DK157139B - Fremgangsmaade til fremstilling af en blanding af 2-ketogulonat og 2-ketogluconat - Google Patents

Description

1 DK 157159 B

Den foreliggende opfindelse angâr en fremgangsmâde til frem-stilling af en blanding af 2-ketogulonat og 2-ketogluconat. Blan-dingen er nyttig til fremstilling af ascorbin- og erythorbinsyrer. Ascorbinsyre eller vitamin C er pâkrævet i den menneskelige diaet og anvendt i vid udstrækning pâ sâvel tabletform som som et additiv til andre naeringsmidler for at imodegâ dette behov. Erythorbinsyre eller isoascorbinsyre er nyttig som antioxidant til anvendelse i næ-ringsmidler.

2,5-Diketogluconsyre fremstilles let ved bakteriel pâvirk-ning af glucose, idet adskillige arter af Acetobacter og Pseudomonas er nyttige til dette formâl. Japansk patent nr. 14493 (1964) i

2 DK 157139 B

navnet Shionogi and Co., Ltd. beskriver anvendelsen af Pseudomonas sesami til denne fremstilling.

Tidligere arbejde vedr0rende natriumborhydridreduktionen af 2,5-diketogluconsyre har været indskrænket til fuldstændig re-duktion af sâvel 2-keto- som 5-ketogrupperne til hydroxylgrupper under anvendelse af et stort overskud af natriumborhydrid, og frem-stillingen af 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre ved stereoselek-tiv og regioselektiv ikke-katalytisk reduktion har sâvidt vides ikke været rapporteret. Wakisaka, Agr. Biol. Chem. 28,819 (1964), reducerede 2,5-diketogluconsyre i sâvel 2- som 5-ketostillingerne ved pâvirkning med et overskud af natriumborhydrid. De opnâede fire isomere blev angivet som værende D-gluconsyre, D-mannonsyre, L-idonsyre og L-gulonsyre. Ruffs oxidation af den resulterende blanding af disse isomere gav D-arabinose og L-xylose. üdbyttet af D-arabinose som opnâet var st0rre end üdbyttet af L-xylose, hvilket Wakisaka foreslog kunne forekomme ved enten stereospecifik reduktion, ved tilstedeværelsen af isomere eller ved transformationer mellem de forskellige strukturisomere. Det st0rre udbytte af D-arabinose tyder pâ, at reduktion med hydrid til dannelse af de . D-isomere var st0rre end reduktionen til dannelse af L-isomeren, hvilket er i modsætning til den foreliggende fremgangsmâde, som giver ikke blot regioselektiv reduktion ved 5-ketostillingen, men ogsâ stereoselektiv reduktion til dannelse af st0rre mængder af den 0nskede L-isomere af 2-ketogulonsyre. Fuldstændig reduktion af 2,5-diketogluconsyre med et overskud af natriumborhydrid er ogsâ rapporteret af Katznelson, J. Biol. Chem., 204, 43 (1953), som opnâede en "gluconsyre", der mentes at bestâ af fire isomere, som ikke kunne adskilles i hans fors0g. Pâ lignende mâde er fuldstændig reduktion af calcium-2,5-diketogluconat med natriumborhydrid rapporteret af Bernaerts et al., Antonie van Leeuwenhoeck, 37,185 (1971).

Katalytisk reduktion af 2,5-diketogluconsyre under anvendelse af en Raney-nikkel-katalysator og hydrogen giver if0lge Wakisaka,

Agr. Biol. Chem. 28, 819 (1964) ringe udbytter af en blanding af 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre med 2-ketogluconsyre som hoved-produkt. Dette er u0nsket, hvis man s0ger at anvende blandingen til fremstilling og isolering af den mere værdifulde ascorbinsyre i h0je udbytter. Til dette formai er en blanding indeholdende en st0rre del 2-ketogulonsyre 0nskelig, da 2-ketogulonsyre er precursoren til ascorbinsyre, medens 2-ketogluconsyre er precursoren til erythor-binsyre.

3

DK 157139 B

Den katalytiske reduktion af et 5-keto-D-gluconat under anvendelse af ædelmetalkatalysatorer til fremstilling af en blanding af L-idonat og et D-gluconat er ogsâ kendt. Selektiviteten med hensyn til L-idonat forages ved anvendelse af en metalborkatalysator fremstillet ved behandling af et asdelmetaisait med natriumborhydrid, Chen et al., Chem. Pharm. Bull., 18,1305 (1970). Natriumborhydrid-reduktionen af 5-keto-D-gluconsyre er ogsâ blevet beskrevet, J.A.C.S., 76* 3543 (1954), men er ikke-stereoselektiv, hvilket giver omtrent lige store mængder af D-gluconsyre og L-idonsyre.

Den foreliggende opfindelse angâr en fremgangsmâde til fremstilling af en blanding af 2-ketogulonat og et 2-ketogluconat, hvilken fremgangsmâde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnen-de del anforte. Den resulterende blanding af 2-ketogulonatet og 2-ketogluconatet kan overfores i ascorbin- og erythorbinsyrer.

Fremgangsmâden if0lge opfindelsen har uventet vist sig at muligg0re den regioselektive og stereoselektive ikke-katalytiske . . reduktion af 2,5-diketogluconat ved 5-ketostillingen i godt total-udbytte til en blanding af et 2-ketogulonat og et 2-ketogluconat. Forholdet mellem produkterne i den resulterende blanding kan varieres fra ca. 85:15 til ca. 45:55 afhængigt af de betingelser og reagenser der anvendes, soin det vil blive beskrevet udf0rligere i det f0lgende. Af særlig interesse er det, at den omhandlede fremgangsmâde kan give et godt udbytte af en blanding indeholdende overvejende 2-keto-gulonsyre, som i godt udbytte kan overf0res til den mere værdifulde ascorbinsyre. Blandinger indeholdende omtrent lige mængder 2-ketogulonat og 2-ketogluconat er imidlertid nyttige kilder til fremstil-lingen af sâvel ascorbin- som erythorbinsyrer, og fremgangsmâden if0lge opfindelsen giver derfor fordele i form af fleksibilitet til fremstilling af varierende mængder af ascorbin- og erythorbinsyrer.

Det i den foreliggende opfindelse anvendte 2,5-diketogluconat kan som nævnt f.eks. være 2,5-diketogluconsyre eller salte af syren. Hensigtsmæssige salte indbefatter de salte, der som modion har et al-kalimetal, et jordalkalimetal, ammonium eller tetraalkylammonium, hvor alkylgrupperne har 1-4 carbonatomer. Nyttige som udgangsmaterialer til fremgangsmâden if0lge opfindelsen er ogsâ de hidtil ukendte normal-alkylestere af 2,5-diketogluconsyre, hvori alkylgruppen har 1-4 carbonatomer. Som anvendt i beskrivelsen og kravene indbefatter udtrykkene 2,5-diketogluconat, 2-ketogulonat og 2-kétogluconat de frie syrer og hensigtsmæssige alkylestere og salte deraf som hfsfikrevet i det foreaâende. 2.5-Diketoaluconsvren οσ salte deraf 4

DK 157139 B

kan freins tilles pâ enhver i teknikken kendt mâde. Almindeligvis fremstilles 2,5-diketogluconatet som calciumsaltet i vandig opl0s-ning ved fermentering under anvendelse af metoder, der er velkendte i fermenteringsindustrien, se f.eks. japansk patent nr. 14493, og det kan anvendes direkte som udgangsmaterialet ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen. 2,5-Diketogluconatet kan ogsâ fremstilles ved fermentering i nærværelse af andre ioner, sâsom natrium, og det resulterende natrium-2,5-diketogluconat kan ligeledes anvendes direkte som udgangsmateriale. Ved en alternativ metode fremstilles 2.5- diketogluconatet pâ konventionel mâde som calcium-2,5-diketo-gluconatet, og det overf0res i den 0nskede forbindelse ved tilsætning af et sait, der kan udfælde calcium og give 2,5-diketogluconat i opl0sning med den 0nskede modion. Sâledes kan f.eks. natrium- eller ammonium-2,5-diketogluconat fremstilles ved tilsætning af natrium-eller ammoniumcarbonat, som det passer sig, til en opl0sning af calcium-2,5-diketogluconat fremstillet ved fermentering. Calcium-, udfældes som calciumcarbonat, hvilket efterlader 2,5-diketogluconatet i opl0sning med natrium- eller ammoniummodioner. De frie syrer kan ogsâ neutraliseres med et hensigtsmæssigt hydroxid eller et andet sait. Om 0nsket kan 2,5-diketogluconatet isoleres, renses og genopl0ses.

De normal— alkylestere af 2,5-diketogluconsyre, hvori alkyl-gruppen har 1-4 carbonatomer, er hidtil ukendte forbindelser, der er nyttige som udgangsmaterialer ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen. Esterne kan fremstilles ved opvarmning af en opl0sning af 2.5- diketogluconsyre eller et passende sait deraf i den hensigts-mæssige normale alkanol ved 50°C til 100°C i nærværelse af en katalytisk mængde af en stærk syre, sâsom koncentreret svovlsyre, saltsyre, p-toluensulfonsyre og lignende, under dannelse af den tilsvarende alkyl-2,5-diketogluconat-5,5-dialkylacetal. Egnede salte af 2,5-diketogluconsyre indbefatter alkalimetal-, jordalkali-metal-, ammonium- og tetraalkylammoniumsalte, i hvilke hver alkyl-gruppe i tetraalkylammoniumionen har 1-4 carbonatomer. Acetalen hydrolyseres derpâ med vandig syre ved en temperatur pâ mellem ca. -10°C og 30°C til tilvejebringelse af den 0nskede alkylester af 2/5-diketogluconsyre. Egnede syrer indbefatter vandig saltsyre, tri-fluor eddikesyre, svovlsyre, sulfonsyre-ionbytterharpikser og lignende. Alkyl-2,5-diketogluconat-5,5-dialkylacetal-mellemprodukterne er ogsâ hidtil ukendte forbindelser. En foretrukken acetal og ester, der opnâs ved hydrolyse deraf, er methyl-2,5-diketogluconat-5,5- 5

DK 157139 B

dimethylacetal og henholdsvis methyl-2,5-diketogluconat.

Nâr der anvendes et alkalimetal-2,5-diketogluconat som udgangsmateriale, foretrækkes natriumsaltet. Natriumsaltet har vist sig at være et særligt 0nskeligt udgangsmateriale til fremstilling af blandinger af et 2-ketogulonat og et 2-ketogluconat indeholdende 2-ketogulonatet som hovedproduktet, hvorved ascorbinsyresyntesen lettes. Et foretrukkent jordalkalimetal-2,5-diketogluconat er calciumsaltet. Nâr tetraalkylammoniumsalte anvendes, er tétraméthylammonium at foretrække pâ grund af prisen og tilgængeligheden. Et foretrukkent alkylester-udgangsmateriale er methyl-2,5-diketogluconat

En opl0sning af 2,5-diketogluconatet bringes i kontakt med et alkalimetalborhydrid. Reaktionen udf0res foretrukkent i vandig opl0sning, eventuelt indeholdende organiske medopl0sningsmidler, sâsom, men ikke begrænset til, alkoholer med 1-4 carbonatomer, alkandioler med 2-4 carbonatomer, acetonitril, dimethylsulfoxid og dimethylformamid. Methanol er et foretrukkent medopl0sningsmid-del. Koncentrationen af 2,5-diketogluconat er ikke kritisk, men ligger foretrukkent mellem 5 og 20 vægt%. Koncentrationen af 2,5-diketogluconat dannet ved fermentering er almindeligvis beliggende i dette omrâde og giver derved en hensigtsmæssig vandig opl0sning af udgangsmaterialet til anvendelse ved fremgangsmâden if0lge opfin- delsen. Nâr der anvendes en alkylester som udgangsmateriale, kan reaktionen udf0res i vandfri opl0sningsmidler, sâsom alkanoler, specielt methanol, dimethylsulfoxid og dimethylformamid. I aile tilfælde er det ikke n0dvendigt, at 2,5-diketogluconatet er fuldstændig opl0st i opl0sningsmidlet, forudsat at en væsentlig del af udgangsmaterialet er i opl0sning.

Q

Alkalimetalborhydridet kan anvendes enten i opl0sning eller pâ fast form. Det foretrukne borhydrid til anvendelse ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen er natriumborhydrid. Det har vist sig, at anvendelsen af natriumforbindelsen, specielt nâr den anvendes med natrium-2,5-diketogluconatet som substrat, f0rer til store forholds-mængder 2-ketogulonat i produktblandingen. Anvendelsen af andre alkalimetalborhydrider har vist sig at give noget lavere mængder 2-ketogulonat, og ved valg af reagenser kan der dannes blandinger med forhold 2-ketogulonat : 2-ketogluconat pâ 85:15 til 45:55.

Dette muligg0r nogen fleksibilitet ved anvendelse af disse blandinger til opnâelse af enten ascorbinsyre eller erythorbinsyre.

Der kan opnâs gode udbytter af en blanding af et 2-ketogulonat og et 2-ketogluconat ved anvendelse af mellem ca. 0,8 ca.

6 DK 157139 B

1,1 ækvivalenter af alkalimetalborhydridet pr. mol 2,5-diketogluco-nat. Ved et ækvivalent alkalimetalborhydrid menes der den st0kiome-triske mængde, der er n0dvendig til at overf0re 5-ketogruppen i 2,5-diketogluconatet til hydroxyl. Dette kan ogsâ udtrykkes som 0,8 til 1,1 ækvivalenter hydridion. 1 mol alkalimetalborhydrid indeholder fire ækvivalenter hydridion, og den mængde reagens, der kræves, kan tilsvarende udtrykkes som 0,200 til 0,275 mol alkalimetalborhydrid. Hvis alkalimetalborhydridet anvendes i mængder min-dre end ca. 0,8 ækvivalenter pr. mol 2,5-diketogluconat til selektiv reduktion af 2,5-diketogluconatet vil udbyttet af blandingen af 2-ketosyrer imidlertid være tilsvarende lavere. Ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen tilsigtes det at opnâ de optimale totaludbytter af den onskede produktblanding. Beskrivelsen og kravene omhandler derfor en fremgangsmâde til udovelse af denne fremgangsmâde, hvori kun en del af 2,5-diketogluconatet omsættes, og uomsat udgangsmate-riale kan derefter recirkuleres til yderligere reaktion.

Under omsætningen af 2,5-diketogluconatet med alkalimetalborhydridet skal oplosningens pH holdes storre end 5, foretrukkent mellem 6 og 10,5. Nâr 2,5-diketogluconsyre anvendes som udgangs-materiale, skal pH helst indstilles til over 5 for tilsætningen af alkalimetalborhydridet. pH for en vandig oplosning af natrium-eller calcium-2,5-diketogluconat fremstillet ved fermentering er sædvanligvis mindre end 5, og pH skal derfor helst indstilles tilsvarende til en værdi st0rre end 5 f0r tilsætning af borhydridet. Dette kan g0res ved tilsætning af en vilkârlig base, men det fore-trækkes at anvende en natriumforbindelse, sâsom natriumcarbonât eller natriumhÿdroxid. Alternativt kan pH indstilles samtidig med borhydridtilsætningen ved opl0sning af borhydridet i en basisk opl0sning, sâsom natriumhydroxid, sa at ved tilsætning af den basiske borhydridopl0sning indstilles den vandige opl0snings pH straks til en værdi h0jere end 5. I dette tilfælde skal der helst ved tilsætning af et lille overskud i forhold til den krævede st0kiometriske mængde gives mulighed for, at en lille del af borhydridet kan dekomponere ved de sure betingelser, f0r pH er blevet indstillet til over 5.

Borhydridet kan tilsættes langsomt portionsvis i l0bet af et tidsrum, f.eks. ved tilsætning af den basiske opl0sning af borhydridet drâbevis under omr0ring af opl0sningen af 2,5-diketogluconatet. Borhydridet sættes foretrukkent til pâ én gang ved reaktionens 7

DK 157139 B

start ved en temperatur under 25°C.

Reduktionen kan ogsâ udf0res i et str0mningsreaktionssystem, nâr en opl0sning af alkalimetalborhydridet almindeligvis blandes med eller indspr0jtes i den 2,5-diketogluconatet indeholdende str0m.

Den tid, der er n0dvendig til fuldendelse af reaktionen, afhænger af reaktionstemperaturen og tilsætningshastigheden for borhydridet til 2,5-diketogluconatet, men almindeligvis vil reak-tionstiderne være forholdsvis korte, og reaktionen vil være fuld-stændig efter tidsforl0b pâ ca. 10 minutter til ca. 2 timer.

Under tilsætning af alkalimetalborhydridet skal temperaturen af den vandige opl0sning helst holdes ved mellem ca. -30°C og ca. 50°C og foretrukkent mellem -25°C og 25°C. Over 50°C kan der iagt-tages dekomponering af reaktanterne.

Reduktionen kan med fordel udf0res i nærværelse af et bor-kompleksdannende middel, som er opl0st eller dispergeret i reaktionsmediet. Borsyre dannes under reduktionen, og denne kan danne kompleks med 2,5-diketogluconat-udgangsmaterialet. Ved et bor-kompleksdannende middel menes der en vilkârlig forbindelse eller et vilkârligt materiale, som vil inhibere eller forhindre kompleks-dannelsen mellem borsyre og 2,5-diketogluconatet, f.eks. ved for- trinsvis at reagere med eller adsorbere borsyren , men midlet skader ikke reaktionen. Hensigtsmæssige bor-kompleksdannende midler ind- befatter alkalimetalfluorider, ammoniumfluorid og borabsorberende ionbytterharpikser. En række sâdanne harpikser er tilgængelige i handelen. Et særligt nyttigt eksempel pâ sidstnævnte er "Amberiite XE-243" (Rohm and Haas Company, Philadelphia, Pa.). Der mâ være en tilstrækkelig mængde bor-kompleksdannende middel til stede til at danne kompleks med den dannede borsyre. Der mâ sâledes anvendes ca. 4 mol fluorid for hvert mol natriumborhydroxid, der anvendes for at bevirke reduktion. Mængden af ionbytterharpiks, der anvendes, vil sædvanligvis være fra ca. 0,5 til 1 volumen harpiks pr. volumen 2.5- diketogluconatopl0sning i en batchproces, men den anvendte mængde vil n0dvendigvis variere efter den særlige harpiks, der anvendes, og reaktionsbetingelserne.

Efter afslutning af den selektive reduktion til dannelse af blandingen af et 2-ketogulonat og et 2-ketogluconat kan uomsat 2.5- diketogluconat recirkuleres til yderligere omsætning, eller det kan effektivt fjernes ved opvarmning med syre eller base.

Hvis det 0nskes at underkaste det uomsatte 2,5-diketogluconat yder-

8 DK 157139 B

ligere reduktionsreaktioner, udfores den indledende reduktion fore-trukkent i nærværelse af et bor-kompleksdannende middel, som be-skrevet i det foregâende.

Blandingen af 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre kan isoleres ved filtrering af reaktionsblandingen og indstilling af filtratets pH til mellem 1,5 og 2 ved tilsætning af syrer, sâsom koncentreret svovlsyre, og frafiltreringog bortkastning af dannet bundfald. 2-Ketogulon- og 2-ketogluconsyrerne kan samles ,ved fjernelse af vandet eller vand-organisk medopl0sningsmiddel, f.eks. ved fryset0rring. Forholdet mellem 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre i blandingen kan bestemmes ved væskechromatografi pâ methyl-esterne under anvendelse af en blanding afborsyre (0,6 M) og ammoniumformiat (0,4 M) i vand som den mobile fase med "Aminex Resin" type A-25 (TM. Bio-Rad Laboratories, Richmond, California), 50-100 mesh som den stationære fase eller ved tyndtlagschromatografi under anvendelse af en cellulosebærer.

Blandingen af 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre kan let overf0res i ascorbin- og erythorbinsyrer. Blandingen af 2-keto-syrer kan overf0res i methylesterne ved kogning under tilbagesvar ling i methanol i nærværelse af en sur katalysator, sâsom saltsyre eller en sulfonisk ionbytterharpiks i 3 til 24 timer. André estere kan dannes pâ denne mâde under anvendelse af den passende alkohol. Esterne dannes direkte, nâr en alkylester af 2,5-diketogluconsyre er udgangsmateriale til den selektive reduktion. Blandingen af methylestere kan adskilles og koges derpâ under tilbagesvaling i methanol i nærværelse af en base, sâsom natriumbicarbonat, i en inert atmosfære. Ved afk0ling udfælder natriumascorbat og natrium-erythorbat. De râ salte samles ved filtrering, blandes med vand og afioniseres med en kationbytterharpiks, sâsom "Dowex 50" frem-stillet af Dow Chemical Co. Vandet fjernes, og ascorbinsyren og erythorbinsyren omkrystalliseres af methanol/vand til opnâelse af en blanding af ascorbin- og erythorbinsyrer. Qm 0nsket kan ascor-binsyre opnâs ved omkrystallisation fra en 4:1 methanol/vand-opl0s-ning.André hensigtsmæssige opl0sningsmidler eller medopl0sningsmid-ler kan om 0nsket anvendtes.0m 0nsket kan methylesterne af 2-ketogulonsvre og 2-ketogluconsyre adskilles og overf0res i ascor-binsyre henholdsvis erythorbinsyre under anvendelse af de samme betingelser som beskrevet i det foregâende for esterblandingen.

t

DK 157139 B

9 · : > * . r ,* *

Ascorbinsyre kan fremstilles sëlektivt ud fra en blanding af 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre. Dette er særlig fordelagtigt, nâr blandingen, indeholdende en haj andel 2-ketogulonsyre, er ble-vet dannet, f. eks. ved natriumborhydridreduktion af natri.um-2,5-diketogluconat. Den ved borhydridreduktionen opnâede blanding af syrer opvarmes i et hensigtsmæssigt organisk oplosningsmiddel, sâsom xylen, til ca. 50-13Q°C, foretrukkent 60-90°C, i nærværelse af en syre valgt blandt saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovlsyre og sulfoni-ske ionbytterharpikser. Den foretrukne syre er saltsyre. Efter op-varmning i et tidsrum pâ 3-12 timer, afhængigt af den anvendte tempe-ratur, er lactoniseringen af 2-ketogulonsyren til ascorbinsyre i det vaesentlige fuldstœndig. I denne procès dannes erythorbinsyre ikke, og det er derfor en enkel metode til selektiv fremstilling af ascorbinsyre ud fra blandinger af 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre fremstillet ved borhydridreduktion af et 2,5-diketogluconat. Denne syrekatalyserede lactoniseing kan ogsâ anvendes til at overfore ·-blandinger af alkylestrene af 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyren i ascorbinsyre.

De efterfolgende eksempler forklarer opfindelsen nærmere.

Eksempel 1

Til en hurtigt omrprt opl0sning af 20 liter filtreret, râ fermenteringsblanding indeholdende 10% calcium-- 2,5-diketogluconat (CgH-yO^, 1,5 H2O, molvægt 238, 0,84 M) ved 0°C (is/vand-bad) blev der sat 42,4 ml 2,2 M NaBH4 i 7 M NaOH (0,93 M H) ved en hastighed pâ 1 ml pr. min. Opl0sningens pH steg hurtigt fra 3,65 til 10,2.

Den resulterende opslæmning blev filtreret, filtratet indstillet til pH 1,6 med koncentreret H2S04, og det resulterende bundfald blev fjernet ved filtrering og bortkastet. Fjernelse af vand ved fryse-t0rring gav 246 g fryset0rret fast'stof. En del af dette iblev for-estret og analyseret ved væskechromatografi med en indre .-standard til opnâelse af et forhold pâ 78:22 mellem 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre i et totaludbytte pâ 79%.

En opl0sning af 10 g fryset0rret 2-ketogulon- og 2-keto-gluconsyrer fra ovennavnte reduktion i 50 ml MeOH blev behandlet med 1 g "Dowex 50"(T. M. Dow Chemical Co.) harpiks og kogt under tilbagesvaling i 12 timer. Ved afk0ling blev harpiksen fjernet ved filtrering og de râ methylestere isoleret ved fjernelse af opl0s-ningsmiddel som en olie.

10

DK 157139 B

Anvendelse af produktet:

Den râ blanding af methylestere fra f0r blev anbragt i methanol med 1,5 ækvivalenter NaHCO^ og kogt under tilbagesvaling i en nitrogenatmosfære i 6 timer. Ved afk01ing udfældede natrium-saltene af ascorbin- og erythorbinsyre fra opl0sningen. De râ salte blev isoleret ved filtrering, anbragt i vand og afioniseret med "Dowex 50"-kationbytterharpiks. Ved fjernelse af vand udkrystal-liserede den râ ascorbin/erythorbinsyrerest af methanol/vand til opnâelse af en blanding af ascorbin- og erythorbinsyrer. Omkrystal-lisation af 4:1 methanol/vand gav ascorbinsyre.

Eksempel 2

En 10%'s vandig opl0sning af natrium-2,5-diketogluconat blev indstillet til et pH pâ 6,1 ved tilsætning af natriumcarbonat, methanol blev tilsat til 50 volumen%, og opl0sningen blev afk01et til mellem -15°C og -25°C. Et ækvivalent natriumborhydrid blev sat til den afk0lede opl0sning, som blev omr0rt i 6 timer ved -15°C til -25°C og ved rumtemperatur natten over. En blanding af natrium-2-ketogulonat og -2-ketogluconat blev isoleret ved udfældning med methanol og filtrering. Analyse af methylestrene ved væskechromato-grafi viste et forhold pâ 78:22 mellem 2-ketogulonsyre og 2-keto-gluconsyre i produktblandingen,

Eksempel 3

Under anvendelse af den i eksempel 2 omhandlede metode blev natriumborhydridreduktion af calcium-2,5-diketogluconat udf0rt ved 0°C ved forskellige pH-værdier. Blandingen af 2-ketogulonat og 2-gluconat som dannet blev analyseret ved væskechromatografi til bestemmelse af forholdet mellem 2-ketogulonsyre og 2-keto-gluconsyre. De opnâede resultater var som f01ger:

Forhold 2-ketogulonsyre: pH Opl0sningsmiddel 2-ketogluconsyre_ 6,37 Vand:methanol (a) 69:31 8,23 Vand:methanol 68:32 8,65 Vand 45:55 (a) 1:1 efter volumen

n DK 157139 B

Eksempel 4

Under anvendlese af den i eksempel 2 omhandlede metode blev der udf0rt natriumborhydridreduktlon af natrium-2,5-diketogluconat i vand:methanol-opl0sning (1:1 efter volumen) holdt ved mellem -15°C og -20°C ved forskellige pH-værdier. Blandingerne af 2-keto-gulonat og 2-ketogluconat som dannet blev analyseret ved væske-chromatografi til bestemmelse af forholdet mellem 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre. De opnâede résultater var som f0lger:

Forhold 2-ketogulonsyre: pH 2-ketogluconsyre_ 6,10 78:22 8,6o 77:23 8,80 77:23 10,20 71:29

Eksempel 5

Under anvendelse af den i eksempel 2 omhandlede metode blev der udf0rt natriumborhydridreduktlon af natrium-2,5-diketogluconat i vand:methanol-opl0sning ved pH mellem 7,9 og 8,6 ved forskellige temperaturer. Forholdet mâlem 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre i de resulterende produkter blev bestemt ved væske-chromatografi. De opnâede resultater var som f0lger:

Forhold 2-ketogulonsyre:

Temp. °C 2-ketogluconsyre_ 24 77:23 0 80:20 -15 til -20 77:23

Eksempel 6

Under anvendelse af den i eksempel 2 omhandlede metode blev der udf0rt natriumborhydridreduktion af natrium-2,5-üiketo-gluconsyre i vand ved 0°C ved et pH pâ 8 med varierende koncentra-tioner af natrium-2,5-diketogluconat. Forholdet mellem 2-ketogulon-syre og 2-ketogluconsyre i de resulterende produkter blev bestemt ved væskechromatografi. De opnâede resultater var som f01ger:

12 DK 157139 B

Koncentration af natrium-2,5- Forhold 2-ketogulonsyre: diketogluconat, vægt%_ 2-ketogluconsyre_ 5 75:25 10 79:21 20 56:44

Eksempel 7

Reduktionen blev udf0rt under anvendelse af forskellige alkalimetalborhydrider og 2,5-diketogluconater af forskellige modioner. Forholdet mellem 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre i de resulterende blandinger blev bestemt ved væskechromatografi. Reaktionsbetingelserne og de opnâede résultater var soin f01ger:

Borhydrid- 2,5-diketo- Temp. Forhold 2-ketogu- ion gluconat °C pH lonsyre:2-ketoglu- _ _ _ _ consyre_

Ll Li -15 til -20 8,26 48:52

Na Li -15 til -20 8,06 63:37

Na Na -15 til -20 8,60 77:23

Na K -15 til -20 8,08 64:36 K K -15 til -20 7,97 67:33

Na Me4N -15 til -20 8,61 63:37

Na Ca 0 8,65 45:55

Ll Li '0 8,0 48:52

Ll Na 0 8,0 47:53

Na

Li 0 8,0 63:37

Na Na 0 8,0 79:21

Eksempel 8

Reduktionen af calcium-2,5-ketogluconat med 4,4 M natrium-borhydrid i 14 M natriumhydroxid blev udf0rt ved 0°C i vand inde-holdende forskellige medopl0sningsmidler. Forholdet mellem 2-ketogulonsyre og 2-kebogluconsyre i de resulterende blandinger blev bestemt ved væskechromatografi. De opnâede resultater var som f0lger: 13

DK 157139 B

Forhold vand: Forhold 2-ketogulonsyre:

Medopl0sningsmîddel medopl0sningsmlddel 2-ketogluconsyre_

Ethylenglycol 6:1 72:28

Acetonitril 4:1 76:24

Dimethylformamid 4:1 72:28

Dimethylsulfoxid 6:1 71:29

Intet - 77:23

Eksempel 9 15 g isoleret calcium-2,5-diketogluconat blev opl0st i 150 ml vand, og 6,61 g natriumcarbonat blev tilsat ved 0°C under omr0-ring af opl0sningen. Opl0sningens pH steg til 9,57. Der blev sat 0,49 g natriumborhydrid til opl0sningen ved 0°C. Efter omr0ring i 15 minutter blev blandingen filtreret, og filtratet blev ionbyttet med en sur ionbytterharpiks. Efter fryset0rring og dannelse af methylestrene, soin beskrevet i eksempel 1, gav analyse ved vaeskechromatografi et forhold mellem 2-ketogulonsyre og 2-ketoglucon-syre pâ 85:15:

Eksempel 10

Til 50 ml 20%'s natrium-2,5-diketogulonat ved 0°C blev der sat 0,8 ml 10%'s natriumhydroxid til indstilling af pH fra 5,15 til 9,70. Der blev straks tilsat natriumborhydridpulver (11,26 mmol, Alfa Products, Danvers, Ma. 01923). Med pH pâ 10,60 efter 10 minutters forl0b blev blandingen indstillet til et pH pâ 7 med koncentreret svovlsyre. Analyse af den reducerede blanding ved HPLC (^minex A-25H-harpiks under anvendelse af 0,5 M NH^HCX^ som elueringsmiddel) viste ren reduktion til en blanding af natrium-2-ketogulonat og natrium-2-ketogluconat i et udbytte pâ 85%.

Til bestemmelse af forholdet mellem 2-ketogulonat og 2-ketogluconat blev det fryset0rrede faste stof fra 5 ml af den reducerede blanding forestret med 15 ml methanol og 0,275 ml koncentreret svovlsyre. Den opnâede methylester blev analyseret ved gas-chromatografi som sit persilvlerede dérivât (fremstillet ved behand-ling med "Tri-Sil/TBT" [Pierce Chemical Company, Rockford, 111. 61105]). Adskillelse pâ en 3%1 s *OV-21O*-s0jle ved 135°C (30 ml pr. min. str0mningshastighed) viste et forhold mellem methyl-2-keto-gulonatsyre og methyl-2-ketogluconatsyre pâ 85:15.

,4 DK 157139 B

Eksempel 11

En 250 ml rundbundet kolbe med 5,0 g (19,8 mol) methyl- 2,5-diketogluconat-5,5-dimethylacetal, 150 ml vand og 3 ml 6 N saltsyre blev omr0rt ved 80°C i 45 minutter, afk0let,og den vandige opl0sning blev passeret gennemen sbjle indeholdende 40 ml "Amberlyst A-21"-ionbytterharpiks (Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pa.) .

Det neutraliserede elueringsmiddel blev derpâ fryset0rret til opnâelse af 2,2 g (100%) methyl-2,5-diketogluconat som et 10st, ustabilt gult pulver, der var homogent if01ge HPLC-analyse ("Aminex A-25"-harpiks under anvendelse af 0,5 M ΝΗ^+Η002 som elueringsmiddel) : IR (KBr) cm”1 3330 (s, OH), 1736 (s, methylester), NMR (D20) S,c 170,00 (s, ester-carbon), 96,86 og 92,84 (singlets, anomere), 73,20 og 71,50 (doublets, -CH-OH), 65,99 (t, -CH2-0-), (53,95 (q, CH3-0).

Produktet blev anbragt i 150 ml vand, af7 k0let til 0°C, og pH blev indstillet til 7,5 med 1 N NaOH. Til den hurtigt omr0rte blanding blev der sat 215 mg natriumborhydrid. Efter 1 minuts forl0b blev blandingen f0rt gennem 40 ml af en ion-bytter i en s0jle indeholdende 50% "Dowex 50" og 50% "Amberlyst A-21" harpiks. Filtratet blev koncentreret i vakuum til en fast blanding af methyl-2-ketogulonat og methyl-2-ketogluconat omfattende 3,7 g. Det râ faste stof blev anbragt i 50 ml 95%'s éthanol med 5,99 g natriumbicarbonat og kogt under tilbagesvaling i 4 timer under nitrogen. Efter afk0ling blev reaktionsblandingen afioni-seret med overskud af "Dowex 50" og derpâ koncentreret i vakuum til en gui olie. GLPC-analyse af den per-trimethylsilylerede reak-tionsblanding (ΙδΟ*3, 5 ft 0V-210 s0jle) indikerer et forhold pâ 78:22 mellem ascorbinsyre og erythorbinsyre i et totaludbytte pâ 20% bestemt ved iodtitrering.

Eksempel 12

Til 50 ml 12%'s vandig natrium-2,5-diketogluconat (28,04 mmol) blev der sat 45 ml "Amberlite XE-243" ionbytterharpiks (Rohm & Haas, Philadelphia, Pa. 19105). Blandingen blev omr0rt til 0°C i et isAand-bad.Veddrâbevis tilsætning af 10%'s natrium-hydroxid blev pH indstillet til 10,8. Behandling med 0,265 g natriumborhydrid (7,01 mmol, Alfa Products, Danvers, Ma. 01923) i 10 minutter efterfulgt af indstilling til pH 7 med koncentreret svovlsyre. Omr0ring i 0,5 timer gav efter filtrering af harpiksen 15

DK 157139 B

en reduceret blanding, hvorfra ca. 50% af det oprindeligt tilstede-værende bor var fjernet. Der opnâedes et 90%'s udbytte af en 85:15-blanding af 2-ketogulon- og 2-ketogluconsyrer.

Eksempel 13

Til 50 ml 12%'s vandig natrium-2,5-diketogluconsyre (28,04 mmol) blev der sat 35 ml "Amberlite EX-243" ionbytterharpiks (Rohm & Haas, Philadelphia, Pa. 19105). Blandingen blev omr0rt ved 0°C i et is/vand-bad. Ved drâbevis tilsætning af 10%'s natrium-hydroxid blev pH indstillet til 10,8. Ved tilsætning af 0,212 g natriumborhydrid (5,61 mmol, Alfa Products, Danvers, Ma. 01923), blev der iagttaget en pH-stigning til 11,55. Efter 10 minutters forl0b blev blandingen afskrækket med koncentreret svovlsyre til indstilling af pH fra 11,2 til 7. Efter omr0ring i 0,5 timer blev den delvist reducerede blanding filtreret til fjernelse af harpiksen.

Til den delvist reducerede opl0sning blev der sat yderligere 10 ml "Amberlite XE-243" harpiks. Efter afk0ling til 0°C blev opl0sningens pH indstillet til 10,8 med 10%'s natriumhydroxid.

Der blev tilsat yderligere 53 mg (1,40 mmol) natriumborhydrid.

Efter 10 minutters forl0b blev der tilsat koncentreret svovlsyre til indstilling af pH til 7. Efter omr0ring i 0,25 timer blev blandingen filtreret. HPLC-analyse viste fuldstændig reduktion af natrium-2,5-diketogluconat til natrium-2-ketogulonat og natrium-2-ketogluconat. Der blev observeret meget lidt borsyre eller mulige overreduktionsprodukter. Ved anvendelse af HPLC-analyse med 2-imidazolidon som indre standard blev der bestemt et 96%'s udbytte af en 85:15-blanding af 2-ketogulonsyre og 2-ketogluconsyre.

Eksempel 14

Til en hurtigt omr0rt 12%'s vandig opl0sning af natrium- 2,5-diketogluconat (28,04 mmol), afk0let til 0°C i et is/vand-bad blev der sat 2,355 g (56,08 mmol) natriumfluorid. Ved drâbevis tilsætning af 10%'s natriumhydroxid blev pH indstillet fra 4,3 til 10,8. 10 minutter efter tilsætningen af 0,530 g natriumborhydrid (14,02 mmol, Alfa Products, Danvers, Ma. 01923) blev pH indstillet til 7 med koncentreret svovlsyre. HPLC-analyse ("Aminex A-25" harpiks under anvendelse af 0,5 M NH^HŒ^ som eluerings-middel) viste mindre tilstedeværende bor end uden harpiks. Efter omr0ring af blandingen natten over blev der ved filtrering fjernet

16 DK 157139 B

lidt hvidt fast udfældet stof. üdbyttet af 85:15-blandingen af 2-ketogulon- og 2-ketogluconsyre blev bestemt til 90%.

Eksempel 15

Til en hurtigt omr0rt opl0sning af 55 mmol natrium-2,5-diketogluconsyre i 150 ml H20 ved 0°C og et pH pâ 9,5 blev der sat 12,7 mmol natriumborhydrid i 10bet af 15 minutter. Efter endt tilsætning blev opl0sningens pH indstillet til ca. 7 med 6 N saltsyre og fryset0rret til opnâelse af 16,3 g fast stof. En portion pâ 15,0 g af det fryset0rrede faste stof blev opl0st i 250 ml methanol: vand i forholdet 95:5 med 100 ml "Amberlyst 15" (Rohm and Haas, Philadelphia, Pa. 19105) ionbytterharpiks og kogt under tilbage-svaling natten over. Efter afk01ing blev harpiksen fjernet ved filtrering, filtratet blev passeret gennem 40 ml "Amberlyst A-21" (Rohm and Haas, Philadelphia, Pa. 19105) ionbytterharpiks og kon-centreret i vakuum. Krystaller, som forekom ved henstand, blev fjernet ved filtrering og vasket med acetone, hvilket gav 2,21 g (21%) methyl-2-ketogulonat (smp. 150-154°C, litteraturangivelse 155-157°C), der ved HPLC-analyse og C^^spektroskopi viste sig at være 97% iscmeriskrai.Methyl-2-ketogulonatet kan overf0res i ascorbinsyre ved opvarmning med natriumbicarbonat under nitrogen.

Claims (13)

17 DK 157139 B

1. Fremgangsmâde til fremstilling af en blanding af 2-ketogu-lonat og 2-ketogluconat, kendetegnet ved, at et 2,5-diketogluconat, valgt blandt 2,5-diketogluconsyre, en normal alkylester af denne syre, hvori alkylgruppen har 1-4 carbonatomer, og et sait af denne syre med en modion valgt blandt alkalimetaller, jordalkali-metaller, ammonium og tetraalkylammonium med 1-4 carbonatomer i hver alkylgruppe, reduceres med fra 0,8 til 1,1 ækvivalenter af et alkali-metalborhydrid pr. mol 2,5-diketogluconat, i oplosning ved en pH-værdi storre end 5 og en temperatur mellem -30°C og 50°C.

2. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at reduktionen udfores ved en temperatur pâ -25°C til 25°C.

3. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at reduktionen udferes ved en pH-værdi mellem 6 og 10,5.

4. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at 2,5-diketogluconat udgor mellem 5 og 20 vaegt% af oplosningen.

5. Fremgangsmâde if0lge krav l,kendetegnet ved, at alkalimetalmodionen er natrium.

6. Fremgangsmâde if01ge krav 1, kendetegnet ved, at jordalkalimetalmodionen er calcium.

7. Fremgangsmâde i£01ge krav 1, kendetegnet ved, at alkylesteren af 2,5-diketogluconsyre er methyl-2,5-diketogluco-nat.

8. Fremgangsmâde if01ge krav 1, kendetegnet ved, at tetraalkylammoniummodionen er tétraméthylammonium.

9. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at alkalimetalborhydridet er natriumborhydrid.

10. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kend etegnet ved, at reduktionen udfores i vandig oplosning.

11. Fremgangsmâde if0lge krav 10, kendetegmet ved, at den vandige opl0sning indeholder et medopl0sningsmidde'l valgt blandt alkanoler med 1-4 carbonatomer, alkandioler med 2-4 carbon-ataner, acetonitril, dimethylsulfoxid og dimethylformamid..

12. Fremgangsmâde if01ge krav 11, kendetegnet ved, at medopl0sningsmidlet er methanol.

13. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at reduktionenudf0res i nærværelse af et bor-kompleksdannende middel valgt blandt alkalimetalfluorider, ammoniumfluorid og bor-ab-sorberende ionbytterharpikser.