DK167271B1 - Fremgangsmaade til fremstilling af et antithrombin iii- eller antithrombin iii-haperinoid-koncentrat - Google Patents

Description

i DK 167271 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et antithrombin Ill-heparin- eller antithrombin III-heparinoid-koncentrat.

Det er kendt, at antithrombin III sammen med heparin eller heparinoider danner et kompleks, der udviser farmaceutisk værdifulde egenskaber. Især undertrykkes enzymatisk betingede proteinforandringer, der kan have uønskede sidereaktioner hos patienter til følge, ved hjælp af tilstedeværelsen af dette kompleks ved fremstillingen og lagringen af koncentrater af højvirksomme koagulationsfaktorer og andre plasmaproteiner med biologisk virkning. Koncentrater af antithrombin III har også en lignende virkning. Yderligere farmaceutisk værdifulde egenskaber ved disse produkter er deres virkning overfor thrombo-embolismus i tilfælde af medfødt mangel på antithrombin III samt hos risikopatienter, hos hvilke antithrombin IIl-formindskelse indtræder under heparinbehandling.

I østrigsk patentskrift nr. 359.646 beskrives dannelsen af et antithrombin III-heparinkompleks ved tilsætning af heparin til menneskeligt citratplasma eller til renset antithrombin III. Blandingen tilsættes faktor VIII-holdige fraktioner med henblik på stabilisering. En isolering af komplekset sker ikke herved.

I det europæiske offentliggørelsesskrift nr. 0.048.898 beskrives fremstillingen af et antithrombin III-heparinkompleks, ved hvilken forinden renset antithrombin III og heparin ad-sorberes til immobiliseret lectin, det overskydende heparin fjernes ved vaskning, og komplekset elueres med kulhydratopløsninger. Herved fremkommer et problem med leakage af liganden, da de benyttede lectiner har mitogen virkning. Derfor er den terapeutiske anvendelse af et således fremstillet produkt risikabel.

2 DK 167271 B1 I litteraturstedet "The Chemistry and Physiology of the Human Plasma Proteins" af R.D. Rosenberg, side 353, Ed.d H. Bing., Pergamon Press, 1979, beskriver Rosenberg kompleksets fremstilling ud fra renset antithrombin III og heparin, hvorved komplekset skilles fra overskydende heparin ved hjælp af gelfiltrering og isoleres. Endvidere kan komplekset ifølge Rosenberg ved hjælp af gelfiltrering i nærværelse af 3 M NaCl-op-løsning adskilles i sine bestanddele.

For så vidt antithrombin III-heparinkomplekser hidtil er blevet fremstilletson sådanne, dvs. som rene stoffer, skete dette hovedsageligt til analytiske formål. En gelfiltrering eller en affinitetskromatografi med toksiske ligander, såsom lec-tiner, er ikke egnede metoder til en produktion af terapeutisk anvendelige produkter.

Opfindelsen tager sigte på undgåelse af disse ulemper og vanskeligheder og at løse opgaven at kunne fremstille antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-heparinoid-kompleks-koncentrater i produktionsmålestok, dvs. for at opnå produkter, der er egnede til anvendelse som terapeutika.

Opfindelsen går ud fra en fremgangsmåde til fremstilling af et antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-heparinoid-koncentrat, hvorved humant plasma eller antithrombin III-holdige plasmafraktioner under dannelse af et antithrombin III-hepa-rin- eller antithrombin III-heparinoidkompleks tilsættes heparin eller heparinoid, og den er ejendommelig ved, at det dannede antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-hepa-rinoidkompleks adsorberes til en anionbytter, at adsorbatet elueres ved hjælp af en saltopløsning, at det i eluatet indeholdte antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-hepa-rinoidkompleks befries for salte og uønskede proteiner, og at det opnåede produkt bringes på holdbar form ved hjælp af lyofilisering.

I modsætning til de indledningsvis nævnte fremstillingsmeto-er foranstaltningerne ifølge opfindelsen yderst simple 3 DK 167271 B1 og kan gennemføres med godt udbytte. En delvis denaturering af antithrombin III finder ikke sted ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Man opnår en meget god heparinbindingsevne hos antithrombin III, og heparinet har høj affinitet til antithrombin III, selvom ingen af de to deltagere skal renses forinden. Som anionbytter kan eksempelvis anvendes sådanne på basis af tværbundne dextrangeler (f.eks. "DEAE-Sephadex", "QAE-Sephadex") eller DEAE-cellulose. Adsorbatet vaskes hensigtsmæssigt før elueringen.

Ifølge en fordelagtig udførelsesform behandles eluatet med proteinfældningsmidler, såsom ammoniumsulfat, i en koncentration, der er tilstrækkelig til at udfælde antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-heparinoidkomplekset, hvorpå bundfaldet opløses, opløsningen varmeinaktiveres, og produktet derpå lyofiliseres. Varmebehandlingen til inaktivering af eventuelt tilstedeværende infektionsvækkere kan foretages ved opvarmning til 60°C i et tidsrum på 10 timer.

Ved hjælp af denne arbejdsmåde kan yderligere efter varme-inak-tiveringstrinnet opløsningen indeholdende antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-heparinoidkomplekset behandles med et proteinfældningsmiddel, nemlig i en koncentration, der er tilstrækkelig til at fjerne uønskede proteiner, men lader komplekset selv forblive i opløsning.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af følgende eksempler.

Eksempel I

Fremstilling af antithrombin III-heparinkompleks ud fra plasma g

Til 100 liter plasma sattes 8 x 10 E heparin efter fjernelse af kryopræcipitatet, og der blev omrørt i 30 min. ved +4°C. Efter indrøring af 100 g "DEAE-Sephadex A 50" blev der omrørt i yderligere 2 timer ved +4°C. Den fyldte gel fraskil 4 DK 167271 B1 tes ved hjælp af Biichner-tragt og blev til fjernelse af led-sageproteiner vasket med 2 liter af et phosphat-citratpuf-ret isotonisk kogsaltopløsning med en pH-værdi på 7,5. Den fyldte, vaskede gel blev suspenderet i 2,2 liter af den ovenfor nævnte puffer, og ved tilsætning af fast NaCl indstillede en ledningsevne på 42 mS/cm. Efter 1 times omrøring ved +4°C blev der fraskilt ved hjælp af Biichner-tragt og efter-vasket med 0,7 liter af en phosphat- og citratpufret kogsaltopløsning med en ledningsevne på 42 mS/cm.

Fra de forenede eluater blev antithrombin III-heparinkomplek-set udfældet ved tilsætning af 1,4 kg amraoniumsulfat og indstilling af pH-værdien til 5,5. Den herved benyttede ammo-niumsulfatkoncentration på 430 g/liter svarer til en 80% mætning af opløsningen. Efter 1 times omrøring ved +4°C blev bundfaldet fraskilt ved hjælp af filtrering og sammen med 13,5 NaCl og 221 g Na^-citrat · 2 H2O opløst i 1,5 liter destilleret vand.

pH-værdien blev indstillet til 7,5, og til inaktivering af eventuelt tilstedeværende hepatitisvira blev der opvarmet til 60°C i 10 timer.

Det pasteuriserede produkt blev dialyseret mod 50 liter isotonisk kogsaltopløsning, og til yderligere rensning blev 303 g ammoniumsulfat pr. liter indrørt ved en pH-værdi på 7,0.

Den herved benyttede ammoniumsulfatkoncentration på 270 g/liter svarer til en 50% mætning af opløsningen. Efter 45 min. omrøringstid ved +4°C blev bundfaldet fjernet ved centrifugering og bortkastet.

Den ovenstående væske blev dialyseret mod 100 liter af en extratpufret, isotonisk kogsaltopløsning og ved hjælp af ultrafiltrering koncentreret til et antithrombin III-indhold på 50 E/ml.

5 DK 167271 B1

Efter dialyse mod en citratpufret, isotonisk kogsaltopløsning blev der sterilfiltreret, fyldt på flasker og frysetørret .

De enzymatiske aktiviteter af antithrombin III og heparin blev afprøvet på følgende måde:

Enzymatisk aktivitet af antithrombin III:

Aktiviteten blev regnet i forhold til et standardpræparat, der var indstillet mod antithrombin III-plasma humant (1.

Int. R.P. 72/1). Med dette standardpræparat konstateredes en justeringskurve, på hvilken de til afprøvning bestemte prøver blev aflæst.

Fortyndingen af prøverne og af standarden til aktiviteter mellem 0,0125 og 0,0625 E/ml skete med en pufferopløsning med følgende sammensætning: 3.03 g Tris Λ 10,8 g NaCl l , . , „ 0 .

^ pr. liter, pH 8,4

1.4 g Na-EDTA

3000 E heparin „

Pipetteringsskema:

a) 0,1 ml prøve blev opvarmet til 37°C

b) 0,1 ml thrombin (12 IE/ml) blev tilsat, og der inkuberedes i 3 min. ved 37°C

c) 0,1 ml af en 1,2 mM opløsning af TH-1 (1 AcOH·H-D-CHG-Ala-Arg-pNA) blev tilsat d) efter nøjagtigt 1 min. ved 37°C blev reaktionen standset ved tilsætning af 1,0 ml 20% eddikesyre e) ekstinktionen ved 405 nm blev målt.

Enzymatisk aktivitet af heparin:

Aktiviteten blev regnet i forhold til et standardpræparat, der var indstillet mod det 3. Int. Stand. Heparin 65/69. Med dette standardpræparat konstateredes en justeringskurve, på hvilken de til afprøvning bestemte prøver blev aflæst.

6 DK 167271 B1

Fortyndingen af prøverne og af standarden til aktiviteter fra 0,001 til 0,5 IE/ml skete med en pufferopløsning med følgende sammensætning: 6,06 g Tris j 18,12 g NaCl ( pr. liter, pH 8,3

2,79 g Na-EDTA J

Pipetteringsskema:

a) 0,2 ml prøve og 0,2 ml heparinfrit antithrombin III (3 E/ml) blev inkuberet i 20 min. ved stuetemperatur og i 3-5 min. ved 37°C

b) 0,2 ml thrombin (20 IE/ml) blev tilsat, og der blev inkuberet i 1,5 min. ved 37°C

c) 0,2 ml af en 1,2 mM. opløsning af TH-1 blev tilsat d) efter nøjagtigt 1 min. ved 37°C blev reaktionen standset ved tilsætning af 0,2 ml 50% iseddike e) ekstinktionen blev målt ved 405 nm.

Derved opnåedes for det ifølge eksempel 1 opnåede slutprodukt et heparinindhold på 5-7 heparinenheder pr. antithrombin III.

Eksempel 2

Fremstilling af et antithrombin III-heparinoidkompleks

Til 1 liter plasma sattes 3 g af det heparinoide pentosan-polysulfat-natriumsalt (polyanion SP 54), hvorpå der blev omrørt i 30 min. ved +4°C. Efter indrøring af 2,5 g "DEAE-Sephadex A 50" blev der omrørt i yderligere 2 timer ved +4°C. Den fyldte gel blev fraskilt ved hjælp af Buchner-tragt og til fjernelse af ledsageproteiner vasket to gange, hver gang med 200 ml af en phosphat- og citratpufret isotonisk kogsaltopløsning. Den fyldte, vaskede gel blev suspenderet i 100 ml af den ovenfor nævnte puffer, og ved tilsætning af fast kogsalt indstilledes en ledningsevne på 60 mS/cm. Efter 1 times omrøring ved +4°C blev der fraskilt ved hjælp af Buchner-tragt, og antithrombin III-SP 54-komplekset blev udvundet.

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et antithrombin III-hepa-rin- eller antithrombin III-heparinoidkoncentrat, ved hvilken humant plasma eller antithrombin III-holdige plasmafraktioner under dannelse af et antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-heparinoidkompleks tilsættes heparin eller heparinoid, kendetegnet ved, at det dannede antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-heparinoidkom-pleks adsorberes til en anionbytter, at adsorbatet elueres ved hjælp af en saltopløsning, at det i eluatet indeholdte antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-heparinoid-kompleks skilles fra salte og uønskede proteiner, og at det opnåede produkt bringes på holdbar form ved hjælp af lyofili-sering.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at adsorbatet vaskes før elueringen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at eluatet behandles med proteinfældningsmidler, såsom ammoniumsulfat, i en koncentration, der er tilstrækkelig til at udfælde antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-heparinoidkomplekset, hvorpå bundfaldet opløses, og opløsningen inaktiveres og derpå lyofiliseres. DK 167271 B1

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at opløsningen indeholdende antithrombin III-heparin- eller antithrombin III-heparinoidkomplekset efter varmeinaktive-ring behandles med et proteinfældningsmiddel, såsom ammoniumsulfat, i en koncentration, der er tilstrækkelig til at fjerne uønskede proteiner, men som lader selve komplekset forblive i opløsning.