dev. Biol. 33, 130-137, 1973).

20

Ultralvdbehandlino

En cellesuspension til ultralydbehandling fremstilles ved at udtage cellerne 3-4 dage efter subdyrkning og vaske to gange i 25 CPW 13S (dvs. CPW indeholdende 13% sorbitol) og suspendering til sidst i CPW 13S i forholdet 1 rumfang celler til 4 rumfang CPW 13S. Til denne suspension i 0,35 ml CPW indeholdende 21% saccharose og indeholdende planteceller (500.000/ml) i et Ep-pendorfrør sættes plasmid DNA til en siutkoncentration på 45 30 μg/ml. Som plasmid DNA anvendes et plasmid, der koder for markør-enzymet chloramphenicol-acetyl transferase (CAT). Det anvendte plasmid er plasmidet pCaMVCN, der med kodebetegnelsen 27-4909 leveres af Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sverige.

Efter hurtig omrystning neddyppes mikrotippen af en Sonifier B 15 (leveret af Branson, Eagle Road, Danbury, Connecticut, USA) 35 DK 168302 Bl 9 i den øvre halvdel af cellesuspensionen (dvs. 2-3 mm fra overfladen). Der tilføres en ultralydimpuls med en frekvens på 20 kHz. Den effekt, der angives i forsøgene bestemmes ud fra udgangskontrolskalaen (output control), hvor en enhed svarer til 5 15 watt elektrisk effekt. Den effektive akustiske effekt er blevet målt til 0,22 watt/cm2 ved 10 watt elektrisk effekt. Behandlingens varighed indstilles ved hjælp af skalaen for procent driftscyklus (procent duty circle), hvor man ved en indstilling på 10% opnår, at en ultralydimpuls varer i 110 ms.

10

Derefter overføres de ultralydbehandlede celler til petriskåle med et MS-medium (Murashige og Skoog, se ovenfor) og der inkuberes ved 23°C i 2 dage. Derefter påvises tilstedeværelsen af CAT-aktivitet i en ekstrakt udvundet fra de behandlede celler 15 ved tilsætning af l4C-mærket chloramphenicol og opvarmning i 6 minutter til 60eC. Efter afkøling tilsættes acetyl-coenzym A til prøven, således at siutkoncentrationen af acetyl-coenzym A bliver 0,71 mM. Indføringen af plasmidet bedømmes ved måling af den procentuelle omdannelse af chloramphenicol (CA). Den 20 anvendte metode er en modifikation af den metode, der er beskrevet af Gorman et al. (Mol. Cell. Biol. 2, 1044-1051, 1982).

Eksempel 1 25 Nærværende eksempel belyser indføring af plasmid-DNA i intakte celler af sukkerroe af genotypen Ml.

Suspensionskulturer af sukkerroeceller opretholdes ved sub-30 dyrkning som beskrevet ovenfor og ultralydbehandies, dyrkes og analyseres på den beskrevne måde. Resultaterne fra den målte CAT-aktivitet fremgår af tabel 1.

35 10 DK 168302 B1

Tabel 1 Sukkerroe

Effekt Tid Omdannelse af CA

(watt) (ms) (%) 500 0,03 60 800 0,06 75 800 0,21 90 800 0,17 105 800 0,07 10

Eksempel 2 Nærværende eksempel belyser indføring af plasmid-DNA i intakte celler af tobak.

15

En cellesuspensionskultur af tobak opretholdes ved subdyrkning på samme måde som beskrevet ovenfor for subdyrkning af celle-suspensionerne af sukkerroe, idet dog dyrkningsmediet består af et medium ifølge Murashige og Skoog (Physiol. Plant. 15, 20 473-497, 1962) suppleret med 0,2 mg/1 2,4-dichlorphenoxy- eddikesyre, 0,1 mg/1 kinetin, 0,9 mg/1 thiaminhydrochlorid og 0,2 g/1 KH2PO4, pH 6,0.

Cellerne udtages 3-4 dage efter subdyrkning og vaskes to gange 25 i CPW13S (dvs. CPW indeholdende 13% sorbitol) og suspenderes til sidst i CPW13S i forholdet 1 rumfang celler til 4 rumfang CPW13S. Herfra udtages prøver på 0,35 ml, som hver tilsættes plasmidet pCaMVCN til en siutkoncentration på 100 pg/ml. Derefter underkastes cellerne ultralydbehandling under de i tabel 30 2 angivne betingelser. Efter dyrkning i 2 dage i det oven nævnte medium ekstraheres cellerne, og CAT-aktiviteten måles. Resultaterne ses i tabel 2.

35

Claims

10 Det fremgår, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til indføring af molekyler i intakte planteceller. Idet opfindelsen nu er blevet beskrevet, vil det være åbenbart, at denne vil kunne varieres på mange måder. Sådanne va-15 riationer skal ikke betragtes som en afvigelse fra opfindelsens idé og rammer, og alle sådanne modifikationer, som vil være nærliggende for fagfolk, skal også forstås som omfattet af de efterfølgende kravs rammer. 20 Patentkrav

1. Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale, i intakte planteceller, kendetegnet 25 ved, at et medium, der indeholder plantecellerne og molekylerne, udsættes for ultralydbehandling med en frekvens fra 5 kHz til 10 MHz, en udgangseffekt på op til 300 watt i et tidsrum på op til 10.000 ms.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ultralydbehandlingen foretages med en udgangseffekt på 5-300 watt i et tidsrum på 100-3000 ms.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 35 at ultralydbehandlingen foretages med en udgangseffekt på SOTO watt i et tidsrum på 400-1000 ms, og at frekvensen for lydbølgerne ligger i området fra 10 til 100 kHz. DK 168302 B1

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at molekylerne er valgt blandt DNA, plasmid-DNA, RNA, virus, proteiner, lipider, lægemidler, små molekyler, organeller eller fragmenter af sådanne materialer. 5

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mediet har en plasmid-DNA-koncentration på mindst 10 pg/ml.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at ultralydbehandlingen foretages med et spidst lydgivende organ, som kun neddyppes i den øvre del af mediet.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plantecellerne er fra en enkimbladet plante. 15

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plantecellerne er fra en tokimbladet plante.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved 20 at plantecellerne er celler fra sukkerroe eller tobak. 25 30 35