DK161091B - Svovlholdige antibiotiske forbindelser med antitumorvirkning, betegnet cl-1577a og cl-1577b, fremgangsmaade til fremstilling deraf, samt farmaceutiske praeparater indeholdende forbindelserne - Google Patents

Description

DK 161091 B

Opfindelsen angår en blanding af svovlholdige antibiotiske forbindelser betegnet CL-1577A og CL-1577B, blandingens enkelte komponenter, en fremgangsmåde til fremstilling deraf, samt farmaceutiske præparater inde-5 holdende forbindelserne.

Blandingen, henholdsvis dens komponenter ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del angivne.

Forbindelserne CL-1577A og CL-1577B har både anti-10 biotisk og antitumorvirkning.

Figurerne la, lb og lc viser de ultraviolette, infrarøde og 200 MHz protonmagnetiske resonansspektre for den forbindelse der betegnes CL-1577A.

Figurerne 2a, 2b og 2c viser de ultraviolette, 15 infrarøde og 200 MHz protonmagnetiske resonansspektre for den forbindelse der benævnes CL-1577B.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at en stamme af Streptomyces sp., identificeret som isolat ATCC 39363, dyrkes under aerobe betingelser i et 20 dyrkningsmedium indeholdende assimilerbare carbon- og nitrogenkilder, indtil der er frembragt en væsentlig mængde af blandingen, og at blandingen, CL-1577A eller CL-1577B efterfølgende isoleres.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er 25 ejendommelige ved, at de indeholder i det mindste en af forbindelserne CL-1577A eller CL-1577B, hvilke forbindelser har karakteristikaene i krav 1, sammen med et farmaceutisk acceptabelt bæremiddel.

Det actinomycetisolat, der er egnet til fremgangs-30 måden ifølge opfindelsen fandtes i en jordprøve indsamlet i Tennessee, U.S.A. Denne mikroorganisme isoleres fra jordprøven ved anvendelse af et passende agarmedium, der indeholder salte såsom kaliumphosphat, kaliumchlorid, magnesiumsulfat og ferrosulfat, samt carbonkilder 35 såsom glycerol og asparagin. For at isolere mikroorganismen foropvarmes jordprøven med calciumcarbonat inden den podes på agarmediet og inkuberes efter podning ved en gunstig temperatur især 33°C for at

DK 161091B

2 muliggøre udviklingen af jordmikroorganismen.

Organismen er en ikke identificeret actinomycet og deponeredes i overensstemmelse med Budapest-traktaten hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 5 20852, den 5. maj 1983, hvor den bevares i deres permanente kultursamling som ATCC 39363. Denne organisme der betegnedes kultur WP-444, og som frembringer CL-1577A og CL-1577B, bevares også som en hvilende kultur i lyofi-le rør, kryogene ampuller og i jordrør i Warner-Lambert/ 10 Parke-Davis Culture Collection, 2800 Plymouth Road, Ann Arbor, Michigan 48105.

Karakterisering af mikroorganismen ATCC 39363.

Mikroorganismen, betegnet ATCC 39363 har cellevægge med et vorteagtigt udseende og har en sporekæde-mor-15 fologi, som er kendetegnet ved korte kroge.

Kromatografisk analyse af digesterede celler antyder tilstedeværelse af meso-2,6-diaimnopimelinsyre blandt cellevæggenes aminosyrekomponenter og tilstedeværelse af madurose blandt komponenterne i totalcellens sukkerarter.

20 Disse forbindelser indicerer, at mikroorganismen kan høre til slægten Actinomadura.

Mikroorganismens morfologi og farve varierer, når den dyrkes på forskellige kulturmedier. Tabel A gengiver farven for luftmyceliet, reverse colour (substratfarv-25 ning) og opløseligt pigment for organismen, når den dyrkes på forskellige kulturmedier. Den anvendte farvekode er den, som anføres af R. Eckerstrom & C.E. Foss: Colour Harmony Manual, 4. udgave, 1958, Container Corporation of America, Chicago, 111., U.S.A.

30 3

DK 161091 B

TABEL Å

Farvning af luftmycelium

Kulturmedium_Farve_

Agar med gærekstrakt + maltekstrakt (ISP-2) Ingen spore 5 Agar med havremel (ISP-3) Hvid

Agar med uorganiske salte og stivelse (ISP-4) Hvid

Agar med glycerol-asparagin (ISP-5) Svagt hvid 10 Reverse (substrat) farvning

Kulturmedium_Fårve_

Agar med gærekstrakt + maltekstrakt (ISP-2) Lys gul

Agar med havremel (ISP-3) Lys gul 15 Agar med uorganiske salte og sti- Lyserød til velse (ISP-4) svagt rød

Agar med glycerol-asparagin (ISP-5) Lyserød

Opløselig pigmentering 20 Kulturmedium_Opløseligt pigment

Agar med gærekstrakt + maltekstrakt (ISP-2) Intet

Agar med havremel (ISP-3) Intet

Agar med uorganiske salte og sti-25 velse (ISP-4) Intet

Agar med glycerol-asparagin (ISP-5) Intet

De fysiologiske karakteristika for ATCC 38363 er anført i Tabel B.

4

DK 161091 B

TABEL· B

Egenskab Resultat

Melaninproduktion Negativ

Nitratreduktion Positiv 5 CarbonkiIdeudnyttelse: D-Glucose + D-Xylose + L-Arabinose + L-Rhamnose + 10 D-Fructose +

Raffinose + D-Mannitol +

Inositol +

Salicin - 15 Sucrose +

Forbindelserne CL-1577A og CL-1577B, der viser både antibiotiske egenskaber og antitumoregenskaber fremstilles af isolatet ATCC 39363 under aerob gæring under 20 kontrollerede betingelser. Gæringsmediet består af carbon-nitrogen- , mineralkilder samt vækstfaktorer. Eksempler på carbonkilder er glycerol og forskellige enkle sukkere såsom glucose, mannose, fructose, xylose, ribose eller andre carbohydratholdige forbindelser såsom dextrin, 25 stivelse, majsmel og hvede. Den normale mængde carbon-kildematerialer i gæringsmediet varierer fra ca. 0,1 til ca. 10 vægtprocent.

Nitrogenkilder i gæringsmediet er organisk , uorganisk eller blandet organisk- uorganisk materiale.

30 Eksempler på sådanne materialer er bomuldsfrømel, sojabønnemel, maj skimmel, majsstøbevand, tøT-rerte opløselige stoffer fra destilater, jordnøddemel, peptoniseret mælk og forskellige ammoniumsalte.

Tilsætning af mineraler og vækstfaktorer er også 35 til hjælp ved fremgangsmåden. Eksempler på gæringsmedium-mineraladditiver inkluderer kaliumchlorid, natriumchlorid, ferrosulfat, calciumcarbonat, cobaltochlorid og zinksul-

DK 161091B

5 fat. Vækstfaktorkilder inkluderer forskellige gærarter og mælkeprodukter.

Den foretrukne fremgangsmåde er ved submers dyrkning. Ifølge denne udførelsesform for opfindelsen 5 fremstilles gæringsingredienserne i opløsning eller suspension og blandingen steriliseres efterfølgende ved autoklavering eller dampopvarmning. Det vandige mediums pH justeres til fortrinsvis mellem pH ca. 4 og ca. 8, og blandingen afkøles efter sterilisering til en tempera-10 tur mellem ca. 16°C og ca. 45°C. Det afkølede sterile gæringsmedium podes med organismen, og derefter udføres gæring under gennemluftning og omrøring.

Ved den submerse dyrkningsmetode udføres gæring i rystekolber eller i stationære tankgæringskar. I 15 rystekolber opnås gennemluftning ved kolbernes bevægelse for at frembringe blanding af mediet med luft. I stationære gæringstanke opnås bevægelse ved skovlhjul, der kan tage form af pladeturbiner, vingede plader, åbne turbiner eller skibsskruer. Gennemluftning gennem-20 føres ved at injicere luft eller oxygen i den omrørte blanding.

Der opnås normalt passende fremstilling af forbindelser under disse betingelser efter et tidsrum på ca. 2-10 dage.

25 Ved en alternativ udførelsesform kan forbindelser ne også fremstilles ved stationær gæring af mikroorganismen.

Produktion ved gæring

Kulturen af Streptomyces sp. ATCC 39363 overførtes 30 efter dens isolering fra agarpladen til en agarskråkultur under anvendelse af CIM 23 medium og inkuberedes ved 28°C i 7-14 dage.

35

DK 161091 B

6

Tabel 1

Sammensætning af CIM23 medium

Amidex majsstivelse 1,0% 5 N-Z amin, type A 0,2% Kødekstrakt (Difco) · 0,1% Gærekstrakt (Difco) 0,1%

Cobalt-chloridpentahydrat' 0,002%

Agar_ 2,0% 10 En portion af mikrobevæksten fra agarskråkulturen anvendtes til at pode et 18 mm x 150 mm udsædsglas indeholdende 15 ml AEM .1550 udsædsmedium. Den podede udsæd rystedes ved 33°C i 3 dage.

15 Tabel II

Sammensætning af AEM 1550 uds ædsmedium.

Bacto-gærekstrakt (Difco) 0,5% 20 Glucosemonohydrat 0,1%

Opløselig stivelse (Difco) 2,4%

Bacto-trypton (Difco) 0,5%

Batco-kødekstrakt (Difco) 0,3%

Calciumcarbonat 0,2% 25 NB: pH justeres til 7,5 med NaOH inden calciumcarbonat-tilsætning._________

En 1 ml portion af mikrobevæksten fra udsæds-30 glasset overførtes til en 300 ml rystekolbe med prel-organer indeholdende 50 ml SM-13 produktionsmedium.

35 7

DK 161091 B

Tabel III

Sammensætning af SM-13 produktionsmedium.

5 Dextrin-Amidex B411 (American Maize) 1,5%

Lactose (Mallinckrodt) 1,0%

Pharmamedia (Traders) 0,65%

Fiskemel (Zapata Haynie) 0,35%

Torulagær (St. Regis)_0,25%_ 10

Indholdet af den podede kolbe inkuberedes ved 33°C i 4 dage under omrystning (170 opm gyrerende ryster, 5 ems kast). Efter et tidsrum på 5 dage var gæringsvæsken lysebrun, myceliet havde et granulært udseende og væskens 15 pH var ca. 6,4.

Denne gæringsbouillons antitumorvirkning undersøgtes ved en fortyndning på 1:100 overfor L1210 muse-leukemiceller dyrket i vævskultur. Undersøgelsesteknikken er beskrevet fuldstændigt i Cancer Chemotherapy Reports, 20 3. del, bind 3, nr. 2 (1972), Deran, Greenberg, Mac

Donald, Schumacher og Abbott. En bouillon der gav LI210 leukemicellevæksthastighed op til 0-35% i sammenligning med væksten af disse celler under regulerede betingelser blev anset for at være aktiv, ved 0% mest 25 aktiv. De observerede aktiviteter af gæringsbouillonen er anført i Tabel IV.

Tabel IV

Antitumorvirkning af gæringsbouillonen (målt overfor L1210 museleukemiceller).

30 Kolbe nr. % L1210 cellevækst

Supernat Frysetørret ethanol- __;__ekstrakt_ I -------- 8 35 II_10__31_

Den rå gæringsbouillon afprøvedes også for anti-bakteriel virkning mod forskellige organismer ved an-

DK 161091B

s vendelse af agarskivemetoden. Den rå bouillon fandtes at være aktiv overfor Alcaligenes viscolactis, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Branhamella catarrhalis og Staphylococcus aureus.

5 En cryogen ampul indeholdende ca. 1 ml kultur suspension anvendtes til at pode 600 ml SD—05 udsædsmedium i en 2 liters rystekolbe med prelorganer.

Indholdet af den podede kolbe inkuberedes i 76 timer ved 33°C på en gyrerende ryster ved 130 opm.

10 Tabel V

Sammensætning af SD-05 udsædsmedium

Amberex 1003 (Amber Laboratories) 0,5%

Glucose monohydrat (Cerelose, Corn Products) 0,1% 15 Dextrin-Amidex B 411 (American Maize) 2,4% N-Z Case (Humko Sheffield) 0,5%

Forstøvningstørret kødekstrakt (Daylin Labs) 0,3%

Calciumcarbonat_0,2% 20 Efter 76 timer overførtes indholdet af udsæds kolben aseptisk til et 30 1 rustfri stålgæringskar indeholdende 16 liter SD-05 udsædsmedium. Indholdet af det podede gæringskar inkuberedes ved 33°C i 24 timer under omrøring ved 300 opm og gennembobledes med luft 25 med en hastighed på 1 rumfang/rumfang/minut.

Den dannede bouillon anvendes til at pode 75 gallons (284 liter) SD-05 udsædsmedium i et 200 gallon (575) rustfrit suilgæringskar. Mediet steriliseres ved dampopvarmning ved 121°C i 40 minutter. Gæringskarret og ind-30 holdet afkøledes til 33°C og podedes derefter med ca. 16 liter bouillon. Den resulterende blanding inkuberedes ved 33°C i ca. 20 timer under omrøring med 155 opm og gennembobledes med luft med en hastighed på 0,75 rumfang/rumfang/minut.

35 Den herved dannede urt anvendtes til at pode ca. 1300 gallons (4921 liter) SM-121 medium i et 2000 gallon (7571 liter) rustfrit stålgæringskar.

Mediet steriliseredes inden podning ved opvarmning med 9

DK 161091 B

damp i 40 minutter ved 121°c. Efter sterilisering afkøledes gæringskarret og indholdet til 33°^podedes og inkuberedes i 5 dage under omrøring ved 125 opm og luftgennembobling ved en hastighed på 0,75 rumfang/ 5 rumfang/minut.

SM-121 mediet bestod af 1,75 vægt% blanding af foderkvalitet sammensat af sojabønnemel, malet gul majs, malet hvede, majsglutenpel, mellemkvalitetshvede, tørrede mælkeprodukter, dyrefedt, konserveret med BHA, ma-10 let roemasse, calciumcarbonat, sucrose, dehydreret lucernemel, dicalciumphosphat, tørret bryggerigær, salt, vitamin B^2 supplement, ribofavinsuppiement, calcium-pantothenat, niacin, cholinchlorid, menadionnatrium-hydrygensulfit (kilde for vitamin K aktivitet), folin-15 syre, pyridoxinhydrochlorid, thiamin., ascorbinsyre, vitamin A supplement, D aktiveret animalsk sterol, kilde for vitamin D^), vitamin E supplement, jerncarbonal; jernsulfat, calciumiodat, manganooxid, kobberoxid, cobaltcarbonat, zinkoxid.

20 Fremstilling af CL-1577-forbindelser overvågedes under gæringscyklen ved in vitro undersøgelser overfor L1210 museleukemiceller og ved antimikrobiel virkning mod Micrococcus luteus. Derudover registreres sådanne gæringsparametre som pH og sedimentprocent under gærings-25 cyklen. Dataene er angivet i Tabel VI.

30 35

DK 161091B

10 o

o III

Q I I I CM H ^ o III-·*·* S I I I m h o

S I I I CM H CO

.. Ill

rH III

O III

o t

o ί i i r- H CM

o iii ^ en I I i lo cn «Η

S ! ! ! H H

4)1*1 ° i i ! I tS ° I I I l£> CO f' S o III-·** jj ” rj _j i i r- in ^ ω o g » i ! !

-P Η > Η III

? 3¾ o ill « Bl ΐ *(5 *<5 a

O IH H Η Η I I I

Λ +} ^ o III

-μ Sin § i ! ! ™ °° «> S IH S i ! ! M " H‘

> DiB-H III

h -p 3 h o iii 0) m^O o vv . ! !

rn CJ π rj in K . 2$ . r-i III

S HIS s a u? ί ί i t 3 bu - <ti s

H

&> 2 53 S~ ij υ ω J| ^ § 8 c*1""" o o r-> h cn cn

So -S . H CN CN CN

> Il II

r-l - (1)___ Λ (d +j 61 s- o 04 m O CO o -N* ίΰ •a o o σ in o m

RJ H CN CM CN CM

m M in o o o o o g. φ h n1 n m in · M K K * * ^ I. pi Φ 03 h h h (O -p

H

Ό 2 •p -s "S TT ^

S' s o <i w in ίο ίο II

h .5 cn t h σι H

8e H $

DK 161091 B

11

Efter 16 timers gæring høstedes de 1140 gallons (4315 liter) gæringsvæske,og blandingen henholdsvis forbindelserne ifølge opfindelsen isoleredes som beskrevet nedenfor.

5 Kemisk isolering af blandingen af CL-1577A og CL-1577B.

pH i gæringsvæsken justeredes til 6,2, og væsken omrørtes i ca. to timer med 3000 liter ethylacetat. Blandingen behandledes med 68 kg Celite 545 filterhjælpemiddel og filtreredes derefter gennem 10 en 79 cm*s plade-og-ranme filterpresse. Filtratet henstilledes og det nedre vandige lag,der udskiltes, fjernedes og ekstraheredes med yderligere 2070 liter ethylacetat. De organiske opløsninger samledes og koncentreredes i vakuum til slutrumfang på 20 liter.

15 Ved henstand ved 5°C natten over udskiltes et nedre lag på ca. 900 ml. Dette lag fandtes kun at indeholde spormængder af CL-1577 A og CL-1577B blandingen og bortkastedes .

Det øvre lag på ca. 19 liter filtreredes gennem 20 Celite545 filterhjælpemiddel for at fjerne uopløselige materialer og vaskedes derefter med 2 liter vand. Ethylacetatopløsningen tilsattes under omrøring 15 liter 50:50 vand-methanoIblanding og derefter 45 liter petroleumsether (kp. 30-60°C). Den resulterende tofase-25 blanding henstilledes,og det øvre organiske lag fjernedes og ekstraheredes en anden gang med 15 liter 50:50 vand-methanolblånding. De vandige methanolekstrakter samledes og koncentreredes i en vakuuminddamper til et rumfang på 3 liter. Den olieagtige rest, der forblev 30 på inddamperens indervægge, opløstes i 5 liter ethylacetat. De 3 liter koncentrat ekstraheredes 3 gange med 1,5 liters ethylacetatportioner, og de fire ethylacetatopløsninger samledes og tørredes på ca. 3 kg vandfri natriumsulfat. Tørringsmidlet affiltreredes og 35 vaskedes med 3 liter ethylacetat. Filtratet og tørre-middelvaskevæsken samledes, og den resulterende opløsning førtes gennem en chromatografisøjle (15 cm i.d.) inde-

DK 161091 B

12 holdende 2,5 kg 40 μια aminopropyl-silicagel (Analytichem International, Inc., Harbor City, CA), der var forvasket med methanol og var i ligevægt med ethylacetat.

De første 4 liter eluat fandtes ikke at indeholde 5 CL-1577 A og CL-1577B blanding og bortkastedes. Det på chromatografisøjlen adsorberede materiale elueredes med et totalt rumfang på 36,1 liter ethylacetat, og eluatet koncentreredes til et rumfang på ca. 600 ml. En lille mængde uopløseligt materiale i eluatet frafiltreredes 10 og filtratet behandledes med 15 liter petroleumsether (kp. 30-60°C) til udfældning af 12,75 g CL-1577 A og CL-1577 B blanding.

Det faste stof tritureredes med 300 ml methanol og det uopløselige materiale fjernedes ved filtrering.

15 Filtratet fortyndedes med 130 ml vand og spor af uopløseligt materiale affiltreredes til fremstilling af et filtrat, der betegnedes "filtrat A".

En 7 cm (i.d.) rustfri stålchromatografisøjle tørpakkedes med 1,9 kg 40 yg C^g-silicagel (Analytichem 20 International, Inc,, Harbor City, CA) og vaskedes derefter i rækkefølge med methanol, 50:50 methanol-vand, 20:10:70 methanol-acetonitril - 0,05 M natriumacetatpuffer (pH 5,1), og endelig 75:25 methanol-vand.

Filtrat A anbragtes på denne søjle og elueredes med 25 17 liter 50:25 methanol-vand efterfulgt af 1,3 liter methanol. CL-1577A og CL-1577B indsamledes i den sidste 1,3 liters methanoleluatfraktion.

Methanolfraktionen koncentreredes i vakuum til en olieagtig rest, der optoges i 30 ml ethylacetat, 30 Ethylacetatopløsningen behandledes med 300 ml petroleums-ether (kp. 30-60°C) til udfældelse af 3,4 g blanding indeholdende CL-1577A og CL-1577B.

Kemisk isolering af CL-1577A.

35 Produktet (3,4 g) af CL-1577A og CL-1577B oplø stes i 40 ml. methanol. Den resulterende opløsning fortyndedes med 10 ml vand og chromatograferedes på den ovenfor beskrevne 7 cm (i.d.) C^g-silicagelsøjle med

DK 161091 B

13 80:20 methanol-0,05 M ammoniumacetatpuffer (pH 6,8) som elueringsmiddel. Strømningshastigheden justeredes til ca. 200 ml/minut, og eluatet overvågedes ved at måle dets ultraviolette absorption ved 254 nm.

5 Den første væsentlige UV-absorberende fraktion elueredes ved en k' værdi på 2,5 (1,8 liter) og betegnedes "opløsning A". (k* værdien er givet ved udtrykket k' = (Ve-Vo)/Vo,hvor Vo er hulrumsfanget, 2,0 liter og Ve er det eluerede rumfang med maksimal 10 ultraviolet absorption).

Opløsning A koncentreredes i vakuum til et rumfang på 100 ml, og koncentratet ekstraheredes med to på hinanden følgende 40 ml's chloroformportioner. Chloroformekstrakterne samledes, tørredes på vandfri 15 natriumsulfat og koncentreredes til et rumfang på 25 ml. Tilsætning af 300 ml petroleumsether (kp. 30-60°C) frembragte udfælding af et fast produkt der betegnedes CL-1577A.

Dette materiale opløstes i 3 ml 65:35 methanol-20 vand og genchromatograferedes med et Prep 500 LC-apparat (Waters Instruments, Inc., Milford, MA) udstyret med en PrepPAK-500 C-18 søjle med 55:20:25 methanol-acetonitril-0,05 molær ammoniumacetatpuffer (pH 6,8) som elueringsmiddel.

25 Eluatet overvågedes ved at måle dets brydnings indeks. Den fraktion der indeholdt CL-1577A elueredes med k'=4,5. Denne fraktion koncentreredes til 85 ml og ekstraheredes med tre 30 ml's chloroformportioner der samledes og tørredes på vandfri natriumsulfat. Til-30 sætning af 250 ml n-hexan til den tørrede og filtrerede opløsning udfældede 0,242 g CL-1577A, der fandtes at være 95% ren ved højtryksvæskechromatografianalyse.

De kemiske og fysiske egenskaber af CL-1577A fremgår af tabel 7 og de ultraviolette infrarøde og 35 200 MHz protonmagnetiske resonansspektre af forbindelsen fremgår af figurerne la, lb og lc.

DK 161091B

14

Kemisk isolering af CL-1577B.

Den anden væsentlige ultravioletabsorberende fraktion, der elueredes fra den ovenfor beskrevne chromatografisøjle elueredes ved k' på 3,5 (2,0 liter) 5 og betegnedes "opløsning B".

Opløsning B koncentreredes i vakuum og koncentratet ekstraheredes med 2 på hinanden følgende 40 ml chloro-formportioner. Chloroformekstrakterne kombineredes, tørredes på vandfri natriumsulfat og filtreredes. Den 10 tørrede opløsning koncentreredes til 25 ml, og ved tilsætning af 300 ml petroleumsether (kp. 30-60°C) udfældede 0,456 g CL-1577B.

En portion (0,43 g) af dette materiale opløstes i 3 ml 65:35 methanol-vand og chromatograferedes på den 15 ovenfor beskrevne søjle med 65:20:25 methanol- acetonitril-0,05 M ammoniumacetatpuffer (pH 6,8) som elueringsmiddel. Eluatet overvågedes ved at måle dets brydningsindeks. CL-1577B forbindelsen elueredes ved k'=7,5 i en fraktion på 1,85 liter. Denne opløsning 20 koncentreredes til 100 ml og ekstraheredes med tre 35 ml chloroformportioner. Chloroformekstrakterne samledes, tørredes og koncentreredes til 20 ml.

Tilsætning af 300 ml cyclohexan udfældede 0,30 g CL-1577Bf der fandtes at være 95% ren ved højtryks-25 væskechromatografianalyse.

De kemiske og fysiske egenskaber af CL-1577B fremgår af tabel 7,og de ultraviolette, infrarøde og 200 MHz prc’-onmagnetiske resonansspektre af forbindelsen fremgår af figurerne 2a, 2b og 2C.

30 35

DK 161091 B

15 , ' ' . - » r- ”g tn Ό Ό rQ —· w ø — —

^ ^ —' '—' CO

O O O LO O CM I 10-00 'tjrHc^cNi rooLDrriTi'xi—'Crv tn <x> <D ό co o ----σν-ιη- fi ό >HHH Ol H CN (N Π •w^ LD CTv 0 oo >d - · C - a' ' ' ' ' ' ' ' φ ' ^ -—. p oo

oomo M ^|d bi *-n P

μ<οο h o- co Ό g g ιο^ΌΛΌό^ ro XI £ QVO'iOh — — —— tø - — — — H 3 43,-),-1,-1 --- OO U Φ

m - ^vOr-IN LO LO 00 <Τι LO Μ Ό dP

co in η σι q - - - lo ΓΜ^οοΜ'σΊΐοοοοοιο - u c jg CQ •.•'•»o o o o lo <n - - - -co --- -i—l ω co t" co CO CD H ·Η (Tv LO LO t'' Η H CM 00 - ^ lO m CO H - “g) „ % - K £33:1.....".....S $>“

h il il II II g * *. »in 'O In 'ε^ε ra ra o S -i K

i cd ni ni aj tn o lo o oo — — — — m — -^--— p H

J JOOCOH — O Ή . dP

pi - - - - (3 σι οι - cm m >j in σιΓ^£ΜΊ,·^Ρ'-'_Ό02 ^ g g g g cmhho Η<ίΗΜϊν^σιο·Νν) _ dj jp ro cccc oo ' ' ' — t'' — O Φ ? —

Cl) - - - 00 Η H CM CM -|J 'f in CO 00 CTi g CO

inMNin Homo ro co _ Φ H m 00 CM (6 I-· CM LO - - - - - -----H UO «

cm cm cm co -η σι in cm m I 0_ G U

ftNrlHO flO M So w S £ S M „ £ S

II II II II -H CTv — — — — g— — — — — II CTv-d dP

ϋ κ < *·. s—1' i—i G i”I

|C o (jooo - H H co co <n t~~ r- H H fl I fe OO

rararara H lo o H to o H'f HinNHC'^Nco ·—> o tn - c ej dj c p -¾1 VO 00 'i LO ---------- O Γ- Φ rf

Hr< r< r< ft CO Η H CJv C- ΗΗΙΜΟΜΜι,ίΜιΐηΐΟΓ' ·—11 Η Μ lO

P--— Γ- i -« - - - o 3 -J'w'2· «!§ ~ y Ό w —— H tn

— — — ' co c- C

in o O O co LO H O CM · - -H

O ti H Is CM HH ' CMM'fflr-H g CO

Φ CD 00 O Ί< >-CM - -- -0)H p

fd ί> Η Η H · - CM r.M-Lnin^ M dP

C- O H -g ** J3 00 m - - -lo - -—.s— - — -co r- ctv B SSSr1' -ίε8^ »139"-·» "ri ® Λ 5333? S““4r““““>o ti S ..

0 m cm cm i oo r^· o -lo 3 <*dO a H < 'tf CM LO g - - - LO LO i—I LO CTv <Ti C- —. - U tJO ^ v_iuj r-, --- - oooiocTi ro - -- -- -ωοο ό o op

>10 k C- 00 CD i—I -HcrvLOlOC- -CMCMCOCOrJiLO - p -tf OM

^ ^ (MCMHH 4JcoM<H H dj - £ P H 00 HU ^ Qj H HH* ***·,% OJ o * φ 3 Η II II II II tf lO n — JT ^ ni °°

O jo I 0 - - - LO 6 B W B fi Λ H JJJ

co to j co co to co tn o lo o 00 —— — — — — —

O CO CO H — CTV O ffl . EC

U ----COCTV^fCM- lOOCMfflC-OlO'T ^ 51¾ g g g g cmhho cocnco-^oocoLOH - Λ ,,Φ <*£ c H c δ oo r**- o O > ^ i (1)---00 HHCMCOCOMflOCO CO O o LO CM CM co Holoo - °ΐ!ί?ϋ{'

H LO 00 H Cl) [ CM LO - --------^ H CTv (O CO

d) CM CM CM CO -HCTiLOCMLO 1 i2 0-1 CM Η Η O Ό g g g »SSSS , J -Λ W II II II II h cn — — — — — — — — — H i ^ o

H U * * * ^HdP

tn x X ><: κ q O O O - HCDCMlOHrOlOO O0„ to >1 ssddd -HLOOHO H in (M COO LO M1 O CD 'TT^S’cm £1 gggg p-^LDCOCTV --------- ti 00 Φ — HHHH ft CO Η H (Tv Η H CM CM CO ^ LO CO CO '—' H Xi c0 _____LO_ g i i ti hi - ^ S g^

•P S U O Q +j H -H

ϊ fis· s f i -g iJ 3?

6· «8 HSS'°iiS

S lH

O 2 -H HH+I'd *P

4J S U d) ^ H ** -p 3 5 e· ds g>~titi3§ s s ρ.·3 r s

m w Μ V) EHB?3- 51 P

8 S 81 S ή

g, +j -8 fio-fi ”3 4 -R 4J I

»Sti 4,3 8 l-dS'JSS 11 s OG d H +1 gtnBy ^>s d

Sus Sqti ^I x & ^ dti cdj-H 15 2 3,61 W-μ i ρω p p 4J Λ 4¾ & S 11 ·Η H s S8 ^ S S 8ls^s" fil 3

3 -Η H (LV o Μ οΓ-Η 51Ό C1 O H

' "16

DK 161091B

ICQ

Γ" Γ" m Η u t VO ΓΟ

CM I

*> «. I

VO O I

CM I

£ Γ- in

I—I

é B1 £ r- in

HU C

H * H £ 1¾¾ t h~ a φ ^ x in cm „ rl o in 00 in ^ fe1 h ° ^ _ ^ X m m cm o a ·· t

'ΰ o H a I

tCM g co p

in S § uH

^in $ * * • HO 0} pj ft

Q Η Φ * #fcS Η H M

P(g§° >HH I 1 W

s & Ιό;aβ a a

I Λ » σι H ί-J Ή & Ή -H S S

(ti tn ». tn+J n-ι n .. <h h 1 IriSSti 1¾¾ «λ &

S S SU 8 8 -§isu 3 3 S

g.§ λι^η I

HH S Q ScOO (ti -H 3 CO „ Q) H ΐ ra ra S vo ^ ^ S d vo ϋ.$ |?h +J (ΧΤΠ 8 JS ^ SiH 8 æ 0¾ rH+! «crtili^eg-IS si åg

DK 161091B

17

Biologisk virkning af CL-1577A og CL-1577B.

Den antimikrobielle virkning af CL-1577A og 5 CL-1577B bedømtes ved af mætte 12,7 mm papirskiver med en 500 pg/ml opløsning af enten CL-1577A eller CL-1577B, anbringe hver mættet papirskive i en bioassaybakke indeholdende et agarmedium podet med en særlig organisme, inkubere i 16 timer ved 37°C og måle diameteren af den 10 resulterende væksthæmningszone, såfremt der var nogen.

Dataenefor disse undersøgelser er vist i tabel VIII.

18

DK 161091 B

-i-pq PQ t" Γ" ΓθΗΓ'ΠοοιηοοΓ'(ΝΜσ>^νο^Γ'«>^<ΝΗΐ> - Λ Ml] OJPIOjmoiOjrOOJrHOiOJOlOiOlOJHOJOlOlCNlH p t*i "Μ ιΗ λ

ιΗ Ο) I X

I i ι-3 Ή ι-3 3 ο <! Ο ·Η ό a tn a Ο 0) s L i VO CO Γ"' g m tri t— __, -[Λ n'd’cotN'^Hor^r^ror'joHr^ni'oovoinmnr^ h V 3 “! NfONfOtONfOHHNMnfONNHCMMMNH .53 J βΐ sg ο ε μι cd g SO o §, Η Ή Λ CN Η η <c +j η ω g > tn (3 o PS « h o Η -H > >i°0 <d cs a w ,Q X g ..

a a a em -η - o > ε <d ·η ^ Η Γ-H 4-) . 3 a cjHCNovcjvoocon·^ o HoifO'vp hg ® S Ϊ!!!ΐϊϊίίίίϊϊ?8ϊϊ·<5ίϊϊϊ§ « p £ϋ Η ω & - a a *. 81 5 B g 5 8 3 d r-voinmin ^ainro^coininimninioiiio ω u η h 10 in in 0310001000-31^^^^-^^01 πω oojioiOiot^LOvnojcoooooioooooooto h-h 3 10 ^•^j'incNioioiOLnioiOLnH o > oyoootrjgoyooosooooooosj O a

3 g 13 g g g g g g Si S S S S S S SS S SS S

g si S to o ·\ · -h-h εωωωωωιοω jjlo

G 4-1 p -Η -Η -Η ·Ή -Η -Η -Η φ H O

Φ iptoratnmm Sh8888888 ^m'3* g P O -H -H -H -H -H -H -H -H -H <D Η Λ a ,a <ΰ a nj a d d ,¾ d S P BHHHHHHHrlri+J il'H'H'HW'H'H'H'O S T a d -S Φ -S*

a •Hto'B'B'B'S'BaaaaMgGDGGGGG^ fcj jd -S

tn HØWtntntntn-H-H-H-HPPGGGGGGG ga-H

^ Μ-ΐδωωωωιη'δ'δ’δ'δϋΪΗδδδδδδδ·^ 8 85‘35355tiTjtiti8d33B35aS8' 1111 a Sii^,d,dr!irz!'d§§§§Pyft,S<£i,ft|ft,S<S,r3j o

M pro-H-H-H-H-HÆÆÆÆH-HQ)<UaJ(D<D(D(Da U

•η Β,ϋϋϋϋϋϋϋΌΌΌϋΡΗ^ΗΗΗΗΗΗ fiQ

s! &Haaa(3awwww-H®4J+)4-)-p4j4j4jp

s < fp m m m m m η η h w a (¾ co co ω cn ω w ω S K

DK 161091B

19

Antitumorvirkningerne af CL-1577A og CL-1577B overfor Bl6 melanocarcinom hos mus bedømtes ved anvendelse af den undersøgelse, der er beskrevet i Cancer Chemotherapy 5 Reports, 3. del, bind 3, 1-87, 1972. Datrene fra disse undersøgelser fremgår af tabel 9. I hvert tilfælde inficeredes musene intraperitonealt på dag 0 og blev derefter indgivet de angivne dosis af CL-1577A eller CL-1577B på dagene 1, 5 og 9 for undersøgelsen.

10 Dataene er anført som T/C-værdier hvor: gennemsnitlig overlevelsestid for behandlede mus ip/c = ----—-- gennemsnitlig overlevelsestid for kontrolmus

Tabel IX

15 In vivo antitumorvirkning af CL-1577A og CL-1577B (målt overfor B16 melanocarcinom hos mus).

Dosis (yg/kg legemsvægt) T/C (x 100)

20 CL-1577A CL-1577B

10 Toxisk 206 5 196 160 2,5 201 172 25 1,25 198 144

Antitumorvirkningerne af CL-1577A og CL-1577B overfor P388 lymfocytleukemi hos mus bedømtes ved an-30 vendelse af den undersøgelse, der er beskrevet i

Cancer Chemotherapy Reports, del 3, bind 3, 1-87, 1972.

Dataene for disse undersøgelser fremgår af tabel X.

Musene inficeredes intraperitonealt dag 0 og blev derefter indgivet de angivne dosis af CL-1577A eller 35 CL-1577B på dagene 1, 5 og 9 for undersøgelsen.

DK 161091 B

20

Tabel X

In vivo antitumorvirkning af CL-1577A og CL-1577B (Målt overfor P388 lymfocytleukemi hos mus).

5 ____

Dosis (ug/kg legemsvægt) T/C (x 100)

CL-1577A CL-1577B

16 Toxisk ---- j^q 10 ---- Toxisk 8 163 ---- 5 160 4 192 ---- 2,5 172 15 _^“_144

De antibiotiske forbindelser CL-1577A og CL-1577B kan anvendes på grund af deres antimikrobielle og antitumor virkning i form af 20 farmaceutiske præparater i kombination med en forenelig farmaceutisk acceptabel bærer. Disse præparater kan også indeholde andre antimikrobielle og/eller antitumor midler. Præparaterne kan oparbejdes til en vilkårlig passende farmaceutisk form til den ønskede indgivnings-25 vej. Eksempler på sådanne former inkluderer faste former til oral indgivning såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere og granulater, flydende former til topisk eller oral indgivning som opløsninger, suspensioner, siruper og elixirer, samt former der er egnede til 30 parenteral indgivning såsom sterile opløsninger suspensioner eller emulsioner.

Til brug som antimikrobielle midler kan præparaterne indgives således, at koncentrationen af den aktive ingrediens eller ingredienser i præparatet overstiger 35 den der kræves til minimal hæmning af den særlige mikroorganisme som søges bekæmpet.

Claims (7)

1. Blanding af svovlholdige antibiotiske forbindelser betegnet CL-1577A og CL-1577B, kendetegnet ved, at CL-1577A har karakteristikaene: 5a) en molekylvægt (FAB massespektrometri) på 1248 а. m.u., b) et ultraviolet absorptionsspektrum i methanol-opløsning med absorptionsmaxima ved 215 nm (a = 27,4), 252 nm (a = 28,2), 282 nm 10 (a = 16,7), og 318 nm (a = 11,6); c) et infrarødt absorptionsspektrum (kaliumbromid-pille) med principale absorptionstoppe ved 3450, 2970, 2930, 1690, 1630, 1610, 1600, 1525, 1465, 1450, 1410, 1370, 1310, 1250, 1210, 1155, 15 1075, 1020,990 , 905, 880, 855, 795, 780 og 750 reciprokcentimeter,. d) et 200 MHz protonmagnetisk resonansspektrum (CDCl^) med signaler ved 1,11 (dublet), 1,33 (dublet), 1,35 (dublet), 1,41 (dublet), 20 1,56 (multiplet), 1,95 (dublet), 2,12 (multiplet), 2,13 (singlet), 2,22 (multiplet), 2,30 (multiplet), 2,52 (dobbelt dublet), 2,53 (singlet), 2,75 (multiplet), 3,42 (singlet), 3,4-4,2 (multiplet), 3,81 (singlet), 25 3,89 (singlet), 3,98 (singlet), 4,21 (singlet), 4,57 (dublet), 4,67 (multiplet). 4,97(dublet), 5,40 (multiplet), 5,49 (dublet), 5,50 (multiplet), 5,70 (dublet), 5,82 (dublet), б, 00 (dublet), 6,15 (bred singlet), 6,26 30 (singlet), 6,60 (dobbelt duplet), 7,49 (singlet) og 11,71 (singlet) ppm. fra tetramethylsilan, e) en optisk rotation [a]D = -198° (c 1,25, CHC13); f) elementaranalysen, 53,26% C, 6,04% H, 35 3,82% N og 8,98% S, og • ‘ DK 161091 B g) smeltepunkt 185-195°C med forudgående brunfarvning begyndende ved ca. 140°C, h) retentionsrunfang, HPLC (pBondpak C^g silica, 3,9 mm i.d. x 30 cm, elueringsmiddel 55:20:25 metha- 5 nol-acetonitril-0,05 M ammoniumacetatpuffer (pH 6,8)): 12,02 ml, og i) Rf-værdi ved tyndtlagschromatografi (opløsningsmiddel: 9:1 methanol-0,1 M ammoniumacetatpuffer (pH 6,8), C^g silicagel, 200 μπι tykkelse, Whatman

10 KClgF modfase TLC): 0,5 og at forbindelse CL-1577B har karakteristikaene: a) et ultraviolet absorptionsspektrum i methanol-opløsning med absorptionsmaxima ved 215 nm (a = 26,8), 252 nm (a = 26,5), 282 nm 15 (a = 16,1) og 325 nm (a = 11,9)? b) et infrarødt absorptionsspektrum (kaliumbromid-pille) med principale absorptionstoppe ved 3450, 2970, 2930, 1690, 1630, 1610, 1600, 1525, 1465, 1450, 1410, 1370, 1310, 1250, 20 1210, 1155, 1075, 1020, 945, 905, 880, 855, 795, 780 og 750 reciprokcentimeter, c) et 200 MHz protonmagnetisk resonansspektrum (CDClg) med signaler ved 1,11 (dublet), 1,12 (dublet), 1,24 (dublet), 1,35 (dublet) 25 1,41 (dublet), 1,43 (singlet), 1,45 (multiplet), 2,00 (multiplet), 2,13 (singlet), 2,14 (multiplet), 2,31 (multiplet), 2,52 (singlet), 2,53 (multiplet), 2,75 (multiplet), 3,42 (singlet), 3,4-4,2 (multiplet), 3,79 30 (singlet), 3,89 (singlet), 3,99 (singlet), 4,19 (singlet), 4,49 (multiplet), 4,56 (dublet), 4,66 (dublet), 4,77 (multiplet), 4,97 (dublet), 5,35 (bred singlet), 5,47 (multiplet), 5,72 (dublet), 5,83 (dublet), 5,93 (dublet), 35 6,21 (multiplet), 6,24 (singlet), 6,59 dobbelt dublet), 7,61 (singlet) , 8,64 (singlet) og 11,58 (singlet) ppm. fra tetramethylsilan, DK 161091B d) en optisk rotation [α]β = -189° (c 0,63, CHClg), e) elementæranalysen, 54,81% C, 6,33% H, 3,68% N, 8,96% S, f) smeltepunkt 170-195°C med forudgående brunfarvning 5 begyndende ved ca. 140°C, g) retentionsrumfang, HPLC (yBondpak C^g silicagel, 3,9 mm i.d. x 30 cm; elueringsmiddel 55:20:25 methanol-acetonitril-0,05 M ammoniumacetatpuffer (pH 6,8)): 26,26 ml, og 10 h) Rf-værdi ved tyndtlagschromatografi (opløsnings middel: 9:1 methanol-0,1 M ammoniumacetatpuffer (pH 6,8), C1g silicagel, 200 ym tykkelse, Whatman KC-jgF modfase TLC): 0,43.

2. Forbindelse CL-1577A som defineret i krav 1.

3. Forbindelse CL-1577B som defineret i krav 1.

4. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder i det mindste en af forbindelserne CL-1577A eller CL-1577B, hvilke forbindelser* har karakteristikaene i krav 1, sammen med et farmaceutisk 20 acceptabelt bæremiddel.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af en antibiotisk blanding af forbindelserne CL-1577A og CL-1577B, som defineret i krav 1, eller de enkelte forbindelser i denne, kendetegnet ved, at en stamme af

25 Streptomyces sp., identificeret som isolat ATCC 39363, dyrkes under aerobe betingelser i et dyrkningsmedium indeholdende assimilerbare carbon- og nitrogenkilder, indtil der er frembragt en væsentlig mængde af blandingen, og at blandingen, CL-1577A eller CL-1577B efterfølgende 30 isoleres.