DK158488B - Fremgangsmaade til fremstilling af blodcelleprotein og haem ved spaltning af haemoglobin - Google Patents

Description

2

DK 158488 B

økonomisk acceptabel måde) kan fjernes fra det blodcelleprotein, der fås til sidst. Af de lavere aliphatiske alkoholder synes kun methanol at have en stærkt affarvende virkning, og dette opløsningsmiddel fjernes også vand fra blodlegemer-5 ne, hvilket naturligvis er en fordel, når blodcelleproteinet senere skal tørres.

Når der valgt methanol eller en blanding af methanol og vand og/eller ethanol som organisk opløsningsmiddel, skal der også findes en egnet syre. Saltsyre synes at være 10 den mest egnede syre, men når der anvendes en kombination af saltsyre og methanol eller en blanding af methanol og vand og/eller ethanol til opdelingen af hæmoglobin i hæm og blodcelleprotein, viser det sig, at når det syrnede opløsningsmiddel blandes med hæmoglobinet, bliver resultatet 15 dannelse af en blød masse, der ikke kan oparbejdes med henblik på yderligere fraskillelse af blodcelleproteinet.

Omfattende eskperimenter har nu vist, at til spaltning af hæmoglobin kan den ønskede kombination af saltsyre og methanol eller en blanding af methanol og vand og/eller 20 ethanol kun anvendes på en praktisk (og økonomisk forsvarlig) måde, hvis hæmoglobinet eller et hæmoglobin-holdigt koncentrat af røde blodlegemer først bringes i berøring med ikke-syrnet methanol eller en blanding af methanol og vand og/eller ethanol under intensiv omrøring og først derefter blandes 25 grundigt med syrnet opløsningsmiddel. Ved yderligere adskillelse af hæm og blodcelleprotein har anvendelse af hydrocyc-loner vist sig at være særlig fordelagtig, idet den resulterer i stor adskillelseseffektivitet og desuden tillader anvendelse af korroderende syrer i hydrocyclonerne, der er 30 fremstillet af syntetiske materialer. Desuden recirkuleres det organiske opløsningsmiddel, der anvendes, så meget som muligt ved fremgangsmåden.

Ifølge US patentskrift nr. 4.098.780 blandes hæmoglobin med ethanol og vand og syrnes til en pH-værdi lavere 35 end 4,5. Dette bevirker, at hæmoglobinet dissocieres i globin og jernforbindelser. Når indholdet af jernforbindelser i

DK 158488B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af blodcelleprotein og hæm ved spaltning af hæmoglobin.

Australsk patentskrift nr. 492.555 angår en fremgangs-5 måde til fremstilling af et blodcelleproteinkoncentrat ved hjælp af plasmolyse eller hæmolyse af dyreblod under anvendelse af et syrnet organisk opløsningsmiddel, der har lav molekylvægt og er blandbart med vand. Saltsyre, myresyre, eddikesyre og vinsyre nævnes som syrer, der kan anvendes, 10 hvoraf saltsyre foretrækkes. Det organiske opløsningsmiddel kan være acetone, methanol eller ethanol, men acetone foretrækkes, da det siges at have en stærkt affarvende virkning og let kan restitueres. Det organiske opløsningsmiddel anvendes i et vægtforhold mellem opløsningsmiddel og blod på 15 6:1, og det organiske opløsningsmiddel indeholder 0,1-0,5 vægtprocent syre. Ved denne fremgangsmåde opskummes blodet fortrinsvis først ved hjælp af en kolloidmølle, hvorefter det opskummende blod blandes med det syrnede opløsningsmiddel.

20 En forbedring af denne fremgangsmåde foreslås i australsk patentskrift nr. 502.112, ifølge hvilket det ikke-koagulerede blod under turbulensbetingelser injiceres i syrnet acetone, hvorunder acetonen, der flyder meget langsommere, transporterer blodet bort fra injektionsstedet. Ved 25 denne fremgangsmåde er det foretrukne udgangsmateriale et koncentrat af røde blodlegemer. Det har vist sig, at den temperatur, ved hvilken fremgangsmåden udføres, ikke er kritisk, men af en konstant temperatur under proceduren er fordelagtig. Den anvendte temperatur kan ligge fra -10 til 30 +35 eC.

I modsætning til det i disse to australske patentskrifter omtalte har det nu vist sig, at det organiske opløsningsmiddel slet ikke kan vælges arbitrært. Når der anvendes lavere aliphatiske ketoner, såsom acetone og methylethylke-.35 ton, har det vist sig, at disse opløsningsmidler slet ikke eller kun med store vanskeligheder (og derfor ikke på en

DK 158488B

3 opløsningen er tilstrækkeligt højt, og indholdet af ethanol i opløsningen er højere end 40 rumfangsprocent, danner jernforbindelserne agglomerater, der kan adskilles fra den flydende blanding. Forud for tilsætning af ethanol og sænkning 5 af pH-værdien afkøles opløsningen først til en temperatur på fra 0 til -20°C, hvilket tjener til bibeholdelse af proteinets funktionelle egenskaber. Til sænkning af pH-værdien kan saltsyre også anvendes, og mindre dele af ethanolen kan erstattes med methanol.

10 Den foreliggende opfindelse angår således en frem gangsmåde til fremstilling af blodcelleprotein og hæm ved -spaltning af hæmoglobin under indvirkning af saltsyre og et organisk opløsningsmiddel, valgt blandt methanol og en blanding af methanol og ethanol og/eller vand ved en pH-værdi 15 under 4,5 under turbulente betingelser, hvorefter den opnåede dispersion ved hjælp af hydrocycloner adskilles i en hæm-rig fase og en blodcelleprotein-rig fase, den således opnåede blodcelleprotein-rige fase neutraliseres, og blodcelleproteinet adskilles fra denne fase, og hæmet adskilles fra den 20 hæm-rige fase, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at hæmoglobinet, inden det bringes i kontakt med blandingen af saltsyre og det organiske opløsningsmiddel, bringes i kontakt med det organiske opløsningsmiddel under turbulente betingelser ved en temperatur fra 20 til 50°C.

25 Hæmoglobinet fås fra blod (hvortil der eventuelt kan være sat et anti-koagulationsmiddel såsom natriumcitrat) ved at opdele det i blodplasma og et koncentrat af røde blodlegemer, f.eks. ved hjælp af en væske/væske-separator med fast skål såsom f.eks. en "Westfalia Separator®" Type 30 BTA (8300 g). Blodplasmaet indeholder ca. 32% af det samlede indhold af blodprotein.

Koncentratet af røde blodlegemer, der i praksis i reglen stadig indeholder en lille mængde blodplasma, bringes nu i berøring med et organisk opløsningsmiddel ved forhøjet 35 temperatur og under turbulente betingelser. Dette sker ved at blande koncentratet af røde blodlegemer meget kraftigt

DK 158488B

4 med methanol eller en blanding af methanol og vand og/eller ethanol som organisk opløsningsmiddel og under opvarmning af denne blanding under fortsat kraftig omrøring til en temperatur på 20-50°C. Blandingen af organisk opløsningsmid-5 del og koncentrat af røde blodlegemer opvarmes fortrinsvis til en temperatur på mellem 20 og 40°C, især til en temperatur på ca. 35°C. Det har vist sig, at den temperatur, der anvendes, er noget afhængig af volumenforholdet mellem hæmoglobinet og det organiske opløsningsmiddel. Jo mere opløs-10 ningsmiddel, der er til stede i blandingen med hæmoglobin, jo lavere er den temperatur, hvortil blandingen skal opvar mes.

Efter blanding og opvarmning med det organiske opløsningsmiddel sættes der til den således fremstillede blanding 15 en blanding af organisk opløsningsmiddel og saltsyre under turbulente betingelser, f.eks. ved intensiv omrøring. Det organiske opløsningsmiddel er fortrinsvis, men ikke nødvendigvis det samme opløsningsmiddel, som anvendes i fremgangsmådens første trin. Saltsyren kan også tilføres blandingen 20 i gasform.

Saltsyren anvendes i en sådan mængde, af pH-værdien for opløsningsmidlet og syren er under 4,5. I reglen anvendes der en sådan mængde syre, at det organiske opløsningsmiddel foreligger i et molforhold på 0,01-0,1 i syren.

25 Den således fremstillede dispersion af organisk opløs ningsmiddel, saltsyre og opdelt hæmoglobin adskilles nu ved hjælp af hydrocycloner i en fase, der er rig på hæm, og en fase, der er rig på blodcelleprotein. Den fase, der er rig på blodcelleprotein, neutraliseres med en base, f.eks. na-30 triumhydroxid, og derefter adskilles blodcelleproteinet fra denne neutraliserede fase på i og for sig kendt måde. Ligeledes fraskilles hæmet på i og for sig kendt måde fra den fase, der er rig på hæm. Det organiske opløsningsmiddel, der fremkommer ved disse to fraskillelser, recirkuleres i 35 det mindste delvis i processen.

Spaltningerne af hæmoglobinet vil i det følgende

DK 158488 B

s blive beskrevet under henvisning til tegningen, på hvilken fig. 1 og 2 som blokdiagrammer viser hver sit strømningsskema for fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

I fig. 1 tilføres blodcellekoncentratet fra en lager-5 tank 1 til et blandeapparat 3 ved hjælp af en doseringspumpe 2. Til dette blandeapparat 3 tilføres også organisk opløsningsmiddel S ved hjælp af en doseringspumpe 2. I blandeap-paratet blandes koncentratet af røde blodlegemer meget intenst med det organiske opløsningsmiddel. Den intents blan-10 dede blanding opvarmes nu til en temperatur på 25-50°C i en varmeveksler 4, men naturligvis kan blandeapparatet samtidig være en varmeveksler (ikke vist i fig.) . Den opvarmede blanding blandes nu intensivt i et andet blandeapparat 3 med en blanding af organisk opløsningsmiddel og syre, der ved hjælp 15 af en doseringspumpe 2 tilføres fra en syrelagertank 5.

Den syrnede blanding, der blandes intensivt i blandeapparatet 3, føres nu ved hjælp af en pumpe 2 til et hydro-cyclonbatteri Hl. Det øverste produkt, der fås fra dette batteri, er en fase, der er rig på hæm, og som føres til et 20 hydrocyclonbatteri H2. Det øverste produkt i dette hydrocyc-lonbatteri H2 afgår til genvinding af opløsningsmiddel, hvor hæmet skilles fra, og det organiske opløsningsmiddel genvindes.

Det nederste produkt i hydrocyclonbatteri et H2 kombi-25 neres med den syrnede blanding fra det andet blandeapparat 3 og føres til hydrocyclonbatteriet Hl. Det nederste produkt i dette hydrocyclonbatteri Hl ledes ved hjælp af en pumpe 2 til et hydrocyclonbatteri H3. Det øverste produkt i hydrocyclonbatteriet H3 blandes med syre fra lagertanken 5 og ledes 30 til det andet blandeapparat 3. Det nederste produkt i hydrocyclonbatteriet H3, der består af en fase, der er rig på blodcelleprotein, blandes med rent organisk opløsningsmiddel og ledes ved hjælp af en pumpe 2 til en hydrocyclonbatteri H4. Det øverste produkt, der er rigt på hæm, fra hydro-35 cyclonbatteriet H4 kombineres med det nederste produkt, der er rigt på blodcelleprotein, fra hydrocyclobatteriet Hl, og

DK 158488 B

6 denne blanding ledes til hydrocyclonbatteriet H3.

Den udvaskede fase, der er rig på blodcelleprotein og afgår fra hydrocyclonbatteriet H4 som det nederste produkt, neutraliseres med en base, f.eks. natriumhydroxid, 5 der transporteres fra en baselagertank 7 ved hjælp af en pumpe (ikke vist) til et neutraliseringsapparat 6, hvor basen blandes intensivt med blodcelleproteinet.

Det således neutraliserede koncentrat af blodcelleprotein fraskilles fra opløsningsmidlet i en separator 8, 10 der f.eks. kan bestå af en centrifuge eller et dekanteringsapparat (vandret centrifuge med fast skål af snekketranspor-tørtypen, f.eks. "Westfalia Decanter®", type CA, 3200 x G).

Det opløsningsmiddel, der fås fra separatoren 8, returneres til procescyclen ved hjælp af en pumpe 2, idet den våde 15 kage af blodcelleprotein tørres, f.eks. i et vakuumtørreap-parat med en vægtemperatur på 40°C.

Fig. 2 viser en modifikation af fremgangsmåden. Ved denne ændring føres koncentratet af røde blodlegemer fra en lagertank 1 ved hjælp af en pumpe 2 til et blandeapparat 3, 20 hvori det blandes intensivt med organisk opløsningsmiddel fra en separator 8. Den intensivt blandede blanding bringes nu op på en temperatur mellem 20 og 50°C i en varmeveksler 4. Også her kan blandeapparatet samtidig indrettes som varmeveksler.

25 I et andet blandeapparat 3 blandes den opvarmede blanding intensivt med en blanding af organisk opløsningsmiddel (fra et hydrocyclonbatteri H3) og syre, der fra en syrelagertank 5 tilføres ved hjælp af en doseringspumpe 2.

Blandingen blandes intensivt og syrnes i dette andet 30 blandeapparat, hvorefter den ved hjælp af en pumpe 2 ledes til et hydrocyclonbatteri Hl. Det øverste produkt, der fås fra dette batteri, er en fase, der er rig på hæm og ledes til et hydrocyclonbatteri H2. Det øverste produkt fra dette hydrocyclonbatteri H2 afgår til genvinding af opløsningsmid-35 del, hvor hæmet fraskilles, og det organiske opløsningsmiddel genvindes.

DK 158488 B

7

Det nederste produkt i hydrocyclonbatteriet H2 kombineres med den syrnede blanding fra det andet blandeapparat 3 og ledes til hydrocyclonbatteriet Hl. Det nederste produkt i dette hydrocyclonbatteri Hl ledes ved hjælp af en pumpe 5 2 til hydrocyclonbatteriet H3. Eventuelt kan der suppleres med syre ved 10 ved hjælp af en doseringspumpe 2.

Dét øverste produkt fra hydrocyclonbatteriet H3 kan eventuelt opvarmes i en varmeveksler 9 og blandes med syren fra lagertanken 5 og ledes til det andet blandeapparat 3.

10 Det nederste produkt i hydrocyclonbatteriet H3 blandes nu med det øverste produkt fra et hydrocyclonbatteri H5 og ledes ved hjælp af en pumpe 2 til et hydrocyclonbatteri H4.

Det øverste produkt, der rigt på hæm, fra hydrocyclonbatteriet H4 kombineres med det nederste produkt, der er rigt på 15 blodcelleprotein, fra hydrocyclonbatteriet Hl, og denne blanding ledes ved hjælp af en pumpe 2 til hydrocyclonbatteriet H3. Det nederste produkt, der er rigt på blodcelleprotein, fra hydrocyclonbatteriet H4 blandes med rent organisk opløsningsmiddel og ledes til hydrocyclonbatteriet H5 ved 20 hjælp af en pumpe (ikke vist). Det nederste produkt fra hydrocyclonbatteriet H5 neutraliseres med en base, f.eks. natriumhydroxid, og blandes med organisk opløsningsmiddel, der kommer fra en separator 8 i et neutraliseringsapparat 6.

Det neutraliserede blodcelleproteinkoncentrat adskil-25 les derefter fra opløsningsmidlet i separatoren 8, der f.eks. kan bestå af en centrifuge eller dekantator (centrifuge med vandret fast skål af snekketransportørtypen, f.eks. "West-falia Decantor®" Type CA 3200 x G) . Opløsningsmidlet, der fås fra separatoren 8, blandes for en dels vedkommende med 30 basen, og resten cirkuleres i processen ved hjælp af en pumpe 2, idet den våde kage af blodcelleprotein tørres.

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan udføres både portionsvis og kontinuerligt, hvilket sidste er foretrukket af økonomiske grunde.

35 Det er vigtigt, at blandingen i begge blandeapparater 3 foretages meget intensivt, og desuden at blodcelleproteinet 8

DK 158488B

fjernes fra reaktionsblandingen så hurtigt som muligt efter opdelingen af hæmoglobinet. Også hæmkoncentratet skal fjernes i så høj grad som muligt fra koncentratet af blodcelleprotein, før dette koncentrat neutraliseres, fordi, hvis kon-5 centratet af blodcelleprotein neutraliseres, medens der er hæm til stede, vil dette stof atter bindes til blodcelleproteinet .

De hydrocycloner, der anvendes, er beskrevet detaljeret, f.eks. af D. Bradley i The Hydrocylone, Pergamon Press, 10 Oxford 1965, især i kapitel 10 (side 200-211). Der anvendes fortrinsvis ,,Nivoba,,-cycloner, der består af batterier med ca. 36 enkelte cycloner anbragt i koncentriske cirkler. I Bradley's bog ovenfor svarer "Nivoba"-typen til hydrocycloner af "Dorrclone"-typen, der består af sammensatte enheder 15 indbefattende 10-40 enheder.

Det opløsningsmiddel, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er methanol eller en blanding af methanol og vand og/eller ethanol. Selv om opløsningsmidlet kan have omgivelsernes temperatur, foretrækkes 20 det i forbindelse med opvarmningstrinnet for blandingen af hæmoglobin og organisk opløsningsmiddel at anvende opvarmet opløsningsmiddel.

Bundfaldet af blodcelleprotein kan også genopløselig-gøres i vand, f.eks. sprøjtetørres, så at der fås et pulver 25 af blodcelleprotein, der er mildt med hensyn til lugt og smag og kan anvendes som emulgeringsmiddel, f.eks. som op-skumningsmiddel, og som foderbestanddel.

Ved hjælp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen reduceres jernindholdet i koncentratet af røde blodlegemer, der 30 ligger på ca. 3000 til 4000 dpm, til et jernindhold i det endeligt fremstillede blodcelleprotein på ca. 350 dpm eller mindre.

Opfindelsen vil herefter blive belyst ved hjælp af et eksempel.

35

DK 158488B

9

Eksempel I et apparat som vist i fig. 1, hvor alle hydrocyclon-batterierne er "Nivoba,,-hydrocycloner omfattende 36 enheder, blandes 4,05 kg røde blodlegemer intenst med 30 liter me-5 thanol i en turboblandemaskine "Ultra-Turrax®". Derefter bringes blandingen op på 35°C i en varmeveksler. I en anden turboblandemaskine "Ultra-Turrax®" blandes den opvarmede blanding intensivt med en blanding af 10,5 liter methanol og 0,35 liter 36%'s saltsyre. Den syrnede blanding ledes 10 ved hjælp af en pumpe til et hydrocyclonbatteri Hl, og blandingen oparbejdes yderligere som vist i fig. 1. Til neutralisering anvendes 0,20 liter 33%'s natriumhydroxidopøsning, idet der anvendes en centrifuge til adskillelse af den neutraliserede blanding. Den våde kage af globin eller blodcel-15 leprotein, der fås herved, tørres i en vakuumtørrer med luft på 40°C, hvilket resulterer i, at der til sidst fås 1,5 kg af et tørt pulver med et jernindhold på 250 dpm.

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af blodcelleprotein og hæm ved spaltning af hæmoglobin under indvirkning af saltsyre og et organisk opløsningsmiddel valgt blandt methanol 5 og ethanol og/eller vand ved en pH-værdi under 4,5 under turbulente betingelser, hvorefter den opnåede dispersion ved hjælp af hydrocycloner adskilles i en hæm-rig fase og en blodcelleprotein-rig fase, den således opnåede blodcelle-protein-rige fase neutraliseres, og blodcelleproteinet ad-10 skilles fra denne fase, og hæmet adskilles fra den hæm-rige fase, kendetegnet ved, at hæmoglobinet, inden det bringes i kontakt med blandingen af saltsyre og det organiske opløsningsmiddel, bringes i kontakt med det organiske opløsningsmiddel under turbulente betingelser ved en 15 temperatur fra 20 til 50"C.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hæmoglobinet bringes i kontakt med det organiske opløsningsmiddel ved en temperatur mellem 20 og 40"C.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet 20 ved, at blandingen af hæmoglobin og det organiske opløsningsmiddel opvarmes i en varmeveksler med skrabet overflade.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at blodcelleproteinet fjernes fra dispersionen så hurtigt som muligt. 25

5. Fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hæm-koncentratet fjernes fra blodcelleproteinkon-centratet før sidstnævnte neutraliseres.