DK161048B

DK161048B - Fremgangsmaade til fremstilling af humant interferon

Info

Publication number: DK161048B
Application number: DK496779A
Authority: DK
Inventors: Sidney Pestka; Menachem Rubinstein
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1979-11-22
Publication date: 1991-05-27
Also published as: ES486263A0; NL193085B; FR2442054A1; FI69476B; GR72828B; GB2037296B; NL7908516A; MY8500222A; ES8100502A1; JPH07224098A; NZ192201A; AU561672B2; DE2947134C2; LU88314I2; LU81918A1; KR830002616B1; US4289690A; PH20763A; SE454276B; CH653347A5

Description

DK 161048B

Rensningen af proteiner har længe været et problem inden for peptidkemien. De til dette formål anvendte metoder omfatter udfældning, gelfiltrering, ionbytningschromatografi, gelelektroforese, affini-tetschromatografi og mange andre metoder. Fremgangsmåder til iso-5 lering af naturligt forekommende, højmolekylære proteiner, som forekommer i biologiske materialer i ekstremt ringe koncentration, omfatter flere af de ovennævnte metoder. I mange tilfælde må der anvendes og forarbejdes overordentlig store mængder råmateriale på grund af de store tab under den samlede fremgangsmåde. Det fremgår 10 deraf, at rensningmetoderne til sådanne proteiner er overordentlig besværlige og kostbare. Et godt eksempel herpå er de forskellige forsøg på isolering og karakterisering af interferon. Siden Isaacs og Lindenmann's opdagelse af dette stof i 1957 har forskere over hele jorden i to årtier uden held forsøgt at isolere interferon, både fra 15 leukocyter og fra fibroblaster, som et homogent peptid i så store mængder, at det var muligt at foretage en karakterisering og bestemmelse af dets specifikke biologiske og kemiske egenskaber.

I USA patentskrift nr. 3.699.222, som angår de første arbejder af Isaacs og Lindenmann med interferon, består rensningen af det aktive 20 stof kun i en ammoniumsulfatudfældning og påfølgende dialyse. Da en sådan fremgangsmåde er relativt uspecifik, er det vundne produkt stadig overordentligt urent.

En flertrinsfremgangsmåde til rensning af interferon er beskrevet i USA patentskrift nr. 3.414.651, hvilken fremgangsmåde omfatter føl-25 gende trin: selektiv adsorption på amorft aluminiumsilicat, eluering med iod- eller thiocyanatopløsning, yderligere fældning af uønskede proteiner med vandigt HC1 og vandig natriumhydroxidopløsning, fældning af interferonet ved hjælp af med vand blandbare opløsningsmidler såsom methanol, ethanol eller acetone og endelig chromatografi af det 30 igen opløste interferon på et ionbytterharpiks såsom 2-diethylamino-ethylcellulose. Ved denne rensningmetode kan interferonets specifikke aktivitet forøges med en faktor 6000. Som specifikke interferoner er i USA patentskriftet nævnt hønse- og abeinterferon.

En yderligere rensningsmetode er beskrevet i USA patentskrift nr.

35 3.975.344, hvor en opløsning af urenset human-fibroblaster-interferon 2

DK 1610 4 8 B

renses ved massefyldegradient-ultracentrifugering. Det er angivet, at der ved denne metode opnås højere udbytte og renhed end ved metoden under anvendelse af søjlechromatografi på "Sephadex" G-100.

De nedenfor anførte publikationer angår ligeledes rensningen og den 5 forsøgte karakterisering af interferoner:

Knight, E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 520-523 (1976);

Tormå, E.T. et al., J. Biol. Chem. 251, 4810-4816 (1976);

Bridgen, P.J. et al., J. Biol. Chem. 252, 6585-6587 (1977); DeMaeyer-Guignard, J. et al., Nature 271, 622-625 (1978); LO Kawakita, M. et al., J. Biol. Chem. 253, 598-602 (1978);

Berthold, W. et al., J. Biol. Chem. 253, 5206-5211 (1978);

Jankowski, W.J. et al., J. Virology 16, 1124-1130 (1975);

Davey, M.W. et al., J. Biol. Chem. 251, 7620-7625 (1976);

Chadha, K.C. et al., Biochemistry 17, 196-200 (1978).

15 Selv om det i adskillige af de ovennævnte publikationer er hævdet, at muse- eller human-interferoner kan renses, indtil de er homogene, er der hverken angivet et af de klassiske beviser på proteiners, homogenitet eller beskrevet de angiveligt rene forbindelsers egenskaber.

Anvendelsen af høj tryksvæskechromatografi (HPLC) til rensning af 20 proteiner er almindelig kendt inden for området, idet der beskrives ionbytnings- og udelukkelseschromatografi (jfr. fx Regnier, F.E. et al., J. Chromatog. Sci. 14, 316-320 (1976) og Chang, S.-H. et al.,

Anal. Chem. 48, 1839-1845 (1976)).

I omvendtfase-chromatografien anvendes fx "Lichrosorb" RP-18 (søjler 25 på basis af octadecyl-modificeret SIO2) med held til rensning af peptider, fx ^-endorphin (jfr. fx Rubinstein, M. et al., Proc. Natl.

Acad. Sci., USA 74, 4969-4972 (1977)).

Endelig er den delvise karakterisering af tre interferonkomponenter fra Ehrlich Ascites-tumorceller fra mus beskrevet (molvægt = 33.000, 30 26.000 og 20.000) af Cabrer, B. et al., J. Biol. Chem. 254, 3681-3684 (1979). Dertil blev anvendt en konventionel oprensningsrutine, dvs. én uden anvendelse af højtryksvæskechromatografi.

DK 161048 B

3

Hancock et al. [FEBS Lett. 72, 139-142 (1976)] og Moluar et al.

[Peptides, Proc. 5th Arner. Peptide Symposium, University of Calif.,

San Diego, 1977, Eds.: Goodmann, Meinhofer; John Wiley & Sons, Inc.; (1977), side 48-51] beskriver udelukkende anvendelse af HPLC på 5 peptider, som er lavmolekylære i forhold til interferon. På det tidspunkt, hvor den foreliggende opfindelse blev gjort, var det overraskende for fagfolk, at HPLC også kunne anvendes på proteiner med en molekylvægt på over 12.000.

Den analytiske adskillelse af en proteinblanding med komponenter, 10 hvis molekylvægte delvis ligger over 12.000 Dalton, er beskrevet af W. Monch og W. Dehnen i J. Chromat. 147, s. 415-418 (1978). Denne analytiske teknik var dog ikke udviklet så vidt, at den uden væsentlige ændringer ville kunne anvendes direkte til renfremstilling af biologisk aktive proteiner i præparativ målestok. Fx var såvel pro-15 blemet med adskillelsens skarphed som med det egnede opløsningmiddel ikke blevet løst. Visse af de i litteraturstedet angivne fremgangsmådeparametre såsom en arbejdstemperatur på 47°C og stærkt sure medier (pH = 2) afviger stærkt fra parametrene for fremgangsmåden ifølge opfindelsen og vil derfor snarere afholde fagfolk fra a priori 20 at anse denne metode for at være egnet til oprensning af biologisk aktive proteiner. Ligeledes er der heller ingen antydning af, hvorledes denne fremgangsmåde skulle modificeres for at gøre den anvendelig til renfremstilling af humant interferon.

Den foreliggende opfindelse angår en forbedret fremgangsmåde til 25 rensning af humant interferon med højere opløsning og godt udbytte i præparativ målestok. Fremgangsmåden er ejendommelig ved, at en vandig opløsning af det urene protein ledes gennem en med en puffer ækvili-breret søjle på basis af en med cyanopropyl-, cyclohexyl-, phenyl-, octyl-, octadecyl- eller glycerylgrupper modificeret porøs S1O2-30 matrix tinder HPLC-betingelser, hvorved proteinet først adsorberes og derefter elueres med en stigende eller faldende gradient af et med vand blandbart opløsningsmiddel, så at det til slut fås i bestemte eluatfraktioner i renere form, og at man eventuelt gentager behandlingen én eller flere gange med de fremkomne eluatfraktioner i renere 35 form. Disse søjler, som kan anvendes efter hinanden og under for-

DK 161048 B

4 skellige betingelser med hensyn til pH og organiske opløsningsmidler, gør det muligt at oprense humant interferon, der i naturligt materiale forekommer i ekstremt ringe mængder, indtil homogenitet.

Således angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til op-5 rensning af humant interferon til homogenitet i mængder, der er tilstrækkelige til for første gang at muliggøre en kemisk karakterisering af dette medicinsk værdifulde stof. Muligheden for kemisk at karakterisere interferon er et bemærkelsesværdigt fremskridt i udviklingen af dette stof, da dette er en forudsætning for at synteti-10 sere stoffet, enten ved konventionel peptidsyntese eller ved gelmanipulering under udnyttelse af egnede organismer, fortrinsvis bakterier.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af humant interferon som homogent protein er ejendommelig ved, at man 15 A) leder en vandig opløsning af interferon i uren tilstand under HPLC-betingelser gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med octylgrupper modificeret Si02-matrix, hvorved interferonet først adsorberes og derefter elueres med en stigende gradient af et med vand blandbart opløsningsmiddel i en puffer, så at det fås i 20 bestemte eluatfraktioner i renere form; B) leder de i trin A) vundne bestemte fraktioner gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med glycerylgrupper modificeret S1θ£-matrix, hvorved interferonen først adsorberes og derefter elueres med en faldende gradient af et med vand blandbart opløsnings- 25 middel i en puffer, så at det fås i udprægede hovedtoppe i bestemte eluatfraktioner i renere form; C) leder de i trin B) vundne fraktioner, som svarer til de udprægede hovedtoppe, under HPLC-betingelser gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med octylgrupper modificeret Si02-matrix, 30 hvorved interferonet først adsorberes og derefter elueres med en blanding af et med vand blandbart opløsningsmiddel og en vandig puffer, så at man får det i en enkelt, udpræget top i bestemte eluat-

DK 161048 B

5 fraktioner som homogent protein, og, om ønsket, gentager trin C) til opnåelse af produktet i yderste renhed.

HPLC-Søjler på basis af med octyl- eller glycerylgrupper modificeret porøs SiC>2-matrix (partikelstørrelse = 10 μ, gennemsnitlig porestør-5 relse = 100 A), som anvendes ved udførelse af den foreliggende opfindelse, er handelspræparater, der fx kan fås fra EM Laboratories of Elmsford, New York, USA, under mærket "Lichrosorb" RP-8 og "Lichro-sorb-Diol". Ækvivalente octylmodificerede porøse Si02-søjler ("Chromegabond" C-8) kan fås fra E.S. Industries, Marlton, N.J., USA.

10 Et egnet HPLC-system, i hvilket de ovenfor nævnte søjler kan anvendes, er beskrevet i USA patent nr. 4.116.046.

Ved udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen ledes opløsningen af det urene højmolekylære peptid, fortrinsvis i nærværelse af en vandig puffer ved en til det pågældende protein egnet pH-værdi, gen-15 nem Si02-søjlen. Normalt foregår dette under tryk, fortrinsvis ved ca. 3,4-340 atmosfærers tryk. Det på søjlefyldmaterialet adsorberede protein elueres derefter trinvis og selektivt under anvendelse af en gradient af et med vand blandbart opløsningsmiddel.

Til dette formål egnede opløsningsmidler er fx alkanoler såsom n-20 propanol, 2-propanol, ethanol, methanol og tert.butanol og cycliske ethere såsom dioxan. Fraktioneringen af eluatet foretages på i og for sig kendt måde, idet indholdet af det aktive protein i de enkelte fraktioner bestemmes med høj følsomme monitorer. Et til dette formål egnet system er beskrevet af Bohlen et al., Anal. Biochem. 67, 438 25 (1975). Det er også anbefalelsesværdigt at iagttage nærværelse af målproteinet ved en egnet bioassay-metode.

Afgørelsen af, hvilken af de to søjletyper (søjle til normal forde-lingschromatografi og søjle til omvendtfase-chromatografi) der skal anvendes og i hvilken rækkefølge, afhænger i stor udstrækning af 30 arten af det protein, der skal renses. Det har vist sig, at der fx i det særlige tilfælde med human-leukocyt-interferon opnås de bedste resultater, når den urene interferonopløsning først ledes gennem en søjle på basis af en med octylgrupper modificeret Si02-matrix (om-

DK 161048 B

6 i i vendtfase-chromatografi) under anvendelse af en puffer med en pH-værdi på ca. 7,5 (fortrinsvis 1M natriumacetat/eddikesyre) og elueres med en stigende n-propanol-gradient, hvorefter de opsamlede aktive fraktioner ledes gennem en søjle på basis af en med glycerylgrupper 5 modificeret S iC>2-matrix med en 0,1M natriumacetat - puffer og elueres med en faldende n-propanol-gradient, hvorefter de adskilte inter-ferohkomponenter ledes gennem en søjle på basis af en med octylgrup-per modificeret S iC>2-matrix under anvendelse af en puffer med en pH-værdi på ca. 4,0, fortrinsvis 1M pyridin/2M myresyre, og elueres med 10 en stigende n-propanol-gradient. På denne måde kan hver af de tre adskilte human-leukocyt-interferoner (α,β og γ) videreopspaltes, idet der i chromatogrammet fås skarpt adskilte toppe, som viser de homoge- j ne proteiner. Ved den totale rensnings fremgangsmåde, startende med ihkuhationsmediet og sluttende med chromatografi på den anden, med 15 octylgrupper modificerede Si02-matrix opnås en forøgelse i renhedsgraden med en faktor 60.000-80.000.

Ved en særlig udførelsesform for fremgangsmåden til rensning af human-leukocyt-interferon samles de i trin B) vundne fraktioner, som svarer til hovedtoppene, ekstraheres til fjernelse af n-propanolet 20 med n-hexan og befries for spor af n-hexan før trin C) .

De fremstillede homogene human-leukocyt-interferonkomponenter har en skarp top i chr omat o gramment fra de ovennævnte HPLC-søjler samt et enkelt snævert bånd ved polyacrylamid-gelelektroforese på natrium-dodecylsulfat (NaDodSO^ i nærværelse af 2-mercaptoethanol. Ekstrak-25 tion af gelen giver en enkelt skarp top med antiviral aktivitet, som stemmer overens med proteiribåndet. Specifikke aktiviteter af de rene interferonkomponenter ligger i området mellem ca. 2,6 og 4,0 x 10® enheder/mg med MDBK-celler (epitheliale nyreceller fra okse) og i området fra 1,5 til 4 x 10® enheder/mg med human-cellelinjen Ag 1732.

30 Molekylvægtene ligger mellem ca. 16.000 og 21.000 (jfr. tabel IV, side 17-18). Resultaterne af aminosyreanalysen er angivet i tabel V (side 18).

Interferonerne har antiviral, antitumor-, væksthæmmende og immunosup-pressiv virkning. Disse aktiviteter kunne endog fastslås i klinisk 35 målestok ved administration af 1-10 x 10® eriheder/dag med relativt

DK 161048 B

7 urene præparater, som indeholdt mindre end 1% human-interferon. De rensede, homogene interferonkomponenter isoleret ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes på samme måde som de kendte interferonpræparater under tilpasning af doseringen efter den 5 opnåede renhedsgrad. De enkelte interferonkomponenter kan administreres alene eller i blandinger med hinanden. Sådanne blandinger kan enten fås ved blanding af de enkelte komponenter eller ved afbrydelse af rensnings fremgangsmåden på et trin, hvor flere interferonkomponenter, men ingen interferon-inaktive proteiner, forekommer.

10 Den omhandlede rensnings fremgangsmåde kan, selv om den kun er eksemplificeret ved human-leukocyt-interferon, også anvendes til rensning af andre interferoner, fx af human-fibroblaster-interferon.

Foranstaltninger, som er egnede til at gøre fremgangsmåden ifølge opfindelsen optimal til rensning af andre humane interferoner, ligger 15 inden for fagmandens kunnen.

Induktionen af interferon-produktionen, den første koncentration og fraktionering af interferonet, herunder gelfiltrering, kan foretages på i og for sig kendt måde. Disse fremgangsmådetrin, som giver en vandig opløsning af interferon i uren tilstand, er ikke genstand for 20 den foreliggende opfindelse.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse illustreres ved nedenstående eksempler: EKSEMPEL 1

Homogent human-leukocyt-interferon fra normale donorer.

25 A. Fremstilling af interferonet.

Interferon fremstilles ved 16 timers inkubering af human-leukocyter fra blodet fra normale donorer (10^ celler/ml) med Newcastle-disease-virus (15 hæmagglutininenheder/ml) i et serumfrit minimalmedium, som indeholder 10 mg/ml casein. Der fås en gennemsnitlig interferontiter

DK 161048 B

8 på 5000 enheder/ml. De anvendte metoder svarer til de af Mogensen, K.E. et al., Pharmacology and Therapeutics A, 1977, 369-381; Whee-lock, E.F., J. Bacterial. 92, 1415-1421 (1966) og Cantell, K. et al., Appl. Microbiol. 22, 625-628 (1971) angivne metoder med enkelte 5 mindre ændringer. Interferontiteren bestemmes ved et forsøg på basis af hæmningen af den cytopatiske effekt, der kan udføres i løbet af 16 timer. Alle interferon-titere er angivet i enheder/ ml, kalibreret mod National Institute of Health (USA) ’ s referencestandard for human-leukocyt-interferon.

10 B. Koncentrering og første fraktionering af interferon.

Såfremt intet andet er angivet, arbejdes der ved en temperatur på 0-4°C. Efter endt inkubering fjernes cellerne og cellerester ved centrifugering (15 minutter, 500 x g). Casein udfældes ved syrning med HC1 til pH-værdi 4,0. Efter 2 timers forløb centrifugeres blan-15 dingen (10 minutter, 12.000 x g), og bundfaldet kasseres. Den overstående væske (10 liter) indstilles på et indhold af 1,5 vægt/volu-menprocent trichloreddikesyre. Efter 1 times forløb fracentrifugeres præcipitatet (10 minutter, 12.000 x g) og opløses igen i 50 ml 0,1M natriumhydrogencarbonatopløsning. Efter tilsætning af 0,5 g "Triton"® 20 X-100 og 1,5 ml eddikesyre (tilsat dråbevis under omrøring) lades blandingen henstå i 1 time ved 0°C og derefter i 16 timer ved -20°C.

Efter optøning centrifugeres blandingen i 10 minutter med 17.000 x g. Remanensen kasseres, og den overstående væske indstilles på 4% trichloreddikesyre. Efter 1 times forløb centrifugeres blandingen i 10 25 minutter med 12.000 x g, og bundfaldet opløses i 5 ml 0,5M natrium-hydro gencarbonatopløsning .

C. Gelfi1 trering.

Til den vundne koncentrerede interferon-opløsning sættes 1,5 g urin-stof, og den føres på en søjle af "Sephadex" G-100 fin (2,6 x 90 30 cm), som i forvejen er ækvilibreret med 4M urinstof/0,1M natriumace-tatpuffer. Søjlen elueres ved stuetemperatur og med en gennemstrømningshastighed på 0,5 ml/minut med 4M urinstof/0,1M natriumacetat, pH-værdi 7,5. Der opsamles fraktioner på 12,5 ml. Interferonaktivitet elueres i fraktionerne 19-23.

DK 161048B

9 D. HPLC.

De samlede fraktioner 19-23 fra "Sephadex" ® G-100-søjlen føres direkte via en pumpe over på en "Lichrosorb" RP-8-søjle (10 μ, 4,6 x 250 mm). Søjlen er i forvejen ækvilibreret med en 1M natriumacetat-5 puffer (pH-værdi 7,5), som indeholder 0,01 volumen/volumenprocent thiodiglycol, og der elueres med en lineær gradient af n-propanol i samme puffer (1 time, 0-20%; 3 timer, 20-40% (volumen/volumen)) med en gennemstrømningshastighed på 0,25 ml/ minut. Der opsamles fraktioner på 0,75 ml. Interferonet elueres i fraktionerne 23-40 (25-30 10 volumen/volumenprocent n-propanol).

Fraktionerne 27-33, som indeholder den største andel af interferonaktiviteten, sammenhældes, tilsættes n-propanol til en slutkoncentra-tion på 80 volumen/volumenprocent og ledes direkte via pumpen til en "Lichrosorb"-diol-søjle (10 μ, 4,6 x 250 mm), som i forvejen er 15 ækvilibreret med en opløsning af 0,1M natriumacetat med et indhold på 80 volumen/volumenprocent n-propanol. Søjlen elueres derefter i 4 timer med en lineær gradient på 72-50 volumen/volumenprocent n-pro-panol i 0,lM natriumacetat med en gennemstrømningshastighed på 0,25 ml/minut. Der opsamles fraktioner på 0,75 ml. Interferonaktiviteten 20 elueres i form af tre tydelige hovedtoppe, som kvantitativt varierer fra præparat til præparat. Disse toppe kaldes i elueringsrækkefølge a, β °g 7· a-Fraktionen elueres ved en koncentration på 68% n-propanol, β-fraktionen ved en koncentration på 66,5% n-propanol og γ-fraktionen ved en koncentration på 65,5% n-propanol. Det totale 25 udbytte af interferonaktivitet er større end 80%.

De til hver top hørende fraktioner sammenhældes og renses yderligere i de næste trin. Da toppen γ er langt den største og synes at være bedst adskilt fra andre komponenter, udvælges den til yderligere rensning. Fraktionerne 54-56 fra diolsøjlen, som indeholder toppen γ, 30 sammenhældes, og n-propanolet fjernes ved to ekstraktioner med samme mængde hexan. Spor af hexan fjernes med en nitrogenstrøm. Der tilsættes pyridin og myresyre til en s lutkoncentration på henholdsvis 1M og 2M, og opløsningen ledes på en "Lichrosorb" RP-8-søjle (10 μ;

4,6 x 250 mm), som i forvejen er ækvilibreret med 1M pyridin og 2M

DK 161048 B

10 ! myresyre) (pH-værdi 4,0). Søjlen elueres i 3 timer med en lineær gradient af n-propanol (20-40%) i 1M pyridin/formiat med en gennemstrømningshastighed på 0,2 ml/minut. Der opsamles fraktioner på 0,6 ml. Aktivitetshovedtoppen stemmer overens med en proteintop.

5 Fraktionerne 45 og 46 (32 volumen/volumenprocent propanol), som svarer til denne top, sammenhældes og genchromatograferes under samme betingelser. Interferon elueres i fraktion 31 (32 volumen/volumenprocent propanol). Denne fraktions specifikke aktivitet beregnes til 4 x 10® enheder/mg i sammenligning med okseserumalbumin. Dette materiale 10 anvendes til yderligere karakterisering. Fluorescensprofilerne fra HPLC er så godt reproducerbare, at de er et holdbart "fingeraftryk" for hele fremgangsmåden.

Resultaterne af rensningen er sammenfattet i nedenstående tabel I.

Den totale rensning, fra ihkubationsmediet til den anden RP-8-søjle, 15 er 60.000-80.000 fold. Det kumulative udbytte fra trin 1 til dioltri-net ligger ved 30-50%. Efter dette trin renses hver af de tre interferontoppe yderligere hver for sig.

Rensning af human-leukocyt-interferon.

Tabel 1 11

DK 161048 B

Enheder, Protein, Relativ Renheds Udbytte pr.

5 fundet fundet specifik grad trin (%) aktivitet aktivitet x 10"® (mg) (enh./mg) 1. Inkubationsmedium 50 10.000 5xl08 1 10 2. pH 4 overstående 50 2.000 2,5xl04 5 100 3. 1,5% trichloreddike- syre-bundfald 40 1.000 4xl04 8 80-100 4. "Triton" X-100/ed-dikesyre-overstå- 15 ende 40 250 l,6xl05 32 70-100 5. 4% trichloreddike- syre-bundfald 35 175 2x10^ 40 80-90 6. "Sephadex" G-100 32 57 5,6xl05 112 70-90 7. "Lichrosorb" RP-8 20 (pH 7,5) 28 11 2,5xl06 500 80-100 8. "Lichrosorb"-diol top α 11 1,1 lxlO7 5.000 top β 2,5 NB NB NB 70-90 top 7 12,5 0,21 6xl07 12.000 25 9. "Lichrosorb" RP-8 (pH 4) 1,6 0,0064 3xl08 60.000 40-60 10. "Lichrosorb” RP-8 (pH 4) 8,2 0,021 4xl08 80.000 40-60 30 Til bestemmelse af det i disse fraktioner værende protein anvendes okseserumalbumin som standard. Den absolutte specifikke aktivitet, som bestemmes ved aminosyreanalyse på den homogene top fra trin 10, er 2-4 x 108 eriheder/mg (jfr. teksten). Trin 9 gennemføres med top 7 fra trin 8. Trin 10 gennemføres med det samlede materiale fra trin 9 35 af forskellige præparater. NB — ikke bestemt.

DK 161048 B

12 E. Polyacrylamidgelelektroforese.

Interferonprøver (1,5 x 10·* enheder) inkuberes med natriumdodecylsul-fat og 2-mercaptoethanol og anbringes på en pladegel. Efter elektro-foresen fås et enkelt skarpt bånd efter farvning med Coomassie-blue.

5 Den tilsyneladende molekylvagt bestemmes til 17.500 (i sammenligning med standardproteiner). Gelen skæres i strimler på 1 mm, hver strimmel homogeniseres i 0,4 ml 0,5M natriumhydrogencarbonat/0,1% natrium -dodecylsulfat og undersøges med henblik på interferonaktivitet. Der findes en enkelt top med antiviral aktivitet, som stemmer overens med 10 det enkelte proteinbånd.

F. Åminosyreanalyse.

Aminosyreanalysen på det homogene human-leukocyt-interferon (top 7) udføres med fluorescamin-aminosyre-analysator på 0,5-1 /ig prøve af oprindeligt og S-carboxymethyleret interferon. Til bestemmelse af 15 cystein/cystin-forholdet carboxymethyleres oprindeligt interferon og hydrolyseres derefter i 6M HC1 under reducerende betingelser (0,1% thioglycolsyre). Under disse betingelser måles cystein som S-carboxy-methylcystein og cystin som frit cystein. Resultaterne af aminosyreanalysen er sammenstillet i nedenstående tabel II. Den specifikke

O

20 aktivitet, beregnet på aminosyre indholdet, bestemmes til 2-4 x 10° enheder/mg.

Tabel II

Aminosyresammensætning i human-leukocyt-interferon.

13

DK 161048 B

Aminosyre Andel

Asx 15,2±1,2 5 Thr* 7,5±0,5

Ser* 8,0+0,5

Glx 24,0+0,6

Pro 6,3+0,3

Gly 5,5+0,5 10 Ala 8,2+0,2

Cys (total) 3,3+0,7

Cystin+ 1,8+0,2

Cystein+ 1,5+0,5

Val 7,8+0,2 15 Met 3,9+0,2

Ile 8,9+0,4

Leu 21,8+1,3

Tyr 5,1+0,2

Phe 9,1+0,3 20 His 3,3+0,4

Lys 11,6+0,5

Arg 7,3+0,5

Trp++ 0,7+0,1 25 * Korrigeret til tid 0.

+ Målt efter carboxymethylering af oprindeligt interferon.

^ Målt efter hydrolyse i 6M HCl/4% thioglycolsyre.

DK 161048 B | !

14 I

EKSEMPEL 2 j

Homogent human-leukocyt-interferon fra leukocyter fra leukæmipatienter.

Interferonet fås ved inkubering af human-leukocyter, der er isoleret 5 fra blodet fra leukæmipatienter (kronisk myelogen leukæmi, CML) ved leukoforese med Newcastle-disease-virus i et serumfrit, caseihholdigt medium. Interferontiteren ligger ved 5000-40.000 enheder/ml.

Rensnings fremgangsmåden er den samme som beskrevet i eksempel 1 for interferon fra blod fra normale donorer og omfatter den selektive 10 udfældning med 0,5M eddikesyre i nærværelse af "Triton" X-100, gel-filtrering på "Sephadex" G-100 i 4M urinstof, HPLC ved pH-værdi 7,5 på "Lichrosorb" RP-8, HPLC på "Lichrosorb"-diol og HPLC på "Lich-rosorb" RP-8 ved pH-værdi 4,0. De fraktioner, som svarer til henholdsvis a.- , β- og γ-toppene fra "Lichrosorb"-diolsøjlen, sammen-15 hældes og skilles derefter fra hinanden i yderligere trin.

Fra de samlede fraktioner 43-46 (α-top) fjernes n-propanol ved to ganges ekstraktion med samme mængde n-hexan. Spor af hexan fjernes med en nitrogenstrøm. Der tilsættes pyridin og myresyre til en slut-koncentration på henholdsvis 1M og 2M, og opløsningen ledes gennem en 20 "Lichrosorb" RP-8-søjle (10 μ, 4,6 x 250 mm), som i forvejen er ækvilibreret med 1M pyridin/2M myresyre (pH-værdi 4,0). Søjlen elu-eres i 3 timer med en lineær n-propanol-gradient (20-40 volumen/-volumenprocent) i 1M pyridinformiat-puffer med en gennemstrømnings-hastighed på 0,2 ml/minut. Der opsamles fraktioner på 0,6 ml. Inter -25 feronaktiviteten elueres i brede toppe ved koncentrationer mellem 31 og 35 volumen/volumenprocent n-propanol. Disse fraktioner sammenhældes og chromatograferes igen under samme betingelser. Interferonaktiviteten elueres i to hovedtoppe (a^ og a^) ved 31 og 32 volumen/volumenprocent n-propanol. Underordnede komponenter elueres ved 30 en koncentration på 34 volumen/volumenprocent n-propanol.

De samlede fraktioner 47-50 (top β) fra "Lichrosorb"-diolsøjlen oparbejdes på samme måde og chromatograferes på "Lichrosorb" RP-8 som beskrevet for a-toppen. Interferonaktiviten elueres i to hovedtoppe; 0

DK 161048 B

15 /?2 ved 32 volumen/volumenprocent n-propanol og β-$ ved 34 volumen/-volumenprocent n-propanol. Genchromatografi er ikke nødvendigt i dette tilfælde. I nogle præparater kan konstateres en ^-top ved 31 volumen/volumenprocent n-propanol.

5 De samlede fraktioner 52-54 (top 7) fra "Lichrosorb"-diolsøjlen oparbejdes på samme måde og chromatograferes på "Lichrosorb" RP-8 som beskrevet for α-top. Interferonaktiviteten elueres i fem hovedtoppe: 71 (ved 31 volumen/volumenprocent n-propanol), 72 (ved 32 volumen/-volumenprocent n-propanol), 73 (ved 34 volumen/volumenprocent n-10 propanol), 74 (ved 35 volumen/volumenprocent n-propanol) og 75 (ved 35,5 volumen/volumenprocent n-propanol). Genchromatografi er ikke nødvendigt i dette tilfælde. Resultaterne af rensningen til frem- j stilling af de enkelte interferonkomponenter er sammenfattet i nedenstående tabel III.

15 Komponenterne c*2 og $2 kan endvidere adskilles ved deres eluerings-karakteristikker på "Lichrosorb"-diol: a2 elueres med 68 volumen/-volumenprocent n-propanol og med 66,5 volumen/volumenprocent n-propanol.

Prøver af interferonkomponenter (1,5 x 105 enheder) inkuberes med 20 natriumdodecylsulfat og 2-mercaptoethanol og anbringes på en plade-gel. Efter elektroforese giver toppene aa2, β2, 71ι 72 °8 14 hver et enkelt bånd, medens toppene βj, 73 og 75 hver giver to bånd. De tilsyneladende molekylvægte ligger mellem 16.000 og 18.000 med undtagelse af β$, som giver et bånd ved 16.500 og et ved 21.000, og 74, 25 der giver et bånd ved 21.000 (jfr. tabel IV).

Tabel III

Rensning af leukocyt-interferon fra CML-celler.

16

DK 161048 B

Trin Enheder, Protein, Specifik Ren- Udbytte hods /y\ 5 fundet x fundet aktivitet 10 "6 (mg) (erih,/mg) grad i. Inkubationsmedium 800 20xl03 4xl04 1 100 10 1. pH 4-overstående 800 4xl03 2xl03 5 100 3. 1,5% trichloreddi- kesyre-bundfald 780 2xl03 3,9xl05 9,8 97 4. Triton X-100/ed-dikesyre-overstå- 15 ende 760 510 l,5xl06 37,5 95 5. 4% trichloreddike- syre-bundfald 810 350 2,3x10^ 57,5 100 6. "Sephadex"® G-100 660 130 5,lxl06 128 82 20 7. "Lichrosorb" RP-8 (pH 7,5) 510 26 2xl07 500 64 (2 ansatser) 8. ,'Lichrosorb"-diol top α 149 5 3xl07 750 25 top β 148 3 5xl07 1250 top 7 139 1,7 8xl07 2000 I alt 436 54 17

DK 1610 4 8 B

Tabel III fortsat 9. "Lichrosorb" RP-8 (pH 4,0) top aj* 9 35xl0'3 2,6xl08 6500 5 top «2* 26 65x10'3 4,0xl08 10000 top β2 30 75x10'3 4,0xl08 10000 top β3 13 32xl0'3 4,0xl08 10000 top 7l 15 58x10'3 2,6xl08 6500 top 72 31 77x10'3 4xl08 10000 10 top 73 26 74x10'3 3,5xl08 8750 top 74 3,5 10x10'3 3,5xl08 8750 top 75 4,5 50x10'3 0,9xl08 2250 I alt 158 20 15 * Efter genchromatografi ** Aktivitet bestemt på MDBK-celler (okse); protein målt med serumalbumin som standard.

Tabel IV

Molvægtr Spec. akt. på Spec. akt. på Væksthæm- 20 ± 1000 MDBK (okse- Ag 1732 (hu- mende akceller, erih./ man-celler, tivitet** mg) ± 25% enh./mg) ± 50% ajL 16500 2,6xl08 2,6xl08 + 25 a2 16200 4 xl°8 3 xl°8 + β2 16500 4 xlO8 2 xlO8 + 21000 4 xlO8 3 xlO8 + 71 17700 2,6xl08 2 xlO8 + 72 17700 4 xlO8 l,5xl08 + 30 73* 17200 3,5xl08 l,5xl07 + 74 21000 3,5xl08 4 xlO8 + 75 16500 0,9xl08 2 xlO6 +

DK 161048 B

18 * 2 bånd ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese; hovedbindets molvægt.

** den af Stewart et al., Nature 262, 300 (1976) angivne metode.

Aminosyreanalysen på de rensede human-leukocyt-interferonf rakt ioner 5 udføres med en fluorescamin-aminosyre-analysator på 0,1-1 /tg prøver. Hydrolysen udføres i 6N HC1 under reducerende betingelser (0,1% thioglycolsyre). Resultaterne af analysen er angivet i nedenstående tabel V.

Tabel V.

10 Amino syre analyse på human-leukocyt-interferon.

Komponenter a^ c*2 $2 ^3* 71 72 73* 74 75*

Molvægtr 16500 16200 16500 21000 17700 17700 17200 21000 16500 15 ______

Rester 142 139 142 181 153 153 148 180 142

Asx 13,8 11,7 11,5 18,2 13,1 13,3 15,0 17,9 13,8

Thr 7,7 8,3 9,0 9,9 8,4 9,6 8,6 7,3 7,6 20 Ser 9,2 10,0 10,0 14,5 10,2 7,8 10,1 13,5 9,0

Glx 20,3 20,5 21,9 28,5 23,9 25,0 22,8 27,0 20,8

Pro 6,1 4,9 5,0 5,9 4,5 4,8 4,8 6,5 4,2

Gly 5,1 4,5 5,0 3,6 5,7 5,0 3,2 4,8 4,0

Ala 8,4 8,3 7,9 11,5 8,7 8,1 9,3 10,4 9,3 25 Val 7,4 6,2 6,7 7,5 7,3 7,0 5,5 7,9 5,1

Met 3,7 3,8 4,4 6,0 4,3 3,9 5,6 4,9 4,7 ILeu 7,4 7,0 7,4 9,5 7,9 8,0 6,8 9,7 6,6

Leu 18,0 18,0 18,9 24,4 20,3 20,1 20,5 24,1 19,6

Tyr 4,0 4,4 4,6 5,0 4,8 4,8 3,7 5,0 3,6 30 Phe 6,9 8,0 8,7 9,9 8,6 9,0 7,2 9,1 6,4

His 3,0 2,8 3,0 3,8 3,7 3,3 2,9 3,8 2,8

Lys 10,5 9,0 8,5 9,3 10,1 10,0 7,6 12,3 12,0

Arg 6,2 7,1 8,0 10,8 8,0 8,5 10,1 8,5 9,0

Cys 3,9 4,0 1,8 2,3 3,3 2,9 3,1 4,1 2,3 35 __;_. __ Nøjagtighed ±1,5 rest.

*

Blandinger af begge bånd.

DK 161048 B

19

Trypsinspaltning og HPLC på fragmenterne.

300 pmol af hver af de rensede human-leukocyt-interferonkomponenter opløses i 50 millimol vandig natriumhydrogencarbonatopløsning (pH-værdi 8, 50 pliter). Efter tilsætning af 0,1 pg trypsin i 2 pliter 5 HCl (pH-værdi 3) til hver prøve inkuberes der i 14 timer ved 37°C og tilsættes 5 pliter eddikesyre, og blandingen ledes på en "Lichrosorb" RP-8-søjle (partikelstørrelse 10 μ; 4,6 x 250 mm). Søjlen elueres i 1 time med en lineær gradient på 0-40 volumen/volumenprocent n-propanol i en 0,1M myresyre/0,03M pyridinpuffer (pH-værdi 3) med en gennem-10 strømningshastighed på 0,5 ml/minut.

Fragmenterne påvises ved fluorescamin-metoden. Resultaterne er sammenfattet i nedenstående tabel VI, hvor toppenes position er angivet som procent n-propanol, og fragmenternes relative størrelse er angivet (S — lille; M = middelstor; L = stor).

15 Tabel VI

Tryptiske peptider fra human-leukocyt-interferon.

Komponent Eluering med procent n-propanol c*! 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M,

20 20S, 21S, 22,5S, 29M

a2 3L, 4L, 4,2M, 11,511, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M,

27S, 29M

β2 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,5S,

18M, 29M

25 β3 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 10M, 12,5S, 14S, 14,5M, 16S,

18L, 19,5M, 27M, 32M

7jL 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 6,5S, 11,5S, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,5M, 18M, 2911 72 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 11,5S, 12,5S, 14,5S,

30 16S, 18L, 29M

73 3M, 4M, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 13,5S, 14,5M, 16S,

18L, 20S, 32M

75 3L, 4L, 4,211, 4,5M, 7S, 7,5S, 10S, 11,5L, 12,5S, 14S, 14,511, 16S, 18L, 24,5S, 25,5S, 32S 35 _

DK 161048 B

20

De rensede human- leukocyt- interferon-komponenter underkastes amino-stikker analyse, hvorved der konstateres et aminosukkerindhold i området på 50-100 pmol. I alle tilfælde findes der mindre end en rest af henholdsvis glucosamin, galactosamin og mannosamin pr. molekyle. I 5 de fleste tilfælde interfererer et antal mindre peptider, som elueres i nærheden af aminosukkeret, med analysen. Det er derfor muligt delvis eller endog helt at henføre peptiderne til de til aminosukrene hørende toppe.

Endelig viser et forsøg på sekvensering af 1 nmol rent 72-interferon 10 ved manuel Edman-nedbrydning, som omfatter tilbagehydrolyse og amino -syreanalyse under anvendelse af fluorescamin, ingen aminosyrer i de første to cykler. Behandlingen af 100 pmol rent 72 -human- leukocyt-interferon med leucinaminopeptidase og aminopeptidase M i 20 timer ved 37°C har ingen indflydelse på den biologiske aktivitet; i inkuba-15 tionsmediet kan der ikke påvises aminosyrer. Ved behandling af den overstående væske fra et induktionsmedium (leukocyter og Newcastle-disease-virus i minimalmedium) med aminopeptidase M kan der ikke iagttages tab af interferonaktivitet. Dette tyder på, at interferonmolekylet allerede før rensningsfremgangsmåden indeholder en blokeret 20 aminoterminal aminosyre. Til kontrol inkuberes råt interferon, rent interferon og /3-kæden af insulin sammen med aminopeptidase M. Medens insulin nedbrydes delvis (aminosyrer påviselige), optræder der ingen tab af interferonaktivitet.

EKSEMPEL 3 25 a) 3 mg homogent human-leukocyt-interferon med en specifik aktivitet på 2 x 10® enheder/mg opløses i 25 ml 5%'s normalt human-serumalbumin. Opløsningen filtreres gennem et bakteriologisk filter og fordeles derefter i 100 aseptiske ampuller. Hver ampul indeholder 6 x 10® enheder rent interferon, som kan anvendes til parenteral 30 applikation. Ampullerne opbevares fortrinsvis koldt (ved -20°C) indtil brug.

b) En vandig opløsning indeholdende 1,5 mg af de samlede homogene human-leukocyt-interferon-komponenter a^, <*2» @2 · 71 °S 72 (som hver

Claims

1. Fremgangsmåde til rensning af humant interferon, 10 kendetegnet ved, at man leder en vandig opløsning af det urene protein gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med cyanopropyl-, cyclohexyl-, phenyl-, octyl-, octadecyl- eller glycerylgrupper modificeret porøs S1O2-matrix under HPLC-betingelser, idet proteinet først adsorberes og derefter elueres med en stigende 15 eller faldende gradient af et med vand blandbart opløsningsmiddel, så at det til slut fås i bestemte eluatfraktioner i renere form, og at man eventuelt gentager behandlingen én eller flere gange med de fremkomne eluatfraktioner i renere form.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 20 kendetegnet ved, at der anvendes en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med octyl- eller glycerylgrupper modificeret porøs S1O2-matrix.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af humant interferon som homogent protein, 25 kendetegnet ved, at man A) leder en vandig opløsning af interferon i uren tilstand under HPLC-betingelser gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med octylgrupper modificeret S1Ο2-matrix, idet interferonet først adsorberes og derefter elueres med en stigende gradient af et 30 med vand blandbart opløsningsmiddel i en puffer, så at det fås i bestemte eluatfraktioner i renere form; DK 161048 B B) leder de i trin A) vundne bestemte fraktioner gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med glycerylgrupper modificeret SiC>2-matrix, idet interferonet først adsorberes og derefter elueres med en faldende gradient af et med vand blandbart opløsnings- 5 middel i en puffer, så at det fås i udprægede hovedtoppe i bestemte eluatfraktioner i renere form; C) leder de i trin B) vundne fraktioner, som svarer til de udprægede hovedtoppe, under HPLC-betingelser gennem en med en puffer ækvilibreret søjle på basis af en med octylgrupper modificeret Si02-matrix, 10 idet interferonet først adsorberes og derefter elueres med en blanding af et med vand blandbart opløsningsmiddel og en vandig puffer, så at det fremkommer i en enkelt, udpræget top i bestemte eluatfraktioner som homogent protein, og, om ønsket, gentager trin C) til opnåelse af produktet i yderste renhed.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der gås ud fra leukocyt-interferon.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at man som med vand blandbart opløsningsmiddel anvender en alkano1 eller en cyclisk ether.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at man som med vand blandbart opløsningsmiddel anvender n-propanol, i trin A) en puffer med en pH-værdi på ca. 7,5 og i trin C) en puffer med en pH-værdi på ca. 4,0.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, 25 kendetegnet ved, at den i trin A) anvendte puffer er 1M natriumacetat/eddikesyre med en pH på ca. 7,5, og at n-propanol-gradienten stiger fra 0 til 40 volumen/volumenprocent, at den i trin B) anvendte puffer er 0,1M natriumacetat, og at n-propanol-gradienten falder fra 72,5 til 50 volumen/volumenprocent, og at den i trin C) 30 anvendte puffer er 1M pyridin/2M myresyre med en pH på ca. 4,0, og at n-propanol-gradienten stiger fra 20 til 40 volumen/volumenprocent. DK 161048 B

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at de bestemte fraktioner, der hører til de udprægede hovedtoppe, kombineres, at n-propanolet fjernes ved ekstraktion med n-hexan, og at spor af n-hexan fjernes fra den van- 5 dige fase før trin C).

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås - interferon som homogent protein.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, 10 kendetegnet ved, at der fås a2"fnterferon som homogent protein.

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås ~ interferon som homogent protein.

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås $3 - interferon som homogent protein.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås 7^-interferon som homogent 20 protein.

14. Fremgangsmåde ifølge at hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås 72-interferon som homogent protein.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, 25 kendetegnet ved, at der fås 73- interferon som homogent protein.

16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås 74-interferon som homogent protein. DK 161048B

17. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8, kendetegnet ved, at der fås 75-interferon som homogent protein.