DK163516B

DK163516B - N-acetyl-beta-d-glucosaminider, deres anvendelse til bestemmelse af n-acetyl-beta-d-glucosaminidaseaktivitet og et diagnostisk udstyr, som kan benyttes hertil

Info

Publication number: DK163516B
Application number: DK115282A
Authority: DK
Inventors: Yasunao Ogawa; Akira Noto; Sachio Mori; Mitsuru Yoshioka
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1981-03-17
Filing date: 1982-03-16
Publication date: 1992-03-09
Also published as: EP0060793A1; EP0060793B1; DE3260690D1; JPS637196B2; KR870001924B1; KR830009136A; GB2095666A; GB2095666B; DK115282A; JPS58994A; US4433139A; DK163516C

Description

DK 163516 B

i

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte N-acetyl-£-D-glu-cosaminider, deres anvendelse til bestemmelse af N-acetyl-/3-D-glucosami-nidaseaktivitet og et diagnostisk udstyr, som kan benyttes hertil.

N-acetyl-/?-D-glucosaminidase (forkortet NAGase) er et enzym i lyso-5 som, som i rig mængde er indeholdt i det renale tubulære epithelium, og det er knyttet til nedbrydningen af mucopolysaccharider og glycoprotei-ner. Man ved, at NAGase-aktivi teten i urin øges ved forskellige nyrelidelser eller efter en nyreoperation, og at NAGase-aktiviteten i såvel urin som serum øges ved diabetes. I forbindelse med kliniske forsøg og 10 dyreforsøg har man været interesseret i at måle NAGase-aktiviteten i forbindelse med diagnose af forskellige nyrelidelser og også som en indikator ved undersøgelse af nephrotoxicitet.

Inden for den kendte teknik er p-nitrophenyl-N-acetyl-jS-D-glucos-aminid (Biochemical Preparations, 10, 118 (1963)) og 4-methylumbellife-15 ryl-N-acetyl-/3-D-glucosaminid (Clinica Chimica Acta, 69 (1), 85-91 (1976)) generelt blevet anvendt ved bestemmelse af NAGase-aktiviteten. Anvendelsen af førstnævnte har imidlertid en ulempe, idet biokomponenter, såsom bil!i rubin og hæmolytisk hæmoglobin interfererer med målingen ved den bølgelængde, der anvendes for at opnå blindmålingen for hver 20 prøve, og dermed komplicerer måleproceduren. Anvendelsen af sidstnævnte har også en ulempe, idet der kræves specielt apparatur, såsom et fluoro-fotometer. Den foreliggende opfindelse er et resultat af omfattende undersøgelser med henblik på at finde substrater til bestemmelse af NAGase-aktiviteten, med hvilke målingen kan gennemføres med stor følsom-25 hed, præcist og hurtigt uden de ovenfor nævnte ulemper. I japansk offentliggjort patentansøgning nr. 51-114990, etc. er det blevet beskrevet, at phenolphthaleinyl-N-acetyl-^-D-glucosaminid, der strukturelt er analogt med forbindelserne ifølge opfindelsen, kan anvendes til bestemmelse af NAGase i saliva hos gravide kvinder. Dette reagens har imidler-30 tid ulemper, idet det er uopløseligt i analysepufferen, og selv efter sol ubi li sering med et solubiliseringsmiddel giver analysereaktionen en ustabil farve, som er tilbøjelig til hurtigt at falme. Som det vil fremgå af de senere anførte forsøgsresultater er forbindelserne ifølge opfindelsen fri for sådanne ulemper.

35 De hidtil ukendte N-acetyl-Ø-D-glucosaminider ifølge opfindelsen fremstilles let ud fra l-chlor-l-deoxy-2,3,4,6-tetraacetyl-or-D-glucos-amin og den tilsvarende aglycon, og de anvendes som substrater til bestemmelse af NAGase-aktiviteten i urin eller serum opsamlet fra menne- 2

DK 163516 B

sker eller dyr. Ved hjælp af N-acetyl-/?-D-glucosaminiderne ifølge den foreliggende opfindelse kan NAGase-aktiviteten bestemmes kolorimetrisk.

De hidtil ukendte N-acetyl-Ø-D-glucosaminider ifølge opfindelsen har den almene formel (I) 5 R2 fQ.

CH OH \_/ T'NsO -OY"

L_o ou_/\\—C

i/ N>==/ JL r1 (I)

10 hoNL# O

NHCOCH^ r3 || \2 · 12 3 15 hvori R , R og R hver især er hydrogen, lavere al kyl eller halogen, og 2 Y er et alkalimetal.

12 3

I ovennævnte definition af formlen (I) betyder det af R , R og R

repræsenterede lavere alkyl ligekædet eller forgrenet alkyl med 1-4 car- bonatomer såsom methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl og isobutyl, 20 hvor specielt methyl og isopropyl foretrækkes. Halogen betyder fluor, chlor, brom eller i od, hvor specielt chlor eller brom foretrækkes. Det 2 af Y repræsenterede alkalimetal betyder lithium, natrium eller kalium.

Forbindelserne (I) ifølge opfindelsen fremstilles let ud fra 1-chlor-l-deoxy-2,3,4,6-tetraacetyl-a-D-glucosamin vist ved formel (II) og 25 en aglycon vist ved formel (III).

R2 R1 Cl n 30 AcO-1 \/ kYvf°2 -p-»

Ac0\f_/éi p jf 1

NllAc 35 (II) (XII) 3

DK 163516 B

λ ? 3 hvori R , R og R har den ovenfor anførte betydning, og Ac er acetyl.

Forbindelse (II) er kendt og er beskrevet i Biochemical Preparations 10, 118 (1963).

Forbindelse (III) er udvalgt blandt i handelen tilgængelige titre-5 ringsindikatorer, som bliver røde eller purpur-blå i en alkalisk opløsning (ca. pH 10-11), såsom phenolrødt (phenolsulfonphthalein) [R*=R2=R3=H], cresolrødt (o-cresolsulfonphthalein) [R1*R2»H, R3=CH,],

1 7 3 J

meta-cresolpurpur (m-cresolsulfonphthalein) [R =CH,, R =R =H], chlor-phenolrødt (dichlorphenolsulfonphthalein) [R =R =H, R =C1], etc., hvor 10 specielt phenolrødt og meta-cresolpurpur foretrækkes. Alle ovennævnte aglyconer har et absorptionsmaksimum ved en bølgelængde over 550 nm, og der er ikke behov for nogen blindmåling på prøver.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan fremstilles ved hjælp af følgende reaktionssekvens.

15 4

DK 163516B

(in) Første trin Base Ψ r2 f ^rYRl tiv) r2 r1 rpj "°Ί ]={ «_i-» O’^Vy'1

Andet trin AcO N V ji 2 NHAc R3^V^R 0 (V) ✓ ✓ ✓

Tredie trin , · 1 ✓

NHAc ““ R X R

(i) <- (VI)

Fjerde trin 5

DK 163516 B

12 3 12 hvori R , R , R og Ac har samme betydning som ovenfor, Y og Y er alkali metaller, og Z er acyl.

Første trin 5 Dette trin omfatter spaltning af sul fonri ngen i forbindelse (III) til frembringelse af di-al kalimetal saltet, og reaktionen opnås let ved behandling med base. Det er hensigtsmæssigt som base at anvende et al kali metal hydroxid eller -alkoholat. F.eks. kan lithiumhydroxid, natriumhydroxid, kaliumhydroxid, natriummethyl at, natriumphenolat etc. anvendes, 10 og specielt natriumhydroxid og natriummethyl at foretrækkes.

I stedet for ovennævnte trinvise reaktion kan omsætningen af forbindelse (II) med (III) gennemføres i nærværelse af en base i et passende opløsningsmiddel, fortrinsvis i et polært opløsningsmiddel, mere foretrukket i acetone til frembringelse af forbindelsen (V).

15

Andet trin

Dette trin omfatter dannelse af en etherbinding, hvilket opnås ved omsætning af forbindelse (II) med (IV). Som opløsningsmiddel kan acetone, dimethyl formamid, dimethyl sul foxid etc. anvendes. Særligt foretruk-20 ket anvendes dimethyl formamid under vandfri betingelser. Omsætningen kan gennemføres ved stuetemperatur eller under køling, og den afsluttes i almindelighed i løbet af ti timer eller mere.

Efter afslutning af omsætningen adskilles produktet let fra den uomsatte udgangsforbindelse (IV) ved syrebehandling. Som syre kan an-25 vendes en svagt sur og kationisk ionbytterharpiks som "Amberi i te® IRC-50" ud over uorganiske syrer som fortyndet saltsyre, fortyndet svovlsyre og fortyndet salpetersyre.

Tredie trin 30 Dette trin omfatter acylering af produktet (V) fra det andet trin til rensningformål, men dette trin kan udelades, når arten af aglyconen og reaktionsbetingelserne tillader det. Hvad acyleringen angår, er ace-tylering særligt foretrukket, og omsætningen kan gennemføres med en ækvimolær eller svagt overskydende mængde eddikesyreanhydrid i et pas-35 sende opløsningsmiddel, fortrinsvis i pyridin. I almindelighed afsluttes omsætningen i løbet af ti timer eller mere ved stuetemperatur.

6

DK 163516B

Fjerde trin I dette trin elimineres acetyl grupperne bortset fra N-acetyl gruppen (O-acetylgrupperne) eller de alternative O-beskyttende grupper, og reaktionen gennemføres ved behandling med base. Som base er et al kalimetal-5 alkoholat hensigtsmæssigt, og specielt natriummethyl at foretrækkes. Reaktionen gennemføres sædvanligvis under køling, fortrinsvis til en temperatur på 0 - 10eC, og afsluttes i løbet af ti timer eller mere.

Efter afslutningen af reaktionen behandles produktet med en syre for at fjerne den overskydende base.

10 Det er muligt at gennemføre hvert af de ovenfor nævnte trin i en enkelt reaktionsbeholder. F.eks. behandles forbindelse (III) med et alkali, forbindelse (II) tilsættes, og acetyl fjernes så ved alkalihydrolyse efterfulgt af syrebehandling til frembringelse af forbindelse (I).

Udstyret ifølge opfindelsen til bestemmelse af NAGase-aktivitet er 15 ejendommeligt ved, at det består af følgende artikler: I) Et substratreagens i form af en forbindelse (I) ifølge opfindelsen, eventuelt i blanding med borax, II) et puffermiddel, som kan indstille pH til 3,5-6,0, samt III) et alkalisk middel, som kan indstille pH til 10-11.

20 Substratreagenset i I) betyder selve substratet, som er forbindelse (I) eller en blanding af forbindelse (I) og borax. Det foretrækkes, at dette reagens lyofiliseres, opbevares i tætlukkede ampuller eller flasker og opløses i en pufferopløsning umiddelbart før brug til opretholdelse af et specificeret pH-område, d.v.s. et puffermiddel ifølge II).

25 Puffermidlet ifølge II) betyder et middel, med hvilket pH-området under NAGase-reaktionen holdes på 3,5 - 6,0, mere foretrukket 4,0 - 5,5.

Der kan f.eks. anvendes en citratpuffer, en borax-citratpuffer, en ci-trat-phosphatpuffer etc. opløst i destilleret vand. Hvis der anvendes en borax-citratpuffer, hvilket foretrækkes specielt, forløber substratets 30 reaktion med NAGase lineært med tiden i de første 30 minutter ved 37°C, mens substratets hydrolyse undertrykkes, hvorved substratblindprøvens absorbans sænkes, og grænsen for påvisning af NAGase udvides. Såfremt substratreagenset anvendes blandet med borax, kan samme virkninger opnås ved anvendelse af citratpufferen. Brugen af citrat-phosphatpuffer er be-35 grænset til urin, fordi lag-fasen viser sig ved NAGase-analyse af serum.

Det alkaliske middel ifølge III) betyder et middel, som kan indstille analyseopløsningens slut-pH til 10-11. F.eks. kan natriumcarbo-nat, kaliumcarbonat, natriumhydroxid, kaliumhydroxid, borat-natrium-car- 7

DK 163516 B

bonat etc. vælges, og de kan opløses i destilleret vand umiddelbart før brug. For at undertrykke hydrolysen af substratet foretrækkes borat-na-triumcarbonatpufferen specielt.

Forbindelserne (I) ifølge opfindelsen kan anvendes som substrater 5 til bestemmelse af NAGase-aktivi teten i urin eller serum opsamlet fra mennesker eller dyr.

Måleprincip Når en prøve inkuberes med forbindelse (I) anvendt som substrat i 10 et specificeret tidsrum i en pufferopløsning, der holder systemets pH surt (pH 3,5 - 6,0, især 4,0 - 5,5), hydrolyserer NAGase i prøven substratet (I) og giver aglyconen (VIII) og N-acetylgiucosamin (VII) som vist i det følgende. Den resulterende blanding indstilles til pH 10-11 med en alkalisk opløsning for at ændre aglyconen (VIII) til det farvede 15 di-alkalisalt vist ved formlen (IV), og den resulterende farve måles ko-lorimetrisk med et spektrometer.

DK 163516 B

e R2 R1^ CH20H W J^sOj-OY2 i-%0-O-Cy \oh / r6 rrr r1 HOy_y R 3 i i , NHCOCH ]| J 0

(D

NAGase Φ

CH20H

J——O r2 R1 IIJs. 9 r \ )—( ‘i so2-oy2 (oh >~^0H + H0_// \)-c η°γί jL·.r1

(VII) S

(VIII)

Alkali Φ r2 r1 W y^SO^OY1 Y^-0—U -c irVRl

R I I

«3^»! 0 (IV) hvori R1, R2, R3, Y1 og Y2 har samme betydning som ovenfor.

9

DK 163516 B

Målemetode I et 10 ml reagensglas anbringes 1,0 ml af substratopløsningen (2 -6 mM/L), og efter forinkubation ved 37*C i 5 minutter tilsættes 50 /il af en prøve*, og blandingen inkuberes ved 37eC i x minutter. Efter inkuba-5 tion afbrydes reaktionen ved tilsætning af 2,0 ml af den alkaliske opløsning, og slutopløsningens absorbans måles ved den bølgelængde, der giver maksimal absorption af den resulterende aglycon inden for en time under anvendelse af destilleret vand eller luft som reference. Substrat-blindprøven kan fås ved i stedet for prøven at anvende 50 μ\ destilleret 10 vand.

*Note: Prøve: urin eller serum opsamlet fra mennesker eller dyr, der fortrinsvis analyseres umiddelbart efter opsamlingen. Når det er nødvendigt at opbevare prøven i et langt tidsrum, indstilles dens pH til 6,5 med 2N saltsyre eller 2N kaliumhydroxid. I denne tilstand kan 15 NAGase-aktiviteten i prøven holdes stabil i én dag ved stuetemperatur og i fire måneder ved -20’C.

Den mængde NAGase, der frembringer 1 /tmol af aglyconen (VIII) ud fra (I) pr. minut defineres som 1 enhed (u).

20 Beregning af koncentrationen af enzymet NAGase-koncentrationen i prøven beregnes ud fra følgende ligning: NAGase-koncentrat!on i prøve (u/L) ΔΕ 1 1000 25 = - X 3,05 X — X - e x d x 0,05 4E E1 - E2

Ej * slutopløsningens absorbans 30 Eg * substratbi indprøvens absorbans d = længde af lysvej (cm) e = ekstinktionskoefficient (cmg/μΜ) for aglyconen (VIII) ved den anvendte bølgelængde x = reaktionstiden (minutter)

Et tidsrum på 10 - 30 minutter og fortrinsvis 10 - 15 minutter er hensigtsmæssigt ved denne analyse.

35

DK 163516 B

10

Standardkurve

Som vist i afsnittet "målemetode" sættes en specificeret mængde NAGase til en substratopløsning af forbindelserne (I), og den resulterende blanding får lov til at reagere, hvorved aglyconen (VIII) fås. Så 5 frembringes standardkurven ud fra forholdet mellem aglyconmængde (VIII) og NAGase-enhed. F.eks. bestemmes NAGase-aktiviteten med et udstyr, som indeholder natrium-m-cresolsulfonphthaleinyl-/)-D-glucosaminid (I) (R^CHg, R^=R^=H, Y^=Na) (forkortet MCP-NAG) som substrat, og forholdet mellem NAGase-enhed og mængde frigjort MCP [meta-cresolpurpur (m-cresol-10 sulfonphthalein)] fås som vist i fig. 1.

Fig. 1 viser, at NAGase-bestemmelsen er mulig ved koncentrationer op til 200 u/L, når MCP-NAG er substrat.

Præcision 15 Analysens reproducerbarhed undersøges ved multiple bestemmelser under anvendelse af en specificeret NAGase-opløsning. Variationskoefficienten er 1,95%, hvilket indikerer høj reproducerbarhed af denne analyse.

20 Normal værdi Når NAGase-aktiviteten i urin bestemmes for 26 raske personer (mænd: 14, kvinder: 12) ved MCP-NAG-metoden, er aktiviteten 1,13 - 13,10 u/L for mænd og 0,68 - 5,20 u/L for kvinder. Det er blevet rapporteret i Clinica Chimica Acta 73, 453 (1976), at den gennemsnitlige aktivitet er 25 8,1 u/L (1,5 - 29,8 u/L) for urin opsamlet i løbet af 3 timer tidligt om morgenen.

Sammenligning med kendt teknik NAGase-aktiviteten fra oksenyre bestemmes ved MCP-NAG-metoden 30 ifølge opfindelsen i sammenligning med fremgangsmåden, ved hvilken der anvendes p-nitrophenyl-N-acetyl-Ø-glucosaminid som substrat (PNP-NAG-me-toden). Fig. 2 viser forholdet imellem dem. Bestemmelsen af NAGase-aktiviteten ved PNP-NAG-metoden gennemføres, som følger.

I et 10 ml reagensglas anbringes 1,0 ml af reagens-I opløsningen^ 35 og efter forinkubation i 10 minutter ved 37°C tilsættes 50 /il urin, og blandingen inkuberes ved 37°C. Efter 30 minutter afbrydes reaktionen ved tilsætning af 2,0 ml af reagens-II opløsningen^. Derefter måles absor-bansen ved 405 nM inden for 2 timer under anvendelse af destilleret vand

DK 163516B

11 eller luft som reference. For at måle den urinbi indprøve, der er nødvendig for hver prøve, anvendes 1,0 ml af reagens-III opløsningen”^ i stedet for reagens-I opløsningen, og fremgangsmåden gennemføres på samme måde. Substratblindprøven fås ved at gennemføre fremgangsmåden under an-5 vendel se af reagens-I opløsningen (1,0 ml), destilleret vand (50 /il), og reagens-II opløsningen (2,0 ml).

Noter: i) 5 mM substratopløsning (0,05 M citrat-phosphat- puffer, pH 4,40) 10 ii) 0,2 M borat-natriumcarbonatpuffer (pH 10,5) iii) 0,05 M citrat-phosphatpuffer (pH 4,40) NAGase-koncentrationen i prøven beregnes ud fra følgende ligning: NAGase-koncentration i prøve (u/L) 15 ΔΕ X 3,05 1 1000 = - X - X - 18,19 x d 30 0,05 20 ΔΕ = Ej - (E2 + E3)

Ej = slutopløsningens absorbans E2 = urinbiindprøvens absorbans E3 = substratblindprøvens absorbans 25 d længde af lysvej (cm)

Som vist i fig. 2 er det klart, at der er en god korrelation mellem MCP-NAG-metoden og PNP-NAG-metoden. Den ved MCP-NAG-metoden bestemte aktivitet er imidlertid ca. 4% højere end den aktivitet, der opnåedes ved 30 at gennemføre PNP-NAG-metoden på samme prøve.

Opfindelsen beskrives nærmere i de følgende eksempler.

12

DK 163516B

Eksempel 1

Natrium-phenol sul fonphthaleinyl-N-acetyl -jS-D-glucosami nid

O

k^~so2 s/ (1) g

I S03Na C J

g

AcO AcO— r—^ I SO Na (/l—°\ 4 ^ ^ΟχΟ-^- <j 3 \?Ac Φ * K0Ac /1 il il

AcO I C1 (2) Ac0 - Η

NHA c T

NHAc O

2 i li3> ri _ gg..,.. 0„^xr! Λ v -¾ ~ Φ NHAc 11 OAc 6 ^

DK 163516B

13 (1) I IN methanol i sk natriummethoxidopiøsning (2,0 ml, 2,0 mmol) opløses phenol sulfonphthalein 1 (373 mg, 1,05 mmol), og methanol fjernes under reduceret tryk ved en temperatur under 35*C. Benzen sættes til remanensen, det faste stof knuses, og opløsningsmidlet afdampes under re- 5 duceret tryk ved en temperatur under 35eC. Denne fremgangsmåde gentages to gange, og den resulterende remanens tørres i tre timer under reduceret tryk, hvorved di-natriumsaltet af phenol sul fonphthalein 2 fås.

(2) Det ved ovenstående fremgangsmåde opnåede di-natriumsalt 2 blandes så godt som muligt med DMF (10 ml), hvorved der fås en blåviolet 10 blanding. l-chlor-l-deoxy-2,3,4,6-tetraacetyl-a-D-glucosamin 3 (366 mg, 1,0 mmol) [Biochemical Preparations 10; 118 (1963)] tilsættes under omrøring, hvorved der fås en rødviolet næsten klar opløsning. Opløsningen omrøres i ca. 30 minutter ved stuetemperatur og henstår natten over (18 timer) ved 5*C. "Amber!ite® IRC-50" (2 ml) vasket med methanol sættes 15 dertil, og blandingen omrøres i 30 minutter og filtreres. Bundfaldet vaskes med methanol. Filtratet og vaskevæskerne kombineres og inddampes under reduceret tryk. Toluen sættes til remanensen, og opløsningen inddampes til tørhed, igen under reduceret tryk. Remanensen opløses i methanol og adsorberes på silicagel (3 g), og efter fjernelse af methanol 20 underkastes remanensen kromatografi (stationær fase: 30 g silicagel; opløsningsmiddelsystem: ethylacetat-ethylacetat - methanol = 3:1), hvorved der fås en fraktion (540 mg), der som hovedkomponent indeholder natrium-phenol sulfonphthaleinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-Ø-D-glucosaminid 4.

(3) Til den ved ovenstående fremgangsmåde (2) opnåede fraktion 25 sættes en blanding af eddikesyreanhydrid (4,5 ml) og pyridin (7 ml). Efter henstand natten over tilsættes methanol (2 ml) under omrøring og køling. Den resulterende blanding henstår i 1 time, og opløsningsmidlet fjernes under reduceret tryk. Toluen sættes til remanensen, og blandingen inddampes til tørhed under reduceret tryk. Denne fremgangsmåde gen-30 tages to gange, og methylenchlorid sættes til den resulterende remanens for at opnå en opløselig fraktion (ca. 540 mg). Denne fraktion giver to hovedpletter på tyndt!agskromatogram. Adskillelse ved søjle-kromatografi [stationær fase: silicagel (8,5 g); opløsningsmiddelsystem: benzen-ethylacetat = 1:2] giver 0,0-diacetylphenolsulfonphthalein (første 35 fraktion) og 0-acetylphenolsulfonphthaleinyl-2,3,4,6-tetra-acetyl-^-D-glucosaminider 5 (anden fraktion) som et næsten farveløst skumagtigt materiale. Udbytte 42%.

Produktet 5 renses yderligere ved søjlekromatografi (stationær fa- 14

DK 163516B

se: silicagel; opløsningsmiddel system: benzen-ethylacetat *1:2), hvilket giver et rent produkt 5.

IR: i/CHC13 1750, 1689 cm'1 g max NMR:5CDC13 1,86 (s, 3H), 2,03 (s,9H), 2,29 (s, 3H) 3,7 - 4,4 (4H), 5,10 (t,J=9,5 Hz, IH), 5,36 (d,J=8,0 Hz, IH), 5,43 (t,J=9,5 Hz, IH), 6,24 (d,J=9,0 Hz,IH) 6,8 - 8,0 (12H) 10 [a]d =-6,3+ 0,3° (C = 1,956, CHClg) (4) I tør methanol (4 ml) opløses det ved ovenstående fremgangsmåde (3) opnåede produkt 5 (308 mg, 0,424 mmol), og IN methanolisk natrium-methoxidopløsning (0,85 ml, 0,85 mmol) sættes dertil. Den resulterende 15 røde opløsning henstår i 15 timer ved 5*C. "Amberlite® IRC-50" (1,5 ml) fugtet med methanol tilsættes, og blandingen omrøres i 1,5 time. Det faste stof opsamles ved filtrering og vaskes med methanol. Filtrat og vaskevæsker kombineres og inddampes under reduceret tryk, hvilket giver en orange pulveragtig remanens. Dette produkt renses ved søjlekromatografi 20 [stationær fase: silicagel (1,5 g); opløsningsmiddelsystem: ethylacetat - methanol 2 :1], hvilket giver natrium-phenolsulfon-phthaleinyl-N-ace-tyl-^-D-glucosaminid 6 (209 mg) som stærkt hygroskopisk orange pulver.

Udbytte:89%.

25 IR: /Br -3350 (br), 1665 (sh), 1625 cm'1 max NMR:5CD30D 1,95 (s, 3H), 3,3 - 4,2 (6H), 5,12 (d,J=8,0 Hz, IH) 6,0 - 6,6 (2H), 6,8 - 7,8 (9H) 7,9 - 8,3 (IH) UV: λΗ2° 262 nm (e = 10300), 408 nm (e = 22400) C = 30 16,94 /ig/ml) TLC ("Merk precoated Kieselgel", ethylacetat: methanol =2:1) Rf-værdi: ca. 0,14 [a]p3= + 35,9 ± 0,8* (C = 1,039, methanol).

15

DK 163516 B

Eksempel 2

Natrium-m-cresolsulfonphthaleinyl-N-acetyl-^-D-glucosaminid 9>,

HOOH

v/l) ^^S03Na CH_ r CH„

ίΊ lS

Na0^ a ° Π <iH3 ^fSo.Na

AcO— AC° /}—Λ ' ^

/—°\ x/ \0_\=/ S

Æa aA Jfc? Λη

NHAc . NHAc X

2 2 0 ch3Q «η ^ J AT3 V>2 /—o o-fZy ί ^- ((oaT )} (A™3

(o„ ( w <*> J^Y O

h°vA v ^ L

o 12 11 16

DK 163516B

(1) Ved at følge den i eksempel 1 (1) beskrevne fremgangsmåde fås di-natriumsalt af m-cresolsulfonphthalein 8 ud fra m-cresolsulfon-phtha-lein 7 (4,02 g, 10,5 mmol), og IN methanol isk natriummethoxidopløsning (20 ml, 20 mmol).

5 (2) Det ovenfor opnåede di-natriumsalt 8 blandes så godt som mu ligt med DMF (50 ml), hvorefter l-chlor-l-deoxy-2,3,4,6-tetraacetyl-ar-D-glucosamin 3 (3,66 g, 10 mmol) tilsættes under omrøring, hvorved fås en rødviolet næsten klar opløsning. Opløsningen opbevares ved 5eC i 16,5 timer, og når "Amberiite® IRC-50" (25 ml) fugtet med methanol sættes 10 dertil, bliver farven rødbrun. Efter omrøring i 30 minutter filtreres blandingen, og det faste stof vaskes med methanol. Filtratet og vaskevæskerne kombineres og inddampes. Så fjernes DMF ved azeotrop destillation med toluen, og remanensen opløses i methanol (25 ml). Opløsningen blandes med silicagel (25 g), methanol afdampes godt, og remanensen 15 underkastes søjlekromatografi (stationær fase: silicagel). Fraktionen, som elueres med ethylacetat (2,3 L) bortkastes, og efterfølgende elue-ring med methanol (0,8 L) giver en fraktion, som indeholder natrium-m-cresolsulfonphthaleinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-0-D-glucosaminid 9 som hovedkomponent.

20 (3) Til den ved ovenstående fremgangsmåde (2) opnåede fraktion sættes en blanding af eddikesyreanhydrid (50 ml) og pyridin (70 ml). Efter opbevaring natten over oparbejdes blandingen på samme måde som beskrevet i eksempel 1 (3). Den opnåede remanens giver to pletter på tyndtlagskromatogram. Adskillelse ved søjlekromatografi [stationær fase: 25 silicagel (100 g), opløsningsmiddel system: benzen-ethyl acetat = 1:2] giver 0,O-di acetyl-m-cresolsulfonphthalein (første fraktion), og O-acetyl -m-cresolsulfonphthaleinyl-2,3,4,6-tetra-acetyl-Ø-D-glucosaminid 10 (4,50 g) (anden fraktion) som et lysegult skumagtigt materiale. Udbytte: 60%.

30 IR: i/CHC13 1747, 1688 cm'1 max NMR:6CDC13 1,88 (s, 3H), 2,02 (s, 9H), 2,12 (s, 6H) 2,27 (s, 3H), 3,7 - 4,4 (4H), 5,10 (t, J=9,5 Hz, IH), 35 5,32 (d, J=8,0 Hz,IH), 5,43 (t, J=9,5 Hz, IH), 5,98 (d, J=9,0 Hz, IH) 6,8 - 8,0 (10H)

[a]n4’5= M (c - 0,977, CHCV

[a]3655= + 2,8 ± 0,4 (C= 0,977, CHC13) 17

DK 163516B

(4) I tør methanol (100 ml) opløses det ved ovenstående fremgangsmåde (3) opnåede produkt 10 (4,42 g, 5,86 mmol), og IN methanolisk na-triummethoxidopløsning (11,72 ml, 11,72 mmol) sættes dertil. Den resulterende mørkebrune opløsning henstår natten over ved 5*C. "Amber!ite® 5 IRC-50" (30 ml) fugtet med methanol tilsættes, og efter omrøring i 30 minutter filtreres blandingen og vaskes med methanol. Filtrat og vaskevæsker kombineres og inddampes under reduceret tryk. Det resulterende produkt renses ved søjlekromatografi [stationær fase: silicagel (120 g); opløsningsmiddelsystem: ethylacetat-methanol =2:1], hvilket giver 10 natrium-m-cresolsulfonphthaleinyl-N-acetyl-/i-D-glucosaminid 11 (2,77g) som stærkt hygroskopisk orange pulver.

IR: vKBr -3400(br), 1660 (sh), 1620 cm'1 max 15 NMR:5CD30D 1,6 - 2,4 (9H), 3,3 - 4,2 (6H), 4,9 - 5,2 (IH) 5,9 - 8,4 (10H), [a]2j*’5= 2,6 ± 0,9° (C=l,032, CH30H) UV og SYNLIGT: λΗ2° 269 nm(c = 12200), 414 nm (e = 24000) max C = 11,80 /ig/ml) 20

Eksempel 3

Et lyofiliseret produkt af MCP-NAG og borax opløses i 0,05 M citratpuffer (pH 4,15, 50 ml) til dannelse af substratopløsning (koncentration af MCP-NAG 5,13 mM, pH 4,4). I et 10 ml reagensglas anbringes 25 1,0 ml af substratopløsningen, og efter forinkubation ved 37*C i 5 minutter tilsættes urin (50 /il). Den resulterende opløsning inkuberes ved 37*C. Efter inkubation i 15 minutter sættes en 0,3 M natriumcarbonatop-løsning (2,0 ml) dertil til fremkaldelse af det frigjorte MCPs farve, og absorbansen ved 580 nm (Ej) måles inden for 1 time under anvendelse af 30 destilleret vand eller luft som reference. Som substrat-blindprøve tilsættes destilleret vand (50 /il), og absorbansen (Eg) måles. NAGase-kon-centrationen beregnes, som følger: NAGase-koncentrat!on (u/L) AE 1 1000 35 = - X 3,05 X- X - 38 X 1 15 0,05 = ΔΕ X 107,0 18

DK 163516 B

Eksempel 4

Et lyofiliseret produkt af natrium-phenol sulfonphthaleinyl-N-ace-tyl-jJ-D-glucosaminid (PR-NA6) opløses i 0,05 M borax-citratpuffer (pH

4,4) (5 mM) til fremstilling af en substratopløsning. I et 10 ml rea-5 gensglas anbringes 1,0 ml af substratopløsningen, og efter en for-inkubation i 5 minutter ved 37eC, tilsættes humanserum (50 /il), og der omrøres øjeblikkelig. Den resulterende blanding inkuberes ved 37 *C i 10 minutter, og 0,2 M borat-natriumcarbonatpuffer (pH 10,5, 2,0 ml) tilsættes for at inaktivere enzymet og sideløbende dermed fremkalde farven af det 10 frigjorte PR [phenolrødt (phenolsulfonphathalein)]. Absorbansen ved 537 nm (Ej) måles under anvendelse af destilleret vand eller luft som reference. Som substratbi indprøve anvendes destilleret vand (50 /il) i stedet for serum, og absorbansen (Eg) måles. NAGase-koncentrationen beregnes, som følger: 15 NAGase-koncentration (u/L) ΔΕ 1 1000 = - X 3,05 X- X - 63 X 1 10 0,05 = AE X 96,8 20

Eksempel 5 PR-NAG opløses i 0,25 M borax-citratpuffer (pH 4,4) til fremstilling af en 25 mM opløsning. Den resulterende opløsning deles i 10 ml portioner, som fyldes i 50 ml glasflasker og derefter lyofiliseres. Bor-25 syre (93,7 g) og natriumcarbonat (706,3 g) formales, blandes og sigtes.

Så pakkes portioner på 1,98 g af blandingen i 120 ml polyethylenflasker med en pulverpåfyldningsmaskine.

Eksempel 6 30 Det i eksempel 5 lyofiliserede opnåede PR-NAG produkt opløses i destilleret vand (50 ml), og 1 ml af den resulterende opløsning anvendes som substratopløsning. Destilleret vand (100 ml) sættes til pulveret i den i eksempel 5 opnåede polyethylenflaske, og 2,0 ml af opløsningen anvendes som alkalisk opløsning. Substratopløsningen og den alkaliske op-35 løsning anvendes til analyse udført på samme måde som beskrevet i eksempel 4. NAGase-koncentrationen beregnes, som følger.

«

DK 163516 B

19 NAGase-koncentration (u/L) AE 1 1000 = - X 3,05 X- X - 63 X 1 10 0,05 5 = AE X 96,8

Eksempel 7

Det lyofili serede MCP-NAG-produkt, der fremstilles på samme måde som beskrevet i eksempel 5, opløses i destilleret vand (50 ml), og 1 ml 10 af opløsningen anvendes som substratopløsning. Destilleret vand (100 ml) sættes til pulveret, der er indeholdt i den i eksempel 5 opnåede poly-ethylenflaske, og 2 ml af opløsningen anvendes som alkalisk opløsning.

Substratopløsningen og den alkaliske opløsning anvendes til analyse udført på samme måde som beskrevet i eksempel 3.

15 Absorbansen måles ved 580 nm.

NAGase-koncentration (u/L) AE 1 1000 - X 3,05 X- X - 38,2 X 1 15 0,05 20 - ΔΕ X 106,46

Kort forklaring af tegningen

Fig. 1 viser forholdet mellem NAGase-aktivitet og frigjort MCP ved MCP-NAG-metoden. Den vandrette akse viser NAGase-koncentrationen (u/L), 25 og den lodrette akse viser mængden af frigjort MCP (AE 580 nm/15 minutter). Denne figur viser, at det er muligt at bestemme NAGase-aktivitet ved MCP-NAG-metoden ved koncentrationer op til 200 u/L.

Fig. 2 viser korrelationen mellem PNP-NAG-metoden og MCP-NAG-metoden. Den vandrette akse viser NAGase-koncentrationen (u/L) ved PNP-NAG-30 metoden, og den lodrette akse viser koncentrationen (u/L) med MCP-NAG-metoden.

Lineær regression Y = 1,04X + 0,02 r = 0,9997 35

Fig. 3 viser stabiliteten af den af MCP og PR fremkaldte farve i sammenligning med den af PP (kendt teknik) fremkaldte farve.

20

DK 163516B

Sammenligningsforsøg

Til dokumentation for de tidligere omtalte fordele med hensyn til opløselighed og stabilitet af den udviklede farve foretoges nogle sammenligningsforsøg mellem forbindelser ifølge opfindelsen og forbindelsen 5 natrium-phenolphthaleinyl-N-acetyl-Ø-D-glucosaminid (PP-NAG) ifølge ja pansk offentliggjort patentansøgning nr. 51-114990. Denne forbindelse har formlen 10 CL·

CHsOH. == Τ'®’«* PP-NAG

nhcoch3 KJ

» T

De undersøgte forbindelser ifølge opfindelsen var dels forbindelsen natrium-phenol sul fonphthaleinyl-N-acetyl-Ø-D-glucosaminid (PR-NAG), der 20 er den i eksempel 1 fremstillede forbindelse, som kun afviger fra førnævnte forbindelse ved, at -CO- er erstattet med -S02-. Endvidere undersøgtes en anden forbindelse ifølge opfindelsen, nemlig forbindelsen natri um-m-cresolsul fonphthaleinyl -N-acetyl-β-D-glucosaminid (MCP-NAG), der afviger fra PR-NAG ved at være substitueret. De opnåede resultater var 25 som følger:

Tabel 1 - Opløselighed »Forbindelse Opløselighed.

30 HCP-NAG Meget opløselig PR-NAG Meget opløselig PP-NAG Dårligt opløselig

Opløsning: 0,05 M citrat-phosphatpuffer (pH 4,4) 35 Temperatur: stuetemperatur * Hver testforbindelse anvendtes i form af dens natriumsalt.

DK 163516 B

21

Stabilitet af fremkaldt farve

De undersøgte forbindelser var som følger: MCP: m-cresolsulfonphthalein PR: phenol sulfonphthalein 5 PP: phenolphthalein Påvisningsmetode

Hver testforbindelse opløstes i 0,1 M borax-NaOH pufferopløsning (pH 12,0) ved stuetemperatur, og for hver testforbindelse måltes absor-10 bansen hver time under følgende betingelser:

Tabel 2

Testforbindelse Koncentration Bølgelængde (ØM) λ max (nm) 15 ....................-..................................

MCP 20 580 PR 10 560 PP 20 550 20 Resultaterne fremgår af figur 3.

Som det fremgår af figur 3 er absorbansen konstant i 6 timer med forbindelserne ifølge opfindelsen (MCP og PR), medens den kendte forbindelse (PP) giver en ustabil farve, som hurtigt falmer og efter 6 ti-25 mer giver en absorbans på kun ca. halvdelen af den oprindelige værdi.

Claims

1. N-acetyl-/i-D-glucosaminider med følgende almene formel: r\2 /a

5 T^-lo—svoy2 »oO • MHCOCH r3 ΓΙ R2 J O 10 12 3 hvori R , R og R hver især er hydrogen, lavere al kyl eller halogen, og 2 Y er et al kalimetal.

2. N-acetyl-/i-D-gl ucosami nid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at 15 det er natrium-m-cresolsulfonphthaleinyl-N-acetyl-/J-D-glucosaminid eller natri um-phenolsul fonphthaleinyl-N-acetyl -/J-D-glucosami ni d.

3. Anvendelse af et N-acetyl -/J-D-gl ucosami nid ifølge krav 1 eller 2 til bestemmelse af N-acetyl-^-D-glucosaminidaseaktivitet. 20

4. Diagnostisk udstyr til bestemmelse af N-acetyl-/J-D-glucosamini-daseaktivitet, KENDETEGNET ved, at det består af følgende artikler: I) Et substratreagens i form af en forbindelse ifølge krav 1 eller 2, eventuelt i blanding med borax,

25 II) et puffermiddel, som kan indstille pH til 3,5-6,0, samt III) et alkalisk middel, som kan indstille pH til 10-11.

5. Diagnostisk udstyr ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, at substratreagenset er et lyofili seret produkt af natrium-m-cresol-sulfon- 30 phthaleinyl-N-acetyl-/J-D-gl ucosami nid eller natrium-phenolsulfon- phthaleinyl-N-acetyl-/J-D-glucosaminid, at puffermidlet er i form af citratpuffer, borax-citratpuffer eller citrat-phosphatpuffer, og at det alkaliske middel er i form af natriumcarbonat, kaliumcarbonat, natriumhydroxid, kaliumhydroxid eller borat-natriumcarbonat. 35