DK158366B - Specifik bindingsanalysefremgangsmaade og reagens til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents
Specifik bindingsanalysefremgangsmaade og reagens til anvendelse ved fremgangsmaaden Download PDFInfo
- Publication number
- DK158366B DK158366B DK576181A DK576181A DK158366B DK 158366 B DK158366 B DK 158366B DK 576181 A DK576181 A DK 576181A DK 576181 A DK576181 A DK 576181A DK 158366 B DK158366 B DK 158366B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- specific binding
- reaction
- ligand
- conjugate
- bound
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
- C07D209/44—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles
- C07D209/48—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles with oxygen atoms in positions 1 and 3, e.g. phthalimide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D237/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings
- C07D237/26—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D237/30—Phthalazines
- C07D237/32—Phthalazines with oxygen atoms directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
- C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D493/10—Spiro-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
- C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D495/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Description
DK 158366 B
i
Den foreliggende opfindelse angår en specifik bindingsanalysefrem-gangsmåde til analyse af et væskeformigt medium for en ligand.
På grund af risikoen og vanskeligheden ved at håndtere radioaktive 5 materialer er der blevet gjort mange forsøg på at udtænke hensigtsmæssige, specifikke bindingsanalysemetoder, der er lige så følsomme og hurtige som radioimmunoanalyser, men som benytter sig af andre kendetegn end radioaktivitet som middel til kontrol af bindingsreaktionen.. Som det vil blive omtalt nærmere i det følgende, omfatter 10 de materialer, der er blevet anvendt som mærkningsmateriale i stedet for radioaktive atomer eller molekyler, så forskellige materialer som enzymer, fluorescerende molekyler og bakteriofager. De specifikke bindingsanalysemetoder, som først vil blive omtalt, er af den "heterogene", type, ved hvilken der gennemføres adskillelse af de 15 bundne og frie faser. En sådan adskillelse er nødvendig for at gennemføre en specifik bindingsanalyse, når det mærkede materiale i den bundne fase ikke kan skelnes fra det mærkede. materi al e i den frie fase.
20 Fra beskrivelsen til US patent nr. 3.654.090, nr. 3.791.932, nr. 3.839.153, nr. 3.850.752 og nr. 3.879.262 og fra the Journal of Immunological Methods 1:247 (1972) og the Journal of Immunology 109:129 (1972) kendes eksempler på heterogene metoder, som er blevet udviklet med anvendelse af et enzym som mærkningsmateriale. Ved hver 25 af de beskrevne metoder kobles der kemisk et enzym til enten den ligand, som skal bestemmes, eller en bindingspartner for denne, og der opbygges et passende specifikt bindingsreaktionsskema, hvorved mængden af enzymatisk aktivitet,, som er knyttet til enten den uopløselige del eller den væskeformige del, efter inkubering med en 30 prøve er en funktion af mængden af ligand i prøven. De med syntesen og karakteriseringen af enzym-konjugaterne forbundne problemer er alvorlige ulemper ved denne metode.
Fra beskrivelsen til GB patent nr. 1.392.403 og FR patent nr.
35 2.201.299 kendes en heterogen, specifik bindingsanalysemetode, ved hvilken der som mærkningsmateriale anvendes en ikke-aktiv precursor for et spektrofotometrisk aktivt materiale. Efter inkubering af prøven med det specifikke bindingsreaktionssystem adskilles de uopløselige og væskeformige dele, og den mængde mærkningsmateriale,
DK 158366B
2 som er til stede i den væskeformige del, og som er en funktion af den mængde ligand, som skal påvises i prøven, bestemmes ved at omdanne det inaktive mærkningsmateriale til et chromogent eller fluorometrisk aktivt materiale, som derefter måles på sædvanlig 5 måde.
Andre heterogene specifikke bindingsanalysemetoder, som gør brug af forskellige typer mærkningsmaterialer, er beskrevet i det følgende: Report No. PB-224.875 fra the National Technical Information Service 10 (NTIS) under USA's Department of Commerce (1973) beskriver et ikke-vellykket forsøg på at anvende heminchlorid som mærkningsmateriale i et heterogent analysesystem, der følges ved hjælp af en chemiluminiscensreaktion. I Nature 219:186 (1968) beskrives meget detaljeret visse radioimmunoanalysefremgangsmåder, og der nævnes i 15 meget generelle vendinger den mulige brug af coenzymer og virus'er i stedet for radioisotoper som mærkningsmaterialer. I artiklen belyses det imidlertid ikke, hvorledes en analyse, ved hvilken sådanne alternative mærkningsmaterialer anvendes, skal gennemføres, og det fremgår således ikke, om en sådan analyse er gennemførlig. Der kan 20 endvidere henvises til Principles of Competitive Protein-Binding Assays, ed. Odell and Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972), hvori de forskellige kendte analyseskemaer og de forskellige materialer og midler, der er blevet anvendt som mærkninger i specifikke bindingsanalyser, diskuteres.
25
En enzymmærket immunoanalyse er beskrevet i beskrivelsen til US patent nr. 3.817.837. Denne fremgangsmåde er af den "homogene" type, idet den ikke kræver brug af et opdelt reaktionssystem (dvs. med en uopløselig del og en væskeformig del) og adskil!el sesprocedure 30 herfor. Den enzymmærkede ligand er nemlig af en sådan form, at den enzymatiske aktivitet efter reaktion med ligandens bindingspartner inhiberes. Forholdene mellem bundet, mærket materiale og frit materiale kan således bestemmes ved at kontrollere forandringer af den enzymatiske aktivitet. Ikke desto mindre har denne fremgangsmåde 35 den ulempe, at det er vanskeligt at fremstille vel karakteriserede enzymmærkede konjugater og at finde passende enzymer.
Skønt mange nye typer specifikke bindingsanalyser er blevet foreslået og undersøgt, forbliver radioimmunoanalysen og de forskellige 3
DK 158366B
enzymmærkede immunoanalyser de mest almindeligt anvendte. Begge typer systemer har imidlertid indlysende mangler, radioimmunoanaly-sen som følge af dens anvendelse af radioaktivt materiale, som er farligt og kræver påpasselig håndtering, og de enzymmærkede immuno-5 analyser som følge af vanskeligheden ved at fremstille anvendelige enzymmærkede konjugater.
Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en yderst bekvem, alsidig og følsom, forbedret specifik bindingsanalysefremgangsmåde til 10 bestemmelse af en ligand i et væskemedium, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: (a) at det væskeformige medium kontaktes med et reagens, der omfatter et konjugat af et mærkningsstof og et specifikt 15 bindingsstof, hvorved reagenset og liganden danner et reak tionsbindingssystem omfattende (i) en bundet form af det mærkede konjugat, hvori det specifikke bindingsstof er bundet til en specifik bin- 20 dingspartner herfor, og (ii) en fri form af det mærkede konjugat, hvori det specifikke bindingsstof er bundet til en specifik bindingspartner herfor; 25 (b) at mærkningsstoffet bestemmes i enten den bundne eller den frie form heraf som et mål for den i væskemediet forekommende ligand.
30 Den specifikke bindingsanalysefremgangsmåde ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at der som mærkningsstof anvendes et enzymsubstrat, og at fremgangsmåden er af homogen type, dvs. at der ikke udføres fysisk adskillelse af den bundne form og den frie form af det substratmærkede konjugat, uden at substrataktiviteten i hele den 35 væskeformige reaktionsblanding måles og sættes i forhold til den i det prøvede væskeformige medium forekommende ligand.
Opfindelsen angår også et reagens til anvendelse ved bestemmelse af en ligand i et væskemedium, hvilket reagens omfatter et konjugat af
DK 158366B
4 et mærkningsstof og et specifikt bindingsstof, hvilket reagens sammen med liganden danner et bindingsreaktionssystem omfattende en bundet form af det mærkede konjugat, hvori det specifikke bindingsstof er bundet til en specifik bindingspartner herfor, samt en fri 5 form af det mærkede konjugat, hvori det specifikke bindingsstof ikke er bundet til en specifik bindingspartner herfor, hvorved mængden af mærkningsstof i enten den bundne eller den frie form er en funktion af mængden af den i det væskeformige medium forekommende ligand, hvilket reagens er ejendommeligt ved, at mærkningsstoffet er et 10 enzymsubstrat og ved, at det substratmærkede konjugat udviser måleligt forskellige substrataktiviteter i den bundne form og i den frie form, hvilket således muliggør homogen analyse.
Nedenstående i beskrivelsen forekommende betegnelser vil herefter 15 blive defineret: ligand er det materiale eller den gruppe af materialer, hvis tilstedeværelse eller hvis mængde i et væskeformigt medium skal bestemmes; specifik bindingspartner for liganden er et hvilket som helst materiale eller en hvilken som helst gruppe af materialer, som har en specifik bindingsaktivitet for liganden med 20 udelukkelse af andre materialer; og specifik bindingsanalog til liganden er et hvilket som helst materiale eller en hvilken som gruppe af materialer, som opfører sig stort set på samme måde som liganden med hensyn til bindingsaktiviteten for den specifikke bindingspartner for liganden.
25
Den nye homogene analyseteknik ifølge opfindelsen er delvis baseret på, at reaktionen mellem en ligand og en specifik bindingspartner, hvor enzymsubstratet er koblet til en af disse, ændrer aktiviteten af enzymsubstratet i den forudbestemte reaktion, hvilken reaktion 30 dermed tjener som middel til overvågning af den specifikke bindingsreaktion. I lyset af dette grundlæggende fænomen kan forskellige bindingsfremgangsmåder, herunder forskellige analysemidler og -anordninger, anvendes til udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. De foretrukne grundfremgangsmåder er den direkte bindings-35 teknik og den kompetitive bindingsteknik.
Ved den direkte bindingsteknik bringes et væskeformigt medium, som antages at indeholde den ligand, som skal påvises, i kontakt med et konjugat omfattende enzymsubstratet koblet til en specifik 5
DK 158366B
bindingspartner for liganden, og derefter måles en eventuel forandring af enzymsubstratets aktivitet. Ved den kompetitive bindingsteknik bringes det væskeformige medium i berøring med en specifik bindingspartner for liganden og med et konjugat omfattende 5 enzymsubstratet koblet til liganden og/eller en specifik bindingsanalog herfor, og derefter måles en eventuel forandring af enzymsubstratets aktivitet. Ved begge teknikker bestemmes aktiviteten af enzymsubstratet ved at bringe det væskeformige medium i kontakt med mindst ét reagens, som med enzymsubstratet udgør den 10 forudbestemte kontrol reaktion. Kvalitativ bestemmelse af liganden i det væskeformige medium indbefatter sammenligning af en egenskab, sædvanligvis hastigheden, for den resulterende reaktion med samme egenskab for kontrol reaktionen i et væskeformigt medium uden liganden, idet en eventuel forskel er en indikation på en forandring 15 af enzymsubstratets aktivitet. Kvantitativ bestemmelse af liganden i det væskeformige medium finder sted ved sammenligning af én egenskab ved den resulterende reaktion med samme egenskab ved kontrol reaktionen i væskeformige medier indeholdende kendte mængder af liganden.
20 Når det homogene analyseskema følges, gælder det generelt, at komponenterne i den specifikke bindingsreaktion, dvs. det væskeformige medium, som antages at indeholde liganden, konjugatet og/eller en specifik bindingspartner for liganden, kan kombineres i alle 25 forhold, på alle måder og i en hvilken som helst rækkefølge, forudsat at aktiviteten af enzymsubstratet i konjugatet ændres måleligt, når det væskeformige medium indeholder liganden i en mængde eller koncentration, der er signifikant i relation til analysemetoden. Fortrinsvis er alle bestanddelene i den specifikke bindingsreaktion 30 opløselige i det væskeformige medium.
Når der anvendes en homogen direkte bindingsteknik, er komponenterne i den specifikke bindingsreaktion det væskeformige medium, som antages at indeholde liganden, og en mængde af et konjugat omfatten-35 de enzymsubstratet koblet til en specifik bindingspartner for liganden. Aktiviteten af det konjugerede enzymsubstrat efter kontakt med det væskeformige medium varierer omvendt med bindingsgraden mellem liganden i det væskeformige medium og den specifikke bindingspartner i konjugatet. Når mængden af ligand i det væskeformige
DK 158366B
6 medium øges» falder således aktiviteten af den konjugerede reaktant.
Når der anvendes en homogen kompetitiv bindingsteknik» er komponenterne i den specifikke bindingsreaktion det væskeformige medium» som 5 antages at indeholde liganden, en mængde af et konjugat omfattende enzymsubstratet koblet til liganden eller en specifik bindingsanalog for liganden og en mængde af en specifik bindingspartner for liganden. Den specifikke bindingspartner kontaktes stort set samtidig med såvel konjugatet som det væskeformige medium. Da en hvilken som 10 helst ligand i det væskeformige medium konkurrerer med liganden eller den specifikke bindingsanalog til denne i konjugatet om binding med den specifikke bindingspartner, varierer aktiviteten af det konjugerede enzymsubstrat ved kontakt med det væskeformige medium direkte med bindingsgraden mellem liganden i det væskeformige 15 medium og den specifikke bindingspartner. Når mængden af ligand i det væskeformige medium øges, øges aktiviteten af det konjugerede enzumsubstrat således.
En variation af den homogene kompetitive bindingsteknik er den 20 homogene fortrængningsbindingsteknik, hvor konjugatet først kontaktes med den specifikke bindingspartner for liganden og derefter med det væskeformige medium. Der forekommer så konkurrence om den specifikke bindingspartner. Ved en sådan fremgangsmåde er den mængde af konjugatet, som bringes i berøring med den specifikke bindings-25 partner, sædvanligvis så stor, at liganden eller analogen for denne foreligger i overskud i forhold til den mængde, som er i stand til at danne binding med den tilstedeværende mængde af den specifikke bindingspartner i løbet af den tid, hvor konjugatet og den specifikke bindingspartner er i kontakt med hinanden inden kontakten med 30 det væskeformige medium, som formodes at indeholde liganden. Denne kontaktorden kan opnås på to hensigtsmæssige måder. Ved den ene fremgangsmåde bringes konjugatet i kontakt med den specifikke bindingspartner i et væskeformigt miljø inden kontakt med det væskeformige medium, som formodes at indeholde liganden. Ved den 35 anden fremgangsmåde bringes det væskeformige medium, som formodes at indeholde liganden, i berøring med et kompleks omfattende konjugatet og den specifikke bindingspartner, hvor den specifiktbindende substans i konjugatet og den specifikke bindingspartner er reversibelt bundet til hinanden. Den mængde af konjugatet, som bliver 7
DK 158366B
bundet til den specifikke bindingspartner, som ved den anden fremgangsmåde er på kompleks form, er sædvanligvis større end den mængde, som kan fortrænges af hele mængden af liganden i det væskeformige medium i den tid, hvor den specifikke bindingspartner eller 5 komplekset og mediet er i kontakt med hinanden inden afslutningen af målingen af den eventuelle aktivitetsforandring for den konjugerede reaktant.
En anden variation af. den homogene kompetitive bindingsteknik er den 10 homogene sekventielle mætningsteknik, hvori komponenterne i den specifikke bindingsreaktion er de samme som de, der anvendes ved den kompetitive bindingsteknik, men tilsætningsrækkefølgen eller kombinationen af komponenterne og de deraf anvendte relative mængder er forskellige. Ved en sekventiel mætningsteknik bringes den specifikke 15 bindingspartner for liganden i kontakt med det væskeformige medium, som formodes at indeholde liganden, i et tidsrum inden det væskeformige medium kontaktes med konjugatet. Den mængde af den specifikke bindingspartner, som kontaktes med det væskeformige medium, er sædvanligvis større end den, som er i stand til at danne binding med 20 hele den mængde af ligand, som antages at være til stede i det væskeformige medium i løbet af det tidsrum, hvor den specifikke bindingspartner og det væskeformige medium er i kontakt med hinanden inden det tidspunkt, hvor det væskeformige medium kontaktes med konjugatet. Yderligere er mængden af liganden eller ligandanalogen i 25 konjugeret form sædvanligvis større end den mængde, som er i stand til at danne binding med den resterende ubundne mængde af den specifikke bindingspartner i løbet af det tidsrum, hvor det væskeformige medium og konjugatet er i kontakt med hinanden inden afslutningen af målingen af forandringen af det konjugerede 30 enzymsubstrats aktivitet.
Målingen af en eventuel aktivitetsforandring for det konjugerede enzymsubstrat, hvilket enzymsubstrat udgør en bestanddel ved den forudbestemte overvågningsreaktion, opnås bekvemt ved at kontakte 35 den specifiktbindende reaktionsblanding med mindst ét stof, som sammen med det konjugerede enzymsubstrat giver den forudbestemte overvågningsreaktion, og bestemme virkningen af den specifikke bindingsreaktion på en egenskab ved denne reaktion.
DK 158366B
8
De reaktionsbestanddele, som sammen med enzymsubstratet i konjugatet giver den forudbestemte overvågningsreaktion, kan bringes i kontakt med den specifikke bindingsreaktionsblanding ved den homogene teknik. Reaktionsbestanddelene tilsættes enten hver for sig eller i 5 en hvilken som helst kombination, enten inden, samtidig med eller efter initiering af den specifikke bindingsreaktion. Efter initiering af den specifikke bindingsreaktion inkuberes reaktionsblandingen, som kan indbefatte enhver af eller alle de nødvendige bestanddele til overvågningsreaktionen, sædvanligvis i et i forvejen 10 fastlagt tidsrum, inden en eventuel forandring af aktiviteten af reaktanten i konjugatet vurderes. Efter inkubationsperioden tilsættes reaktionsblandingen alle de bestanddele, som er nødvendige til overvågningsreaktionen, og som ikke allerede er til stede i tilstrækkelige mængder i reaktionsblandingen, og overvågningsreak-15 tionen måles som indikation på tilstedeværelsen eller mængden af ligand i det væskeformige medium.
En foretrukket, følsom overvågningsreaktion involverer fluorescensfænomenet og er enzymkatalyseret. I et sådant reaktionssystem er 20 reaktanten i konjugatet et substrat i en enzymatisk reaktion, som danner et produkt, som har fluorescerende egenskaber, som afviger fra det konjugerede substrats. En hvilken som helst forandring af det konjugerede enzymsubstrats aktivitet hidrørende fra den specifikke bindingsreaktion bevirker en forandring i reaktionsblandingens 25 fluorescensegenskaber. Et generelt reaktionsskema for et sådant enzymkatalyseret reaktionssystem er følgende:
Enzymatisk reaktant -X-Z (enzym) produkt 30 hvor X betegner en enzymspaltelig binding eller bindingsgruppe, såsom en ester- eller amidogruppe, og Z et specifikt bindingsstof, som, alt efter den anvendte, specifikke bindingsreaktionsteknik er enten liganden, en specifik bindingsanalog til liganden eller en specifik bindingspartner for liganden. Specifikke konjugater, som 35 kan anvendes i denne type reaktionssystem, er forskellige enzymspaltelige derivater af fluorescein, umbelliferon, 3-indol, /?-naphthol, 3-pyridol, resorufin o.s.v. Eksempler på mulige strukturformler for sådanne derivater er følgende: 9
DK 158366B
Derivat Formel . „ . "-cc^y fV\ KÅ?
Y
10 0 rI^v. o 0
Nj V)/
umbelliferon | I
R3 15 o
aR
jT
H
20 R2
j8-naphthol [[ ^lf X
25 ^.2
3-pyridol i · J
\nA
30 0γ/\/0γ/νκ2 resorufin ^ N ^ 35 1 2 hvor R betegner -OH eller -X-Z (som defineret ovenfor), R betegner -1-1, og R3 betegner -H eller -CHg.
DK 158366B
10
Et reaktionssystem, som navnlig kan foretrækkes til overvågning af den nye specifikke bindingsreaktion ifølge den foreliggende opfindelse, er et cyklisk eller cykl iseringsreaktionssystem. Et sådant reaktionssystem er et system, hvori et produkt af en første reaktion 5 er en reaktant i en anden reaktion, hvilken anden reaktion som et af sine produkter har et stof, som også er reaktant i den første reaktion.
Nedenstående diagram viser en model af et cyklisk reaktionssystem: 10 produkter A. xykliseret materi al e\ ^reaktanter B \7* (form 1)
REAKTION A I [ REAKTION B
λ Λ
15 reaktanter A7 'cykliseret materiale produkter B
. (form 2) I ovenstående cykliske reaktionssystemmodel vil en ringe mængde af det cykl i serede materiale, hvis der tilvejebringes tilstrækkelige 20 mængder af reaktanter A og B, danne store mængder af produkter A og B. Da reaktionshastigheden og mængden af produkt, som dannes ved reaktionerne, som udgør det cykliske reaktionssystem, er yderst følsomme over for den tilstedeværende mængde cykl i seret materiale, foretrækkes det især at anvende det cykl iserede materiale som 25 reaktanten i konjugatet ifølge den foreliggende opfindelse. Eksempler på cykliserende reaktionssystemer udtænkt til brug i forbindelse med det nye specifiktbindende reaktionssystem ifølge opfindelsen ses i tabellerne B og C.
30 1
DK 158366B
11
TABEL B
produkt NAD*^^. reaktant B
5 enzym enzym k Λ
reaktant K x NADH** * produkt B
Reaktant A Reaktant B
10 eller eller
Reaktion produkt B Enzym produkt A
1 lactaldehyd al koholdehydrogenase propandiol 15 2 α-ketoglutarat glutaminsyredehydro- glutamat + ^3 genase 3 oxalacetat æblesyredehydrogenase mal at 20 4 acetaldehyd al koholdehydrogenase ethanol 5 α-ketoglutarat isocitronsyredehydro- isocitrat + C02 genase 25 6 dihydroxyacetone- a-glycerolphosphat- L-a-glyce- phosphat dehydrogenase rolphosphat 7 pyruvat mælkesyredehydrogenase lactat 30 8 1,3-diphospho- glyceraldehyd-3-phos- glyceralde- glycerat phatdehydrogenase hyd-3-phos- phat + phos-phat 35 * nicotinamidadenindinucleotid
** reduceret NAD
DK 158366B
12
TABEL C
produkt NADP*^^,reaktant B
5 enzym enzym λ λ
reaktant A NADPH** Λprodukt B
Reaktant A Reaktant B
10 eller eller
Reaktion produkt B Enzym produkt A
1 6-phosphogluconat glucose-6-phosphat- glucose-6- dehydrogenase phosphat 15 2 oxideret gluta- glutathionreduktase reduceret thion glutathion 3 p-benzoquinon quinonreduktase hydroquinon 20 4 nitrat nitratreduktase nitrit 5 α-ketoglutarat giutaminsyre- glutamat + NH^ dehydrogenase 25 * ni coti namidadeni ndi nueleotidphosphat
** reduceret NADP
Det bør bemærkes, at de i tabellerne B og C angivne cykliske reak-30 tionssystemer omfatter kombinationen af enhver af de i de respektive tabeller angivne reaktioner med en hvilken som helst anden deri angiven reaktion. F.eks. kan reaktion 1 i tabel B parres med en hvilken som helst af reaktionerne 2-8 under dannelse af et anvendeligt cyklisk reaktionssystem. Tabellerne B og C repræsenterer 35 således henholdsvis 56 og 20 mulige cykliske reaktionssystemer.
Ud over de i tabellerne B og C repræsenterede cykliske reaktionssystemer kan man tænke sig, at en af reaktionerne i det cykliske reaktionssystem kan indbefatte enzymatisk eller ikke-enzymatisk 13 omdannelse af en spektrofotometrisk indikator, fortrinsvis kolorime-trisk. I et sådant system vil enhver forandring i reaktions- eller cykl i seringshastigheden afspejles ved en forandring af indikatorens spektrofotometriske egenskaber. Når de foretrukne kolorimetriske 5 indikatorer anvendes, ville en sådan forandring være et farveskift. Et eksempel på et cyklisk reaktionssystem, som involverer en omdannelse af en indikator, er det system, som dannes ved at kombinere en af reaktant B - produkt B reaktionerne fra tabel B med en reaktion omfattende en oxidations-reduktionsindikator og et elektronoverfør-10 selsmiddel. Som elektronoverførselsmiddel kan phenazinmethosulfat anvendes. Anvendelige indikatorer indbefatter de oxiderede former af nitrotetrazolium, thiazoylblåt og dichlorphenolindophenol.
Man kan også tænke sig, at et eksponentielt cyklisk reaktionssystem 15 kan indgå i overvågningssystemet. Et eksempel på et eksponentielt cyklisk reaktionssystem er følgende:
AMP + ATP my°kinas^ 2 ADP
20 ADP * PEP Pyiwtklnase „p + pyruvat
En sådan cyklisk reaktion er autokatalytisk i den forstand, at mængden af cykl i seret materiale fordobles i løbet af hver cyklus. Cykl i seringshastigheden stiger derfor eksponentielt med tiden og 25 giver en høj følsomhedsgrad. Yderligere enkeltheder ved og omtale af sådanne cykliske reaktioner findes i J. Biol. Chem. 247; 3558-70 (1972).
Den foreliggende opfindelse kan anvendes til påvisning af en hvilken 30 som helst ligand, hvortil der findes en specifik bindingspartner.
Liganden er sædvanligvis et peptid, et protein, et carbonhydrat, et glycoprotein, et steroid eller et andet organisk molekyle, hvortil der eksisterer en specifik bindingspartner i biologiske systemer, eller hvortil en specifik bindingspartner kan syntetiseres. Liganden 35 udvælges sædvanligvis blandt antigener og antistoffer herfor, haptener og antistoffer herfor samt hormoner, vitaminer, metabolit-ter og farmakologiske midler og disses receptorer og bindingsstoffer. Specifikke eksempler på ligander, som kan påvises ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er hormoner, såsom
DK 158366B
14 insulin, choriongonadotropin, thyroxin, liothyronin og østriol; antigener og haptener, såsom ferritin, bradykinnin, prostaglandiner og tumorspecifikke antigener; vitaminer, såsom biotin, vitamin B^2> folinsyre, vitamin E og ascorbinsyre; metabolitter, såsom 3',5'-ade-5 nosinmonophosphat og 3',5'-guanosinmonophosphat; farmakologiske midler, såsom dilantin, digoxin, morfin, digitoxin og barbiturater; antistoffer, såsom mi krosomalt antistof og antistoffer til hepatitis og allergener; samt specifikke bindingsreceptorer, såsom thyroxin-bindende globulin, avidin og transcobalamin.
10 I konjugatet ifølge den foreliggende opfindelse er enzymsubstratet koblet eller bundet til et specifiktbindende stof, som er liganden, en specifik bindingsanalog for liganden eller en specifik bindingspartner for liganden alt efter det valgte analysesystem, således at 15 en målelig mængde af reaktantens aktivitet bevares. Bindingen mellem enzymsubstratet og det specifiktbindende stof er sædvanligvis stort set irreversibel under analysebetingelserne, såsom når overvågningsreaktionen, hvori enzymsubstratet har aktivitet, ikke er bestemt til kemisk at ødelægge denne binding som i ovennævnte luminescens- og 20 cykliske reaktionssystemer. I visse tilfælde sker der imidlertid ødelæggelse eller anden påvirkning af denne binding ved den valgte overvågningsreaktion som middel til at måle forandringen i enzymsubstratets aktivitet. Et sådant tilfælde er det heri tidligere omtalte enzymatiske fluorescerende substratreaktionssystem.
25
Enzymsubstratet kan være direkte koblet til det specifiktbindende materiale, således at molekylvægten af konjugatet er mindre end eller lig med den samlede molekylvægt af enzymsubstratet og det specifiktbindende stof. Sædvanligvis er enzymsubstratet og det 30 specifiktbindende stof imidlertid forbundet ved hjælp af en brodannende gruppe indeholdende mellem 1 og 50, og fortrinsvis mellem 1 og 10 carbonatomer eller heteroatomer, såsom nitrogen, oxygen, svovl, phosphor og så videre. Eksempler på en brodannende gruppe omfattende et enkelt atom er en methylengruppe (ét carbonatom) og en amino-35 gruppe (ét heteroatom). Den brodannende gruppe har sædvanligvis en molekylvægt, som ikke overstiger 1000, og er fortrinsvis mindre end 200. Den brodannende gruppe omfatter en kæde af carbonatomer eller heteroatomer eller en kombination heraf og er knyttet til enzymsubstratet og det specifiktbindende stof eller et aktivt derivat heraf
DK 158366B
15 ved hjælp af en forbindelsesgruppe, sædvanligvis i form af en ester-, amido-, ether-, thioester-, thioether-, acetal-, methylen-eller aminogruppe.
5 Et enzymsubstrat er en forbindelse eller en gruppe, som er i stand til at undergå en kemisk omdannelse, som katalyseres af et enzym. Substratet har en foretrukket molekylvægt på mindre end 9000 og fortrinsvis mindre end 5000. Substrater af denne størrelse er som følge af deres mangel på molekylær kompleksitet særligt hensigts-10 mæssige til brug ved fremstillingen af konjugatet. Endvidere på virkes aktiviteten af sådanne substrater, når de kobles til et specifikt bindingsstof, let ved reaktion mellem konjugatet og det specifikke bindingsstof. Eksempler på enzymsubstrater, som kan tænkes anvendt til den foreliggende opfindelse, er de tidligere 15 omtalte enzymspaltelige fluorescerende substrater, såsom fluo rescein- og umbel1 iferonderivater, pH-indikatorer og spektrofoto-metriske indikatorfarvestoffer, navnlig chromogene typer.
I en udførelsesform for opfindelsen er de komponenter i den speci-20 fikke bindingsreaktion, som skal kombineres med det væskeformige medium, som formodes at indeholde liganden, i væskeform eller fast ' form. I det foretrukne homogene analysesystem foreligger komponenterne sædvanligvis i opløsning eller i en fast form, som let opløses i det væskeformige medium. Da det væskeformige medium, som skal 25 undersøges, normalt er af vandig art, er komponenterne sædvanligvis i vandopløselig form, dvs. enten i vandig opløsning eller i en vandopløselig fast form, såsom et pulver eller en harpiks. Analysemetoden kan udføres i en sædvanlig laboratoriebeholder såsom et reagensglas, idet komponenterne i den specifikke bindingsreaktion og 30 komponenterne i reaktionssystemet sættes dertil i fast form eller væskeform.
En eller flere af de specifikke bindingsreaktionskomponenter og/-eller én eller flere af komponenterne i overvågningsreaktionen kan 35 endvidere forbindes med en bærer. I et aspekt kan bæreren være en beholder, såsom et reagensglas eller en kapsel, indeholdende komponenten eller komponenterne i en indre del, f.eks. i form af en væske eller et løst fast stof eller en belægning på en indre overflade af beholderen. I et andet aspekt kan bæreren foreligge i form af en
DK 158366B
16 matrix, som er uopløselig og porøs og fortrinsvis absorberende i forhold til det væskeformige medium, som skal betemmes. Matricen kan foreligge i form af fugtighedsabsorberende papir, polymerfilm, -membraner, -slør eller -blokke, geler o.s.v. I denne form udgør 5 matricen et bekvemt middel til berøring af det væskeformige medium, som skal undersøges, til gennemførelse af den specifikke bindings reaktion og/eller overvågningsreaktionen og til obvervation af det resulterende respons.
10 Det væskeformige medium, som skal undersøges, kan være en naturligt forekommende eller kunstigt dannet væske, som formodes at indeholde liganden. Det væskeformige medium er sædvanligvis en biologisk væske eller en væske hidrørende fra en opløsning heraf eller en anden behandling heraf. Biologiske væsker, som kan analyseres ifølge den 15 foreliggende fremgangsmåde, indbefatter serum, plasma, urin og fostervand, cerebral- og spinalvæske. Andre materialer, såsom fast materiale, f.eks. væv, eller gasser, kan analyseres ved at bringe dem i væskeform, såsom ved opløsning af det faste stof eller gassen i en væske eller ved ekstraktion af det faste stof.
20 I modsætning til de kendte homogene metoder kan biologiske væsker, som indeholder stoffer, der har en reaktantaktivitet, som svarer til eller er identisk med aktiviteten af det konjugerede mærkningsstof, analyseres for liganden uden baggrundsforstyrrelse. Endogen bag-25 grundsreaktantaktivitet kan let elimineres på en række måder. Den biologiske væske kan behandles således, at den endogene reaktantaktivitet selektivt ødelægges. En sådan behandling kan involvere påvirkning med et klaringsmiddel, som kemisk ødelægger den endogene aktivitet, efterfulgt af behandling for at inaktivere dette anvendte 30 middel.
Opfindelsen vil nu blive illustreret af følgende eksempler, som ikke må opfattes som begrænsende: • 35
DK 158366B
17
Eksempel 1
Fremstilling af 2,4-dinitrophenyl-fluoresceinkonjugat.
5 F1uorescei n-3',6'-bi s-[6-(2,4-di ni troani1 i n)hexanat].
Syntesen indbefattede reaktionen af syrechloridet af 6-(2,4-dinitro-anilin)hexansyre med dinatriumsaltet af fluorescein. 6-(2,4-Dinitro-anilin)hexansyre fremstilledes ved den i Biochem. J. 42:287-94 10 (1948) beskrevne fremgangsmåde.
En opløsning af 1,5 g (5 minimol) af 6-(2,4-dinitroanilin)hexansyre omdannedes til syrechloridet ved reaktion med 10 ml varmt thionyl-chlorid i 15 minutter efterfulgt af afkøling og fortynding med 20 ml 15 hexan. Det faste syrechlorid, som dannedes, opsamledes ved filtrering og sattes efter grundig tørring til 600 mg af di natriumsaltet af fluorescein i 10 ml tør acetone. Efter 5 timers tilbagesvaling blev reaktionen stoppet ved tilsætning af 2 ml vand og 5 ml acetone.
Efter 30 minutter ved 25°C koncentreredes blandingen til tørhed, og 20 remanensen deltes mellem ethyl acetat og vandig natriumbicarbonatop-løsning. Den organiske fase fraskiltes og vaskedes med 1% vandig svovlsyre, tørredes over vandfrit magnesiumsulfat og inddampedes.
Den røde olie chromatograferedes på 60 g silicagel 60, som fås fra E. Merck, Darmstadt, Tyskland, idet der anvendtes en blanding af 25 acetone og carbontetrachlorid som elueringsmiddel i et volumenforhold på 2:8. De således opnåede 1,2 g uren bisester rechromatogra-feredes på 60 g silicagel under anvendelse af en blanding af acetone og carbontetrachlorid i et volumenforhold på 1:9. De fraktioner, der indeholdt det ønskede produkt, forenedes og inddampedes til 180 mg 30 af et gult, glaslignende fast stof.
Beregnet for ¢44^3^0^: C: 59,33; H: 4,30; N: 9,43 Fundet: C: 60,92; H: 4,35; N: 6,65.
Det infrarøde spektrum af produktet udviste den forventede ester-carbonylstrækningsabsorption ved 1765 cm"*.
35
Eksempel 2
DK 158366B
18
Der udførtes analyser ved den homogene fremgangsmåde til påvisning af derivater af 2,4-dinitrophenyl og antistoffer herfor under 5 anvendelse af et enzymsubstrat (modificeret fluorescein) som mærkningsstof.
Det i eksemplet anvendte specifikke bindingsreaktionssystem er baseret på den i nedenstående diagram 1 viste reaktion.
10 15 20 25 30 35
DK 158366B
19 DIAGRAM 1
0 O
5 1 I
R“C“0\^Y o χ o-c-« esterase rj^Y \ -> 10 H20, PR 7>°
O
2,4-Di ni trophenyl-fluorescei nkonjugat 15
e °G
2o \ + an^re produkter I „ o o 25 (maximal fluorescens ved 510 nm) 1 R = -(CH2) 5— NH —^J^N02
35 02N
DK 158366B
20 A. Homogen direkte bindende-fluorescensanalyse for antistoffer til 2,4-dinitrophenyl; virkning af forskellige anti stofkoncentrationer på reaktionshastigheden.
5 Der fremstilledes og analyseredes syv specifiktbindende reaktionsbi åndinger. For hver reaktionsblanding forenedes 20 /il 1 μΜ 2,4-dinitrophenyl-fluorescei nkon jugat (fremstillet ifølge eksempel 1) i dimethylsulfoxid med det rumfang antiserum til 2,4-dinitrophenyl, der angives i tabel 1, og med et tilstrækkeligt rumfang 0,1 M 10 bis-hydroxyethylglycinhydrochloridpuffer ved pH 7,0 til et samlet rumfang på 2,0 ml. Baggrundshastigheden for hydrolyse af esterbindingerne i konjugatet bestemtes over 3 minutter for hver reaktionsbiånding ved at bestemme hastigheden for fluorescensintensitetsforøgelsen ved 510 nm med fluorometeret indstillet til excitation ved 15 470 nm. Et 10 /il rumfang 0,1 M bishydroxyethylglycinhydrochlorid- puffer ved pH 7,0 indeholdende 0,54 enheder Type I esterase (E. C.
No. 3.1.1.1, leveret af Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) tilsattes derefter til hver reaktionsblanding. Den fremkomne totale reaktionshastighed måltes på samme måde som baggrundshydrolyseha-20 stigheden. Resultaterne heraf ses i tabel 1.
TABEL 1
Baggrunds- 25 Reaktions- Mængde anti- hydrolyse- Total reak- bl ånding serum (/il) hastighed ti onshastighed 1 0 0,02 2,68 2 5 0,07 2,48 30 3 10 0,11 1,91 4 20 0,17 1,08 5 30 0,21 0,63 6 40 0,22 0,45 7 60 0,26 0,30 35
Det fremgår af ovenstående, at netto-reaktionshastigheden for hydrolysereaktionen var en omvendt funktion af den i den specifiktbindende reaktionsblanding tilstedeværende mængde af antistoffer til den i bindingsreaktionsblandingen forekommende 2,4-dinitrophenyl.
21
DK 158366B
Det ses tilsvarende, at reaktionshastigheden for baggrundshydrolysereaktionen var en direkte funktion af den i den specifiktbindende reaktionsblanding tilstedeværende mængde antistoffer. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer derfor et analysemiddel og en 5 analysefremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af ligandantistoffet til 2,4-dinitrophenyl i et væskeformigt medium under anvendelse af en direkte bindings-fluorescensanalyseteknik.
B. Homogen kompetitiv bindings-fluorescensanalyse for derivater af 10 2,4-dinitrophenyl; virkning af forskellige niveauer af 2,4-dinitrophenyl -/J-alanin på reaktionshastigheden.
Ti specifiktbindende reaktionsblandinger fremstilledes, hver med et samlet rumfang på 2,0 ml og hver indeholdende 0,1 M bis-hydroxy-15 ethylgiycinhydrochloridpuffer ved pH 7,0 og 2,4-dinitrophenyl-j8- alanin fremstillet ifølge den i J. Amer. Chem. Soc. 76:1328 (1954) beskrevne fremgangsmåde med de i nedenstående tabel 2 angivne koncentrationer. Til de med 2-10 nummererede reaktionsblandinger i tabel 2 sattes en tilstrækkelig mængde antiserum til 2,4-dinitro-20 phenyl til at inhibere hastigheden af den esterasekatalyserede reaktion i den anden blanding, dvs. nr. 1, med 60%. Efter blanding tilsattes 20 /il 1 μΜ 2,4-dinitrophenyl-fluoresceinkonjugat (fremstillet som i eksempel 1) i di methyl sul foxid til hver reaktionsblanding. Et 10 μΐ rumfang 0,1 M bis-hydroxyethylglycinhydrochlo-25 ridpuffer ved pH 7,0 indeholdende 0,54 enheder af Type I esterase (E. C. No. 3.1.1.1, leveret af Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) tilsattes derefter til hver reaktionsblanding. Den fremkomne reaktionshastighed måltes som i del A af dette eksempel. Det procentiske forhold mellem hastigheden for reaktionerne 2 - 10 og 30 hastigheden af reaktion nr. 1 (intet antistof til stede) beregnedes. Resultaterne er anført i tabel 2.
35 TABEL 2
DK 158366B
22
Koncentration af Procent af 5 Reaktions- 2,4-dinitrophenyl- Reaktions- hastigheden af blanding /i-alanin (nM) hastighed reaktion nr. 1 1 0 2,78 2 0 1,04 37 10 3 5 1,01 36 4 10 1,04 37 5 20 1,24 45 6 30 1,51 54 7 50 1,54 56 15 8 75 1,80 65 9 100 1,85 67 10 150 2,33 84
Det fremgår af ovenstående resultater, at reaktionshastigheden for 20 hydrolysereaktionen var en direkte funktion af mængden af 2,4-dini-trophenyl-Ø-alanin i reaktionsblandingen. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer derfor et analysemiddel og en analysefremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af ligander, såsom derivater af 2,4-dinitrophenyl i et væskeformigt medium under 25 anvendelse af en kompetitiv bindings-fluorescensanalyseteknik.
C. Homogen kompetitiv bindings-spektrofotometrisk analyse for derivater af 2,4-dinitrophenyl; virkning af forskellige niveauer af 2,4-dinitrophenyl-/J-alanin på reaktionshastigheden.
30
Der fremstilledes otte bindingsreaktionsblandinger, hver med et samlet rumfang på 1,0 ml og hver indeholdende 0,1 M tris-(hydroxymethyl )-aminomethanhydrochl ori dpuffer ved pH 7,0. Reaktionsblandingerne indeholdt endvidere 2,4-dinitrophenyl -/J-alanin ved de i 35 nedenstående tabel 3 angivne koncentrationer. Til reaktionsblandingerne 2 - 8 i tabel 3 sattes en tilstrækkelig mængde af antiserum til 2,4-dinitrophenyl til at inhibere hastigheden af den esterase-katalyserede reaktion i blanding nr. 1 med 82%. Efter blanding sattes 10 /ti 0,1 mM 2,4-dinitrophenyl-fluoresceinkonjugat
DK 158366B
23 (fremstillet som i eksempel 1) i di methyl sul foxid til hver reaktionsblanding. Et 20 /il rumfang 0,1 M tris-( hydroxymethyl)-aminomethanhydrochloridpuffer ved pH 7 indeholdende 2,6 internationale enheder af Type I esterase (E. C. No. 3.1.1.1, leveret fra 5 Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) tilsattes derefter til hver reaktionsblanding. Absorbansforandringen for hver reaktionsblanding ved 489 nm per minut registreredes med et Gilford 2000 spektrofoto-meter. Resultaterne er anført i tabel 3.
10 TABEL 3
Koncentration af Absorbans-
Reaktions- 2,4-dinitrophenyl- forandringsblanding /?-alanin (/zM) hastighed 15 - 1 0 0,0261 2 0 0,0047 3 1,25 0,0118 4 2,5 0,0131 20 5 5,0 0,0185 6 7,5 0,0202 7 10,0 0,0192 8 12,5 0,0223 25 Det fremgår af ovenstående resultater, at reaktionshastigheden var en direkte funktion af mængden af 2,4-dinitrophenyl-/J-alanin i reaktionsblandingen. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer derfor et analysemiddel og en analysefremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af ligander, såsom derivater af 2,4-dinitrophe- 30 nyl, i et væskeformigt medium under anvendelse af en kompetitiv bin-dings-spektrofotometrisk analyseteknik.
D. Homogen kompetitiv bindings-fluorescensanalyse for derivater af 2,4-dinitrophenyl; brug af ikke-enzymati sk overvågningsreaktion.
35
Det i denne del anvendte specifiktbindende analysesystem var det samme som vist i diagram 1 med undtagelse af, at der ikke anvendtes esterase til at katalysere hydrolysen af esterbindingerne i konju-gatet.
DK 158366B
24
Der fremstilledes otte bindingsreaktionsblandinger, hver med et samlet rumfang på 2 ml, og hver indeholdende 0,1 M tri s-hydroxymethyl )-ami nomethanhydrochl ori dpuf fer ved pH 7,5. Blandingerne indeholdt endvidere 2,4-dinitrophenyl-/5-alanin ved de i tabel 4 angivne 5 koncentrationer. Til hver reaktionsblanding sattes 50 /il antiserum til 2,4-dinitrophenyl. Efter blanding tilsattes 20 pi 2 pM 2,4-di-nitrophenyl-fluoresceinkonjugat (fremstillet som i eksempel 1) i dimethyl sul foxid til hver reaktionsblanding. Den fremkomne reaktionshastighed måltes som i del A i dette eksempel. Resultaterne er 10 anført i tabel 4.
TABEL 4
Koncentration af 15 Reaktions- 2,4-dinitrophenyl- Reaktionsblanding /f-alanin (nM) hastighed 1 0 0,96 2 12,5 0,94 20 3 31,2 0,84 4 62,5 0,78 5 94,0 0,70 6 125 0,59 7 187 0,57 25 8 250 0,53
Det fremgår af ovenstående resultater, at baggrundshydrolysehastigheden i fravær af esterase var en invers funktion af mængden af 2,4-dinitrophenyl-j8-alanin i reaktionsblandingen. Den foreliggende 30 opfindelse tilvejebringer derfor et analysemiddel og en analyseme tode til bestemmelse af tilstedeværelsen af ligander, såsom derivater af 2,4-dinitrophenyl, i et væskeformigt medium under anvendelse af en kompetitiv bindings-fluorescensteknik, hvori bindingspartneren efter at være blevet bundet til liganden i konjugatet deltager i 35 overvågningsreaktionen.
Eksempel 3
DK 158366B
25
Fremstilling af biotin-umbelliferonkonjugat.
5 (2-0xo-2-H-l-benzopyran-7-yl)-5-[cis-hexahydro-2-oxo-lH-thien-(3,4-d-)-i mi dazol]valeri ansyreester.
En opløsning af 300 mg (1,2 millimol) vandfrit biotin i 20 ml tørt dimethyl formamid omrørtes ved -10°C under tør nitrogengas, og der 10 tilsattes 0,17 ml (1,2 millimol) tør tri ethylamin. En opløsning af frisk destilleret ethylchlorformiat (0,141 ml i 3 ml tør ether) tilsattes dråbevis. Efter inkubering i 30 minutter under omrøring filtreredes det fremkomne bundfald under en tør nitrogenatmosfære og afkøledes straks til -10°C. Til den filtrerede remanens sattes en 15 opløsning af 197 mg (1,2 millimol) vandfrit 7-hydroxycoumarin i 3 ml tør pyridin og omrørtes i 1 time ved -10°C og derefter i 20 timer ved 25“C. Opløsningsmidlerne afdampedes under højvakuum ved 40*C.
Efter afkøling filtreredes det fremkomne faste stof, og det omkry-stalli seredes fra methanol. Det ønskede produkt fremkom herved (smp.
20 = 216 - 218°C).
Beregnet for Cjg^øNgPijS: C: 48,75; H: 4,19; N: 7,21
Fundet: C: 58,4; H: 5,12; N: 6,86 25 1 35
Claims (7)
1. Specifik bindingsanalysefremgangsmåde til analyse af et væskeformigt medium for en ligand, hvilken fremgangsmåde omfatter føl - 5 gende trin: (a) at det væskeformige medium kontaktes med et reagens, der omfatter et konjugat af et mærkningsstof og et specifikt bindingsstof, hvorved reagenset og liganden danner et reak-10 tionsbindingssystem omfattende (i) en bundet form af det mærkede konjugat, hvori det specifikke bindingsstof er bundet til en specifik bindingspartner herfor, og 15 (ii) en fri form af det mærkede konjugat, hvori det specifikke bindingsstof er bundet til en specifik bindingspartner herfor; 20 (b) at mærkningsstoffet bestemmes i enten den bundne eller den frie form heraf som et mål for den i væskemediet forekommende ligand, kendetegnet ved, at der som mærkningsstof anvendes et 25 enzymsubstrat, og at fremgangsmåden er af homogen type, dvs. at der ikke udføres fysisk adskillelse af den bundne form og den frie form af det substratmærkede konjugat, uden at substrataktiviteten i hele den væskeformige reaktionsblanding måles og sættes i forhold til den i det prøvede væskeformige medium forekommende ligand. 30
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det substratmærkede konjugat er et substrat for et enzym, som er i stand til at indvirke på konjugatet og ved enzymatisk kløvning frigøre et produkt, som har en detekterbar egenskab, som adskiller sig fra 35 konjugatets.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, k e n d e t e g n e t ved, at det frigjorte produkt er fluorescerende. ί 27 DK 158366B
4. Reagens til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, hvilket reagens omfatter et konjugat af et mærkningsstof og et specifikt bindingsstof, og hvilket reagens sammen med liganden danner et bindingsreaktionssystem omfattende en bundet form af det 5 mærkede konjugat, hvori det specifikke bindingsstof er bundet til en specifik bindingspartner herfor, samt en fri form af det mærkede konjugat, hvori det specifikke bindingsstof ikke er bundet til en specifik bindingspartner herfor, hvorved mængden af mærkningsstof i enten den bundne eller den frie form er en funktion af mængden af 10 den i det væskeformige medium forekommende ligand, kendetegnet ved, at mærkningsstoffet er et enzymsubstrat og ved, at det substratmærkede konjugat udviser måleligt forskellige substrataktiviteter i den bundne form og i den frie form, hvilket således muliggør homogen analyse. 15
5. Reagens ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det omfatter: 1. et mærket konjugat omfattende mærkningssubstansen bundet til liganden eller en specifik bindingsanalog hertil, og 20 ^2) en bindingspartner til liganden.
6. Reagens ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det substratmærkede konjugat er et substrat for et enzym, som er i stand til at indvirke på konjugatet ved enzymatisk kløvning til frigørelse 25 af et produkt, som har en detekterbar egenskab, der adskiller sig fra konjugatets.
7. Reagens ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det frigjorte produkt er fluorescerende. 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US57200875A | 1975-04-28 | 1975-04-28 | |
| US57200875 | 1975-04-28 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK576181A DK576181A (da) | 1981-12-23 |
| DK158366B true DK158366B (da) | 1990-05-07 |
| DK158366C DK158366C (da) | 1990-10-01 |
Family
ID=24285954
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK189176A DK149969C (da) | 1975-04-28 | 1976-04-27 | Specifik coenzymmaerkningsbindingsanalysefremgangsmaade og reagensmiddel til anvendelse ved fremgangsmaaden |
| DK576181A DK158366C (da) | 1975-04-28 | 1981-12-23 | Specifik bindingsanalysefremgangsmaade og reagens til anvendelse ved fremgangsmaaden |
| DK576281A DK150808C (da) | 1975-04-28 | 1981-12-23 | Kemiluminiscent specifik bindings-analysefremgangsmaade og reagensmiddel til anvendelse ved fremgangsmaaden |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK189176A DK149969C (da) | 1975-04-28 | 1976-04-27 | Specifik coenzymmaerkningsbindingsanalysefremgangsmaade og reagensmiddel til anvendelse ved fremgangsmaaden |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK576281A DK150808C (da) | 1975-04-28 | 1981-12-23 | Kemiluminiscent specifik bindings-analysefremgangsmaade og reagensmiddel til anvendelse ved fremgangsmaaden |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (6) | JPS604939B2 (da) |
| AT (1) | AT357685B (da) |
| AU (2) | AU509182B2 (da) |
| BE (1) | BE841179A (da) |
| BR (1) | BR7602561A (da) |
| CA (2) | CA1078712A (da) |
| CH (1) | CH635438A5 (da) |
| DD (1) | DD125231A5 (da) |
| DE (3) | DE2660548C2 (da) |
| DK (3) | DK149969C (da) |
| ES (1) | ES447378A1 (da) |
| FI (1) | FI68324C (da) |
| FR (1) | FR2332533A1 (da) |
| GB (2) | GB1552607A (da) |
| HU (1) | HU179542B (da) |
| IE (1) | IE42544B1 (da) |
| IL (1) | IL49354A (da) |
| IN (1) | IN142734B (da) |
| IT (1) | IT1064132B (da) |
| LU (1) | LU74834A1 (da) |
| NL (1) | NL181281C (da) |
| SE (3) | SE440280B (da) |
| ZA (1) | ZA762030B (da) |
Families Citing this family (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL51668A (en) | 1977-03-16 | 1981-12-31 | Israel State | Analytical method for the quantitative determination of immunogens and antibodies and a kit therefor |
| SE7811630L (sv) * | 1977-11-17 | 1979-05-18 | Welsh Nat School Med | Metod for uppteckt eller mengdbestemning av substanser med anvendning av merkningsteknik |
| USRE34394E (en) * | 1978-01-23 | 1993-09-28 | Baxter Diagnostics Inc. | Method and composition for double receptor, specific binding assays |
| US4233402A (en) * | 1978-04-05 | 1980-11-11 | Syva Company | Reagents and method employing channeling |
| AU531777B2 (en) * | 1978-04-05 | 1983-09-08 | Syva Co. | Label/solid conjugate immunoassay system |
| FR2422956A1 (fr) * | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
| US5605800A (en) * | 1978-04-13 | 1997-02-25 | Institut Pasteur | Method of detecting and characterizing a nucleic acid or a sequence of the latter, and enzymatic reactant for the application of this method |
| IL57570A (en) * | 1978-06-22 | 1982-07-30 | Miles Lab | Method and reagent for specific binding assay with a prosthetic group as a label component |
| DE2924332A1 (de) * | 1978-06-22 | 1980-01-03 | Miles Lab | Flavin-adenin-dinukleotid-markiertes konjugat und dessen verwendung in spezifischen bindungsversuchen |
| US4225485A (en) * | 1978-07-24 | 1980-09-30 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent naphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrazide-labeled polypeptides and proteins |
| US4334069A (en) * | 1978-07-24 | 1982-06-08 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent phthalhydrazide-labeled hapten conjugates |
| US4228237A (en) * | 1978-09-21 | 1980-10-14 | Calbiochem-Behring Corp. | Methods for the detection and determination of ligands |
| US4288538A (en) | 1979-01-31 | 1981-09-08 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Test method and composition therefor |
| US4273866A (en) * | 1979-02-05 | 1981-06-16 | Abbott Laboratories | Ligand analog-irreversible enzyme inhibitor conjugates and methods for use |
| US4446231A (en) * | 1979-10-03 | 1984-05-01 | Self Colin H | Immunoassay using an amplified cyclic detection system |
| GB2059421A (en) * | 1979-10-03 | 1981-04-23 | Self C H | Assay method and reagents therefor |
| US4259232A (en) * | 1979-10-23 | 1981-03-31 | Miles Laboratories, Inc. | Flavin adenine dinucleotide-labeled protein and polypeptide conjugates |
| AT367796B (de) * | 1979-10-29 | 1982-07-26 | List Hans | Verfahren zur bestimmung einer stoffkonzentration in einer loesung |
| JPS56501583A (da) * | 1979-11-19 | 1981-10-29 | ||
| US4299916A (en) * | 1979-12-26 | 1981-11-10 | Syva Company | Preferential signal production on a surface in immunoassays |
| DK256581A (da) * | 1980-06-13 | 1981-12-14 | Nat Res Dev | Bindingsanalyse |
| EP0049606A1 (en) * | 1980-10-02 | 1982-04-14 | Colin Henry Self | Detection method, use and diagnostic aid |
| CA1183450A (en) * | 1980-10-30 | 1985-03-05 | Alfred C. Greenquist | Homogeneous specific binding assay device and method |
| US4404278A (en) * | 1980-11-24 | 1983-09-13 | Syva Company | Methods and compositions for assaying for the production of 1,4-dihydropyridyl |
| US4378458A (en) * | 1981-03-30 | 1983-03-29 | Baker Instruments Corporation | Novel chromogenic and/or fluorogenic substrates for monitoring catalytic or enzymatic activity |
| CA1219824A (en) * | 1981-04-17 | 1987-03-31 | David C. Ward | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| EP0329198B1 (en) * | 1981-04-17 | 1998-06-10 | Yale University | Base modified oligo- and polynucleotides and methods of preparing and using same |
| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| US4366243A (en) | 1981-04-17 | 1982-12-28 | Miles Laboratories, Inc. | Stabilization of glucose oxidase apoenzyme |
| JPS5818167A (ja) * | 1981-07-24 | 1983-02-02 | Fuji Photo Film Co Ltd | 分析フイルム及びこれを用いる分析方法 |
| JPS5877843U (ja) * | 1981-11-20 | 1983-05-26 | 株式会社三協精機製作所 | テ−プレコ−ダ |
| GB2112779B (en) * | 1981-12-11 | 1986-10-15 | Welsh Nat School Med | Aryl acridinium esters as luminescent labelling materials |
| FR2519005B1 (fr) * | 1981-12-29 | 1985-10-25 | Pasteur Institut | Fragments d'adn marques a l'une au moins de leurs extremites par des ribonucleotides modifies reconnaissables par des molecules affines et procede pour realiser une analyse de tels fragments d'adn |
| FR2519004B1 (fr) * | 1981-12-29 | 1985-09-27 | Pasteur Institut | Acide adenosine 5'-triphosphorique modifie et procede de dosage de substances biologiques susceptibles de fixer des produits de degradation de l'acide adenosine 5'-triphosphorique |
| US4709016A (en) * | 1982-02-01 | 1987-11-24 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
| US5650270A (en) * | 1982-02-01 | 1997-07-22 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
| IL67289A (en) * | 1982-03-18 | 1985-12-31 | Miles Lab | Homogeneous immunoassay with labeled monoclonal anti-analyte |
| CA1223831A (en) * | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| US4495281A (en) * | 1982-10-21 | 1985-01-22 | Miles Laboratories, Inc. | Tricyclic antidepressant drug immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives |
| US4994373A (en) | 1983-01-27 | 1991-02-19 | Enzo Biochem, Inc. | Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes |
| US4828979A (en) * | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
| EP0201211A1 (en) * | 1985-04-10 | 1986-11-12 | Whittaker Corporation | Method and compositions for visual solid phase immunoassays based on luminescent microspheric particles |
| JPS61271457A (ja) * | 1985-05-28 | 1986-12-01 | Olympus Optical Co Ltd | 免疫学的分析方法 |
| JPH06100599B2 (ja) * | 1985-06-27 | 1994-12-12 | 東亜医用電子株式会社 | 体液成分の測定方法 |
| JPS6321559A (ja) * | 1986-07-16 | 1988-01-29 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | ハプテンの酵素免疫測定法 |
| US6002007A (en) * | 1988-02-20 | 1999-12-14 | Dade Behring Marburg Gmbh | Special chemiluminescent acridine derivatives and the use thereof in luminescence immunoassays |
| DE3844954C2 (de) * | 1988-02-20 | 1998-07-16 | Hoechst Ag | Spezielle chemilumineszierende Acridinderivate und ihre Verwendung in Lumineszenzimmunoassays |
| JP2525678B2 (ja) * | 1989-10-03 | 1996-08-21 | 富士写真フイルム株式会社 | 免疫測定装置 |
| US6380377B1 (en) | 2000-07-14 | 2002-04-30 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
| US6596490B2 (en) | 2000-07-14 | 2003-07-22 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
| CN100494399C (zh) | 2003-06-30 | 2009-06-03 | 清华大学 | 一种基于dna芯片的基因分型方法及其应用 |
| US7732153B2 (en) | 2006-05-09 | 2010-06-08 | Beckman Coulter, Inc. | Nonseparation assay methods |
| US7799534B2 (en) | 2006-05-09 | 2010-09-21 | Beckman Coulter, Inc. | Nonseparation assay methods |
| JP6214449B2 (ja) * | 2014-03-31 | 2017-10-18 | シスメックス株式会社 | キナーゼ活性の測定方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154600B (nl) * | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
| US3817837A (en) * | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
| US3880934A (en) * | 1972-02-10 | 1975-04-29 | Syntex Inc | Nitrophenyloxy-butanediols |
| JPS5147347A (ja) * | 1974-10-21 | 1976-04-22 | Nippon Electric Co | Johoshorisochi |
| JPS5147348A (ja) * | 1974-10-21 | 1976-04-22 | Nippon Electric Co | Johoshorisochi |
-
1975
- 1975-09-30 IN IN1874/CAL/75A patent/IN142734B/en unknown
-
1976
- 1976-04-02 IE IE696/76A patent/IE42544B1/en unknown
- 1976-04-05 IL IL49354A patent/IL49354A/xx unknown
- 1976-04-05 ZA ZA762030A patent/ZA762030B/xx unknown
- 1976-04-07 CA CA249,744A patent/CA1078712A/en not_active Expired
- 1976-04-07 CA CA249,745A patent/CA1082577A/en not_active Expired
- 1976-04-21 CH CH497976A patent/CH635438A5/de not_active IP Right Cessation
- 1976-04-23 GB GB16610/76A patent/GB1552607A/en not_active Expired
- 1976-04-23 GB GB16609/76A patent/GB1548741A/en not_active Expired
- 1976-04-26 IT IT49195/76A patent/IT1064132B/it active
- 1976-04-26 NL NLAANVRAGE7604420,A patent/NL181281C/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-04-26 LU LU74834A patent/LU74834A1/xx unknown
- 1976-04-26 FI FI761148A patent/FI68324C/fi not_active IP Right Cessation
- 1976-04-27 DE DE2660548A patent/DE2660548C2/de not_active Expired
- 1976-04-27 BR BR2561/76A patent/BR7602561A/pt unknown
- 1976-04-27 FR FR7612441A patent/FR2332533A1/fr active Granted
- 1976-04-27 DE DE2618419A patent/DE2618419C2/de not_active Expired
- 1976-04-27 JP JP51047347A patent/JPS604939B2/ja not_active Expired
- 1976-04-27 AT AT309376A patent/AT357685B/de not_active IP Right Cessation
- 1976-04-27 ES ES447378A patent/ES447378A1/es not_active Expired
- 1976-04-27 DD DD192528A patent/DD125231A5/xx unknown
- 1976-04-27 HU HU76MI600A patent/HU179542B/hu unknown
- 1976-04-27 DK DK189176A patent/DK149969C/da not_active IP Right Cessation
- 1976-04-27 BE BE166499A patent/BE841179A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-04-27 AU AU13352/76A patent/AU509182B2/en not_active Expired
- 1976-04-27 AU AU13353/76A patent/AU502726B2/en not_active Expired
- 1976-04-27 SE SE7604841A patent/SE440280B/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-04-27 DE DE2618511A patent/DE2618511C3/de not_active Expired
- 1976-04-27 JP JP51047348A patent/JPS6052378B2/ja not_active Expired
-
1980
- 1980-10-21 SE SE8007397A patent/SE451895B/sv not_active IP Right Cessation
- 1980-10-21 SE SE8007396A patent/SE447510B/sv not_active IP Right Cessation
-
1981
- 1981-12-23 DK DK576181A patent/DK158366C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-12-23 DK DK576281A patent/DK150808C/da not_active IP Right Cessation
-
1983
- 1983-07-07 JP JP58122463A patent/JPS5942453A/ja active Granted
- 1983-07-07 JP JP58122465A patent/JPS5951353A/ja active Granted
- 1983-07-07 JP JP58122466A patent/JPS5951354A/ja active Granted
- 1983-07-07 JP JP58122464A patent/JPS5942454A/ja active Granted
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK158366B (da) | Specifik bindingsanalysefremgangsmaade og reagens til anvendelse ved fremgangsmaaden | |
| US4318980A (en) | Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label | |
| US4230797A (en) | Heterogenous specific binding assay employing a coenzyme as label | |
| US4492751A (en) | Heterogenous specific binding assay employing an enzyme substrate as label | |
| US4380580A (en) | Heterogenous chemiluminescent specific binding assay | |
| US4383031A (en) | Homogeneous chemiluminescent specific binding assay | |
| US4134792A (en) | Specific binding assay with an enzyme modulator as a labeling substance | |
| US4378428A (en) | Method for carrying out non-isotopic immunoassays, labeled analytes and kits for use in such assays | |
| US4238565A (en) | Specific binding assay with a prosthetic group as a label component | |
| EP0093613B1 (en) | Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay method, apparatus and diagnostic kit | |
| US4363759A (en) | Chemiluminescent-labeled haptens and antigens | |
| NO314946B1 (no) | Fremgangsmåte og analysesett for analyse av homocystein | |
| JP2010237226A (ja) | 化学発光性アクリジニウム化合物を使用するヒドリドの測定 | |
| Carrico et al. | A method for monitoring specific binding reactions with cofactor labeled ligands | |
| US4376165A (en) | Method of preparing an enzyme-labeled ligand for use in specific binding assays and the labeled conjugate produced thereby | |
| DK158534B (da) | Homogen kompetitiv bindings-immunoanalysemetode til bestemmelse af en iodothyronin i en proeve af uekstraheret serum eller plasma med et tbp-blokerende middel samt reagensmiddel til anvendelse ved metoden | |
| US4629688A (en) | Homogeneous specific binding assay method | |
| US4791055A (en) | Homogenous specific binding assay reagent system and labeled conjugates | |
| FI70726C (fi) | Homogeniskt immunoanalysfoerfarande med flavinadeninnukleotid som maerkeskomponent och detektering av det med apoglukosoxidas | |
| Rani et al. | Measurement of bile acid in serum and bile with arylamine-glass-bound 3α-hydroxysteroid dehydrogenase and diaphorase | |
| US4171432A (en) | Flavin adenine dinucleotide-iodothyronine conjugates | |
| US6673560B1 (en) | Measurement of hydride using chemiluminescent acridinium compounds and applications thereof | |
| JPS61234797A (ja) | マクロ分子ヒドロラ−ゼ用螢光偏光アツセイ、このアツセイに使用する試薬及びこれら試薬の製法 | |
| JPS6229578A (ja) | Ｎ―アシル―ジヒドロレゾルフィン誘導体及びその製法 | |
| Goldbarg et al. | A method for the colorimetric determination of α-d-glucosidase with a chromogenic substrate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |