DK161543B - Testanordning til reflektometrisk paavisning af en komponent i et vandigt testmedium samt analysemetode under anvendelse af testanordningen - Google Patents

Description

DK 161543 B

Den foreliggende opfindelse angår en testanordning til spektrofotometrisk analyse af en komponent i et vandigt testmedium, især en legemsvæske. Karakteristisk for anordningen ifølge opfindelsen er, at den har mindst én asym-5 metrisk, ved koagulationsmetoden fremstillet polymermembran, idet porerne mod den side, hvorpå prøven påføres, bliver snævrere, hvorhos den polymere er valgt blandt polyamider, polyamider med disulfimidgrupper, polyethercarbonater, poly-acrylonitril og polyurethaner, og at bærerlaget er makro-10 skopisk glat og fortrinsvis uigennemtrængeligt for prøven under testbetingelserne, hvorhos polymermembranen indeholder enzymholdige reagenser til påvisning af de komponenter, der skal bestemmes.

Bestemmelsen af en komponent i en væske ved hjælp af 15 "tørre" reagenser (f.eks. test- eller prøvestrimler) får især indenfor den kliniske diagnostik stadig større betydning. ‘Således foretages påvisningen af bestemte urin-, serumeller blodkomponenter såsom glucose, bilirubin, urinstof eller proteiner i tiltagende grad ved hjælp af test- eller 20 prøvestrimler. Sådanne analyser er i sammenligning med de gængse vådkemiske metoder hurtigere, simplere og billigere.

Ved de almindeligvis anvendte test- eller prøvestrimler til flydende prøver indeholdes de til bestemmelse af de søgte analytter nødvendige reagenser i et egnet, væskeop-25 tagende bærermateriale. Dersom den flydende prøve påføres denne bærer, optræder der diffusion af væsken i bærerens indre (reaktionsrum), hvorved påsningsreagenserne sammen med den prøvekomponent, der skal analyseres, f.eks. giver en specifik, koncentrationsafhængig farvning.

30 Som væskeoptagende bærermateriale har man til at begynde med anvendt simple og senere kemisk modificerede papirsorter, som blev gennemvædet med påvisningsreagenserne.

På grund af dets manglende homogenitet med hensyn til lagtykkelse og sammensætning er papir dog mindre egnet til kvan-35 titative bestemmelser.

DK 161543 B

2

Et vigtigt fremskridt inden for den kvantitative prøvestrimmel-diagnostik udgør anvendelsen af polymere bærermaterialer ved hjælp af egnede overtræksteknologier.

Således er der i DE fremlæggelsesskrift nr. 2.232.760 5 beskrevet en test- eller prøveanordning med flere lag af transparent bærer, gelatinelag og mikroporøst, fyldstofhol-digt celluloseacetatlag. Gelatinelaget indeholder reagenserne og fungerer således som reaktions- og påvisningszone. Det mikroporøse celluloseacetatlags funktion omfatter den homo-10 gene fordeling af prøven, fraskillelsen af erythrocyter og reflektering af den fra bærersiden indstrålede målestråling.

En fordel ved test- eller prøveanordninger, der indeholder gelatinelag, er, at den ved deres fremstilling anvendte overtrækningsteknologi er kendt og videreudviklet 15 teknisk fra det fotografiske område. En ulempe ved sådanne systemer, lige som også ved andre test- eller prøveanordninger, som indeholder polymere (f.eks. agarose), der kvælder i vand, er, at der ved siden af påvisningsreaktionen også foregår en kvældeproces, så at reaktionen først efter længere 20 tid falder til ro. Man kan derfor ved hurtig analyse ikke tage en slutbestemmelse i betragtning, men kun reaktionens kinetik. For at muliggøre kvantitative analyser skal prøven doseres. Gelatine er desuden ikke ideelt, fordi de biokemiske påvisningsreagenser kun har begrænset holdbarhed i gelatine, 25 og på grund af den begrænsede stabilitet af den ved påvisningsreaktionen dannede farvning (en udnyttelse af analyse efter måske flere dage er derfor ikke mulig). Desuden er gelatine ustahil over for proteaser, som almindeligvis forekommer som forurening i de til påvisningsreaktionen nødven-30 dige enzymer.

Endnu et test- eller prøvestrimmelsystem på polymerbasis til bestemmelse af indeholdte stoffer i legemsvæsker er beskrevet i EP offentliggørelsesskrift nr. 64.710. Som matrix for reagenserne fungerer her en porøs polymerfilm, 35 fremstillet ved indtørring af en latex (f.eks. en vandig polyvinylpropionat-dispersion) i nærvær af en poredanner

DK 161543 B

3 (f.eks. kieselgel). Den flydende prøve, der skal analyseres, påføres direkte på reagenslaget, som findes på en PVC-folie. Efter en bestemt tid aftørres overskuddet af prøven eller erythrocyterne, og farvereaktionen iagttages på den side, 5 der vender bort fra bæreren, og bestemmes reflektometrisk.

Det utilfredsstillende ved dette system (og helt alment ved systemer, hvor prøven anbringes direkte på reagenslaget) , er den såkaldte "udsivning". Der kan nemlig ud fra reagenslaget, især de vandopløselige (f.eks. enzymer), 10 opløses påvisningsreagenser i prøveoverskuddet, som derpå ved aftørring unddrages systemet og fører til forkerte resultater. Af denne grund er også prøvestrimmeludviklinger interessant, ved hvilke bedømmelsen er mulig via en transparent bærer, så at man undgår aftørring af prøven.

15 Det er endvidere en ulempe ved systemet ifølge EP

offentliggørelsesskrift nr. 64.710, at prøven skal virke forholdsvis længe, f.eks. 2 minutter, og at indstillingen af beregnede, især forholdsvis store porer (i området på /zm) er problematisk. Sådanne storporede systemer ville især 20 være interessante til påvisning af højeremolekylære analyt-ter.

I EP offentliggørelsesskrift nr. 71.169 beskrives der åbenporet-mikroporøst udformede formlegemer med iboende latent strukturomdannelighed, dvs. at disse formlegemer er 25 "latent transparente". Disse formlegemer kan anvendes ved analytiske og diagnostiske metoder på immunologisk basis.

Det er en ulempe, at strukturomdannelsen kun foregår forsvarligt hurtigt, når formlegemerne opvarmes til en temperatur mellem 50 og 220°C og/eller påvirkes kemisk, f.eks. med 30 acetone, eventuelt yderligere kombineret med kraftpåvirkning. Disse formlegemer kan således kun anvendes til analyseformål under de nævnte betingelser, eftersom den langsomme strukturomdannelse ellers overlejrer analysereaktionen og dermed virker generende eller ødelæggende for analysen. Enzymer, 35 som ofte anvendes ved diagnostik, denatureres og ødelægges under sådanne betingelser.

DK 161543B

4

Formålet med den foreliggende opfindelse er udviklingen af en ny testanordning, især til påvisning af komponenter i helblod, som ved enkelt håndtering giver så kvantitative resultater som muligt. En enkel håndtering er vigtig, for 5 så vidt som test- eller prøvestrimmeldiagnostikken i tiltagende omfang anvendes af ikke-fagfolk, for hvem især en nøjagtig dosering af prøvemængden eller aftørringen af prøveoverskuddet efter bestemte tidsrum er problematisk.

Testanordningen skal kunne fremstilles enkelt og med 10 ensartet kvalitet og især have følgende egenskaber: - farvereaktionens reproducerbare afhængighed af analyt-koncentrationen, intensive farvninger, hurtig reaktion (slutbestemmelse) 15 - aflæselighed fra bærersiden og (efter aftørring) fra påføringssiden, måling af helblod skal væie mulig, - god holdbarhed af farverne og hele systemet, enkelt indstilling af den ønskede porestørrelse, 20 - analyseværdiernes ufhængighed af det påførte prøve volumen, ikke-kvældende polymermatrix og ingen "udsivning".

Det har nu overraskende vist sig, at der ved hjælp 25 af membranfremstillingsmetoden ved koagulation af polymeropløsninger kan fremstilles test- eller prøveanordninger med polymerlag til prøvepåføring, som alene eller kombineret med andre elementer tilfredsstiller alle de krav, som klinisk diagnostik stiller, uden at være behæftet med de ovenfor 30 anførte mangler. Der findes et stort antal polymersystemer, der egner sig til fremstilling af membraner ved koagulationsmetoden, med den mest forskellige kemiske konstitution (f.eks. hydrofil, hydrofob, sure eller basiske ionbytter-funktioner), som muliggør de specifikke adskillelser og 35 ikke nedbrydes biologisk. Desuden kan der via fremstillingsmetoden fremstilles membraner med forskellige definerede

DK 161543 B

5 porestørrelser og porevoluminer, hvorved den tilsigtede fraskillelse af forstyrrende bestanddele bliver mulig, og systemet virker selvdoserende.

Den foreliggende opfindelse angår således en test-5 anordning til reflektometrisk påvisning af en komponent i et vandigt testmedium, især i en legemsvæske såsom blod eller urin, hvilken anordning omfatter et bærerlag, et mi-kroporøst polymerlag, eventuelt yderligere lag samt inkorporeret i et eller flere af lagene reagenser til påvisning 10 af de komponenter, der skal bestemmes og denne anordning er ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at det mikroporøse polymerlag er en ifølge koagulationsmetoden fremstillet membran med asymmetrisk porestruktur, idet porene mod den side, hvorpå prøven påføres, bliver snævrere, hvorhos den 15 polymere er valgt blandt polyamider, polyamider med disulf-imidgrupper, polyethercarbonater, polyacrylonitril og poly-urethaner, og at bærerlaget er makroskopisk glat og fortrinsvis^ uigennemtrængeligt for prøven under testbetingelserne, hvorhos reagenserne er enzymholdige.

20 Opfindelsen angår også en analysemetode til påvisning af en komponent i et vandigt testmedium, og denne metode er ejendommelig ved, at man bringer en testanordning ifølge opfindelsen i kontakt med en prøve, idet prøvepåføringen udføres således, at prøven træder ind i membranen ved over-25 fladen med den snævre porediameter, og at påvisningsreaktionen derefter finder sted.

Ifølge opfindelsen er der tale om mikroporøse film af helsyntetiske polymere, som kan fremstilles med definerede porevoluminer og variable porestørrelser. Polymerenes hel-30 syntetiske karakter er vigtig, da disse - i modsætning til naturlige eller halvsyntetiske produkter - kan fremstilles med høj reproducerbarhed og muliggør en enkel kvalitetskontrol.

Mikroporøse polymerfilm (membraner), som benyttes 35 under anvendelse af ydre tryk til industriel eller storteknisk adskillelse af molekylære blandinger, er velkendte

DK 161543 B

6 og fås på markedet. Der findes flere metoder til fremstilling af sådanne membraner, idet den såkaldte "faseinversionsmeto-de" har opnået størst betydning. Med hensyn til principperne for denne teknologi henvises f.eks. til H. Strathmann, "Tren-5 nungen von molekularen Mischungen mit Hilfe synthetischer Membranen", Steinkopfverlag Darmstadt (1979).

Inden for faseinversionsmetoden findes der forskellige varianter. Vedjcoagulationsmetoden går man principielt således frem, at en fast bærer overtrækkes med en polymeropløs-10 ning (støbeopløsning) af ensartet tykkelse (f.eks. 100 μιη), eventuelt udsættes den for en atmosfære, som indeholder et ikke-opløsningsmiddel (fortrinsvis vand) for polymeren i dampform, indtil opløsningen er delvis eller fuldstændig geleret, og derpå neddyppes den i et koagulationsbad, hvorved 15 der opstår en fast, mikroporøs film med asymmetrisk struktur. Dersom membranfilmen under koagulationen bindes på den faste bærer (ved anvendelse af specielle porøse polymerfibre eller polymerfolier), fås bærerunderstøttede membraner. Løsnes membranfilmen under koagulationen fra den faste bærer (f.eks.

20 ved anvendelse af glas), dannes der bærerfri membraner. Koagulationsvæsken har sådanne egenskaber, at den er blandbar med opløsningsmidlet i støbeopløsningen, men er et fældningsmiddel for polymeren.

Det er typisk for denne variant, at koagulationen 25 (poredannelsen) hovedsagelig først sker ved neddypning i koagulationsvæsken, og at der opstår asymmetriske membranstrukturer. Asymmetrisk betyder her, at porerne - når de betragtes fra mémbranundersiden (bærersiden) - bliver snævrere hen mod membranoverfladen.

30 Forholdet mellem den gennemsnitlige porediameter på membranundersiden og på membranoverfladen (kan f.eks. bestemmes ved hjælp af elektromikroskopiske optagelser) er her i reglen større end 5:1, fortrinsvis større end 10:1 og især større end 30:1. Som det har vist sig, har anvendelsen ifølge 35 opfindelsen af sådanne membraner den fordel, at når der tilføres produkt på membranoverfladen, hindres en tilstopning » 7

DK 161543 B

af porerne.

Flertallet af de på markedet værende membraner fremstilles ved hjælp af denne fremgangsmåde. Det har allerede være foreslået at anvende sådanne membraner som bærermatrix 5 til påvisningssystemer (US patentskrift nr. 3.607.093), idet de færdige membraner senere kan fugtes med prøvereagenser. De på markedet værende, bærerunderstøttede membraner opfylder dog ikke de krav, der i praksis stilles til reproducerbarhed.

10 Disse membraner findes nemlig på porøse bærerfnug, f.eks. af polyethylen, polypropylen eller polyester, som ikke er makroskopisk glatte. Derfor er membranlagtykkelsen og dermed porevoluminet underkastet forholdsvis kraftige svingninger, hvilket fører til misvisninger ved påvisnings-15 reaktionen. Desuden har bærerfnugmaterialets væskeoptagende karakter til følge, at ikke alene membranens porevolumen er ansvarligt for den optagne væskemængde, men at også den porøse bærer opsuger væske på grund af kapillarvirkningen.

Bærerfri asymmetriske membraner har hidtil ikke været 20 anvendt eller foreslået til fremstilling af test- eller prøveanordninger. De er dog ikke særlig foretrukne ifølge opfindelsen, fordi de er vanskelige at håndtere og i reglen først kan tørres, når de er imprægneret med konserveringsmidler. De kræver derfor ved fremstillingen af et prøvemiddel 25 et yderligere arbejdstrin, nemlig påføringen på en bærer.

Hertil kan der anvendes klæbestoffer, som dog kan føre til yderligere komplikationer (f.eks. opløsning af membranen, væskeoptagelse).

Indførelsen af påvisningsreagenser i de færdige mem-30 braner sker ifølge det i US patentskrift nr. 3.607.093 beskrevne system ved gennemvædning. Da der i reglen skal indføres såvel organiske som vandopløselige reagenser, er man henvist til gennemvædning i både organisk opløsning og i vandig opløsning.

35 Man må derfor indskrænke sig til membraner, der er bestandige over for det tilsvarende organiske opløsningsmid-

DK 161543 B

8 del. Desuden har sådanne systemer, der kun er gennemvædet med påvisningsreagenser, tendens til "udsivning".

En yderligere variant i membranfremstillingen efter faseinversionsmetoden er baseret på, at en polymer opløses 5 i en blanding af et godt, let fordampeligt og et ringe, højerekogende opløsningsmiddel. Udstryges en sådan opløsning på en film, og tilføres der varme, fordamper det gode, let kogende opløsningsmiddel først, medens det for polymeren ringe opløsningsmiddel beriges og bringer systemet til koa-10 gulation. Derpå kan membranen eventuelt til udvaskning af resten af det højtkogende opløsningsmiddel nedsænkes i et flydende bad, som dog i modsætning til den ovenfor beskrevne koagulation i fældningsbad ikke bidrager væsentligt til membrandannelsen.

15 Ved denne metode fås ingen asymmetriske strukturer.

Desuden kan der i praksis kun anvendes sådanne polymere, hvortil der findes et godt, letkogende opløsningsmiddel, hvilket begrænser polymerudvalget stærkt. Således er der ved denne metode hidtil i praksis kun blevet forarbejdet 20 halvsyntetiske cellulosederivater (f.eks. celluloseacetat, cellulosenitrat), for hvilke acetone er ét udmærket opløsningsmiddel, til membraner. Således er de ifølge DE fremlæggelsesskrift nr. 2.232.760 anvendte filtrerlag af cellulose-acetat på gelatinelag ("blush-polymerlag") fremstillet i 25 opløsningsmiddelsystemet acetone/toluen.

Denne metode blev, således som beskrevet i DE offentliggørelsesskrift nr. 2.602.975, også allerede anvendt til fremstilling af et enkeltlags-påvisningssystem, hvor reagenserne blev indarbejdet i polymeropløsningen. Ved denne 30 metode fås derfor direkte porøse membraner, der indeholder påvisningsreagenserne. Fremstillingen af prøveelementerne ifølge det nævnte offentliggørelsesskrift sker på en glasplade, hvorfra membranen efter tørring trækkes af og opklæbes på en formstoffolie. Herved opstår de ovenfor beskrevne 35 vanskeligheder med de bærerfrie membraner. I det nævnte offentliggørelsesskrift beskrives også, at påvisningssystemet

DK 161543B

9 kan fremstilles direkte på et integralt substrat, idet glaspladen erstattes med en polymerfolie, som skal være således, at den reagerer kemisk eller fysisk med det anvendte opløsningsmiddelsystem, hvorved der forekommer en sammensmeltning 5 af membranen med bærerfolien. Denne proces er dog kun meget lidt variabel, eftersom opløsningsmiddelsammensætningen og fordampningstiden skal vælges efter den porøsitet, hvormed membranen skal fremstilles. Herefter påvirkes bæreren med forskellig styrke i overensstemmelse med, om man vil frem-10 stille fin- eller grovkornede membraner. Ved transparente bærere påvirkes også ved opløsning i reglen lysgennemskinneligheden, hvorved bedømmelsen fra bærersiden bliver problematisk.

Desuden sker der i polymerfolier, som angribes af 15 opløsningsmidler, i reglen irreversible ændringer, såsom kvældning, skrumpning eller ujævnheder, især når kontakttiden mellem opløsningsmiddel og polymerbærer er relativt lang, hvilket er tilfældet ved den her beskrevne type membranfremstilling. Denne metode er derfor ikke egnet til fremstilling 20 af bærerunderstøttede mikroporøse polymerfolier, som skal opfylde kravene til reagensbærere.

Enkeltheder vedrørende fremstillingen af mikroporøse fladedannere efter den ifølge opfindelsen anvendte koagulationsmetode findes angivet i en række publikationer. Således 25 i DE patentskrift nr. 1.110.607 til koagulation af polyure-thaner på polyetherbasis at udsætte hygroskopiske polyure-thaner (som opløsningsmiddel anvendes her f.eks. dimethyl-formamid) for påvirkning af en vanddampholdig, eventuelt i cirkulation blandet atmosfære, som har en relativ fugtighed 30 på 15-100% ved en tør termometertemperatur på 10-38°C. På grund af vandabsorptionen ved opløsningsmidlets hygroskopi begynder polyurethanen at udfældes fra opløsningen på overfladen, sandsynligvis under prædannelse af den mikroporøse struktur. Ved at lægge de på denne måde forgelerede film 35 eller overtræk i vand fjernes det hygroskopiske opløsningsmiddel under opløsningens koagulation fuldstændig fra filmen.

10

DK 161543 B

I DE offentliggørelsesskrift nr. 1.444.163 anføres en noget modificeret metode: Ved tilsætning af mindre andele ikke-opløsningsmidler (f.eks. vand) bringes polyurethanop-løsningen først i en tilstand af begyndende faseadskillelse, 5 dvs. en let uklar dispersionsagtig form, før den (efter påstrygning i fladeform) direkte, altså uden forgelering i fugtig atmosfære, koaguleres ved neddypning i ikke-opløs-ningsmidlet.

I DE offentliggørelsesskrift nr. 1.444.163 anføres 10 en yderligere fremgangsmåde, ved hvilken polymeropløsningen uden forgelering ved indirekte koagulation i en blanding af ikke-opløsningsmiddel og opløsningsmiddel (f.eks. dimethyl-formamid og H2O i et blandingsforhold på mellem 10:90 og 95:5) kan overføres til mikroporøse folier.

15 Ifølge endnu en variant, som findes beskrevet i BE

patentskrift nr. 624.250, sættes der til polymeropløsningen så meget ikke-opløsningsmiddel, at polymeren udskilles som gel. Denne gel stryges derpå først på et substrat og koaguleres med ikke-opløsningsmiddel (vand) til et mikroporøst 20 materiale.

I DE fremlæggelsesskrift nr. 1.238.206 anføres, at en direkte koagulation af elastomeropløsninger fører til mikroporøse strukturer, når de overtrukne substrater koaguleres i bade, som opvarmes til i nærheden af badvæskens koge-25 punkt, f.eks. i varmt vand på 95°C.

Der fås bedre resultater, når også forgeleringen finder sted ved forhøjet temperatur. Således beskrives der i DE offentliggørelsesskrift nr. 2.025.616 en fremgangsmåde til fremstilling af mikroporøse fladeprodukter, ved hvilken 30 et tyndt lag af en polyurethanopløsning udsættes for en vanddampatmosfære med mindst 50%'s relativ fugtighed ved temperaturer over 65°C, hvorpå størstedelen af opløsningsmidlet fjernes i vandige koagulationsbade, og der derefter tørres.

35 Ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. 2.125.908 føres der over et lag af en polyurethanopløsning vanddamp med en i

DK 161543 B

11 temperatur mellem 101 og 190’C, indtil lagets indhold af organisk opløsningsmiddel er faldet til mindre end 50 vægt-%, og laget er omdannet til et fast, mekanisk stabilt, mikro-porøst fladeprodukt. Denne fremgangsmåde har især den fordel, 5 at der i løbet af kort tid og med ét eneste fremgangsmådetrin fås et mikroporøst slutprodukt ud fra en polyurethanopløs-ning.

Ved de nævnte fremgangsmåder kan der til polymeropløsningerne sættes bestemte koagulationshjælpemidler med 10 henblik på forbedring af koagulationsevnen. Således beskrives der i DE fremlæggelsesskrift nr. 1.270.276 og i DE offentliggørelsesskrifterne nr. 1.694.171 og 1.769.277 fremgangsmåder til fremstilling af fladeprodukter, der tillader gennemtrængning af vanddamp, ved hvilke opløsninger af 90-70 15 vægtdele polyurethaner eller polyurinstoffer og 10-30 vægtdele højmolekylære, hovedsagelig lineære, kationiske polyurethaner, der indeholder 0,5-2,0 vægt-% kvaternære ammonium-nitrogenatomer, eventuelt efter gelering i fugtig luft, koagulerer med vand eller en blanding af vand og opløsnings-20 middel. Foruden de kationiske polyurethaner kan disse opløsninger som yderligere koagulationsregulatorer også indeholde anioniske garvestoffer.

I mange tilfælde kan der ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. 2.427.274 opnås en yderligere forbedring ved, 25 at de kationiske eller anioniske polyurethanurinstofsuspen-sioner, der er beregnet til koagulerende polyurethanopløs-ninger, alene eller fortrinsvis samtidig indeholder kationiske og anioniske polyurethan(urinstof)er på saltform. Det lykkes på denne måde også at regulere koagulationen af van-30 skeligt forarbejdelige polyurethanopløsninger, så at der opstår fladeprodukter med tilfredsstillende mikroporøsitet.

Ifølge de i de nævnte skrifter beskrevne fremgangsmåder kan der praktisk taget af enhver opløselig polymer fremstilles mikroporøse membraner, idet man ved hjælp af 35 forskellige parametre, (f.eks støbeopløsningens koncentration, temperatur, additiver, koagulationsvæskens art) - even-

DK 161543 B

12 tuelt efter nogle få forudgående forsøg - kan indstille den ønskede porestørrelse.

På grundlag af disse muligheder vil også den foreliggende opfindelses fordele opnås. Således kan den polymere 5 membran på enkel måde indrettes til det tilsigtede påvis-ningssystem.

I de fleste tilfælde foretrækkes det ifølge opfindelsen at udføre koagulationen direkte i et vandigt koagulationsbad, dvs. uden særlig forbehandling.

10 Egenskaberne hos testanordningerne ifølge opfindelsen (farvereaktionens homogenitet og intensitet, påvisningssystemets udvanding og holdbarhed, erytrocytternes evne til aftørring og påvisningsreaktionens hurtighed) afhænger stærkt af arten af det anvendte polymersystem.

15 For at opfylde kravene til en enkel maskinel frem stillingsmetode, defineret porevolumen og bedømmelse fra bærerbagsiden .anvendes der ifølge opfindelsen fortrinsvis sådanne polymerstøbeopløsninger, at membranfremstillingen kan ske direkte på en makroskopisk', glat og uigennemtrængelig 20 bærer. Dersom konventionelle membraners støbeopløsninger (f.eks. celluloseacetat eller polysulfon) påføres på glatte, uigennemtrængelige folier, løsner den faste film, der opstår ved koagulationen fra bæreren, hvis bæreren ikke angribes så kraftigt af opløsningsmidler, at den smelter sammen med 25 membranen. Dette fører dog til en spredning af måleresultaterne. For at undgå dette problem skal systemet støbeop-løsning/bærer ved den direkte fremstilling af bærerunderstøttede membraner afstemmes således, at støbeopløsningen har stor affinitet over for bæreren uden at angribe, dvs.

30 opløse denne.

Sådanne polymersystemer har vist sig gunstige, som på i og for sig kendt måde kan varieres med hensyn til deres hydrofili/hydrofobi-balance. I denne sammenhæng anvendes især med fordel polymere med ioniske grupper, som eventuelt 35 også kan anvendes som komponenter i en polymerblanding. Polymermembranens hydrofile (eller hydrofobe) egenskaber

DK 161543 B

13 kan f.eks. have betydning for optimering af farvereaktionen (hyppigt bliver farver mere intensiv, når polymeren indeholder ioniske grupper).

Eksempler på polymere, hvoraf der kan fremstilles 5 egnede støbeopløsninger til de her omhandlede testanordninger, er:

Polyamider, polyamider med disulfimidgrupper fiNa® (-S022N-S02-) (jfr. f.eks. US patentskrift nr. 4.269.967), 10 polyethercarbonater (jfr. f.eks. DE offentliggørelsesskrift nr. 2.251.066), polyacrylonitril og polyurethaner som f.eks. i DE offentliggørelsesskrift nr. 2.247.274 og de deri anførte trykskrifter.

Der fås foretrukne støbeopløsninger, når der i op-15 løsningerne af de nævnte polymere på i og for sig kendt måde blandes vandige polymerdispersioner, som fortrinsvis har ioniske grupper, f.eks. af polyvinylforbindelser, vinylblandingspolymer isater, polystyrensulfonsyrer, polyamider eller polyurethaner. Ganske særlig egnet er støbeopløsninger, 20 som består af blandinger af polyurethanopløsninger med vandige polyurethandispersioner [jfr. f.eks. Angew. Makromol.

Chem. 98, 133 (1981) og de i det nævnte DE offentliggørelsesskrift nr. 2.427.274 anførte trykskrifter]. Polyurethan-dispersionerne kan være ikke-ioniske eller fortrinsvis ioni-25 ske, idet de ioniske rester f.eks. kan være -S03~-, -COO“-eller -N+R3-grupper.

Ioniske polymersystemer er særlig foretrukne, fordi de udviser god hæftning på bærerfolien og immobilisering af de til påvisningsreaktionen nødvendige enzymer. Påvisnings-30 systemerne ifølge opfindelsen på basis af ioniske polymere kan skylles i flere timer med vand, uden at der forekommer nævneværdig udvanding.

Til fremstilling af støbeopløsningerne anvendes der til de pågældende polymere gængse opløsningsmidler, f.eks.

35 dimethylformamid, N-methylpyrrolidon eller dioxolan, idet der eventuelt kan tilsættes uorganiske, i støbeopløsningen opløselige salte såsom LiCl, CaCl2 eller Mg(C104)2 som pore-

DK 161543 B

14 dannere. Som yderligere additiver tilsættes der også stoffer, som er uopløselige i støbeopløsningen og fungerer som fyldstoffer, såsom Si02, Ti02 (jfr. EP-patentansøgning nr.

77.509), BaS04, ZnO eller cellulose- eller agarosepulver, 5 hvorpå der eventuelt er immobiliseret biologisk aktivt materiale.

Fremstillingen af bærerstøttede, mikroporøse testanordninger ifølge opfindelsen sker ved, at en egnet bærer overtrækkes med en sådan støbeopløsning (lagtykkelse ca.

10 50-100 μιη) og fortrinsvis straks efter nedsænkes i et koa gulationsbad, hvorved de mikroporøse, bærerunderstøttede polymerfilm dannes. Den tid, der går mellem overtrækningen på bæreren og koagulationen, skal være så kort som mulig (nogle sekunder), for at bæreren ikke skal anbringes af 15 støbeopløsningens opløsningsmiddel. Som koagulationsvæske egner sig f.eks. vand eller vandige pufferopløsninger, som eventuelt også kan indeholde blødgører, f.eks. glycerol.

Gennem koagulationsbadets natur kan porestrukturen modificeres på simpel måde. Således kan man af kun én støbe-20 opløsning ved fældning i vand opnå porestørrelser, der tiltager ved stigende temperaturer, på membranoverfladerne, således som det kan påvises ved hjælp af REM-optagelser af mikroporøse polymerfilm, som koaguleres ved stuetemperatur, ved 45 og ved 60°C. Lignende virkninger kan også opnås ved 25 anvendelse af blandinger af vand med organiske opløsningsmidler , f.eks. vand/dimethylformamid.

Som bærer for testanordningerne ifølge opfindelsen egner sig principielt makroskopisk glatte polymerfolier, på hvilke det anvendte polymersystem under koagulationen og 30 også efter tørringen udviser god hæftning, og som på grund af polymerstøbeopløsningen ikke undergår nogen forandring.

Særlig foretrukne er transparente polymerfolier, som også muliggør en bedømmelse af farvereaktionen gennem bærersiden. Ganske særligt foretrukne er transparente polyethylentereph-35 thalatfolier.

DK 161543 B

15

De reagenser, der er nødvendige til påvisningsreaktionen, kan på forskellig måde indbringes i de mikroporøse polymerfilm, f.eks. ved irøring i støbeopløsningen, ved efterfølgende gennemvædning af den porøse film eller ved en 5 kombination af disse to metoder.

Ifølge opfindelsen indføres i og for sig kendte enzymholdige reagenssystemer til påvisning af en analyt i testanordningerne.

En enkel metode til fremstilling af mikroporøse 10 polymerfilm indeholdende påvisningsreagenser består f.eks. i, at det anvendte chromogen (f.eks. 3,3',5,5'-tetramethyl-benzidin) opløses i støbeopløsningen, og at denne efter koagulationsoperationen forarbejdes til en chromogenholdig mikroporøs film, som derpå vædes med det (eventuelt pufrede) 15 enzymsystem.

Testanordningen ifølge opfindelsen kan også være udformet som et flerlagssystem. I så fald er det en fordel, hvis man er henvist til en adskillelse af påvisningsreagenserne. F.eks. kan en bærerfolie forsynes med et polymerlag, 20 herpå anbringes den asymmetriske membran efter den beskrevne koagulationsmetode, eller en separat fremstillet bærerfri færdig membran pålamineres.

I polymerlaget mellem bæreren og membranen kan eventuelt alle eller en del af påvisningsreagenserne indarbejdes, 25 idet den anden del af påvisningsreagenserne findes i membranen ovenover.

Som polymert mellemlag, hvori de eventuelle påvisningsreagenser kan være indarbejdet (reagenslag) egner sig f.eks. i og for sig kendte film af vandige dispersioner, 30 som tilhører klassen af polyvinylforbindelser, polyamider eller polyurethaner. Da det reagensholdige lag fortrinsvis skal være opløseligt i vand eller i det mindste kvældbart, egner sig især polyurethandispersioner, som eventuelt blandes med vandopløselige eller med vand kvældbare polymere såsom 35 polyvinylalkohol, polyethylenglycol, celluloseether, poly-acrylamid, polyacrylsyre eller polyvinylpyrrolidon.

16

DK 161543 B

Iagttagelsen af farvereaktionen kan efter aftørring af prøveroverskuddet ske fra påføringssiden (membranoverfladen) eller ved anvendelse af transparente bærere også fra bærersiden, og i så fald behøver man ikke at aftørre prøve-5 overskuddet. I sidstnævnte tilfælde foretrækkes det, at chromogenet findes i et reagenslag mellem membran og den transparente bærer.

Testanordningerne ifølge opfindelsen egner sig til kvantitativ bestemmelse af lav- og højmolekylære komponenter 10 i flydende prøver, især til kvantitativ spektrofotometrisk påvisning af indholdsstoffer i legemsvæsker, f.eks. bilirubin, ketoner, triglycerider, urinstoffer eller hæmoglobin.

Ganske særligt egner testanordningen ifølge opfindelsen sig, således som det fremgår af de følgende eksempler, til 15 kvantitativ glucose-påvisning i helblod samt til påvisning af enzymer som glucoseoxidase eller cholinesterase, til påvisning af bilirubin eller ketonstoffer.

Opfindelsen vil det følgende blive nærmere forklaret ved hjælp af eksempler, hvor mængdeangivelserne, dersom andet 20 ikke er anført, er vægtdele eller vægt-%.

25 30 35 17

DK 161543 B

Eksempel 1 Påvisning af glucose

Ved hjælp af en hurtigtarbejdende omrører (Dissolvers) fremstilles en støbeopløsning med følgende sam-5 mensætning:

Disulfimid-polyamid 8,02 g

CaCl2 2,40 g

Dimethylformamid (DMF) 43,02 g

Ascorbinsyre 0,01 g 10 Natriumcitrat 0,01 g

Citronsyre 0,40 g 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin 0,48 g Titandioxid 45,40 g

Peroxidase (POD, 277 enh/mg) 0,13 g 15 Glucoseoxidase (GOD, 116 enh/ mg) 0,13 g

Med denne støbeopløsning overtrækkes en polyethy-lenterephthalatfolie ved hjælp af en rakel med et lag med 20 en tykkelse på lOO^um. Denne bærerstøttede film koagulerer i 10 minutter i et 30%’s vandigt glycerolbad. Den herved opståede faste bærerunderstøttede membran tørres med varm luft (350C); og dens funktionsdygtighed afprøves med helblod. Blodet påføres på membranoverfladen og af-25 tørres efter ét minut. Ca. 30 sekunder efter aftørringen er der på membranoverfladen dannet en homogen grøn farve.

30 35 18

DK 1615 4 3 B

o

Ved disulfimid-polyamid drejer det sig om et polykondensat fremstillet ved en enkeltbeholdereaktion ifølge US patentskrift nr. 4.269.967 ud fra:

O

5 awVi^iF0C1 0 * H^J N o 10 H^V~\ ^ Γ-Γ™2 <Q)-S02-^S°2H(g> 15

Eksempel 2 Påvisning af glucose Støbeopløsning: 20 Polyurethan 13,73 g

Dimethylformamid 66,37 g

Polyurethandispersion i vand/DMF 7,24 g

Natriumdioctylsulfosuccinat 0,07 g

Titandioxid 11,01 g 25 3,31,5,5'-Tetramethylbenzidin 0,79 g

Ascorbinsyre 0,79 g

Med det anvendte polyurethan drejer det sig om et termoplastisk materiale, der fås ved omsætning af 30 75 dele af en polyester ud fra adipinsyre, 70 mol% ethylenglycol og 30 mol% 1,4-butandiol (molekylevægt 2000), 25 dele af en polyester ud fra adipinsyre og 1,4-butandiol (molekylevægt 2250), 35 25 dele 1,4-butandiol og 85 dele diphenylmethandiisocyanat.

O

19

DK 161543 B

Polyrethandispersionen fungerer som koaguleringshjælpemiddel og er en kationisk emulgatorfri dispersion af et reaktionsprodukt ud fra 200 dele af en polyester ud fra adipinsyre, phthal-5 syre og ethylenglycol (molekylevægt 1700), 50 dele toluylendiisocyanat, 20 dele N-methyldiethanolamin og 6 dele p-xylylendichlorid.

Fremstillingen af den bærerunderstøttede, mikro-10 porøse polymermembran sker som i eksempel 1 med følgende ændringer: Bærer: Polyethylenterephthalatfolie

Koagulationsbad: 1%'s opløsning af Na-Laurylsulfat.

Efter tørringen vædes filmen i 1 minut i en 1%'s 15 POD (277 enh./mg)/G0D (116 enh./mg)-opløsning i citratpuffer (pH 5,5) og tørres.

Prøve med helblod: 10 sekunder efter påførelse af prøven ses gennem den transparente bærer en homogen blå farve, ligeledes efter aftørring af prøveoverskuddet 20 på membranoverfladen.

Med 0,05, 0,1 og 0,5%'s glucoseopløsninger fås straks homogen blåfarvning, som overensstemmende med den øgede glucosekoncentration udviser tiltagende farveinten-sitet (farvenuancer).

25 I overensstemmelse hermed kan der ved de reflek- tometriske bedømmelser for forskellige glucosekoncentra-tioner måles trinvise reflektionsværdier. Desuden viser målingerne, at farvningen afhængigt af glucosekoncentra-tionen i området fra 20 til 800 mg glucose/dl vand er li-30 neær, og at slutpunktet for påvisningsreaktionen nås senest efter 40 sekunder. Dette er i sammenligning med kendte analyseanordninger overordenligt hurtigt.

De elektronmikroskopiske undersøgelser (REM) af det i eksempel 2 beskrevne prøvestrimmelsystem viser, at 35 det drejer sig om en højporøs membran, hvor den gennemsnitlige porestørrelse er 0,5^.

DK 161543B

O

20

Eksempel 3 Påvisning af glucose Tolagssystem.

(A) Fremstilling af et bærerunderstøttet reagenslag. | 5 Vandig polyurethandispersion 8,40 g

Polyvinylpyrrolidon (molekylvægt 35.000) 3,00 g

Tetramethylbenzidin (opløst i 1 g ethylacetat) 0,50 g 10 Glucoseoxidase (116 enh./mg) 0,12 g

Peroxidase (277 enh./mg) 0,12 g og ascorbinsyre 0,025 g røres sammen, overtrækkes på en polyesterfolie og tørres med varmluft, hvorved der fås et bærerunderstøttet reagenslag.

15 Polyurethandispersionen er en 40%'s vandig dis persion af en reaktionsprodukt ud fra 82 dele af en polyester ud fra adipinsyre, hexandiol og neopentylglykol (molekylevægt 1700) , 20 15 dele hexamethylendiisocyanat, 2 dele Na-ethylendiamin-ethanolsulfonat og 1 del ethylendiamin.

Disse bærerunderstøttede reagenslag giver med vandige glucoseopløsninger ca. 20 sekunder efter prøve-25 påførslen homogene, efter forskellige glucosekoncentra-tioner nuancerede farvninger (jfr. eksempel 2).

(B) Påføring af en asymmetrisk faseinversionsmembran.

(a) Alle påvisningsreagenser i reagenslaget.

På det i eksempel 3(A) beskrevne bærerunderstøt-30 tede reagenslag påføres et lag af den i eksempel 2 beskrevne støbeopløsning, som dog ikke indeholder det der beskrevne tetramethylbenzidin og ascorbinsyre, og kolagule-rer i 1%'s vandig Na-lauryl-sulfatopløsning.

Efter tørring med varm luft afprøves med vandi-35 ge glucoseopløsninger samt helblod. Der kunne ca. 30 sekunder efter påføring af prøven fra bærersiden iagttages

O

21

DK 161543 B

homogene, koncentrationsafhængige blåfarvninger.

(b) Reagenser i forskellige lag.

Af vandig polyurethandispersion 8,40 g 5 (jfr. eks. 3) ....

Polyvinylpyrrolidon (molekylevægt 350.000) 3,00 g glucoseoxidase (116 enh/mg) 0,12 g og peroxidase (277 enh/mg) 0,12 g 10 fremstilles analogt med eksempel 3(A) et bærerunderstøttet enzymholdigt lag. Derpå påføres et lag af den .i eksempel 2 beskrevne støbeopløsning, koaguleres i 1%'s Na--laurylsulfatopløsning og tørres. Ved prøve med helblod kan der ca. 40 sekunder efter påføring af prøven og af-15 tørring af erythrocytter iagttages en homogen blå farve fra påføringssiden. Glucoseopløsninger med forskellige koncentrationer giver forskelligt nuancerede blå farver.

Eksempel 4 20 Påvisning af glucose

Tolagssystem med reagenslag.

Støbeopløsning til reagenslaget:

Polyurethandispersion (eks. 3) 8,00 g

Polyvinylpyrrolidon (molekyle-25 vægt 10.000) 1,00 g

Tetramethylbenzidin opløst i 10 g ethylacetat 0,05 g

Glucoseoxidase (116 enh/mg) 0,10 g

Peroxidase (277 enh/mg) 0,10 g 30 (to sidstnævnte opløst i 2 ml vand) 5%'s vandig ascorbinsyreopløsning 0,01 ml røres sammen, overtrækkes på en polyethylentereph-tphalatfolie og tørres med varmluft (= bærerunderstøttet reagenslag).

35 På dette bærerunderstøttede reagenslag påføres en ved hjælp af faseinversionsmetoden fremstillet polya-

DK 161543 B

22 .

o midmembran af følgende støbeopløsning:

Polyamid (polykondensationsprodukt af hexamethylendiamin og isophthaisyre iflg. DE-OS 27 43 515) 8f10 g 5 CaC12 2,40 g

Dimethylformamid 43,00 g

Ti02 46,00 g

Lagtykkelse: 100^,um 10 Koagulationsbad: 30%'s vandig glycerolopløsning.

Prøve med helblod: Der påføres en dråbe blod på membranoverfladen. Ca. 10 sekunder efter prøvepåføringen kan der igennem den transparente bærer iagttages en homogen blå farve.

15 Med glucoseopløsninger med forskellige koncen trationer (jfr. eksempel 2) fås forskelligt nuanceret blå farve.

Eksempel 5 20 Påvisning af glucose

Membran med reagenslag.

Støbeopløsning til membranen:

Polysulfon (kondensationsprodukt af Bisphenol A og bis(chlorphenylsulfon), 25 "Udel P 1700" (firma Union Carbide) 20,00 g opløses i N-methylpyrrolidon 80,00 g

Støbeopløsningen påføres med en rakel på en 30 glasplade (lOO^um) og neddyppes for koagulation i et 10%’s vandigt glycerolbad. Herved løsner filmen sig fra glasbæreren, og der fås en asymmetrisk membran uden bærer.

Efter tørring lægges der på bagsiden af polysul-fonmembranen (filmsiden, der befinder sig på bæreren) et 35 lag af det i eksempel 4 beskrevne reagens.

O

23

DK 161543 B

Prøve med helblod: På membranoverfladen påfø res en dråbe blod. Ca. 30 sekunder efter påføringen kan der i reagenslaget iagttages en homogen blå farve.

Med glucoseopløsninger med forskellig koncentration fås 5 forskelligt nuancerede blå farver. ........

Eksempel 6 Påvisning af enzym

Den i eksempel 2 beskrevne membran vædes efter 10 tørring med en 1%'s vandig glucose/POD (277 enh/mg)-opløsning og tørres.

Ved prøven med fortyndede GOD-opløsninger (20, 40, 80, 120 og 160 enh./ml) iagttages straks efter påføring af prøven på membranoverfladen og gennem den trans-15 parente bærer en homogen blå farve, hvis nuance svarer til GOD-koncentrationen.

Eksempel 6a

Cholinesterase-prøvestrimler 20 Støbeopløsning og fremstilling af membranen som i eksempel 2, dog uden TMB og ascorbinsyre.

Membranen vædes i en opløsning af 40 mg indoxyl-acetat i 5 ml ethylacetat og 120 mg 2-methoxy-4-morpholi-no-benzendiaznomiumchlorid.ZnC^ i 5 ml methanol og der -25 på yderligere med Tris-HCl-puffer (0,4 molær, pH 7,5) og tørres og oparbejdes til prøvestrimler.

Prøvestrimlerne farves efter påføring af cholin-esteraseopløsninger og serum alt efter enzymaktiviteten med forskellig hastighed. Farvningen kan bedømmes kvan-30 titativt med et reflektionsmåleapparat.

35

Claims (10)

1. Testanordning til reflektometrisk påvisning af en komponent i et vandigt testmedium, hvilken anordning omfatter et bærerlag, et mikroporøst polymerlag, eventuelt 5 yderligere lag samt inkorporeret i et eller flere af lagene reagenser til påvisning af de komponenter, der skal bestemmes, kendetegnet ved, at det mikroporøse polymerlag er en ifølge koagulationsmetoden fremstillet membran med asymmetrisk porestruktur, idet porerne med den side, 10 hvorpå prøven påføres, bliver snævrere, hvorhos den polymere er valgt blandt polyamider, polyamider med disulfimidgrupper, polyethercarbonater, polyacrylonitril og polyurethaner, og at bærerlaget er makroskopisk glat og fortrinsvis uigennemtrængeligt for prøven under testbetingelseme, hvorhos 15 reagenserne er enzymholdige.

2. Testanordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at forholdet mellem den gennemsnitlige porediameter ved membranundersiden og den gennemsnitlige porediameter ved membranoverfladen er større end 5:1.

3. Testanordning ifølge krav 1 og 2, kende tegnet ved, at den yderligere indeholder polymere med ioniske grupper og/eller uopløselige fyldstoffer.

4. Testanordning ifølge krav 3, kendetegnet ved, at de ioniske polymere er valgt blandt polyvi- 25 nylforbindelser, vinylblandingspolymerisater, polystyrensul-fonsyrer, polyamider og polyurethaner.

5. Testanordning ifølge krav 3 og 4, kendetegnet ved, at de ioniske grupper hidrører fra kvater-nær amin, S03” eller COO”.

6. Testanordning ifølge krav 3-5, kendeteg net ved, at det uopløselige fyldstof hidrører fra S1O2, TiC>2, BaS04, ZnO, cellulose eller agarose.

7. Analysemetode til påvisning af en komponent i et vandigt testmedium, kendetegnet ved, at man brin-35 ger en testanordning ifølge krav 1-6 i kontakt med en prøve, idet prøvepåføringen udføres således, at prøven træder ind DK 161543 B i membranen ved overfladen med den snævre porediameter, og at påvisningsreaktionen derefter finder sted.

8. Metode ifølge krav 7, kendetegnet ved, at prøven påføres på membranoverfladen, og at påvis- 5 ningsreaktionen iagttages fra påføringssiden.

9. Metode ifølge krav 7 og 8, kendetegnet ved, at der anvendes en testanordning med transparent bærer-lag, og at påvisningsreaktionen iagttages fra bærersiden.

10. Metode ifølge krav 7-9, kendetegnet 10 ved, at der anvendes en flydende prøve i form af en legemsvæske såsom urin, serum eller blod.